ES2349879T3

ES2349879T3 - Peptidomiméticos fijados sobre patrón.

Info

Publication number: ES2349879T3
Application number: ES07701901T
Authority: ES
Inventors: Reshmi Mukherjee; John Anthony Robinson; Daniel Obrecht; Barbara Romagnoli; Frank Gombert; Christian Ludin; Kerstin Moehle; Steven J. Demarco; Heiko Henze; Jan Wim Vrijbloed
Original assignee: Polyphor AG; Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie; Spexis AG
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2027-02-28
Also published as: US20180127467A1; US10787486B2; EA017583B1; IL200312A; DE602007008150D1; JP5140686B2; DK2132221T3; ATE475667T1; US8921325B2; BRPI0721259A2; US9879047B2; US20190100558A1; US8399611B2; PL2132221T3; NO20093064L; US20100048463A1; BRPI0721259C1; JP2010519331A; AU2007348171A1; CN101641372B

Abstract

Ciclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala- D Pro-Dab-Arg-Tyr-Cys- Tyr-Arg-Gln-Lys- D Pro-Pro), enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, siendo X Ala o Tyr.

Description

La presente invención da a conocer peptidomiméticos de horquilla β fijados sobre patrón que presentan actividad antagonista de CXCR4 y están comprendidos en el alcance general del documento WO2004/096840 A1, aunque no se dan a conocer específicamente en el mismo.

DeMarco y otros, Bioorganic & Medicinal Chemistry 14, 8396-8404 (2006), muestran inhibidores selectivos de CXCR4 miméticos de horquilla β útiles en el tratamiento de las

infecciones: por VIH, cáncer, inflamaciones, y en terapias de

trasplante: de células madre, así como la síntesis de dichos

peptidomiméticos cíclicos.

Los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención son ciclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-DPro-Pro), enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, siendo X Ala o Tyr.

De acuerdo con la presente invención, los miméticos de horquilla β mencionados anteriormente y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden preparar por un procedimiento que comprende

(a): acoplar un soporte sólido apropiadamente funcionalizado con un derivado apropiadamente N-protegido de Pro;

(b): eliminar el grupo N-protector del producto obtenido en la etapa (a);

(c): acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado apropiadamente N-protegido de DPro;

(d): eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo;

(e): acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado apropiadamente N-protegido del aminoácido que en el producto final deseado se encuentra en la posición 14, es decir, Lys, estando de forma similar el grupo amino presente en su cadena lateral adecuadamente protegido;

(f): eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo;

(g): llevar a cabo etapas sustancialmente correspondientes a las etapas (e) y (f), pero utilizando derivados apropiadamente N-protegidos de los aminoácidos que en el producto final deseado se encuentran en las posiciones 13 a 1, es decir Gln, Tyr, Cys, Tyr, Arg, Dab, DPro, Ala, Ser,

Cys, Ala o Tyr, His y Tyr, estando igualmente apropiadamente protegido cualquier grupo funcional que pueda estar presente en dichos derivados aminoácidos N-protegidos;

(h): formar el enlace disulfuro de cadena β entre las cadenas laterales de los residuos Cys de las posiciones 4 y 11;

(i): separar el producto obtenido de este modo del soporte sólido;

(j): ciclar el producto separado del soporte sólido;

(k): eliminar cualquier grupo protector presente en los grupos funcionales de todos los miembros de la cadena de residuos aminoácidos; y

(l): si se desea, convertir el producto obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable, obtenida de este modo, en el correspondiente compuesto libre o en una sal diferente farmacéuticamente aceptable.

Las etapas del procedimiento anteriormente mencionado se pueden llevar a cabo mediante métodos bien conocidos por la persona experta en la química de los péptidos.

Los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones para prevenir las infecciones por VIH en individuos sanos o para ralentizar y detener la progresión viral en pacientes infectados; o un cáncer mediado por la actividad del receptor CXCR4 o resultante de la misma; o enfermedades inmunológicas mediadas por la actividad del receptor CXCR4 o resultantes de la misma; o para tratar una inmunosupresión; o para tratar inflamaciones, o, particularmente, para la movilización de células madre de células madre de sangre periférica y/o células madre mesenquimales (MSC) y/u otras células madre cuya retención depende del receptor CXCR4.

Los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden administrar como tales o en una formulación apropiada junto con portadores, diluyentes o excipientes bien conocidos en la técnica.

Particularmente, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden utilizar como tratamiento para aumentar la liberación de células madre hematopoyéticas (HSC) desde la médula ósea en transplantes alogénicos o autólogos.

El tratamiento agudo con HSC infundido se utiliza ampliamente para restablecer las funciones inmunes en pacientes que

han recibido terapia mieloablativa durante el tratamiento de patologías malignas, tales como mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin. Los pacientes o los donantes se tratan con el agente de movilización de HCS, tal como un compuesto según la presente invención, y a continuación las células se recolectan de la sangre periférica por aféresis. Las HCS se vuelven a trasplantar, por ejemplo, después del tratamiento de quimioterapia, al paciente (trasplante autólogo), o del donante al receptor (trasplante alogénico), promoviéndose de este modo el restablecimiento de la función inmune (Frühauf y otros, Br. J. Haematol. 122, 360-375 (2003)).

Otras aplicaciones del tratamiento con HSC incluyen, sin limitarse a las mismas, angiogénesis terapéutica, por ejemplo, en caso de infarto (Sheferd RM y otros, Blood 2006 108(12):36623667).

