ES2351686T3 - Método para la amplificación de alelos hla de clase i. - Google Patents
Método para la amplificación de alelos hla de clase i. Download PDFInfo
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Abstract
Método para tipar o subtipar uno o más alelos HLA-A en una muestra, que comprende las siguientes etapas: (i) si es necesario, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra; (ii) amplificar de forma separada, específica del locus, el exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-A, haciendo uso de al menos tres conjuntos de cebadores, en los que - para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 de HLA-A, - para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 de HLA-A, y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 3 de HLA-A, y - para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 3 de HLA-A; (iii) tipar el alelo HLA-A específico presente en dicha muestra.
Description
Método para la amplificación de alelos HLA de
clase I.
La presente invención se refiere a un método
para el tipado o subtipado de HLA-A. Más
específicamente, la presente invención se refiere a un método para
la amplificación separada, específica del locus, del exón 2, exón 3
y exón 4 de HLA-A.
El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)
humano está contenido en alrededor de 4 Mpb de ADN en el brazo corto
del cromosoma 6 en 6p21.3 (Campbell y Trowsdale, 1993). El MHC
humano se divide en las regiones de clase I, clase II y clase III.
Los genes de clase I y clase II codifican moléculas de la superficie
celular muy polimórficas que se unen y presentan antígenos
procesados en forma de péptidos a linfocitos T, iniciando respuestas
inmunitarias tanto celulares como humorales.
Las moléculas de clase I del MHC humano,
HLA-A, -B, y -C, se encuentran en la mayoría de las
células nucleadas. Son glucoproteínas de la superficie celular que
se unen y presentan péptidos procesados derivados de proteínas
endógenamente sintetizadas a células T CD8+. Estos heterodímeros
consisten en una cadena \alpha codificada por HLA asociada con un
polipéptido monomórfico no codificado por MHC,
\beta_{2}-microglobulina (Townsend y Bodmer,
1989; Spencer y Parham, 1996). Las moléculas de clase II del MHC
humano están codificadas en la región de HLA-D.
Estas glucoproteínas de la superficie celular consisten en una
cadena \alpha y \beta codificada por HLA, asociada con
heterodímeros sobre la superficie celular de células que presentan
antígenos, tales como células B y macrófagos. Las moléculas de
clase II sirven como receptores para péptidos procesados. Sin
embargo, estos péptidos derivan predominantemente de proteínas
membránicas y extracelulares, y se presentan a células T CD4+. La
región de HLA-D contiene varios genes de clase II, y
tiene tres subregiones principales: HLA-DR, -DQ, y
-DP. Tanto las regiones HLA-DQ como -DP contienen un
gen funcional para cada una de sus cadenas \alpha y \beta. La
subregión de HLA-DR contiene un gen funcional para
la cadena \alpha; el número de genes funcionales para la cadena
\beta varía de uno a dos según el haplotipo (Andersson et
al., 1987: Apple y Erlich, 1996).
Existe un amplio polimorfismo en la mayoría de
los locus. A la vista de la importancia biológica y médica de estos
antígenos, se requiere una técnica rápida y muy sensible para el
tipado de HLA. Actualmente se usa una variedad de técnicas para
detectar el polimorfismo de HLA, incluyendo el reconocimiento
serológico, bioquímico, de células T y, más recientemente, métodos
biológicos moleculares.
La serología sigue siendo el método de sostén
para el tipado de HLA - especialmente para clase I - para muchos
laboratorios de histocompatibilidad rutinarios. El microensayo de
linfocitotoxicidad (Kissmeyer et al., 1969; Terasaki y
McClelland, 1964) es el enfoque estándar: se mezclan células
mononucleares de sangre periférica (clase I) viables o células B
separadas (clase II) con antisueros (policlonales o monoclonales) de
especificidad por HLA conocida.
La detección del polimorfismo se puede lograr
observando la diferente composición de aminoácidos de las moléculas
de HLA mediante técnicas bioquímicas tales como el enfoque
isoeléctrico unidimensional (IEF; Yang, 1987). Este método se basa
en sustituciones de aminoácidos que contribuyen a cambios en la
carga de la molécula de
HLA.
HLA.
