ES2350922T3

ES2350922T3 - Diagnóstico y monitorización del lupus eritematoso sistémico y de la escrerodermia.

Info

Publication number: ES2350922T3
Application number: ES02757691T
Authority: ES
Inventors: Joseph M. Ahearn; Susan M. Manzi
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 2001-09-10
Filing date: 2002-09-09
Publication date: 2011-01-28
Anticipated expiration: 2022-09-09
Also published as: DE60237529D1; WO2003022223A3; EP1432731A4; JP2010014720A; WO2003022223A2; ATE479707T1; US20050037441A1; EP1432731B1; AU2008202941A1; AU2002323691C1; AU2002323691B2; CA2460189A1; JP4570872B2; EP1432731A2; DK1432731T3; JP2005509146A; US7390631B2; JP4906898B2

Abstract

Un procedimiento de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico o con la cantidad de dicho componente conocido por estar presente sobre la superficie de glóbulos rojos de individuos que no tienen esclerodermia.

Description

INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE

Algunos trabajos descritos en la presente invención han sido amparados por la Ayuda No. N01AR92239 entre el NIH y la University of Pittsburgh. El Gobierno puede tener ciertos derechos en la presente invención.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a la diagnosis y/o monitorización de pacientes con lupus eritematoso sistémico o esclerodermia, incluyendo procedimientos para llevar a cabo esta actividad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a la diagnosis y/o monitorización de pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) y con esclerosis sistémica (esclerodermia). La invención proporciona igualmente medios para distinguir entre las dos enfermedades y ayuda a los doctores a distinguir el SLE y la esclerodermia de otras enfermedades.

El lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus es la enfermedad autoinmune prototípica que resulta de una implicación multiorgánica. Esta anti-autorespuesta se caracteriza por autoanticuerpos dirigidos contra una diversidad de componentes celulares nucleares y citoplásmicos. Estos auto-anticuerpos se unen a sus antígenos respectivos, que forman complejos inmunes los cuales circulan y eventualmente se depositan en los tejidos. Esta deposición de complejo inmune causa inflación crónica y lesión en los tejidos.

El diagnóstico y monitorización de la actividad de la enfermedad son ambas problemáticas en pacientes con SLE. La diagnosis es problemática debido a que el espectro de la enfermedad es amplio y varía desde síntomas sutiles o vagos hasta el fallo multi-orgánico con amenaza para la vida. Existen otras enfermedades con implicación mult-sistema que pueden ser confundidas con lupus eritematoso, o viceversa. Se desarrollaron criterios con el fin de clasificación de la enfermedad en 1971(Cohen, AS, y otros, “Preliminary criteria for the classification of systemic lupus erythematosus”. Bull. Rheum. Dis., vol. 21, págs. 643-648, (1971)) y se revisaron en 1982 (Tan, EM, y otros, “The 1982 revised criteria for the classifaction of systemic lupus erythematosus”. Arth. Rheum., vol. 25, págs. 1271-1277, (1982)) y en 1997 (Hochberg, MC. “Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classication of systemic lupus erythematosus”. Arth. Rheum., vol. 40, pág. 1725, (1997)). Estos criterios están pensados para asegurar que los pacientes procedentes de localizaciones geográficamente diferentes son comparables. De los once criterios, la presencia de cuatro o más, tanto seriadamente como simultáneamente, es suficiente para la clasificación de un paciente como que tiene SLE. Aunque los criterios sirven como recordatorios útiles de aquellas características que distinguen al lupus de otras enfermedades autoinmunes relacionadas, son inevitablemente falibles. La determinación de la presencia o la ausencia de los criterios requiere frecuentemente interpretación. Si se aplican normas liberales para la determinación de la presencia o la ausencia de un signo o síntoma, se podría fácilmente diagnosticar a un paciente como que tiene lupus cuando de hecho no lo tiene. De manera similar, la gama de manifestaciones clínicas en SLE es mucho más grande que la descrita mediante los once criterios y cada manifestación puede variar en cuanto al índice de actividad y de severidad de un paciente a otro. Para complicar adicionalmente una diagnosis difícil, los síntomas de SLE evolucionan continuamente en el transcurso de la enfermedad. Pueden desarrollarse con el tiempo nuevos síntomas en órganos previamente no afectados. No existe un ensayo definitivo para el lupus y, en consecuencia, frecuentemente está mal diagnosticado.

La monitorización de la actividad de la enfermedad es también problemática en cuanto el cuidado de los pacientes con lupus. El lupus progresa en una serie de reactivaciones, o periodos de enfermedad aguda, seguido de remisiones. Los síntomas de una reactivación, la cual varía considerablemente entre pacientes o incluso dentro del mismo paciente, incluyen malestar, fiebre, dolor simétrico de articulaciones, y fotosensibilidad (desarrollo de exantemas después de breve exposición al sol). Otros síntomas de lupus incluyen pérdida del cabello, úlceras de membranas mucosas e inflamación del revestimiento del corazón y pulmones lo cual conduce a dolor del pecho. Los glóbulos rojos, plaquetas y glóbulos blancos pueden ser objetivos del lupus, dando como resultado problemas de anemia y de hemorragias. Más seriamente, la deposición de complejos inmunes y la inflamación crónica en los vasos sanguíneos puede conducir a implicaciones del riñón y ocasionalmente fallos, lo cual requiere diálisis y trasplante de riñón. Puesto que el vaso sanguíneo es un objetivo fundamental de la respuesta autoinmune en el lupus, no son raros los ataques y enfermedad cardíaca prematuros. Sin embargo, con el tiempo, estas reactivaciones pueden conducir a un daño irreversible del órgano. Con el fin de minimizar dicho daño, la detección más prematura y más exacta de la reactivación de la enfermedad no solamente aceleraría el tratamiento apropiado, sino que reduciría la frecuencia de intervenciones innecesarias. Desde un punto de vista de la investigación, la capacidad para describir de manera uniforme la “extensión de la inflamación” o la actividad de la enfermedad en sistemas de órganos individuales o como una medida general, es una herramienta de investigación valor incalculable. Además, una medida de la actividad de la enfermedad puede usarse como una variable de respuesta en un ensayo terapéutico.

Dos de los instrumentos más comúnmente usados son el Indice de Actividad de la Enfermedad de Lupus Sistémico (SLEDAI) (Bombardier, C., D.D. Gladman, y otros, “Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus pacients. The Committee on Prognosis Studies in SLE”. Arth. Rheum., vol. 35, págs. 630-40, (1992)), y la Medida de la Actividad del Lupus Sitémico (SLAM) (Liang, M.H., S.A. Socher, y otros, “Reliability and validity of six systems for the clinical assesment of disease activity in systemic lupus erythematosus”, Arth. Rheum., vol. 32, págs. 1107-18, (1989)). El SLEDAI incluye 24 partidas que representan 9 sistemas de órganos. Las variables se obtuvieron mediante la historia, examen físico y evaluación de laboratorio. A Cada partida se asignó un peso desde 1 hasta 8 en base a la importancia del órgano implicado. Por ejemplo, las úlceras de boca se puntuaron como 2, en tanto que las crisis se puntuaron como 8. Los parámetros de laboratorio que se incluyeron en el SLEDAI incluyen el recuento de glóbulos blancos, recuento de plaquetas, análisis de orina, suero C3, C4 y anti-ADNds. La puntuación máxima total es de 105. La SLAM incluye 32 partidas que representan 11 sistemas de órganos. Las partidas se puntuaron no solamente como presente/ausente, sino que además se graduaron en una escala de 1 a 3 en base a la severidad. La puntuación posible total para la SLAM es de 86. Tanto el SLEDAI como la SLAM han mostrado ser válidos, fiables, y sensibles al cambio a lo largo del tiempo (Liang, M.H., S.A. Socher, y otros, “Reliability and validity of six systems for the clinical assesment of disease activity in systemic lupus erythematosus”, Arth. Rheum., vol. 32, págs. 1107-18, (1989)), y son ampliamente usados en protocolos de investigación y ensayos clínicos. Estos índices son particularmente útiles para examinar el valor de marcadores serológicos o inflamatorios recientemente propuestos de la actividad de la enfermedad en SLE.

