ES2350983T3 - Fosfonatos, monofosfonamidatos, bisfosfonamidatos para el tratamiento de enfermedades víricas. - Google Patents

Fosfonatos, monofosfonamidatos, bisfosfonamidatos para el tratamiento de enfermedades víricas. Download PDF

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ES2350983T3 ES04815956T ES04815956T ES2350983T3 ES 2350983 T3 ES2350983 T3 ES 2350983T3 ES 04815956 T ES04815956 T ES 04815956T ES 04815956 T ES04815956 T ES 04815956T ES 2350983 T3 ES2350983 T3 ES 2350983T3
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Zheng-Yu Yang
Edward Doerffler
Manoj C. Desai
Jianying Wang
Choung U. Kim
Xiaqin Cheng
Gong-Xin He
Gary P. Cook
John C. Rohloff
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Abstract

Un compuesto de la Fórmula IA, en la que Y 1A e Y 1B son -NH(R x ); R x es independientemente R 2 ; R 2 es (a) etilo sustituido con C(=O)OR 4 , en el que R 4 es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, m­ butilo i-butilo, s-butilo, t-butilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2butilo, 3-metil-1-butilo, 2-metil-1-butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3­ metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, vinilo, alilo, ciclopentenilo, 5-hexenilo, etinilo o propargilo; (b) propilo sustituido con C(=O)OR 4 , en el que R 4 es un alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono o un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono; o (c) metilo sustituido con 2 R 3 , siendo un R 3 -R 5 W 3 y el otro R 3 C(-O)OR 4 ; R 4 es un alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, un alquenilo de 2 a 18 átomos de carbono o un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono; R 5 es metileno; W 3 es fenilo; o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. .

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos y composiciones de los mismos, útiles para tratar infecciones víricas, en particular virus del papiloma humano.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus del papiloma humano (HPV) es una de las infecciones transmitidas sexualmente más prevalentes en el mundo. Existen más de 100 tipos diferentes del HPV, siendo inocuas la mayor parte de las mismas. No obstante, existen aproximadamente 30 tipos que se transmiten a través del contacto sexual. Algunos tipos del HPV provocan verrugas genitales, que aparecen como protuberancias simples o múltiples en las áreas genitales de hombres y mujeres, incluidas la vagina, el cuello uterino, la vulva (superficie exterior de la vagina), el pene y el recto. Sin embargo, muchas personas infectadas por el HPV no tienen síntomas.
Mientras que la mayoría de los subtipos de HPV dan como resultado lesiones benignas, ciertos subtipos pueden conducir a lesiones más serias. Las infecciones anogenitales que surgen del HPV-16 y del HPV-18, aunque son menos comunes que del HPV6 y del HPV-11, son las que están asociadas más frecuentemente con lesiones precancerosas en tejidos cervical y anal, llamadas displasias. Los pacientes con displasias son frecuentemente asintomáticos y pueden descubrir su lesión únicamente después de una exploración. Las displasias de alto grado, si se dejan sin tratar, pueden transformarse en tejidos cancerosos. Las lesiones de bajo grado pueden revertirse espontáneamente, mientras que otras pueden progresar hasta lesiones de alto grado. El HPV-16 y el HPV-18 son los que están asociados más frecuentemente con displasias, aunque otros varios subtipos del HPV transformantes están también asociados con las displasias. Estudios recientes indican que el 89 % de los varones homosexuales positivos al VIH pueden estar infectados con estos subtipos de alto riesgo del HPV. Es también más probable que los pacientes positivos al VIH estén infectados simultáneamente con múltiples subtipos del HPV, lo que está asociado con un riesgo superior de progresión de la displasia.
Las verrugas genitales son la enfermedad transmitida sexualmente más común en el mundo, y son más prevalentes en personas de 17-33 años de edad. El HPV-6 y el HPV11 son responsables de casi el 90 % de todas las verrugas genitales, pero están asociados raramente con crecimientos neoplásicos. De acuerdo con la American Social Health Association (asociación estadounidense de salud social), al menos 20 millones de personas en los Estados Unidos están actualmente infectadas con el HPV, teniendo lugar anualmente 5,5 millones de nuevos casos de infecciones de HPV transmitidas sexualmente. Las verrugas genitales probablemente producen protuberancias indoloras con picor situadas sobre o cerca de los genitales, pero sin tratamiento, pueden progresar desarrollándose en forma de coliflores más pronunciados y más grandes. Aproximadamente dos tercios de personas que tienen contacto sexual con una persona infectada con verrugas desarrollarán verrugas dentro de tres meses tras el contacto. La regresión espontánea de las verrugas genitales ocurre en el 10-20 % de los casos de verrugas genitales. No obstante, incluso si una lesión se revierte, la recurrencia de verrugas genitales es común con un 50 % de recurrencia después de un año. Como resultado de las lesiones de aspecto desagradable, el tratamiento de las verrugas genitales es común.
La evidencia en las últimas dos décadas ha conducido a una amplia aceptación de que la infección por HPV es necesaria, aunque no suficiente, para el desarrollo del cáncer cervical. La presencia del HPV en el cáncer cervical es estimada en un 99,7%. Se piensa que el cáncer anal tiene una asociación similar entre la infección por el HPV y el desarrollo de la displasia anal y el cáncer anal, como es el caso con el cáncer cervical. En un estudio de pacientes negativos al VIH con cáncer anal, se encontró infección por el HPV en el 88 % de los cánceres anales. En los Estados Unidos en el año 2003, se pronostican 12.200 nuevos casos de cáncer cervical y 4.100 muertes por cáncer cervical junto con 4.000 nuevos casos de cáncer anal y 500 muertes por cáncer anal. Mientras que la incidencia de cáncer cervical ha disminuido en las últimas cuatro décadas debido a la generalización de los exámenes médicos, la incidencia del cáncer anal se está incrementado. El incremento en la incidencia del cáncer anal puede ser atribuido en parte a infección por el VIH ya que los pacientes positivos al VIH tienen una mayor incidencia de cáncer anal que la población general. Mientras que el cáncer anal tiene una incidencia de 0,9 casos por 100.000 en la población general, el cáncer anal tiene una incidencia de 35 casos por 100.000 en la población masculina homosexual y 70-100 casos por 100.000 en la población masculina homosexual positiva al VIH. De hecho, debido a la alta prevalencia de la displasia anal entre pacientes infectados por el VIH y una tendencia creciente de los cánceres anales, las directrices de la USPHA/IDSA del 2003 para el tratamiento de enfermedades oportunistas en pacientes positivos al VIH incluirán las directrices de tratamiento para pacientes diagnosticados con displasia anal.
No existe curación conocida para el HPV. Existen tratamientos para las verrugas genitales, aunque éstas frecuentemente desaparecen incluso sin tratamiento. El procedimiento de tratamiento depende de factores tales como tamaño y la localización de las verrugas genitales. Entre los tratamientos utilizados están, la crema Imiquimod, solución antimicótica de podofilina al 20 por ciento, solución de podofilox al 0,5 por ciento, crema de 5-fluorouracilo al 5 por ciento y ácido tricloroacético. El uso de podofilina o podofilox no es recomendado para mujeres embarazadas, debido a que éstos son absorbidos por la piel y pueden provocar defectos de nacimiento. El uso de la crema de 5-fluorouracilo tampoco está recomendado para mujeres embarazadas. Las verrugas genitales pequeñas pueden ser típicamente eliminadas mediante congelamiento (criocirugía), quemaduras (electrocauterización) o tratamiento con láser. Las verrugas grandes que no responden a otro tratamiento pueden tener que ser eliminadas mediante cirugía. Se ha sabido que las verrugas genitales regresan después de la eliminación física, en esos casos se ha utilizado el α-interferón para inyectarlo directamente en estas verrugas. No obstante, el α-interferón es caro y su uso no reduce la velocidad de regresión de las verrugas genitales.
R. Snoeck, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, 3356-3361, evaluó la capacidad de inhibir el crecimiento de virus de la vacuna de una serie de derivados de fosfonatos de nucleósidos acíclicos en monocapas de células epiteliales y los derivados más potentes se analizaron en los cultivos organotípicos. K.A. Keith y col., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 2193-2198, evaluó la capacidad de inhibir la replicación de virus de la vacuna o de virus de la viruela bovina de una serie de fosfonatos de nucleósidos (análogos a cidofovir, adefovir y tenofovir) en células de cultivo de tejidos.
N.D. Christensen y col., Antiviral Research 48 (2000), 131-142, analizó la actividad en vivo contra el virus del papiloma de una serie de análogos de nucleósido y encontró que algunos de los mismos tienen una actividad potente.
El documento US 2003/0072814 da a conocer una composición farmacéutica tópica para el tratamiento de verrugas que contiene fosfonatos de nucleósidos y otros análogos de nucleósidos como compuestos activos.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad no satisfecha de un tratamiento eficaz contra el HPV. Se han descubierto ahora, sorprendentemente, compuestos que satisfacen esta necesidad y que también proporcionan otros beneficios.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un compuesto de fórmula IA
imagen1
IA
en la que Y1A e Y1B son -NH(Rx); Rx es independientemente R2; R2 es
(a)
etilo sustituido con C(=O)OR4, siendo R4 metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, i-butilo, sbutilo, t-butilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1butilo, 2-metil-1-butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, vinilo, alilo, ciclopentenilo, 5-hexenilo, etinilo o propargilo;
(b)
propilo sustituido con C(=O)OR4, siendo R4 un alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, un alquenilo de 2 a 18 átomos de carbono o un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono; o
(c)
metilo sustituido con 2 R3, siendo un R3 -R5W3 y el otro R3 C(-O)OR4; R4 es un alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, un alquenilo de 2 a 18 átomos de carbono o un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono; R5 es metileno; W3 es fenilo;
o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
DESCRICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula
imagen1
Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
fórmula
imagen1
Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
fórmula,
imagen1
Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
fórmula,
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Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
fórmula,
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Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
fórmula
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Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
fórmula
5
10
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Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
fórmula
15
20
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Una realización de la presente invención proporciona un compuesto de la
25 fórmula
30
35
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Una realización de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de la Fórmula IA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto de la presente realización proporciona una composición farmacéutica, siendo la composición una composición en gel.
Otro aspecto más de la presente realización proporciona una composición farmacéutica, siendo la composición una composición de ungüento.
Una realización de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de la Fórmula IA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y una cantidad eficaz de al menos un agente antivírico y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto de la presente realización proporciona una composición farmacéutica, siendo la composición una composición en gel.
Otro aspecto de la presente realización proporciona una composición farmacéutica, siendo la composición una composición de ungüento.
Definiciones El término “PMEG” se refiere al compuesto 9-(2-fosfonilmetoxietil)guanidina,
imagen2
9-(2-fosfonilmetoxietil)-2,6
diaminopurina,
imagen1
El término “cprPMEDAP” se refiere al compuesto 9-(2-fosfonilmetoxietil)-2
amino-6-(ciclopropil)purina,
imagen1
“Biodisponibilidad” es el grado al que el agente farmacéuticamente activo se vuelve disponible para el tejido objetivo después de la introducción del agente en el organismo. El aumento de la biodisponibilidad de un agente farmacéuticamente activo puede provocar un tratamiento más eficaz y efectivo para pacientes debido a que, para una dosis dada, estará disponible en los sitios del tejido objetivo una cantidad superior del agente farmacéuticamente activo.
Los términos “fosfonato” y “grupo fosfonato” incluyen los grupos o restos funcionales de una molécula que comprenden un fósforo que está 1) unido por enlace sencillo a un carbono, 2) unido por doble enlace a un heteroátomo, 3) unido por enlace sencillo a un heteroátomo y 4) unido por enlace sencillo a otro heteroátomo, en donde cada heteroátomo puede ser el mismo o diferente. Los términos “fosfonato” y “grupo fosfonato” también incluyen los grupos o restos funcionales que comprenden un fósforo en el mismo estado de oxidación que el fósforo descrito anteriormente, así como los grupos o restos funcionales que comprenden un resto de profármaco que puede separarse de un compuesto, de tal modo que el compuesto conserva un fósforo que tiene las características descritas anteriormente. Por ejemplo, los términos “fosfonato” y “grupo fosfonato” incluyen grupos funcionales ácido fosfónico, monoéster fosfónico, diéster fosfónico, fosfonamidato y fosfonotioato. En una realización específica de la invención, los términos “fosfonato” y “grupo fosfonato” incluyen grupos o restos funcionales dentro de una molécula que comprende un fósforo que está 1) unido por enlace sencillo a un carbono, 2) unido por enlace doble a un oxígeno, 3) unido por enlace sencillo a un oxígeno, y 4) unido por enlace sencillo a otro átomo de oxígeno, así como los grupos o restos funcionales que comprenden un resto de profármaco que puede separarse de un compuesto, de modo que el compuesto conserva un fósforo que tiene tales características. En otra realización específica de la invención, los términos “fosfonato” y “grupo fosfonato” incluyen los grupos o restos funcionales dentro de una molécula que comprenden un fósforo que está 1) unido por enlace sencillo a un carbono, 2) unido por doble enlace a un oxígeno, 3) unido por enlace sencillo a un oxígeno o nitrógeno y 4) unido por enlace sencillo a otro oxígeno o nitrógeno, así como los grupos o restos funcionales que comprenden un resto de profármaco que puede separarse de un compuesto, de modo que el compuesto conserva un fósforo que tiene tales características.
Las recetas y procedimientos para determinar la estabilidad de los compuestos en secreciones gastrointestinales sustitutas, son conocidos. En el presente documento, los compuestos se definen como estables en el tracto gastrointestinal si menos de aproximadamente el 50 por ciento en moles de los grupos protegidos se encuentran desprotegidos en el jugo intestinal o gástrico sustituto después de una incubación durante 1 hora a 37 ºC. Tales compuestos son adecuados para su uso en esta realización. Nótese que simplemente porque los compuestos sean estables al tracto gastrointestinal, eso no significa que no puedan ser hidrolizados in vivo. Los profármacos, típicamente, serán estables en el sistema digestivo, pero son sustancialmente hidrolizados al fármaco progenitor en el lumen digestivo, el hígado u otro órgano metabólico o dentro de las células en general.
Los compuestos de la invención pueden también existir como isómeros tautoméricos en ciertos casos. Por ejemplo, los tautómeros eno-amina pueden existir para el imidazol, guanidina, amidina y sistemas de tetrazol, y todas sus posibles formas tautoméricas están dentro del alcance de la invención.
El término “profármaco”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto que cuando se administra a un sistema biológico genera la sustancia farmacológica, por ejemplo, el ingrediente activo, como resultado de la o las reacciones químicas espontáneas; la o las reacciones químicas catalizadas por enzimas, fotolisis y/o una o varias reacciones químicas metabólicas. Un profármaco es, de este modo, un análogo modificado covalentemente o una forma latente de un compuesto terapéuticamente activo.
Un “resto de profármaco” se refiere a un grupo funcional lábil que se separa del compuesto inhibitorio activo durante el metabolismo, sistémicamente, dentro de una célula, mediante hidrólisis, por escisión enzimática, o mediante algún otro proceso (Bundgaard, Hans, “Design and Application of Produgs” en A Texbook of Drug Design and Development (1991), P. Krogsgaard-Larsen y H. Bundgaard, Eds. Harwood Academic Publishers, pp. 113-191). Las enzimas que son capaces de realizar un mecanismo de activación enzimática con los compuestos profármacos de fosfonato de la invención incluyen, pero no están limitados a, amidasas, esterasas, enzimas microbianas, fosfolipasas, colinesterasas, y fosfasas. Los restos de profármaco pueden servir para aumentar la solubilidad, la absorción y la lipofilicidad, para optimizar la distribución de los fármacos, la biodisponibilidad y la eficacia. Un resto de profármaco puede incluir un metabolito activo o el fármaco mismo.