Los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención también se pueden utilizar para tratar o prevenir infecciones por VIH o cánceres, tales como cáncer de pecho, cáncer cerebral, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, cáncer de páncreas, melanoma, angiogénesis y tejidos hematopoyéticos; o enfermedades inflamatorias, tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades pulmonares por hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, neumonías eosinofílicas, hipersensibilidad de tipo retardado, enfermedad pulmonar intersticial (ILD), fibrosis pulmonar idiopática, ILD asociada a artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, enfermedad vascular periférica, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, enfermedad de von Hippel Lindau, anafilaxis sistémica o respuestas por hipersensibilidad, alergias a fármacos, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Behcet, mucositis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, miastenia gravis, diabetes juvenil, glomerulonefritis, tiroiditis autoimmune, rechazo de injertos, incluyendo rechazo de aloinjertos o enfermedades injerto contra huésped, enfermedades inflamatorias del intestino, dermatosis inflamatorias; o para tratar la inmunosupresión, incluyendo inmunosupresión inducida por el rechazo de injerto/trasplante.

Los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden administrar individualmente, como mezclas de

más de un peptidomimético de horquilla β, en combinación, según el caso, con otros agentes de movilización de HSC, o agentes anti-VIH,

o: agentes antimicrobianos, o agentes anticáncer, o agentes

antiinflamatorios,: y/o en combinación con otros agentes

farmacéuticamente activos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, preparación de comprimidos recubiertos, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de forma convencional, utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de los peptidomiméticos activos de horquilla β para obtener preparaciones farmacéuticamente utilizables. La formulación adecuada depende del método de administración escogido.

Para la administración tópica, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden formular como soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc., tal como es bien conocido en la técnica.

Las formulaciones sistémicas incluyen las designadas para administración por inyección, por ejemplo inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como las designadas para administración transdérmica, transmucosal, oral o pulmonar.

Para las inyecciones, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden formular en soluciones adecuadas, preferentemente en soluciones tampón fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Las soluciones pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, agentes estabilizantes y/o dispersantes.

Alternativamente, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden presentar en forma de polvos para su combinación con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso.

Para la administración transmucosal, en la formulación se utilizan penetrantes apropiados a la barrera que se debe permear, tal como es bien conocido en la técnica.

Para la administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando los peptidomiméticos activos de horquilla β según la presente invención con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos portadores permiten que los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, emulsiones, suspensiones, etc., para su ingestión oral por parte de un paciente que debe ser tratado. Para las formulaciones orales, tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen sustancias de relleno tales como azúcares, por ejemplo lactosa, sucrosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio; agentes de granulación; y agentes aglutinantes. Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidonas reticuladas, agar o ácido algínico, o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación sólidas se pueden dotar de un recubrimiento de azúcar o un recubrimiento entérico utilizando técnicas estándar.

Para las preparaciones líquidas orales, tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, los portadores, excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Además, se pueden añadir agentes aromatizantes, conservantes, colorantes y similares.

Para la administración bucal, la composición puede adoptar la forma de comprimidos, grageas, etc., formulados del modo habitual.

Para la administración por inhalación, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se suministran convenientemente en forma de aeorosol en recipientes a presión o nebulizadores, con utilización de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, tricloroflurometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosificación se puede ajustar proporcionando una válvula a efectos de suministrar una cantidad medida determinada. Se pueden formular cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina, para su utilización en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo de los peptidomiméticos de horquilla β según la presente

invención: y una base adecuada de polvos, tal como lactosa o

almidón.

Los: compuestos también se pueden formular en

composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios, junto con bases apropiadas de supositorio, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención también se pueden formular como preparaciones de depósito (“depot”). Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Para la fabricación de dichas preparaciones de depósito, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como sales poco solubles.

Además, se pueden utilizar otros sistemas de administración farmacéutica, tales como liposomas y emulsiones bien conocidos en la técnica. También se pueden utilizar algunos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido. Adicionalmente, los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se pueden administrar utilizando un sistema de liberación controlada, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación controlada, y los mismos son bien conocidos por los expertos en la materia. En función de su naturaleza química, las cápsulas de liberación controlada pueden liberar los compuestos durante un periodo comprendido entre unas semanas y más de 100 días. En función de la naturaleza química y la estabilidad biológica del agente terapéutico, se pueden utilizar estrategias adicionales para la estabilización proteínica.

Dado que los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención contienen residuos cargados, se pueden incluir cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como tales

o como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las formas libres correspondientes. Las sales farmacéuticamente aceptables particularmente adecuadas incluyen sales con ácido carboxílico,

fosfónico, sulfónico y sulfámico, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tales como ácido glutámico o ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido metansulfónico o etansulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido etan-1,2-disulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 2-naftalensulfónico, ácido 1,5naftalendisulfónico, ácido 2-, 3-ó 4-metilbencensulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclohexilsulfámico, ácido N-metil-, N-etil-o N-propilsulfámico, y otros ácidos protónicos orgánicos, tal como ácido ascórbico. Son ácidos inorgánicos adecuados, por ejemplo, los hidrácidos, tal como ácido clorhídrico, el ácido sulfúrico y el ácido fosfórico.

Los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención, en forma libre o en forma de sales farmacéuticamente aceptables, o las composiciones de los mismos, se utilizarán de forma general en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito buscado. Debe entenderse que la cantidad utilizada dependerá de la aplicación particular.

Para la administración tópica para tratar o prevenir las infecciones por VIH, se puede determinar una dosis terapéuticamente eficaz utilizando, por ejemplo, los ensayos in vitro proporcionados en los ejemplos. El tratamiento se puede aplicar mientras es visible la infección por VIH, o incluso cuando la misma no es visible. Un experto en la materia será capaz de determinar las cantidades terapéuticamente eficaces para tratar tópicamente infecciones por VIH sin llevar a cabo una experimentación innecesaria.

Para la administración sistémica, inicialmente se puede estimar una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para obtener un intervalo de concentraciones de peptidomimético de horquilla β en circulación que incluye el IC50 determinado en el cultivo celular (es decir, la concentración de un compuesto de

ensayo que resulta letal al 50% de cultivo celular). Dicha información se puede utilizar para determinar con más precisión las dosis útiles en humanos.

