ES2350255T3 - Los péptidos natriuréticos y el factor de crecimiento placentario/receptor soluble de vegf discriminan la disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca con respecto a una disfunción cardíaca asociada a la placenta en la mujer gestante. - Google Patents

Abstract

Método para el diagnóstico de una mujer gestante afecta de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca o asociada a la placenta, que comprende las etapas de a) medir in vitro en una muestra de una mujer gestante los niveles de ai) un péptido natriurético aii) al menos un péptido seleccionado del grupo formado por factor de crecimiento placentario (PlGF) y tirosina quinasa similar al fms soluble (sFlt-1) o variantes de los mismos. b) comparar los resultados obtenidos con valores de referencia en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un valor aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indican la presencia de una disfunción asociada a la placenta, o en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un valor no disminuido del factor de crecimiento placentario y/o un nivel no aumentado de sFlt-1 o una variante del mismo indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca.

Description

La presente invención se refiere a la utilización de

biomarcadores para el diagnóstico de la disfunción cardíaca en la mujer gestante, en particular para distinguir la disfunción cardíaca asociada a la placenta de la disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca.

La preclampsia es una de las patologías más frecuentes de la gestación, que afecta aproximadamente al 5% de los

embarazos.

Es una causa importante de mortalidad y

morbilidad

materna, muertes perinatales, nacimientos

pretérmino

y retraso del crecimiento intrauterino. La

preclampsia

es un síndrome de hipertensión, edema y

proteinuria, síntomas que aparecen a partir de la 20a semana de gestación y que se detectan habitualmente mediante el control rutinario de la presión arterial de la mujer y de la orina. La preclampsia se diagnostica cuando una mujer gestante desarrolla elevación de la presión arterial (dos lecturas independientes tomadas con una separación de al menos 6 horas de 140/90 o más) y 300 mg de proteínas en una muestra de orina de 24 horas

(proteinuria). La preclampsia también es más frecuente en

-2 –

mujeres que presentan hipertensión previa, diabetes, o patología renal, en mujeres con historia familiar de preclampsia y en mujeres con gestación múltiple (gemelos, trillizos o más). Existen hallazgos clave que apoyan un modelo causal o patogénico de placentación superficial debida a una adaptación inmunitaria anómala, con una disminución subsiguiente de las concentraciones de factores de crecimiento angiogénicos y un incremento de los desechos placentarios en la circulación materna que provoca una respuesta inflamatoria materna. Las mujeres con riesgo se identifican sobre la base de factores de riesgo epidemiológicos y clínicos, pero los criterios diagnósticos de la preclampsia no son claros.

La gestación supone la formación coordinada de nuevos vasos, un proceso conocido como angiogénesis. Diversos factores de crecimiento y receptores específicos, por ejemplo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento placentario (PlGF) y los Flts-1 solubles (sFlts-1), juegan un papel esencial en este proceso. La preclampsia se asocia a la expresión aberrante de estas moléculas, que puede medirse en muestras de sangre de mujeres gestantes. El VEGF es un mitógeno específico de las células endoteliales, un inductor angiogénico y un mediador de la permeabilidad vascular. Se ha demostrado que el VEGF es importante para la reparación de los capilares glomerulares. VEGF se une a un homodímero del receptor tirosín quinasa que atraviesa la membrana, la tirosín

quinasa similar a fins (Flt-1), la cual se expresa

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diferencialmente en células endoteliales obtenidas de diferentes tejidos. Flt-1 tiene una expresión elevada en células trofoblásticas que contribuye al desarrollo placentario. PlGF es expresado por los citotrofoblastos y sincitiotrofoblastos y es capaz de inducir la proliferación, migración y activación de las células endoteliales. PlGF se une en forma de homodímero al receptor Flt-1. Tanto PlGF como VEGF contribuyen a la actividad mitogénica y la angiogénesis que son críticas para el desarrollo de la placenta. sFlt-1 una variante de empalme del receptor Flt-1, que carece de los dominios transmembrana y citoplásmico del receptor, se une a VEGF con una afinidad alta pero no estimula la mitogénesis de las células endoteliales. Se expresa en tejido placentario así como en las células endoteliales de la vena umbilical

humana.

Se considera que sFlt-1 disminuye la vía de

señalización de VEGF.

Diversos

estudios han sugerido que las mujeres que

desarrollan preclampsia tienen riesgo de complicaciones cardiovasculares a lo largo de la vida. Diversos factores de riesgo y alteraciones patofisiológicas de la preclampsia son similares a los de la enfermedad coronaria. Se ha implicado la resistencia a la insulina como factor común. La disfunción microvascular, que se asocia con la resistencia a la insulina, podría predisponer tanto a la enfermedad cardíaca coronaria como a la preclampsia. Además de las formas de disfunción cardíaca inducidas por la placenta, también pueden ser causa de disfunción

cardíaca en la mujer gestante las disfunciones cardíacas

-4 –

primarias.

La causa principal de disfunción cardíaca

primaria

son las enfermedades cardíacas valvulares

congénitas

y adquiridas, así como las enfermedades

miocárdicas.

En la patente US 2004/0126828 A1 se da a conocer un método para controlar la preclampsia en la mujer gestante mediante la medición de sFlt-1, VEGF o el polipéptido PlGF.

Los autores señalan que los niveles de sFlT-1 están elevados en muestras sanguíneas de mujeres con preclampsia. sFLt-1 se une a VEGF y PlGF con una afinidad elevada y bloquea la actividad mitogénica y angiogénica de estos factores de crecimiento. Los autores sugieren que el sFLt-1 circulante en pacientes con preclampsia podría oponerse a la relajación vascular, contribuyendo de este modo a la hipertensión. Además, la patente US 2005/0025762 A1 da a conocer métodos para el tratamiento de la preclampsia y la eclampsia utilizando compuestos que disminuyen los niveles de sFlt-1, y compuestos que inhiben la unión de VEGF o PlGF a sFlt-1. Sin embargo, las disfunciones cardíacas de las mujeres gestantes parece que no son detectadas mediante la medición exclusiva de estos factores de crecimiento angiogénicos.

La patente DE102004051847 da a conocer un método para el diagnóstico de la aterosclerosis mediante la medición del nivel de PlGF y sFlt-1, comprendiendo dicho método la medición de la relación entre PlGF y sFlt-1. El nivel aumentado de PlGF en pacientes afectos de infarto de miocardio se relaciona con el riesgo aumentado de eventos

vasculares adicionales. Sin embargo, los autores predicen

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que el método reivindicado solamente se refiere a enfermedades vasculares de etiología aterosclerótica, la preclampsia o la eclampsia están excluidas del método reivindicado.

Además, han habido intentos de determinar si puede utilizarse el péptido natriurético cerebral (BNP) como marcador bioquímico en mujeres gestantes afectas de preclampsia. Resnik y otros, (American Journal of Obstetrics and Gynecology (2005) 193, 450-4) hallaron que los niveles de BNP están elevados en la preclampsia grave en comparación con gestaciones normales. Los autores suponen que el estrés ventricular y/o una disfunción cardíaca subclínica están asociados con la preclampsia. Sin embargo, Resnik no describe si la disfunción cardíaca de la mujer gestante está causada por la preclampsia o si los síntomas son debidos a eventos cardíacos preexistentes.

Sin embargo, la determinación exclusiva del péptido natriurético no aporta evidencia sobre la causa de la disfunción cardíaca en la mujer gestante, porque no se detectan otras causas como la insuficiencia placentaria. Por lo tanto, en el estado de la técnica no existe actualmente ningún procedimiento diagnóstico que permita diferenciar si la disfunción cardíaca en la mujer gestante

es

causada por una disfunción cardíaca asociada a la

placenta

o si es causada por una enfermedad cardí aca

primaria.

Por ello, es un objetivo de la presente invención el dar a conocer métodos y medios para un diagnóstico mejorado

de las disfunciones cardíacas en la mujer gestante, en

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particular para discriminar entre la disfunción cardíaca asociada a la placenta y la enfermedad cardíaca primaria.

La presente invención se refiere a un método para diagnosticar si una mujer gestante está afecta de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca

o si está asociada a la placenta, que comprende las etapas de a) medir in vitro en una muestra de una mujer gestante, los niveles de ai) un péptido natriurético en una muestra aii) al menos un péptido seleccionado del grupo formado por factor de crecimiento placentario y sFlt-1 o variantes de los mismos comparando los resultados obtenidos con valores de referencia en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un nivel aumentado de sFlt-1 del mismo indica la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta o en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel no disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un nivel no aumentado de sFlt-1

o variantes de los mismos indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca.

Además, la presente invención se refiere a un método de apoyo a la decisión para el posible tratamiento de una enfermedad gestante que está afecta de una disfunción cardíaca, que comprende las etapas de a) medir in vitro en una muestra de una mujer gestante, los niveles de ai) un péptido natriurético aii) al menos un péptido seleccionado del grupo formado por factor de crecimiento placentario y

sFlt-1 o variantes de los mismos b) comparar los resultados

-7 –

obtenidos con valores de referencia c) en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un nivel aumentado de sFlt-1 del mismo indica la presencia de una disfunción

cardíaca

asociada a la placenta o en el que un nivel

aumentado

de un péptido natriurético y un nivel no

disminuido de

Factor

de crecimiento placentario y/o un nivel no

aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca, d) recomendar el inicio de tratamiento de ya sea la disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca o la disfunción cardíaca asociada a la placenta, dependiendo de los resultados obtenidos en la etapa c).