Otro método de tipado de HLA es la reacción
linfocitaria mixta (MLR). Concurrente con las observaciones
realizadas usando antisueros específicos de HLA, se observó que los
linfocitos procedentes de dos fuentes no relacionadas, cuando se
mezclan en cultivo, proliferan (Hirschom et al., 1963).
El análisis de las especificidades de HLA a
partir de ADN proporcionó un nuevo enfoque para definir sus
diferencias polimórficas. En lugar de fijarse en las diferencias en
la molécula expresada, el polimorfismo se caracteriza a nivel
nucleotídico.
Un desarrollo importante y poderoso en el campo
de la biología molecular ha sido la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR; Mullis et al., 1986; Mullis y Faloona,
1987). En el tipado tisular, la PCR se usa para amplificar las
regiones polimórficas de genes de HLA. Este producto de la PCR de
HLA se puede analizar entonces en busca de sus diferencias
polimórficas, para establecer el tipo de tejido. Se ha desarrollado
un número de tales enfoques, incluyendo el análisis de heterodúplex
de productos de la PCR (Clay et al., 1994), el análisis de
polimorfismo conformacional monocatenario del producto de la PCR
(PCR-SSCP; Yoshida et al., 1992), el tipado a
base de secuencias (SBT; Santamaria et al., 1992 y 1993), el
uso de cebadores específicos de secuencias en la reacción de PCR
(PCR-SSP; Olerup y Zetterquist, 1991), el uso de PCR
en combinación con el sondaje oligonucleotídico específico de
secuencias (PCR-SSOP; Saiki et al., 1986) o
el sondaje mediante transferencia de punto inversa (Saiki et
al., 1989). Estos enfoques, usados de forma individual o en
combinación, se han aplicado todos como métodos basados en ADN para
el tipado tisular de las especificidades de HLA de clase I y clase
II. Los métodos de tipado de ADN se deberían de preferir con
respecto a los métodos serológicos con la condición de que esté
disponible un método de tipado de ADN fácil, rápido y fiable.
Algunas diferencias a nivel de subtipo, que son detectables mediante
los métodos de ADN, pueden no ser detectadas mediante los métodos
actuales de tipado serológico, aunque estas diferencias pueden
provocar rechazo de haloinjertos (Fleischhauer et al.,
1990).
El sistema de HLA es el sistema genético humano
más polimórfico todavía conocido. Los genes de HLA clase I comparten
una estructura similar (desde 5' a 3'): una región de flanqueo no
traducida en 5', un primer exón (exón 1) que tiene una longitud de
aproximadamente 73 pares de bases, un primer intrón (intrón 1) que
tiene una longitud de aproximadamente 130 pares de bases, un segundo
exón (exón 2), que tiene una longitud de aproximadamente 250 pares
de bases, un segundo intrón (intrón 2), que tiene una longitud de
aproximadamente 272 pares de bases, un tercer exón (exón 3), que
tiene una longitud de aproximadamente 276 pares de bases, un tercer
intrón (intrón 3), que tiene una longitud de aproximadamente 588
pares de bases, y un cuarto exón (exón 4), que tiene una longitud de
aproximadamente 276 pares de bases. Las sustituciones polimórficas
en los alelos HLA de clase I están mayoritariamente localizados
tanto en el exón 2 como en el exón 3, que codifican la ranura de
unión a péptidos de la molécula de clase I. Estos polimorfismos
hacen una diferenciación entre alelos que se pueden lograr a través
de una variedad de técnicas biológicas moleculares, tales como
secuenciación o hibridación con sondas relevantes. En los kits de
diagnóstico actuales, el exón 2 y el exón 3, se amplifican juntos,
dando como resultado amplicones de alrededor de 1 kb, que consisten
en al menos el exón 2, el intrón 2 y el exón 3. Existen cebadores
específicos del locus para la amplificación de estos amplicones de 1
kb. Sin embargo, tales amplicones grandes son difíciles de
amplificar y muestran una formación de estructura secundaria, dando
como resultado la hibridación ineficaz de algunas sondas. Además,
debido a la aparición de nuevos alelos HLA de clase I, ya no se
pueden distinguir ciertas combinaciones alélicas mediante la
detección de polimorfismos sólo en el exón 2 y en el exón 3, y se
requiere un tipado adicional en el exón 4. Esto provoca la necesidad
de la amplificación adicional del exón 4, dando como resultado un
amplicón incluso más grande. Por lo tanto, sería deseable una
amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4, dando como
resultado productos de amplificación que permiten un tipado más
eficaz de alelos HLA de clase I. Sin embargo, puesto que los sitios
de hibridación a cebadores específicos del locus son escasos y no se
pueden encontrar en el exón 2, exón 3 o exón 4, la amplificación
separada y específica del locus del exón 2, exón 3 y exón 4 de
HLA-A, HLA-B o HLA-C
no es tan evidente.