Las dosificaciones iniciales también se pueden determinar a partir de datos in vivo, por ejemplo en modelos animales, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. El experto en la materia podrá optimizar fácilmente la administración en humanos sobre la base de los datos en animales.

Las cantidades de dosificación para la aplicación como agentes anti-VIH se pueden ajustar individualmente a efectos de proporcionar niveles en plasma de los peptidomiméticos de horquilla β, según la presente invención, suficientes para mantener el efecto terapéutico. Se pueden alcanzar niveles en suero terapéuticamente eficaces administrando múltiples dosis cada día.

En casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva de los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención puede no estar relacionada con la concentración en plasma. El experto en la materia será capaz de optimizar las dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin llevar a cabo una experimentación innecesaria.

Evidentemente, la cantidad de peptidomiméticos de horquilla β administrada dependerá del sujeto que se esté tratando, de su peso, de la gravedad de la afección, de la forma de administración y del juicio del médico prescriptor.

La terapia anti-VIH se puede repetir intermitentemente mientras las infecciones son detectables, o incluso cuando no lo son. La terapia se puede proporcionar sola o en combinación con otros fármacos, tales como, por ejemplo, otros agentes anti-VIH o agentes anti-cáncer, u otros agentes antimicrobianos.

Normalmente, una dosis terapéuticamente eficaz de los peptidomiméticos de horquilla β descritos en el presente documento proporcionarán un beneficio terapéutico sin provocar ninguna toxicidad sustancial.

La toxicidad de los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando el LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) o el LD100 (la dosis letal para el 100% de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y el efecto terapéutico se conoce como índice terapéutico.

Son preferentes los compuestos que exhiben elevados índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de dichos ensayos en cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosis que no presenta toxicidad para su utilización en humanos. La dosificación de los peptidomiméticos de horquilla β según la presente invención está comprendida preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo en función de la forma de dosificación y la vía de administración utilizadas. La formulación exacta, la vía de administración y la dosis pueden ser seleccionadas por el médico individual teniendo en cuenta el estado del paciente (véase, por ejemplo, Fingl y otros 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics (“Base farmacológica de sustancias terapéuticas”), cap. 1, pág. 1).

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención con más detalle, pero no pretenden limitar su alcance en ningún sentido. En dichos ejemplos, se utilizan las siguientes abreviaciones:

HBTU: hexafluorofosfato de 1-benzotriazol-1-iltetrametiluronio (Knorr y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 19271930);

HOBt: 1-hidroxibenzotriazola;

DIEA: diisopropiletilamina;

HOAT: 7-aza-1-hidroxibenzotriazola;

HATU: hexafluorofosfato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)N,N,N’,N’-tetrametiluronio (Carpino y otros, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281).

1. Síntesis peptídica

Acoplamiento del primer residuo aminoácido protegido a la resina

Se rellenó un matraz seco con 0,5 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo (malla 100-200, matriz polimérica de copoli(estireno-1% DVB), Cat. No. 01-64-0114, Novabiochem, Merck Biosciences Ltd.) (Barlos y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946) (1,4 mmol/g, 0,7 mmol). La resina se suspendió en CH2Cl2 (2,5 ml) y se dejó hinchar a temperatura ambiente bajo agitación constante durante 30 min. La resina se trató con 0,49 mmol (0,7 eq) del primer residuo aminoácido adecuadamente protegido y 488 µl (4 eq) de diisopropiletilamina (DIEA) en CH2Cl2 (2,5 ml). La mezcla se agitó a 25oC durante 4 horas. La resina se agitó (CH2Cl2/MeOH/DIEA:

17/2/1), 30 ml durante 30 min; a continuación se lavó por este orden con CH2Cl2 (1x), DMF (1x), CH2Cl2 (1x), MeOH (1x), CH2Cl2 (1x), MeOH (1x), CH2Cl2 (2x), Et2O (2x), y se secó en vacío durante 6 horas.

La carga fue típicamente de 0,6-0,9 mmol/g.

Se preparó la siguiente resina precargada: resina FmocPro-2-clorotritilo. Síntesis del fragmento peptídico completamente protegido

La síntesis se llevó a cabo en un sintetizador Syropeptide (MultiSynTech GmbH) utilizando de 24 a 96 recipientes de reacción. En cada recipiente se colocaron aproximadamente 60 mg (peso de la resina antes de la carga) de la resina anterior. Se programaron y llevaron a cabo los siguientes ciclos de reacción:

Etapa Reactivo Tiempo

1 CH2Cl2, lavar e hinchar (manual) 1 x 3 min.

2 DMF, lavar e hinchar 1 x 60 min.

3 40% piperidina/DMF 2 x 5 min.

4 DMF, lavar 5 x 1 min.

5 5 equiv. Fmoc aminoácido/DMF

+ 5 eq. HBTU

+ 10 eq. DIEA 2 x 60 min. 6 DMF, lavar 5 x 1 min. 7 40% piperidina/DMF 2 x 5 min. 8 DMF, lavar 5 x 1 min. 9 CH2Cl2, lavar (al final de la síntesis) 3 x 1 min.

Las etapas 3 a 6 se repiten para añadir cada aminoácido. Método analítico:

Se determinaron los tiempos de retención de HPLC analítica (RT, en minutos) utilizando una columna Jupiter Proteo 90 A, 150 x 2,0 mm, (cod. 00F-4396-B0 -Phenomenex) con los siguientes disolventes A (H2O + 0,1% TFA) y B (CH3CN + 0,1% TFA) y el gradiente: 0 min: 95% A, 5% B; 0,5 min: 95% A, 5% B; 20 min: 40% A, 60% B; 21 min: 0% A, 100% B; 23 min: 0% A, 100% B; 23,1 min: 95% A, 5% B; 31 min: 95% A, 5% B. Formación del enlace disulfuro de cadena β

Tras la finalización de la síntesis, la resina se dejó hinchar en 3 ml de DMF seco durante 1 h. A continuación, se añadieron 10 eq. de solución de yodo en DMF (6 ml) al reactor, seguido de agitación durante 1,5 h. La resina se filtró y se añadió

una solución fresca de yodo (10 eq.) en DMF (6 ml), seguido de agitación durante 3 h adicionales. La resina se filtró y lavó con DMF (3x) y CH2Cl2 (3x).