La figura 1 muestra los diagramas de caja de los valores de referencia de las concentraciones de NTproBNP. N representa el número de pacientes. La primera columna muestra la concentración de NT-proBNP en 508 mujeres donantes de sangres de edades entre 18 y 44,9 años, que eran aparentemente sanas. Este valor de referencia se compara con la concentración de NTproBNP de 55 mujeres gestantes clasificadas en 9 mujeres en el segundo trimestre de gestación y 46 mujeres en el tercer trimestre de gestación. No existen diferencias significativas aparentes en la concentración de NT-proBNP entre estos grupos. Además, se indican la mediana y los percentiles 75, 95 y 5 y

25.

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La Figura 2 muestra los diagramas de caja de los valores de referencia determinados de las concentraciones de sFlt-1 y PlGF en 46 mujeres gestantes. La concentración de NT-proBNP de estas 46 mujeres gestantes es inferior a 125 pg/mL, el grupo se clasifica en 14 mujeres en el segundo trimestre de gestación y 32 mujeres en el tercer trimestre de gestación. La concentración de PlGF y sFlt-1 desciende sólo ligeramente desde el segundo al tercer trimestre de gestación. Además se muestra un diagrama de cajas del cociente sFlt-1/PlGF. El cociente de las concentraciones de sFlt-1/PlGF aumenta desde el segundo al tercer trimestre de gestación. Además se indican la mediana y los percentiles 75, 95

y 5, y 25.

En una primera realización, el objetivo se consigue mediante un método de diagnóstico en una mujer gestante que está afecta de una disfunción cardíaca, que comprende las etapas de

a)

medir el nivel de un péptido natriurético en

una muestra.

b)

Medir el nivel del factor de crecimiento

placentario

y/o sFlt-1 o variantes de los

mismos en una muestra

en

el que un nivel aumentado de un péptido

natriurético

y un nivel disminuido del factor de

crecimiento placentario y/o un nivel aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indica la presencia de una

disfunción cardíaca asociada a la placenta o en el que un

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nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel no disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un nivel no aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca.

El presente método también permite distinguir una disfunción cardíaca asociada a la placenta de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca en una mujer gestante que está afecta de una disfunción cardíaca. De forma análoga, la presente invención también se refiere a la utilización de la información combinada de los niveles medidos de un péptido natriurético y del factor de crecimiento placentario y/o sFlt-1 para el diagnóstico de una disfunción cardíaca, particularmente de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca y/o una disfunción cardíaca asociada a la placenta, en una mujer gestante que presenta síntomas de disfunción cardíaca. Dicha utilización puede adaptarse de forma análoga a todas las otras características y realizaciones preferentes dadas a conocer en la presente especificación y ejemplos.

Una muestra de tejido, según la presente invención, hace referencia a cualquier tipo de tejido obtenido a partir de animales o humanos vivos o muertos. Las muestras de tejido pueden obtenerse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo mediante biopsia o legrado.

Los fluidos corporales, según la presente invención,

pueden incluir sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo,

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linfa, líquido cefalorraquídeo, saliva, humor vítreo y orina. Particularmente, los fluidos corporales incluyen la sangre, el suero sanguíneo, el plasma sanguíneo y la orina. Las muestras de fluidos corporales pueden obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica.

La presente invención también da a conocer una seguridad mejorada en el diagnóstico de una mujer gestante que está afecta de una disfunción cardíaca. Tal como se ha descrito previamente, se ha hallado en el contexto de la presente invención que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel disminuido del factor de crecimiento placentario y/o un nivel aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indica la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta, mientras que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel no disminuido del factor de crecimiento placentario y/o un nivel no aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca.

Se ha hallado en el contexto de la presente invención que la medición de un péptido natriurético, en particular de NT-proBNP, por sí sola no permite diferenciar si la disfunción cardíaca está relacionada con una enfermedad cardíaca o es una disfunción cardíaca asociada a la placenta. La medición combinada de un péptido natriurético y del factor de crecimiento placentario y/o sFlt-1 o variantes de los mismos puede ayudar a evitar falsos

diagnósticos, particularmente en el ámbito de urgencias.

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La invención se aprovecha de ciertos “biomarcadores” (o simplemente “marcadores”), de forma más particular marcadores bioquímicos o moleculares. Los términos “biomarcador”, “marcador bioquímico” y “marcador molecular” son conocidos por los expertos en la técnica. En particular, los marcadores bioquímicos o moleculares son productos de expresión génica que se expresan de forma diferencial (es decir, aumenta o disminuye su expresión) en presencia o ausencia de ciertas condiciones, enfermedades o complicaciones. Habitualmente, un marcador molecular se define como un ácido nucleico (tal como un ARNm), mientras que un marcador bioquímico es una proteína o un péptido. El nivel de un biomarcador adecuado puede indicar la presencia

o ausencia de la condición o enfermedad permitiendo así el diagnóstico.

La presente invención se aprovecha del factor de crecimiento placentario (PlGF), sFlt-1 y variantes del mismo y de los péptidos natriuréticos, en particular NTproANP y NT-proBNP, como biomarcadores, en particular como marcadores bioquímicos.

NT-proANP y NT-proBNP pertenecen al grupo de péptidos natriuréticos (ver por ejemplo, Bonow, R.O. (1996). New insights into the cardiac natriuretic peptides (“Nuevos conocimientos sobre los péptidos natriuréticos cardíacos”). Circulation 93: 1946-1950). Como ya se ha mencionado, NTproANP y NT-proBNP se generan mediante la escisión proteolítica de moléculas precursoras, los pre-pro péptidos, dando lugar a las hormonas activas (ANP o BNP), y

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los fragmentos N-terminal correspondientes (NT-proANP y NTproBNP, respectivamente).

El pre-pro péptido (134 aminoácidos en el caso de preproBNP) comprende un péptido de señal corto, que es escindido enzimáticamente liberando el propéptido (108 aminoácidos en el caso de proBNP). El propéptido es escindido adicionalmente en un propéptido N-terminal (NTpropéptido, 76 aminoácidos en el caso de NT-proBNP) y la hormona activa (32 aminoácidos en el caso de BNP, 28 aminoácidos en el caso de ANP).

Los diferentes productos de escisión muestran varias propiedades diferentes. BNP se produce predominantemente (aunque no de forma exclusiva) en los ventrículos y se libera con el aumento de la tensión de la pared. Por el contrario, ANP se produce y libera exclusivamente en las aurículas. ANP y BNP son las hormonas activas y poseen una vida media más corta que sus homólogos inactivos respectivos, NT-proANP y NT-proBNP. BNP se metaboliza en el torrente sanguíneo, mientras que NT-proBNP circula en el torrente sanguíneo como molécula intacta y se elimina como tal por vía renal. La vida media in vivo de NT-proBNP es 120 minutos más larga que la de BNP, que es de 20 minutos (Smith MW, Espiner EA, Yandle TG, Charles CJ, Richards AM. Delayed metabolism of human brain natriuretic peptide reflects resistance to neutral endopeptidase. (El retraso en el metabolismo del péptido natriurético cerebral refleja su resistencia a la endopeptidasa neutra) J Endocrinol. 2000; 167: 239-46.).

-13 –

Según la presente invención, el término “un péptido natriurético” incluye ANP y/o BNP o un fragmento de los mismos, y /o NT-proBNP y/o NT-proANP o una variante de los mismos. Por tanto el término “un péptido natriurético” comprende el grupo formado por ANP, BNP o un fragmento de los mismos, NT-proBNP, NT-proANP o una variante de los mismos. Además, “un péptido natriurético” incluye NT-proBNP o una variante del mismo. Es por tanto una realización preferente de la presente invención, la medición de un péptido natriurético, preferentemente de ANP y/o un BNP o un fragmento de los mismos, más preferentemente de NT-proBNP y/o NT-proANP o una variante de los mismos, de forma más preferente de NTproBNP o una variante del mismo.

El factor de crecimiento placentario (PlGF, también denominado PGF) es bien conocido por los expertos en la técnica. Es una proteína relacionada con el factor de permeabilidad vascular (VPF o VEGF). La proteína posee una longitud de 149 aminoácidos y comparte una identidad del 53% con la región similar al factor de crecimiento derivado de las plaquetas de VPF. PlGF está aparentemente involucrado en la angiogénesis durante el desarrollo, en algunos períodos de la vida adulta y en la tumorogénesis. Durante la primera fase de la gestación, se acumula en el útero células “natural killer” (asesinas naturales) en forma de infiltrados densos alrededor de las células del citotrofoblasto invasoras. A partir de la etapa media de la

gestación, estas células “natural killer” desaparecen

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progresivamente, lo cual coincide con la invasión por el citotrofoblasto, dado que la placentación se completa aproximadamente a la semana 20 de gestación. Las células “natural killer” uterinas producen diversas citoquinas que están implicadas en la angiogénesis y estabilidad vascular, incluyendo PlGF, VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular), y angiopoyetina-2. En la gestación normal, la interacción adecuada entre el trofoblasto endovascular y los leucocitos deciduales, especialmente las células “natural killer” da lugar a una liberación substancial de PlGF y VEGF. Durante la preclampsia, el sFlt-1 (tirosina quinada similar a fms soluble, también conocida como receptor de VEGF soluble) derivado de la placenta, un antagonista de PlGF y VEGF aumenta, provocando un incremento de las cantidades sistémicas de sFlt-1 que disminuyen tras el parto. El aumento de los niveles circulantes de sFlt-1 en la preclampsia se asocia con una disminución de las concentraciones circulantes de VEGF y PlGF libres, lo que da lugar a disfunción endotelial. La magnitud del aumento de sFlt-1 se correlaciona con la gravedad de la enfermedad.