A pesar de la obvia utilidad de estos instrumentos, existen algunos inconvenientes. En primer lugar, no existe siempre una completa concordancia entre la SLAM y el SLEADI en el mismo grupo de pacientes. Existen diversas posibles razones para estas discrepancias. A diferencia del SLEDAI, la SLAM incluye síntomas atribuibles a la constitución tales como fatiga y fiebre, los cuales pueden considerarse o no como atribuibles a un SLE activo; este índice de actividad depende de la interpretación del médico. Además, el SLEDAI no captura grados suaves de actividad en algunos sistemas de órganos y no tiene descriptores para diversos tipos de actividad tales como anemia hemolítica. Por estas y otras razones, la mayoría de los estudios incorporan más de una medición de la actividad de la enfermedad.

Una revisión general del estado de la técnica puede encontrarse en Ramsey-Goldman,

R. y Manzi, S. “Systemic Lupus Erythematosus”. En: Goldman and Hatch. Ed. Women and Health. Academic Press, San Diego, CA, págs. 704-723, (2000).

La esclerosis sistémica (esclerodermia) es un trastorno crónico del tejido conjuntivo caracterizado por inflamación y fibrosis y por cambios degenerativos de los vasos sanguíneos, piel, tracto gastrointestinal, pulmón, corazón y riñón. La esclerodermia es una enfermedad inhabilitante y amenazante para la vida. Se han desarrollado criterios para la clasificación de pacientes con esclerodermia (Masi, AT, Rodnan, GP, Medsger, TA, Jr. y otros, “Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma)”. Arth. Rheum., vol. 23, págs. 581590, (1980)). Estos criterios están destinados para la descripción de grandes series de pacientes en estudios de investigación y no para la diagnosis de pacientes individuales. El criterio principal es los cambios de piel esclerodermatosos (aumento de grosor de la piel) en cualquier lugar próximo a los dedos. Con la adición de cualquiera de dos o más criterios menores [esclerodactilidad (aumento de grosor de la piel que implica a los dedos), cicatrices de depresiones digitales, fibrosis intersticial pulmonar bibasilar], se incrementa la sensibilidad para la diagnosis. Sin embargo, cerca del 10% de los individuos con esclerodermia definida no satisfacen estos criterios (Medsger, TA Jr. “Comment on scleroderma criteria cooperative study”. En: Black, CM, Myers, AR., eds. Current Topics in Rheumatology: Systemic Sclerosis. New York: Gower Medical Publishing, págs. 16-17, (1985)).

El estado de un paciente con esclerodermia o “severidad” de su enfermedad en un momento determinado representa alguna combinación de cambios irreversibles o “daño” y cambios potencialmente reversibles o “actividad”. La inflamación, prematura en el curso de la enfermedad, conduce a la fibrosis y posterior formación de cicatrices. Si se pudiera detectar de manera más exacta la actividad inflamatoria, una intervención más temprana podría prevenir un daño irreversible futuro. Sin embargo, frecuentemente es difícil para los médicos distinguir daño de la enfermedad de actividad de la enfermedad. En parte, esto puede ser debido a que la evidencia clínica de actividad puede ser extremadamente sutil. Además, no existe un marcador de inflamación de laboratorio fiable. La evaluación en corte transversal y longitudinal del daño de la enfermedad y la actividad son esenciales en la evaluación de la historia natural de la enfermedad y en la medición de la eficacia de intervenciones, tanto en pacientes individuales como en ensayos clínicos. Una revisión de este trastorno puede encontrarse en Medsger, TA Jr. “Systemic sclerosis (scleroderma): clinical aspects”. En: Koopman WJ, ed. Arthritis and Allied Conditions, 13th ed. Philadelphia: Lea and Febiger, págs. 1433-1464, (1997).

El sistema complemento está constituido por una red compleja de más de 30 proteínas ligadas funcionalmente que interactúan de una manera altamente regulada para proporcionar muchas de las funciones efectoras de inmunidad humoral e inflamación, sirviendo, de esta forma, como el mecanismo de defensa principal contra infecciones bacterianas y fúngicas. Este sistema de proteínas actúa contra la invasión por organismos extraños mediante tres vías diferentes: la vía clásica (en la presencia de anticuerpo) o la vía alternativa (en la ausencia de anticuerpo) y la vía lectina. Tras la activación, las proteínas dentro de cada vía forman una cascada que implica el auto-ensamblado secuencial en complejos multi-moleculares que llevan a cabo diversas funciones destinadas a erradicar los antígenos extraños que iniciaron la respuesta.

La vía clásica es iniciada usualmente por un anticuerpo unido a una partícula extraña. Consiste en diversos componentes que son específicos de la vía clásica y designados como C1, C4, C2 (en dicho orden en la vía).

En la vía clásica, el primer componente Clq está unido a un complejo antigenoanticuerpo, el cual activa la vía. Este episodio está seguido por la activación secuencial de las dos serina proteasas C1r y C1s. La C1s activada tiene dos substratos, las dos proteínas finales de la vía clásica, es decir, C4 y C2. La proteína C4 se escinde en C4a y C4b. La proteína C2 se escinde para formar C2a y C2b. Los fragmentos C4b y C2a se ensamblan para formar C4b2a, el cual escinde la proteína C3 en C3a y C3b, lo cual completa la activación de la vía clásica.

Los fragmentos C4b y C3b están sometidos a posterior degradación por el Factor I. Este factor escinde C4b para generar C4d y también escinde C3b, para generar iC3b seguido de C3d. De esta forma, la activación de la vía clásica del complemento puede conducir a la deposición de un cierto número de fragmentos, incluyendo C4d e iC3b sobre complejos inmunes u otras superficies de activación. Estos fragmentos son ligandos para el receptor complemento tipo 1 (CR1) sobre eritrocitos o glóbulos rojos.

Existen informes contradictorios referentes a proteínas complemento y SLE. Una manifestación que ha sido informada en pacientes que tienen SLE es una expresión disminuida del receptor complemento CR1 sobre eritrocitos [E-CR1] en comparación con individuos normales. Esto ha sido informado, por ejemplo, por Ross y otros, J. Immunol., vol. 135, pág. 2005, (1985), Corvetta y otros, J. Rheumatol., vol. 18, pág. 1021, (1991) y por otros. Otros estudios parecen mostrar que no existe correlación. Lida y otros, J. Exp. Med., vol. 155, pág. 1427, (1982) ha indicado que el número de CR1 sobre eritrocitos varía inversamente con la actividad de la enfermedad, apareciendo los números más bajos durante los períodos de manifestaciones más severas de SLE, y habiendo sido observados números más altos durante los períodos de remisión en los mismos pacientes.