Escisión, ciclación del esqueleto, desprotección y purificación del péptido

Tras la formación del enlace disulfuro de cadena β, la resina se suspendió en 1 ml (0,14 mmol) de 1% TFA en CH2Cl2 (v/v) durante 3 minutos y se filtró, y el filtrado se neutralizó con 1 ml (1,15 mmol) de 20% DIEA en CH2Cl2 (v/v). Este procedimiento se repitió dos veces para asegurar la finalización de la escisión. La resina se lavó tres veces con 1 ml de CH2Cl2. La capa de CH2Cl2 se evaporó hasta sequedad.

Las sustancias volátiles se eliminaron y se añadieron 8 ml de DMF seco al tubo. A continuación, se añadieron 2 eq. de HATU en DMF seco (1 ml) y 4 eq. de DIPEA en DMF seco (1 ml) al péptido, seguido de agitación durante 16 h. Las sustancias volátiles se evaporaron hasta sequedad. El péptido crudo ciclado se disolvió en 7 ml de CH2Cl2 y se extrajo con 10% acetonitrilo en H2O (4,5 ml) tres veces. La capa de CH2Cl2 se evaporó hasta sequedad. Para desproteger completamente el péptido, se añadieron 3 ml de cóctel de escisión TFA:TIS:H2O (95:2,5:2,5), y la mezcla se prosiguió durante 2,5 h. Las sustancias volátiles se evaporaron hasta sequedad y el péptido crudo se disolvió en 20% AcOH en agua (7 ml) y se extrajo con isopropil éter (4 ml) tres veces. La capa acuosa se recuperó y se evaporó hasta sequedad, y el residuo se purificó por HPLC de fase inversa preparativa.

Tras la liofilización, los productos se obtuvieron en forma de polvo blanco y se analizaron mediante el método analítico HPLC-ESI-MS descrito anteriormente. Se indican los datos analíticos que comprenden la pureza tras la HPLC preparativa y ESI-MS.

Ejemplo 1: el péptido se sintetizó empezando por el aminoácido L-Pro, injertado en la resina. La resina de partida era resina Fmoc-Pro-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro-DPro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-DPro-Ala-Ser-Cys-Ala-His-Tyr. Se introdujo un enlace disulfuro de cadena β tal como se ha descrito anteriormente. El producto se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y se

purificó tal como se ha indicado mediante LC-MS de fase inversa preparativa.

Tras la liofilización, el producto se obtuvo en forma de polvos blancos y se analizó mediante el método analítico HPLCESI-MS descrito anteriormente ([M+2H]2+: 933,1; RT: 10,47; pureza UV: 72%).

Ejemplo 2: el péptido se sintetizó empezando por el aminoácido L-Pro, injertado a la resina. La resina de partida era resina Fmoc-Pro-2-clorotritilo, que se preparó tal como se ha descrito anteriormente. El péptido lineal se sintetizó sobre un soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro-DPro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-DPro-Ala-Ser-Cys-Tyr-His-Tyr. Se introdujo un enlace disulfuro de cadena β tal como se ha descrito anteriormente. El producto se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y se purificó tal como se ha indicado mediante LC-MS de fase inversa preparativa.

Tras la liofilización, el producto se obtuvo en forma de polvo blanco y se analizó mediante el método analítico HPLC-ESIMS descrito anteriormente ([M+2H]2+: 978,6; RT: 10,95; pureza UV: 82%).

2. Métodos biológicos

2.1. Preparación de los péptidos

Los péptidos liofilizados se pesaron en una Microbalance (Mettler MT5) y se disolvieron en agua estéril hasta una concentración final de 1 mM, a menos que se indique lo contrario. Las soluciones madre se mantuvieron a +4oC y protegidas de la luz.

2.2. Ensayo Ca2+: actividad antagonista de CXCR4 de los péptidos.

Los aumentos en el calcio intracelular se controlaron utilizando un Flexstation 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) para determinar el antagonismo de CXCR4 de los péptidos en un ratón de línea celular pre-B 300-19 transfectado de forma estable con CXCR4 humano [véanse referencias 1, 2 y 3, a continuación]. Las células se cargaron por lotes con el equipo de ensayo Calcium 3 Assay kit (Molecular Devices) en tampón de ensayo (solución salina de Hanks equilibrada, HBSS, 20 mM HEPES, pH 7,4, 0,1% BSA) durante 1 h a temperatura ambiente y a continuación se introdujeron 200.000 células marcadas en placas de ensayo negras de 96 pocillos (Costar No. 3603). Se añadió una solución de péptido

concentrada veinte veces en tampón de ensayo a las células y se centrifugó toda la placa a efectos de depositar las células en el fondo de los pocillos. La movilización del calcio inducida por factor-1 derivado de estroma (SDF-1) 10 nM se midió en el Flexstation 384 (excitación, 485 nm; emisión, 525 nm) durante 90 segundos. Se utilizó un cambio máximo en la respuesta de fluorescencia por encima de la línea de base para calcular la actividad antagonista. Los datos para las curvas de respuesta a la dosis (concentración de antagonista frente a % de respuesta máxima) se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros utilizando SoftmaxPro 4.6 (Molecular Devices), a partir de la cual se calcularon los valores de IC50%.