Durante la gestación normal, la mediana de los niveles de NT-proNBP no está elevada y son estables a lo largo de la misma. Los valores normales de NT-proBNP de mujeres gestantes corresponden a un nivel plasmático de NT-proBNP inferior a 125 pg/mL, particularmente menos de 76 pg/mL, más particularmente menos de 50 pg/mL.

-15 –

La elevación de los niveles de NT-proBNP de mujeres gestantes con preclampsia se asocia con la gravedad de la enfermedad. De acuerdo con la presente invención, los niveles elevados de NT-proBNP se corresponden con un nivel plasmático de NTproBNP entre 125 pg/mL y 300 pg/mL, los niveles muy elevados de NT-proBNP se corresponden con un nivel plasmático entre 300 pg/mL y 500 pg/mL indicando una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca primaria o una disfunción cardíaca asociada a la placenta.

De acuerdo con la presente invención, el término “un nivel no disminuido de PlGF y/o un nivel no aumentado de sFlt-1 y/o del cociente sFlt-1/PlGF” se refiere a niveles de muestras control de un colectivo de referencia sano. Este colectivo de referencia incluye muestras de mujeres gestantes sanas no afectas de preclampsia o una enfermedad cardíaca primaria.

De acuerdo con la presente invención se produce un “nivel disminuido de PlGF y/o un nivel aumentado de sFlt-1

o un nivel modificado del cociente sFlt-1/PlGF” si los valores difieren del colectivo de referencia sano, preferentemente si salen fuera del percentil 90, más preferentemente si salen fuera del percentil 95, y de forma más preferente si salen fuera del percentil 99.

Por lo que se ha observado en el contexto de la presente invención, la medición de un péptido natriurético, en particular de NT-proBNP, por sí sola no permite diferenciar una disfunción cardíaca relacionada con una

enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a

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la placenta. De acuerdo con la presente invención, la medición combinada de un péptido natriurético, el factor de crecimiento placentario y/o sFlt-1 o variantes de los mismos permite diferenciar una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a la placenta.

Los niveles de PlGF y sFlt-1 durante la gestación normal no disminuyen o lo hacen sólo ligeramente desde el segundo al tercer trimestre de gestación. Estos datos se muestran en la figura 2 de la presente invención. Una elevación de los niveles de un péptido natriurético y una disminución de los niveles de PlGF y/o una elevación de los niveles de sFlt-1 determinados durante el segundo y tercer trimestre de gestación indican la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta debida a la preclampsia. Estos datos quedan demostrados en la tabla 1 de la presente invención que muestra que 8 de 9 mujeres gestantes presentan niveles de PGF inferiores a 100 pg/mL. Además, estas 8 mujeres gestantes presentan niveles elevados de NT-proBNP correspondientes a un nivel plasmático de NT-proBNP entre 125 y 1000 pg/mL.

Una elevación de los niveles de un péptido natriurético y unos niveles no disminuidos de PlGF y/o unos niveles no aumentados de sFlt-1 o variantes de los mismos determinados durante el segundo y tercer trimestre de gestación indican la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca debida a una enfermedad cardíaca primaria. Estos datos se demuestran en

el paciente 92316544 de la tabla 1 de la presente invención

-17 –

que

muestra un nivel elevado de NT-proBNP pero un nivel

normal de PlGF y sFlt-1.

El

término “variantes” hace referencia a péptidos

substancialmente similares a péptidos natriuréticos, en particular NT-proANP, NT-proBNP, PlGF, y sFlt-1. El término “substancialmente similar” es fácilmente comprensible por los expertos en la técnica. En particular, una variante puede ser una isoforma o alelo que muestra intercambios de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la isoforma más prevalente del péptido en la población humana. Preferentemente, dicho péptido substancialmente similar posee una similitud en la secuencia con la isoforma más prevalente del péptido de al menos el 80%, preferentemente de al menos el 85%, más preferentemente de al menos el 90% y de forma más preferente de al menos el 95%. También son substancialmente similares los productos de degradación, por ejemplo los productos de degradación proteolítica, que siguen siendo reconocidos por el medio de diagnóstico o por ligandos dirigidos contra el péptido de longitud completa respectivo.

El término “variante” también hace referencia a péptidos modificados post-traducción tales como péptidos glicosilados. También es una “variante” un péptido que ha sido modificado tras la recolección de la muestra, por ejemplo mediante la unión covalente o no covalente al péptido de un marcador, particularmente un marcador radioactivo o fluorescente. La medición del nivel de un péptido modificado tras la recolección de la muestra se

-18 –

entiende como la medición del nivel del péptido original no modificado.

Se conocen ejemplos de variantes particulares de NTproANP y NT-proBNP y métodos para su medición (Ala-Kopsala, M., Magga, J., Peuhkurinen, K. et al. (2004): Molecular heterogeneity has a major impact on the measurement of circulating N-terminal fragments of A-type and B-type natriuretic peptides (La heterogeneidad molecular tiene un gran impacto en la medición de fragmentos N-terminal circulantes de los péptidos natriuréticos tipo A y tipo B). Clinical Chemistry, vol. 50(9), 1576-1588).

El término “diagnosticar” es conocido por los expertos en la técnica. Diagnosticar se entiende como ser consciente de cualquier condición médica, particularmente una enfermedad cardíaca. Diagnosticar también hace referencia a “diagnóstico diferencial”, es decir, distinguir entre condiciones diferentes con síntomas idénticos o similares. Particularmente, el diagnóstico diferencial incluye distinguir una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a la placenta.

Preferentemente, la información diagnóstica adquirida con los medios y métodos según la presente invención es interpretada por un médico capacitado. Preferentemente, cualquier decisión sobre tratamientos adicionales en un individuo concreto también la realiza un médico capacitado. Si se considera adecuado, el médico decidirá sobre medidas diagnósticas adicionales.

-19 –

El término “mujer gestante” de acuerdo con la presente invención hace referencia preferentemente a una persona gestante. La persona puede no poseer historia conocida de enfermedad cardiovascular. Preferentemente, de acuerdo con la presente invención, el término “mujer gestante” hace referencia a una persona gestante que muestra síntomas de disfunción cardíaca que puede estar provocada por una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca

o relacionada con una disfunción cardíaca asociada a la placenta.

La presente invención hace referencia en un sentido amplio al diagnóstico de la disfunción cardíaca en mujeres gestantes. El término “disfunción cardíaca” es conocido por los expertos en la técnica. Hace referencia a cualquier tipo de disfunción cardíaca, de forma más particular a disfunciones cardíacas que afectan la capacidad de bombeo, más particularmente hace referencia a eventos cardíacos agudos y crónicos.

Los pacientes afectos de enfermedad cardíaca pueden ser personas afectas de angina de estable (SAP) y personas con síndromes coronarios agudos (ACS). Los pacientes con ACS pueden presentar una angina de pecho aguda (UAP) o bien pueden haber presentado ya un infarto de miocardio (MI). El MI puede ser un MI con elevación del segmento ST o un MI sin elevación del segmento ST. La ocurrencia de un MI puede seguirse de disfunción ventricular izquierda (LVD). Finalmente, los pacientes con LVD pueden padecer insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) con una tasa de

mortalidad de aproximadamente el 15%. Las enfermedades

-20 –

cardíacas, de acuerdo con la presente invención, también incluyen la enfermedad cardíaca coronaria, los defectos en las válvulas cardíacas (por ejemplo, defectos en la válvula mitral), la cardiomiopatía dilatada, la cardiomiopatía hipertrófica y los defectos del ritmo cardíaco (arritmias).

Las mujeres gestantes afectas de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca muestran un incremento del nivel de un péptido natriurético y un nivel no disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un nivel no incrementado de sFlt-1 o variantes de los mismos. El término “disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca” puede referirse a la capacidad del corazón de suministrar cantidades adecuadas de sangre oxigenada a los tejidos periféricos sin adaptación. La disfunción cardíaca puede ser sintomática o asintomática o puede estar relacionada con una disfunción diastólica o sistólica o ambas.

Las mujeres gestantes afectas de una disfunción cardíaca relacionada con una disfunción cardíaca asociada a la placenta muestran un incremento del nivel de un péptido natriurético y un nivel disminuido del factor de crecimiento placentario y/o un nivel incrementado de sFlt-1

o variantes de los mismos. El término “disfunción cardíaca asociada a la placenta” hace referencia a una disfunción cardíaca que tiene su origen primario en una disfunción de la placenta y

alteraciones asociadas y no primariamente en el corazón.

-21 –

Cuando producen síntomas, las enfermedades cardíacas pueden dar lugar a la “insuficiencia cardíaca”. El término “insuficiencia cardíaca” es familiar para los expertos en la técnica. Preferentemente, la insuficiencia cardíaca hace referencia a la incapacidad del corazón para hacer circular la sangre de forma suficiente, particularmente bajo condiciones de incremento de la demanda de oxigenación, tal como por ejemplo durante el ejercicio físico. La insuficiencia cardíaca incluye tanto la incapacidad para eyectar sangre de forma suficiente (fallo anterógrado) como la incapacidad para captar suficientemente el flujo venoso retrógrado hacia el corazón (fallo retrógrado).