Los restos de profármaco ejemplares incluyen los ésteres de aciloximetilo hidrolíticamente sensibles o lábiles –CH2OC(=O)R y los carbonatos de aciloximetilo – CH2OC(=O)OR en donde R en este caso es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido, arilo de 6 a 20 átomos de carbono, o arilo sustituido de 6 a 20 átomos de carbono. El éster de aciloxialquilo fue primeramente utilizado como una estrategia de profármaco para los ácidos carboxílico, y luego aplicado a fosfatos y fosfonatos por Farquhar y col. (1983) J. Pharm. Sci. 72:324; también Patentes de los Estados Unidos Nº. 4816570, 4968788, 5663159 y 5792756. Subsecuentemente, el éster de aciloxialquilo fue utilizado para distribuir los ácidos fosfónicos a través de las membranas celulares y para aumentar la biodisponibilidad oral. Una variante cercana del éster de aciloxialquilo, el éster de alcoxicarboniloxialquilo (carbonato), puede también aumentar la biodisponibilidad oral como un resto de profármaco en los compuestos de las combinaciones de la invención. Un ejemplo de éster de aciloximetilo es el isopropilcarboniloximetoxi, -OCH2OC(=O)C(CH3)2. Un ejemplo de resto de profármaco de carbonato de aciloximetilo es el carbonato de isopropilcarboniloximetilo, HOC(=O)OCH2OC(=O)C(CH3)2.
El grupo fosfonato puede ser un resto de profármaco de fosfonato. El resto de profármaco puede ser sensible a la hidrólisis, tal como, pero no limitado a, un grupo isopropilcarbonil-oximetoxi o carbonato de isopropilcarboniloximetilo. Alternativamente, el resto de profármaco puede ser sensible a la escisión potenciada enzimática, tal como un éster de lactato o un grupo éster de fosfonamidato.
Se ha informado que los ésteres de arilo o grupos fósforo, especialmente ésteres de fenilo, aumentan la biodisponibilidad oral (De Lombaert y col. (1994) J. Med. Chem. 37:498). Los ésteres de fenilo que contienen un éster carboxílico en posición orto respecto al fosfato, han sido también descritos (Khamnei y Torrence, (1996), J. Med. Chem. 39:4109-4115). Se ha informado que los ésteres de bencilo generan el ácido fosfónico progenitor. En algunos casos, los sustituyentes en la posición orto o para pueden acelerar la hidrólisis. Los análogos de bencilo con un fenol acilado o un fenol alquilado pueden generar el compuesto fenólico a través de la acción de enzimas, por ejemplo, esterasas, oxidasas, etc., que a su vez sufren escisión del enlace C-O bencílico para generar el ácido fosfórico y el intermedio de metiluro de quinona. Los ejemplos de esta clase de profármacos se describen por Mitchel y col. (1992) J. Chem. Soc. Perkin Trans. II 2345; Glazier WO 91/19721. Incluso se han descrito otros profármacos bencílicos que contienen un grupo que contiene éster carboxílico enlazado al metileno bencílico (Glazier WO 91/19721). Se ha informado que los profármacos que contienen tio son útiles para la distribución intracelular de los fármacos de fosfonato. Estos proésteres contienen un grupo etiltio en el cual el grupo tiol está ya sea esterificado por un grupo acilo o combinado con otros grupos tiol para formar un disulfuro. La desesterificación o la reducción del disulfuro genera el intermediario tio libre el cual subsecuentemente se rompe dando ácido fosfórico y episulfuro (Puech y col. (1993) Antiviral Res. 22:155-174; Benzaria y col. (1996) J. Med. Chem. 39:4958). Los ésteres de fosfonato cíclicos han sido también descritos como profármacos de los compuestos que contienen fósforo (Erion y col., Patente de los Estados Unidos No. 6312662).
“Grupo protector” se refiere a un resto de un compuesto que enmascara o que altera las propiedades de un grupo funcional o las propiedades del compuesto como un todo. Los grupos protectores químicos y las estrategias para la protección/desprotección son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Protective Groups in Oganic Chemistry, Teodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991. Los grupos protectores son frecuentemente utilizados para enmascarar la reactividad de ciertos grupos funcionales, para asistir en la eficiencia de las reacciones químicas deseadas, por ejemplo, realizando y rompiendo enlaces químicos en una manera ordenada y planeada. La protección de los grupos funcionales de un compuesto altera las propiedades físicas además de la reactividad del grupo funcional protegido, tal como la polaridad, la lipofilicidad (hidrofobicidad), y otras propiedades que pueden ser medidas por herramientas analíticas comunes. Los intermediarios químicamente protegidos pueden por si mismos ser biológicamente activos o inactivos.
Los compuestos protegidos pueden también exhibir propiedades alteradas, y en algunos casos, optimizadas, in vitro o in vivo, tales como el paso a través de las membranas celulares y la resistencia a la degradación enzimática o al secuestro. En este papel, los compuestos protegidos con los efectos terapéuticos pretendidos, pueden ser denominados como profármacos.
Otra función del grupo protector es convertir el fármaco progenitor en un profármaco, con lo cual el fármaco progenitor es liberado después de la conversión del profármaco in vivo. Debido a que los profármacos activos pueden ser absorbidos más eficazmente que el fármaco progenitor, los profármacos pueden poseer mayor potencia en vivo que el profármaco progenitor. Los grupos protectores son eliminados ya sea in vitro, en el caso de los intermediarios químicos o en vivo, en el caso de los profármacos. Con intermedios químicos, no es particularmente importante que los productos resultantes después de la desprotección, por ejemplo, alcoholes, sean fisiológicamente aceptables, aunque en general es más deseable que los productos sean farmacológicamente inocuos.
Cualquier referencia a cualquiera de los compuestos de la invención también incluye una referencia a una sal fisiológicamente aceptable de los mismos. Los ejemplos de sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de la invención incluyen las sales derivadas de una base apropiada, tal como un metal alcalino (por ejemplo, sodio), un metal alcalinotérreo (por ejemplo, magnesio), amonio y NX4+ (en donde X es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono). Las sales fisiológicamente aceptables de un átomo de hidrógeno o un grupo amino incluyen sales de ácidos carboxílicos orgánicos tales como los ácidos acético benzoico, láctico, fumárico, tartárico, maleico, malónico, málico, isetiónico, lactobiónico y succínico; ácidos sulfónicos orgánicos tales como los ácidos metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico y p-toluenosulfónico; y ácidos inorgánicos tales como los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico y sulfámico. Las sales fisiológicamente aceptables de un compuesto de un grupo hidroxilo incluyen el anión del compuesto en combinación con catión adecuado tal como Na+ y NX4+ (en donde X está independientemente seleccionado de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “gel” se refiere a sistemas semisólidos constituidos por ya sea suspensiones compuestas por partículas inorgánicas pequeñas o moléculas orgánicas grandes que encierran y que están interpenetradas por un líquido. Si la masa de gel está constituida por flóculos de partículas pequeñas, el gel es clasificado como un sistema de dos fases y es algunas veces denominado magma. El gel de hidróxido de aluminio y el magma de bentonitas son ejemplos de sistemas de dos fases. Los geles de fase simple están constituidos por macromoléculas orgánicas uniformemente distribuidas a todo lo largo de un líquido, de una manera tal que no existen límites aparentes entre las macromoléculas dispersas y el líquido. Los ejemplos de tales geles son carboximetilcelulosa de sodio y tragacanto. Aunque los geles son comúnmente acuosos, pueden usarse alcoholes y aceites como fase continua.
Tal como se utiliza en la presente, el término “ungüento” se refiere a una preparación semisólida para la aplicación externa de una consistencia tal que pueda aplicarse fácilmente a la piel mediante unción. Deben ser de una composición tal que se reblandezcan pero no necesariamente se fundan cuando son aplicados al cuerpo. Sirven como vehículos para la aplicación tópica de sustancias medicinales y también funcionar como protectores y emolientes para la piel.
Para uso terapéutico, las sales de ingredientes activos de los compuestos de la invención serán fisiológicamente aceptable, es decir, serán sales derivadas de un ácido o una base fisiológicamente aceptable. No obstante, las sales de ácidos o bases que no sean fisiológicamente aceptables pueden también encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto fisiológicamente estable.
“Alquilo” es un hidrocarburo de 1 a 18 átomos de carbono que contiene átomos de carbono normales, secundarios o terciarios. Los ejemplos son metilo (Me, -CH3), etilo (Et, CH2CH3), 1-propilo (N-Pr, N-propilo, -CH2CH2CH3) 2-propilo (I-Pr, I-propilo, -CH(CH3)2, 1-butilo
(N-Bu, N-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (I-Bu,I-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (T-Bu, T-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (5 CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2)3CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (C(CH3)(CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (
10 CH(CH3)C(CH3)3. “Alquenilo” es un hidrocarburo de 2 a 18 átomos de carbono que contiene átomos de carbono normales, secundarios o terciarios con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace, carbono-carbono, sp2. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentilo (-C5H7), y 5-hexenilo (
15 CH2CH2CH2CH=CH2). “Alquinilo” es un hidrocarburo de 2 a 18 átomos de carbono que contiene átomos de carbono, normales, secundarios o terciarios, con al menos un sitio de insaturación, por ejemplo, un triple enlace carbono-carbono sp. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, acetilénico (-C=CH) y propargilo (-CH2C≡CH).
20 Tal como se utiliza en el presente documento, el término “Aba” se refiere a un resto divalente del ácido 2-aminobutanoico,
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en el que los puntos de enlace están designados por “*”. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “Ala” se refiere a un 30 resto divalente de alanina,
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en el que los puntos de enlace están designados por “*”.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “Phe” se refiere a un resto divalente de la fenilalanina,
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en el que los puntos de enlace están designados por “*”.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “POC” se refiere a un resto divalente del carbonato de hidroximetilisopropilo,
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en el que el punto de enlace está designado por “*”.
Los grupos sustituyentes Y1A e Y1B pueden describirse usando la nomenclatura que incorpora los restos de aminoácidos divalentes y los restos alquilo, anteriormente mencionada, tal como en la Tabla 37-3.
Por ejemplo, el compuesto de la fórmula, puede describirse usando la nomenclatura de la Fórmula I, en la que Y1A e Y1B son –N(RX), donde RX es R2, donde R2 es R4 sustituido con R3d, en donde R4 es etilo sustituido con R3d , donde R3d es –C(R3b)OR4, donde R3b es =O y donde R4 es n-propilo. Alternativamente, el compuesto puede describirse, como en la Tabla 37-3, como la Fórmula I, en donde Y1A e Y1B son “Ala-nPr”, que describe el resto (en el que el “*” indica el punto de enlace),
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Por ejemplo el compuesto de la fórmula,
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puede describirse usando la nomenclatura de la Fórmula I, en la que Y1A e Y1B son –N(RX),
25 donde RX es R2, donde R2 es R4 sustituido con R3d, en donde R4 es etilo sustituido con R3d , donde R3d es –C(R3b)OR4, donde R3b es =O y donde R4 es n-propilo. Alternativamente, el compuesto puede describirse, como en la Tabla 37-3, como la Fórmula I, en donde Y1A e Y1B son “Ala-nPr”, que describe el resto (en el que el “*” indica el punto de enlace),
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el cual es “Ala” enlazado a “nPr” (n-propilo).
El término “quiral” se refiere a las moléculas que tienen la propiedad de no superponibilidad del asociado imagen en el espejo, mientras que el término “aquiral” se refiere a las moléculas que son superponibles sobre su imagen en el espejo.
El término “estereoisómeros” se refiere a los compuestos que tienen constitución química, idéntica, pero que difieren con respecto a la disposición de los átomos o los grupos en el espacio.
“Diastereoisómero” se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes en el espejo una de la otra. Los diastereoisómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereoisómeros pueden separarse por procedimientos analíticos de alta resolución tales como electroforesis y cromatografía.
“Enantiómeros” se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes en el espejo no superponibles una de la otra.
El término “tratamiento” o “tratar” al grado en que éste se refiera a una enfermedad o condición incluyen prevenir que tenga lugar la enfermedad o afección, inhibir la enfermedad o afección, eliminar la enfermedad o afección y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad o afección.
El término “antiproliferativo” se refiere a las actividades utilizadas para, o que tienden a, inhibir el crecimiento celular, tales como los efectos antiproliferativos sobre células tumorales o efectos antiproliferativos sobre células infectadas víricamente.
El término “apoptosis” se refiere a uno de los principales tipos de muerte celular programada. Como tal, éste es un proceso de suicidio deliberado por una célula no deseada, en un organismo multicelular. En contraste con la necrosis, que es una forma de muerte celular que resulta del daño tisular agudo, la apoptosis se lleva a cabo en un proceso ordenado que, en general, confiere ventajas durante el ciclo de vida de un organismo. La apoptosis es un tipo de muerte celular en el cual la célula utiliza maquinaria celular especializada para matarse a si misma; un mecanismo de suicidio celular que hace posible que los metazoarios controlen el número de células y eliminen células que amenazan la supervivencia del animal. La apoptosis puede tener lugar, por ejemplo, cuando una célula es dañada más allá de la reparación o infectada con un virus. Los estímulos para la apoptosis pueden venir de la célula misma, de su tejido circundante o de una célula que es parte del sistema inmunitario; puede ser química, biológica o física. El término relacionado “apoptótico” se refiere al proceso de la apoptosis.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas utilizadas en el presente documento, siguen en general a S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Willey & Sons, Inc., New York,. Existen muchos compuestos orgánicos en formas ópticamente activas, es decir, tienen la habilidad de rotar el plano de luz polarizada en un plano. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S son utilizados para denotar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su
o sus centros quirales. Los prefijos d y l o (+) o (-) son empleados para designar el signo de rotación de la luz polarizada en el plano por el compuesto, donde (-) o l significa que el compuesto es levógiro. El compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereosómeros son idénticos excepto que éstos son imágenes en el espejo uno del otro. Un estereoisómero específico puede también denominarse enantiómero, y una mezcla de tales isómeros es frecuentemente denominada una mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros es denominada mezcla racémica o racemato, que puede aparecer donde no ha existido estereoselección o estereoespecificidad en un proceso o reacción química. Los términos “mezcla racémica” y “racemato” se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovistas de actividad óptica.
Grupos protectores
En el contexto de la presente invención, los grupos protectores incluyen los restos de profármacos y los grupos protectores químicos.
Los grupos protectores están disponibles, son comúnmente conocidos y utilizados, y son opcionalmente utilizados para prevenir reacciones colaterales con el grupo protegido durante los procedimientos sintéticos, es decir, las rutas o procedimientos para preparar los compuestos de la invención. La mayor parte de las decisiones respecto a que grupos proteger, cuándo realizarlo y la naturaleza del grupo protector químico “PG” dependerán de la química de la reacción contra la cual va a ser protegido (por ejemplo, condiciones ácidas, alcalinas, oxidantes, reductoras u otras) y la dirección pretendida de la síntesis. Los grupos PG no necesitan ser, y en general no son, los mismos si el compuesto es sustituido con PG múltiples. En general, el PG se usará para proteger los grupos funcionales tales como los grupos carboxilo, hidroxilo, tio o amino y para prevenir de este modo las reacciones colaterales
o para facilitar de otro modo la eficacia de la síntesis. El orden de la desprotección para producir grupos desprotegidos, libres, depende de la dirección pretendida de la síntesis y de las condiciones de reacción que van a encontrarse, y puede aparecer en cualquier orden que determine un experto.
Pueden protegerse diversos grupos funcionales de los compuestos de la
invención. Por ejemplo, los grupos protectores para los grupos –OH (ya sea hidroxilo, ácido carboxílico, ácido fosfónico u otros grupos funcionales) incluyen los “grupos formadores de éter
o de éster”. Los grupos formadores de éter o de éster son capaces de funcionar como grupos protectores químicos en los esquemas de síntesis descritos en el presente documento. No obstante, algunos grupos protectores de hidroxilo y de tio no son ni formadores de éter ni de éster, como entenderán los expertos en la técnica, y se incluyen con las amidas, tratadas más adelante.
Una serie muy extensa de grupos protectores de hidroxilo y grupos formadores de amida y las reacciones de escisión química correspondientes se describen en Protective Groups in Organic Synthesis, Teodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 1991, ISBN 0-471-62301-6) (“Greene”). Ver también Kocienski, Philip J.; Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1994), la cual se incorpora por referencia al presente documento en su totalidad. En particular, Capítulo 1, Grupos Protectores: Una Revisión, páginas 1-20, Capítulo 2, grupos protectores de hidroxilo, páginas 21-94, Capítulo 3, Grupos protectores de Diol, páginas 95-117, Capítulo 4, grupos protectores de carboxilo, páginas 118154, Capítulo 5, grupos protectores de carbonilo, páginas 155-184. Para los grupos protectores para el ácido carboxílico, el ácido fosfónico, el fosfonato, el ácido sulfónico y otros grupos protectores para ácidos, ver Greene tal como se describe más adelante. Tales grupos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, ésteres, amidas, hidrazidas y similares.