2.3. Ensayo FIGS™

El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con la ref. 5, a continuación. Se prepararon diluciones madre de los péptidos (10 µM) disolviéndolos en Tris-HCl 10 µM a temperatura ambiente. Las soluciones madre se mantuvieron a +4oC y protegidas de la luz. Se prepararon diluciones de trabajo extemporáneamente mediante la dilución en serie en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añadieron en un volumen final de 10 µl directamente a los cultivos celulares. Tras 48 horas de co-cultivo, los cultivos se enjuagaron con PBS y a continuación se expusieron a glutaraldehído/formaldehído (0,2% / 2%) en PBS durante cinco minutos. Para la cuantificación fotométrica, los cultivos fijados se incubaron posteriormente con orto-nitro-fenil-galactopiranósido (ONPG) como substrato de β-galactosidasa, que se convirtió enzimáticamente en el cromóforo orto-nitrofenol (ONP). La lectura se obtuvo directamente midiendo la densidad óptica de los pocillos a 405 nm en un lector de placa de 96 pocillos iEMS.

2.4. Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de los péptidos en células HELA (Acc57) y células COS-7 (CRL-1651) se determinó utilizando el ensayo de reducción MTT [véase ref. 6 y 7, a continuación]. De forma resumida, el método consistía en lo siguiente: se sembraron células HELA y células COS-7 a razón de 7,0 x 103 y, respectivamente, 4,5 x 103 células por pocillo y se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos durante 24 horas a 37oC a 5% de CO2. En este instante, se determinó el tiempo cero (Tz) mediante reducción MTT (véase a continuación). El sobrenadante de los pocillos restantes se descartó y se pipetearon medio fresco y

los péptidos en diluciones en serie de 12,5, 25 y 50 µM al interior de los pocillos. Cada concentración de péptido se midió por triplicado. La incubación de las células se prosiguió durante 48 horas a 37oC a 5% de CO2. Posteriormente, los pocillos se lavaron una vez con PBS y a continuación se añadieron 100 µl de reactivo MTT (0,5 mg/ml en medio RPMI1640 y, respectivamente, DMEM) a los pocillos. Se incubaron a 37oC durante 2 horas y a continuación el medio se aspiró y se añadieron 100 µl de isopropanol a cada pocillo. Se midió la absorbancia a 595 nm del producto solubilizado (OD595péptido). Para cada concentración, se calcularon promedios a partir de triplicados. El porcentaje de crecimiento se calculó como sigue:

(OD595péptido-OD595Tz-OD595Pocillo vacío) / (OD595Tz-OD595Pocillo vacío) x 100% y se representó para cada concentración de péptido. Los valores de LC50 (concentración letal, definida como la concentración que destruye el 50% de las células) se determinaron para cada péptido utilizando la función de línea de tendencia de EXCEL (Microsoft Office 2000) para las concentraciones (50, 25, 12,5 y 0 µM), los porcentajes de crecimiento correspondientes y el valor -50, (=TREND(C50:C0,%50:%0,-50)). Las concentraciones de GI 50 (inhibición del crecimiento) se calcularon para cada péptido utilizando una función de línea de tendencia para las concentraciones (50, 25, 12,5 y 0 µg/ml), los porcentajes correspondientes y el valor 50, (=TREND (C50: C0, %50: %0,50).

2.5. Cultivo celular

Se cultivaron células ‘CCR5’ en medio DMEM con 4.500 mg/ml de glucosa, 10% de suero bovino fetal (FBS), complementado con 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina (Pen/Estrept.). Las células Hut/4-3 se mantuvieron en medio RPMI, 10% de FBS, complementado con Pen/Estrept. y 10 mM de HEPES. Las células HELA y las células CCRF-CEM se mantuvieron en RPMI1640 más 5% de FBS, Pen/Estrept y 2 mM de L-glutamina. Las células Cos-7 se cultivaron en medio DMEM con 4.500 mg/ml de glucosa complementada con 10% de FCS, Pen/Estrept. y 2 mM de L-glutamina. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37oC a 5% de CO2. El medio celular, los complementos del medio, el tampón PBS, HEPES, Pen/Estrept., Lglutamina y los sueros se adquirieron a través de Gibco (Pailsey,

Reino Unido). Todos los productos químicos finos se obtuvieron a través de Merck (Darmstadt, Alemania).

2.6. Hemólisis

Se realizaron ensayos en los péptidos para determinar su actividad hemolítica frente a glóbulos rojos humanos (hRBC). Los hRBC frescos se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante centrifugación durante 10 min a 2.000 x

g. Los péptidos se incubaron a una concentración de 100 µM con 20% v/v de hRBC durante 1 hora a 37oC. La concentración final de eritrocitos fue aproximadamente de 0,9 x 109 células por ml. Se determinó un valor de 0%, respectivamente 100%, de lisis celular mediante incubación del hRBC en presencia de PBS solo y, respectivamente, 0,1% de Triton X-100 en H2O. Las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se diluyó 20 veces en tampón PBS, y se midió la densidad óptica (OD) de dicha muestra a 540 nM. El valor del 100% de lisis (OD540H2O) dio un OD540 de aproximadamente 1,3-1,8. El porcentaje de hemólisis se calculó como sigue: (OD540péptido/OD540H2O) x 100%.

2.7. Ensayo quimiotáctico (ensayo de migración celular)

La respuesta quimiotáctica de las células CCRF-CEM al gradiente de factor 1α derivado de célula estromal (SDF-1) se midió utilizando placas de ensayo desechables de Neuroprobe (5 µm de tamaño de poro) (Gaithersburg, MD, EE.UU.), según las indicaciones del fabricante y las referencias citadas [particularmente, la ref. 8, a continuación]. Resumiendo, se lavó un matraz de 175 cm3 una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dubecco (DPBS), y se tripsinizó durante 10 minutos o hasta que las células se habían elevado. La tripsina se neutralizó mediante la adición de medio fresco con contenido en suero y las células se granularon, se lavaron una vez en DPBS, y se volvieron a suspender a razón de 10,5 x 107 células/ml en RPMI + 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA). Se mezclaron 45 µl de suspensión celular con 5 µl de péptido PEM concentrado 10 veces diluido en el mismo medio de ensayo. Se aplicaron 35 µl de esta mezcla sobre el filtro de ensayo. Las células se dejaron migrar (a 37oC) a la cámara inferior de la placa de ensayo que contenía 1 nM de SDF-1. Tras 4 horas, el filtro se eliminó y se añadió MTT a las células migradas hasta una concentración final de 0,5 mg/ml, y se incubaron durante 4 horas adicionales. Tras marcar con MTT, se eliminó todo el medio y se añadieron 100 µl de isopropanol + 10 mM de HCl a las células. La

