ES2351146T3 - Asociación de los polimorfismos en el gen frzb con la osteoporosis. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis, que comprende: la detección de la presencia de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis en un gen FRZB en una muestra de ácido nuclei- co del individuo, en el que la presencia de al menos dicho polimorfismo proporciona una indicación del riesgo del in- dividuo de padecer osteoporosis, y en el que al menos un polimorfismo se selecciona de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención está relacionada con métodos y reactivos para detectar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis. Más en concreto, está relacionada con los métodos y reactivos para detectar el aumento o descenso de riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis mediante la identificación de la presencia de al menos un polimorfismo en el gen FRZB.

ANTECEDENTES OF LA INVENCIÓN

Los experimentos de transplantes de Spemann y Mangold (1924, Arch. Mikroskopische Anat. Entwicklungsmechanik, 100:599638) establecieron la presencia de una región anatómica concreta, el organizador Spemann, o labio dorsal, que controla el patrón de desarrollo del eje corporal en los embriones de los vertebrados. Se encontró que los factores difundibles que salen de esta región están involucrados en diferentes procesos del desarrollo. La distribución de los pelos de la cutícula de Drosophila en una polaridad definida se encontró que estaba genéticamente controlada por "frizzled" (FZD1), un receptor transmembrana de 7 lazos con un gran dominio extracelular rico en cisteínas.

Los homólogos bovinos y humanos de FZD1 se clonaron mediante RT-PCR y mediante el cribaje de bibliotecas de cDNA de cartílago articular bovino y de placenta humana, que identificaron cDNA que codifican por FRZB, el análogo de mamífero de FZD1

(Hoang et al., 1996, J. Biol. Chem., 271:26131-26137). Las proteínas deducidas de 325 aminoácidos de FRZB bovino y humano comparten el 94% de identidad de aminoácidos. El análisis de las secuencias predijo que FRZB contiene un péptido señal de 25 aminoácidos, un sitio de N-glicosilación en N-terminal, un segmento transmembrana putativo de 24 aminoácidos, una región con múltiples sitios potenciales de fosforilación Ser/Thr, y un dominio C- terminal rico en serina. La región N-terminal de FRZB comparte el 50% de identidad de aminoácidos, incluyendo la conservación de los 10 residuos de Cys, con frizzled. El análisis por inmunoblot determinó que FRZB se expresa como una proteína de aproximadamente 36-kD. El análisis de hibridación in situ de los embriones humanos que representa las diferentes etapas de desarrollo, no detectaron expresión desde la semana 6 hasta la semana 13 excepto en el esqueleto apendicular en desarrollo, así como en varios huesos craneofaciales y extremos epifíseos de la caja torácica. El análisis inmunohistoquímico confirmó la expresión de FRZB en las estructuras esqueléticas en desarrollo.

El análisis Northern blot reveló que FRZB se expresa fuertemente en la placenta y el corazón, de forma moderada en el cerebro, músculo esquelético, riñón, y páncreas, y a niveles bajos en los pulmones e hígado (Leyns et al., 1997, Cell 88:747-756). El análisis SDS-PAGE detectó secreción de FRZB, posiblemente tras la escisión proteolítica, consistente con la falta de FRZB de los 7 dominios transmembrana encontrados en Drosophila y en la familia génica frizzled de vertebrados. EL análisis funcional en los embriones de Xenopus mostró que FRZB puede antagonizar los efectos iniciales y tardíos de la señalización de WNT8. Los genes WNT

de mamíferos incluye oncogenes que conducen a tumores en mamíferos. Para una mayor caracterización de FRZB, véase, por ejemplo, Dann et al., 2001, Nature 412:86-90; Rattner et al., 1997, Proc. Nat. Acad. Sci. 94:2859-2863; y Schumann et al., 2000, Cardiovasc. Res. 45:720-728.

Leyns et al. (supra) mapearon el gen FRZB humano en 2q31q33. Encontraron que la pérdida de una copia en el brazo 2q ocurre con una gran incidencia en los carcinomas de pulmón y colo- rectal, así como en neuroblastomas, y sugiere que FRZB puede funcionar como un gen supresor de tumores. Hoang et al. (supra) sugirió que FRZB puede jugar un papel en la morfogénesis del esqueleto. No obstante, no se ha identificado un papel directo para el gen FRZB en la enfermedad humana y el desarrollo.

J. Loughlin et al (Rheumatology (2002); 41: 955-956) describe un estudio que localiza el locus de susceptibilidad genética de la osteoartritis de cadera en el cromosoma 2q24.3-q31.1. CJ Ciesielski et al (Arthritis and Rheumatism vol. 46, nº 9, (2002), página S274) describe 4 SNP en el gen FRZB que se encontró en pacientes con osteoartritis.

Entre otros aspectos, la presente invención proporciona alelos de FRZB, identificados por la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores, que están asociados con una aumento o descenso del riesgo de osteoporosis. Se obtendrá un completo entendimiento de la invención tras revisar lo que viene a continuación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona métodos, reactivos y equipos para

detectar un aumento o descenso del riesgo de un individuo para

enfermedades osteoporóticas y enfermedades relacionadas. En ciertas realizaciones, se utilizan los métodos para determinar el riesgo de un individuo para la osteoporosis y enfermedades relacionadas. En otras realizaciones, los métodos para determinar el riego se combina con métodos clínicos conocidos para diagnosticar la osteoporosis.

Una clase general de realizaciones proporciona métodos para determinar el riesgo de un individuo por la osteoporosis. En los métodos, se detecta la presencia de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis en el gen de la proteína relacionada con frizzled (FRZB) en una muestra de ácidos nucleicos del individuo. La presencia de al menos un polimorfismo proporciona una indicación del riesgo del individuo para la osteoporosis. El riesgo de un individuo para la osteoporosis puede ser, por ejemplo, un aumento del riesgo o una disminución del riesgo si se compara con un individuo sin al menos un polimorfismo (por ejemplo, un individuo con un alelo diferente en el sitio del polimorfismo). De acuerdo con esto, al menos un polimorfismo puede comprender un polimorfismo de predisposición o de protección en el gen FRZB.

El polimorfismo puede comprender en esencia cualquier polimorfismo(s) adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, DNA polimórfico amplificado aleatorio, polimorfismos de longitud de fragmentos arbitrarios, repeticiones de secuencias sencillas, polimorfismos de conformación de cadenas sencillas, y secuencias variables amplificadas. En una clase preferible de realizaciones, el polimorfismo comprende al menos un polimorfismo de nucleótido único

(SNP). Por ejemplo, el polimorfismo puede ser un alelo de T2303723C, C18679T, G19524A, T19575G, T22242A, G23043A, G23415A, T23549C, A24791G, C26794G, o G27014A. En una clase de realizaciones, el al menos un polimorfismo se selecciona del grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A, y alelo A de G27014A.

En una clase de realizaciones, la presencia de dos o más polimorfismos se detecta (por ejemplo, dos o más polimorfismos en un sitio único de polimorfismo y/o en sitios diferentes de polimorfismo, por ejemplo, un haplotipo). Al menos uno de dos o más polimorfismos (por ejemplo, todos los polimorfismos) se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en: el alelo C de C18679T, el alelo T de C18679T, el alelo G de G19524A, el alelo A de G19524A, el alelo A de A24791G, el alelo G de A24791G,el alelo C de C26794G, el alelo G de C26794G, el alelo G de G27014A, y el alelo A de G27014A.

La muestra de ácido nucleico normalmente comprende DNA o RNA. La presencia de al menos un polimorfismo en la muestra de ácido nucleico puede detectarse mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, el polimorfismo puede detectarse secuenciando, por ejemplo, secuenciando la región del gen FRZB que incluye los sitio(s) polimórficos. La región de FRZB se amplifica opcionalmente antes del paso de secuenciación. Como otro ejemplo, el polimorfismo se detecta mediante amplificación, por ejemplo, de la región del gen FRZB que incluye los sitio(s) polimórficos. La amplificación puede ser, por ejemplo, una amplifica

ción específica de alelo. La amplificación puede comprender una reacción en cadena de la polimerasa (por ejemplo, una PCR cinética), una reacción en cadena de la ligasa o similares. En otro ejemplo, el polimorfismo puede detectarse mediante hibridación de una sonda de ácido nucleico. Así, en una clase de realizaciones, para detectar el polimorfismo, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con al menos un oligonucleótido específico de secuencia bajo condiciones (por ejemplo, condiciones astringentes) que permiten la unión de al menos un oligonucleótido a la muestra de ácido nucleico. Los oligonucleótidos específicos de secuencia hibridan bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis. La hibridación de al menos un oligonucleótido con la muestra de ácidos nucleicos se detecta entonces. En una clase de realizaciones relacionadas, la región FRZB que comprende el(los) polimorfismo(s) se amplifica antes de la hibridación con la sonda. Así, en esta clase de realizaciones, la muestra de ácido nucleico se amplifica para proporcionar una muestra de ácido nucleico amplificada. La muestra de ácido nucleico amplificada se pone en contacto con al menos un oligonucleótido específico de secuencia bajo condiciones que permiten la unión del oligonucleótido a la muestra de ácido nucleico amplificada (por ejemplo, condiciones astringentes). El al menos un oligonucleótido específico de secuencia hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis. Se detecta la hibridación de al menos un oligonucleótido específico de secuencia con la muestra de ácido nucleico amplificada. La presencia de al menos un polimor

fismo relacionado con la osteoporosis puede, por ejemplo, detectarse de forma cualitativa o cuantitativa.

En ciertas realizaciones, la presencia de polimorfismo heredado de uno de los padres del individuo proporciona una indicación del riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis (por ejemplo, cuando el alelo FRZB asociado ejerce un efecto dominante, por lo que la herencia del polimorfismo de uno de los padres es suficientemente predictiva). En otras realizaciones, la presencia del polimorfismo heredado de los dos padres del individuo proporciona una indicación del riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis.

Tal como se ha dicho, los métodos se combinan opcionalmente con métodos clínicos conocidos, por ejemplo, para diagnosticar osteoporosis. Así, los métodos opcionalmente incluyen la realización de al menos una prueba clínica para detectar la osteoporosis (por ejemplo, un ensayo de recambio óseo o un escáner óseo).

Otra clase general de realizaciones proporciona métodos para determinar el riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis. En los métodos, se determina el genotipo del individuo en uno o más sitios polimórficos en un gen FRZB. Un primer genotipo en los sitios polimórficos se asocia estadísticamente con un aumento del riesgo por osteoporosis si se compara con un segundo genotipo en uno o más sitios polimórficos. Así, por ejemplo, si el genotipo del individuo corresponde con el primer genotipo, el riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis es mayor que la de otros individuos que poseen el segundo genotipo.

Cada sitio polimórfico puede comprender uno o más nucleóti

dos. En una clase preferible de realizaciones, al menos uno de

los sitios polimórficos consiste en una posición de nucleótido única (es decir, el individuo se genotipa para uno o más SNP, por ejemplo, un grupo y/o un haplotipo de SNP). En ciertas realizaciones, un grupo de sitios polimórficos consiste cada uno de un posición de nucleótido única (por ejemplo, posición 2628, 18679, 19524, 19575, 22242, 23043, 23415, 23549, 24791, 26794, o 27014 de Id. de Sec. Nº:1). Por ejemplo, al menos uno de los sitios polimórficos puede seleccionarse del grupo que consiste en: posición de nucleótido 2628, posición de nucleótido 18679, posición de nucleótido 19524, posición de nucleótido 22242, posición de nucleótido 24791, posición de nucleótido 26794, y posición de nucleótido 27014 de Id. de Sec. Nº:1.

En algunas realizaciones, la presencia de un alelo único de un polimorfismo particular es suficiente para indicar si el riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis está aumentado o disminuido. En otras realizaciones, dos copias de un alelo de un polimorfismo particular debe estar presente para indicar un aumento o descenso del riesgo de osteoporosis (por ejemplo, cuando el efecto es recesivo de forma que ambos cromosomas homólogos deben llevar el alelo). Así, en una clase de realizaciones, el primer genotipo está estadísticamente asociado con un aumento del riesgo de sufrir osteoporosis si se compara con el segundo genotipo. El primer genotipo comprende dos alelos C y el segundo genotipo dos alelos T o un alelo T y un alelo C de SNP C18679T; el primer genotipo comprende dos alelos G y el segundo genotipo dos alelos A

o un alelo A y un alelo G de SNP G19524A; el primer genotipo comprende dos alelos A y el segundo genotipo dos alelos G o un alelo G y un alelo A de SNP A24791G; el primer genotipo comprende dos

alelos C y el segundo genotipo dos alelos G o un alelo C y un alelo G de SNP C26794G; y/o el primer genotipo comprende dos ale- los G y el segundo genotipo dos alelos A o un alelo G y un alelo A de SNP G27014A.

Determinar el genotipo del individuo normalmente implica obtener una muestra de ácido nucleico del individuo. Determinar el genotipo del individuo puede implicar la amplificación de al menos una porción del gen FRZB de la muestra de ácido nucleico, la porción comprende al menos uno de uno o más sitios polimórficos. Dicha amplificación puede ser, por ejemplo, para determinar directamente el genotipo o para facilitar la detección de uno o más polimorfismos mediante un paso adicional. En una clase de realizaciones, el genotipo del individuo se determina mediante la realización de una amplificación específica de alelo o una reacción de extensión específica de alelo. En otras clase de realizaciones, el genotipo del individuo se determina mediante la secuenciación de al menos una porción del gen FRZB de la muestra de ácido nucleico, la porción comprende al menos uno de uno o más sitios polimórficos. en otra clase de realizaciones, el genotipo del individuo se determina mediante la hibridación de una sonda de ácido nucleico, opcionalmente tras la amplificación de al menos una porción del gen FRZB. En una clase de ejemplo de realizaciones, al menos uno de uno o más sitios polimórficos consiste en una posición de nucleótido única. En estas realizaciones, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con al menos un oligonucleótido específico de secuencia bajo condiciones astringentes. El oligonucleótido hibrida bajo las condiciones astringentes a la muestra de ácido nucleico cuando un primer nucleótido

ocupa la posición de nucleótido que define el sitio polimórfico pero no cuando un segundo nucleótido ocupa la posición de nucleótido. Se detecta la hibridación del oligonucleótido a la muestra de ácido nucleico.

Un aspecto de la invención proporciona equipos para detectar la presencia de un primer polimorfismo de predisposición o protector en un gen FRZB, por ejemplo, en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de sufrir osteoporosis y/o obesidad está siendo evaluado. Así, una clase general de realizaciones proporcionan un equipo que incluye uno o más primer oligonucleótido capaz de detectar el primer polimorfismo e instrucciones para detectar el primer polimorfismo con uno o más primer oligonucleótido y para correlacionar dicha detección con el riesgo de un individuo para sufrir osteoporosis y/o obesidad, empaquetado en uno o más recipientes.

Esencialmente todas las características indicadas para las realizaciones del método anterior, se aplican a está realización también. Por ejemplo, en una clase preferible de realizaciones, el primer polimorfismo es un polimorfismo de nucleótido único, por ejemplo, un SNP seleccionado del grupo que consiste en: el alelo T de T2303723C, el alelo C de T2303723C, el alelo C de C18679T, el alelo T de C18679T, el alelo G de G19524A, el alelo A de G19524A, el alelo T de T22242A, el alelo A de T22242A, el ale- lo A de A24791G, el alelo G de A24791G, el alelo C de C26794G, el alelo G de C26794G, el alelo G de G27014A, y el alelo A de G27014A. Otro SNP potencial incluye, pero no se limita a, cualquier alelo de T19575G, G23043A, G23415A, y T23549C.

En un aspecto, el equipo puede utilizarse para detectar la

presencia del primer polimorfismo mediante la hibridación de una sonda de ácido nucleico con el polimorfismo. Así, en una clase de realizaciones, el primer oligonucleótido comprende al menos una sonda. En ciertas realizaciones, el primer oligonucleótido hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo. En una clase de realizaciones, el primer polimorfismo es un primer polimorfismo de nucleótido único que comprende un primer nucleótido en una posición de primer nucleótido. En esta clase de realizaciones, bajo condiciones astringentes, el primer oligonucleótido hibrida con una región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo de nucleótido único con una relación señal-ruido que es al menos de 2x (por ejemplo, al menos 5x o al menos 10x) la relación señal-ruido en la que el primer oligonucleótido hibrida con la región del gen FRZB comprende un segundo nucleótido en la posición del primer nucleótido. El primer oligonucleótido es normalmente completamente complementario con la región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo, y normalmente comprende al menos alrededor de 10 nucleótidos complementarios contiguos al gen FRZB.