Grupos protectores formadores de éter y éster
Los grupos formadores de éster incluyen: (1) grupos formadores de éster de fosfonato, tales como ésteres de fosfonamidato, éteres de fosforotioato, ésteres de fosfonato y fosfon-bis-amidatos; (2) grupos formadores de éster de carboxilo; (3) grupos formadores de éster de azufre, tales como sulfonato, sulfato y sulfinato.
Los restos fosfonato de los compuestos de la invención pueden o no ser los restos de profármacos, es decir, pueden o no ser susceptibles a la escisión o modificación hidrolítica o enzimática. Determinados restos fosfonato son estables en la mayoría o casi todas las condiciones metabólicas. Por ejemplo, un dialquilfosfonato, donde los grupos alquilo son dos o más carbonos, pueden tener estabilidad apreciable in vivo debido a la velocidad lenta de hidrólisis.
Sales e hidratos
Las composiciones de la presente invención comprenden opcionalmente sales de los compuestos del presente documento, especialmente sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables que contienen por ejemplo, Na+, Li+, K+, Ca++ y Mg++ . Tales sales pueden incluir las derivadas por combinación de cationes apropiados tales como iones de metal alcalino y alcalinotérreo o iones amonio y amino cuaternario, con un resto de anión ácido. Las sales monovalentes son preferentes y se desea una sal soluble en agua.
Muchas sales se preparan típicamente mediante la reacción de un compuesto de la presente invención con un hidróxido metálico. Los ejemplos de sales metálicas que se preparan de esta manera son sales que contienen Li+, Na+, y K++ . Puede precipitarse una sal metálica menos soluble en agua a partir de la solución de una sal más soluble mediante adición del compuesto metálico adecuado.
Además, las sales pueden formarse a partir de la adición de ácido de ciertos ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo, HCl, HBr, H2SO4, o ácidos sulfónicos orgánicos, a los centros básicos, o a los centros ácidos. Finalmente, se debe entender que las composiciones del presente documento comprenden los compuestos de la invención en su forma no ionizada, así como anfotérica, y combinaciones con cantidades estequiométricas de agua como los hidratos.
También están incluidas dentro del alcance de la invención las sales de los compuestos progenitores con uno o más aminoácidos. Cualquiera de los aminoácidos descritos anteriormente son adecuados, especialmente los aminoácidos de origen natural encontrados como componentes proteicos, aunque el aminoácido típicamente es uno que posee una cadena lateral con un grupo básico o ácido, por ejemplo, lisina, arginina, o ácido glutámico, o un grupo neutro tal como glicina, serina, treonina, alanina, isoleucina, o leucina.
Procedimientos de inhibición de HPV
Otro aspecto de la invención se refiere a los compuestos de la invención para usar en procedimientos para inhibir la actividad de HPV que comprenden la etapa de tratar una muestra sospechosa de contener HPV con un compuesto de la invención.
Las composiciones de la invención actúan como inhibidores de HPV, como intermedios para tales inhibidores o tienen otras utilidades tal como se describe más adelante.
La etapa de tratamiento de la invención comprende la adición de la composición de la invención a la muestra o comprende la adición de un precursor de la composición a la muestra. La etapa de adición comprende cualquier procedimiento de administración tal como se describe anteriormente.
Si se desea, la actividad de HPV después de la aplicación de la composición puede observarse mediante cualquier procedimiento, incluidos procedimientos directos e indirectos de detección de HPV. Se contemplan todos los procedimientos cuantitativos, cualitativos y semi-cualitativos para determinar la actividad de HPV. Típicamente, se aplica uno de los procedimientos de análisis descritos anteriormente, no obstante, son también aplicables cualesquiera otros procedimientos tales como la observación de las propiedades físicas de un organismo viviente.
Análisis de inhibidores HPV
Se analiza la utilidad terapéutica de compuestos y composiciones de la invención mediante la medición de la CE50, que es la concentración del compuesto que logra un 50 % de inhibición del crecimiento celular. La tasa de CE50 en las células no infectadas e infectadas por el HPV proporciona una medición de la selectividad del compuesto para las células infectadas con virus. Los protocolos utilizados para obtener estas medidas se muestran en los ejemplos.
Formulaciones farmacéuticas y vías de administración
Los compuestos de la presente invención se formulan con vehículos y excipientes convencionales, que se seleccionan de acuerdo con la práctica ordinaria. Los comprimidos contendrán excipientes, lubricantes, cargas, aglutinantes y similares. Las formulaciones acuosas se preparan en forma estéril y cuando están destinadas a la distribución para una administración diferente de la oral, serán en general isotónicas. Todas las formulaciones contendrán opcionalmente excipientes tales como aquellos descritos en “Handbook of Pharmaceutical Excipients” (1986). Los excipientes incluyen ácido ascórbico y otros antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA, carbohidratos tales como dextrina, hidroxialquilcelulosa, hidroxialquilmetilcelulosa, ácido esteárico y similares. El pH de las formulaciones está en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 11, pero es ordinariamente de aproximadamente 7 a 10.
Uno o más compuestos de la invención (denominados en el presente contexto como ingredientes activos) se administran mediante cualquier vía apropiada para el trastorno que va a ser tratado. Las vías adecuadas incluyen la vía oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural), y similares. Se apreciará que la vía preferida puede variar con la afección del paciente. Una ventaja de los compuestos de esta invención es que éstos son oralmente biodisponibles y pueden ser dosificados oralmente.
Mientras que es posible que los ingredientes activos se administren solos puede ser preferible presentarlos como formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones, para uso veterinario y para uso humano de la invención comprenden al menos un ingrediente activo, tal como se ha definido anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables para los mismos, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El o los vehículos deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y fisiológicamente inocuos para el recipiente de los mismos.
Las formulaciones incluyen las adecuadas para las vías de administración anteriormente mencionadas. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Las técnicas y formulaciones se encuentran, en general, en Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tales procedimientos incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo uniforme e íntimamente en asociación el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, conformando el producto.
Las formulaciones de la invención adecuadas para la administración oral se preparan como unidades discretas tales como cápsulas, sacos o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en forma de polvo o gránulo; en forma de solución o de suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso, o como emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El ingrediente activo puede presentarse también en forma de bolo, electuario o pasta.
Un comprimido se fabrica mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos prensados pueden prepararse prensando en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre, tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, agente tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse mediante el moldeo, en una máquina adecuada, de una mezcla del ingrediente activo en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden ser opcionalmente recubiertos o amuescados y opcionalmente se formulan para proporcionar liberación lenta o controlada del ingrediente activo a partir de éstas.
Para infecciones de los ojos u otros tejidos externos, por ejemplo, la boca y la piel, se aplican preferentemente formulaciones en forma de ungüento tópico o crema que contiene el o los ingredientes activos en una cantidad de, por ejemplo, el 0,075 al 20 % p/p (incluyendo el o los ingredientes activos en un intervalo de entre el 0,1 % y el 20 % en incrementos del 0,1 % p/p tal como 0,6 % p/p, 0,7 % p/p, etc.), preferentemente del 0,2 al 15 % p/p y lo más preferentemente del 0,5 al 10 % p/p. Cuando se formula en un ungüento, los ingredientes activos pueden usarse en una base de ungüento o parafínica o miscible en agua.
Alternativamente, los ingredientes activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua.
Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos el 30 % p/p de un alcohol polihídrico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, butan-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG 400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir de manera deseable un compuesto que aumenta la absorción o penetración del ingrediente activo a través de la piel u otras áreas afectadas. Los ejemplos de tales aumentadores de la penetración dérmica incluyen sulfóxido de dimetilo y análogos relacionados.
La fase aceitosa de las emulsiones de la presente invención puede estar constituida de otros ingredientes conocidos de una manera conocida. Mientras que la fase puede comprender meramente un emulsionante (también conocido como emulgente), ésta comprende deseablemente una mezcla de al menos un emulsionante con un aceite o una grasa, o con una grasa y un aceite. Preferentemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipofílico que actúa como estabilizante. Se prefiere también incluir un aceite y una grasa. Conjuntamente, el o los emulsionantes con o sin estabilizante(s) constituyen la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa constituyen la denominada base de ungüento emulsionante que forman la fase dispersa aceitosa de las formulaciones en crema.
Los emulgentes y estabilizantes de la emulsión adecuados para el uso en la formulación de la invención incluyen Tween® 60, Span® 80, alcohol cetoestearílico, alcohol bencílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de sodio.
La elección de los aceites o grasas adecuadas para la formulación está basada en el logro de las propiedades cosméticas deseadas. La crema debe ser preferentemente un producto no grasiento, que no manche y lavable, con consistencia adecuada para evitar la fuga desde los tubos u otros recipientes. Pueden usarse ésteres de alquilo mono-o dibásicos, de cadena lineal o ramificadas, tales como el di-isoadipato, estearato de isocetilo, diéster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocida como Crodamol CAP, siendo los últimos tres los ésteres preferidos. Éstos pueden usarse solos o en combinación, dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se usan también lípidos de alto punto de fusión tales como la parafina blanda blanca y/o la parafina líquida u otros aceites minerales.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en el ojo también incluyen gotas oftálmicas en las que se disuelve o suspende el ingrediente activo en un vehiculo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el ingrediente activo. El ingrediente activo está preferentemente presente en tales formulaciones en una concentración del 0,5 al 20 %, ventajosamente del 0,5 al 10 %, particularmente aproximadamente el 1,5 % p/p.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen tabletas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sucrosa y acacia y tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicina, o sucrosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.
Las formulaciones para la administración rectal pueden ser presentadas como un supositorio en una base adecuada que comprende por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.
Las formulaciones adecuadas para la administración intrapulmonar o nasal tienen un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo de 0,1 a 500 micrómetros (incluyendo los tamaños de partículas en un intervalo entre 0,1 y 500 micrómetros en incrementos de micrómetros tales como 0,5, 1, 30 micrómetros, 35 micrómetros, etc.), que se administran mediante inhalación rápida a través de las vías nasales o mediante inhalación a través de la boca, para llegar a los sacos alveolares. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas o aceitosas del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración de aerosol de polvo seco pueden prepararse de acuerdo con procedimientos convencionales y pueden distribuirse con otros agentes terapéuticos tales como compuestos utilizados hasta ahora en el tratamiento o profilaxis de infecciones por gripe A ó B tal como se describirá más adelante.
Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden ser presentadas en forma de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen además del ingrediente activo, vehículos tales como los que se conocen en la técnica como apropiados.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyecciones estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterioestáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del recipiente pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes.
Las formulaciones son presentadas en recipientes de dosis unitarias o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas selladas y viales, y pueden almacenarse en una condición secada por congelamiento (liofilizadas) requiriendo únicamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas son preparadas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo previamente descrito. Las formulaciones de dosis unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o subdosis diaria unitaria, como se describió anteriormente en la presente, o una fracción apropiada de las mismas del ingrediente activo.
Se debe entender que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica, con respecto al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, aquellos adecuados para la administración oral pueden incluir agentes saborizantes.
La invención proporciona además composiciones veterinarias que comprenden al menos un ingrediente activo como se definió anteriormente, junto con un vehículo veterinario para el mismo.
Los vehículos veterinarios son materiales útiles para el propósito de administrar la composición y pueden ser materiales sólidos, líquidos o gaseosos que son de otro modo inertes o aceptables en la técnica veterinaria y son compatibles con el ingrediente activo. Estas composiciones veterinarias pueden ser administradas oralmente, parenteralmente o mediante cualquier otra vía deseada.
Los compuestos de la invención pueden ser utilizados para proporcionar formulaciones farmacéuticas de liberación controlada que contienen como ingrediente activo uno o más compuestos de la invención (“formulaciones de liberación controlada”) en las cuales la liberación del ingrediente activo es controlada y regulada para permitir dosificación menos frecuente, o para mejorar el perfil farmacocinético o de toxicidad de un ingrediente activo dado.
La dosis eficaz depende al menos de la naturaleza de la afección que se trate, de la toxicidad, si el compuesto está siendo utilizado profilácticamente (dosis más bajas) o contra una infección de gripe activa, el procedimiento de administración, y la formulación farmacéutica, y serán administrados por el clínico utilizando estudios convencionales de escala de dosis. Se puede esperar que ésta sea de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal por día; típicamente, de aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día; más típicamente, de aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día; más típicamente, de aproximadamente 0.05 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, para la inhalación la dosis diaria candidata para un adulto humano de aproximadamente 70 kg de peso corporal, estará en el intervalo de 1 mg a 1000 mg, preferentemente entre 5 mg y 500 mg, y puede tomar la forma de dosis simple o dosis múltiples.
Los ingredientes activos de la invención son también utilizados en combinación con otros ingredientes activos. Tales combinaciones son seleccionadas con base en la condición que se trate, las reactividades cruzadas de los ingredientes y las propiedades farmacocinéticas de la combinación. Por ejemplo, cuando se trata de infecciones víricas del sistema respiratorio, en particular infección por gripe, las composiciones de la invención son combinadas con antivirales (tales como amantidina, rimantadina y ribavirina), mucolíticos, expectorantes, broncodilatadores, antibióticos, antipiréticos o analgésicos. Ordinariamente, se administran antibióticos, antipiréticos y analgésicos junto con los compuestos de esta invención. Metabolitos de los compuestos de la invención
En vivo, los productos metabólicos de los compuestos descritos en el presente documento pueden ser el resultado, por ejemplo, de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidación, esterificación y similares del compuesto administrado, principalmente debido a los procesos enzimáticos. Tales productos típicamente son identificados mediante la preparación de un compuesto radiomarcado (por ejemplo, C14 o H13) de la invención, administrándolo parenteralmente en una dosis detectable (por ejemplo, mayor de aproximadamente 0,5 mg/kg) a un animal tal como una rata, ratón, cobaya, mono o a un ser humano, permitiendo tiempo suficiente para que tenga lugar el metabolismo (típicamente aproximadamente 30 segundos a 30 horas) y aislando sus productos de conversión de la orina, de la sangre o de otras muestras biológicas. Estos productos son fácilmente aislados, ya que éstos están marcados (otros son aislados mediante el uso de anticuerpos capaces de enlazarse a los epitopos que sobreviven en el metabolito). Las estructuras de los metabolitos son determinadas de una manera convencional, por ejemplo, mediante análisis de espectrometría de masa (EM) o resonancia magnética nuclear (RMN). En general, el análisis de los metabolitos es realizado de la misma manera que los estudios de metabolismos de fármacos convencionales, bien conocidos por los expertos en la técnica. Los productos de conversión, siempre y cuando éstos no sean de otro modo encontrados in vivo, son útiles en ensayo de diagnóstico para la dosificación terapéutica de los compuestos de la invención incluso si éstos no poseen actividad inhibitoria de la neuraminidasa por si mismos.
Usos adicionales para los compuestos de la presente invención
Los compuestos de esta invención, o las sustancias biológicamente activas producidas a partir de los compuestos mediante hidrólisis o metabolitos in vivo, son utilizados como inmunógenos o para la conjugación a proteínas, mediante lo cual éstos sirven como componentes de composiciones inmunogénicas para preparar anticuerpos capaces de enlazarse específicamente a la proteína, a los compuestos o a sus productos metabólicos que conservan epitopos inmunológicamente reconocidos (sitios de enlace al anticuerpo). Las composiciones inmunogénicas por lo tanto son útiles como intermediarios en la preparación de anticuerpos para el uso en el diagnóstico, control de calidad o similares, procedimientos o en análisis de los compuestos o sus productos metabólicos nuevos. Los compuestos son útiles para producir anticuerpos contra polipéptidos de otro modo no inmunogénicos, ya que los compuestos sirven como sitios hapténicos que estimulan una respuesta inmunitaria que reacciona cruzadamente con la proteína conjugada no modificada.
Los productos de hidrólisis de interés incluyen productos de la hidrólisis de los grupos ácidos y básicos protegidos y discutidos anteriormente. Como se indicó anteriormente, las amidas ácidas o básicas que comprenden los polipéptidos inmunogénicos tales como albúmina o la hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, son en general útiles como inmunógenos. Los productos metabólicos descritos anteriormente pueden conservar un grado sustancial de reactividad inmunológica cruzada con los compuestos de esta invención. De este modo, los anticuerpos de esta invención serán capaces de enlazarse a los compuestos no protegidos de la invención, sin enlazarse a los compuestos protegidos; alternativamente, los productos metabólicos, serán capaces de enlazarse a los compuestos protegidos y/o a los productos metabólicos sin enlazarse a los compuestos protegidos de la invención, o serán capaces de enlazarse específicamente a uno o a los tres de ellos. Los anticuerpos de manera deseable no reaccionarán sustancialmente de manera cruzada con los materiales de origen natural. La reactividad cruzada sustancial es la reactividad bajo las condiciones necesarias específicas para analitos específicos, suficientes para interferir con los resultados de ensayo.