Tausk y otros (Artrhitis and Rheumatism, vol. 33, No. 6, págs. 888-892, (1990)), Jouvin y otros (Complement, vol. 3, págs. 88-96, (1986) y Hammond y otros (Artrhitis and Rheumatism, vol. 32, No. 3, págs. 259-264, (1989)), informan que el índice de CR1 es decreciente en pacientes con SLE en comparación con el de pacientes que no tienen SLE.

Senaldi y otros, divulgan en Annals of the Rheumatic Diseases, vol. 47, págs. 913-917, (1988), que los índices de activación de C4, C4d y C4d/C4 proporcionan una medida de laboratorio de actividad de la enfermedad en pacientes con SLE.

Manzi y otros, informan en Arthritis and Rheumatism, vol. 39, No. 7, págs. 1178-1188, (1996), que los índices de C4d en suero son un indicador para SLE.

Senaldi y otros, informan en Arthritis and Rheumatism, vol. 32, No. 10, págs. 12621267, (1989), que los índices de C4d soluble son superiores en pacientes con esclerosis sistémica que en grupos de control.

Marquart y otros, divulgan en Clin. Exp. Immunol., vol. 101, págs. 60-65, (1995), un ensayo citométrico de flujo para medir la expresión de receptores complemento y proteínas reguladoras sobre células B procedentes de pacientes con SLE.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCION

La invención implica el uso de determinaciones del componente complemento C4d, y del receptor complemento CR1, un receptor presente sobre la superficie de eritrocitos que actúa como un receptor para fragmentos proteolíticos de C4 y C3.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico o con la cantidad del componente conocido por estar presente sobre la superficie de glóbulos rojos de individuos que no tienen esclerodermia.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de monitorización de la actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico en un individuo o de monitorización de la esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de los glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos previamente obtenidos del individuo.

En aspectos preferidos de la presente invención, el procedimiento incluye igualmente la determinación del receptor complemento CR1 sobre las superficies de glóbulos rojos en la muestra y la comparación de dicha determinación con la cantidad de CR1 presente sobre las superficies de glóbulos rojos de pacientes que no tienen SLE o esclerodermia, respectivamente.

En otros aspectos preferidos de la presente invención, se determina la relación Cd4 a CR1 sobre superficies de glóbulos rojos y se compara con la de pacientes que no tienen SLE o esclerodermia, respectivamente, o si se está realizando la monitorización de un paciente, dicha relación se compara con un tipo de relación previamente determinada para el paciente (o para los glóbulos previamente obtenidos procedentes del paciente).

En otro aspecto preferido de la presente invención, el procedimiento incluye igualmente la determinación del receptor complemento CR1 sobre las superficies de glóbulos rojos en la muestra, y la comparación de dichas determinaciones con la cantidad de CR1 depositado sobre las superficies de glóbulos rojos previamente obtenidos de individuos con lupus eritematoso sistémico y esclerodermia, respectivamente, como un procedimiento de monitorización de la actividad de la enfermedad.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un medio de lectura por ordenador que comprende:

(a): código para la recepción de datos correspondientes a una determinación del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos;

(b): código para la recuperación de un valor de referencia para el componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos;

(c): código para la comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b). en el que la comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b) proporciona información relativa a si un paciente tiene lupus eritematoso sistémico o esclerodermia, en un procedimiento para el diagnóstico o la monitorización del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación automáticamente de la determinación con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos, en el que los códigos (a) a (c) son ejecutados sobre un ordenador digital.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una representación gráfica de índices del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 sobre los glóbulos rojos de individuos sanos, es decir, que no tienen lupus eritematoso sistémico, esclerodermia u otras enfermedades conocidas. La Figura 1a y 1b muestra los mismos datos representados usando dos ejes Y diferentes. Se muestran puntos de corte de C4d y CR1, usados para diferenciar estos controles sanos de pacientes con SLE.

La Figura 2 es una representación gráfica de índices del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 sobre los glóbulos rojos de pacientes diagnosticados como que tienen lupus eritematoso sistémico. La Figura 2a y 2b muestra los mismos datos representados usando dos ejes Y diferentes. Se muestran puntos de corte de C4d y CR1, usados para diferenciar estos pacientes con SLE de controles sanos.

La Figura 3 es una representación gráfica de índices del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 sobre los glóbulos rojos de pacientes con enfermedades distintas de SLE y esclerodermia.

La Figura 4 es una representación gráfica de índices del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 sobre los glóbulos rojos de individuos sanos, es decir, que no tienen lupus eritematoso sistémico, esclerodermia u otras enfermedades conocidas. Estos son los mismos controles sanos representados en la Figura 1. En esta Figura, se muestra el punto de corte usado para distinguir estos controles sanos de pacientes con esclerodermia. No se requiere un punto de corte de CR1 para distinguir estos dos grupos.

La Figura 5 es una representación gráfica de índices del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 sobre los glóbulos rojos de pacientes diagnosticados como que tienen esclerodermia. Se muestra el punto de corte de C4d, usado para diferenciar estos pacientes con esclerodermia de controles sanos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Exposición general

Los procedimientos de la presente invención posibilitan la diagnosis y/o monitorización de SLE y esclerodermia. Dado que estos dos estados son serios problemas de sanidad, existe una necesidad de una diagnosis relativamente exacta y temprana de estos estados. De igual forma, es de gran importancia la capacidad para monitorizar la actividad de estas enfermedades.

La invención implica el uso de determinaciones del componente complemento C4d y opcionalmente también del componente receptor CR1, un receptor presente sobre las superficies de eritrocitos que actúa como un receptor para fragmentos proteolíticos de C3 y C4.

En el sentido más general, los procedimientos de la presente invención están basados en el descubrimiento por los presentes inventores de que una determinación de C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de un paciente puede servir como un marcador de diagnóstico tanto para SLE como para esclerodermia. Tal como se expondrá más adelante, una combinación de esta determinación con una determinación de CR1 expresado sobre superficies de glóbulos rojos del mismo paciente puede ayudar a distinguir entre SLE y esclerodermia, así como ayudar a los doctores a distinguir entre las dos enfermedades y otras enfermedades que tienen manifestaciones similares.

En el diagnóstico de la incidencia, o la incidencia previa, o bien de la enfermedad, se determinó el componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en una muestra. Preferiblemente, se determinó también el receptor complemento CR1 sobre las superficies de los mismos glóbulos rojos. A continuación, una o ambas de estas determinaciones se compararon con las cantidades de C4d y CR1, respectivamente, que usualmente se encuentran sobre las superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen SLE o esclerodermia.

En la monitorización de la actividad de la enfermedad de un paciente con uno u otro trastorno, se hicieron las mismas determinaciones en la muestra de sangre de los pacientes y, a continuación, se compararon con las determinaciones de las cantidades de C4d y CR1 presentes sobre superficies de glóbulos rojos en una muestra obtenida del mismo paciente anteriormente.

En ambos casos, cuando se habla de “determinación” y “cantidad”, los presentes autores incluyen tanto una cantidad absoluta o cantidad de material, así como (además, o como alternativa), una relación de C4d a CR1. Tal como se expondrá más adelante, pueden usarse cualquiera o ambas de estas mediciones, particularmente en el diagnóstico tanto del SLE como de esclerodermia en un paciente.

Procedimientos generales

La invención implica la realización de ensayos sobre muestras de sangre obtenidas a partir de pacientes para determinar C4d y preferiblemente también CR1.