En los documentos in WO 99/07883, WO 97/23645,
WO 98/26091, por ejemplo, se describen métodos y kits para el tipado
de HLA-A a base de la amplificación de exones 2 y 3.
En los documentos EP-A-0414469, WO
97/23650, WO 97/20197 se describen, por ejemplo, cebadores
específicos de HLA-A.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un método para la amplificación específica del locus y
separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de alelos
HLA-A.
Es un objetivo más específico de la presente
invención proporcionar un método para una amplificación de una sola
etapa, específica del locus, separada de los tres exones, exón 2,
exón 3 y exón 4, de HLA-A.
Se describen además aquí cebadores para uso en
un método para la amplificación separada, específica del locus, del
exón 2 de los alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C,
cebadores para uso en un método para la
amplificación separada, específica del locus, del exón 3 de los
alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C,
cebadores para uso en un método para la
amplificación separada, específica del locus, del exón 4 de los
alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C,
un conjunto de cebadores para uso en un método
para la amplificación separada, específica del locus, del exón 2 de
los alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C,
un conjunto de cebadores para uso en un método
para la amplificación separada, específica del locus, del exón 3 de
los alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C,
un conjunto de cebadores para uso en un método
para la amplificación separada, específica del locus, del exón 4 de
los alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C,
una mezcla de cebadores múltiple para uso en un
método para la amplificación separada, específica del locus, en una
etapa, del exón 2 y del exón 3 de HLA-A,
HLA-B o HLA-C,
una mezcla de cebadores múltiple para uso en un
método para la amplificación separada, específica del locus, en una
etapa, del exón 2 y del exón 4 de HLA-A,
HLA-B o HLA-C,
una mezcla de cebadores múltiple para uso en un
método para la amplificación separada, específica del locus, en una
etapa, del exón 3 y del exón 4 de HLA-A,
HLA-B o HLA-C,
una mezcla de cebadores múltiple para uso en un
método para la amplificación separada, específica del locus, en una
etapa, del exón 2, del exón 3 y del exón 4 de HLA-A,
HLA-B o HLA-C.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un método mejorado para el tipado o subtipado de uno o
más alelos HLA-A en una muestra.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un kit de diagnóstico mejorado para el tipado o
subtipado de uno o más alelos HLA-A en una
muestra.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar un ensayo de sondas en líneas para el tipado
o subtipado de uno o más alelos HLA-A en una
muestra.
La presente invención se refiere a un método
para la amplificación separada, específica del locus, del exón 2,
exón 3 y exón 4 de alelos HLA-A, haciendo uso de al
menos un primer conjunto de cebadores, en el que:
- -
- para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 de HLA-A;
- -
- para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 de HLA-A, y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 3 de HLA-A;
- -
- para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 3 de HLA-A.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de amplificación descrito aquí hace
uso así de un conjunto de cebadores de los cuales al menos uno de
los cebadores se hibrida a una secuencia diana específica del locus
en el intrón 2 o en el intrón 3 del gen de HLA de Clase I a fin de
obtener la amplificación separada del exón 2 (sin el exón 3 o el
exón 4), del exón 3 (sin el exón 2 o el exón 4) y/o del exón 4 (sin
el exón 2 o el exón 3).