absorbancia óptica a 595 nm (ABS595) se midió utilizando un lector de placas Tecan Genios con software Magellan. El número de células migradas se determinó comparando los valores de ABS595 frente a una curva estándar generada con un número conocido de células en la placa de ensayo, y los valores se representaron frente a la concentración de SDF-1 a efectos de obtener una curva sigmoidal y determinar los valores de IC50. Los valores de IC50 se determinaron utilizando la función de línea de tendencia de Microsoft Excel ajustando una curva logarítmica a los puntos de datos promediados.

2.8 Estabilidad de plasma

Se colocaron 405 µl de solución de plasma/albúmina en un tubo de polipropileno (PP) y se inocularon con 45 µl de compuesto de una solución B 100 µM, derivada de 135 µl de PBS y 15 µl de péptido 1 mM en PBS, pH 7,4. Se transfirieron alícuotas de 150 µl a pocillos individuales de la placa de filtro de 10 kDa (membrana Millipore MAPPB 1010 Biomax). Para los “controles de 0 minutos”: se introdujeron 270 µl de PBS en un tubo de PP, se añadieron 30 µl de solución B stock y se homogeneizó por agitación. Se introdujeron 150 µl de solución de control en un pocillo de la placa de filtro, lo que se utilizó como “control filtrado”.

Se introdujeron otros 150 µl de solución de control directamente en un pocillo receptor (reservado para filtrado) y el mismo se utilizó como “control no filtrado”. La placa entera, incluyendo la tapa de evaporación, se incubó durante 60 min a 37oC. Se centrifugaron muestras de plasma (plasma de rata: Harlan Sera lab, Reino Unido; plasma humano: Blutspendezentrum, Zurich) como mínimo durante 2 h a 4.300 rpm (3.500 g) y 15oC a efectos de obtener 100 µl de filtrado. Para las muestras de “albúmina de suero” (albúmina humana recién preparada: Sigma A-4327; albúmina de rata: Sigma A-6272, todas a una concentración de 40 mg/ml en PBS), es suficiente aproximadamente 1 hora de centrifugación. Los filtrados en la placa receptora de PP se analizaron mediante LC/MS como sigue: Columna: Jupiter C18 (Phenomenex); fases móviles: (A) 0,1% de ácido fórmico en agua y (B) acetonitrilo, gradiente: 5%100% (B) en 2 minutos, ionización por electrospray, detección por MRM (triple cuadrípolo). Se determinaron las áreas de pico y se promediaron valores por triplicado. El enlazamiento se expresa en porcentaje del control (filtrado no filtrado, punto temporal 0 min) 1 y 2 por: 100-(100 * T60/T0). A continuación, se calcula el promedio de estos valores (véase ref. 9, a continuación).

3.0 Estudios en vivo

3.1. Dosis máxima tolerada en ratones a) Se administró el compuesto del ejemplo 1, dispersado en agua para inyección ó 0,9% de solución salina fisiológica), en el estudio preliminar por inyección i.v. con dosis de 35, 50, 70, 85, 100, 150, 250 ó 500 mg/kg a grupos consistentes en un macho y una hembra de ratón (Crl:CD1(ICR)). Además, dos grupos compuestos por dos machos y dos hembras de ratón recibieron dosis de 90 y 100 mg/kg, respectivamente, y la dosis de 50 mg/kg se repitió en un grupo comprendido por un macho y una hembra. b) Se llevaron a cabo estudios de dosis máxima tolerada (MTD) con el compuesto del ejemplo 2 utilizando ratones CD1 (3 ratones/grupo) y se llevaron a cabo por administración i.v., i.p. y s.c.

3.2 Estudios de toxicidad repetida en ratones

La toxicidad y la toxicocinética del compuesto del ejemplo 1 se investigó haciendo un seguimiento de una inyección diaria i.v. en los ratones durante, como mínimo, 14 días. Grupos de 12 ratones macho y 12 ratones hembra Crl:CD1(ICR) recibieron preparaciones de dosis que contenían artículo de control (50 mM de tampón de dihidrógeno ortofosfato de sodio que contenía 0,9% p/v de cloruro de sodio) u 8, 24, ó 40 mg/kg/día de POL6326 a un volumen de dosis de 5 ml/kg. Se incluyeron grupos satélite de 24 animales por sexo por grupo en cada nivel de dosis. La evaluación de la toxicidad se basó en la mortalidad, los síntomas clínicos, el peso corporal, el consumo de alimentos, el examen oftalmológico, las patologías clínicas y anatómicas y las evaluaciones toxicocinéticas.

3.3 Movilización de células madre a) Modelo de ratones:

El objetivo del estudio era evaluar la capacidad del compuesto del ejemplo 1 y el ejemplo 2 para movilizar progenitores hematopoyéticos de médula ósea de ratón a la sangre periférica utilizando ensayos de colonias hematopoyéticas in vitro. En humanos, una información precisa sobre la movilización de células progenitoras es proporcionada por el ensayo de unidad formadora de colonias granulocítico-macrofágicas (CFU-GM) o determinando la abundancia de células CD34(+) mediante análisis FACS (véase ref. 10, a continuación). En ratones, el CD34 no es un marcador útil

para las células madre; en su lugar se utiliza más habitualmente el CFU-GM (véase ref. 11, a continuación).