Las muestras de sangre se obtuvieron a partir del paciente y se trataron con EDTA (etilenodiaminotetraacetato) para inhibir la activación del complemento. Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente o bajo condiciones de frio. Los ensayos se llevaron a cabo preferiblemente dentro de las 48 horas.

La determinación de C4d y CR1 puede realizarse mediante un cierto número de procedimientos incluyendo citometría de flujo, ELISA usando lisatos de glóbulos rojos, y radioinmunoensayo. En una realización de la presente invención, la determinación del índice de C4d y CR1 se llevó a cabo usando procedimientos citométricos de flujo, con mediciones tomadas mediante inmunofluorescencia directa o indirecta usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para cada una de las dos moléculas. Cada una de estas dos moléculas puede medirse con una muestra separada o usando una única muestra. El canal de fluorescencia medio (MFC) para CR1 y C4d sobre eritrocito se determinó individualmente. Puede usarse el mismo tipo de ensayo para diagnosis o para monitorización de la actividad de la enfermedad en pacientes que se sabe que tienen SLE o esclerodermia.

El desarrollo de un ensayo de este tipo para CR1 y C4d es conocido en la técnica y está descrito por Freysdottir y otros, en J. Immunol. Meth., vol. 135, pág. 2005, (1991). Dicho ensayo fue un ensayo citométrico de flujo para CR1 y para fragmentos de proteína de C4d y C3d sobre eritrocitos, y ha sido descrito como que permite la identificación de individuos que tienen índices comparativamente altos o comparativamente bajos de CR1. Sin embargo, los C4d y C3d sobre eritrocitos fueron bajos y frecuentemente no detectables por encima del valor de fondo (límites de detección). Estos autores sugieren un posible uso de su ensayo para proporcionar información general referente a la carga o aclaramiento de complejo inmune en pacientes. Sin embargo, su trabajo se limitó a desarrollar el ensayo para uso general. No investigaron el uso o aplicación de su trabajo para el diagnóstico o monitorización de la actividad de enfermedades particulares.

Kits

Los kits para la realización de los ensayos tanto para el diagnóstico de la enfermedad como para la monitorización de la actividad de la enfermedad, usan cualquiera de los diversos reactivos necesarios para llevar a cabo los procedimientos descritos en la presente invención. Por ejemplo, en el uso de ensayos de inmunofluorescencia, los kits comprenden generalmente un conjugado de anticuerpo monoclonal específico para el componente complemento C4d con un resto fluorescente, y preferiblemente también un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para el receptor complemento CR1 con un resto fluorescente diferente. Adicional-mente, los kits comprenderán otro material tal como el que pueda ser necesario para la realización de ensayos de este tipo, por ejemplo, tampones, anticuerpos radiomarcados, reactivos de colorimetría, etc.

Los anticuerpos para uso en estos procedimientos y kits son conocidos. Los hibridomas que secretan anticuerpos Anti-CR1 se encuentran disponibles de la American Type Culture Collection en Maryland (ATCC #HB 8592). Una referencia general es la Patente de EE.UU.

4.672.044. Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA. Los anticuerpos Anti-C4d se encuentran disponibles de Quidel Corp., en San Diego, California (#A213) y se encuentran descritos de manera general por Rogers, J., N. Cooper, y otros, en “Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease”, PNAS, vol.89, págs. 10016-10020, (1992); Schwab, C. y otros, “Neurofibrillary tangles of Guam Parkinson-dementia are associated with reactive microglia and complement proteins”, Brain Res., vol. 707, (no. 2), pág. 196, (1996); Gemmell, C. “A flow cytometric immunoassay to quantify adsorption of complement activation products on artificial surfaces”, J. Biomed. Mater Res., vol. 37, págs. 474-480, (1997); y Stoltzner, S.E. y otros, “Temporal accrual of complement proteins in amyloid plaques in patients with Down’s syndrome

with Alzheimer disease”, Am. J. Path., vol. 156, págs. 489-499, (2000).

La determinación de los valores de C4d y CR1 puede alternativamente ser llevada a cabo usando un cierto número de técnicas de medición convencionales tales como ELISA. En lugar de marcadores fluorescentes, pueden usarse marcadores de otros tipos, tales como marcadores radioactivos y colorimétricos. Si han de usarse dichos otros tipos de ensayos, los kits comprenderán anticuerpos monoclonales específicos para C4d y CR1 conjugados con marcadores apropiados tales como yodo radioactivo, avidina, biotina o enzimas tal como peroxidasa.

Procedimientos de diagnóstico

La diagnosis de un paciente con SLE o esclerodermia se lleva a cabo comparando la determinación de Cd4 y preferiblemente también de CR1 con un valor base o intervalo de valores para las cantidades de estas entidades típicamente presentes sobre las superficies de glóbulos rojos en individuos normales. En individuos normales, el C4d está presente en índices relativamente bajos sobre superficies de glóbulos rojos. Cuando se usa medición citométrica de flujo con inmunofluorescencia indirecta, el MFC de C4d sobre glóbulos rojos en individuos sanos varía desde 1,06 hasta 16,12 (media 5,7). (Tabla II y Tabla VII). El MFC de Cd4 sobre eritrocitos en pacientes que tienen SLE fue mayor que el de los individuos sanos y varió desde 2,66 hasta 155,03 (media 23,9). (Tabla III y Tabla VII). Los pacientes con esclerodermia tenían también índices elevados de Cd4 comparados con individuos sanos. En pacientes con esclerodermia, el MFC de Cd4 sobre eritrocitos varía desde 2,86 hasta 28,89 (media 11,6). (Tabla VI y Tabla V).

Inversamente, tal como es generalmente sabido en la técnica, el índice de CR1 sobre superficies de eritrocitos de individuos que tienen SLE fue usualmente menor que en individuos sanos. En estos últimos, el valor de MFC para CD1 sobre eritrocitos varió desde 10,53 hasta 50,83 (media 25,4). (Tabla II y Tabla VII), en tanto que el MFC para CR1 sobre eritrocitos procedentes de pacientes que tienen SLE varió desde 1,41 hasta 40,89 (media 12,4). (Tabla VIII y Tabla VII). Los pacientes con esclerodermia tenían valores de MCF para CR1 sobre eritrocitos (intervalo de 4,69 a 38,26, media 18,4) (Tabla VI y Tabla VII) que fueron menores que los de los individuos sanos, pero mayores que los individuos con SLE.

Una indicación adicional de una diagnosis de SLE está basada en la relación de CR1 sobre eritrocitos a Cd4 sobre eritrocitos en estos ensayos. Más del 93% de los pacientes con SLE tenían una relación CR1:C4d menor de 3,00, en tanto que más del 77% de individuos sanos tenían una relación superior a 3,00. De acuerdo con ello, una relación de CR1:C4d menor de 3,00 en un individuo es una indicación de SLE.

Un procedimiento adicional para distinguir entre una diagnosis de SLE y una diagnosis

de esclerodermia es comparar las relaciones de CR1:C4d sobre eritrocitos. Más del 47% de pacientes con SLE tenía una relación CR1:C4d menor de 0,69, en tanto que únicamente uno de 30 pacientes con esclerodermia tenía una relación de CR1:C4d menor de 0,69. De acuerdo con ello, una relación de CR1:C4d menor de 0,69 distingue el SLE de la esclerodermia.