Los inmunógenos de la presente invención contienen el compuesto de esta invención que presenta el epitopo deseado en asociación con una sustancia inmunogénica. Dentro del contexto de la invención, tal asociación significa el enlace covalente para formar un conjugado inmunogénico (cuando es aplicable) o una mezcla de materiales no covalentemente enlazados, o una combinación de los anteriores. Las sustancias inmunogénicas incluyen adyuvantes tales como adyuvantes de Freund, proteínas inmunogénicas tales como polipéptidos víricos, bacterianos, de levadura, vegetales y animales, en particular la hemocianina de lapa de cerradura, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya y polisacáridos inmunogénicos. Típicamente, el compuesto que tiene la estructura del epitopo deseado es covalentemente conjugado a un polipéptido o polisacárido inmunogénico mediante el uso de un agente de reticulación polifuncional (ordinariamente bifuncional). Los procedimientos para la fabricación de los inmunógenos haptenos son convencionales per se, y cualquiera de los procedimientos utilizados hasta ahora para conjugar haptenos a los polipéptidos inmunogénicos o similares, son adecuadamente empleados también aquí, tomando en cuenta los grupos funcionales sobre los precursores o sobre los productos hidrolíticos que están disponibles para la reticulación, y la probabilidad de producir anticuerpos específicos para el epitopo en cuestión, en oposición a la sustancia inmunogénica.
Típicamente, el polipéptido es conjugado a un sitio sobre el compuesto de la invención, distante del epitopo que va a ser reconocido.
Los conjugados son preparados de una manera convencional. Por ejemplo, los agentes de reticulación N-hidroxisuccinimida, anhídrido succínico o alqN-C-Nalq son útiles en la preparación de los conjugados de esta invención. Los conjugados comprenden un compuesto de la invención unido por un enlace o grupo enlazador de 1-100, típicamente de 1-25, más típicamente de 1-10 átomos de carbono a la sustancia inmunogénica. Los conjugados son separados de los materiales iniciales y subproductos utilizando cromatografía o similar, y luego son esterilizados por filtración y colocados en frascos para el almacenamiento.
Los animales son típicamente inmunizados contra los conjugados o derivados inmunogénicos, y los antisueros o anticuerpos monoclonales preparados de una manera convencional.
Los compuestos de esta invención son útiles como enlazadores o espaciadores en la preparación de matrices de absorción de afinidad, enzimas inmovilizadas para control de proceso, o reactivos de inmunoensayo. Los compuestos en la presente contienen una pluralidad de grupos funcionales que son adecuados como sitios para reticular sustancias deseadas. Por ejemplo, es convencional enlazar los reactivos de afinidad tales como hormonas, péptidos, anticuerpos, fármacos y similares, a sustratos insolubles. Estos reactivos insolubilizados son empleados de una manera conocida para absorber socios de enlace para los reactivos de afinidad a partir de preparaciones fabricadas, muestras de diagnóstico y otras mezclas impuras. Similarmente, son utilizadas enzimas inmovilizadas para realizar conversiones catalíticas con recuperación fácil de la enzima. Los compuestos bifuncionales son comúnmente utilizados para enlazar los analitos a grupos detectables en la preparación de reactivos de diagnóstico.
Los ensayos de análisis utilizan preferentemente células de los tejidos particulares que son susceptibles a la infección por el HPV. Los ensayos conocidos en la técnica son adecuados para determinar la biodisponibilidad in vivo, incluyendo la estabilidad de lumen intestinal, la permeación celular, la estabilidad de los homogenatos hepáticos y los ensayos de estabilidad en plasma. No obstante, incluso si el éster, la amida u otros derivados protegidos no son convertidos in vivo a los grupos carboxilo, amino o hidroxilo libres, éstos permanecen útiles como intermediarios clínicos.
La utilidad para la presente invención fue enseñada utilizando ensayos de antiproliferación. Los ensayos de antiproliferación miden el efecto de los compuestos sobre la proliferación de las células cultivadas. Las células se cultivan durante 7 días en presencia de diversas concentraciones de los compuestos. En el 7°día, las células se tiñen con colorante, y la intensidad de la tinción (proporcional al número de células) se mide con un espectrofotómetro. Los datos se trazan gráficamente frente a las concentraciones del compuesto, ajustados a la curva de respuesta de dosis sigmoidal, de la cual se determina la concentración del compuesto que reduce la velocidad de proliferación celular en un 50 % (concentración eficaz al 50 % o CE50). Los compuestos activos en los ensayos de antiproliferación pueden ser citostáticos (inhiben la división celular) y/o citocidas (matan las células). Mediante la realización de ensayos de proliferación en células cancerosas positivas al HPV y células normales, identificamos compuestos que inhiben la proliferación de las células cancerosas positivas al HPV más eficazmente que las células de tejidos humanos normales.
Procedimientos ejemplares de elaboración de los compuestos de la invención
La invención también se refiere a los procedimientos de fabricación y a las composiciones de la invención. Las composiciones son preparadas mediante cualquiera de las técnicas aplicables de síntesis orgánica. Muchas de tales técnicas son bien conocidas en la técnica. No obstante, muchas de las técnicas conocidas son elaboradas en “Compendium of Organic Synthetic Methods” (John Wiley & Sons, New York), Vol. 1, Ian T. Harrison y Shuyen Harrison, 1971; Vol. 2, Ian T. Harrison y Shuyen Harrison, 1974; Vol. 3, Louis S. Hegedus y Leroy Wade, 1977; vol. 4, Leroy G. Wade, Jr., 1980; Vol. 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; y Vol. 6, Michael B. Smith, así como March, J., “Advanced Organic Chemistry, Third Edition”, (John Wiley & Sons, New York, 1985), “Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry. In 9 Volumes”, Barry M. Trost, Editor-in-Chief (Pergamon Press, New York, ed1993).
Una serie de ejemplos de procedimientos para la preparación de las composiciones de la invención se proporcionan más adelante. Estos procedimientos están destinados a ilustrar la naturaleza de tales preparaciones y no se pretende que limiten el alcance de los procedimientos aplicables.
En general, las condiciones de reacción tales como la temperatura, el tiempo de reacción, los disolventes, los procedimientos de tratamiento y similares, serán aquellos comunes en la técnica para la reacción particular que va a ser realizada. El material de referencia citado, junto con el material citado en la presente, contiene descripciones detalladas de tales condiciones. Típicamente, la temperatura será de -100 ºC a 200 ºC, los disolventes serán apróticos o próticos, y los tiempos de reacción serán de 10 segundos a 10 días. El tratamiento consiste esencialmente en desactivar cualesquiera reactivos sin reaccionar, seguido por la división entre un sistema de capa agua/orgánico (extracción) y separando la capa que contiene el producto.
5 Las reacciones de oxidación y reducción son típicamente llevadas a cabo a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), aunque para reacciones de hidruro metálico frecuentemente la temperatura es reducida a 0 ºC hasta -100 ºC, los solventes son típicamente apróticos para las reducciones, y pueden ser ya sea próticos
o apróticos para las oxidaciones. Los tiempos de reacción se ajustan para lograr las 10 conversiones deseadas.
Las reacciones de condensación son típicamente llevadas a cabo a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente, aunque para las condensaciones cinéticamente controladas, no en equilibrio, son también comunes a temperaturas reducidas (0 ºC a -100 ºC). Los disolventes pueden ser o próticos (comunes en las reacciones en equilibrio)
15 o apróticos (comunes en las reacciones cinéticamente controladas). Las técnicas sintéticas estándares tales como la eliminación azeotrópica de los subproductos de reacción y el uso de las condiciones de reacción anhidras (por ejemplo, ambientes de gas inerte) son comunes en la técnica, y serán aplicadas cuando sea aplicable. Los ejemplos de procedimientos para preparar los compuestos de la invención
20 se muestran en los esquemas de reacción siguientes. Las descripciones detalladas de los procedimientos se encuentran en la sección experimental más adelante, y se refieren a los esquemas de reacción específicos.
Esquemas Esquema 1
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Esquema 2
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Esquema 3
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Esquema 4
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Esquema 5
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Esquema 6
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Esquema 7
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Esquema 8
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Esquema 9
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Esquema 10
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Cada uno de los productos de los siguientes procesos es opcionalmente
separado, aislado y purificado antes de su uso en procesos subsecuentes.
Los términos “tratados”, “tratamiento” y similares, como se utilizan en el contexto de un proceso químico, protocolo o preparación, significa poner en contacto, mezclar, hacer reaccionar, permitir que reaccione, contactar, u otros términos comunes en la técnica para indicar que una o más entidades químicas son tratadas de una manera tal como para convertirla a una o más de otras entidades químicas. Esto significa que el “tratamiento del compuesto uno con el compuesto dos” es sinónimo con “permitir que el compuesto uno reaccione con el compuesto dos”, “poner en contacto el compuesto uno o el compuesto dos”, “hacer reaccionar el compuesto uno con el compuesto dos”, y otras expresiones comunes en la técnica de la síntesis orgánica para indicar razonablemente que el compuesto uno fue “tratado”, “reaccionado”, “dejado reaccionar”, etc., con el compuesto dos.
En el contexto de un proceso químico, protocolo, o preparación, “tratar o tratamiento” indica la manera razonable y usual en la cual los productos químicos orgánicos se dejan reaccionar. Se pretenden concentraciones normales (0,01 M a 10 M, típicamente 0,1 M a 1 M), temperaturas (-100 ºC a 250 ºC, típicamente -78 ºC a 150 ºC, más típicamente -78 ºC a 100 ºC, todavía más típicamente 0 ºC a 100 ºC), los recipientes de reacción (típicamente vidrio, plástico, metal), disolventes, presiones, atmósferas (típicamente aire para reacciones insensibles al oxígeno y al agua o nitrógeno o argón para reacciones sensibles al oxígeno o al agua), etc., a no ser que se indique de otro modo. El conocimiento de reacciones similares conocidas en la técnica de la síntesis orgánica se usa en la selección de las condiciones y aparatos para el “tratamiento” en un proceso dado. En particular, una persona de experiencia ordinaria en la técnica de la síntesis orgánica, selecciona las condiciones de aparatos razonablemente esperados para llevar a cabo exitosamente las reacciones químicas de los procesos descritos, con base en el conocimiento en la técnica.
Las modificaciones de cada uno de los esquemas de reacción anteriores conduce a diversos análogos de los materiales ejemplares específicos producidos anteriormente. Las citas anteriormente referidas que describen los procedimientos adecuados de síntesis orgánica son aplicables a tales modificaciones.
En cada uno de los ejemplos de esquemas anteriores puede ser ventajoso separar los productos de reacción uno del otro y de los materiales iniciales. Los productos deseados de cada paso o serie de pasos se separan y/o se purifican (de aquí en adelante se separan) al grado deseado de homogeneidad por la técnica común en la materia. Típicamente, tales separaciones involucran la extracción de fases múltiples, cristalización a partir de un solvente o mezcla de solvente, destilación, sublimación o cromatografía. La cromatografía puede involucrar cualquier número de procedimientos que incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño o de intercambio iónico, cromatografía líquida de presión alta, media o baja, cromatografía a escala pequeña y en capa delgada o gruesa preparativa, así como técnicas de cromatografía a escala pequeña en capa delgada y cromatografía instantánea.
Otra clase de procedimiento de separación involucra tratamientos de una mezcla con un reactivo seleccionado para enlazarse a o a ser de otro modo separable de un producto deseado, material inicial sin reaccionar, reacción por producto o similar. Tales reactivos incluyen adsorbentes o absorbentes tales como carbón activado, tamices moleculares, medios de intercambio iónico, o similares. Alternativamente, los reactivos pueden ser ácidos en el caso de un material básico, bases en el caso de un material ácido, reactivos tales como anticuerpos, proteínas de enlace, quelantes selectivos tales como éteres corona, reacciones de extracción de iones líquido/líquido (LIX) o similares.
La selección de los procedimientos apropiados de separación depende de la naturaleza de los materiales involucrados, por ejemplo, el punto de ebullición y el peso molecular en destilación y sublimación, la presencia o ausencia de grupos funcionales polares en cromatografía, estabilidad de materiales en medios ácidos y básicos en extracción de fase múltiples, y similares. Una persona experta en la técnica aplicará las técnicas más probables para lograr la separación deseada.
La invención se ha descrito con detalle suficiente para permitir que una persona de experiencia ordinaria en la técnica elabore y utilice el objeto de las reivindicaciones siguientes.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ejemplificar la presente invención, y de ningún modo pueden ser considerados como limitantes de la presente invención.
EJEMPLOS General
Algunos ejemplos han sido realizados múltiples veces. En ejemplos repetidos, las condiciones de reacción, tales como el tiempo, temperatura, concentración y similares, y los rendimientos, estuvieron dentro de los intervalos experimentales normales. En ejemplos repetidos donde fueron realizadas modificaciones significativas, éstas han sido notadas donde los resultados variaron significativamente de aquellos descritos. En los ejemplos donde fueron utilizados diferentes materiales iniciales, éstos son indicados. Cuando los ejemplos repetidos se refieren a un análogo “correspondiente” de un compuesto, tal como un “éster de etilo correspondiente”, se pretende que un grupo de otro modo presente, en este caso típicamente un éster de metilo, sea tomado para ser el mismo grupo modificado como se indica.
Los ejemplos 1 a 35 se refieren a los esquemas 1 al 9 anteriores.
Ejemplo 1 Cloruro de acetoxietiloximetilo 1: Un matraz de tres bocas de 5 litros se equipó con un agitador mecánico, termómetro, embudo de adición de 500 ml y purgado con argón. Se agregó 1,3-dioxalano (140 ml, 2,00 mol) en Et2O anhidro (800 ml) y ZnCl2/Et2O 1 M (7,5 ml, 0,007 mol). Se agregó gota a gota una solución de cloruro de acetilo (157 ml, 2,20 mmol) en Et2O (200 ml) a través de un embudo de adición en 20 minutos. Se utilizó un baño de agua fría para mantener la temperatura entre 19-27 ºC a todo lo largo de la reacción. Se continuó la agitación sin enfriamiento externo durante 4 horas, la reacción de autocalentamiento de 20-25 ºC durante aproximadamente 1 hora. La solución incolora clara se mantuvo bajo argón toda la noche. Se dejó reposar 3 días y se formó una solución anaranjada. Se retiró el Et2O en un evaporador rotatorio (aspirador de agua) hasta que ya no se destiló más en un baño a 35 ºC. Se obtuvo un rendimiento cuantitativo del producto 318 g (rendimiento teórico 306 g).
Ejemplo 2 Fosfonato de isopropilo 2: Se cargó un matraz de tres bocas a 500 ml con el éter clorometílico 1 bruto (317 g, 2,00 mol). Se agregó gota a gota fosfito de triisopropilo (494 ml) a través de un embudo de adición, mientras que se calentaba en un baño de aceite a 125 ºC y se agitaba vigorosamente. El destilado de 2-cloropropano se recogió por medio de una cabeza de trayectoria corta en un receptor enfriado con hielo seco, atmósfera de argón, y se recolectaron 140 g del destilado (157 g teóricos). El fosfito blanqueó la reacción hasta un color amarillo, se continuó el calentamiento durante otras 2 horas a 125 ºC en un baño de aceite, luego se dispuso para la destilación a vacío utilizando una bomba de vacío. Se destiló un corte frontal amarillo (140 g, cabeza a 135 ºC, cola a 190 ºC), luego se cambió a un receptor limpio. La fracción principal fue recolectada a la temperatura de la cabeza de 178-187 ºC (principalmente 185-187 ºC) con vacío desconocido a temperatura del baño de 222-228 ºC. Se obtuvieron 258 g del producto 2 (rendimiento de 47 % a partir de 1,3-dioxolano).
Ejemplo 3 Alcohol 3: Una solución del compuesto 2 (125 g, 0,443 mol) en MeOH absoluto (400 ml) se trató con HCl concentrado (11.2 ml, 0,112 mmol) y se calentó a reflujo por 6 horas bajo atmósfera de argón. Se eliminó el metanol en un evaporador rotatorio (aspirador de agua) a 55 ºC, dejando 115 g del aceite claro que se coevaporó con tolueno (2 x 200 ml). El producto bruto se secó luego a vacío para dar un aceite (102 g, 96 %).