Para facilitar la detección del polimorfismo (por ejemplo, a través de la detección de la hibridación entre el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales y un ácido nucleico que comprende el polimorfismo), por ejemplo, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales opcionalmente comprende un marcaje, por ejemplo, un marcaje isotópico, fluorescente, fluorogénico, luminiscente o colorimétrico. En algunas realizaciones, el marcaje en sí produce directamente una señal detectable (por ejemplo, un marcaje fluorescente). En otras realizaciones, el equipo tam

bién incluye un reactivo que detecta el marcaje (por ejemplo, una enzima que escinde un marcaje colorimétrico, una porción de unión, o similares).

En un aspecto, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende uno o más cebadores. El(los) cebador(es) pueden utilizarse para detectar el polimorfismo, por ejemplo, en una amplificación específica de alelo o reacción de extensión. Por ejemplo, en una clase de realizaciones, el primer polimorfismo es un primer polimorfismo de nucleótido único que comprende un primer nucleótido en una posición de primer nucleótido, y el nucleótido 3’ del conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales es complementario al primer nucleótido.

El(los) cebador(s) pueden utilizarse para amplificar una región de FRZB que comprende el polimorfismo, por ejemplo, para la posterior detección del polimorfismo mediante hibridación, secuenciación o similares. En una clase de realizaciones, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende cebadores de amplificación, en la que los cebadores de amplificación amplifican una secuencia de ácido nucleico que comprende el primer polimorfismo. En una clase relacionada de realizaciones, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende secuenciar cebadores que flanquean el primer polimorfismo.

El conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales está opcionalmente inmovilizado en un sustrato. El sustrato puede ser, por ejemplo, un sustrato plano o un sustrato con cuentas. El(los) oligonucleótido(s) puede(n) organizarse en un chip de oligonucleótidos utilizado para detectar otros polimorfismos, por ejem

plo, otros polimorfismos en FRZB.

El equipo puede utilizarse opcionalmente para detectar más de un polimorfismo (de forma simultanea o secuencial). Así, en una clase de realizaciones, el equipo también incluye un conjunto de uno o más segundos oligonucleótidos capaces de detectar un segundo polimorfismo (y opcionalmente tercer, cuarto, quinto, etc. oligonucleótidos capaces de detectar un tercer, cuarto, quinto, etc. polimorfismo). El segundo polimorfismo puede estar en el mismo sitio polimórfico que el primer sitio o en un sitio polimórfico diferente (en FRZB o un gen diferente), y puede ser protector o de predisposición.

Una clase general de realizaciones proporciona chips para detectar la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición y/o protectores en un gen FRZB, por ejemplo, en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de sufrir osteoporosis está siendo evaluado. En una clase de realizaciones, el chip comprende un sustrato y una serie de oligonucleótidos, cada uno de los cuales hibrida con una región del gen FRZB que comprende al menos uno de los polimorfismos. La hibridación detecta la presencia del polimorfismo, y esta detección proporciona una indicación del riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis. La pluralidad de oligonucleótidos está inmovilizada en el sustrato. Normalmente, el chip se utiliza para detectar la presencia de un grupo de polimorfismos, por ejemplo, alelos múltiples en un sitio polimórfico único y/o sitios polimórficos diferentes.

Esencialmente todas las características descritas para el método y realizaciones del equipo anteriores aplican también a esta realización. Por ejemplo, el conjunto de uno o más polimorfismos preferiblemente comprende uno o más polimorfismos de nu

cleótido único. Por ejemplo, al menos uno del conjunto de uno o más polimorfismos puede seleccionarse del grupo que consiste en: el alelo T de T2303723C, el alelo C de T2303723C, el alelo C de C18679T, el alelo T de C18679T, el alelo G de G19524A, el alelo A de G19524A, el alelo T de T22242A, el alelo A de T22242A, el ale- lo A de A24791G, el alelo G de A24791G, el alelo C de C26794G, el alelo G de C26794G, el alelo G de G27014A, y el alelo A de G27014A. Otros SNP potenciales incluyen, pero no se limitan a, cualquier alelo de T19575G, G23043A, G23415A, y T23549C.

En una clase de realizaciones en que el chip puede utilizarse para detectar la presencia de uno o más SNP, cada uno de los oligonucleótidos en el chip hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende uno de los polimorfismos de nucleótido únicos con una proporción de señal-ruido de al menos 2x (por ejemplo, al menos 5x o al menos 10x) en la que el oligonucleótido hibrida con una región del gen FRZB que comprende cualquiera de los restantes polimorfismos de nucleótido únicos. Normalmente, se utiliza un oligonucleótido para detectar un SNP; es decir, cada uno de los oligonucleótidos normalmente hibrida con un polimorfismo de nucleótido único distinto.

Como se ha dicho antes, el grupo de oligonucleótidos se in- moviliza en un sustrato, por ejemplo, un sustrato plano, una membrana, un portaobjetos o similares. Normalmente, cada grupo de oligonucleótidos se inmoviliza en una posición conocida, predeterminada del sustrato.

Para facilitar la detección de polimorfismos mediante hibridación específica con el oligonucleótido, cada grupo de oligonucleótidos es normalmente completamente complementario con una

región del gen FRZB que comprende uno de los polimorfismos, y cada grupo de oligonucleótidos normalmente comprende al menos de alrededor de 10 nucleótidos contiguos complementarios con el gen FRZB. Cada grupo de oligonucleótidos opcionalmente comprende un marcaje, por ejemplo, un marcaje que facilita la detección de la hibridación entre el oligonucleótido y el correspondiente polimorfismo.

El chip forma parte opcionalmente de un sistema. Así, una clase de realizaciones proporciona un sistema que comprende un chip de la invención y un sistema de instrucciones que correlaciona la detección de la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores con el riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 describe ejemplos de SNP de FRZB. Se muestran nueve pares de bases centradas en cada SNP; la cadena superior corresponde con la cadena cuya secuencia se muestra en Id. de Sec. Nº:1. los alelos SNP ilustrados son: alelo C de C18679T (Panel A), alelo T de C18679T (Panel B), alelo G de G19524A (Panel C), alelo A de G 19524A (Panel D), alelo T de T19575G (Panel E), alelo G de T19575G (Panel F), alelo T de T22242A (Panel G), alelo A de T22242A (Panel H), alelo G de G23043A (Panel I), alelo A de G23043A (Panel J), alelo G de G23415A (Panel K), alelo A de G23415A (Panel L), alelo de T23549C (Panel M), alelo C de T23549C (Panel N), alelo A de A24791G (Panel O), alelo G de A24791G (Panel P), alelo C de C26794G (Panel Q), alelo G de C26794G (Panel R), alelo G de G27014A (Panel S), alelo A de G27014A (Panel T), alelo T de T2303723C (Panel U), y alelo C de T2303723C (Panel V).

DEFINICIONES

Antes de describir la invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a dispositivos o sistemas biológicos particulares, que pueden variar, por descontado. Debe también entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene como propósito describir tan solo realizaciones particulares, y no pretende ponerles límite.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento poseen el mismo significado que el que se entiende normalmente por un experto en la materia a la que pertenece la invención. Las siguientes definiciones complementan las de la materia y están dirigidas a la presente solicitud y no deben imputarse a cualquier otro caso relacionado o no relacionado, por ejemplo, a cualquier patente

o solicitud propia. Aunque puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento, para la práctica de análisis de la invención, los materiales y métodos preferibles se describen en este documento. En la descripción y reivindicaciones de la invención, se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones descritas anteriormente.

Tal como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones anexadas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluye los plurales a no ser que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, en referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células; en referencia a "bacteria" incluye mezclas de bacterias, y similares.

Tal como se utiliza en el documento, los términos "ácido

nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a polímeros de nucleótido de cadena sencilla o de doble cadena que comprende más de dos subunidades de nucleótido unidas covalentemente. Los nucleótidos pueden comprender desoxiribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), ribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y/o cualquier otro N-glicósido de una base de purina o pirimidina, o base de purina o pirimidina modificada, o cualquier combinación de las mismas. Los grupos de azúcar de las subunidades de nucleótido pueden también comprender derivados modificados de ribosa o desoxiribosa, como O-metilribosa. Las subunidades de nucleótido de un oligonucleótido pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster, enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato o mediante otros enlaces, que incluye, pero no se limita a, enlaces raros o que no suceden normalmente, que no previenen la hibridación del oligonucleótido. Además, un oligonucleótido puede tener nucleótidos infrecuentes o porciones que no son nucleótidos. Con la adición de dichos análogos como ácidos nucleicos bloqueados (LNA), el tamaño de los cebadores y sondas pueden reducirse en tan solo 8 ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos bloqueados son una nueva clase de análogos bicíclicos de DNA en que las posiciones 2’ y 4’ en el anillo furanosa están unidos mediante una porción O-metileno (oxi-LNA), S-metileno (tio-LNA), o amino metileno (amino-LNA).

Las sondas de oligonucleótido y los oligonucleótidos de amplificación de una secuencia definida pueden producirse mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia, como la síntesis química o bioquímica, y mediante expresión in vitro o in vivo de moléculas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, vecto

res bacterianos o retrovirales. Tal como se utiliza aquí, un oligonucleótido no consiste del DNA cromosómico de tipo salvaje o los productos de transcripción in vivo de los mismos.

Los oligonucleótidos que son secuencias de cebador y/o de sondas, tal como se describe más adelante, pueden comprender análogos de DNA, RNA o ácido nucleico como análogos de ácido nucleico sin carga que incluye, pero no se limita a, péptido de ácidos nucleicos (PNA), que se describen en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/20702, o análogos de morfolino, que se describen en Pat. Estadounidenses Nº 5.185.444, 5.034.506, y 5.142.047. Dichas secuencias pueden sintetizarse de forma rutinaria utilizando una serie de técnicas disponibles en la actualidad. Por ejemplo, una secuencia de DNA puede sintetizarse utilizando química convencional de fosforamidita de nucleótido y los instrumentos disponibles de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.); DuPont (Wilmington, Del.); o Milligen (Bedford, Mass.). De forma similar, y cuando se desee, las secuencias pueden marcarse utilizando las metodologías conocidas en la técnica como las descritas en las Pat. Estadounidenses Nº 5.464.746, 5.424.414 y

4.948.882. Los oligonucleótidos (incluyendo, por ejemplo, oligos marcados o modificados) pueden también solicitarse a una serie de fuentes comerciales conocidas por los expertos en la materia. En esencia cualquier ácido nucleico puede solicitarse a gusto de cada uno de cualquier fuente comercial, por ejemplo, The Midland Certified Regent Company (www.mcrc.com), La Great American Gene Company (www.genco. com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), y QIAGEN (http://oligos.qiagen.com), entre otras.

Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido o oligonu

cleótido puede comprender las cinco bases naturales (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases diferentes de las cinco bases naturales. Estas bases pueden servir para varios propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizas la hibridación; para promover o inhibir la degradación de sondas; o como puntos de anclaje para las porciones detectables o porciones bloqueadoras. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener una o más porciones modificadas, no usuales, o de bases derivadas, que incluye, pero no se limita a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilamino-metiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, uracil-5oxiacetato de metilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidine. Otros ejemplos de porciones de bases modificadas, no usuales, o porciones de base derivadas pueden encontrarse en las Patentes Estadounidenses Nº 6.001.611, 5.955.589, 5.844.106, 5.789.562, 5.750.343,

5.728.525 y 5.679.785.

Además, un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido o oligonucleótido puede comprender una o más porciones modificadas de azúcar que incluyen, pero no se limitan a, arabinosa, 2fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa. Un ácido nucleico, nucleótido, polinucleótido o oligonucleótido puede comprender enlaces fosfodiéster o enlaces modificados que incluye, pero no se limita a fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato con puentes, metilenfosfonato con puentes, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato con puentes o enlaces sulfona, y combinaciones de dichos enlaces.

Una molécula de ácido nucleico "aislado", tal como se utiliza aquí, es una que está separada de las secuencias de nucleótido que normalmente flanquean la molécula de ácido nucleico y/o se ha purificado completa o parcialmente a partir de otro material biológico (por ejemplo, una proteína) normalmente asociada con el ácido nucleico.

La molécula de ácido nucleico puede fusionarse con otras secuencias codificantes o reguladoras y aún debe considerarse aislada. Así, el DNA recombinante contenido en un vector se incluye en la definición de "aislado" tal como se utiliza aquí. También, las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de DNA recombinante en células huésped heterólogas, así como moléculas de DNA parcialmente o sustancialmente purificadas en solución. Las moléculas de ácido nucleico "aisladas" también abarcan transcritos de RNA in vivo e in vitro de las moléculas de DNA de la invención. Una molécula de ácido nucleico aislada o secuencia de nucleótido puede incluir una molécula de ácido nuclei

co o secuencia de nucleótido que se sintetiza químicamente o mediante métodos recombinantes. También, los polinucleótidos aislados incluyen moléculas de DNA recombinante en organismos heterólogos, así como parcialmente o sustancialmente moléculas de DNA purificadas en solución. Los transcritos de RNA in vivo e in vitro de las moléculas de DNA de la invención también están abarca- das por las secuencias de nucleótido "aisladas". Dichos polinucleótidos son útiles, por ejemplo, como cebadores y/o sondas para detectar polimorfismos, en la fabricación del polipéptido codificado, como sondas para aislar secuencias homólogas (por ejemplo, de otras especies de mamíferos), para el mapeado génico (por ejemplo, mediante hibridación in situ con cromosomas), o para detectar la expresión de genes en tejidos (por ejemplo, tejido humano), como el análisis Northern blot.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden ser RNA, mRNA, DNA, o cDNA, por ejemplo, y pueden ser de cadena doble o sencilla. Pueden codificar una cadena sentido, las regiones no codificantes, y/o la cadena antisentido. La molécula de ácido nucleico puede incluir toda o una porción de la secuencia codificante del gen y puede comprender además regiones no codificantes adicionales como intrones y secuencias 3’ y 5’ no codificantes (incluyendo, por ejemplo secuencias reguladoras). De forma adicional, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse a una secuencia marcadora, por ejemplo, una secuencia que puede utilizarse para purificar la molécula de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención puede comprender uno o más residuos de nucleótido modificados. La modificación puede ser en la base, azúcar y/o porción fosfato e inclu

ye, por ejemplo, halogenación, hidroxilación, alquilación, un enlazante unido y/o un marcaje. Las modificaciones pueden comprender además, por ejemplo, marcajes, metilación, modificaciones internucleótido como enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos), porciones colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácido nucleicos alfa anoméricos). También se incluyen las moléculas sintéticas que imitan moléculas de ácido nucleico en su capacidad de unión a una secuencia diseñada mediante puentes de hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, aquellas en que los enlaces peptídicos sustituyen los enlaces fosfato en el esqueleto de la molécula.

En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen, pero no se limitan a, mRNA de FRZB, cDNA y/o moléculas de DNA genómico. Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen oligonucleótidos, por ejemplo, un oligonucleótido comprende uno o más de los SNP de FRZB descritos aquí.

Tal como se utiliza aquí, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que posee una especificidad de hibridación suficiente para la iniciación de una polimerización enzimática bajo condiciones predeterminadas, por ejemplo en una técnica amplificación como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en un proceso de secuenciación, en un método de transcripción inversa

y/o similares.

Tal como se utiliza aquí, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido con una especificidad de hibridación suficiente para unirse a una secuencia diana definida bajo condiciones predeterminadas, por ejemplo en una técnica de amplificación como una reacción de 5’-nucleasa, en un método de detección dependiente de la hibridación, como un Southern o Northern blot, y/o similares. Los cebadores y sondas pueden utilizarse en una serie de formas y pueden definirse mediante el uso específico. Por ejemplo, una "sonda de captura" se inmoviliza o puede inmovilizarse en un soporte sólido mediante un método apropiado, que incluye, pero no se limita a: enlaces covalentes, adsorción, interacción hidrofóbica y/o electroestática, o mediante síntesis directa en un soporte sólido (véase en particular la solicitud de patente WO 9210092). Una "sonda de detección" puede marcarse por medio de un marcador escogido, por ejemplo, de entre isótopos radioactivos, enzimas, en particular enzimas capaces de actuar en un sustrato cromogénico, fluorescente o luminiscente (en particular una peroxidasa o una fosfatasa alcalina), compuestos cromofóricos químicos, cromogénicos, fluorogénicos o compuestos luminiscentes, análogos de bases de nucleótido, y ligandos como biotina. Los compuestos fluorescentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, Cy3, tetrametilrodamina, Cy3.5, carboxi-xrodamina, rojo Texas, Cy5, y Cy5.5. Los compuestos luminiscentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, luciferina y 2,3dihidroftalazinedionas, como luminol.