La insuficiencia cardíaca puede clasificarse según una clasificación funcional establecida para las enfermedades cardíacas de acuerdo con la New York Heart Association (Asociación del corazón de Nueva York) (NHYA). Los pacientes de Clase I no presentan síntomas obvios de enfermedad cardiovascular. La actividad física no está limitada, y la actividad física normal no provoca una fatiga excesiva, palpitaciones o disnea (ahogo). Los pacientes de clase II presentan una ligera limitación para la actividad física. Están asintomáticos en reposo, pero la actividad física normal provoca fatiga, palpitaciones o disnea. Los pacientes de clase III muestran una limitación marcada a la actividad física. Se encuentran asintomáticos en reposo, pero una actividad física inferior a la normal provoca fatiga, palpitaciones o disnea. Los pacientes de clase IV son incapaces de realizar cualquier grado de

actividad física sin molestias. Muestran síntomas de

-22 –

insuficiencia cardíaca en reposo. Si se realiza cualquier actividad física, la sintomatología aumenta.

Otro indicador de insuficiencia cardíaca en la “fracción de eyección del ventrículo izquierdo” (LVEF) que también se conoce como “fracción de eyección”. Las personas con una corazón sano presentan habitualmente una LVEF no alterada, que generalmente se describe como superior al 50%. La mayoría de personas con una disfunción cardíaca sistólica sintomática poseen una LVEF del 40% o inferior.

El término “descompensación cardíaca” es familiar para los expertos en la técnica. “Descompensación cardíaca” se refiere de forma general a los grados más graves de insuficiencia cardíaca. Durante la descompensación cardíaca, la incapacidad del corazón para hacer circular la sangre de forma suficiente alcanza un nivel en el cual las reacciones de estrés del organismo son incapaces de compensar la falta de capacidad de bombeo. Los síntomas de la descompensación cardíaca son conocidos por los expertos en la técnica. Particularmente, un paciente que muestra síntomas de “descompensación cardíaca” muestra síntomas de clase II, III, IV de la NYHA o peores. De forma más particular, el paciente muestra síntomas de clase III, IV de la NYHA o peores. Incluso de forma más particular, el paciente muestra síntomas de clase IV de la NYHA o peores. De forma más particular, el paciente necesita soporte clínico para estabilizar o mantener la circulación.

Los términos nivel “no aumentado” y “aumentado”, y “disminuido” hacen referencia al nivel de un biomarcador

medido en una mujer gestante en comparación con un nivel

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conocido indicativo de la ausencia de una disfunción cardíaca, particularmente de la ausencia de una disfunción

cardíaca

relacionada con una enfermedad cardíaca o en

relación

con una disfunción cardíaca asociada a la

placenta.

Los expertos en la técnica son capaces de medir el nivel o niveles conocidos (o por ejemplo cociente o cocientes). Por ejemplo, un nivel conocido puede medirse como la mediana o la media de los niveles medidos en una población de individuos no afectos de enfermedad cardíaca. La evaluación de los niveles en un mayor número de individuos o pacientes, por ejemplo en estudios de cohortes, puede ayudar a refinar los niveles o cocientes conocidos. De forma análoga, también es posible definir y/o refinar los niveles de referencia indicativos de la presencia de disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca o de disfunción cardíaca asociada a la placenta.

El nivel conocido también puede ser un “valor de referencia”. Los expertos en la técnica están familiarizados con el concepto de valores de referencia (o “valores normales”) de los biomarcadores. En particular, el término valor de referencia puede referirse al valor real del nivel de una o más muestras de control o puede referirse a un valor derivado del valor real en una o más muestras de control. Preferentemente, se analizan muestras de al menos 2, más preferentemente de al menos 5, más preferentemente de al menos 50, más preferentemente de al

-24 –

menos 100, más preferentemente de al menos 500 individuos para medir el valor de referencia.

En el caso más sencillo, el valor de referencia es el mismo que el nivel medido en la muestra de control o la media de los medidos en una serie de muestras control. Sin embargo, el valor de referencia también puede calcularse a partir de más de una muestra control. Por ejemplo, el valor de referencia puede ser la media aritmética del nivel medido en muestras control que representan el estado control (por ejemplo, sano, condición concreta, o estado de enfermedad particular). Preferentemente, el valor de referencia hace referencia a un rango de valores que puede ser hallado en una serie de muestras control comparables (muestras control que representan un estado de enfermedad

idéntico o similar), por ejemplo la media ± una o más veces la desviación estándar. De forma similar, el valor de referencia también puede calcularse mediante otros parámetros o métodos estadísticos, por ejemplo como un percentil definido hallado en una serie de muestras control, por ejemplo un percentil del 90%, 95%, 97,5% o 99%. La selección de una valor de referencia en particular puede medirse según la sensibilidad, especificidad o significación estadística deseados (en general cuanto más alta es la sensibilidad, más baja es la especificidad y viceversa). Los cálculos pueden realizarse de acuerdo con métodos estadísticos conocidos y considerados adecuados por los expertos en la técnica.

Los términos “control” o “muestra control” son conocidos por los expertos en la técnica. Preferentemente,

-25 –

el término “control” hace referencia a un experimento o prueba realizada para proporcionar un estándar, frente al cual pueden evaluarse los resultados experimentales (por ejemplo el nivel o niveles medidos en un paciente). En el presente contexto, el término estándar hace referencia al nivel del biomarcador de interés asociado con una estado particular de salud o enfermedad. Por tanto, un “control” es preferentemente una muestra tomada para proporcionar dicho estándar. Por ejemplo, la muestra control puede derivarse de uno o más individuos sanos, o de uno o más

pacientes

representativos de una estado particular de

enfermedad.

En

el contexto de la presente invención, como

pacientes

representativos de una estado particular de

enfermedad

se incluyen particularmente las mujeres

gestantes

afectas de una disfunción cardíaca relacionada

con una enfermedad cardíaca o de una disfunción cardíaca asociada a la placenta. Todas las determinaciones de este grupo de pacientes se realizan en el segundo y/o tercer trimestre de gestación. La muestra control que comprende mujeres gestantes sanas no afectas de preclampsia también se realiza en el segundo y/o tercer trimestre de gestación. Una realización de la presente invención es por tanto, que todas las determinaciones se realizan en el segundo y/o tercer trimestre de gestación.

Más adelante se aportan ejemplos de niveles o cocientes conocidos. Será posible refinar adicionalmente dichos niveles o cocientes. Los niveles o cocientes particulares conocidos en esta especificación pueden servir

-26 –

como directriz para el diagnóstico. Como es sabido y está bien aceptado en la técnica, el diagnóstico real en el individuo en particular se realiza preferentemente mediante un análisis individual por el médico, por ejemplo dependiendo del peso, edad, estado de salud general y anamnesis del individuo en particular.

Tal como ya se ha mencionado, la causa subyacente de una disfunción cardíaca en mujeres gestantes puede estar relacionada con la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta, por ejemplo una mujer gestante afecta de preclampsia. Además, una mujer gestante puede estar afecta de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca, por ejemplo una mujer gestante cuya función cardíaca ya se ha alterado previamente al inicio de la gestación.

Por tanto, el método según la presente invención puede preferentemente estar relacionado con dos grupos de pacientes que muestran síntomas de disfunción cardíaca durante la gestación:

Mujeres gestantes afectadas:

(1)

de una enfermedad cardíaca primaria

(2)

de una disfunción cardíaca asociada a la placenta provocada por la preclampsia En el contexto de la presente invención se ha hallado

que las mujeres gestantes que presentan síntomas de una enfermedad cardíaca primaria (grupo de pacientes previamente mencionado) muestran un nivel aumentado de un péptido natriurético, en particular de NT-proBNP pero un

-27 –

nivel no disminuido de PlGF y un nivel no aumentado de sFlt-1. Además, en el contexto de la presente invención se ha hallado que las pacientes que presentan síntomas de disfunción cardíaca relacionada con una disfunción cardíaca asociada a la placenta (grupo de pacientes 2 previamente mencionado) muestran un nivel aumentado de NT-proBNP pero un nivel disminuido de PlGF y un nivel aumentado de sFlt-1.

De acuerdo con la presente invención, el término “nivel no aumentado de NT-proBNP” corresponde preferentemente a un nivel en plasma de NT-proBNP inferior a 125 pg/mL, particularmente inferior a 76 pg/mL, más particularmente inferior a 50 pg/mL.

La elevación de los niveles de NT-proBNP en mujeres con preclampsia se asocia a la gravedad de la enfermedad. De acuerdo con la presente invención, los niveles aumentados de NT-proBNP corresponden a un nivel en plasma de NT-proBNP entre 125 y 300 pg/mL, y los niveles muy elevados de NT-proBNP corresponden a un nivel en plasma de NT-proBNP entre 300 pg/mL y más de 500 pg/mL.

Es evidente que la información combinada de los péptidos natriuréticos y PlGF y/o sFlt-1 también puede expresarse de forma diferente. En general, cuanto más alto es el cociente entre NT-proBNP y PlGF en una muestra de una mujer gestante con síntomas de enfermedad cardíaca, más probable es que la paciente esté afecta de una disfunción cardíaca asociada a placenta provocada por la preclampsia.