Ejemplo 4 Fosfonato de diisopropilo 4: Una solución de trifenilfosfina (25,57 g, 97,5 mmol) y alcohol 3 (18 g, 75 mmol) en DMF (120 ml) se trató con 6-cloropurina (12,72 g, 75 mmol) y se enfrió a -15 ºC. Se agregó gota a gota una solución de azodicarboxilato de diisopropilo (16,68 g, 82,5 mmol) en DMF (50 ml) a través de un embudo de adición en 80 minutos. La mezcla de reacción se mantuvo a -15 °C durante 2 horas y luego se calentó a la temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas adicionales. Una mezcla de reacción turbia se tornó en una solución amarillo brillante. El disolvente de reacción fue evaporado a presión reducida, se coevaporó con 3 porciones de tolueno, y se secó a vacío toda la noche antes de la purificación. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (5 % MeOH/CH2Cl2) para dar el fosfonato de diisopropilo (18,52 g, 63 %) como un sólido blanco: RMN 1H (CDCl3) δ 7,95 (s, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,31 (m, 2H), 3,93 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 1,29 (m, 12H); RMN 31P (CDCl3) δ 18,42.
Ejemplo 5 Fosfonato de diisopropilo 5: Una mezcla del compuesto 4 (11,00 g, 28,08 mmol) y ciclopropilamina (4,86 g, 85,16 mmol) en 80 ml de CH3CN se colocó en una bomba de reacción y se calentó a 100 ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El producto se dividió entre 15 % de MeOH/CH2Cl2 (3 x) y salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (5 %.MeOH/CH2Cl2) para dar el compuesto 5 (10,42 g, 90 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,59 (s, 1H), 5,83 (s ancho, 1H), 4,88 (s ancho, 2H), 4,70 (m, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,72 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,03 (s ancho, 1H), 1,28 (m, 12H), 0,84 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); RMN 31P (CDCl3) δ 18,63.
Ejemplo 6 cPrPMEDAP 6: Una solución del compuesto 5 (11,00 g, 26,67 mmol) en CH3CN anhidro (120 ml) se trató con bromotrimetilsilano (21,1 ml, 160,02 mmol). La reacción se protegió de la luz mediante envolvimiento de matraz con papel aluminio. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Los materiales volátiles se evaporaron a presión reducida. El residuo se disolvió en 250 ml de H2O y el pH se ajustó a 9 con hidróxido de amonio. La mezcla de reacción se concentró y se obtuvo un sólido amarillo. El sólido se disolvió en 30 ml de agua y el pH se ajustó a 2 con HCl al 10 %. El sólido fino se recogió y se secó a vacío para dar el compuesto 6 (7,88 g, 90 %) como un sólido blanco.
Ejemplo 7 Clorhidrato del ácido monofosfónico 7: Una mezcla del ácido 6 (3,00 g, 9,15 mmol) y 0,1 ml de DMF en 9,2 ml de sulfolano se calentó a 70 ºC. Se agregó cloruro de tionilo (1,66 ml, 22,76 mmol) gota a gota en un periodo de 1 hora. La temperatura se incrementó hasta 90 ºC y se agregó TMSOPh (1,74 ml, 9,61 mmol) y se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de reacción se agregó gota a gota a 100 ml de acetona enfriada con hielo bien agitada. El producto se precipitó. El sólido se filtró bajo una atmósfera de argón, se lavó con 100 ml de acetona fría, se secó a vacío para dar el clorhidrato del ácido monofosfónico (3,70 g, 92 %) como un sólido.
Ejemplo 8 Monofosfonamidato 8: Una mezcla del ácido monofosfónico 7 (0,22 g, 0,50 mmol), clorhidrato del éster metílico de L-alanina (0,14 g, 1.00 mmol), y trietilamina (0,21 ml, 1,50 mmol) en 3 ml de piridina se calentó a 60 °C durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,39 g, 1,75 mmol) y trifenilfosfina (0,46 g, 1,75 mmol) en 2 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre acetato de etilo y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (97 mg, 39 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma blanquecina.
Ejemplo 9 Monofosfonamidato 9: Una mezcla del ácido monofosfónico 7 (0,88 g, 2,00 mmol), clorhidrato del éster metílico de D-alanina (0,84 g, 6,00 mmol), y trietilamina (0,84 ml, 6,00 mmol) en 8 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (1,56 g, 7,00 mmol) y trifenilfosfina 1,84 g, 7,00 mmol) en 8 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato 0,40 g, 41 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma blanquecina.
Ejemplo 10 Monofosfonamidato 10: Una mezcla de ácido monofosfónico 7 (0,88 g, 2,00 mmol), clorhidrato del éster de L-alanina (1,31 g, 6,00 mmol) y trietilamina (0,84 ml, 6,00 mmol) en 8 ml de piridina, se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (1,54 g, 7,00 mmol) y trifenilfosfina (1,84 g, 7,00 mmol) en 8 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (0,38 g, 36 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma anaranjada pálida.
Ejemplo 11 Monofosfonamidato 11: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster etílico de L-alanina (94 mg, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7% de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (74 mg, 48%, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H δ 7,61 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,26-7,08 (m, 5H), 4,23 (m, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,09 (m, 1H), 3,92-3,85 (m, 4H), 3,03 (s ancho, 1H), 1,30-1,26 (m, 3H), 1,24 (m, 3H), 0,88 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); RMN 31P (CDCl3) δ 21,94, 20,68.
Ejemplo 12 Monofosfonamidato 12: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (1,50 g, 4,56 mmol), clorhidrato de éster n-propílico de L-alanina (1,59 g, 9,49 mmol), fenol (2,25 g, 22,80 mmol) y trietilamina (10,50 ml, 54,72 mmol) en 8,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (6,54 g, 31,92 mmol) y trifenilfosfina (7,32 g, 31,92 mmol) en 8,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (0,43 g, 18 %, Compuesto E, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,61 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,27-7,09 (m, 5H), 4,274,20 (m, 2H), 4,16-4,00 (m, 3H), 3,93-3,82 (m, 4H), 3,04 (s ancho, 1H), 1,63 (m, 2H), 1,30 (dd, 3H), 0,92 (m, 3H), 0,89 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); RMN 31P (CDCl3) δ 21,89, 20,66.
Ejemplo 13 Monofosfonamidato 13: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster isopropílico de L-alanina (0,10 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (87 mg, 55 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla: RMN 1H (CDCl3) δ 7,60 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,26-7,09 (m, 5H), 4,98 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 3,91-3,83 (m, 4H), 3,04 (s ancho, 1H), 1,29-1,21 (m, 9H), 0,89 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,85, 20,68.
Ejemplo 14 Monofosfonamidato 14: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster de L-alanina (0,11 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (80 mg, 50 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,61 (d, J = 4,20 Hz, 1H), 7,27-7,08 (m, 5H); 5,93 (s ancho, 4,97 (s ancho, 2H), 4,23 (m, 2H), 4,10-4,08 (m, 3H), 3,91-3,84 (m, 4H), 3,03 (s ancho, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,34-1,27 (m, 5H), 0,92-0,89 (m, 5H), 0,63 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,94, 20,68.
Ejemplo 15 Monofosfonamidato 15: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster n-hexílico de L-alanina (0,13 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) y trietilamina 0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (0,10 g, 59 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,59 (d, J = 4,20 Hz, 7,26-7,08 (m, 5H), 4,22 (m, 2H), 4,11 (m, 4,06 (m, 2H), 3,91-3,84 (m, 4H), 3,01 (s ancho, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,31-1,27 (m, 9H), 0,89 (m, 3H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,94, 20,68.
Ejemplo 16 Monofosfonamidato 16: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster de L-alanina (0,15 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (0,13 g, 73 % mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,59 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,25-7,07 (m, 5H), 4,22 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 4,07 (m, 2H), 3,90-3,84 (m, 4H), 3,02 (s ancho, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,29-1,26 (m, 13H), 0,88 (m, 3H), 0,85 (m, 0,60 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,96, 20,69.
Ejemplo 17 Monofosfonamidato 17: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), clorhidrato del éster etílico del ácido L-2-aminobutírico (72 mg, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) y trietilamina (0,36 ml, 2,52 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) y trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (66 mg, 60 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,26-7,08 (m, 5H), 5,91 (s ancho, 1H), 4,97 (s ancho, 2H), 4,22-4,12 (m, 4H), 4,01-3,81 (m, 5H), 3,03 (s ancho, 1H), 1,71-1,60 (m, 2H), 1,24 (m, 3H), 0,89 (m, 2H), 0,84-0,76 (m, 3H), 0,63 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 22,15, 20,93.
Ejemplo 18 Monofosfonamidato 18: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (1,00 g, 3,05 mmol), clorhidrato del éster n-butílico del ácido L-2-aminobutírico (1,19 g, 6,09 mmol), fenol (1,43 g, 15,23 mmol) y trietilamina (5,10 ml, 36,60 mmol) en 5,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (4,70 g, 21,32 mmol) y trifenilfosfina (5,59 g, 21,32 mmol) en 5,00 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (5 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (0,7 g, 42 %, Compuesto G, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma blanquecina: RMN 1H (CDCl3) δ 7,60 (d, J = 6,60 Hz, 1H), 7,27-7,04 (m, 5H), 5,89 (s ancho, 1H), 4,94 (s ancho, 2H), 4,22(m, 2H), 4,07-3,99 (m, 3H), 3,91-3,84 (m, 4H), 3,03 (s ancho, 1H), 1,70-1,57 (m, 4H), 1,35 (m, 2H), 0,92-0,75 (m, 8H), 0,63 2H) RMN 13P (CDCl3) δ 22,21, 20,95.
Ejemplo 19 Monofosfonamidato 19: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster del ácido n-octanílico de L-2-aminobutírico (0,15 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (0,12 g, 64 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,62 (d, J = 6,60 Hz, 1H), 7,25-7,08 (m, 5H), 4,24-4,21 (m 2H), 4,094,04 (m, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,91-3,83 (m, 4H), 3,01 (s ancho, 1H), 1,70-1,58 (m, 4H), 1,27 (m, 10H), 0,89-0,76 (m, 8H), 0,62 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 22,22, 20,92.
Ejemplo 20 Monofosfonamidato 20: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (1,5 g, 4,57 mmol), clorhidrato del éster etílico de L-fenilalanina (2,10 g, 9,14 mmol), fenol (2,15 g, 22,85 mmol) y trietilamina (7,64 ml, 54,84 mmol) en 8,0 ml de piridina se calentó a 60 °C durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (7,05 g, 31,99 mmol) y trifenilfosfina (8,39 g, 31,99 mmol) en 7,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (5 % de metanol/CH2Cl2) para dar un sólido amarillo pálido 1,32 g, que contenía aproximadamente 10 % de impurezas. El sólido amarillo
(1.32 g, 2.28 mmol) se disolvió en 10 ml de iPrOH y se transfirió a una solución caliente de 30 ml de iPrOH de ácido fumárico (0,27 g, 2,28 mmol) y se agitó a 80 ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió gradualmente hasta la temperatura ambiente y la sal de fumarato se recogió a 0ºC. La sal de fumarato resultante fue neutralizada mediante división a partir de NaHCO3 (2 veces) y acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, agua, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto se secó a vacío para dar el monofosfonamidato (0,70 g, 26%, Compuesto A, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma blanca: RMN 1H (CDCl3) δ 7,54 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,27-6,98 (m, 10H), 4,35 (m, 1H), 4,16 (m, 2H), 4,08 (m, 2H), 3,84-3,61 (m, 3H), 3,33 (m, 1H), 3,02 (s ancho, 1H), 2,95-2,87 (m, 2H), 1,17 (m, 3H), 0,87 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,88, 21,07.
Ejemplo 21 Monofosfonamidato 21: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), clorhidrato del éster de n-butílico de L-fenilalanina (0,11 g, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) y trietilamina (0,36 ml, 2,52 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) y trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (30 mg, 23 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,55 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7,25-6,98 (m, 10H), 4,36 (m, 1H), 4,17 (m, 2H), 4,02 (m, 2H), 3,83-3,35 (m, 4H), 3,02 (s ancho, 1H), 2,94-2,86 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,29 (m, 2H), 0,90 (m, 3H), 0,88 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,85, 21,05.
Ejemplo 22 Monofosfonamidato 22: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), clorhidrato del éster isobutílico de L-fenilalanina (0,11 g, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) y trietilamina (0,36 ml, 2,52 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) y trifenilfosfina (0,39 g, mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (7 % de metanol/CH2Cl2) para dar el monofosfonamidato (65 mg, 50 %, mezcla diastereoisomérica 1:1) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,56 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,26-6,98 (m, 10H), 4,40 (m, 1H), 4,17 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,75-3,62 (m, 3H), 3,35 (m, 1H), 3,04 (s ancho, 1H), 2,96-2,87 (m, 2H), 1,83 (m, 1H), 0,90 (m, 2H), 0,86 (m, 6H), 0,63 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,82, 21,03.
Ejemplo 23 Bisfosfonamidato 23: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster etílico de L-alanina (0,28 g, 1,80 mmol), y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10 % de metanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (80 mg, 50 %,) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,63 (s, 1H), 5,88 (s ancho, 1H), 4,96 (s ancho, 2H), 4,24-4,16 (m, 6H), 4,00 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,01 (s ancho, 1H), 1,36 (m, 6H), 1,26 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,63.
Ejemplo 24 Bisfosfonamidato 24: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (1,00 g, 3,05 mmol), Clorhidrato del éster n-propílico de L-alanina (3,06 g, 18,30 mmol) y trietilamina (5,10 ml, 36,50 mmol) en 5,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (4,70 g, 21,32 mmol) y trifenilfosfina (5,59 g, 21,32 mmol) en piridina (5,0 ml) a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10 % para dar el bisfosfonamidato (1,13 g, 71 %, Compuesto F) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,65 (s, 1H), 5,92 (s ancho, 1H), 5,03 (s ancho, 4,24 (m, 2H), 4,10-4,02 (m, 6H), 3,87 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 3,03 (s ancho, 1H), 1,65 (m, 4H), 1,37 (m, 6H), 0,93 (m, 6H), 0,88 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,61.
Ejemplo 25 Bisfosfonamidato: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,60 g, 1,83 mmol), clorhidrato del éster isopropílico de L-alanina (1,84 g, 10,98 mmol), y trietilamina (3,06 ml, 21,96 mmol) en 3,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (2,82 g, 12,80 mmol) y trifenilfosfina (3,36 g, 12,80 mmol) en piridina (3,0 ml) a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10% para dar el bisfosfonamidato (0,53 g, 52 %, Compuesto B) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,65 (s, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,24 (m, 3,97 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,71 (m, 2H), 3,01 (s ancho, 1H), 1,34 (m, 6H), 1,23 (m, 12H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,59.
Ejemplo 26 Bisfosfonamidato 26: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster n-butílico de L-alanina (0,33 g, 1,82 mmol) y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10 % metanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (97 mg, 55 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,63 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 4,01 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,01 (s ancho, 1H), 1,61 (m, 4H), 1,37 (m, 10H), 0,93 (m, 6H), 0,88 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,59.
Ejemplo 27 Bisfosfonamidato 27: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster n-hexílico de L-alanina (0,38 g, 1,80 mmol) y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2propanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (0,13 g, 65 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,62 (s, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 4,01 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 2,99 (s ancho, 1H), 1,61 (m, 4H), 1,36-1,29 (m, 18H), 0,88 (m, 6H), 0,84 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,61.
Ejemplo 28 Bisfosfonamidato 28: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster n-octanílico de L-alanina (0,43 g, 1,80 mmol), y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2propanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (0,13 g, 61 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,61 (s, 1H), 4,21 (m, 2H), 4,07-4,00 (m, 6H), 3,84-3,70 (m, 4H), 2,98 (s ancho, 1H), 1,60 (m, 4H), 1,34 (m, 1,27 (m, 20H), 0,87 (m, 6H), 0,83 (m, 2H), 0,58 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,63.
Ejemplo 29 Bisfosfonamidato 29: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,70 g, 2,13 mmol), clorhidrato del éster etílico del ácido L-2-aminobutírico (2,15 g, 12,80 mmol) y trietilamina (3,57 ml, 25,56 mmol) en 3,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (3,29 g, 14,91 mmol) y trifenilfosfina (3,92 g, 91 mmol) en piridina (3,0 ml) a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10 % de metanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (0,71 g, 60 %, Compuesto D) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,16 (m, 4H), 3,89-3,87 (m, 4H), 3,72 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 3,01 (s ancho, 1H), 1,78-1,64 (m, 4H), 1,26 (m, 6H), 0,91 (m, 6H), 0,87 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,23.