Todos los oligonucleótidos, cebadores y sondas de la inven

ción, tanto si las sondas de ensayo de hibridación, cebadores de

amplificación, u otros oligonucleótidos, pueden modificarse con grupos químicos para aumentar su rendimiento o para facilitar la caracterización de los productos de amplificación. Por ejemplo, oligonucleótidos modificados en su estructura como los que tienen grupos fosforotioato o metilfosfonato que proporcionan a los oligonucleótidos resistencia a la actividad nucleolítica de ciertas polimerasas o las enzimas nucleasas pueden permitir el uso de dichas enzimas en una amplificación u otra reacción. Otro ejemplo de modificación implica el uso de enlazantes no nucleótidos (por ejemplo, Arnold, et al., "Reactivos de unión no nucleotídicos para sondas de nucleótido", PE 0 313 219) incorporada entre nucleótidos en la cadena de ácido nucleico que no interfiere con la hibridación o la elongación del cebador. Los oligonucleótidos de amplificación pueden también contener mezclas de los nucleótidos deseados modificados y naturales.

El extremo 3’ de un cebador de amplificación o una sonda puede opcionalmente bloquearse para prevenir la iniciación de la síntesis de DNA como se describe por McDonough, et al., titulado "Amplificación de secuencias de ácidos nucleicos", WO94/03472 que goza de propiedad común con la invención. Una mezcla de diferentes oligonucleótidos de amplificación bloqueados en 3’, o de oligonucleótidos bloqueados y no bloqueados en 3’, puede aumentar la eficiencia de la amplificación de ácido nucleico, como se ha descrito allí. El extremo 5’ de los oligonucleótidos puede modificarse para ser resistente a la actividad exonucleasa 5’ presente en algunas polimerasas de ácido nucleico. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo añadiendo un grupo no nucleótido al nucleótido terminal 5’ del cebador utilizando técnicas como las

descrita en Arnold, et al., supra, titulado "Reactivos de unión no nucleotídicos para sondas de nucleótido".

Una vez sintetizado, las sondas de oligonucleótido seleccionadas pueden marcarse mediante cualquiera de los métodos conocidos (por ejemplo, J. Sambrook, infra). Los marcajes útiles incluyen radioisótopos así como grupos marcadores no radioactivos. Los marcajes isotópicos incluye 3H, 35S, 32P, 125I, 57Co y 14C. Los marcajes isotópicos pueden introducirse en el oligonucleótido mediante técnicas conocidas en la materia como la traslación de la mella (“nick translation”, marcaje de extremos, síntesis de segunda cadena, uso de transcripción inversa, y mediante métodos químicos. Cuando se utilizan sondas de hibridación radiomarcadas pueden detectarse, por ejemplo, mediante autoradiografía, contaje de centelleo, o contaje gamma. El método de detección seleccionado dependerá del radioisótopo concreto utilizado para el marcaje.

Los materiales no isotópicos pueden también utilizarse para el marcaje y pueden introducirse internamente en la secuencia de ácido nucleico o al final de la secuencia del ácido nucleico. Los nucleótidos modificados pueden incorporarse enzimáticamente o químicamente. Las modificaciones químicas de la sonda pueden realizarse durante o después de la síntesis de la sonda, por ejemplo, a través del uso de grupos enlazantes no nucleotídicos como se describe en Arnold, et al., supra " Reactivos de unión no nucleotídicos para sondas de nucleótido,". Los marcajes no isotópicos incluyen moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes, enzimas, cofactores, sustratos de enzima, haptenos u otros ligandos.

En una realización, las sondas están marcadas con un éster

de acridinio. El marcaje del éster de acridinio puede realizarse como se describe en Arnold et al., Pat. Estadounidense Nº 5.185.439, titulado "Marcaje de éster de acridinio y purificación de sondas de Nucleótido" depositado 9 Febrero de 1993.

El término "oligonucleótido específico de secuencia" se refiere a un oligonucleótido que hibrida (bajo condiciones definidas) con un ácido nucleico diana con una proporción de señal- ruido al menos de 2x superior a la de una proporción de señal- ruido en la que hibrida con un ácido nucleico que no es la diana. Por ejemplo, un oligonucleótido específico de secuencia puede hibridar, bajo condiciones astringentes, con una región de FRZB que comprende un primer alelo de un SNP (el ácido nucleico diana) con una proporción de señal-ruido de al menos 2x (por ejemplo, al menos 5x o 10x) superior a la proporción de señal-ruido en la que el oligonucleótido hibrida con la región de FRZB que comprende un segundo alelo de SNP.

El término "gen FRZB" o "locus FRZB" se refiere a la secuencia de ácido nucleico genómico que codifica la proteína FRZB. La secuencia de nucleótido de un gen, tal como se utiliza aquí, abarca regiones codificantes, referidas como exones, regiones intermedias, regiones no codificantes, referidas como intrones y regiones corriente arriba y/o corriente abajo. Las regiones corriente arriba o corriente abajo pueden incluir regiones del gen que se transcribe pero no parte de un intrón o exón, o regiones del gen que comprende, por ejemplo, sitios de unión para factores que modulan la transcripción génica. La secuencia para la secuencia genómica humana FRZB se proporciona en los números de acceso del GenBank NT_005100.3, NT_005265, y NT_005403, y una porción de

la secuencia se proporciona aquí como Id. de Sec. Nº:1. La secuencia para el mRNA de FRZB humano se proporciona en el número de acceso del GenBank N_001463, y se proporciona aquí como Id. de Sec. Nº:2.

El término "alelo", tal como se utiliza aquí, se refiere a una variante de secuencia de un gen y/o un polimorfismo. Los ale- los se identifican normalmente con respecto a una o más posiciones polimórficas, con el resto de la secuencia génica no especificada. Por ejemplo, un alelo FRZB puede definirse por el nucleótido presente en un SNP único, o mediante los nucleótidos presentes en un grupo de SNP. Ejemplos de dichos SNP de FRZB se proporcionan en la Tabla 1, a continuación.

Por comodidad, el alelo presente en la mayor frecuencia en la población se referirá como el alelo de tipo salvaje, y los alelos menos frecuentes se referirán como alelos mutantes. (No obstante, vale la pena decir que un alelo que es más frecuente en una población puede ser menos frecuente en una población diferente.) Esta designación de un alelo como mutante sólo se dice para distinguir el alelo del alelo de tipo salvaje y no significa un cambio o pérdida de función.

Los términos "polimórficos" y "polimorfismo", tal como se utiliza aquí, se refieren a la condición en que dos o más variantes de una secuencia genómica específica, o la secuencia de aminoácidos codificada, puede encontrarse en una población. Los términos se refieren tanto a la secuencia de ácido nucleico como a la secuencia de aminoácidos codificada; el uso quedará claro según el contexto. El término "región polimórfica" o "sitio polimórfico" se refiere a una región de ácido nucleico en la que apa

recen las diferencias de nucleótidos que distingue las variantes,

o para secuencias de aminoácidos, una región de la secuencia de aminoácidos en la que aparecen las diferencias de aminoácidos que distingue las variantes de proteína. Tal como se utiliza aquí, el término "polimorfismo de nucleótido único", o SNP, se refiere al polimorfismo en el que el sitio polimórfico consiste en una posición de nucleótido única. Ya que quedará claro en el contexto, el término polimorfismo puede referirse a una secuencia de variante específica en la que el sitio polimórfico; por ejemplo, el término SNP puede referirse al nucleótido específico (por ejemplo, A, C, G, o T) que ocupa un sitio polimórfico que consiste en una posición de nucleótido única.

Los aminoácidos individuales en una secuencia están representados aquí como AN o NA, en la que la A es el aminoácido en la secuencia y N es la posición en la secuencia. En el caso que la posición N sea polimórfica, es adecuado designar una variante (por ejemplo, la variante más frecuente) como A1N y la otra variante (por ejemplo, la variante menos frecuente) como NA2. Alternativamente, el sitio polimórfico, N, está representado como A1NA2, en la que A1 es el aminoácido en una variante y A2 es el aminoácido en la otra variante. Vale la pena decir que un alelo que es más frecuente en una población puede ser menos frecuente en una diferente población. Tanto el código de una letra como el de tres letras se utiliza para designar a los aminoácidos (véase Lehninger, BioChemistry 2ª ed., 1975, Worth Publishers, Inc. New York, NY: páginas 73-75). Las posiciones de los aminoácidos se numeran según la secuencia de la proteína madura FRZB.

Las representaciones de nucleótidos y variaciones de nu

cleótido únicas en las secuencias de DNA son análogas a las representaciones de los aminoácidos. Por ejemplo, C18679T representa un polimorfismo de nucleótido único en la posición de nucleótido 18679, en la que la citosina está presente en el alelo más frecuente (de tipo salvaje) en la población y la timidina está presente en el alelo menos frecuente (mutante). En general, un SNP puede representarse como A1NA2, en el que A1 es el nucleótido presente en una variante y A2 es el nucleótido en la otra variante. EL código de letra única para los nucleótidos es bien conocido por los expertos en la materia, es decir, C para citosina; A para adenina; T para timidina, G para guanina, I para inosina, y U para uracilo. Queda claro que en una forma de doble cadena, la cadena complementaria de cada alelo contiene la base complementaria de la posición polimórfica; un SNP (u otro polimorfismo) puede así describirse y/o detectarse en referencia al nucleótido(s) que ocupa el sitio polimórfico sobre cualquier cadena.

Tal como se utiliza aquí, el término "polimorfismo de predisposición" se refiere a un polimorfismo que está asociado positivamente con una condición, como por ejemplo, obesidad y/o osteoporosis. La presencia de un polimorfismo de predisposición en un individuo puede ser indicativo que el individuo presenta un riesgo aumentado para la enfermedad en relación con un individuo sin el polimorfismo. El término "polimorfismo protector" se refiere a un polimorfismo que está asociado negativamente con una condición. La presencia de un polimorfismo protector en un individuo puede ser indicativo que el individuo presenta un riesgo disminuido para la enfermedad en relación con un individuo sin el

polimorfismo.

El término "polimorfismo asociado a la osteoporosis" o "polimorfismo relacionado con la osteoporosis" se refiere a un polimorfismo que está asociado con la osteoporosis (por ejemplo, con un aumento de la incidencia de fractura de cadera y/o vertebral y/o descenso de la densidad ósea mineral), tanto positiva o negativamente.

El término "asociación" o "asociado con" en el contexto de esta invención se refiere a la presencia de una enfermedad o rasgo fenotípico en individuos con uno o más alelos específicos o polimorfismos en uno o más genes específicos.

Tal como se utiliza aquí, el término razón de posibilidades "odds ratio" (OR) se refiere a la proporción de la frecuencia de la enfermedad en individuos con un marcador particular (alelo o polimorfismo) con la frecuencia de la enfermedad en individuos sin el marcador (alelo o polimorfismo).

Tal como se utiliza aquí, el término "desequilibrio de unión" (LD) se refiere a los alelos en diferentes loci que no están asociados de forma aleatoria, es decir, no están asociados en proporción a sus frecuencias. Si los alelos están en un desequilibrio de unión positivo, entonces los alelos aparecen juntos más a menudo de lo esperado, asumiendo una independencia estadística. Por el contrario, si los alelos están en un desequilibrio de unión negativo, entonces los alelos aparecen juntos menos a menudo de lo esperado, asumiendo una independencia estadística.

El término "genotipo", tal como se utiliza aquí, se refiere a una descripción de los alelo(s) de un gen o genes contenidos en un individuo o una muestra. Tal como se utiliza aquí, no se hace distinción entre el genotipo de un individuo y el genotipo de una

muestra originada de un individuo. Aunque, normalmente, un geno- tipo se determina a partir de las muestras de células diploides, un genotipo puede determinarse a partir de una muestra de células haploides, como una célula espermática. De forma similar, un "genotipo en unos o más sitios polimórficos" de un individuo se refiere a una descripción del alelo(s) de uno o más polimorfismos contenidos en el individuo o una muestra. Por ejemplo, un genotipo de un individuo para un SNP está definido por el nucleótido presente en el sitio polimórfico.

El término "haplotipo", tal como se utiliza aquí, se refiere a una descripción de las variantes de un gen o genes contenidos en un cromosoma, es decir, el genotipo de un sólo cromosoma. Un haplotipo es un grupo de alelos heredados por vía materna, o un grupo de alelos heredados por vía paterna, en cualquier locus. Un haplotipo también puede referirse a dos o más SNP agrupados juntos.

Tal como se utiliza aquí, el término "región diana" se refiere a una región de un ácido nucleico que se va a analizar y normalmente incluye al menos una región polimórfica.

El término "astringente" tal como se utiliza aquí se refiere a las condiciones de hibridación y lavado que están cerca o en la Tm de una secuencia particular, teniendo en cuenta, por ejemplo las consideraciones como la concentración de sal y la longitud del oligonucleótido y la composición de la base. Generalmente, las condiciones astringentes se seleccionan para que estén entre alrededor de 5 °C y 15 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica definida y pH. Se seleccionan mayores condiciones de astringencia

de forma opcional, por ejemplo, igual a la Tm o incluso 5 °C o más por encima de la Tm. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida y pH) en la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Normalmente, las condiciones astringentes serán aquellas en las que la concentración de sal sea al menos alrededor de 0,02 molar a pH 7 y la temperatura sea al menos alrededor de 50 °C para una secuencia con una Tm de alrededor de 55-65 °C. Como otros factores pueden afectar significativamente la astringencia de hibridación, incluyendo, entre otros, la composición de las bases, la longitud de las cadenas de ácido nucleico, la presencia de solventes orgánicos, y la longitud de emparejamiento de bases, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera de ellos.

Un "marcaje" es una porción que facilita la detección de una molécula. Los marcajes habituales en el contexto de la presente invención incluye marcajes fluorescentes, luminiscentes, y/o colorimétricos. Los marcajes adecuados incluye radionucleótidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Las patentes que muestran el uso de dichos marcajes incluye las patentes Estadounidense Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Muchos marcajes están disponibles comercialmente y pueden utilizarse en el contexto de la invención.

Una "secuencia de polinucleótido", "secuencia de nucleótido", o "secuencia de ácido nucleico" es un polímero de nucleótidos (un oligonucleótido, un DNA, un ácido nucleico, etc.) o una

cadena de caracteres que representa un polímero de nucleótido, dependiendo del contexto. A partir de cualquier secuencia de polinucleótido especificada, puede determinarse tanto el ácido nucleico determinado o la secuencia de polinucleótido complementaria (por ejemplo, el ácido nucleico complementario).

Una serie de términos adicionales se definen o se caracterizan de otra manera aquí.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Ciertas realizaciones de la invención parten de la observación que al menos un polimorfismo en el gen FRZB se correlaciona con el riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis. Otras realizaciones proporcionan métodos para detectar un aumento o descenso del riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis. Otras realizaciones proporcionan equipos, reactivos y chips útiles para detectar el riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar un aumento o descenso del riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis mediante la detección de la presencia de al menos un polimorfismo asociado con la osteoporosis en el locus FRZB en una muestra de ácido nucleico del individuo, en la que la presencia de dicho al menos un polimorfismo indica un aumento o descenso del riesgo en el individuo de sufrir osteoporosis.

En otra realización, la invención proporciona un método para detectar la presencia de osteoporosis en un individuo mediante una combinación del ensayo diagnóstico para la predisposición y al menos uno otra prueba clínica para la osteoporosis, que incluye pero no se limita a ensayo de recambio óseo y cualquier tipo de escáner óseo. Otras enfermedades, condiciones o criterios que

pueden causar predisposición o utilizarse además de lo anterior, incluyen pero no se limitan a, hipertiroidismo, fase post- trasplante, mala adsorción, hiperparatiroidismo, alcoholismo e historial familiar.