Monitorización de pacientes

Una característica particular de los procedimientos de la presente invención es la capacidad para monItorizar la actividad de una enfermedad de un paciente. El lapso de vida de un glóbulo rojo es aproximadamente de 120 días. Por ello, una característica particular de este ensayo o procedimiento es la de indicar o reflejar la actividad del SLE o de la esclerodermia que se ha producido en paciente durante varias semanas o incluso varios meses precedentes. Es posible, usando este procedimiento, identificar la incidencia de una reactivación de SLE o de esclerodermia durante unas pocas semanas previas o posiblemente incluso varios meses previos debido a la persistencia del C4d depositado sobre la superficie de glóbulos rojos. El seguimiento en el tiempo de una incidencia previa puede realizarse de manera aproximada separando de la muestra los eritrocitos que portan Cd4 y averiguando su edad mediante técnicas convencionales tales como centrifugación mediante gradientes de densidad (Rennie, C.M.,

S. Thompson y otros, ”Human erythrocyte fractionation in Percoll density gradients”, Clinica Chimica Acta, vol. 98, págs. 119-125, (1979)).

Igualmente importante es que el procedimiento de la presente invención es capaz de detectar la evidencia de activación de complementos en esclerodermia, la cual es una enfermedad relativamente no inflamatoria. Actualmente, no existen marcadores disponibles útiles, o, para dicho fin, marcadores de ningún tipo, para la medición de la actividad de la enfermedad de esclerodermia.

Automatización y software de ordenador

Las determinaciones de C4d y CR1 y el los procedimientos de diagnóstico y de monitorización de la actividad de la enfermedad descritos anteriormente pueden realizarse manualmente, pero frecuentemente se realizan de manera conveniente usando un sistema y/o equipo automatizado, en el cual la muestra de sangre es analizada automáticamente para llevar a cabo la determinación o determinaciones necesarias, y la comparación con la base o valor de referencia se lleva a cabo automáticamente, usando un software de ordenador apropiado para tal fin.

De acuerdo con ello, en un aspecto, la invención comprende un procedimiento de diagnóstico o monitorización del lupus eritematoso sistémico en un individuo, que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 depositados sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación automáticamente de dichas determinaciones con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, sobre superficies de glóbulos rojos. En otro aspecto, este procedimiento automatizado incluye uno en el cual los valores de referencia comprenden una relación de C4d:CR1.

La invención comprende igualmente un procedimiento de diagnóstico o monitorización de esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 depositados sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación automáticamente de dichas determinaciones con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, sobre superficies de glóbulos rojos. En otro aspecto, este procedimiento automatizado incluye igualmente uno en el cual los valores de referencia comprenden una relación de C4d:CR1.

Otro aspecto de la invención comprende un procedimiento de diagnóstico o monitorización del lupus eritematoso sistémico en un individuo, que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación automáticamente de dicha determinación con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos.

Un aspecto adicional de la invención comprende un procedimiento de diagnóstico o monitorización de la esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y

(b): la comparación automáticamente de dicha determinación con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos.

Un aspecto adicional de la invención comprende el uso de medios de lectura por ordenador, incluyendo los medios de lectura por ordenador:

(b): código para la recuperación de un valor de referencia para el componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos; y

(c) código para la comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b).

en el que la comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b) proporciona in

formación relativa a si un paciente tiene lupus eritematoso sistémico o esclerodermia, en un procedimiento para el diagnóstico o la monitorización del lupus eritematoso sistémico o la esclerodermia en un individuo que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación automáticamente de la determinación con un valor de referencia para componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos, en el que los códigos (a) a (c) son ejecutados sobre un ordenador digital.

De acuerdo con una realización preferida del uso anteriormente mencionado, los medios de lectura por ordenador pueden comprender además:

(d): código para la recepción de datos correspondientes a una determinación del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos;

(e): código para la recuperación de un intervalo de valores de referencia para el receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos; y

(f) código para la comparación de los datos en (d) con los valores de referencia de (e).

En realizaciones de la invención, pueden almacenarse uno o más valores de referencia en una memoria asociada con un ordenador digital. Después de haberse obtenido los datos correspondientes a una determinación del complemento C4d (por ejemplo, a partir de un instrumento analítico apropiado), el ordenador digital puede comparar los datos de C4d con uno o más valores de referencia apropiados. Después de llevar a cabo esta comparación, el ordenador digital puede determinar automáticamente si los datos correspondientes a la determinación del complemento C4d están asociados con SLE.

De acuerdo con ello, las realizaciones de la invención son realizadas por el código del ordenador, el cual está ejecutado por un ordenador digital. El ordenador digital puede ser un ordenador de estructura micro, mini o grande, que use cualquier sistema operativo convencional o especializado tal como un sistema operativo basado en Windows™. El código puede almacenarse sobre cualquier medio de lectura de ordenador adecuado. Los ejemplos de medios de lectura por ordenador incluyen magnético, electrónico, o discos ópticos, cintas, lápices, chips, etc. El código puede ser igualmente escrito por los expertos normales en la técnica y en cualquier lenguaje de programación de ordenador adecuado incluyendo C, C++, etc.

Los ejemplos siguientes se proporcionan únicamente a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no críticos los cuales podrían cambiarse o modificarse para proporcionar resultados esencialmente similares.

EJEMPLOS Y DATOS EXPERIMENTALES

Ejemplo 1: Ensayos de C4d y CR1 en controles sanos: Fluctuación mínima con el tiempo

Inicialmente, se estudiaron seis individuos sanos. Cada uno de estos controles normales se estudió sobre al menos dos días separados, y un individuo se estudió sobre seis días diferentes a lo largo de un intervalo de tres meses. Tal como se muestra en la Tabla I, el Cd4 se detectó a bajos niveles sobre eritrocitos de cada uno de los seis individuos sanos, y el índice de C4d detectado fue señaladamente constante a lo largo de los días, semanas, e incluso meses dentro de un individuo dado. Estos datos demostraron que el Cd4 podría ser detectado de manera fácil y fiable sobre eritrocitos de cualquier individuo, y los índices consistentes observados en individuos sanos indicaron que incluso ligeras fluctuaciones reflejan actividad de la enfermedad. Tal como se esperaba, el CR1 estuvo presente a índices mucho más altos que el C4d sobre eritrocitos de todos los individuos normales, incluso los índices de CR1 demostraron fluctuación mínima a lo largo de los días, semanas, e incluso meses.

Se extrajeron muestras de 1 ml de sangre periférica anti-coagulada con EDTA procedente de cada individuo y se usó como una fuente de glóbulos rojos. Los glóbulos se lavaron y resuspendieron en tampón FACS. Los índices de C4d y CR1 se midieron mediante inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos monoclonales específicos para C4d y CR1, respectivamente, midiéndose cada C4d y CR1 con una muestra separada. Los índices de C4d y CR1 se cuantificaron mediante citometría de flujo usando un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson). Los glóbulos rojos se identificaron mediante dispersor frontal y lateral y el canal de fluorescencia media (MFC) se determinó individualmente para C4d y CR1, respectivamente.