Ejemplo 30 Bisfosfonamidato 30: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,70 g, 21,32 mmol) clorhidrato del éster n-butílico del ácido L-2-aminobutírico (2,50 g, 12,80 mmol), y trietilamina (3,57 ml, 25,56 mmol) en 3,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (3,29 g, 14,91 mmol) y trifenilfosfina (3,92 g, 14,91 mmol) en 3,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10 % de metanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (0,40 g, 31 %, Compuesto C) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,11 (m, 4H), 3,91 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,71 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 3,03 (s ancho, 1H), 1,791,64 (m, 4H), 1,60 (m, 4H), 1,37 (m, 4H), 0,94 (m, 6H), 0,90 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,25.
Ejemplo 31 Bisfosfonamidato 32: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), clorhidrato del éster n-octanílico del ácido L-2-aminobutírico (0,33 g, 1,82 mmol), y trietilamina (0,51 ml, 3,60 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) y trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (0,12 g, 55 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,13-4,05 (m, 4H), 3,91 (m, 2H), 3,87-3,72 (m, 4H), 3,01 (s ancho, 1H), 78-1,65 (m, 4H), 61-1,29 (m, 24H), 0,91 (m, 6H), 0,89 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 21,20.
Ejemplo 32 Bisfosfonamidato 32: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,60 g, 1,82 mmol), clorhidrato del éster etílico de L-fenilalanina (2,51 g, 10,96 mmol), y trietilamina (3,06 ml, 21,84 mmol) en 3,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (2,82 g, 12,74 mmol) y trifenilfosfina (3,36 g, 12,74 mmol) en 3,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2propanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (0,53 g, 43 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,48 (s, 7,22-7,06 (m, 10H), 4,20 (m, 1H), 4,12 (m, 4H), 4,09 (m, 2H), 4,04 (m, 3,63 (m, 2H), 3,33-3,21 (m, 2H), 3,04-2,78 (m, 5H), 1,20 (m, 6H), 0,83 (m, 2H), 0,58 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,38.
Ejemplo 33 Bisfosfonamidato 33: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), clorhidrato del éster n-butílico de L-fenilalanina (0,33 g, 1,26 mmol) y trietilamina (0,36 ml, 2,52 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) y trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10 % de metanol/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (0,11 g, 70 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,51 (s, 1H), 7,23-7,06 (m, 10H), 4,23 (m, 1H), 4,114,05 (m, 7H), 3,65 (m, 2H), 3,35-3,23 (m, 2H), 3,01 (m, 1H), 3,04-2,78 (m, 4H), 1,57 (m, 4H), 1,33 (m, 4H), 0,92 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,35. Ejemplo 34 Bisfosfonamidato 34: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), clorhidrato del éster isobutílico de L-fenilalanina (0,33 g, 1,26 mmol) y trietilamina (0,36 ml, 2,52 mmol) en 1,0 ml de piridina se calentó a 60 ºC durante 5 minutos. Se agregó una solución amarilla brillante recién preparada de aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) y trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) en 1,0 ml de piridina a la mezcla de reacción anterior. La reacción se agitó a 60 ºC toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (10 % MeOH/CH2Cl2) para dar el bisfosfonamidato (78 mg, 50 %) como una espuma amarilla pálida: RMN 1H (CDCl3) δ 7,52 (s, 1H), 7,24-7,07 (m, 10H), 4,26 (m, 1H), 4,11 (m, 2H), 4,01 (m, 1H), 3,85 (m, 4H), 3,66 (m, 2H), 3,35-3,25 (m, 2H), 3,07-2,85 (m, 3H), 2,97-2,79 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 0,90 (m, 12H), 0,89 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,31.
Ejemplo 35 BisPOC de cPrPMEDAP 35: Una mezcla del ácido fosfónico 6 (0,20 g, 0,61 mmol) y trietilamina (0,42 ml, 3,01 mmol) en 2,0 ml de 1-metil-2-pirrolidinona se calentó a 60 ºC durante 30 minutos. Se agregó POCCl (0,45 g, 2,92 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 60 ºC durante 3 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto se dividió entre EtOAc y NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró, y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para dar el bisPOC de cPrPMEDAP (0,13 g, 39 %) como un sólido: RMN 1H (CDCl3) δ 7,58 (s, 1H), 5,66 (m, 4H), 4,92 (m, 2H), 4,22 (m, 2H), 3,90-3,88 (m, 4H), 3,01 (s ancho, 1H), 1,81 (m, 12H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); RMN 13P (CDCl3) δ 20,93.
Ejemplo 36
Este ejemplo muestra ensayos usados para demostrar la actividad de antiproliferación
Tipo celular utilizado para los ensayos anti-proliferación
Las líneas celulares de cáncer humano utilizadas en los ensayos antiproliferación incluyeron seis líneas celulares de carcinoma cervical con tres tipos de HPV (HPV-16, HPV-18, HPV-39), una línea celular de carcinoma cervical negativo al HPV y dos carcinomas similares a queratinocitos provenientes de lengua. Las células humanas normales probadas incluyeron queratinocitos de piel, queratinocitos cervicales y fibroblastos pulmonares. Los queratinocitos de piel y los queratinocitos cervicales fueron obtenidos de Cambrex (East Rutherford, NJ) y todas las otras células fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). La Tabla 36-1 resume las características de cada tipo celular y las condiciones de cultivo. Procedimiento de ensayo anti-proliferación
1.
Cultivo Celular
Las células fueron desprendidas de los matraces de cultivo utilizando tripsina, contadas y sembradas en placas de cultivo de 96 pocillos (250-1000 células por pocillo, dependiendo del tipo celular). Al siguiente día (definido como el día 0), después de que las células se acoplaron al fondo de las placas, se agregaron por duplicado diluciones en serie hasta un quinto de los compuestos. Se agregaron cero compuestos y colchicina 10 µM (inhibidor de la división celular) a los pocillos control, los cuales podrían representar 100 % de la proliferación y 0 % de la proliferación, respectivamente.
2.
Tinción de las células con sulforodamina B
Siete días después de la adición de los compuestos, las placas de cultivo fueron tratadas con ácido tricloroacético al 10 % a 4 °C durante 1 hora, luego lavadas con agua. Este procedimiento permite que las proteínas derivadas de la célula se enlacen a la superficie inferior de las placas. Las proteínas fueron teñidas con 0,4 % de sulforrodamina B en 1 % de ácido acético durante 10 minutos, seguido por lavado intenso con ácido acético al 1 %. El colorante remanente enlazado al fondo de las placas fue disuelto en base Trizma 10 mM. Esto generó color púrpura que fue cuantificado mediante la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm, utilizando el espectrofotómetro.
3.
Análisis de datos
A partir de los datos experimentales, se generó la curva sigmoidal de respuesta a la dosis y se calculó la concentración eficaz al 50 % (CE50) utilizando GraphPad Prism versión
4.01 para Windows (Software GraphPad, San Diego, California EEUU).
Tabla 36-1. Tipos celulares utilizados en los ensayos anti-proliferación
Nombre
Estado del HPV Origen Medio de cultivo*
Líneas celulares de carcinoma positivas al HPV
SiHa
HPV-16 (1-2 copias por célula) Carcinoma de células escamosas en cuello uterino A1, A2
Ca Ski
HPV-16 (600 copias por célula) Carcinoma epidermoide, mestastatizado al intestino delgado desde la cuello uterino A1, A2
MS751
HPV-18 (también contiene un genoma de HPV45 parcial) Carcinoma epidermoide, metastatizado a nódulos linfáticos desde el cuello uterino A1, A2
HeLa
HPV-18 Adenocarcinoma epitelial en cuello uterino A1, A2
C-4 I
HPV-18 Carcinoma en cuello uterino A1, A2
ME-180
HPV-39 Carcinoma epidermoide, metastatizado al omentum de cuello uterino A1, A2
Líneas celulares de carcinoma negativas al HPV
HT-3
Ninguno Carcinoma, metastatizado a nódulos linfáticos desde el cuello uterino A1, A2
SCC-4
Ninguno Carcinoma de células escamosas en lengua A1, A2
SCC-9
Ninguno Carcinoma de células escamosas en lengua A1, A2
continuación
Células provenientes de tejidos humanos normales
HEL299
Ninguno Fibroblastos en pulmón embrionario A1, A2
PHK (queratinocitos de piel)
Ninguno Queratinocitos en prepucio de adulto B1, B2
CK (queratinocitos cervicales)
Ninguno Queratinocitos en cuello uterino de adulto B1, B2
* Medio de cultivo Las células fueron mantenidas en incubadoras humidificadas a 37 °C con 5 % de CO2, en los siguientes medios de cultivo. A1: Medio para mantenimiento de cultivo: Eagle MEM con BSS de Earle (Cambrex, East Rutherford, NJ), suplementado con 10 % de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina. A2: Medio para los ensayos antiproliferación: MEM de Eagle con BSS de Earle, suplementado con 5 % de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. B1: Medio para mantenimiento de cultivo: queratinocito-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado con 0,01 mg/ml de extracto de pituitaria bovina, 0,001 µg/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. B2: Medio para los ensayos de antiproliferación: mezcla 4:1 de B1 y A2.
Resultados
1. La actividad de antiproliferación selectiva de los profármacos de amidato en células SiHa positivas al HPV, se comparó con los fibroblastos normales.
El objetivo fue descubrir un compuesto que inhiba el desarrollo de la lesión transformada por HPV sin afectar las células normales en la epidermis y la dermis (tales como los queratinocitos y los fibroblastos). Fueron establecidos ensayos antiproliferación in vitro utilizando células SiHa y células HEL, las cuales modelan la lesión transformada por HPV y los fibroblastos normales, respectivamente. Las células SiHa son derivadas de carcinoma de células escamosas en el cuello uterino, provocado por la infección por el HPV-16 y fibroblastos HEL son derivados de pulmón embrionario humano normal (Tabla 36-1). Como se muestra en la Tabla 36-2, la concentración eficaz al 50 % (CE50) de los siete profármacos de amidato en las células SiHa que estuvieron en el intervalo de 0,13-3,2 nM, mientras que CE50 en células HEL estuvo en el intervalo de 12-727 nM, indicando que estos compuestos inhibieron la proliferación de células SiHa más eficientemente que las células HEL. El índice de selectividad de HEL/SiHa (CE50 de HEL dividido entre CE50 de SiHa) estuvo en el intervalo de 72-559 (Tabla 36-2).
Los siete profármacos de amidato producen el mismo metabolito, cprPMEDAP. cprPMEDAP es además metabolizado a PMEG [Compton y col., 1999; Haste y col., 1999]. La CE50 antiproliferación de estos compuestos en células SiHa fue mucho más alta que aquellas de los profármacos (Tabla 36-2), indicando que el acoplamiento de las porciones de amidato mejoró la potencia. Además, los índices de selectividad HEL/SiHa de cprPMEDAP y PMEG fueron 17 y 4,1, respectivamente (Tabla 36-2), indicando que los profármacos tienen mejor selectividad que cprPMEDAP, y cprPMEDAP tiene mejor selectividad que PMEG.
Se sabe que PMEG es fosforilado a PMEGpp que actúa como un inhibidor de la terminación de cadena de la ADN-polimerasa celular [Compton y col., 1999; Haste y col., 1999]. Cuatro inhibidores de ADN-polimerasa conocidos (Cidofovir, Ara C, doxifluiridina y afidicolin) y otros fármacos anticancerosos con diferentes mecanismos de acción, incluyendo, los inhibidores de la ADN-topoisomerasa (dacarbazina, elipticina), alquilantes de ADN (doxorrubicina, mitoxantrona, bleomicina, mecloretamina), e inhibidores de tubulina (vincristina, vinblastina, etopósido e indanocina) fueron probados en células SiHa y HEL (Tabla 36-2). La CE50 de antiproliferación de estos compuestos en células SiHa varió, y algunas fueron igualmente o más potentes que los siete profármacos de amidato. No obstante, todos ellos mostraron bajos índices de selectividad HEL/SiHa (0,01-3,98), en comparación con los siete profármacos de amidato.
Tomado conjuntamente, un grupo único de compuestos fueron mostrados, que muestran la CE50 antiproliferación de sub-bajo nM en las células de carcinoma SiHa positivas al HPV-16, y una selectividad mayor de 50 veces cuando se comparó con los fibroblastos HEL.
2. Actividad de proliferación selectiva de los profármacos de amidato en células SiHa positivas al HPV en comparación con los queratinocitos normales
Con el fin de probar el efecto de los compuestos en células normales provenientes de la epidermis, se realizaron ensayos anti-proliferación utilizando queratinocitos humanos primarios, aislados de piel (PHK) y cuello uterino (CK). Los valores de CE50 antiproliferación obtenidos con siete profármacos en PHC y CK fueron menores que aquellos en HEL, indicando que los queratinocitos son más susceptibles que los fibroblastos (Tabla 36-2 y 36-3). No obstante, los índices de selectividad de PHK/SiHa y CK/SiHa de estos profármacos y cprPMEDAP fueron todavía mejores que los compuestos control PMEG y un inhibidor de la ADN-polimerasa, AraC (Tabla 36-3). De este modo, los profármacos inhibieron
5 preferentemente la proliferación de las células SiHa positivas a HPV-16, en comparación con los queratinocitos normales de piel y cuello uterino.
3. Actividades antiproliferación en otras células positivas a HPV Los siete profármacos fueron luego probados en cinco líneas celulares
10 adicionales derivadas del carcinoma cervical inducido por HPV (listadas en la Tabla 36-1) en ensayos de antiproliferación, y los datos se muestran en la Tabla 4 junto con los datos de SiHa. En las células SiHa, C-4I y MS751, todos los compuestos, excepto el Compuesto C mostraron CE50 antiproliferación de sub-bajo nM. En células CaSki, HeLa y ME-180, no obstante, todos los compuestos fueron significativamente menos potentes, con CE50 en el intervalo de 7,8-410
15 nM. No parece existir correlación entre la resistencia y el tipo de HPV (16, 18 ó 39), o resistencia y metástasis (CaSki, MS751, y ME180 son derivadas del sitio con metástasis). El compuesto control AraC (inhibidor de la ADN-polimerasa) inhibió uniformemente todas las líneas celulares con valores de CE50 en el intervalo de 94-257 nM.
20 4. Actividades antiproliferación en células de carcinoma negativas al HPV
Para investigar el efecto de los compuestos sobre las líneas celulares de carcinoma negativas al HPV, se probaron tres líneas celulares (HT-3, SCC4, SCC9, Tabla 791) en ensayos antiproliferación. Como se muestra en la Tabla 36-4, los siete profármacos fueron igualmente o más potentes que el compuesto AraC control.