En una realización, el polimorfismo FRZB se selecciona de los polimorfismos FRZB numerados en la Tabla 1. En otra realización, se detecta más de un polimorfismo en la muestra de ácido nucleico, al menos uno de ellos se selecciona de los polimorfismos numerados en la Tabla 1. En otra realización, se detectan al menos dos de los polimorfismos seleccionados de los numerados en la Tabla 1. Ejemplos de polimorfismos en FRZB que pueden utilizarse incluyen pero no se limitan a: T2303723C, C18679T, G19524A, T19575G, T22242A, G23043A, G23415A, T23549C, A24791G, C26794G, y G27014A.

El individuo puede ser cualquier mamífero, incluyendo a humanos de cualquier raza o población. El individuo puede ser macho o hembra. No obstante, se entiende que los métodos, equipos y composiciones descritos aquí se ajustaran adecuadamente para los análisis de osteoporosis en las mujeres mayores de 50, y/o postmenopáusicas. Además, los métodos, equipos y composiciones descritas aquí deberán ajustarse adecuadamente a los análisis de osteoporosis en hombres o mujeres entre 35 y 77 años. Más en particular, hombres o mujeres por encima de 40 años de edad deberán ajustarse adecuadamente para los análisis.

La muestra de ácido nucleico puede obtenerse de cualquier parte del cuerpo del individuo, incluyendo, pero sin limitarse a: pelo, piel, uñas, tejidos, como órganos o tumores, o fluidos corporales, como saliva, sangre, plasma, suero, líquido espinal,

linfa, líquido sinovial, semen, líquido seminal, lavado bronquioalveolar, orina, o lágrimas, así como muestras de sangre aislada

o células de tejido o componentes de cultivo de células in vitro (que incluye, pero no se limita a, medio condicionado obtenido del crecimiento de células en el medio de cultivo celular, células recombinantes y componentes celulares). La muestra de ácido nucleico puede, pero no es necesario, amplificarse mediante cualquier método de amplificación que incluye, pero no se limita a, la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR").

El polimorfismo puede ser cualquier polimorfismo de predisposición o protector en el locus FRZB. En una realización de la invención, el polimorfismo puede ser cualquier polimorfismo identificado como de predisposición o protector por los métodos descritos aquí. En una realización, el polimorfismo puede ser un polimorfismo de nucleótido único (SNP) en el locus FRZB. En otra realización, los haplotipos específicos en el locus FRZB así como las combinaciones específicas de, y las interacciones entre, los SNP en este locus puede ser indicativo de un riesgo aumentado o disminuido de sufrir osteoporosis.

En otra realización, la presencia del polimorfismo de sólo un padre es suficientemente predictiva. En otra realización, la presencia del polimorfismo de ambos padres es suficientemente predictiva.

El polimorfismo puede detectarse mediante cualquier método conocido en la materia para detectar la presencia de un polimorfismo específico en una muestra de ácido nucleico. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, contactar la muestra de ácido nucleico con una o más moléculas de ácido nucleico que hibridan ba

jo condiciones de hibridación astringentes en al menos un polimorfismo de FRZB y detectar la hibridación, detección mediante amplificación de la muestra de ácido nucleico mediante, por ejemplo, PCR, y mediante secuenciación directa de la muestra de ácido nucleico.

En ciertas realizaciones, el riesgo de un individuo de sufrir enfermedades osteoporóticas se diagnostica a partir del genotipo FRZB del individuo. Un individuo que posee al menos un polimorfismo estadísticamente asociado con osteoporosis posee un factor que contribuye tanto a un aumento como una disminución del riesgo en comparación con un individuo sin el polimorfismo. La asociación estadística de varios polimorfismos de FRZB (variantes de secuencia) con osteoporosis se muestra en los ejemplos.

El genotipo puede determinarse utilizando cualquier método capaz de identificar una variación de nucleótido, por ejemplo, variación de nucleótido que consiste en sitios polimórfico de nucleótido único. El método particular utilizado no es un aspecto crítico de la invención. Se describen a continuación una serie de métodos adecuados.

En una realización de la invención, la genotipificación se lleva a cabo utilizando sondas de oligonucleótido específicas a variantes de secuencias de FRZB. En una realización, una región del gen FRZB que abarca uno o varios sitios polimórficos de interés se amplifica antes de, o a la vez que, la hibridación de las sondas dirigidas contra estos sitios. Los ensayos basados en sondas para la detección de variantes de secuencia son bien conocidos en la materia.

Alternativamente, la genotipificación se lleva a cabo uti

lizando una amplificación específica de alelo o reacción de extensión, en la que los cebadores específicos de alelo se utilizan para que la extensión de cebador ocurra sólo si el alelo diana está presente. Normalmente, un cebador específico de alelo hibrida con el gen FRZB de forma que el nucleótido terminal 3’ se alinea con una posición polimórfica. Las reacciones de amplificación específicas de alelo y las reacciones de extensión específicas de alelo son bien conocidas en la materia.

Otro aspecto de la invención está relacionada con un equipo útil para detectar la presencia de un polimorfismo de predisposición o protector en el locus FRZB en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de sufrir osteoporosis está siendo analizado. El equipo puede comprender uno o más oligonucleótidos capaces de detectar un polimorfismo de predisposición o protector en el locus FRZB así como instrucciones para utilizar el equipo para detectar susceptibilidad para osteoporosis. En realizaciones preferibles, el oligonucleótido o oligonucleótidos individualmente comprenden una secuencia que hibrida bajo condiciones de hibridación astringentes con al menos un polimorfismo de FRZB. En algunas realizaciones, el oligonucleótido o oligonucleótidos individualmente comprenden una secuencia que es totalmente complementaria con una secuencia de ácido nucleico que comprende un polimorfismo de FRZB.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido puede utilizarse para detectar la presencia del polimorfismo FRZB mediante la hibridación del polimorfismo bajo condiciones de hibridación astringentes. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden utilizarse como un cebador de extensión en cualquier reacción

de amplificación como PCR o una reacción de secuenciación, en la que el polimorfismo FRZB se detecta mediante amplificación o secuenciación.

En ciertas realizaciones, el equipo puede comprender además cebadores de amplificación o secuenciación que pueden, pero no necesariamente, ser específicos de secuencia. El equipo puede también comprender reactivos para marcar uno o más oligonucleótidos, o comprender oligonucleótidos marcados. Opcionalmente, el equipo puede comprender reactivos para detectar el marcaje.

En algunas realizaciones, el equipo puede comprender uno o más oligonucleótidos que pueden utilizarse para detectar la presencia de dos o más polimorfismos de FRZB de predisposición o protectores o combinaciones de polimorfismos de predisposición, polimorfismos protectores o ambos.

En otro aspecto, la invención proporciona un chip útil para detectar la presencia de un polimorfismo de FRZB de predisposición o protector en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de sufrir osteoporosis está siendo evaluado. El chip puede comprender uno o más oligonucleótidos capaces de detectar un polimorfismo de FRZB de predisposición o protector. Los oligonucleótidos pueden inmovilizarse en un sustrato, por ejemplo, una membrana o vidrio. En realizaciones preferibles, el oligonucleótido o oligonucleótidos individualmente comprenden una secuencia que puede hibridar bajo condiciones de hibridación astringentes con la secuencia de ácido nucleico que comprende un polimorfismo de FRZB. En algunas realizaciones, el oligonucleótido o oligonucleótidos individualmente comprenden una secuencia que es totalmente complementaria con una secuencia de ácido nucleico compren

de un polimorfismo de FRZB. El oligonucleótido o oligonucleótidos puede, pero no necesariamente, estar marcado. En algunas realizaciones, el chip puede ser un microchip.

En algunas realizaciones, el chip puede comprender uno o más oligonucleótidos utilizados para detectar la presencia de dos o más polimorfismos de FRZB de predisposición o protectores o combinaciones de polimorfismos de predisposición, polimorfismos protectores o ambos.

Un aspecto de la invención proporciona ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden uno o más nuevos polimorfismos en el gen FRZB y/o ácido nucleicos útiles para detectar uno o más polimorfismos de FRZB. De acuerdo con esto, una realización de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una porción del gen FRZB, su complementario, y/o a variante del mismo. Preferiblemente dicha variante comprende al menos un polimorfismo identificado en este documento. Aún más preferiblemente, dicha variante comprende al menos uno de los polimorfismos identificados aquí por estar asociado con la osteoporosis. Así, en una realización, la molécula de ácido nucleico comprende al menos uno de los polimorfismos de FRZB proporcionados en la Tabla 1. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en un cebador y/o una sonda específica de al menos uno de los polimorfismos identificados en el gen FRZB (por ejemplo, los identificados aquí por estar asociados con la osteoporosis).

SNP

En un aspecto, la invención proporciona un método para de

tectar un aumento o descenso del riesgo de un individuo para su

frir osteoporosis mediante la detección de la presencia de uno o

más SNP de FRZB en una muestra de ácido nucleico del individuo,

en el que la presencia de dicho SNP indica el aumento o descenso

del riesgo del individuo de sufrir osteoporosis. Los SNP pueden

5 ser cualquier SNP en el locus de FRZB incluyendo SNP en exones,

intrones y/o regiones corriente arriba y/o corriente abajo. Ejem

plos de dichos SNP incluye, pero no se limita a, los proporciona

dos en la Tabla 1, a continuación, y se discuten en detalle en

los Ejemplos. En una realización, el SNP presente en el locus 10 FRZB se identifica mediante la genotipificación de los SNP de

FRZB.

Tabla 1: SNP de FRZB

FRZB SNP

Nombre estándar Posición en NT_005403 Fuente de SNP Pos. en Gen/ Cambio

FRZB1_T23

NT_005265.11_23 rs6433992 Intron 1/T-C

03723C

03723 NT_005403_3393

3138

FRZB_C186

NT_005100.3_186 NT005403_33917 rs288330 Intron 2/C-T

79T

79 116

FRZB_G195

NT_005100.3_195 Z005403_339162 rs2242070 Intron 3/G-A

24A

24 71

FRZB_T195

NT_005100.3_195 Z005403_339162 RMSSNP Intron 3/T-G

75G

75 20

FRZB_T222

NT_005100.3_222 NT005403_33913 rs288327 Intron 3/T-A

42A

42 553

FRZB_G230

NT_005100.3_230 NT005403_33912 rs288326 Exon 4/G-A

43A

43 752 >Arg200Trp

41 

FRZB_G234

NT_005100.3_234 NT005403_33912 rs1561369 Intron 4/G-A

15A

15 380

FRZB_T235

NT_005100.3_235 NT005403_33912 rs288325 Intron 4/T-C

49C

49 246

FRZB_A247

NT_005100.3_247 NT005403_33911 rs288324 Intron 5/A-G

91G

91 004

FRZB_C267

NT_005100.3_267 NT005403_33909 rs7775 Exon 6/C-G -

94G

94 000 >Arg324Gly

FRZB_G270

NT_005100.3_270 NT005403_33908 rs13009 3’ UTR/G-A

14A

14 780

En ciertas realizaciones, el genotipo de un SNP de FRZB puede utilizarse para determinar el riesgo de que un individuo sufra una enfermedad osteoporótica. En otras realizaciones, pueden utilizarse los genotipos de un grupo de SNP de FRZB. En otras

5  realizaciones, pueden utilizarse ciertas combinaciones de SNP en el mismo o diferente loci.

MÉTODOS DE GENOTIPIFICACIÓN

En los métodos de la invención, los alelos presentes en una muestra se identifican mediante la identificación del nucleótido 10 presente en uno o más sitios polimórficos en una muestra de ácido nucleico de un individuo. Son conocidos un número de métodos en la materia para identificar el nucleótido presente en los sitios polimórficos. El método particular utilizado para identificar el genotipo no es un aspecto crítico de la invención. Aunque las 15 consideraciones de rendimiento, coste, y conveniencia harán más deseables unos métodos en particular que otros, quedará claro que cualquier método que pueda identificar el nucleótido presente proporcionará la información necesaria para identificar el geno

tipo. Los métodos de genotipificación preferibles involucran la secuenciación de DNA, amplificación específica de alelo, o detección basada en sondas de ácidos nucleicos amplificados.

Los alelos de FRZB pueden identificarse mediante métodos de secuenciación de DNA, como el método de terminación de la cadena (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463-5467), que son bien conocidos en la materia. En una realización, se amplifica una porción del gen que comprende el sitio polimórfico y o bien se clona en un plásmido adecuado y luego se secuencia, o bien se secuencia directamente. La secuenciación basada en la PCR se describe en la patente estadounidense Nº 5.075.216; Brow, en PCR Protocols, 1990, (Innis et al., Ed. Academic Press, San Diego), capítulo 24; y Gyllensten, en PCR Technology, 1989 (Erlich, ed., Stockton Press, New York), capítulo 5. Normalmente, la secuenciación se realiza utilizando un secuenciador de DNA automático, que está are disponible a nivel comercial en, por ejemplo, PE Biosystems (Foster City, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), Genomyx Corp. (Foster City, CA), LI-COR Biotech (Lincoln, NE), GeneSys technologies (Sauk City, WI), y Visible Genetics, Inc. (Toronto, Canadá).

Los alelos de FRZB también pueden identificarse utilizando métodos de genotipificación basada en la amplificación. Pueden utilizarse varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la materia para detectar cambios de nucleótido en un ácido nucleico diana. Un método preferible es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que actualmente es bien conocido en la materia, y se describe en las patentes estadounidenses Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188. Ejemplos de los numerosos artí

culos publicados que describen los métodos y aplicaciones de la PCR se encuentran en PCR Applications, 1999, (Innis et al., Ed., Academic Press, San Diego), PCR Strategies, 1995, (Innis et al., Ed., Academic Press, San Diego); PCR Protocols, 1990, (Innis et al., Ed., Academic Press, San Diego); y PCR Technology, 1989, (Erlich, Ed., Stockton Press, New York). Los distribuidores comerciales, como PE Biosystems (Foster City, CA) comercializan re- activos de PCR y publican protocolos de PCR.

Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (Wu y Wallace, 1988, Genomics 4: 560569); el ensayo de desplazamiento de la cadena (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, Walker et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20:1691-1696, y la patente estadounidense Nº 5.455.166); y varios sistemas de amplificación basada en la transcripción, lo que incluye los métodos descritos en las patentes estadounidenses Nº 5.437.990, 5.409.818 y 5.399.491, el sistema de amplificación transcripción (TAS) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177) y de replicación de secuencia automantenida (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878 y WO 92/08800). Alternativamente, pueden utilizarse métodos que amplifican la sonda hasta niveles detectables, como la amplificación de la Qß-replicasa (Kramer et al., 1989, Nature, 339:401-402, y Lomeli et al., 1989, Clin. Chem., 35:1826-1831). Una revisión de los métodos de amplificación conocidos se proporciona en Abramson et al., 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47.

La genotipificación también puede realizarse detectando y

analizando el mRNA de FRZB bajo condiciones en las que se trans

criben tanto el cromosoma materno como el paterno. La amplificación de RNA puede realizarse con una transcripción reversa inicial del RNA diana utilizando, por ejemplo, una transcriptasa re- versa viral, y luego amplificando el cDNA resultante, o utilizando una reacción en cadena de la polimerasa con una transcripción reversa a elevada temperatura (RT-PCR) combinadas, como se describe en las patentes estadounidenses 5.310.652, 5.322.770, 5.561.058, 5.641.864 y 5.693.517 (véase también Myers y Sigua, 1995, en PCR Strategies, supra, capítulo 5).

Los alelos de FRZB también pueden identificarse utilizando métodos de amplificación específica de alelo o de extensión del cebador, que se basan en el efecto inhibidor de un desemparejamiento terminal del cebador de la capacidad de la polimerasa de DNA de extender el cebador. Para detectar una secuencia alélica utilizando un método de amplificación específica de alelo o basado en la extensión, se escoge un cebador complementario a los genes FRZB de forma que el nucleótido en 3’ terminal hibrida en la posición polimórfica. En presencia del alelo a identificar, el cebador es complementario de la secuencia diana en el extremo 3’ terminal y el cebador puede extenderse. En presencia de sólo el otro alelo, el cebador posee un desemparejamiento en 3’ en relación a la secuencia diana y la extensión del cebador se evita o se reduce significativamente. Los métodos de amplificación específica de alelo o basados en la extensión se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nº 5.137.806, 5.595.890,

5.639.611 y la patente estadounidense Nº 4.851.331. Utilizando la genotipificación basada en la amplificación

específica de alelo, la identificación de los alelos requiere só

lo la detección de la presencia o ausencia de secuencias diana amplificadas. Los métodos de detección de secuencias diana amplificadas son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la electroforesis en gel (véase Sambrook et al., 1989, infra) y los ensayos de hibridación de sonda descritos anteriormente se han utilizado ampliamente para detectar la presencia de ácidos nucleicos.