-28 –

Además,

los expertos en la técnica son capaces de

definir

los niveles correspondientes a otras muestras

diferentes al plasma sanguíneo.

Como

puede observarse en los ejemplos, la

determinación

del nivel o niveles de PlGF, sFlt-1 y

péptidos natriuréticos, en particular de NT-proANP y NTproBNP, en al menos un punto temporal adicional puede proporcionar información diagnóstica adicional. Por ejemplo, la medición de NT-proBNP puede ayudar a evitar subestimar la magnitud de la enfermedad cardíaca. Por tanto, en una realización preferente, el nivel de PlGF, sFlt-1 y péptidos natriuréticos, en particular NT-proANP y NT-proBNP, se determina en al menos una muestra adicional, preferentemente tomada en un intervalo de tiempo corto después de la primera determinación. Un tiempo adecuado puede ser, por ejemplo, entre las 2 y 12 horas, preferentemente entre las 4 y 12 horas después de tomar la primera muestra.

En otra realización preferente, se determinan parámetros diagnósticos adicionales de enfermedad cardíaca, particularmente escogidos del grupo formado por (a) fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF), (b) ecocardiograma (c) anamnesis (historia clínica), en particular en relación con angina de pecho, (d) electrocardiograma, (e) parámetros de función tiroidea y renal, (f) tensión arterial, en particular hipertensión arterial, (g) gammagrafía con talio, (h) angiografía, (i) cateterismo.

-29 –

Estos parámetros diagnósticos adicionales pueden medirse antes, después o en paralelo a la medición de PlGF, sFlt-1 y los péptidos natriuréticos. Los parámetros diagnósticos adicionales pueden o bien establecer una sospecha de la presencia de disfunción cardíaca o pueden servir para evaluar de forma adicional la importancia diagnóstica de un nivel o cociente en particular.

La medición de PlGF, sFlt-1 y los péptidos natriuréticos puede realizarse en paralelo o de forma sucesiva. Preferentemente, la medición se realiza en paralelo. El término “paralelo” en este contexto hace referencia a la utilización de muestras tomadas al mismo tiempo, preferentemente tomadas con menos de 2 horas de diferencia, más preferentemente tomadas con menos de 1 hora de diferencia. Más preferentemente “paralelo” en este contexto hace referencia a la utilización de la misma muestra. Preferentemente, también la medición de la cantidad o concentración de los péptidos en la muestra se realiza al mismo tiempo.

En otra realización preferente, adicionalmente se determina al menos un biomarcador de preclampsia. Los biomarcadores de preclampsia son conocidos por los expertos en la técnica. Dichos marcadores indican la presencia de preclampsia en las mujeres gestantes. Varios de los factores placentarios que se hallan en la circulación materna durante la gestación normal están aumentados en la preclampsia. Entre ellos se incluyen diversas citoquinas inflamatorias, la hormona liberadora de corticotropina,

-30 –

radicales libres y la activina A, comprendiendo factores que estimulan la respuesta inflamatoria materna. Como ejemplos de biomarcadores de preclampsia se incluyen factores como la α2-macroglobulina, el ligando de CD40, la urotensina II y otros. El nivel de un marcador bioquímico o molecular puede medirse midiendo la concentración de la proteína (péptido o polipéptido) o el transcrito correspondiente. En este contexto, el término “medir” hace

referencia

preferentemente a una medición cuantitativa o

semi-cuantitativa del nivel.

El

nivel puede medirse midiendo la cantidad o la

concentración del péptido o polipéptido. Preferentemente, el nivel se determina como la concentración en una muestra en concreto. A los efectos de la presente invención, puede no ser necesario medir el nivel absoluto. Puede ser suficiente medir el nivel relativo en comparación con el nivel en un control adecuado. La medición también puede realizarse midiendo derivados o fragmentos específicos del péptido o polipéptido de interés, tales como fragmentos específicos contenidos en productos de la digestión de ácidos nucleicos o proteínas.

La medición de ácidos nucleicos, en particular de ARNm, puede realizarse según cualquier método conocido y considerado adecuado por los expertos en la técnica.

Como ejemplo de medición del ARN se incluyen la hibridación Northern, los ensayos de protección de ARNasa, la hibridación in situ, y los aptámeros, por ejemplo ligandos de ARN que se unen a Sephadex (Srisawat, C., Goldstein I.J., y Engelke, D.R. (2001). Sephadex-binding

-31 –

RNA ligands: rapid affinity purification of RNA from complex RNA mixtures (“Ligandos de ARN que se unen a Sephadex: purificación por afinidad rápida del ARN a partir de mezclas de ARN complejas”). Nucleic Acids Research, vol. 29, no. 2 e4).

Además, el ARN puede transcribirse de forma inversa en ADNc. Por tanto pueden utilizarse métodos de medición de ADN para medir también el ARN, por ejemplo hibridación Southern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (ver por ejemplo Cao,

W. (2004) Recent developments in ligase-mediated amplification and detection (Avances recientes en la amplificación y detección mediada por ligasa”). Trends in Biotechnology, vol. 22 (1), p. 38-44), RT-PCR, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR cuantitativa e hibridación en micromatrices (micorarray) (ver por ejemplo Frey, B., Brehm, U., y Kübler, G., y otros. (2002). Gene expression arrays: highly sensitive detection of expression patterns with improved tools for target amplification (“Matrices de expression génica: detección altamente sensible de patrones de expression con herramientas mejoradas de amplificación de la diana”). Biochemica, vol. 2, p. 27-29).

La medición de ADN y ARN también puede realizarse en solución, por ejemplo utilizando marcadores moleculares, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), o ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (ver por ejemplo Demidov, V.V. (2003). PNA and LNA throw light on DNA (“Los PNA y los LNA arrojan luz sobre el ADN”) Trends in Biotechnology, vol. 21 (1), p. 4

6).

-32 –

La medición de proteínas o fragmentos de proteínas puede realizarse de acuerdo con cualquier método conocido para la medición de péptidos o polipéptidos de interés. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar un método adecuado.

Los expertos en la técnica están familiarizados con diferentes métodos de medición del nivel de un péptido o polipéptido. El término “nivel” hace referencia a la cantidad o concentración de un péptido o polipéptido en la muestra.

La medición puede realizarse de forma directa o indirecta. La medición indirecta incluye medir respuestas celulares, ligandos unidos, marcadores o productos de reacciones enzimáticas.

La medición puede realizarse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, tales como ensayos celulares, ensayos enzimáticos, o ensayos basados en la unión de ligandos. Los métodos típicos se describen a continuación.

En una realización, el método para medir el nivel de un péptido o polipéptido de interés comprende las etapas de

(a)

poner en contacto el péptido o polipéptido con un substrato adecuado durante un período de tiempo adecuado,

(b)

medir la cantidad de producto.

En otra realización, el método para medir el nivel de un péptido o polipéptido de interés comprende las etapas de

(a)

poner en contacto el péptido o polipéptido con un ligando de unión específico, (b) (opcionalmente) eliminar

-33 –

el ligando no unido, (c) medir la cantidad de ligando unido.

En otra realización, el método para medir el nivel de un péptido o polipéptido de interés comprende las etapas de

(a)

(opcionalmente) fragmentar los péptidos o polipéptidos de una muestra, (b) (opcionalmente) separar los péptidos o polipéptidos o los fragmentos de los mismos según una o más propiedades bioquímicas o biofísicas (por ejemplo según su unión a una superficie sólida o su tiempo de retención en una instalación de cromatografía), (c) determinar la cantidad de uno o más péptidos, polipéptidos o fragmentos,

(d)

determinar la identidad de uno o más de los péptidos, polipéptidos o fragmentos de la etapa (c) mediante espectrometría de masas. Se da una visión general de los métodos de espectrometría de masas en, por ejemplo, Richard

D.

Smith (2002). Trends in mass spectrometry instrumentation for proteomics (“Tendencias en la instrumentación para espectrometría de masas para la proteómica”). Trends in Biotechnology, Vol. 20, No. 12 (Suppl.), pp. S3-S7).

Otros métodos típicos de medición incluyen la medición de la cantidad de un ligando que se une específicamente al péptido o polipéptido de interés. El término unión, de acuerdo con la presente invención, incluye tanto la unión covalente como la no covalente.

Un ligando, de acuerdo con la presente invención, puede ser cualquier péptido, polipéptido, ácido nucleico u otra sustancia que se une al péptido o polipéptido de

interés. Es bien conocido que los péptidos o polipéptidos,

-34 –

si se obtienen o purifican a partir de humanos o animales, pueden modificarse, por ejemplo mediante glicosilación. Un ligando adecuado, de acuerdo con la presente invención, también puede unirse al péptido o polipéptido a través de estos sitios.

Preferentemente, el ligando debería unirse específicamente al péptido o polipéptido que se quiere medir. El término “unión específica”, de acuerdo con la presente invención, significa que el ligando no debería unirse substancialmente a (“tener reacción cruzada” con) otro péptido, polipéptido o sustancia presente en la muestra investigada. Preferentemente, la proteína o isoforma unida de forma específica debería unirse al menos con una afinidad al menos 3 veces superior, más preferentemente con una afinidad al menos 10 veces superior e incluso más preferentemente con una afinidad al menos 50 veces superior que cualquier otro péptido o polipéptido relevante.