En el caso en el que se amplifique el exón 2, el
cebador inverso se hibrida a una secuencia diana específica del
locus en el intrón 2, mientras que el cebador directo se puede
escoger para que se hibride a una región en dirección 5' del exón 2
(por ejemplo en el intrón 1 o en el exón 1) o a los nucleótidos
iniciales del exón 2. En una realización preferida, el cebador
directo se hibrida a una región específica del locus en dirección 5'
del exón 2 (por ejemplo en el intrón 1 o en el exón 1) o a
nucleótidos iniciales específicos del locus del exón 2, y el cebador
inverso se hibrida a una secuencia diana específica del locus en el
intrón 2.
En el caso en el que se amplifique el exón 3, el
cebador directo se hibrida a una secuencia diana específica del
locus en el intrón 2, mientras que el cebador inverso se puede
escoger para que se hibride a los nucleótidos finales del exón 3 o
en dirección 5' del exón 3 (por ejemplo, en el intrón 3), o el
cebador inverso se hibrida a una secuencia diana específica del
locus en el intrón 3 mientras que el cebador directo se puede
escoger para que se hibride a una región en dirección 5' del exón 3
(por ejemplo, intrón 2) o a los nucleótidos iniciales del exón 3. En
una realización preferida, el exón 3 se amplifica mediante uso de un
conjunto de cebadores de los cuales el cebador directo se hibrida a
una secuencia diana específica del locus en el intrón 2, y el
cebador inverso se hibrida a una secuencia diana específica del
locus en el intrón 3.
En el caso en el que se amplifique el exón 4, el
cebador directo se hibrida a una secuencia diana específica del
locus en el intrón 3, mientras que el cebador inverso se puede
escoger para que se hibride a los nucleótidos finales del exón 4 o
en dirección 3' del exón 4 (por ejemplo, en el intrón 4). En una
realización preferida, el cebador directo se hibrida a una secuencia
diana específica del locus en el intrón 3, mientras que el cebador
inverso se hibrida a secuencias diana específicas del locus al final
del exón 4 o en dirección 3' del exón 4 (por ejemplo, en el intrón
4).
Este nuevo método de amplificación dará como
resultado la amplificación de fragmentos de ADN más cortos, que sólo
contienen el exón 2, sólo el exón 3 o sólo el exón 4, que son mucho
más fáciles de amplificar y mucho más fáciles para uso en diferentes
métodos de tipado, tales como secuenciación o hibridación con
diferentes sondas específicas de alelos. De la sección de ejemplos,
está claro que los conjuntos de cebadores que contienen un cebador
que se hibrida a una secuencia diana en el intrón 2 o en el intrón 3
proporcionan una amplificación mucho mejor y más fácil del exón 2,
exón 3 o exón 4 de los alelos HLA de Clase I, y un patrón de
hibridación más claro y pronunciado con las sondas de tipado de
alelos. Ha sido un mérito definir cebadores específicos que permiten
esta amplificación separada del exón 2, exón 3 o exón 4 de sólo un
locus de HLA, mientras que dichos exones de los otros locus de HLA
(es decir, otros genes de HLA clásicos, genes de HLA no clásicos o
pseudogenes) no se coamplifican. Puesto que los amplicones
específicos de \alpha en el producto de amplificación pueden dar
como resultado un tipado defectuoso, el método de amplificación de
la invención ciertamente mejorará la seguridad de los métodos
actuales de tipado.
La expresión "específico del locus"
significa así que el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de un solo
locus (es decir HLA-A, HLA-B o
HLA-C) se amplifica, mientras que el exón 2, exón 3
y/o exón 4 de los otros locus de HLA (es decir, otros genes de HLA
clásicos, genes de HLA no clásicos o pseudogenes) no se amplifica.
De este modo, cuando se usan cebadores específicos para la
amplificación del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-A, el exón 2, el exón 3 y/o el exón 4 de
HLA-B, HLA-C o de otros locus de HLA
no se amplifican. De forma similar, cuando se usan cebadores
específicos para la amplificación del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-B, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-A, HLA-C o de otros locus de HLA
no se amplifican. De forma similar, cuando se usan los cebadores
específicos para la amplificación del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-C, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-A, HLA-B y de otros locus de HLA
no se amplifican. A partir de esto está claro que el exón 2, exón 3
y/o exón 4 de 2, 3 o más locus de HLA diferentes nunca se pueden
amplificar juntos. De este modo, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-A nunca se pueden amplificar en el mismo tubo de
reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B.