Los métodos de genotipificación basados en la amplificación específica de alelo pueden facilitar la identificación de haplotipos, como se describe en los ejemplos. Esencialmente, la amplificación específica de alelo se utiliza para amplificar una región que incluye múltiples sitios polimórficos de sólo uno de los dos alelos en una muestra heterozigota. Las variantes SNP presentes dentro de la secuencia amplificada se identifican a continuación, mediante la hibridación de sondas o por secuenciación.

Un método alternativo sin sondas es el aquí denominado método de PCR cinética, en el que la generación de ácidos nucleicos amplificados se detecta monitorizando el aumento de la cantidad total de DNA de doble cadena en la mezcla de reacción, se describe en Higuchi et al., 1992, Bio/Technology, 10:413-417, Higuchi et al., 1993, Bio/Technology, 11:1026-1030, Higuchi y Watson, en PCR Applications, supra, capítulo 16, las patentes estadounidenses Nº 5.994.056 y 6.171.785 y las publicaciones de patente europea Nº 487.218 y 512.334. La detección del DNA de doble cadena diana se basa en el aumento de la fluorescencia que muestran los colorantes que se unen al DNA, como el bromuro de etidio o SYBR™ Green, cuando se unen al DNA de doble cadena. El aumento del DNA de doble cadena que resulta de la síntesis de las secuencias di

ana resulta en un aumento en la cantidad de colorante unido al DNA de doble cadena y en un aumento detectable concomitante de la fluorescencia. En la genotipificación que se realiza utilizando métodos de PCR cinética, las reacciones de amplificación se realizan utilizando un par de cebadores específicos de uno de los alelos, de forma que cada amplificación puede indicar la presencia de un alelo particular. Por ejemplo, puede determinarse el genotipo de la muestra respecto a un SNP realizando dos amplificaciones, una utilizando cebadores específicos del alelo salvaje y una utilizando cebadores específicos del alelo mutante. De forma similar, puede determinarse el genotipo de la muestra respecto a dos SNP realizando cuatro amplificaciones, cada una de ella con uno de los posibles pares y utilizando cebadores específicos de alelo tanto para los cebadores directos como reversos. Esto proporciona información del haplotipo de un par de SNP.

También pueden identificarse los alelos utilizando métodos basados en sondas, que se basan en la diferencia de estabilidad de la hibridación de los dúplex formados entre una sonda y su correspondiente secuencia diana que comprende un alelo de FRZB. Bajo condiciones de hibridación suficientemente astringentes, se forman dúplex estables sólo entre una sonda y su secuencia de alelo diana y no con otras secuencias de alelo. La presencia de dúplex de hibridación estable puede detectarse mediante cualquiera de una serie de métodos bien conocidos. En general, es preferible amplificar un ácido nucleico que incluye un sitio polimórfico de interés previamente a su hibridación para facilitar su detección. sin embargo, esto no es necesario si puede obtenerse

suficiente ácido nucleico sin una amplificación.

Una sonda adecuada para su utilización en los métodos basados en sondas de la invención, que contiene una región de hibridación sustancialmente complementaria o exactamente complementaria a la región diana del gen FRZB o de la cadena complementaria del mismo, en la que la región diana incluye el sitio polimórfico, y es exactamente complementaria a una de las dos secuencias del alelo en el sitio polimórfico, puede seleccionarse utilizando las guías que aquí se proporcionan y que son bien conocidas en la materia. De forma similar, las condiciones de hibridación adecuadas (por ejemplo, condiciones de hibridación astringentes), que dependen del tamaño exacto y de la secuencia de la sonda, pueden seleccionarse de forma empírica utilizando las guías que aquí se proporcionan y que son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Nucleic Acids Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins. Ed., 1984) y Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000). La utilización de sondas de oligonucleótidos para detectar las variaciones de nucleótido, lo que incluye diferencias de un único par de bases en la secuencia se describe en, por ejemplo, Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:278-282, y en las patentes estadounidenses Nº

5.468.613 y 5.604.099.

En algunas realizaciones de los métodos basados en sondas para la determinación de los genotipos de FRZB, se amplifican múltiples secuencias de ácido nucleico de los genes FRZB que incluyen los sitios polimórficos y se hibridan con un conjunto de sondas bajo condiciones de hibridación suficientemente astringentes. Los alelos presentes se infieren a partir del patrón de

unión de las sondas a las secuencias diana amplificadas. En esta realización, se realiza una amplificación para proporcionar suficiente ácido nucleico para el análisis mediante hibridación de una sonda. Por lo tanto, los cebadores están diseñados de forma que las regiones de los genes FRZB que incluyen los sitios polimórficos se amplifiquen independientemente del alelo presente en la muestra. La amplificación independiente de alelo se consigue utilizando cebadores que hibridan con regiones conservadas de los genes FRZB. Los genes FRZB contienen muchas regiones invariables

o monomórficas, y pueden seleccionarse cebadores independientes de alelo adecuados de forma rutinaria a partir del Id. de Sec. Nº:1 o los números de registro de GenBank NT 005100.3, NT 005265

o NT 005403.

Los formatos de ensayo adecuados para detectar los híbridos formados entre las sondas y las secuencias de ácido nucleico diana en una muestra son conocidos en la materia e incluyen el formato de diana inmovilizada (dot-blot) y los formatos de ensayo de sonda inmovilizada (dot-blot reverso o line-blot). Los formatos de ensayo de dot-blot y dot-blot reverso se describen en las patentes estadounidenses Nº 5.310.893, 5.451.512, 5.468.613 y

5.604.099.

En un formato de dot-blot, el DNA diana amplificado se in- moviliza en un soporte sólido, como una membrana de nylon. El complejo membrana-diana se incuba con una sonda marcada bajo condiciones de hibridación adecuadas, la sonda no hibridada se elimina mediante lavados en condiciones de astringencia adecuada, y se detecta la presencia de sonda unida en la membrana. Un ensayo

de detección de dot-blot preferible se describe en los ejemplos.

En el formato de dot-blot reverso (o line-blot), las sondas están inmovilizadas en un soporte sólido, como una membrana de nilón o una placa microtitulada. El DNA diana se marca, normalmente durante la amplificación mediante la incorporación de ceba- dores marcados. Uno o ambos cebadores pueden estar marcados. El complejo membrana-sonda se incuba con el DNA diana amplificado marcado bajo condiciones de hibridación adecuadas, el DNA diana no hibridado se elimina mediante lavados en condiciones de astringencia adecuada, y se detecta la presencia de DNA diana unido en la membrana. Un ensayo de detección de line-blot reverso preferible se describe en los ejemplos.

La genotipificación basada en sondas puede realizarse utilizando el ensayo de la 5’-nucleasa, como se describe en las patentes estadounidenses Nº 5.210.015, 5.487.972 y 5.804.375, y en Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280. En el ensayo de la 5’-nucleasa, se añaden en la mezcla de la reacción de amplificación sondas de detección marcadas que hibridan en la región amplificada. Las sondas están modificadas de forma que se evita que las sondas actúen como cebadores para la síntesis de DNA. La amplificación se realiza utilizando una polimerasa de DNA que posee actividad exonucleasa de 5’ a 3’, por ejemplo, la polimerasa de DNA Tth. Durante cada paso de síntesis de la amplificación, cualquier sonda que hibride con el ácido nucleico diana corriente abajo del cebador que se extiende se degradará mediante la actividad exonucleasa de 5’ a 3’ de la polimerasa de DNA. Por lo tanto, la síntesis de una nueva cadena diana también resulta en la degradación de una sonda, y la acumulación de producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de se

cuencias diana.

Puede utilizarse cualquier método adecuado para detectar el producto de degradación en el ensayo de la 5’-nucleasa. En un método preferible, las sondas de detección están marcadas con dos colorantes fluorescentes, uno de los cuales es capaz de bloquear la fluorescencia del otro colorante. Los colorantes están unidos a la sonda, preferiblemente uno unido al extremo 5’ y el otro unido en un punto interno, de forma que el bloqueo aparezca cuando la sonda se encuentra en estado no hibridado y de forma que la escisión de la sonda por la actividad exonucleasa de 5’ a 3’ de la polimerasa de DNA ocurra entre los dos colorantes. La amplificación resulta en la escisión de la sonda entre los colorantes con una eliminación concomitante del bloqueo de la fluorescencia y un aumento de fluorescencia observable en referencia al colorante inicialmente bloqueado. La acumulación de producto de degradación se controla midiendo el aumento de fluorescencia en la reacción. Las patentes estadounidenses Nº 5.491.063 y 5.571.673, describen métodos alternativos de detección de degradación de la sonda que ocurre de forma concomitante a la amplificación.

El ensayo de la 5’-nucleasa puede utilizarse con cebadores de amplificación específicos de alelo de forma que la sonda se utiliza sólo para detectar la presencia de producto amplificado. Tal ensayo se realiza como se ha descrito para los métodos basados en la PCR cinética descritos anteriormente. Alternativamente, el ensayo de la 5’-nucleasa puede utilizarse con una sonda específica de diana.

Ejemplos de otras técnicas que pueden utilizarse para la

genotipificación basada en sondas incluyen, pero no se limitan

al, Amplifluor™, intercalado de colorantes de unión, transferencia de la energía de resonancia de la fluorescencia (FRET), método de amplificación de la señal de hibridación (HSAM), sondas HYB™, tecnología invasor/ escindasa (Invader/CFLP™), balizas moleculares™, Origen™, amplificación-ramificación basada en el DNA (RAM™), amplificación de círculo rodante (RCA™), Scorpions™, amplificación con desplazamiento de cadena (SDA).

Los formatos de ensayo descritos anteriormente normalmente utilizan oligonucleótidos marcados para facilitar la detección de los dúplex de hibridación. Los oligonucleótidos pueden estar marcados al incorporar un marcaje detectable mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, radiológicos, radioquímicos o químicos. Los marcajes útiles incluyen el 32P, colorantes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (como se utilizan habitualmente en los ELISA), biotina o haptenos y proteínas para los que se encuentren disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Los oligonucleótidos marcados de la invención pueden sintetizarse y marcarse utilizando las técnicas descritas anteriormente para la síntesis de oligonucleótidos. Por ejemplo, un ensayo de dot-blot puede realizarse utilizando sondas marcadas con biotina, como se describe en Levenson et al., 1989, en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Ed., Academic Press. San Diego), págs. 99-112. Tras la hibridación del DNA diana inmovilizado con las sondas biotiniladas bajo condiciones específicas de secuencia, las sondas que permanecen unidas se detectan uniendo en primer lugar la biotina a avidina-peroxidasa de rábano picante (A-HRP) o estreptavidinaperoxidasa de rábano picante (SA-HRP), que luego se detecta rea

lizando una reacción en la que la HRP cataliza un cambio de color de un cromógeno.

Sea cual sea el método para determinar que oligonucleótidos de la invención hibridan selectivamente con las secuencias alélicas de FRZB en una muestra, la característica central del método de tipificación involucra la identificación de los alelos de FRZB presentes en la muestra detectando las variantes de secuencias presentes. Más detalles de la genotipificación de SNP están disponibles en la bibliografía, véase por ejemplo, Lindblad-Toh et al., 2000, Nature Genetics 24:381-386; Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, 2001, CABI Publishing; Syvanen, 2001, Nat. Rev. Genet. 2:930-942; Kuklin et al., 1998, Genetic Testing

1: 201-206; Gut, 2001, Hum. Mutat. 17:475-492; Ahmadian et al., 2000, Anal. Biochem. 280:103-110; Useche et al., 2001, Genome Inform Ser Workshop Genome Inform 12:194-203; Pastinen et al., 2000, Genome Res. 10: 1031-1042; Hacia, 1999, Nature Genet. 22:164-167; y Chen et al., 2000, Genome Res. 10:549-557.

OTROS MARCADORES

Otros marcadores genéticos y métodos de detección de los polimorfismos de secuencia son conocidos en la materia y pueden utilizarse en la práctica de la presente invención, lo que incluye, pero no se limita a, los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), DNA polimórfico amplificado al azar (RAPD), polimorfismos en la longitud de fragmentos arbitrarios (AFLP), repeticiones simples de secuencia (SSR), polimorfismos en la conformación de la cadena sencilla (SSCP) y secuencias variables de amplificación. El descubrimiento, detección y genotipificación de estos y otros tipos de marcadores genéticos está

bien establecido en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Orita et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770; USPN 6.399.855; Henry, Ed., 2001, Plant Genotypifing. The DNA Fingerprinting of Plants Wallingford: CABI Publishing; Phillips y Va- sil, Ed., 2001, DNA-based Markers in Plants Dordrecht: Kluwer Academic Publishers; Pejic et al., 1998, Theor. App. Genet. 97:1248-1255; Bhattramakki et al., 2002, Plant Mol. Biol. 48:53947; Nickerson et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:2745-2751; Underhill et al., 1997, Genome Res. 7:996-1005; Shi, 2001, Clin. Chem. 47:164-172; Kwok, 2000, Pharmacogenomics 1:95-100; Rafalski et al., 2002, Cell Mol Biol Lett 7:471-5; Ching y Rafalski, 2002, Cell Mol Biol Lett. 7:803-10; Powell et al., 1996, Mol. Breeding 2:225-238; Vos et al., 1995, Nucl. Acids Res. 23:4407; Becker et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 249: 65; Meksem et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 249:74; Huys et al., 1996, Int’l J. Sistemaatic Bacteriol. 46:572; Jacob et al., 1991, Cell 67:213; Taramino y Tingey, 1996, Genome 39:277-287; Condit y Hubbell, 1991, Genome 34:66; y Zietkiewicz et al., 1994, Genomics 20:176-83.

ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN

En los ejemplos se describe la evaluación de la asociación del gen candidato FRZB con varios fenotipos de obesidad y osteoporosis. Además, se han descrito en la materia el diseño y ejecución de varios tipos de estudios de asociación; véase, por ejemplo, Rao y Province, Ed., 2001, Advances in Genetics volumen 42, Genetic Dissection of Complex Traits; Balding et al., Ed., 2001, Handbook of Statistical Genetics, John Wiley and Sons Ltd.; Borecki y Suarez, 2001, Adv Genet 42:45-66; Cardon y Bell, 2001, Nat Rev Genet 2:91-99; y Risch, 2000, Nature 405:847-856. Los es

tudios de asociación se han utilizado tanto para evaluar la asociación de los genes candidatos con una característica fenotípica (por ejemplo, Thornsberry et al., 2001, Nature Genetics 28:286289) y para realizar un cribado del genoma completo para identificar los genes que contribuyen a la variación fenotípica.

EQUIPOS

La invención también está relacionada con un equipo que comprende una unidad contenedora y los componentes para practicar el presente método. Un equipo puede contener sondas de oligonucleótido específicas de los alelos de FRZB así como las instrucciones para su utilización para determinar el riesgo de padecer osteoporosis. En algunos casos, un quipo puede comprender sondas de detección fijadas a una membrana de soporte apropiada. El equipo también puede contener cebadores de amplificación para amplificar las regiones del locus FRZB que incluyen los sitios polimórficos, siendo tales cebadores útiles en la realización preferible de la invención. Alternativamente, los equipos útiles pueden contener un conjunto de cebadores que comprende un cebador específico de alelo para la amplificación específica de los ale- los de FRZB. Otros componentes opcionales de los equipos incluyen reactivos adicionales utilizados en los métodos de genotipificación aquí descritos. Por ejemplo, un equipo puede contener adicionalmente un agente para catalizar la síntesis de productos de extensión del cebador, nucleósidos trifosfato sustrato, reactivos para el marcaje y/o detección de ácidos nucleicos (por ejemplo, un conjugado de avidina-enzima y el sustrato de la enzima y cromógeno si el marcaje es biotina) y tampones apropiados para las

reacciones de amplificación o hibridación.

Un aspecto de la invención proporciona equipos para la detección de la presencia de un primer polimorfismo de predisposición o protector en el gen FRZB, por ejemplo, en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de padecer osteoporosis se está valorando. Por lo tanto, una clase general de realizaciones proporciona un equipo que incluye uno o más oligonucleótidos iniciales capaces de detectar el primer polimorfismo y las instrucciones para detectar el primer polimorfismo con uno o más de los oligonucleótidos iniciales y para correlacionar dicha detección con el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis, empaquetado en uno o más contenedores.