La unión no específica puede ser tolerable, particularmente si el péptido o polipéptido todavía puede distinguirse y medirse de forma inequívoca, por ejemplo mediante separación según su tamaño (por ejemplo, mediante electroforesis), o por su abundancia relativamente superior en la muestra.

La unión del ligando puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Preferentemente, el método es semicuatitativo o cuantitativo. Los métodos adecuados se describen a continuación.

-35 –

En primer lugar, la unión del ligando puede medirse

directamente,

por ejemplo mediante RMN o resonancia de

plasmones superficiales.

En

segundo lugar, si el ligando también sirve como

substrato de una actividad enzimática del péptido o polipéptido de interés, puede medirse el producto de la reacción enzimática (por ejemplo puede determinarse la cantidad de proteasa midiendo la cantidad de substrato escindido, por ejemplo mediante transferencia Western). Para la medición de los productos de una reacción enzimática, preferentemente la cantidad de substrato en saturante. También puede marcarse el substrato con un marcador detectable antes de la reacción. Preferentemente, la muestra se pone en contacto con el substrato durante un período de tiempo adecuado. Un período de tiempo adecuado hace referencia al tiempo necesario para que se produzca una cantidad de producto detectable, preferentemente medible. En lugar de medir la cantidad de producto, puede medirse el tiempo necesario para que aparezca una cantidad determinada (por ejemplo, detectable) de producto.

En tercer lugar, el ligando puede acoplarse de forma covalente o no covalente a un marcador que permita la detección y medición del ligando. El marcaje puede realizarse mediante métodos directos o indirectos. El marcaje directo supone el acoplamiento del marcador (de forma covalente o no covalente) al ligando. El marcaje indirecto supone la unión (de forma covalente o no covalente) de un ligando secundario al primer ligando. El

ligando secundario debería unirse de forma específica al

-36 –

primer ligando. Dicho segundo ligando puede estar acoplado a un marcador adecuado y/o ser la diana (receptor) de un ligando terciario que se une al ligando secundario. La utilización de ligandos secundarios, terciarios e incluso de órdenes superiores se utiliza habitualmente para aumentar la señal. Los ligandos secundarios y de órdenes superiores pueden incluir anticuerpos, anticuerpos secundarios y el bien conocido sistema estreptavidinabiotina (Vector Laboratorios, Inc.)

El ligando o substrato también puede “etiquetarse” con una o más etiquetas tal como se conoce en la técnica. Dichas etiquetas pueden subsiguientemente ser dianas de ligandos de órdenes superiores. Como etiquetas adecuadas se incluyen la biotina, la digoxigenina, el His-Tag, la Glutation-S-Transferasa, FLAG, GFP, myc-tag, la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, la proteína de unión a la maltosa, y similares. En el caso de un péptido o polipéptido, la etiqueta se encuentra preferentemente en el extremo N-terminal y/o C-terminal.

Son marcadores adecuados todos aquellos detectables mediante un método de detección adecuado. Entre los marcadores típicos se incluyen la partículas de oro, las bolas de látex, el éster acridan, el luminol, el rutenio,

marcadores

enzimáticamente activos,

marcadores

radioactivos,

marcadores magnéticos (por ejemplo “bolas

magnéticas”,

incluyendo marcadores paramagnéticos y

superparamagnéticos), y marcadores fluorescentes. Entre los marcadores enzimáticamente activos se

incluyen por ejemplo la peroxidasa de rábano picante, la

-37 –

fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa, la luciferasa y derivados de los mismos. Entre los substratos adecuados para la detección se incluyen la di-amino-bencidina (DAB), la 3,3’-5,5’-tetrametilbencidina, el NBT-BCIP (cloruro de 4-nitro azul de tetrazolio y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3indolilo, disponible en forma de solución madre lista para usar de Roche Diagnostics), el CDP-Star™ (Amersham Biosciences), el ECF™ (Amersham Biosciences). Una combinación adecuada de enzima-substrato puede dar lugar a un producto de reacción con color, fluorescencia o quimioluminiscencia que puede ser medida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, utilizando una película sensible a la luz o un sistema de cámara adecuado). Para la medición de las reacciones enzimáticas, se aplican igualmente los criterios citados previamente.

Entre los marcadores fluorescentes típicos pueden incluirse proteínas fluorescentes (tales como GFP y sus derivados), Cy3, Cy5, Texas Red, fluoresceína y los colorantes Alexa (por ejemplo Alexa 568). Están disponibles marcadores fluorescentes adicionales, por ejemplo, de Molecular Probes (Oregon). También se contempla la utilización de puntos cuánticos como marcadores fluorescentes.

Entre los marcadores radioactivos típicos se incluyen el S35, el I125, el P32, el P33 y similares. Los marcadores radioactivos pueden detectarse mediante cualquier método conocido y adecuado, por ejemplo una película sensible a la luz o un generador de imágenes de fósforo.

-38 –

También se incluyen como métodos de medición adecuados, de acuerdo con la presente invención, la precipitación (particularmente la inmunoprecipitación), la

electroquimioluminiscencia

(quimioluminiscencia generada

por

electricidad), el RIA (radioinmunoensayo), el ELISA

(enzimoinmunoensayo),

enzimoinmunoensayos en sándwich,

inmunoensayos

electroquimioluminiscentes en sándwich

(ECLIA), inmunoensayo fluorométrico con disociación aumentada por lantánidos (DELFIA), ensayo de centelleo por proximidad (SPA), turbidimetría, nefelometría, nefelometría

o turbidimietría aumentada por látex, inmunoensayos en fase sólida y espectrometría de masas tales como SELDI-TOF, MALDI-TOF, o espectrometría de masas capilar (CE-MS). Pueden utilizarse métodos adicionales conocidos en la técnica (tales como electroforesis en gel, electroforesis en gel bidimensional, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), transferencia Western), solos o en combinación con marcaje u otros medios de detección, tal como se ha descrito anteriormente.

Además, se incluyen como métodos adecuados los métodos basados en ELISA en microplaca, los inmunoensayos completamente automatizados o robotizados (disponibles por ejemplo en analizadores Elecsys™, o Cobas™), el CBA (un Ensayo de Unión de Cobalto enzimático, disponible por ejemplo en los analizadores Roche-Hitachi™) y los ensayos de aglutinación con látex (disponible por ejemplo en los analizadores Roche-Hitachi™).

Como ligandos preferentes se incluyen los anticuerpos,

los ácidos nucleicos, los péptidos o polipéptidos, y los

-39 –

aptámeros, por ejemplo aptámeros peptídicos o de ácidos nucleicos. Los métodos para dichos ligandos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los suministradores comerciales también ofrecen la identificación y producción de anticuerpos o aptámeros adecuados. Los expertos en la técnica están familiarizados con los métodos para desarrollar derivados de dichos ligandos con mayor afinidad

o especificidad. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones aleatorias en los ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos. A continuación pueden cribarse estos

derivados

según su capacidad de unión de acuerdo con

procedimientos

de cribado conocidos en la técnica, por

ejemplo, exposición en fagos (phage display).

El término “anticuerpo” tal como se utiliza en la presente invención incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales, así como fragmentos de los mismos, tales como los fragmentos Fv, Fab y F(ab)2, que son capaces de unirse a un antígeno o hapteno.

En otra realización preferente, el ligando, preferentemente seleccionado del grupo formado por ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, más preferentemente del grupo formado por ácidos nucleicos, anticuerpos o aptámeros está presente en una matriz.

Dicha matriz contiene al menos un ligando adicional, que puede estar dirigido contra un péptido, polipéptido o ácido nucleico de interés. Dicho ligando adicional también puede estar dirigido contra un péptido, polipéptido o ácido nucleico que no tiene un interés particular en el contexto

de la presente invención. Preferentemente, la matriz

-40 –

contiene ligandos para al menos tres, preferentemente al menos cinco, más preferentemente al menos ocho péptidos o polipéptidos de interés en el contexto de la presente invención.

La unión del ligando a la matriz puede detectarse mediante cualquier método de detección o lectura, por ejemplo métodos que utilizan señales ópticas (por ejemplo fluorescente), electroquímicas o magnéticas, o la resonancia de plasmones superficiales.

En otra realización preferente, la presente invención hace referencia a la utilización de un ligando que se une específicamente a un péptido natriurético, particularmente NT-proBNP o una variante del mismo y un ligando para PlGF y/o sFlt-1 o una variante de los mismos para la fabricación de un kit para el diagnóstico de una enfermedad cardíaca, particularmente para distinguir una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a la placenta en una mujer gestante afecta de disfunción cardíaca. Adicionalmente, puede utilizarse para la fabricación de dicho kit un ligando que se une específicamente a un biomarcador de preclampsia.

Según la presente invención, el término “matriz” hace referencia a un portador de fase sólido o tipo gel sobre el cual se unen o enlazan al menos dos compuestos en una disposición uni, bi o tridimensional. Dichas matrices, (incluyendo los “chips génicos”, “chips de proteínas”, matrices de anticuerpos y similares), son generalmente conocidos por los expertos en la técnica y se generan típicamente en láminas de vidrio para microscopio, láminas

-41 –

de vidrio recubiertas de forma especial tales como láminas recubiertas de policationes, nitrocelulosa o biotina, cubreobjetos, y membranas tales como, por ejemplo, membranas basadas en nitrocelulosa o nylon. La matriz puede incluir un ligando unido o al menos dos células expresando cada una de ellas al menos un ligando.