De forma similar, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-A nunca se pueden amplificar en el mismo tubo de
reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-C.
De forma similar, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 del
HLA-B nunca se pueden amplificar en el mismo tubo de
reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-C.
De forma similar, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de
HLA-A nunca se pueden amplificar en el mismo tubo de
reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B y
con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-C. Como
consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la
amplificación separada, específica del locus, del exón 2, exón 3 y
exón 4 de alelos HLA-A. Esto significa que la
invención se refiere a un método para la amplificación separada del
exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A.
El término "cebador" se refiere a una
secuencia oligonucleotídica monocatenaria capaz de actuar como un
punto de iniciación para la síntesis de un producto de extensión de
cebador que es complementario a la hebra de ácido nucleico a copiar.
La longitud y la secuencia del cebador debe ser tal que permitan
cebar la síntesis de los productos de extensión. En una realización
específica, la longitud del cebador tiene alrededor de
5-50 nucleótidos. En otra realización específica, la
longitud del cebador tiene alrededor de 10-30
nucleótidos. En otra realización específica, la longitud de los
cebadores tiene alrededor de 20-25 nucleótidos. La
longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad de la
diana de ADN o ARN requerida, así como de las condiciones a las que
se use el cebador, tal como temperatura y fuerza iónica.
La expresión "conjunto de cebadores" o
"par de cebadores" se refiere a un par de cebadores que permite
la amplificación de parte o de todos los exones 2, 3 ó 4 de
HLA-A, HLA-B o
HLA-C. Un conjunto de cebadores siempre consiste en
un cebador directo (o cebador 5') y un cebador inverso (o cebador
3').
Las expresiones "para hibridarse
específicamente" y "se hibrida específicamente" significa
que, durante la etapa de amplificación, dicho cebador forma un
dúplex con parte de su secuencia diana o con toda la secuencia diana
en las condiciones experimentales usadas, y que en esas condiciones
dicho cebador no forma un dúplex con otras secuencias de los ácidos
polinucleicos presentes en la muestra a analizar. Se debería
entender que los cebadores que se diseñan para hibridarse
específicamente a una secuencia diana de un ácido nucleico pueden
caer dentro de dicha secuencia diana, o pueden solapar en gran
medida con dicha secuencia diana (es decir, formar un dúplex con
nucleótidos fuera así como dentro de dicha secuencia diana).
La expresión "secuencia diana" de un
cebador según la presente invención es una secuencia en un intrón 2
o intrón 3 de los alelos HLA de Clase I a la que el cebador es
completamente complementaria o parcialmente complementaria (es
decir, con hasta 20%, 15%, 10% o 5% de desemparejamientos). Se
entenderá que el complemento de dicha secuencia diana es también en
algunos casos una secuencia diana adecuada. El hecho de que los
cebadores de la amplificación no tengan que emparejarse exactamente
con la secuencia diana correspondiente en el molde para garantizar
la amplificación apropiada está ampliamente documentado en la
bibliografía (Kwok et al., 1990). Sin embargo, cuando los
cebadores no son completamente complementarios con su secuencia
diana, se debería tener en cuenta que los fragmentos amplificados
tendrán la secuencia de los cebadores y no de la secuencia
diana.
En una realización, la amplificación se lleva a
cabo en un tubo de reacción con un conjunto de cebadores para la
amplificación del exón 2 como se describe anteriormente (el cebador
inverso se hibrida con una secuencia diana específica del locus en
el intrón 2) y consiguientemente sólo se amplifica el exón 2. En
otra realización, la amplificación se lleva a cabo en un tubo de
reacción con un conjunto de cebadores para la amplificación del exón
3 como se describe anteriormente (el cebador directo se hibrida con
una secuencia diana específica del locus en el intrón 2) y
consecuentemente sólo se amplifica el exón 3.
En otra realización, la amplificación se lleva a
cabo en un tubo de reacción con un conjunto de cebadores para la
amplificación del exón 3 como se describe anteriormente (el cebador
inverso se hibrida con una secuencia diana específica del locus en
el intrón 3) y consiguientemente sólo se amplifica el exón 3.