A efectos de evaluar la capacidad de los compuestos del ejemplo 1 y el ejemplo 2 para movilizar células madre murinas (CFUGM), se inyectaron ratones hembra C3H/HeJ (Jackson Laboratory) con una inyección s.c. de 5 mg/kg de los compuestos del ejemplo 1 y del ejemplo 2, y como referencia AMD3100 (Broxmeyer y otros, J Exp Med 201, 1307-1318), (actualmente en fase III de ensayos clínicos) para la movilización de células madre. Se tomaron muestras de sangre periférica de 5 animales por grupo de ensayo en cada. Temporal y se llevaron a cabo conteos de células nucleadas como ensayos estándar. b) Modelo de mono:

Se llevó a cabo una evaluación de movilización de células madre hematopoyéticas de sangre periférica en macacos cangrejeros (Macaca fascicularis). El compuesto del ejemplo 1 se administró a 4 monos (2 machos y 2 hembras) como inyección i.v. en bolo durante 2 minutos y se determinaron las células CD34(+) mediante análisis FACS. También se llevaron a cabo tomas de muestra de sangre toxicocinética.

4.0. Resultados

Los resultados de los experimentos descritos en los puntos anteriores 2.2-2.8 se indican en las siguientes tablas 1 y

2. Tabla 1

Ej.: IC50 (nM) ensayo Ca2+ FIGS IC50 (nM) Citotoxicidad LC50/GI50 células Hela Hemólisis a 100 µM IC50 (µM) ensayo de migración celular

1: 5,5 n.d. >50 0,6 n.d.

2: 4,1 24,7 94 0,3 0,5

n.d.: no determinado

Tabla 2

Ej.: Estabilidad plasma humano t1/2 (min) Estabilidad plasma de rata t1/2 (min)

1: >240 >240

2: >300 >300

Los resultados del experimento descrito en 3.1-3.3 se indican a continuación.

4.1: Estudio MTD en ratones a) estudio MTD, compuesto del ejemplo 1

Se puso de manifiesto que la dosis intravenosa letal mínima aguda del ejemplo 1 en el ratón era superior a 90 mg/kg. b) estudio MTD, compuesto del ejemplo 2

La dosis más elevada ensayada para las tres vías de administración fue de 120 mg/kg de bolo. A esta dosis, todos los animales sobrevivieron y solo se observaron síntomas leves. Los síntomas exhibidos fueron una leve depresión conductual, una leve cianosis, un aumento de la profundidad de respiración y relajación muscular.

4.2: Toxicidad de inyección intravenosa durante 14 días y estudio toxicocinético El nivel NOAEL para el compuesto del ejemplo 1 tras la aplicación i.v. de dosis en el ratón fue de 40 mg/kg/día.

No se observó un efecto notable del tratamiento sobre el peso corporal, el cambio de peso corporal o el consumo de alimentos, ni en las observaciones oftalmológicas durante la semana final de la fase de aplicación de la dosis.

La administración del compuesto del ejemplo 1 se asoció con unos conteos de leucocitos y de linfocitos absolutos ligeramente más elevados para las hembras a las que se administraron 40 mg/kg/día. Los machos a los que se administraron 40 mg/kg/día no se vieron afectados de forma similar, y estos efectos menores no se consideraron adversos. Los resultados de la química clínica no se vieron afectados por la administración del compuesto del ejemplo 1. Los aumentos en los pesos de los órganos (los riñones en los machos a los que se administraron 8 mg/kg/día y las vesículas seminales en los machos a los que se administraron 24 ó 40 mg/kg/día) se consideraron coyunturales y no relacionados con el tratamiento. No se registraron lesiones visibles relacionadas con el artículo ensayado. Tres animales (1 grupo de control de hembras, 1 macho a 8 mg/kg/día y 1 hembra a 24 mg/kg/día) presentaron una zona focal, roja, con costra, en el lugar de inyección (cola), resultado de las punciones con aguja hipodérmica. No se observaron lesiones microscópicas relacionadas con el artículo ensayado.

4.3 Movilización de células madre a) Movilización de células madre en ratones, compuesto del ejemplo 1:

La administración de 5 mg/kg del compuesto del ejemplo 1 hizo aumentar los números en células sanguíneas de CFU-GM con un efecto máximo a los 120 minutos y retorno a los niveles de línea de base 6 h después de la administración. (Figura 1). En el mismo ensayo, se utilizó AMD3100 (actualmente en fase III de ensayos clínicos para la movilización de células madre) como comparador. En un estudio de seguimiento, se determinó la respuesta a la dosis del ejemplo 1 sobre la liberación de CFU-GM (figura 1). Existe un claro efecto de respuesta a la dosis del ejemplo 1 sobre la liberación de CFU-GM en ratones con un aumento de nivel de pico a 5 mg/kg. Figura 1. Aumento de unidades formadoras de colonias por ml de sangre (CFU-GM) a lo largo del tiempo para el compuesto del ejemplo 1 (5 mg) y el compuesto de referencia AMD3100.

b) Movilización de células madre en ratones, compuesto

del ejemplo 2: La administración de 5 mg/kg del compuesto del ejemplo 2 aumentó los números en células sanguíneas de CFU-GM hasta seis horas tras la administración con un efecto máximo a los 240 minutos, mientras que la administración de AMD3100 se asocia con un aumento de la frecuencia y el número de progenitores a los 30 y 60 minutos en comparación con los ratones de control (figura 2). Figura 2. Aumento de unidades formadoras de colonias por ml de sangre (CFU-GM) a lo largo del tiempo para el compuesto del ejemplo 2 y el compuesto de referencia AMD3100.

c) Movilización de células madre en monos, compuesto

del ejemplo 1: La administración del compuesto del ejemplo 1 indujo la movilización de células hematopoyéticas CD34(+) en macacos cangrejeros. Tal como se observó en los ratones, el inicio de la movilización fue rápido, con un pico a las dos horas. La movilización también fue temporal y los

números de células madre en sangre periférica volvieron al nivel de línea de base con niveles decrecientes en plasma del compuesto del ejemplo 1 (figura 3). Figura 3. Promedio de células CD34(+) por µl de sangre a lo largo del tiempo para el compuesto del ejemplo 1.