Más particularmente, la sangre se recogió en tubos con cierre de lavanda de 5 cc conteniendo EDTA como anticoagulante (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). La sangre entera se diluyó en solución salina tamponada con fosfato conteniendo 1% de suero de becerro bovino (PBSB). Los eritrocitos se granularon, se lavaron con PBSB, y se repartieron en partes alícuotas para el teñido de anticuerpos. Se agregaron anticuerpos monoclonales (mAb) a los eritrocitos a una concentración de 10 µg/ml. Las células se incubaron durante 20 minutos a 4ºC, y se lavaron con PBSB frío + azida sódica al 0,2%. A las células se agregó un anticuerpo secundario, IgG anti-ratón de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de Jackson Immunoresearch Laboratories (# 115-096-062) a una concentración de 10 µg/ml. Las células se incubaron y lavaron tal como se ha descrito anteriormente, se resuspendieron en PBSB + azida sódica al 0,2%, y se analizaron mediante citometría de flujo usando un FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). La unión no específica de inmunoglobulinas a eritrocitos se determinó mediante la realización de ensayos idénticos en paralelo usando el isotipo de anticuerpo de control MOPC21 (obtenido de ATCC). Las uniones específicas de anti-C4d y anti-CR1 se determinaron restando el MFC obtenido con MOPC21 del MFC obtenido con anti-C4d y anti-CR1, respectivamente. Sibinovic, K.H., M. Potter, L. D’Hoostelaere, B. Rode, J. Wax, Catalogue of Plasmacytomas and Other Tumors of the Lymphoreticular System, Third Edition, Litton Bionetics, Inc., pág. 33, (1976).

Tabla I. Cd4 y CR1 sobre eritrocitos de individuos sanos

Individuos sanos Fecha C4d CR1

001 120700 9,06 55,12 001 130700 9,47 54,35 001 140700 9,66 53,54 001 200700 9,88 51,61

002 130700 6,91 40,50 002 200700 6,13 47,07

003 140700 8,94 23,06 003 200700 8,68 22,45

004 140700 10,77 53,82 004 200700 10,82 50,91 004 091000 10,06 45,24

005 300800 8,36 32,42 005 070900 10,31 30,49 005 250900 10,06 32,99 005 270900 8,77 28,51 005 051000 8,63 31,02 005 081100 8,88 25,83

006 091000 7,04 36,47 006 251000 6,84 34,20

(Continuación) Individuos sanos Fecha C4d CR1

006 281100 6,85 35,24

Ejemplo 2: Ensayos de CR1 y C4d para distinguir pacientes con SLE de controles sanos

Este ejemplo describe la realización de ensayos sobre pacientes para la diagnosis del lupus eritematoso sistémico, y para establecer valores de referencia o intervalos de valores para el componente complemento Cd4 y para el receptor complemento CR1.

Los estudios piloto de determinaciones en serie en individuos normales fueron seguidos mediante estudios de pacientes con SLE. Para este fin, los presentes inventores reclutaron 86 pacientes con lupus procedentes de la consulta externa de los presentes inventores. Se realizó una única determinación de CR1 y C4d sobre eritrocito, usando el mismo ensayo, en 86 individuos que cumplían con los criterios ACR para la diagnosis de SLE (Tabla III) y en 35 controles sanos (Tabla II). Los valores medios y la mediana de CR1 y C4d para pacientes con SLE y controles sanos se muestran en la Tabla VII. En tanto que el valor medio para C4d en individuos sanos fue de 5,7, el valor medio para C4d entre pacientes con SLE fue de 23,9 (p=0,0001). El MFC medio para CR1 entre los 35 individuos sanos fue de 25,4, en tanto que el MFC medio para CR1 en los 86 pacientes con SLE fue de 12,4 (p=0,0001). Las Figuras 1(a,b) y 2(a,b) representan gráficas de determinaciones de muestras individuales de C4d frente a CR1 en los 35 individuos sanos y en los 86 pacientes con SLE, respectivamente.

Tabla II. Controles sanos (n=35)

ID: RBC CR1 RBC C4

2001: 48,11 8,66

2002: 36,85 3,36

2003: 19,55 5,43

2004: 50,83 5,95

2005: 38,39 5,74

2006: 28,98 4,92

2007: 41,82 6,65

2008: 32,86 3,43

2009: 22,26 3,11

2010: 32,62 5,53

2011: 20,28 16,12

2012: 18,08 7,86

(Continuación)

ID: RBC CR1 RBC C4

2013: 24,91 5,90

2014: 19,99 6,13

2015: 29,34 4,46

2016: 16,00 4,73

2017: 34,83 2,05

2018: 10,53 5,49

2019: 23,47 4,93

2020: 16,57 4,09

2021: 25,76 8,52

2022: 14,19 3,50

2025: 10,86 12,62

2026: 16,55 5,89

2027: 25,56 4,39

2028: 23,81 5,69

2029: 21,27 2,81

2030: 10,78 4,32

2031: 17,89 10,84

2032: 28,70 4,94

2033: 26,27 1,06

2034: 32,08 4,30

2035: 12,46 5,64

2036: 35,16 5,45

2037: 23,31 5,06

Tabla III. Pacientes con SLE (n=86) ID paciente RBC CR1 RBC C4

1001 5,81 25,68 1002 6,98 12,87 1003 7,87 55,28 1004 14,27 155,03 1005 30,60 45,00 1006 9,22 43,76 1007 40,89 13,45 (Continuación)

ID paciente RBC CR1

1008 7,18 1009 14,32 1010 12,23 1011 23,93 1012 12,41 1013 12,26 1014 19,18 1015 1,41 1016 4,77 1017 15,87 1018 14,48 1019 15,44 1021 17,11 1022 12,19 1023 12,56 1024 13,75 1025 5,20 1026 7,07 1027 6,40 1029 11,27 1030 18,39 1031 6,29 1032 5,67 1033 9,24 1034 12,45 1035 35,40 1036 7,37 1037 19,09 1038 7,10 1039 23,19 1040 20,26 1041 18,62 1042 9,32

RBC C4

27,00 13,66 33,17 18,65 6,16 20,64 17,74 11,61 16,52 8,92 9,78 10,53 11,13 70,62 22,68 13,02 13,65 6,95 6,85 4,14 5,10 25,40 6,53 9,24 8,53 22,65 31,18 11,56 83,70 22,98 7,70 12,02 16,86

(Continuación)

ID paciente RBC CR1

1043 19,68 1044 23,86 1045 10,32 1046 17,47 1047 8,84 1048 5,27 1049 13,53 1050 19,54 1051 2,99 1052 10,59 1053 13,94 1054 3,43 1055 19,19 1056 20,63 1057 17,56 1058 6,43 1059 5,62 1060 17,36 1061 11,79 1062 12,83 1063 9,41 1064 5,59 1065 11,07 1066 1,92 1067 18,96 1068 7,65 1071 10,32 1072 5,57 1073 6,82 1074 16,60 1075 11,66 1076 5,87 1077 12,53

RBC C4

9,49 5,46 12,91 8,49 17,76 19,44 10,24 17,51 13,29 12,35 93,05 88,92 30,64 13,39 9,41 14,22 10,26 5,03 21,94 25,85 12,92 27,63 2,73 31,26 10,75 89,64 3,54 4,63 22,05 2,66 11,61 146,43 14,51

(Continuación)