En otra realización, la amplificación se lleva a
cabo en un tubo de reacción con un conjunto de cebadores para la
amplificación del exón 3 como se describe anteriormente (el cebador
directo se hibrida con una secuencia diana específica del locus en
el intrón 2, y el cebador inverso se hibrida con una secuencia diana
específica del locus en el intrón 3) y consiguientemente sólo se
amplifica el exón 3.
En otra realización, la amplificación se lleva a
cabo en un tubo de reacción con un conjunto de cebadores para la
amplificación del exón 4 como se describe anteriormente (el cebador
directo se hibrida con una secuencia diana específica del locus en
el intrón 3), y consiguientemente sólo se amplifica el exón 4.
En consecuencia, se describe aquí un método para
la amplificación separada del exón 2, exón 3 o exón 4 de alelos HLA
de Clase I.
En otra realización, los diferentes conjuntos de
cebadores implicados en la amplificación del exón 2 y la
amplificación del exón 3 se mezclan y se lleva a cabo en un único
tubo de reacción la amplificación separada tanto del exón 2 como del
exón 3. De este modo, se describe además aquí un método como se
describe anteriormente, caracterizado además porque tanto el exón 2
como el exón 3 de HLA-A, HLA-B o
HLA-C se amplifican mediante uso de una mezcla de
cebadores múltiple que contiene al menos un par de cebadores para la
amplificación del exón 2 y al menos un par de cebadores para la
amplificación del exón 3. En consecuencia, se describe un método
para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 de alelos HLA
de Clase I.
En una realización, los diferentes conjuntos de
cebadores implicados en la amplificación del exón 2 y la
amplificación del exón 4 se mezclan y se lleva a cabo en un único
tubo de reacción la amplificación separada tanto del exón 2 como del
exón 4. De este modo, se describe un método como se describe
anteriormente, caracterizado además porque tanto el exón 2 como el
exón 4 de HLA-A, HLA-B o
HLA-C se amplifican mediante uso de una mezcla de
cebadores múltiple que contiene al menos un par de cebadores para la
amplificación del exón 2 y al menos un par de cebadores para la
amplificación del exón 4. En consecuencia, se describe un método
para la amplificación separada del exón 2 y del exón 4 de alelos HLA
de Clase I.
En otra realización, los diferentes conjuntos de
cebadores implicados en la amplificación del exón 3 y la
amplificación del exón 4 se mezclan y se lleva a cabo en un único
tubo de reacción la amplificación separada tanto del exón 3 como del
exón 4. De este modo, se describe un método como se describe
anteriormente, caracterizado además porque tanto el exón 3 como el
exón 4 de HLA-A, HLA-B o
HLA-C se amplifican mediante uso de una mezcla de
cebadores múltiple que contiene al menos un par de cebadores para la
amplificación del exón 3 y al menos un par de cebadores para la
amplificación del exón 4. En consecuencia, se describe un método
para la amplificación separada del exón 3 y del exón 4 de alelos HLA
de Clase I.
En otra realización, los diferentes conjuntos de
cebadores implicados en la amplificación del exón 2, la
amplificación del exón 3 y la amplificación del exón 4 se mezclan y
se lleva a cabo en un único tubo de reacción la amplificación
separada de los tres exones, el exón 2, exón 3 y exón 4. De este
modo, la presente invención también se refiere a un método como se
describe anteriormente caracterizado además porque los tres exones,
el exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A,
HLA-B o HLA-C se amplifican mediante
uso de una mezcla de cebadores múltiple que contiene al menos un par
de cebadores para la amplificación del exón 2, al menos un par de
cebadores para la amplificación del exón 3 y al menos un par de
cebadores para la amplificación del exón 4.
En consecuencia, la presente invención se
refiere a un método para la amplificación separada del exón 2, exón
3 y exón 4 de alelos HLA de Clase I.