Esencialmente todas las características mencionadas en las realizaciones anteriores del método aplican también a esta realización y son relevantes. Por ejemplo, en una clase preferible de realizaciones, el primer polimorfismo es un polimorfismo de un único nucleótido, por ejemplo, un SNP seleccionado de entre el grupo que consiste en: el alelo T de T2303723C, el alelo C de T2303723C, el alelo C de C18679T, el alelo T de C18679T, el alelo G de G19524A, el alelo A de G19524A, el alelo T de T22242A, el alelo A de T22242A, el alelo A de A24791G, el alelo G de A24791G, el alelo C de C26794G, el alelo G de C26794G, el alelo G de G27014A, y el alelo A de G27014A. Otros SNP potenciales incluyen, pero no se limitan al alelo de T19575G, G23043A, G23415A y T23549C.

En un aspecto, el equipo puede utilizarse para detectar la presencia del primer polimorfismo mediante la hibridación de una sonda de ácido nucleico con el polimorfismo. Por lo tanto, en una clase de realizaciones, el conjunto de uno o más oligonucleótidos

iniciales comprende al menos una sonda. En ciertas realizaciones, el primer oligonucleótido hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo. En una clase de realizaciones, el primer polimorfismo es un primer polimorfismo de un único nucleótido que comprende un primer nucleótido en una primera posición de nucleótido. En esta clase de realizaciones, bajo condiciones astringentes, el primer oligonucleótido hibrida con una región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo de un único nucleótido con una proporción entre señal y ruido que es de al menos 2x (por ejemplo, al menos 5x

o al menos 10x) la proporción entre señal y ruido a la que el primer oligonucleótido hibrida con la región del gen FRZB que comprende un segundo nucleótido en la primera posición de nucleótido. El primer oligonucleótido normalmente es completamente complementario a la región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo, y normalmente comprende al menos alrededor de 10 nucleótidos contiguos complementarios al gen FRZB.

Para facilitar la detección del polimorfismo (por ejemplo, mediante la detección de la hibridación entre el conjunto de uno

o más oligonucleótidos iniciales y un ácido nucleico que comprende el polimorfismo), por ejemplo, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales opcionalmente comprende un marcaje, por ejemplo, un marcaje isotópico, fluorescente, fluorogénico, luminiscente o colorimétrico. En algunas realizaciones, el marcaje en sí mismo provoca directamente una señal detectable (por ejemplo, un marcaje fluorescente). En otras realizaciones, el equipo también incluye un reactivo que detecta el marcaje (por ejemplo, una enzima que escinde un marcaje colorimétrico, una porción de unión

o similares).

en un aspecto, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende uno o más cebadores. El(los) cebador(es) puede(n) utilizarse para detectar el polimorfismo, por ejemplo, en una reacción de amplificación o extensión específica de alelo. Por ejemplo, en una clase de realizaciones, el primer polimorfismo es un primer polimorfismo de un único nucleótido que comprende un primer nucleótido en una primera posición de nucleótido, y el nucleótido en 3’ de uno del conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales es complementario del primer nucleótido.

El(los) cebador(es) puede(n) utilizarse para amplificar una región de FRZB que comprende el polimorfismo, por ejemplo, para la subsiguiente detección del polimorfismo mediante hibridación, secuenciación o similares. En una clase de realizaciones, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende cebadores de amplificación, y los cebadores de amplificación amplifican una secuencia de ácido nucleico que comprende el primer polimorfismo. En una clase relacionada de realizaciones, el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende cebadores de secuenciación que flanquean el primer polimorfismo.

El conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales se encuentran opcionalmente inmovilizados sobre un sustrato. El sus- trato puede ser, por ejemplo, un sustrato plano o un sustrato en forma de cuenta. El(los) oligonucleótido(s) puede(n) colocarse en un chip junto con otros oligonucleótidos utilizados para detectar otros polimorfismos, por ejemplo, otros polimorfismos en FRZB.

El equipo puede utilizarse opcionalmente para detectar más

de un polimorfismo (de forma simultanea o secuencial). Por lo

tanto, en una clase de realizaciones, el equipo también incluye un segundo conjunto de uno o más oligonucleótidos capaces de detectar un segundo polimorfismo (y opcionalmente un tercer, cuarto, quinto, etc. conjunto de oligonucleótidos capaces de detectar un tercer, cuarto, quinto, etc. polimorfismo). El segundo polimorfismo puede estar en el mismo sitio polimórfico que el primero

o en un sitio polimórfico diferente (en FRZB o en un gen diferente), y puede ser protector o de predisposición.

CHIPS y SISTEMAS

La invención también está relacionada con un chip, un soporte con oligonucleótidos inmovilizados útil para poner en práctica el presente método. Un chip útil puede contener sondas de oligonucleótido específicas de alelos de FRZB o ciertas combinaciones de alelos de FRZB. Los oligonucleótidos pueden estar inmovilizados sobre un sustrato, por ejemplo, una membrana o vidrio. Los oligonucleótidos pueden estar marcados, aunque no es necesario. En algunas realizaciones, el chip puede ser un microchip. En algunas realizaciones, el chip puede comprender uno o más oligonucleótidos utilizados para detectar la presencia de dos o más alelos de FRZB o ciertas combinaciones de los alelos de FRZB.

Una clase general de realizaciones proporciona chips para detectar la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición y/o protectores en un gen FRZB, por ejemplo, en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de padecer osteoporosis se desea valorar. En una clase de realizaciones, el chip comprende un sustrato y una serie de oligonucleótidos, y cada uno de los oligonucleótidos hibrida con una región del gen FRZB que comprende al menos uno de los polimorfismos. La hibridación de

tecta la presencia del polimorfismo, y esta detección proporciona una indicación del riesgo de un individuo de padecer osteoporosis. Normalmente, el chip se utiliza para detectar la presencia de una serie de polimorfismos, por ejemplo, múltiples alelos en un único sitio polimórfico y/o diferentes sitios polimórficos.

Esencialmente todas las características mencionadas anteriormente para las realizaciones del método y el equipo también se aplican a esta realización como relevantes. Por ejemplo, el conjunto de uno o más polimorfismos preferiblemente comprende uno

o más polimorfismos de un único nucleótido. Por ejemplo, puede seleccionarse al menos uno del conjunto de uno o más polimorfismos de entre el grupo que consiste en: el alelo T de T2303723C, el alelo C de T2303723C, el alelo C de C18679T, el alelo T de C18679T, el alelo G de G19524A, el alelo A de G19524A, el alelo T de T22242A, el alelo A de T22242A, el alelo A de A24791G, el ale- lo G de A24791G, el alelo C de C26794G, el alelo G de C26794G, el alelo G de G27014A y el alelo A de G27014A. Otros SNP potenciales incluyen, pero no se limitan al alelo de T19575G, G23043A, G23415A o T23549C.

En una clase de realizaciones en las que el chip puede utilizarse para detectar la presencia de uno o más SNP, cada uno de los oligonucleótidos en el chip hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende uno de los polimorfismos de un único nucleótido con una proporción entre señal y ruido que es de al menos 2x (por ejemplo, al menos 5x o al menos 10x) la del oligonucleótido que hibrida con una región del gen FRZB que comprende cualquiera de los polimorfismos de un único nucleótido restantes. Normalmente se utiliza un oligonucleótido

para detectar un SNP, es decir, cada uno de los oligonucleótidos normalmente hibrida con un polimorfismo de un único nucleótido distinto.

Como se ha indicado, la serie de oligonucleótidos están in- movilizados en un sustrato, por ejemplo, un sustrato plano, una membrana, un portaobjetos de vidrio o similares. Normalmente, cada uno de los oligonucleótidos de la serie está inmovilizado en una posición conocida, predeterminada sobre el sustrato.

Para facilitar la detección de polimorfismos mediante hibridación específica con los oligonucleótidos, cada uno de los oligonucleótidos de la serie normalmente es completamente complementario a una región del gen FRZB que comprende uno de los polimorfismos, y cada uno de los oligonucleótidos de la serie normalmente comprende al menos alrededor de 10 nucleótidos contiguos complementarios al gen FRZB. Cada uno de los oligonucleótidos de la serie comprende opcionalmente un marcaje, por ejemplo, un marcaje que facilita la detección de la hibridación entre los oligonucleótidos y los polimorfismos.

El chip forma parte opcionalmente de un sistema. por lo tanto, una clase de realizaciones proporciona un sistema que comprende un chip de la invención y las instrucciones del sistema para correlacionar la detección de la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores del riesgo de un individuo de padecer osteoporosis. Los sistemas, por ejemplo, sistemas digitales, se describen en mayor detalle a continuación.

En un chip sobre un sustrato, normalmente cada oligonucleótido está unido (por ejemplo, unido electrostáticamente o covalentemente, directamente o a través de un enlazante) al sustrato

en una localización única.

Los métodos para obtener, utilizar y analizar tales chips (por ejemplo microchips) son bien conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, Wang et al., 1998, Science 280:1077-82; Lockhart y Winzeler, 2000, Nature 405:827-836; y Scherf et al., 2000, Nat Genet. 24:236-44. Los chips pueden estar formados (por ejemplo, impresos), por ejemplo, utilizando instrumentos disponibles a nivel comercial como un GMS 417 Arrayer (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los soportes sólidos adecuados están disponibles a nivel comercial fácilmente. Por ejemplo, una serie de membranas (por ejemplo, membranas de nylon, PVDF y nitrocelulosa) están disponibles a nivel comercial, por ejemplo, de Sigma-Aldrich, Inc. (www.sigmaaldrich.com). Como otro ejemplo, los portaobjetos con la superficie modificada y portaobjetos pre-recubiertos con una gran variedad de químicas en su superficie están disponibles a nivel comercial, por ejemplo, de TeleChem International (www.arrayit.com), Corning, Inc. (Corning, NY), o Greiner Bio- One, Inc. (www.greinerbiooneinc.com). Por ejemplo, están disponibles los portaobjetos silanizados y silicatados con grupos libres amino y aldehído, respectivamente, que permiten el acoplamiento covalente de moléculas (por ejemplo, oligos) a los portaobjetos. Están disponibles portaobjetos con estreptavidina en la superficie que pueden unir oligos biotinilados. Además, están disponibles a nivel comercial servicios que fabrican chips de ácidos nucleicos personalizados, por ejemplo, de TeleChem International (www.arrayit.com).

SISTEMAS DIGITALES

En general, pueden utilizarse varios sistemas automatizados

para realizar algunos pasos o la totalidad del método aquí indicado. Además de poner en práctica algunos pasos o la totalidad del método aquí indicado, los sistemas digitales o análogos, por ejemplo, los que comprenden una computadora digital o análoga, también pueden controlar una variedad de otras funciones como una pantalla visualizable por el usuario (por ejemplo, que permita visualizar al usuario los resultados del método) y/o controlar los datos de salida.

Por ejemplo, algunos de los métodos descritos anteriormente se implementan opcionalmente a través de un programa o programas informáticos (que por ejemplo, correlacionan la detección de la presencia de el conjunto de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores con el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis). Por lo tanto, la presente invención proporciona sistemas digitales, por ejemplo, computadoras, medios legibles en una computadora y/o sistemas integrados que comprenden las instrucciones (por ejemplo, incorporadas en un programa apropiado) para realizar los métodos aquí descritos. Por ejemplo, un sistema digital que comprende las instrucciones para correlacionar la detección de la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores con el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis, como se describe aquí, es una característica de la invención. El sistema digital también puede incluir información (datos) correspondientes a los genotipos individuales de un conjunto de marcadores genéticos, valores fenotípicos y/o similares. El sistema también ayudar en la detección de uno o más polimorfismos (por ejemplo, controlando un escáner de microchips o simi

lares).

Las aplicaciones estándar de escritorio, como un programa procesador de textos (por ejemplo, Microsoft Word™ o Corel Word- Perfect™) y/o un programa de bases de datos (por ejemplo, programas de hoja de cálculo como Microsoft Excel™, Corel Quattro Pro™

o programas de bases de datos como Microsoft Access™ o Paradox™) pueden adaptarse a la presente invención introduciendo los datos que están cargados en la memoria de un sistema digital, y realizando una operación como la que se indica aquí con los datos. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir los programas anteriores con la información genotípica apropiada, asociaciones entre fenotipo y genotipo, etc., por ejemplo, utilizados junto con una interfaz de usuario (por ejemplo, una GUI en un sistema operativo estándar como los sistemas Windows, Macintosh o LINUX) para realizar cualquier análisis aquí indicado, o simplemente para adquirir los datos (por ejemplo, en una hoja de cálculo) para utilizarla en los métodos aquí descritos.

Los sistemas normalmente incluyen, por ejemplo, una computadora digital con programas para realizar análisis de asociación y/o predicción del riesgo, así como datos introducidos en el sistema de programas que comprenden los genotipos de un conjunto de marcadores genéticos, valores fenotípicos y/o similares. La computadora puede ser, por ejemplo, un PC (una máquina Intel x86 o con chip compatible con Pentium DOS™, OS2™, WINDOWS™, WINDOWS NT™, WINDOWS95™, WINDOWS98™, LINUX, compatible con Apple, compatible con MACINTOSH™, compatible con Power PC o compatible con UNIX (por ejemplo, estación de trabajo SUN™) u otras computadoras comunes a nivel comercial que son conocidas para el experto en la materia. Un experto puede generar programas para realizar análi

sis de asociación y/o predicción del riesgo utilizando un lenguaje de programación estándar como Visualbasic, Fortran, Basic, Java o similares, de acuerdo con los métodos aquí descritos.

Cualquier sistema controlador o computadora opcionalmente incluye un monitor que puede incluir, por ejemplo, una pantalla con tubo de rayos catódicos ("CRT"), una pantalla de panel plano (por ejemplo, pantalla de cristal líquido de matriz activa, pantalla de cristal líquido) u otras. Los circuitos de la computadora a menguado están situados en una caja que incluye numerosas tarjetas de circuitos integrados, como un microprocesador, memoria, circuitos de interfaz y otros. LA caja también incluye opcionalmente un directorio de disco duro, un directorio de disco flexible, un directorio externo de alta capacidad como un CD-ROM gravable y otros elementos periféricos comunes. Los dispositivos de entrada como un teclado o un ratón opcionalmente proporcionan la entrada desde el usuario y la selección del usuario del geno- tipo del marcador genético, valor fenotípico o similares en el sistema de computadora relevante.

La computadora normalmente incluye programas adecuados para recibir instrucciones del usuario, en forma de información introducida por el usuario en un conjunto de campos de parámetros, por ejemplo, en una GUI, o en forma de instrucciones preprogramadas, por ejemplo, preprogramadas para una serie de operaciones específicas diferentes. El programa luego convierte estas instrucciones al lenguaje apropiado para que el sistema realice cualquier operación deseada. Por ejemplo, además de realizar una predicción del riesgo, un sistema digital puede controlar el equipo para detectar los polimorfismos de acuerdo con el método relevante aquí

descrito.

La invención también puede realizarse con el grupo de circuitos de un circuito integrado específico de aplicación (ASIC) o dispositivo lógico programable (PLD). En tal caso, la invención se realiza en un lenguaje descriptor legible por una computadora que puede utilizarse para crear un ASIC o PLD. La invención también puede realizarse con el grupo de circuitos o procesadores lógicos de una variedad de aparatos digitales distintos, como PDA, sistemas de computadora portátil, pantallas, equipo de edición de imágenes, etc.

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Las técnicas convencionales de biología molecular y química de los ácidos nucleicos, que son habituales en la materia, están explicadas en detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins. Ed., 1984); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); la serie Current Protocols in Human Genetics (Dracopoli et al., Ed., 1984 con actualizaciones trimestrales, John Wiley & Sons, Inc.); Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Ed., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado durante

2004); Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias que allí se citan; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg y Phillips (Ed.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York); y Atlas y Parks (Ed.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Protocolo de genotipificación: PCR específica de alelo de los alelos de FRZB

Este ejemplo describe un método de genotipificación de SNP (y/o la determinación de la frecuencia de los alelos en muestras de DNA agrupadas) en el locus de FRZB, por ejemplo, los SNP que están asociados con la osteoporosis. El método utilizado es básicamente el de Germer, et al., Genome Research, 10:258-266 (2000). El método y los cebadores se probaron inicialmente en las líneas celulares listadas en la Tabla 2. Los genotipos de FRZB de estas líneas celulares se habían determinado previamente mediante secuenciación de DNA para algunas de las líneas, otras líneas se genotipificaron mediante secuenciación con posterioridad y algunas no se han secuenciado hasta la fecha.