ID paciente: RBC CR1 RBC C4

1078: 4,22 9,72

1079: 10,50 11,58

1080: 9,38 27,02

1081: 14,03 27,93

1082: 6,57 19,94

1083: 8,92 6,64

1084: 21,93 9,50

1085: 7,91 32,65

1086: 12,70 13,90

1087: 5,43 67,68

1089: 5,12 10,63

1090: 8,16 34,54

1091: 11,96 6,51

Estas observaciones indicaron que las determinaciones combinadas de índices de CR1 y C4d sobre eritrocitos serían un ensayo de diagnóstico útil para SLE. Usando el análisis estadístico CART, los presentes autores determinaron la sensibilidad y especificidad del C4d y CR1 sobre eritrocitos en la diagnosis de SLE usando puntos de corte generados por ordenador. La sensibilidad es la probabilidad de que el ensayo sea positivo en una persona que tiene la enfermedad y la especificidad es la probabilidad de que el ensayo sea negativo en una persona que no tiene la enfermedad. Estos puntos de corte se demuestran en las Figuras 1 y 2 mediante las líneas continuas que dividen los gráficos en cuatro cuadrantes. Estos gráficos demuestran que el “perfil del lupus” que fue el más comúnmente observado fue un CR1 bajo y un C4d elevado. En pacientes con SLE comparados con controles sanos, la sensibilidad y especificidad de estas medidas fueron del 87% y 91%, respectivamente (Tabla VIII). Igualmente, se determinaron los valores predictivos positivos y los valores predictivos negativos. El valor predictivo positivo (PPV) es la probabilidad de que una persona tenga la enfermedad si el ensayo es positivo. El PPV para SLE frente a Controles Sanos fue del 96%. El valor predictivo negativo (NPV) es la probabilidad de que una persona no tenga la enfermedad si el ensayo es negativo. El NPV para SLE frente a Controles Sanos fue del 74%. Ningún otro ensayo actualmente disponible tiene tales altos PPV y NPV combinados. Estos datos indican la utilidad de las determinaciones de CR1 y C4 sobre eritrocitos en la diagnosis del SLE.

Ejemplo 3: Ensayos de CR1 y C4d para distinguir pacientes con SLE de pacientes con otras

enfermedades

Estos estudios de pacientes con SLE frente a controles sanos fueron seguidos por estudios para comparar pacientes con SLE con pacientes diagnosticados con enfermedades distintas del SLE (n=111). Para esta comparación, los presentes autores estudiaron pacientes con artritis reumatoide (n=15), osteoartritis (n=2), infección por virus de la hepatitis C (n=17), polimiositis/dermatomiositis (n=33), granulomatosis de Wegener (n=1), síndrome de Sjogren (n=3), sarcoidosis (n=1), vasculitis urticariana (n=1), anemia de hematíes falciformes (n=8), síndrome de solapamiento/enfermedad de tejido conjuntivo no diferenciado (n=15), leucemia/linfoma (n=9), síndrome de Raynaud primario (n=3), hemofilia (n=2), y artritis psoriática (n=1). Se llevó a cabo una única determinación de CR1 y C4d sobre eritrocitos, usando el mismo ensayo. En la Tabla VII se muestra los valores medios y la mediana de CR1 y C4d para pacientes con SLE, comparados con pacientes con otras enfermedades. En tanto que el valor medio para C4d en pacientes con otras enfermedades fue de 9,3, el valor medio para C4d entre pacientes con SLE fue de 23,9 (p=0,0001). El MFC medio para CR1 entre los 111 pacientes con otras enfermedades fue de 18,3, en tanto que el MFC medio para CR1 en los 86 pacientes con SLE fue de 12,4 (p=0,0001). La Figura 3 es una gráfica de determinaciones de muestras individuales de C4d frente a CR1 en los 111 pacientes con otras enfermedades. En pacientes con SLE comparado con pacientes con otras enfermedades, la sensibilidad y especificidad de estas mediciones fue del 87% y 89%, respectivamente (Tabla VIII). El PPV y NPV fueron del 86% y 90%, respectivamente. Ningún otro ensayo actualmente disponible tiene dicha alta probabilidad combinada.

Ejemplo 4: Ensayos de CR1 y C4d para la medición de la actividad de la enfermedad en pacientes con SLE

A continuación, los presentes autores examinaron la utilidad de los índices de CR1 y C4d sobre eritrocitos en la medición de la actividad de la enfermedad tal como se define mediante la Medida de Actividad del Lupus Sistémico (SLAM). Los presentes autores presentan los resultados de los primeros 86 pacientes de lupus que formaron parte del estudio. Usando un modelo de regresión lineal univariante, el CR1 sobre eritrocito (p=0,0007) fue el único pronosticador significativo de la SLAM (Tabla IV). El suero C3, C4 y anticuerpo anti-ADNds no se asociaron significativamente con la actividad de la enfermedad. En modelos multivariantes, que controlan todas las variables, el CR1 sobre eritrocitos se asoció independientemente con la SLAM (p=0,001) (Tabla V). La asociación de anticuerpos anti-ADNds con la actividad de la enfermedad no alcanzó importancia estadística en este análisis multivariante. Estos datos muestran que las determinaciones de C4d y CR1 sobre eritrocitos proporcionan información útil clínicamente valiosa que no se obtiene con las mediciones del “patrón oro” tradicionales de suero C3, suero C4, y anticuerpo anti-ADNds.

Tabla IV. Asociación con análisis univariante de actividad de la enfermedad de SLE

Variable valor p E-CR1 0,0007 E-C4 0,6 Suero C3 0,93 Suero C4 0,81 Ab anti-ADNds 0,15

Tabla V. Asociación con análisis multivariante de actividad de la enfermedad de SLE

Variable valor p E-CR1 0,001 Ab anti-ADNds 0,07

Ejemplo 5: Uso de la determinación de C4d para la diagnosis de la esclerodermia

Se usó la misma metodología para ensayar una muestra de 30 pacientes con esclerodermia (Tabla VI) en comparación con los mismos 35 individuos sanos (Tabla II). Mientras que el valor medio para C4d en individuos sanos fue de 5,7, el valor medio para C4d entre pacientes con esclerodermia fue de 11,6 (p=0,0001, Tabla VII). El MFC medio para CR1 entre los 35 controles normales fue de 25,4, mientras que el MFC medio para CR1 en los 30 pacientes con esclerodermia fue de 18,4 (p=0,0001, Tabla VII). La Figura 4 es una gráfica de determinaciones de muestras individuales de C4d frente a CR1 en 35 individuos sanos. La Figura 5 es una gráfica de determinaciones de muestras individuales de C4d frente a CR1 en 30 pacientes con esclerodermia.

Tabla VI. Pacientes con esclerodermia (n=30)

ID paciente: RBC CR1 RBC C4

3001: 38,26 16,77

3002: 10,97 9,71

3003: 28,77 15,33

3004: 17,85 7,96

3006: 23,95 22,12

3008: 16,26 8,41

(Continuación)

ID paciente: RBC CR1 RBC C4

3009: 18,92 19,95

3010: 15,12 10,80

3011: 27,05 6,37

3012: 32,42 10,74

3013: 9,62 8,46

3014: 10,03 12,87

3017: 19,69 8,51

3019: 13,93 5,38

3020: 13,79 8,25

3021: 26,40 7,82

3022: 13,67 5,26

3023: 10,06 2,86

3024: 20,02 28,89

3025: 14,32 19,30

3026: 4,69 12,73

3027: 20,06 9,98

3028: 25,37 6,15

3029: 15,3 6,66

3030: 19,2 8,00

3031: 21,28 26,12

3032: 11,80 13,70

3034: 11,13 5,78

3035: 24,19 17,00

3036: 19,3 5,84

Tabla VII. Análisis de RBC-CR1 y RBC-C4

RCB-CR1: RBC-C4d

Media Desviación típica: Mediana Media Desviación típica Mediana

SLE (n=86): 12,4 7,2 11,5 23,9 27,9 13,6

Esclerodermia

(n=30): 18,4 7,5 18,4 11,6 6,5 9,1

Controles sa

nos (n=35): 25,4 10,2 23,8 5,7 2,9 5,4

(Continuación)

RCB-CR1 RBC-C4d

Media Desviación típica Mediana Media Desviación típica Mediana

Otras enfermedades (n=111) 18,3 7,3 17,3 9,3 6,8 8,0

Los RBC CR1 y C4 no se distribuyeron normalmente en ninguna de las comparaciones. Por ello, se usó en ensayo de suma de filas de Wilconxon.