Referencias

1.: Oberlin E, Amara A, Bachelerie F, Bessia C, Virelizier J-L, Arenzana-Seisdedos F, Schwartz O, Heard J-M, Clark- Lewis I, Legler DF, Loetscher M, Baggiolini M, Moser B. Nature. 1996, 382:833-835

2.: Loetscher M, Geiser T, O’Reilly T, Zwalen R, Baggiolini M, Moser B. J.Biol.Chem. 1994. 269: 232-237

3.: D’Apuuo M, Rolink A, Loetscher M, Hoxie JA, Clark- Lewis I, Melchors F, Baggiolini M, Moser B. Eur. J. Immunol. 1997.

27: 1788-1793

4.: von Tschamer V, Prod’hom B, Baggiolini M, Reuter H. Nature. 1986. 324: 369-72.

5.: Hamy F, Felder ER, Heizmann G, Lazdins J, Aboul-ela F, Varani G, Karn J, Klimkait T. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. 94: 3548-3553.

6.: Mossman T. J. Immunol. Met. 1983, 65: 55-63

7.: Berridge MV, Tan AS. Arch. Biochem. Biophys. 1993,

303: 474-482

8.: Frevert CW, Wong VA, Goodman RV, Goodwin R, Martin TR, J. Immunol. Met. 1998. 213: 41-52

9.: Singh R., Chang, S.Y., Talor, L.C., Rapid Commun. Mass Spectrom., 1996, 10: 1019-1026

10.: To LB, Hailock DN, Simmons PJ, Juttner CA. Blood 1997, 89(7): 2233-2258.

11.: Broxmeyer HE, Orschell CM, Clapp DW, Hangoc G, Cooper S, Plett PA y otros J. Exp. Med. 2005. 201(8): 1307-1318.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Ciclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys- Tyr-Arg-Gln-Lys-DPro-Pro), enlace disulfuro entre Cys4 y Cys11, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, siendo X Ala o Tyr.
2.

Compuestos, según la reivindicación 1, para su utilización como sustancias terapéuticamente activas.
3.

Compuestos, según la reivindicación 1, que presentan actividad antagonista de CXCR4 y resultan útiles para prevenir las infecciones por VIH en individuos sanos o para ralentizar y detener la progresión viral en pacientes infectados; o un cáncer mediado por la actividad del receptor CXCR4 o resultante de la misma; o enfermedades inmunológicas mediadas por la actividad del receptor CXCR4 o resultantes de la misma; o para tratar una inmunosupresión;

o para tratar inflamaciones, o para la movilización de células madre de células madre de sangre periférica y/o células madre mesenquimales (MSC) y/u otras células madre cuya retención depende del receptor CXCR4.
4.

Composición farmacéutica que contiene un compuesto, según la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente inerte.
5.

Composiciones, según la reivindicación 4, en una forma adecuada para su administración oral, tópica, transdérmica, por inyección, bucal, transmucosal, pulmonar o por inhalación.
6.

Composiciones, según la reivindicación 4 ó 5, en forma de comprimidos, grageas, cápsulas, soluciones, líquidos, geles, parches, cremas, pomadas, jarabe, emulsiones, suspensiones, aerosoles, nebulizadores o supositorios.
7.

Utilización de compuestos, según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento antagonista de CXCR4.
8.

Utilización, según la reivindicación 7, en la que dicho medicamento antagonista de CXCR4 se pretende utilizar para prevenir las infecciones por VIH en individuos sanos o para ralentizar y detener la progresión viral en pacientes infectados; o un cáncer mediado por la actividad del receptor CXCR4 o resultante de la misma; o enfermedades inmunológicas mediadas por la actividad del receptor CXCR4 o resultantes de la misma; o para tratar una inmunosupresión; o para la movilización de células madre de células madre de sangre periférica y/o células madre mesenquimales (MSC) y/u otras células madre cuya retención depende del receptor CXCR4.
9. Procedimiento para la preparación de compuestos,

según la reivindicación 1, que comprende

(a)

acoplar un soporte sólido apropiadamente funcionalizado con un derivado apropiadamente N- protegido de Pro;

(b)

eliminar el grupo N-protector del producto obtenido en la etapa (a);

(c)

acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado apropiadamente N-protegido de DPro;

(d)

eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo;

(e)

acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado apropiadamente N-protegido del aminoácido que en el producto final deseado se encuentra en la posición 14, es decir, Lys, estando igualmente el grupo amino presente en su cadena lateral adecuadamente protegido;

(f)

eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo;

(g)

llevar a cabo etapas sustancialmente correspondientes a las etapas (e) y (f), pero utilizando derivados apropiadamente N-protegidos de los aminoácidos que en el producto final deseado se encuentran en las posiciones 13 a 1, es decir Gln, Tyr, Cys, Tyr, Arg, Dab, DPro, Ala, Ser, Cys, Ala o Tyr, His y Tyr, estando del mismo modo apropiadamente protegido cualquier grupo funcional que pueda estar presente en dichos derivados aminoácidos N-protegidos;

(h)

formar el enlace disulfuro de cadena β entre las cadenas laterales de los residuos Cys de las posiciones 4 y 11;

(i)

separar el producto obtenido de este modo del soporte sólido;

(j)

ciclar el producto separado del soporte sólido;

(k)

eliminar cualquier grupo protector presente en los grupos funcionales de todos los miembros de la cadena de residuos aminoácidos; y

(l)

si se desea, convertir el producto obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable,

obtenida de este modo, en el correspondiente compuesto libre o en una sal diferente farmacéuticamente aceptable.