Se diseñaron y probaron cebadores específicos de alelo y cebadores comunes. La PCR específica de alelo se realizó utilizando los pares de cebadores listados en la Tabla 2 (Id. de Sec. Nº:3-29). Todos los cebadores se muestran en orientación de 5’ a

3’. Además de los cebadores, en la Tabla 2 también se muestra el genotipo control de cada línea celular control para SNP particulares utilizados en los ensayos de prueba.

Tabla 2: Información del ensayo específico de alelo

67 

SNP

Línea celular control Genotipo control Cebador Alelo Secuencias cebador (Id. de Sec. Nº)

FRZB C18679T

GM15890 A1/A1 AS1 C ATAGTAGGAGGAGTACTGTGTCG (Id. de Sec. Nº:3)

FRZB C18679T

GM15892 A1/A2 AS2 T AATAGTAGGAGGAGTACTGTGTCA (Id. de Sec. Nº:4)

FRZB C18679T

GM15891 A2/A2 Común CCCTGTGGACTATCACCTAATGTT (Id. de Sec. Nº:5)

FRZB G19524A

GM15890 A1/A1 AS1 G ATAGGCCATCAGTTGTGC (Id. de Sec. Nº: 6)

FRZB G19524A

GM15208 A1/A2 AS2 A CATAGGCCATCAGTTGTGT (Id. de Sec. Nº: 7)

FRZB G19524A

GM15206 A2/A2 Común TCAAAGTGCTCTGCTGTTCAC (Id. de Sec. Nº:8)

FRZB T22242A

GM15207 A1/A1 AS1 T GATCTTATTTCCTCCATCTGCT (Id. de Sec. Nº:9)

FRZB T22242A

GM15889 A1/A2 AS2 A ATCTTATTTCCTCCATCTGCA (Id. de Sec. Nº:10)

FRZB T22242A

GM15206 A2/A2 Común CGTGAGGGAAAGGAATGTTG (Id. de Sec. Nº:11)

FRZB G23043A

GM15888 A1/A1 AS1 G TTGTCTTTTATCCCAGTCATTC (Id. de Sec. Nº:12)

68 

FRZB G23043A

GM15890 A1/A2 AS2 A TTGTCTTTTATCCCAGTCATTT (Id. de Sec. Nº:13)

FRZB G23043A

GM13626 A1/A2 Común CATCATGGCACTTAGTCTTTATCTC (Id. de Sec. Nº:14)

FRZB G23415A

GM15888 A1/A1 AS1 G AAAAATGTAAACCTATAAACTACACG (Id. de Sec. Nº:15)

FRZB G23415A

GM15890 A1/A2 AS2 A GAAAAATGTAAACCTATAAACTACACA (Id. de Sec. Nº:16)

FRZB G23415A

GM13626 A1/A2 Común TCTTGATTTCATATATGGAATGGGT (Id. de Sec. Nº:17)

FRZB T23549C

GM15204 A1/A1 AS1 T ACAGTACTTGAACAAGAAAGACTTAT (Id. de Sec. Nº:18)

FRZB T23549C

GM15889 A1/A2 AS2 C ACAGTACTTGAACAAGAAAGACTTAC (Id. de Sec. Nº:19)

FRZB T23549C

NA14700 A1/A2 Común ACTGTTCTAAATCTTAGCTGTCCTATTC (Id. de Sec. Nº:20)

FRZB G24791A

GM10347 A1/A1 AS1 G CTCCCTTTTGACAAATCTACTG (Id. de Sec. Nº:21)

FRZB G24791A

GM11235 A1/A2 AS2 A TCTCCCTTTTGACAAATCTACTA (Id. de Sec. Nº:22)

FRZB G24791A

GM13625 A2/A2 Común GAAACTACCCTCCAGTAAGTTCTTC (Id. de Sec. Nº:23)

FRZB C26794G

GM11318 A1/A1 AS1 C TTCGGGATTTAGTTGCG (Id. de Sec. Nº:24)

FRZB C26794G

GM10873 A1/A2 AS2 G TTCGGGATTTAGTTGCC (Id. de Sec. Nº:25)

69 

FRZB C26794G

NA14683 A2/A2 Común GTCTGGCAGGAACTCGAACC (Id. de Sec. Nº:26)

FRZB G27014A

GM05045 A1/A1 AS1 G TGGGGGCAGACTCTTAAG (Id. de Sec. Nº: 27)

FRZB G27014A

GM10873 A1/A2 AS2 A TGGGGGCAGACTCTTAAA(Id. de Sec. Nº: 28)

FRZB G27014A

NA14683 A1/A2 Común CATGATTAGTGAAATAGAAAACTCACA (Id. de Sec. Nº:29)

FRZB T19575G

GM10347 A1/A1 AS1 T GACTGAAGAAGTCAAGTTTGAGT (Id. de Sec. Nº:30)

FRZB T19575G

GM04340 A1/A2 AS2 G ACTGAAGAAGTCAAGTTTGAGG (Id. de Sec. Nº:31)

FRZB T19575G

GM13626 A1/A2 Común TGAACAGCAGAGCACTTTGAT (Id. de Sec. Nº:32)

FRZB T2303723C

GM12548 A1/A1 AS1 T GTCGGCATTCTTATCATTCA (Id. de Sec. Nº:33)

FRZB T2303723C

GM14663 A1/A2 AS2 C CGGCATTCTTATCATTCG (Id. de Sec. Nº: 34)

FRZB T2303723C

GM14667 A2/A2 Común AATAAGTCTCATCCATACTCAACCC (Id. de Sec. Nº:35)

La amplificación de PCR se realizó en un volumen total de reacción de 50 µl que contenían los siguientes reactivos: 3,5 ng de DNA genómico humano purificado, 0,2 µM de cada cebador (un cebador común y un cebador específico de alelo), 50 µM de dATP, dCTP, dGTP, 25 µM de dTTP, 75 µM de dUTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 3 mM MgCl2, 0,02U UNG (uracil-n-glucosilasa), DMSO al 4%, glicerol al 2%, 0,2X SYBR™ Green, 12 unidades CEA2 DNA polimerasa

Gold™*. *desarrollada y fabricada por Hoffmann-La Roche. Con la CEA2 Gold se añade 0,5% de glicerol. Con el SYBR Green se añade 1% de DMSO.

La PCR se analizó en un sistema de detección de secuencia GeneAmp 5700 (ABI) midiendo la fluorescencia del SYBR™ Green I (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) a tiempo real (Higuchi, R. et al., 1993, Biotechnology 11:1026-30), como sigue: 50°C durante 2 min., 95°C durante 12 min., 95°C durante 20 s. y 58°C durante 20

s. repetido durante 45 ciclos.

Todos los cebadores que se muestran en la Tabla 2 utilizados bajo estas condiciones resultaron en el genotipo correcto conocido de cada SNP para cada línea celular. Por lo tanto, el ensayo de genotipificación puede utilizarse para un posterior análisis de los SNP. Las líneas celulares se utilizaron como controles positivos en un posterior análisis.

Ejemplo 2: Análisis de agrupamiento para identificar enfermedades asociadas con SNP de FRZB conocidos

El análisis de agrupamiento se utilizó para facilitar el cribaje de genes candidatos (por ejemplo, el gen FRZB) que se cree que está asociado con la osteoporosis. Una gran diferencia de la frecuencia de alelos entre los grupos de DNA de pacientes y de los controles es indicativo de una posible implicación de un gen en estas condiciones. En lugar de genotipar un gran número de muestras, medir la frecuencia de alelo de un conjunto único compuesto de las mismas cantidades de estas muestras permite el análisis rápido de un gran número de genes candidatos.

En la Tabla 1 se listan once ejemplos de SNP en el gen

humano FRZB. Las frecuencias de alelo de estos SNP se midieron

utilizando PCR cuantitativa específica de alelo, en conjuntos de muestras del Estudio de Fracturas Osteoporóticas (EFO), utilizando el método de Germer, et al., Genome Research, 10:258-266 (2000) como se describe en el Ejemplo 1. El Estudio de Fracturas Osteoporóticas (Kado, et al., Arch. Intern. Med. 159:1215-1220 (1999)) incluye DNA obtenidos de mujeres de 65 años o más que presentan fracturas de cadera, fracturas vertebrales, baja densidad mineral ósea (BMD) o un índice de masa corporal alto (IMC), así como muestras control. El grupo en estudio comprende 1042 muestras de DNA en total.

Determinación de la frecuencia de alelo:

Para medir una frecuencia de alelo de SNP en una mezcla de DNA agrupadas de muestras de individuos, se dividieron las mismas alícuotas del conjunto entre dos reacciones de PCR, cada una de las cuales contiene un primer par específico con una o la otra variante alélica de SNP (por ejemplo, un cebador específico de alelo y un cebador común para cada SNP, como se describe en el Ejemplo 1). La especificidad de la amplificación de PCR se confiere al situar el extremo 3’ de uno de los cebadores (el cebador específico de alelo) directamente sobre y emparejando con una u otra de las variantes de nucleótidos. Esta especificidad puede aumentarse en particular utilizando el fragmento Stoffel de la polimerasa de DNA Taq o variantes de las mismas. Idealmente, sólo los cebadores completamente emparejado se extienden, y sólo el alelo emparejado se amplifica. En la práctica, no obstante, habrá normalmente la amplificación del alelo desemparejado, pero esto debe ocurrir menos eficientemente ya que son necesarias muchos ciclos de amplificación para generar niveles detectables de pro

ducto. La amplificación de desemparejamientos se retrasa frecuentemente en > 10 ciclos cuando la amplificación se monitoriza en un régimen de ciclo tras ciclo utilizando tinciones fluorescentes de unión a dsDNA como el SYBR Green I. Un retraso de alrededor de seis ciclos es adecuado para la determinación de frecuencias de alelo de SNP para los que la frecuencia del alelo menor es superior que un pequeño porcentaje.

Cuando la frecuencia de alelo es del 50%, se espera que cada una de las dos amplificaciones de PCR requieran el mismo número de ciclos para producir la misma señal fluorescente, asumiendo que ambos cebadores específicos de alelo amplifiquen con la misma eficiencia. El número de ciclos antes de que la reacción cruce un umbral predeterminado, el Ct, puede ser una fracción. Cuando un alelo es más frecuente, la amplificación del alelo alcanzará el umbral en un ciclo más temprano, esto es, posee un Ct más pequeña. La diferencia de Ct entre las dos reacciones de PCR, el ΔCt, es una medida del sesgo y así de la frecuencia de alelo. Un retraso de un ciclo indica que la proporción de la cantidad de un alelo respecto al otro es de 1:2, un retraso de dos ciclos, 1:4,

o en general, 1:2 ΔCt. Al convertir una proporción en una frecuencia añadiendo el numerador al denominador resulta en la ecuación

Frecuencia de alelo1 =1/(2 ΔCt+ 1),

En la que ΔCt = (Ct de PCR específica del alelo1) -(Ct de PCR específica del alelo2).

Debe notarse que el ΔCt puede ser positivo o negativo, dependiendo de la PCR específica que presenta el Ct más bajo. El "2" en el denominador es se forma adecuada "1 + la eficiencia inicial de replicación". No obstante, eficiencia inicial de replicación está normalmente cercana al 100% por lo que el "2" es una aproximación adecuada. Las eficiencias de amplificación para las dos PCR específicas de alelo pueden diferir ligeramente. Tal como se discute en Germer et al. (supra), puede medirse y compensarse para realizar el ensayo con un DNA conocido por ser heterozigoto para el SNP de interés. El ΔCt para este DNA puede ser igual a cero si la PCR son igualmente eficientes. Cualquier desviación del cero indica que no lo son. Esta desviación puede sustraerse de todas las mediciones de ΔCt para compensar las eficiencias de amplificación diferenciales.

Cada SNP excepto T2303723C se describieron por esta posición en la referencia del GenBank de la secuencia NT_005100.3. Esta secuencia (con tan sólo 4 exones) se archivó y sustituyó en GenBank con una secuencia más completa que contenía 6 exones (NT_005265), que a su vez se sustituyó por NT_005403. No obstante, la secuencia original en la que se basa la numeración (NT_005100.3) puede obtenerse del GenBank, y los primeros 30.000 nucleótidos de esta secuencia se presentan como Id. de Sec. Nº:1. Así, por ejemplo, el segundo SNP listado en la Tabla 1 se encuentra en la posición 18679 de NT_005100.3 (y de Id. de Sec. Nº:1), en la que un nucleótido "T" está presente como el complementario del nucleótido 18679 de Id. de Sec. Nº:1. El alelo común posee un nucleótido "C" en esta posición. El SNP T2303723C se describió en su posición en la secuencia del GenBank con número de acceso NT_005265. Los SNP están referidos por el Nº de SNP (es decir, por la posición del nucleótido en Id. de Sec. Nº:1 o NT_005265, como se la indicado antes, aunque el(los) nucleótido(s) indicados

ocupen la posición indicada o su complementario, dependiendo del SNP en particular; véase la Figura 1) en el texto posterior. De forma similar, los SNP pueden localizarse en cualquier secuencia FRZB realizando un alineamiento de secuencia con las secuencias de cebadores específicas de alelo listadas en la Tabla 2. Los SNP pueden también localizarse de forma inequívoca en la base de datos del NCBI dbSNP (http://www.ncbi. n1m.nih.gov/SNP/index.html) a través del número de fuente de SNP listado en la Tabla 1.

Las muestras agrupadas se denominaron de la A a la D (véase, por ejemplo, la Tabla 3). El criterio de agrupamiento de A fue fractura de cadera (cualquier incidente de fractura de cadera desde línea de base, con exclusión de fractura de cadera anterior a los 50 años). El criterio de agrupamiento de B fue fractura vertebral (cualquier incidente de fractura mediante morfometría entre la línea basal y la visita 3). El criterio de agrupamiento de C fue DMO baja (densidad mineral ósea, definida como tener una DMO de cadera de puntuación T <-2,5). El criterio de agrupamiento de D (control) fue ausencia de fractura desde los 50 años y DMO de cadera de puntuación Z > 1,285. El criterio de agrupamiento de IMC alto fue un índice de masa corporal dentro del 5% de mayor índice de entre los participantes del SOF y el criterio para el agrupamiento de IMC bajo fue un índice de masa corporal dentro del 5% de menor índice de entre los participantes del SOF.

Los grupos involucrados que combinan las mismas cantidades de DNA de pacientes con cada criterio específico. El grupo A incluye 275 muestras de pacientes; el grupo B contiene 262 muestras de pacientes; el grupo C incluye 276 muestras de pacientes; y el grupo D contiene 278 muestras de pacientes. El grupo de IMC alto

contiene 141 muestras y el grupo de IMC bajo contiene 82 muestras. Las PCR se realizaron en 4 réplicas utilizando los cebado-res y el protocolo descrito en el Ejemplo 1 excepto que las PCR contenían 10 ng de DNA genómico humano purificado y 2 uM de Rox. 5 Las medias de las cuatro réplicas se calcularon, y las frecuencias de alelo se calcularon entonces siguiendo el método anterior y se compararon con los controles. Un cambio en la frecuencia de alelo de más de aproximadamente 4-5% se consideró significativo. Los resultados de agrupamiento para cada SNP de FRZB se muestran

10 en la Tabla 3 a continuación. Tabla 3: Resultados de agrupamiento de FRZB

Frecuencia media de alelo I (%)

Cambio en la Frecuencia de alelo I (%)

Grupo

A B C D IMC bajo IMC alto A-D B-D C-D IMC bajo-IMC alto

FRZB_ C18679T

66,38 61,81 69,06 63,79 71,02 65,75 2,59 -1,98 5,27 5,27

FRZB_ G19524A

74,12 68,57 71,49 68,6 81,69 67,6 5,52 -0,03 2,89 14,09

FRZB_ T22242A

74,66 69,91 72,74 70,14 82,27 72,18 4,52 -0,23 2,60 10,09

FRZB_ G23043A

88,01 91,66 91,15 88,65 88,79 88,89 -0,63 3,01 2,50 -0,10

FRZB_ G23415A

83,69 89,48 88,86 84,90 85,30 86,26 -1,21 4,58 3,96 -0,96

FRZB_ T23549C

98,30 97,89 97,33 98,56 97,77 97,02 -0,26 -0,67 -1,22 0,75

76 

FRZB_ A24791G

50,53 56,92 55,67 56,26 46,12 61,57 -5,73 0,66 -0,59 -15,45

FRZB_ C26794G

82,22 81,82 78,24 82,23 80,5 76,66 0,0 -0,41 -3,99 3,84

FRZB_ G27014A

96,79 98,69 96,54 95,5 98,62 96,1 1,29 3,2 1,04 2,52

A Fractura de cadera B Fractura Vertebral C DMO bajo D Control

Ejemplo 3: Genotipificación de individuos

Debido a las diferencias significativas en la frecuencia de alelo entre algunos casos osteoporóticos y grupos control y entre los grupos de IMC alto y bajo, las muestras de individuo se geno

5  tiparon para verificar las diferencias en la frecuencia de alelo y para determinar las frecuencias de genotipo en estos grupos. El mismo protocolo específico de alelo se utilizó en las muestras de DNA de los individuos para determinar sus genotipos. Las amplificaciones de PCR se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.