Comparación CR1 (valores p) C4 (valores p) SLE frente a controles sanos 0,0001 0,0001 SLE frente a otras enfermedades 0,0001 0,0001 SLE frente a esclerodermia 0,0001 0,004 Esclerodermia frente a controles sanos 0,004 0,0001

Usando un análisis estadístico CART, los presentes autores determinaron la sensibilidad y especificidad de C4d y CR1 sobre eritrocitos en la diagnosis de esclerodermia usando puntos de corte generados por ordenador. En pacientes con esclerodermia en comparación con controles sanos, la sensibilidad y especificidad de estas medidas fue del 83% y 80%, respectivamente (Tabla VIII). Igualmente, se determinaron los valores predictivos positivos y los valores predictivos negativos. El PPV para distinguir pacientes con esclerodermia de los controles sanos fue del 78%. El NPV para distinguir pacientes con esclerodermia de los controles sanos fue del 85%. No existe ensayo de laboratorio individual actualmente usado con sensibilidad y especificidad, PPV, y NPV equivalentes para esclerodermia.

Tabla VIII. Análisis CART de RBC-CR1 y RBC-C4d

Comparación: Sensibilidad Especificidad PPV NPV

SLE frente a control sano: 0,87 0,91 0,96 0,74

SLE frente a otras enfermedades: 0,87 0,89 0,86 0,90

Esclerodermia frente a controles sanos: 0,83 0,80 0,78 0,85

Claims

Reivindicaciones

1.

Un procedimiento de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico o con la cantidad de dicho componente conocido por estar presente sobre la superficie de glóbulos rojos de individuos que no tienen esclerodermia.
2.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico en el que la etapa a) comprende además la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa b) comprende además la comparación de dicha determinación con la cantidad de receptor CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico.
3.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico de esclerodermia, que comprende además la determinación, en la muestra de sangre del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa

(b) comprende la comparación de la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra con la relación de C4d:CR1 sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen esclerodermia.
4.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico del lupus eritematoso sistémico, en el que el componente complemento C4d se determina en la etapa (a) automáticamente, y en el que en la etapa (b) la determinación se compara automáticamente con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos.
5.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el componente complemento C4d y el receptor complemento CR1 se determinan en la etapa (a) automáticamente, y en el que en la etapa (b) la determinación se compara automáticamente con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, depositados sobre superficies de glóbulos rojos.
6.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico de esclerodermia, en el que el componente complemento C4d se determina en la etapa (a) automáticamente, y en el que en la etapa (b) la determinación se compara automáticamente con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 de diagnóstico de escleroder

mia, en el que la etapa (a) comprende la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d y del receptor complemento CR1 depositados sobre superficies de los glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa (b) comprende la comparación automáticamente de dichas determinaciones con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, sobre superficies de glóbulos rojos.
8.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la determinación de C4d se realiza mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un resto marcado, y la determinación del resto marcado.
9.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el resto marcado es un resto fluorescente.
10.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el resto fluorescente se determina mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.
11.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la etapa (b) comprende la comparación de la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra con la relación de C4d:CR1 sobre superficies de glóbulos rojos de individuos que no tienen lupus eritematoso sistémico.
12.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las determinaciones de C4d y CR1 se realizan mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un primer resto marcado, la unión de CR1 a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para CR1 con un segundo resto marcado, y la determinación del primer y segundo restos marcados.
13.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que los restos marcados son restos fluorescentes.
14.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que los restos fluorescentes se determinan mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.
15.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 ó 7, en el que los valores de referencia comprenden una relación de C4d:CR1.
16.

Un procedimiento de monitorización de la actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico en un individuo o de monitorización de la esclerodermia en un individuo, que comprende (a) la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de los

glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación de la determinación con la cantidad de componente C4d depositado sobre superficies de los glóbulos rojos previamente obtenidos del individuo.
17.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la determinación de C4d se realiza mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un resto marcado, y la determinación del primer resto marcado.
18.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el resto marcado es un resto fluorescente.
19.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el resto fluorescente se determina mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.
20.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el componente complemento C4d se determina automáticamente en la etapa (a), y en el que dicha determinación se compara automáticamente con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la etapa (b).
21.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16 de monitorización de la actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico, en el que la etapa a) comprende además la determinación, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y en el que la etapa b) comprende demás la comparación de dicha determinación con la cantidad de receptor CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos previamente obtenidos del individuo.
22.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la etapa (b) comprende la comparación de la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra con la relación de C4d:CR1 depositada sobre superficies de glóbulos rojos previamente obtenidos del individuo.
23.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la determinación de C4d y CR1 se realiza mediante un procedimiento que comprende la unión de C4d a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para C4d con un primer resto marcado, la unión de CR1 a un conjugado de un anticuerpo monoclonal específico para CR1 con un segundo resto marcado, y la determinación del primer y segundo restos marcados.
24.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que los restos marcados son restos fluorescentes.
25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que los restos flúores centes se determinan mediante la determinación del canal de fluorescencia medio usando análisis citométrico de flujo.
26.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el componente complemento C4d y el receptor complemento CR1 se determinan automáticamente en la etapa (a), y en el que dichas determinaciones se comparan automáticamente en la etapa (b) con valores de referencia para el componente C4d y el receptor CR1, respectivamente, sobre superficies de glóbulos rojos.
27.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, en el que los valores de referencia comprenden una relación de C4d:CR1.
28.

Uso de un medio de lectura por ordenador, comprendiendo dicho medio de lectura por ordenador:

(a)

código para la recepción de datos correspondientes a una determinación del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos;

(b)

código para la recuperación de un valor de referencia para el componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos;

(c)

código para la comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b), en el que dicha comparación de los datos en (a) con el valor de referencia en (b) proporciona información relativa a si un paciente tiene lupus eritematoso sistémico o esclerodermia, en un procedimiento para el diagnóstico o la monitorización del lupus eritematoso sistémico o esclerodermia en un individuo que comprende (a) la determinación automáticamente, en una muestra de sangre procedente del individuo que contiene glóbulos rojos, del componente complemento C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos en la muestra, y (b) la comparación automáticamente de dicha determinación con un valor de referencia para el componente C4d depositado sobre superficies de glóbulos rojos, en el que los códigos (a) a (c) son ejecutados sobre un ordenador digital.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el medio de lectura por ordenador, comprende además:

(d)

código para la recepción de datos correspondiente a una determinación del receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos;

(e)

código para la recuperación de un intervalo de valores de referencia para el receptor complemento CR1 depositado sobre superficies de glóbulos rojos de individuos; y

(f)

código para la comparación de los datos en (d) con los valores de referencia de (e), en el que dichos códigos (d) a (f) son también ejecutados sobre dicho ordenador digital.