También se contempla la utilización de “matrices en suspensión” como matrices de acuerdo con la presente invención (Nolan JP, Sklar LA. (2002). Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm (“Tecnología de matrices en suspensión: evolución del paradigma de la matriz plana”). Trends Biotechnol. 20(1):912). En las matrices en suspensión, el portador, por ejemplo una microbola o microesfera, está en suspensión. La matriz está formada por diferentes microbolas o microesferas, posiblemente marcadas, que portan diferentes ligandos.

En otra realización preferente, la presente invención se refiere a una matriz que contiene un ligando que se une específicamente a un péptido natriurético, particularmente NT-proBNP o una variante del mismo y un ligando para PlGF y/o sFlt-1 o una variante de los mismos para (a) medir el nivel de un péptido natriurético en una muestra de una mujer gestante y (b) medir el nivel de PlGF y/o sFlt-a o variantes de los mismos en una muestra de una mujer gestante, para el diagnóstico in vitro de una enfermedad cardíaca, en particular para distinguir una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una

disfunción cardíaca asociada a la placenta mediante la

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determinación de un péptido natriurético y del factor de crecimiento placentario y/o sFlt-1 o una variante de los mismos.

La invención se refiere además a un método para la producción de matrices, tal como se ha definido anteriormente, en las que al menos un ligando está unido al material portador además de otros ligandos.

Los métodos para la producción de dichas matrices, por ejemplo basados en la química de fase sólida y grupos protectores lábiles a la luz, son conocidos de forma general (US 5.744.305). Dichas matrices también se pueden poner en contacto con una substancia o una biblioteca de substancias y analizar su interacción, por ejemplo su unión

o cambio de conformación. Por tanto, pueden utilizarse matrices que contienen un péptido o polipéptido tal como se han definido previamente para identificar ligandos que se unen específicamente a dichos péptidos o polipéptidos.

Los péptidos y polipéptidos (proteínas) pueden medirse en muestras de tejido, células, y fluidos corporales, es decir preferentemente in vitro. Preferentemente, el péptido

o polipéptido de interés se mide en una muestra de fluido corporal.

Algunas de las muestras, tales como las muestras de orina, pueden contener solamente productos de degradación, en particular fragmentos, del péptido o polipéptido de interés. Sin embargo, tal como se ha establecido anteriormente, la medición del nivel aún es posible siempre y cuando los fragmentos sean específicos del péptido o

polipéptido de interés.

-43 –

En caso necesario, las muestras pueden procesarse adicionalmente antes de la medición. Por ejemplo, pueden purificarse los ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidoa a partir de la muestra de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos de filtración, centrifugación o extracción, tales como la extracción con cloroformo/fenol.

Además, se contempla la utilización de los denominados dispositivos de punto de atención o laboratorio en un chip para obtener la muestra y medir el péptido o polipéptido de interés. Dichos dispositivos pueden diseñarse de forma análoga a los dispositivos utilizados en la determinación de glucosa sanguínea. De este modo, el paciente será capaz de obtener la muestra y medir el péptido o polipéptido de interés sin la ayuda inmediata de un médico o enfermero capacitados.

La presente invención también da a conocer un kit que comprende (a) un medio o dispositivo para medir el nivel de un péptido natriurético en una muestra de una mujer gestante, y (b) un medio o dispositivo para medir el nivel de PlGF y/o sFlt-1 o variantes de los mismos en una muestra de una mujer gestante, para el diagnóstico in vitro de una enfermedad cardíaca, particularmente para distinguir una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a la placenta. Preferentemente, el medio de acuerdo con (a) es un ligando que se une específicamente a un péptido natriurético, y/o los medios de acuerdo con (b) es un ligando que se une específicamente a PlGF y/o sFlt-1 o variantes de los

mismos. Adicionalmente, el kit puede comprender un medio o

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dispositivo, particularmente un ligando que se une específicamente, para medir el nivel de un biomarcador de preclampsia en una muestra de un paciente.

En una realización preferente, la presente invención hace referencia a la utilización de dicho kit para el diagnóstico in vitro de una enfermedad cardíaca, particularmente para distinguir una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a la placenta en una mujer gestante que presente síntomas de una disfunción cardíaca, tal como se define en la reivindicación 14.

Una realización adicionalmente preferente de la presente invención es una prueba inmunológica rápida, caracterizada por utilizar anticuerpos específicos para un péptido natriurético y/o sFlt-1 o variantes de los mismos para (a) medir el nivel de un péptido natriurético o una variante del mismo en una muestra de una mujer gestante, y

(b) medir el nivel de PlGF y/o sFlt-1 o variantes de los mismos en una muestra de una mujer gestante, para el diagnóstico in vitro de una enfermedad cardíaca, en particular para distinguir una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a la placenta mediante la determinación de un péptido natriurético y el factor de crecimiento placentario y/o sFlt-1 o una variante de los mismos.

Una “prueba inmunológica rápida”, según la presente invención, es una prueba rápida para substancias detectables inmunológicamente, que se conocen desde hace

mucho tiempo para numerosos parámetros diferentes, por

-45 –

ejemplo para WO 97/06439, EP 0 291 194, US 5,591,645, US 4,861,711, US 5,141,850, US 6,506,612, US 5,458,852, US 5,073,484. En estos casos los reactivos inmunológicos de detección (esencialmente anticuerpos o antígenos marcados y no marcados) se proporcionan habitualmente en forma seca sobre un soporte que permite el transporte de una muestra líquida (en particular fluidos corporales como sangre, suero, plasma, orina, saliva, etc.) sobre o en el soporte. Con este fin, el soporte es preferentemente capilarmente activo, por ejemplo una membrana o soporte de plástico provisto de canales capilares. Entre los expertos se denominan habitualmente dispositivos o tiras de ensayo inmunocromatográfico.

Dado que el ensayo Elecsys® NT-proBNP solamente puede llevarse a cabo en un laboratorio central, es difícil determinar rápidamente NT-proBNP fuera del horario habitual. Por lo tanto, sería especialmente ventajoso para el servicio de urgencias si se dispusiera de una prueba rápida que pudiera realizarse directamente en el servicio de urgencias fuera del horario habitual. Esta prueba rápida debe, sin embargo, garantizar los rangos de referencia y de corte según el método de referencia del laboratorio central (Elecsys® NT-proBNP) con el fin de permitir una buena comparabilidad de los resultados de forma independiente del tipo de prueba que finalmente se realice.

La determinación cuantitativa de la concentración de factor de crecimiento placentario (PlGF) humano en sobrenadantes de cultivo celular, suero, plasma y orina

puede realizarse mediante la utilización del inmunoensayo

-46 –

de PlGF humano “Quantikine” (número de catálogo DPG00) de R&D Systems. La determinación cuantitativa de las concentraciones del Receptor soluble del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular 1 (sVEGF R1) humano pueden llevarse a cabo mediante el uso del inmunoensayo para VEGF R1/Flt-1 soluble humano "Quantikine" (número de catálogo DVR100B) de R&D Systems. Este ensayo rápido de PlGF y VEGF R1/Flt-1, debe, sin embargo, garantizar los rangos de referencia y de corte, según el método de referencia antes citado, con el fin de permitir una buena comparabilidad de los resultados de forma independiente del tipo de prueba que finalmente se realice.

La presente invención también se refiere a un método, según la reivindicación 15, para el apoyo a la decisión sobre el posible tratamiento de una mujer gestante afecta de una disfunción cardíaca. Una vez un paciente ha sido diagnosticado, ello puede tener consecuencias para el tratamiento subsiguiente. Si un método, según la presente invención, indica que el paciente está afecto de una enfermedad cardíaca, puede entonces iniciarse o adaptarse el tratamiento. El nivel o niveles y/o el cociente o cocientes de un péptido natriurético, particularmente NTproBNP y NT-proANP, PlGF y/o sFlt-1 o una variante de los mismos en una mujer gestante pueden controlarse a intervalos regulares. Además, puede investigarse intensivamente el individuo para realizar un diagnóstico más completo, según métodos conocidos por los cardiólogos expertos, tal como se ha

descrito previamente en esta especificación, por ejemplo

-47 –

mediante electrocardiografía o ecocardiografía. El tratamiento puede incluir cualquiera de las medidas que generalmente se asocian con una mejoría u recuperación de la función cardíaca.

El tratamiento de la disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca puede ser diferente del tratamiento de la disfunción cardíaca asociada a la placenta en una mujer gestante. Si un método, según la presente invención, indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca, el tratamiento debe centrarse en la administración de

inhibidores de la ECA, diuréticos, β-bloqueantes, digoxina y otros.

Si un método, según la presente invención, indica la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta en una mujer gestante, el tratamiento puede centrarse más bien en aspirina, esteroides, avanzar el parto con o sin tratamiento cardíaco.

Más particularmente, en una realización adicional, la presente invención hace referencia a un apoyo a la decisión para el posible tratamiento de una mujer gestante afecta de una disfunción cardíaca, que comprende las etapas de a) medir in vitro en una muestra de una mujer gestante el nivel de ai) un péptido natriurético aii) al menos un péptido seleccionado del grupo formado por factor de crecimiento placentario y sFlt-1 o variantes de los mismos b) comparar los resultados obtenidos con valores de referencia c) en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel disminuido de factor de crecimiento

-48 –

placentario y/o un nivel aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indican la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta, o en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel no disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un nivel no aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indican la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca, d) recomendar el inicio de tratamiento de o bien la disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca o de una disfunción cardíaca asociada a la placenta dependiendo de los resultados obtenidos en la etapa c).