10  Los cebadores utilizados para genotipar los SNP de FRZB son los que se muestran en la Tabla 2. Estos resultados se analizaron utilizando la Chi cuadrado de Pearson (o un Test Exacto si el número de sujetos con uno de los genotipos fue de 10 o menos) para determinar si la distribución de las frecuencias de genotipo fue

15  ron significativamente diferentes entre los grupos de individuos que poseen cualquiera de los fenotipos osteoporóticos y controles y entre los grupos de individuos con IMC alto (es decir, obesidad) e IMC bajo.

Se demostró una asociación significativa entre un IMC alto y los SNP de FRZB_T2303723C, FRZB_C18679T, FRZB_ G19524A y FRZB_T22242A (p < 0,45). También se demostró una asociación menor entre un IMC alto y el SNP FRZB_A24791G (p<0,1). Se demostró que cada uno de los alelos T de T2303723C, el alelo T de C18679T, el alelo A de G19524A, el alelo A de T22242A, y el alelo G de A24791G estaban asociados con un IMC alto (y así, con un riesgo alto de padecer obesidad). La asociación es más estadísticamente significativa si el efecto de cada uno de los alelos se asume que es recesivo.

Respecto a la osteoporosis, se demostraron asociaciones significativas entre el aumento de la incidencia de fractura vertebral y los SNP FRZB_C26794G y FRZB_G27014A (p < 0,05). También se demostró una asociación menor entre una incidencia alta de fractura de cadera y el SNP FRZB_C18679T (p<0,1), así como entre una incidencia alta de fractura de cadera y el SNP FRZB_G19524A (p<0,1). Se demostró que cada uno de los alelos C de C18679T, el alelo G de G19524A, el alelo C de C26794G, y el alelo G de G27014A estaban asociados con una incidencia alta de fractura de cadera o fractura vertebral (y así, con un riesgo alto de sufrir osteoporosis). La asociación es más estadísticamente significativa si el efecto de cada uno de estos alelos se asume que es recesivo.

Además, vale la pena señalar que tras el ajuste de peso y edad de los pacientes, el alelo A de A24791G está asociado con un aumento de la incidencia de fractura de cadera (p<0,1, asumiendo que el alelo A es recesivo). De forma similar, al utilizar un grupo control alternativo (definido como ausencia de fractura

desde los 50 años y el 5% mayor de DMO de cadera en los individuos del grupo de edad de 5 años), el alelo T de T22242A está asociado con un aumento de la incidencia de fractura de cadera. De nuevo, la asociación es más estadísticamente significativa si

5 el efecto de este alelo se asume que es recesivo. Asociación de los SNP de FRZB con la obesidad en mujeres Este ejemplo demuestra la asociación de los SNP de FRZB con

la obesidad en mujeres. Como se ha señalado anteriormente, la genotipificación de

10  FRZB se llevó a cabo en mujeres del Estudio de Fracturas Osteoporóticas (SOF), utilizando un método de genotipificación esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1. La Tabla 4 describe los resultados de genotipificación para los cuatro SNP de FRZB indicados y los números y porcentajes de individuos en cada cate

15 goría de IMC para cada genotipo. Tabla 4: Asociación del genotipo FRZB con el IMC

C18679T

G19524A

IMC

Nº % IMC Nº % Distribución total de G19524A P=,0051

T/T

Alto 18 12,8 A/A Alto 14 10,0

Bajo

3 3,7 Bajo 0 0,0

T/C

Alto 55 39,0 A/G Alto 50 35,5

Bajo

38 46,3 Bajo 30 36,6 Modelo en que 19524A es alelo recesivo P=,0032

C/C

Alto 68 48,2 G/G Alto 77 54,6

Bajo

41 50,0 Bajo 52 63,4

Nº Total IMC alto=141; Nº Total IMC bajo=82

T22242A

A24791G

IMC

Nº % IMC Nº %

A/A

Alto 15 10,7 G/G Alto 36 25,5

Bajo

2 2,4 Bajo 13 15,9

A/T

Alto 57 40,4 G/A Alto 69 48,9

Bajo

32 39,0 Low 43 52,4

T/T

Alto 69 48,9 A/A Alto 36 25,5

Bajo

48 58,5 Bajo 26 31,7

Análisis estadístico, métodos y algoritmos: Se evaluó la asociación de los genotipos de FRZB con la obesidad utilizando un test de Chi-cuadrado de Pearson o, si el número de sujetos con uno de los genotipos fue de 10 o menos, el test exacto de Fisher.

5  La Tabla 4 muestra los valores p (probabilidades) de la distribución de genotipos en el SNP G19524A entre los grupos de IMC alto y baja que pueden obtenerlo meramente por probabilidad. Esto se ha visto que es bastante improbable. Así existe una asociación estadística entre G19524A y el IMC. El valor p es aún inferior si

10 se asume que los alelos minoritarios, 19524A, ejercen su efecto genético de forma recesiva (son necesarios dos alelos 19524A). Asociación de FRZB con osteoporosis en muestras de SOF Este ejemplo demuestra la asociación de SNP de FRZB con la osteoporosis en muestras de SOF.

15 La Tabla 5 describe los resultados de la genotipificación de SNP C26794G de FRZB y los números y porcentajes de individuos en la categoría de fractura vertebral y control para cada genotipo. Tabla 5: Asociación del genotipo FRZB con la fractura ver

20 tebral

C26794G (Arg -> Gly)

fractura

Nº % Distribución total P=,025

G/G

No 1 0,4

Sí

2 0,8

G/C

No 52 18,7

Sí

29 11,1

C/C

No 225 80,9

Sí

231 88,1

Nº Total de fracturas vertebrales =262; Nº Total de control =278

Análisis estadístico, métodos y algoritmos: Se evaluó la

asociación de los genotipos de FRZB con la osteoporosis utilizando un test de Chi-cuadrado de Pearson o, si el número de sujetos con uno de los genotipos fue de 10 o menos, el test exacto de Fisher. La Tabla 5 muestra los valores p (probabilidades) de la distribución de genotipos de C26794G entre la fractura vertebral y los grupos control que pueden obtenerlo meramente por probabilidad. Esto se ha visto que es bastante improbable. Así existe una asociación estadística entre C26794G y la fractura vertebral. C26794G imparte una sustitución (aminoácido) de código (arginina por glicina) en la secuencia de proteínas de FRZB.

Como FRZB es un componente pequeños del sistema complejo de genes asociados con la obesidad y/o osteoporosis (que se cree que está relacionada ya que las células óseas y adiposas se originan de las mismas ramas de la ruta de desarrollo), el efecto del locus FRZB se espera que sea variable. Otros factores, como los hábitos alimentarios, ejercicio, dieta, salud general y la presencia de enfermedades asociadas, pueden ejercer un efecto dominante que, en algunos casos, pueden enmascarar el efecto de los genotipos FRZB. Además, ya que las frecuencias de alelo en otros loci relevantes para las enfermedades relacionadas con el peso y los huesos difieren entre populaciones y, así, las poblaciones presentas diferentes riesgos para dichas enfermedades, se espera que el efecto del genotipo FRZB pueda ser de diferente magnitud en algunas poblaciones. Aunque la contribución del genotipo FRZB pueda, en ciertas poblaciones, ser relativamente menor por sí misma, la genotipificación en el locus FRZB proporciona información que es, sin embargo, útil para una caracterización de la predisposición de un individuo hacia la obesidad y/o osteoporo

sis. La información del genotipo de FRZB puede ser particularmente útil cuando se combina con la información del genotipo de otro loci y/o análisis clínico para la obesidad y/o osteoporosis, por ejemplo.

5 Aunque la invención se ha descrito en el contexto de ciertas realizaciones y ejemplos, los expertos en la materia entenderán que la invención se extiende más allá de las realizaciones específicamente descritas incluyendo realizaciones y/o usos alternativos y modificaciones evidentes y equivalentes de los mis

10  mos. De acuerdo con esto, la invención no pretende limitar mediante las descripciones específicas de realizaciones preferibles de este documento, sino en referencia a las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS EN EL GEN FRZB CON LA OBESIDAD Y LA OSTEOPOROSIS

<130> 21634 WO

<150> US 60/464,372

<151> 2003-04-21

<150> US 60/526,689

<151> 2003-12-01

<160> 35

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 30000

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (7061)..(7160)

<223> n sin identificar (a, c, g o t)

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (7344)..(7344)

<223> n sin identificar (a, c, g o t)

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (7438)..(7438)

<223> n sin identificar (a, c, g o t)

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (7509)..(7608)

<223> n sin identificar (a, c, g o t)

<220> 5 <221> característica miscelánea

<222> (28902)..(28902)

<223> n sin identificar (a, c, g o t)

<220>

<221> característica miscelánea 10 <222> (28954)..(28954)

<223> n sin identificar (a, c, g o t)

<400> 1

imagen1

imagen2

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imagen18

<210> 2

<211> 2058

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

imagen19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3 atagtaggag gagtactgtg tcg 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4 aatagtagga ggagtactgt gtca 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5 ccctgtggac tatcacctaa tgtt 24

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6 ataggccatc agttgtgc 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7 cataggccat cagttgtgt 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8 tcaaagtgct ctgctgttca c 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9 gatcttattt cctccatctg ct 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10 atcttatttc ctccatctgc a 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11 cgtgagggaa aggaatgttg 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12 ttgtctttta tcccagtcat tc 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13 ttgtctttta tcccagtcat tt 22

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14 catcatggca cttagtcttt atctc 25

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15 aaaaatgtaa acctataaac tacacg 26

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16 gaaaaatgta aacctataaa ctacaca 27

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17 tcttgatttc atatatggaa tgggt 25

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18 acagtacttg aacaagaaag acttat 26

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19 acagtacttg aacaagaaag acttac 26

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20 actgttctaa atcttagctg tcctattc 28

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21 ctcccttttg acaaatctac tg 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22 tctccctttt gacaaatcta cta 23

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23 gaaactaccc tccagtaagt tcttc 25

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24 ttcgggattt agttgcg 17

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25 ttcgggattt agttgcc 17

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26 gtctggcagg aactcgaacc 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 27 tgggggcaga ctcttaag 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 28 tgggggcaga ctcttaaa 18

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29 catgattagt gaaatagaaa actcaca 27

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 30 gactgaagaa gtcaagtttg agt 23

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31 actgaagaag tcaagtttga gg 22

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 32 tgaacagcag agcactttga t 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33 gtcggcattc ttatcattca 20

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34 cggcattctt atcattcg 18

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35 aataagtctc atccatactc aaccc 25

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para determinar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis, que comprende: la detección de la presencia de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis en un gen FRZB en una muestra de ácido nucleico del individuo, en el que la presencia de al menos dicho polimorfismo proporciona una indicación del riesgo del individuo de padecer osteoporosis, y en el que al menos un polimorfismo se selecciona de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de al menos un polimorfismo comprende dos o más polimorfismos.

3. 3. El método de la reivindicación 2, en el que los dos

   o más polimorfismos se seleccionan de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de al menos un polimorfismo se detecta mediante secuenciación.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de al menos un polimorfismo se detecta mediante amplificación.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1, en el que la detección comprende:

   -poner en contacto la muestra de ácido nucleico con al menos un oligonucleótido específico de secuencia bajo condiciones que permiten la unión del oligonucleótido a la muestra de ácido nucleico, en el que el conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende el conjunto de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis; y,

   -detectar la hibridación del conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia con la muestra de ácido nucleico.
7. 7. El método de la reivindicación 1, en el que la detección comprende:

   -amplificar la muestra de ácido nucleico, proporcionando así una muestra de ácido nucleico amplificado;

   -poner en contacto la muestra de ácido nucleico amplificado con al menos un oligonucleótido específico de secuencia bajo condiciones que permiten la unión del oligonucleótido a la muestra de ácido nucleico amplificado, en el que el conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende el conjunto de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis; y,

   -detectar la hibridación del conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia con la muestra de ácido nucleico amplificado.
8. 8. Un método para determinar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis, método que comprende: determinar el genotipo del individuo en uno o más sitios polimórficos en un gen FRZB, en el que un primer genotipo en dichos uno

   o más sitios polimórficos está asociado estadísticamente con un aumento del riesgo de padecer osteoporosis comparado con un segundo genotipo en dichos uno o más sitios polimórficos, y en el que dicho primer genotipo comprende dos ale- los C y dicho segundo genotipo comprende dos alelos T o un alelo T y un alelo C del SNP C18679T, dicho primer genotipo comprende dos alelos G y dicho segundo genotipo comprende dos alelos A o un alelo A y un alelo G del SNP G 19524A, dicho primer genotipo comprende dos alelos A y dicho segundo genotipo comprende dos alelos G o un alelo G y un alelo A del SNP A24791G, dicho primer genotipo comprende dos ale- los C y dicho segundo genotipo comprende dos alelos G o un alelo C y un alelo G del SNP C26794G, y/o dicho primer genotipo comprende dos alelos G y dicho segundo genotipo comprende dos alelos A o un alelo G y un alelo A del SNP G27014A.
9. 9. Un equipo para detectar la presencia de un primer polimorfismo de predisposición o protector en un gen FRZB en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de padecer osteoporosis se está valorando, y el equipo comprende: uno o más oligonucleótidos iniciales capaces de detectar dicho primer polimorfismo e instrucciones para detectar dicho primer polimorfismo con dicho conjunto de uno

   o más oligonucleótidos iniciales y para correlacionar dicha

   detección con el riesgo del individuo de padecer osteoporosis, empaquetado en uno o más contenedores; en el que dicho primer polimorfismo se selecciona de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A, y en el que dicho polimorfismo de predisposición comprende el alelo C del SNP C18679T, el alelo G del SNP G19524A, el alelo A del SNP A24791G, el alelo C del SNP C26794G, y/o el alelo G del SNP G27014A y/o dicho polimorfismo protector comprende el alelo T del SNP C18679T, el alelo A del SNP G19524A, el alelo G del SNP A24791G, el alelo G del SNP C26794G y/o el alelo A del SNP G27014A.
10. 10. El equipo de la reivindicación 9, en el que el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende al menos una sonda.
11. 11. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 9

    o 10, en el que los oligonucleótidos iniciales son completamente complementarios a la región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo.

12. 12.

    El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de 9 a 11, en el que el conjunto de uno o más de los oligonucleótidos iniciales comprende uno o más cebadores.

13. 13.

    Un chip para detectar la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición y/o protectores en un gen FRZB en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de padecer osteoporosis se está valorando, y que

    comprende:

    -una serie de oligonucleótidos, en la que cada uno de los oligonucleótidos hibrida con una región del gen FRZB que comprende al menos uno de los polimorfismos, en la que

    5  dicha hibridación detecta la presencia del polimorfismo, y en la que dicha detección proporciona una indicación del riesgo del individuo de padecer osteoporosis; y,

    -un sustrato sobre el que se inmovilizan la serie de oligonucleótidos y en el que se selecciona al menos uno de

    10  entre el conjunto de uno o más polimorfismos del grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A.

    15  14. Un sistema, que comprende: el chip de la reivindicación 13 y las instrucciones del sistema para correlacionar dicha detección de la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores con el riesgo del individuo de padecer osteoporosis.