25
Tabla 36-2. Inhibición selectiva de las células SiHa HPV16+ comparadas con los fibroblastos HEL
5
10
15
20
25
30
ID del Compuesto
Nota Selectividad (HEL/SiHa) Antiproliferación CE50 (nM)
Carcinoma cervical SiHa (HPV-16)
Fibroblasto de pulmón HEL
A
72 0,8 43
B
559 1,3 727
C
115 0,20 23
D
135 3,2 431
E
164 0,50 82
F
210 2,5 526
G
92 0,13 12
Controles
cprPMEDAP
Metabolito 17 284 4821
PMEG
Metabolito 4,1 207 861
AraC
Inh de pol-ADN 0,113 257 29
Cidofovir
Inh de pol-ADN 0,3 84013 27952
Doxifluridina
Inh de polADN856 0,449 8755 3927
Afidicolina (+)
Inh de pol-ADN 0,40 856 324
Dacarbazina
Inh de ADN-topo 3,98 7402 29841
continuación
Elipticina
Inh de ADN-topo 1,02 478 486
Doxorrubicina
Alquilador de ADN 0,43 9,76 4,20
Mitoxantrona
Alquilador de ADN <0,37 8,67 <3,2
Clorhidrato de mecloretamina
Alquilador de ADN 1,02 21863 22203
Bleomicina
Alquilador de ADN 0,01 3138 20,28
Vincristina
Inh de tubulina 1,55 1,24 1,92
Vinblastina
Inh de tubulina 0,39 0,68 0,27
Etopósido
Inh de tubulina 0,31 469 144
Indanosina
Inh de tubulina 0,27 588 159
Tabla 36-3. Inhibición selectiva de células SiHa HPV16+ en comparación con los queratinocitos primarios
5
10
15
20
ID del Compuesto
Nota Selectividad (PHK/SiHa) Selectividad (CK/SiHa) Antiproliferación EC50 (nM)
Carcinoma cervical SiHa (HPV16)
Queratinocitos de piel PHK Queratinocitos cervicales CK
A
58 11 0,6 35 7
B
75 42 1,3 98 54
C
4 7 0,20 0,8 1,4
D
12 7 3,2 39 22
E
10 11 0,50 5,2 5,4
F
31 3 2,5 78 7,1
G
22 15 0,13 2,9 1,9
Controles
cprPMEDAP
Metabolito 13 2,4 284 3698 694
MPEG
Metabolito 0,48 2,4 207 101 501
AraC
Inh de pol-ADN 0,57 0,4 257 147 107
Tabla 36-4. Actividades de antiproliferación en otras células de carcinoma positivas y negativas al HPV
5
10
15
20
ID del compuesto
Antiproliferación EC50 (nM) en células de carcinoma positivas al HPV Antiproliferación EC50 (nM) en células de carcinoma negativas al HPV
SiHa HPV16
CaSki HPV16 HeLa HPV18 MS751 HPV18 C-4I HPV18 ME180 HPV39 HT-3 cuello uterino SCC-4 lengua SCC-9 lengua
A
0,6 29 16 1,7 6,5 27 14 17 40
B
1,3 246 410 18 27 254 104 53 150
C
0,20 3,87 6,6 0,54 1,0 7,8 9,5 2,1 2,5
D
3,2 301 398 16 24 288 127 44 147
E
0,50 38 19 2,40 3,1 27 17 8 13
F
2,5 124 127 4,2 6,0 41 24 10 28
G
0,13 28 12 0,9 3,1 8,2 6,0 2,1 7,9
Controles
AraC
257 94 174 144 123 101 214 74 68
Ejemplo 37 Ensayo de antiproliferación
Los ensayos de antiproliferación miden el efecto de los compuestos sobre la proliferación de las células cultivadas. Los compuestos activos en los ensayos de antiproliferación pueden ser citostáticos (inhiben la división celular) y/o citocidas (matan las células). Mediante la realización de los ensayos de antiproliferación utilizando células de carcinoma positivas al HPV y células normales, se identificaron los compuestos que inhiben selectivamente la proliferación de las células de carcinoma positivas al HPV en comparación con las células de tejidos humanos normales. La Tabla 37-1 resume las características de cada tipo celular, incluyendo seis líneas celulares de carcinoma cervical transformadas por el HPV, queratinocitos de piel humana normales (PHK), y fibroblastos de pulmón normal (HEL). Los queratinocitos de piel fueron obtenidos desde Cambrex (East Rutherford, NJ). Todas las otras células fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (Manassas, VA).
Las células fueron desprendidas de los matraces de cultivo utilizando tripsina, contadas y sembradas en placas de cultivo de 96 pocillos (250-100 células por pocillo, dependiendo del tipo celular). Al siguiente día (definido como día 0), se agregaron diluciones en serie a un quinto, de los compuestos, por duplicado. Siete días después de la adición de los compuestos, las placas de cultivo fueron tratadas con ácido tricloroacético al 10 % a 4 °C durante 1 hora y lavadas con agua. Este procedimiento permite que las proteínas celulares se enlacen a la superficie inferior de las placas. Las proteínas fueron teñidas con 0,4 % de sulforrodamina B en 1 % de ácido acético por 10 minutos, seguidas por lavado intensivo con ácido acético al 1 %. El colorante remanente enlazado al fondo de las placas fue solubilizado en base Trizma 10 mM, generando un color púrpura. La intensidad del color (proporcional al número de células) fue cuantificada mediante la medición de la absorbancia a 510 nm de longitud de onda, utilizando un espectrofotómetro. Las células sin el tratamiento con el fármaco (=100 % de proliferación) y las células tratadas con colchicina 10 µM (inhibidor de la división celular) (=0 % de proliferación) fueron utilizadas como controles, para determinar el porcentaje de inhibición. Los valores del porcentaje de inhibición fueron trazados gráficamente contra las concentraciones del compuesto, ajustada a una curva de respuesta a la dosis sigmoidal, a partir de la cual fue determinada la concentración del compuesto que redujo la proporción o velocidad de proliferación celular en un 50 % (=CE50). Se utilizó GraphPad Prism versión 4.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego California EEUU) para el ajuste de la curva y el cálculo de la CE50.
Ensayo de apoptosis (procedimiento de inducción de caspasa 3)
La inducción de las caspasas es uno de los eventos tempranos asociados con la apoptosis o la muerte celular programada. La actividad de caspasa puede ser cuantitativamente detectada utilizando el sustrato fluorescente. Los compuestos que actúan directamente de la vía apoptótica pueden inducir la caspasa en un periodo de incubación relativamente corta (< 24 horas). Los compuestos que perturban otra fisiología celular, que eventualmente provoca apoptosis, pueden requerir un periodo de incubación más prolongado (> 48 horas) para la inducción de la caspasa.
10.000 células fueron sembradas en placas de cultivo de 96 pocillos e incubadas con diluciones en serie a un quinto, de los compuestos por 24, 48 y 72 horas. Las células fueron lisadas y se midió la actividad de caspasa en los lisados celulares utilizando el sustrato fluorescente, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (equipo de ensayo de caspasa, Roche, Indianápolis, IN).
Ensayo de apoptosis (procedimiento de tinción con anexina V)
La translocación de la fosofatidilserina a partir de la parte interna de la membrana celular hacia la parte externa es uno de los eventos tempranos/intermedios asociados con la apoptosis con la muerte celular programada. La fosfatidilserina translocada puede ser detectada mediante la incubación de las células con anexina V marcada con FITC, que es una proteína de enlace al fosfolípido, dependiente deseado. Cuando las células son teñidas con anexina-FITC y yoduro de propidio (que tiñe las células muertas) las células vivas son negativas para ambos colorantes, las células muertas son positivas para ambos, mientras que las células apoptóticas son sensibles únicamente para la anexina FITC.
Las células SiHa HPV-16 fueron cultivadas con tres diferentes concentraciones de los compuestos por 3 ó 7 días y simultáneamente teñidas con anexina FITC y yoduro de propidio. La tinción de cada célula individual fue examinada mediante citometría de flujo.
Resultados
Actividad de antiproliferación selectiva
El propósito de este procedimiento fue identificar los compuestos que inhiben el desarrollo de la lesión transformada por el HPV sin afectar las células normales en la epidermis y la dermis (tales como los queratinocitos y los fibroblastos). Por lo tanto, los compuestos fueron probados en células SiHa, PHK y HEL, que son modelos de las células transformadas con HPV, queratinocitos normales, y fibroblastos normales, respectivamente.
Los compuestos representativos de la presente invención mostraron niveles detectables de actividad de antiproliferación en células SiHa, con una concentración eficaz del 50 % (CE50) menor de 25.000 nM. Los compuestos activos fueron también probados en células HEL. En todos los casos, los CE50 en las células HEL fueron mayores que los CE50 en las células SiHa, indicando que los compuestos activos inhibieron la proliferación de las células SiHa, más eficientemente que las células HEL. Otros análogos de nucleótidos/nucleósido, tales como PMEG (2-fosfonometoxietilguanina), Ara-C (citarabina, Nº CAS 147-94-3), y gencitabina (Nº CAS 95058-81-4) no mostraron tal selectividad. El podofilox (Nº CAS 518-285), el ingrediente activo del fármaco anti-arrugas Condilox, tampoco mostró selectividad.
Los compuestos profármacos representativos de la presente invención, tales como aquellos enumerados en la tabla 37-2 muestran actividades. En la mayoría de los casos, los profármacos fueron más potentes y en algunos casos, más selectivos que sus respectivos compuestos progenitores. La mayoría de los profármacos fosfoamidato fueron más activos y selectivos que el podofilox.
Tomados conjuntamente, los compuestos fueron identificados, los cuales poseen CE50 antiproliferación sub nM en células SiHa positivas al HPV-16, y una selectividad mayor a 50 veces como se comparó con los queratinocitos PHK o los fibroblastos HEL.
Actividad antiproliferación en otras líneas celulares de HPV+
Los compuestos seleccionados fueron también probados en cinco líneas celulares adicionales derivadas del carcinoma cervical inducido por HPV (ver ejemplo 36 y tabla 37-3). Cada compuesto mostró niveles diferentes de actividades en las líneas celulares HPV+, no obstante del tipo de HPV presente. En general, los compuestos fueron más potentes en las células SiHa (HPV-16), C-4I (HPV-18), y MS751 (HPV-18), que en células CaSki (HPV-16), HeLa (HpV-18) y ME-180 (HPV-39).
Inducción de la apoptosis (procedimiento de inducción de caspasa 3)
Un compuesto representativo de la presente invención fue probado para la inducción de la apoptosis en células SiHa. Cuando las células fueron incubadas por 72 horas (barras sólidas), se observó una inducción significativa que responde a la dosis, de la caspasa, indicando que el compuesto induce la apoptosis (37-1). La inducción de la caspasa fue menos obvia con incubación de 48 horas (barras sombreadas) y no fue observada con la incubación a las 24 horas (datos no mostrados).
Inducción de la apoptosis (procedimiento de tinción con anexina V) PMEG, N6-ciclopropilPMEDAP, y un compuesto representativo de la presente
invención fueron probados a tres diferentes concentraciones, para la inducción de la apoptosis en células SiHa, utilizando el procedimiento de tinción doble con anexina V-propidio. Con los tres compuestos, se observó un porcentaje mayor de células apoptóticas en el día 7 que en el día 3. El compuesto representativo anteriormente mencionado de la presente invención fue el 5 más activo en la inducción de la apoptosis; el día 7, 63,8 % de las células en los cultivos tratados con 0,2 µg/m de este compuesto fueron apoptóticas. En contraste, los cultivos tratados con 0,2 µg/ml de PMEG y 0,5 µg/ml de N6-ciclopropilPMEDAP únicamente tuvieron
1,2 % y 15,9 % de las células apoptóticas, respectivamente.
10 Tabla 37-1. Tipos celulares utilizados en los ensayos antiproliferación * El subtipo del ADN del HPV integrado en el ADN celular ** Medios de cultivo Las células fueron mantenidas en incubadoras humidificadas a 37ºC con 5% de CO2, en los siguientes medios de cultivo: A1: Medio para mantenimiento de cultivo: MEM de Eagle con BSS de Earle (Cambrex, East
Nombre
Estado del HPV* Origen Medio de cultivo**
Líneas celulares de carcinoma positivos al HPV
SiHa
HPV-16 Carcinoma de células escamosas en cuello uterino A1, A2
Ca Ski
HPV-16 Carcinoma epidermoide, metastatizado al intestino delgado desde el cuello uterino A1, A2
MS751
HPV-18 (también contiene un genoma parcial del HPV-45) Carcinoma epidermoide, metastatizado al nodo linfático desde el cuello uterino A1, A2
HeLa
HPV-18 Adenocarcinoma epitelial en cuello uterino A1, A2
C-4 I
HPV-18 Carcinoma en cuello uterino A1, A2
Me-180
HPV-39 Carcinoma epidermoide, metastatizado al omentum desde el cuello uterino A1, A2
continuación
Células provenientes de tejidos humanos normales
HEL299
Ninguno Fibroblastos en pulmón embrionario A1, A2
PHK
Ninguno Queratinocitos en prepucio de B1, B2
Rutherford, NJ), suplementado con 10 % de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina.
A2: Medio para ensayos de antiproliferación: MEM de Eagle con BSS de Earle, suplementado con 5 % de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina.
B1: Medio para mantenimiento de cultivo: queratinocito-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado con 0,01 mg/ml de extracto de pituitaria bovina, 0,001 µg/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 µg/ml de
estreptomicina. B2: Medios para ensayo antiproliferación: mezcla 4:1 de B1 y A2.
Tabla 37-2. Actividad de antiproliferación del profármacos de fosfoamidato de PMEDAP sustituido con N6 en células SiHa, HPV16+, queratinocitos PHK y en fibroblastos HEL
5
10
15
20
25 5
en la que RX1 y Rx2 están sustituidos como se representa en la fórmula, e Y1A e Y1B están sustituidos como se indica
Y1A
Y1B
OH
OH
POC
POC
O-iPr
O-iPr
Ala-Et
Ala-Et
Ala-Pr
Ala-Pr
Ala-iPr
Ala-iPr
Ala-Bu
Ala-Bu
Ala-cBu
Ala-cBu
Ala-cPen
Ala-cpentilo
Ala-hexilo
Ala-hexilo
Ala-octilo
Ala-octilo
Ala-Et
Aba-Et
Ala-Bu
Aba-Bu
Aba-octilo
Aba-octilo
Phe-Et
Phe-Et
Phe-Bu
Phe-Bu
10
15
20
25
30
continuación
Phe-iBu
Phe-iBu
Phe-cBu
Phe-cBu
OPh
Ala-Me
OPh
Ala-Et
OPh
Ala-Pr
OPh
Ala-iPr
OPh
Ala-Bu
OPh
Ala-tBu
OPh
Ala-hexilo
OPh
Ala-octilo
OPh
Aba-Et
OPh
Aba-Bu
OPh
Aba-cBu
OPh
Aba-octilo
OPh
Phe-Et
OPh
Phe-Bu
OPh
Phe-iBu
OPh
D-Ala-Me
Tabla 37-3. Actividades antiproliferación de N6-ciclopropil-PMEDAP y sus profármacos de fosfoamidato en seis diferentes células positivas al HPV
ID del
CE50 antiproliferación (nM) en célula de carcinoma positivas al HPV
Compuesto
SiHa HPV16 CaSki HPV16 HeLa HPV18 MS-751 HPV18 C-4I HPV18 ME-180 HPV39
A
0,6 29 16 1,7 6,5 27
B
1,3 246 410 18 27 254
C
0,2 3,9 6,6 0,5 1,0 7,8
D
3,2 301 398 16 24 288
E
0,5 38 19 2,4 3,1 27
F
2,5 124 127 4,2 6,0 41
G
0,13 28 12 0,9 3,1 8,2
H
0,03 2,0 0,7 0,04 0,44 1,8
(cprPMEDAP)
284 14149 6926 3313 1332 8315
Ejemplo 38 Estudio de Irritación de Piel de Conejo de los Compuestos A y B
Fue conducido un estudio para evaluar el potencial de dos compuestos de la presente invención, para producir irritación, cuando se administran vía la aplicación dérmica a conejos macho por siete días consecutivos. Un total de seis machos fueron asignados al estudio como se presenta en la siguiente tabla.
Asignaciones de Grupo
Número de Grupo
Artículo de Pruebaa Número de Animales (machos)
1
Compuesto Bb 3
2
Compuesto Ac 3
aCada animal recibió tratamientos dérmicos del vehículo (gel de placebo), un artículo control positivo, y tres concentraciones del artículo de prueba apropiado. Cada animal recibió un artículo de prueba a las concentraciones de 0,01, 0,03 y 0,1 %. bEl artículo control positivo utilizado fue 9-(2-fosfonilmetoxietil)guanina al 0,1 % (PMEG). cEl artículo control positivo utilizado fue Cidofovir® al 1 %.
El vehículo, los artículos control positivos y los artículos de prueba fueron administrados dérmicamente una vez al día por siete días durante el estudio. Los artículos de prueba fueron administrados a concentraciones de 0,01, 0,03 y 0,1 %. Los artículos de control positivos fueron administrados a concentraciones de 0,1 % (PMEG) o 1 % (Cidofovir®). El volumen de dosis para todas las formulaciones fue un volumen fijo de 100 µl.
Los sitios de prueba para cada animal fueron afeitados antes de la administración inicial y como fuera necesario durante el estudio. Los dos sitios fueron pinzados sobre el lado dorsal izquierdo, y tres fueron pinzados sobre el lado dorsal derecho. El perfil de cada dosificación (aproximadamente 6,45 cm2 (1 pulgada cuadrada) cada una) fue marcado con tinta indeleble. El área pinzada total comprendió menos de 10 % de la superficie corporal total de cada animal. El vehículo y el control positivo apropiado y el artículo de prueba fueron administrados a cada animal dentro de un sitio de dosificación de aproximadamente 6.45 cm2 (1 pulgada cuadrada). El vehículo fue administrado sobre el sitio rostral izquierdo (Sitio de Dosis 1), y el artículo de control positivo apropiado fue administrado al sitio caudal izquierdo (Sitio de Dosis 2). El artículo de prueba apropiado fue administrado como sigue: 0,01 % al sitio rostral derecho (Sitio de Dosis 3), 0,03 % al sitio intermedio derecho (Sitio de Dosis 4), y 0,1 % al sitio caudal derecho (Sitio de Dosis 5). Fueron colocados collares sobre los animales inmediatamente después de la dosificación durante 1 a 2 horas.