Ejemplos

Se ha investigado clínicamente la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta o la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca en una cohorte de 55 mujeres gestantes. Se determinaron los valores de referencia para sFlt-1, PlGF y NT-proBNP en mujeres gestantes (N = 55) clasificadas en segundo trimestre (N = 9) y tercer trimestre (N = 46). En la tabla 1 se muestran los valores de sFlt-1 y PlGF en mujeres gestantes con valores elevados de NT-proBNP (> 125 pg/mL). Se analizó la concentración de NT-proBNP en las muestras sanguíneas de las mujeres gestantes mediante el ensayo Elecsys NT-proBNP™ (Roche Diagnostics). La concentración de sFlt-1 se analizó utilizando el inmunoensayo "Quantikine" soluble humano (número de catalogo DVR100B) de R&D Systems. La determinación cuantitativa de las concentraciones de factor de

-49 –

crecimiento placentario humano (PlGF) se analizó utilizando el inmunoensayo para PlGF "Quantikine" (número de catalogo DPG00) de R&D Systems.

Tabla 1: valores de sFlt-1 y PlGF en mujeres gestantes con valores de NT-proBNP elevados (> 125 pg/ml)

nº de la gestante

semana de gestación trimestre sFlt-1 [pg/ml] PlGF [pg/ml] NT-proBNP [pg/ml]

92316544

24 2 2645,7 324,31 181,85

6

26 -33 3 1062,1 96,80 336,94

17

26 -33 3 7551,6 93,01 125,12

1

34 - 36 3 8653,8 73,97 655,69

16

34 - 36 3 3285,1 21,61 184,57

2

26 -33 3 341,6 15,31 415,13

2

26 -33 3 165,9 11,99 940,15

5

26 -33 3 164,7 11,27 324,75

16

26 -33 3 127,3 10,69 940,52

5 La tabla 1 resume los niveles de sFlt-1 y PlGF de mujeres gestantes con valores elevados de NT-proBNP. 9 de las 55 mujeres gestantes mostradas en la tabla 1 tienen valores elevados de NT-proBNP superiores a 125 pg/mL. Además 8 de estas 9 mujeres gestantes (pacientes, 6, 17, 1,

10  16, 2, 2, 5, 16) presentan niveles disminuidos de PlGF, lo que indica la presencia de una disfunción cardíaca asociada a la placenta relacionada con la preclampsia. La elevación de los niveles de NT-proBNP de las mujeres gestantes

-50 –

afectas de preclampsia se asocia con la gravedad de la enfermedad.

1 de las 9 mujeres gestantes, la paciente 92316544, muestra un nivel elevado de NT-proBNP pero con niveles normales de PlGF, lo que indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca relacionada con una disfunción cardíaca primaria.

Tabla 2: Valores de referencia de NT-proBNP en mujeres donantes de sangre aparentemente sanas (18-44,9 años)

Edad 18-44,9 años

Mediana de edad

33

Total

Hombres Mujeres

N

1323 815 508

Percentil

0

20,00 20,00 20,00

2,5

20,00 20,00 20,00

5

20,00 20,00 20,00

10

20,00 20,00 20,00

25

20,00 20,00 21,67

50

20,43 20,00 37,06

75

39,35 25,67 61,97

90

70,20 41,69 98,80

95

97,32 62,89 116,40

97,5

115,00 85,75 129,70

100

534,40 534,40 196,30

La tabla 2 comprende los valores de referencia de NT

10  proBNP de una cohorte de 1.323 donantes de sangre aparentemente sanos de edad entre 18 y 44,9 años. La edad mediana de los donantes de sangre es de 33 años. Se analizó la concentración de NT-proBNP en muestras de sangre de 508 mujeres. Se muestran los percentiles 0, 2,5, 5, 10, 25, 50,

15  75, 90, 95, 97,5 y 100.

-51 –

La figura 1 muestra los diagramas de caja de los valores de referencia de la concentración de NT-proBNP. N representa el número de pacientes. La primera columna muestra la concentración de NT-proBNP de 508 mujeres

5  donantes de sangre de edades entre 18 y 44,9 años, aparentemente sanas. Este valor de referencia se compara con la concentración de NT-proBNP de 55 mujeres gestantes clasificadas en 9 mujeres en el segundo trimestre de gestación y 46 mujeres en el tercer trimestre de gestación.

10  No existen diferencias aparentemente significativas en la concentración de NT-proBNP entre estos grupos. Además, se muestra la mediana y los percentiles 75, 95, y 5 y 25.

La figura 2 muestra los diagramas de caja de los valores de referencia medidos para la concentración sFlt-1 15 y PlGF en 46 mujeres gestantes. La concentración de NTproBNP de estas 46 mujeres gestantes es inferior a 125 pg/mL, el grupo se clasifica en 14 mujeres en el segundo trimestre de gestación y 32 en el tercer trimestre de gestación. La concentración de PlGF y sFlt-1 disminuye sólo

20  ligeramente desde el segundo al tercer trimestre de gestación. Además, se muestra un diagrama de cajas del cociente sFlt-1/PlGF. El cociente sFlt-1/PlGF se incrementa del segundo al tercer trimestre de gestación. Además, se muestran la mediana, y los percentiles 75, 95 y

25  5 y 25.

-52 –

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para el diagnóstico de una mujer gestante afecta de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca o asociada a la placenta, que comprende las etapas de

   a) medir in vitro en una muestra de una mujer gestante

   los niveles de ai) un péptido natriurético aii) al menos un péptido seleccionado del grupo

   formado por factor de crecimiento placentario (PlGF) y tirosina quinasa similar al fms soluble (sFlt-1) o variantes de los mismos. b) comparar los resultados obtenidos con valores de

   referencia

   en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un valor aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indican la presencia de una disfunción asociada a la placenta, o en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un valor no disminuido del factor de crecimiento placentario y/o un nivel no aumentado de sFlt-1

   o

   una variante del mismo indica la presencia de una

   disfunción

   cardíaca relacionada con una enferm edad

   cardíaca.

2. 2. Método, según la reivindicación 1, en el que las mediciones de un péptido natriurético y del factor de crecimiento placentario y/o sFlt-1 o variantes de los mismos se realizan en paralelo.

   -53 –

3. 3.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el péptido natriurético es un péptido tipo BNP o una variante del mismo.

4. 4.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido natriurético es NT-proBNP o una variante del mismo.

5. 5.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el péptido natriurético es un péptido tipo ANP o una variante del mismo.

6. 6.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra es una muestra de sangre, preferentemente plasma sanguíneo y/o una muestra de orina.

7. 7.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la medición se realiza en el segundo o tercer trimestre de gestación.

8. 8.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que un nivel aumentado de NT-proBNP corresponde a un nivel en plasma de NT-proBNP entre 125 y 300 pg/mL, y un nivel altamente aumentado de NT-proBNP corresponde a un nivel en plasma de NT-proBNP entre 300 y más de 500 pg/mL.

9. 9.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el nivel no aumentado de NT-proBNP corresponde a un nivel en plasma de menos de 125 pg/mL.

10. 10.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se mide el nivel de un péptido natriurético y del factor de crecimiento placentario y sFlt-1 o variantes de los mismos.

11. 11.

    Método, según la reivindicación 10, en el que se determina el cociente sFlt-1/PlGF.

    -54 –

12. 12.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se mide adicionalmente al menos un biomarcador de preclampsia, preferentemente seleccionado

    del grupo formado por α2-macroglobulina, ligando CD40, urotensina II y otros.

13. 13.

    Utilización de un péptido natriurético y al menos un péptido adicional del grupo formado por PlGF y sFlt para distinguir in vitro una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca de una disfunción cardíaca asociada a la placenta en una mujer gestante.

14. 14.

    Utilización de una prueba inmunológica rápida que comprende un ligando que se une específicamente a un péptido natriurético y un ligando para PlGF y/o sFlt-1 o variantes de los mismos como kit diagnóstico para diagnosticar in vitro si una disfunción cardíaca en una mujer gestante está relacionada con una enfermedad cardíaca

    o es una disfunción cardíaca asociada a la placenta.
15. 15. Método de apoyo a la decisión sobre el posible tratamiento de una mujer gestante afecta de una disfunción cardíaca que comprende las etapas de

    a) medir in vitro en una muestra de una mujer gestante los niveles de

    ai) un péptido natriurético

    aii) al menos un péptido seleccionado del grupo

    formado por factor de crecimiento placentario sFlt-1 o

    variantes de los mismos.

    b) comparar los resultados obtenidos con valores de

    referencia

    -55 –

    c) en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un nivel disminuido de factor de crecimiento placentario y/o un valor aumentado de sFlt-1 o variantes de los mismos indica la presencia de una disfunción asociada a

    5  la placenta, o en el que un nivel aumentado de un péptido natriurético y un valor no disminuido del factor de crecimiento placentario y/o un nivel no aumentado de sFlt-1 indica la presencia de una disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca

    10 d) recomendar el inicio del tratamiento o de la disfunción cardíaca relacionada con una enfermedad cardíaca

    o de la disfunción cardíaca asociada a la placenta, según los resultados obtenidos en la etapa c).