Los sitios fueron evaluados por eritema y el edema antes de la dosificación en el día 1 y diariamente después de esto, aproximadamente 24 horas después de cada dosis y antes de la siguiente dosis. Cada sitio fue asignado con una calificación irritación con base en la escala de Draize para la calificación de irritación de la piel (Draize JH, Woodard G, Calvery HO, Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J Pharmacol Exp Ther 1944; 82: 377-90).
Las observaciones para la mortalidad, morbididad y la disponibilidad del alimento y el agua fueron conducidas dos veces al día para todos los animales. Los exámenes clínicos detallados fueron conducidos antes de la repartición aleatoria, antes de la dosificación en el día 1, y diariamente después de esto. Los pesos corporales fueron medidos y registrados el día después de la llegada, antes de la repartición aleatoria, y antes de la dosificación en los días 1, 3 y7.
La eutanasia fue mediante anestesia intravenosa de sobredosis con solución de eutanasia basada en pentobarbitalsódico y sangrados mediante visión de los vasos femorales. Los animales fueron examinados cuidadosamente para las anormalidades externas incluyendo las masas. La piel fue reflejada desde una incisión de línea intermedia ventral y cualesquiera anormalidades fueron identificadas y correlacionadas con los hallazgos ante-mortem. Las cavidades abdominales, torácica y craneal fueron examinadas para anormalidades y los órganos removidos, examinados, y, donde se requiriera, colocados en formalina amortiguada neutra. Los sitios de dosificación, los riñones y cualesquiera lesiones gruesas de cada animal fueron recogidas y preservadas. Los exámenes microscópicos de secciones con parafina teñida con hematoxilina y eosina fijadas, fueron realizados para cada sitio de dosificación para todos los animales. Los portaobjetos fueron examinados por un patólogo veterinario. Se utilizó un sistema de graduación de cuatro pasos para definir las lesiones graduables para la comparación entre los grupos de dosis. Conclusiones
Los dos artículos de prueba no produjeron hallazgos clínicos notables, irritación dérmica, cambios en el peso corporal u observaciones macroscópicas y microscópicas a cualesquiera concentraciones de dosis. Uno de los controles positivos estuvo asociado con hallazgos clínicos y observaciones macroscópicas y microscópicas ligeras a moderadas.
Ejemplo 39 Estudio de Irritación de la Piel de Conejo de los Compuestos B y H
Fue conducido un estudio para evaluar el potencial de dos compuestos de la presente invención para producir irritación cuando se administraron vía la aplicación dérmica a conejos macho por siete días consecutivos. Fueron asignados un total de 24 machos al estudio.
Diseño de Estudio para el Compuesto B
Grupo 1
Grupo 1 Concentraciónb Grupo 2 Grupo 2 Concentraciónb
Sitio de Dosis
(n=6)a % (mg/ml) (n=6)a % (mg/ml)
1
Vehículo control 0,0 0,0 PMEG (control positivo) 1,0 % 1,0
2
Dosis baja 0,03 0,3 Dosis baja 0,03 0,3
3
Dosis media 0,1 1,0 Dosis media 0,1 1,0
4
Dosis alta 0,3 3,0 Dosis alta 0,3 3,0
aCada grupo constó de seis conejos intactos. bEl vehículo para el sitio de Dosis 1, Grupo 1, y Sitio de Dosis 1, Grupo 2 (PMEG) fue el gel vehículo. El vehículo para los sitios tratados del Grupo 1 fue el gel vehículo, y el vehículo para los sitios tratados del Grupo 2 fue el ungüento del vehículo.
Diseño de Estudio para el Compuesto H
Grupo 3
Grupo 3 Concentraciónb Grupo 4 Grupo 4 Concentraciónb
Sitio de Dosis
(n=6)a % (mg/ml) (n=6)a % (mg/ml)
1
Vehículo control 0,0 0,0 PMEG (control positivo) 1,0 % 10,0
2
Dosis baja 0,03 0,3 Dosis baja 0,03 0,3
3
Dosis media 0,1 1,0 Dosis media 0,1 1,0
4
Dosis alta 0,3 3,0 Dosis alta 0,3 3,0
aCada grupo consistió de seis conejos intactos. bEl vehículo para el sitio de Dosis 1, Grupo 3 fue el ungüento vehículo, y el vehículo para el Sitio de Dosis 1, Grupo 4 (cPrPMEDAP) fue el gel vehículo. El vehículo para los sitios tratados del Grupo 3 fue el gel vehículo, y el vehículo para los sitios tratados del Grupo 4 fue el ungüento vehículo.
Los artículos de prueba y control fueron administrados dérmicamente una vez al día por 7 días consecutivos durante el estudio. Los niveles de dosis para el Compuesto B fueron 0,03, 0,1 y 0,3 %. Los niveles de dosis para el Compuesto H fueron de 0,03, 0,1 y 0,3 %. El nivel de dosis para PMEG (control positivo) fue del 0,1 %. El nivel de dosis para cPrPMEDAP (control positivo) fue de 1,0 %. El nivel de dosis para el control del vehículo fue de 0,0 % (este fue dosificado como formulaciones de gel y de ungüento). El volumen de dosis para todos los sitios fue un volumen constante de 100 µl. Menos de 24 horas antes de la primera administración, se pinzó el pelo de la espalda del animal. Esta área pinzada comprendió no menos de 10% del área superficial corporal total. Se tuvo cuidado al evitar someter a abrasión la piel.
Los artículos de prueba, control positivo y control vehículo fueron administrados dentro de un sitio de dosificación de aproximadamente 2,54 x 2,54 cm (1 x 1 pulgada). Dos sitios de dosificación fueron colocados a lo largo de la superficie dorsal izquierda. El artículo o vehículo control positivo fue administrado al sitio rostral, y la dosis baja del artículo de prueba fue administrado al sitio caudal. Los dos sitios de dosificación fueron colocados a lo largo de la superficie dorsal derecha. La dosis media del artículo de prueba fue administrada al sitio rostral, y la dosis alta del artículo de prueba fue administrada al sitio caudal. Fueron colocados collares sobre los animales por aproximadamente dos horas inmediatamente después de la dosificación. La duración de la portación de los collares fue documentada en los datos brutos.
Las observaciones para mortalidad, morbididad y la disponibilidad de alimento y agua fueron conducidas dos veces al día para todos los animales. Los sitios de prueba fueron evaluados para el eritema y el edema antes de la primera administración, y aproximadamente a las 24 horas después de cada administración (antes de la siguiente dosificación programada) y diariamente durante el periodo de registro de 7 días. Las observaciones para los signos clínicos fueron conducidas diariamente durante el estudio al mismo tiempo que las observaciones dérmicas. Los pesos corporales fueron medidos y registrados el día después de la recepción, antes de la repartición aleatoria, antes de la administración del artículo de prueba en el día 1, y en los días 7 y 14, y a la necropsia (días 8 y 15). Los pesos corporales tomados a la recepción y antes de la repartición aleatoria no son reportados, pero son mantenidos en el archivo del estudio. Serán recolectadas muestras de sangre de 4 a 6 ml de 6 animales/grupo a la terminación, y 3 animales/grupo a la recuperación de la vena yugular u otra vena adecuada para la evaluación de los parámetros de patología clínica.
Fueron tomadas muestras sanguíneas adicionales (aproximadamente 1 ml) de todos los animales de la yugular y otra vena adecuada para la determinación de las concentraciones plasmáticas del artículo de prueba aproximadamente a las 2 horas después de la dosis en el día 7. Las muestras fueron colocadas en tubos que contenían EDTA potásico y almacenadas sobre un bloque de hielo hasta que fueron centrifugadas. Los animales no fueron sometidos a ayuno antes de la recolección de la sangre. Las muestras fueron almacenadas a -70 °C antes del examen.
Los exámenes de necropsia completos fueron realizados bajo los procedimientos aprobados por un patólogo veterinario en todos los animales. La eutanasia fue mediante una sobredosis de anestesia con solución de eutanasia basada en pentobarbital sódico vía la vena/arteria de la oreja u otra vena adecuada y los sangrados fueron mediante corte de los vasos femorales. Los animales fueron examinados cuidadosamente para las anormalidades externas incluyendo las masas. La piel fue reflejada a partir de la incisión de línea media ventral y cualesquiera anormalidades fueron identificadas y correlacionadas con los hallazgos antemortem. Las cavidades abdominales, torácica y craneal fueron examinadas para las anormalidades y los órganos retirados, examinados y, donde se requiriera, colocados en formalina amortiguada neutra. El examen microscópico de las secciones de parafina teñidas con hematoxilina y eosina, fijadas fueron realizadas sobre las secciones de tejidos provenientes de los sitios de dosificación (4 por animal), los riñones, y cualesquiera lesiones gruesas.
Al tiempo de la necropsia, el día 8 para los animales del estudio principal y el día 15 para los animales en recuperación, los cuatro sitios de dosificación por animal fueron identificados. Aproximadamente la mitad de cada sitio de dosificación era extirpado y luego recolectado y preservado como se mencionó anteriormente para el procesamiento histológico. Mientras que la otra mitad aproximada de cada sitio de dosificación estuvo todavía intacta sobre el animal, se realizaron los siguientes procedimientos. Los sitios de dosificación fueron frotados con tres gasas de etanol (95 %) y se dejaron secar completamente. Fue aplicada cinta (cinta de embalaje 3M® o equivalente) a cada sitio de dosificación diez veces. Una pieza limpia de la cinta fue utilizada para cada aplicación. Las porciones remanentes de los sitios de dosificación fueron luego extirpadas con tijeras. Las tijeras fueron lavadas entre cada sitio de dosis y cada animal con acetona y etanol. El orden de retiro de sitio de dosis fue el sitio vehículo o control positivo, sitio de baja dosis, sitio de dosis media, y sitio de dosis alta. Se extirpó 1 cm2 de tejido de cada sitio de dosis. La muestra de tejido fue pesada y registrada. Los punzones de piel fueron desmenuzados con tijeras limpias en frascos de cintilación individuales de tamaño apropiado. Se agregaron 5 ml de solución salina amortiguada con fosfato al frasco de cintilación. El tejido fue luego homogeneizado con pulsos de 20 segundos utilizando un homogeneizador mecánico. Los homogeneizados fueron rápidamente congelados aproximadamente a -20 °C.
Conclusiones
Con base en las calificaciones de irritación dérmica y los hallazgos microscópicos, uno de los artículos de prueba fue no irritante en el gel vehículo, pero fue un irritante leve a moderado en el ungüento vehículo. El segundo artículo de prueba fue un irritante muy ligero en el gel vehículo y un irritante leve cuando fue formulado en el ungüento vehículo.
Ejemplo 40 Preparación de la Composición Farmacéutica de Gel Tópico
Este ejemplo ilustra la preparación de una composición de gel tópico, representativo que contiene un compuesto activo de la Fórmula I.
Una composición de gel tópico es preparada teniendo la siguiente composición: *X=compuesto en el intervalo de 0,01 % a 1,0 %
Componentes
% p/p
Compuesto activo
X*
Amortiguador de pH 4,5 ó 7
25
Propilenglicol, USP
25
Hidroxietilcelulosa, NF
1,25
Propilparabeno, NF
0,01
Metilparabeno, NF
0,09
Edetato disódico, USP
0,025
Glicerina, USP
10,00
Ácido Cítrico, USP
0,50
Agua estéril para inyección, USP
38,125
Otros compuestos de la Fórmula I, tales como aquellos preparados de acuerdo con la presente especificación, pueden ser utilizados como el compuesto activo en la preparación de las formulaciones de gel de este ejemplo.
Los siguientes ingredientes han sido evaluados para la adecuación durante el desarrollo de esta formulación:
Miristato de isopropilo (disolvente/codisolvente/aumentador de la penetración),
Polietilenglicoles, triacetina (disolventes),
Alcohol cetílico y alcohol estearílico (agentes de rigidización),
Carbómero (aumentador de la viscosidad), y
Tweens, Spans (emulsionantes).
Ejemplo 41 Preparación de la Composición Farmacéutica de Ungüento Tópico
Este ejemplo ilustra la preparación de una composición de ungüento tópico representativo que contiene un compuesto activo de la Fórmula I.
Se prepara una composición de ungüento tópico que tiene la siguiente composición:
Componentes
% p/p
Compuesto Activo
X*
Glicerina, USP
94,0
Sesquioleato de sorbitan, NF
0,5
Propilenglicol, USP
4,5
*X=Compuesto en el intervalo de 0,01 % a 1,0 %
Otros compuestos de la Fórmula I, tales como aquellos preparados de acuerdo 10 con la presente especificación, pueden ser utilizados como el compuesto activo en la preparación de las formulaciones de gel de este ejemplo. Los siguientes ingredientes han sido evaluados para la adecuación durante el desarrollo de esta formulación: Miristato de isopropilo (disolvente/codisolvente/aumentador de la penetración),
15 Polietilenglicoles, triacetina (disolventes), Alcohol cetílico y alcohol estearílico (agentes de rigidización), Carbómero (potenciador de la viscosidad), y Tweens, Spans (emulsionantes).
20

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de la Fórmula IA,
    5
    10
    imagen1
    en la que Y1A e Y1B son -NH(Rx); 15 Rx es independientemente R2; R2 es
    (a) etilo sustituido con C(=O)OR4, en el que R4 es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, mbutilo i-butilo, s-butilo, t-butilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2butilo, 3-metil-1-butilo, 2-metil-1-butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3
    20 metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, vinilo, alilo, ciclopentenilo, 5-hexenilo, etinilo o propargilo;
    (b) propilo sustituido con C(=O)OR4, en el que R4 es un alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono o un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono; o
    25 (c) metilo sustituido con 2 R3, siendo un R3 -R5W3 y el otro R3 C(-O)OR4; R4 es un alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, un alquenilo de 2 a 18 átomos de carbono o un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono; R5 es metileno; W3 es fenilo;
    o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. .
    30 2. El compuesto según la reivindicación 1, siendo seleccionado de entre:
    imagen1
    (a)
    imagen1
    (b)
    (c)
    (d)
    (e)
    (f)
    (g)
    imagen1
    imagen1
    imagen1
    imagen1
    imagen1
  2. 3.
    El compuesto según la reivindicación 1 que tiene la fórmula
  3. 4.
    El compuesto según la reivindicación 1 que tiene la fórmula
    imagen1
    imagen1
  4. 5.
    Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  5. 6.
    La composición de la reivindicación 5, que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una sal
    5 farmacéuticamente aceptable del mismo, una cantidad eficaz de al menos otro agente antivírico y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  6. 7. El uso de un compuesto de Fórmula IA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores,
    10
    imagen2
    20 en la que Y1A e Y1B son -NH(Rx); Rx es independientemente R2; R2 es
    (a) etilo sustituido con C(=O)OR4;
    (b) propilo sustituido con C(=O)OR4; o 25 (c) metilo sustituido con 2 R3, en el que un R3 es -R5W3 y el otro R3 es C(-O)OR4;
    R4 es un alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, un alquenilo de 2 a 18 átomos de carbono
    o un alquinilo de 2 a 18 átomos de carbono;
    R5 es metileno; 30 W3 es fenilo.
  7. 8. El uso según la reivindicación 7 en la que el compuesto de fórmula IA está seleccionado de entre:
    imagen1
    (a)
    imagen1
    (b)
    (c)
    (d)
    (e)
    (f)
    (g)
    imagen1
    imagen1
    imagen1
    imagen1
    imagen1
  8. 9.
    El uso según la reivindicación 7 en la que el compuesto de fórmula I está seleccionado de:
  9. 10.
    El uso según la reivindicación 7 en la que el compuesto de fórmula I está seleccionado de:
    imagen1
    imagen1
  10. 11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el
    medicamento comprende una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula IA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una cantidad eficaz de al menos un agente antivírico y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  11. 12.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que dicho medicamento es una composición en gel o una composición de ungüento.
  12. 13.
    Un compuesto tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7 a 12 para su uso en un procedimientos para el tratamiento de tumores.
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