El método de amplificación usado puede ser
reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki et al.,
1988), reacción en cadena de la ligasa (LCR; Landgren et al.,
1988; Wu y Wallace, 1989; Barany, 1991), amplificación a base de
secuencias de ácido nucleico (NASBA; Guatelli et al., 1990;
Compton, 1991), sistema de amplificación a base de transcripción
(TAS; Kwoh et al., 1989), amplificación por desplazamiento de
hebra (SDA; Duck, 1990) o amplificación por medio de Q\beta
replicasa (Lomeli et al., 1989), o cualquier otro método
adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico conocida en la
técnica. También, en el método de la presente invención, se pueden
usar técnicas de TMA (Guatelli et al., 1990) o de ADNb
(Sanchez-Pescador et al., 1988; Urdea et
al., 1991). En una realización específica, el exón 2, exón 3 y
exón 4 de HLA-A se amplifican mediante PCR.
En una realización específica, la presente
invención se refiere a un método como se describe anteriormente,
caracterizado además porque la secuencia diana específica del locus
está situada en una de las siguientes posiciones:
- -
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A (Fig. 1) y/ó 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150, 501, 525, 561 ó 571 (Fig. 4) del intrón 3 de HLA-A.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que estas posiciones contienen todas
ellas nucleótidos específicos del locus, estas posiciones son
particularmente adecuadas para diseñar un cebador eficaz para la
amplificación específica del locus del exón 2, exón 3 o exón 4. Los
cebadores pueden tener diferente longitud. En una realización
específica, la longitud del cebador es alrededor de
5-50 nucleótidos. En otra realización específica, la
longitud del cebador es alrededor de 10-30
nucleótidos. En otra realización específica, la longitud de los
cebadores es alrededor de 20-25 nucleótidos. La
longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad de la
diana de ADN o ARN requerida, así como de las condiciones a las que
se use el cebador, tales como temperatura y fuerza iónica.
En una realización específica, la presente
invención se refiere a un método como se describe anteriormente
caracterizado además porque dichas posiciones constituyen el extremo
3' del cebador que se usar para la amplificación del exón 2, exón 3
o exón 4. De este modo, a partir de las posiciones descritas
anteriormente, se pueden diseñar cebadores directos así como
inversos que tienen su extremo 3' en estas posiciones específicas.
El cebador inverso que tiene su extremo 3' en una de las posiciones
específicas mencionadas anteriormente del intrón 2 permitirá la
amplificación específica del locus del exón 2 del alelo HLA. El
cebador directo que tiene su extremo 3' en una de las posiciones
específicas mencionadas anteriormente del intrón 2 permitirá la
amplificación específica del locus del exón 3 del alelo
HLA-A. El cebador inverso que tiene su extremo 3' en
una de las posiciones específicas mencionadas anteriormente del
intrón 3 permitirá la amplificación específica del locus del exón 3
del alelo HLA-A. El cebador directo que tiene su
extremo 3' en una de las posiciones específicas mencionadas
anteriormente del intrón 3 permitirá la amplificación específica del
locus del exón 4 del alelo HLA-A. Los cebadores
pueden tener diferente longitud. En una realización específica, la
longitud del cebador es alrededor de 5-50
nucleótidos. En otra realización específica, la longitud del cebador
es alrededor de 10-30 nucleótidos. En otra
realización específica, la longitud de los cebadores es alrededor de
20-25 nucleótidos. La longitud y secuencia
específicas dependerán de la complejidad de la diana de ADN o ARN
requerida, así como de las condiciones a las que se use el cebador,
tales como temperatura y fuerza iónica.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un método como se describe anteriormente, caracterizado
además porque el cebador se elige de la siguiente lista:
- -
- para la amplificación del exón 2 de HLA-A (tabla 1):
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
- -
- para la amplificación del exón 3 de HLA-A (tabla 2; tabla 3)
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación del exón 4 de HLA-A (tabla 4):
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen además aquí los siguientes
cebadores para la amplificación del exón 2 de HLA-B
(tabla 5):
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación del exón 3 de HLA-B (tabla 6; tabla 7):
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación del exón 4 de HLA-B (tabla 8):
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación del exón 2 de HLA-C (tabla 9):
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación del exón 3 de HLA-C (tabla 10):
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.2cm
\newpage
- -
- para la amplificación del exón 4 de HLA-C (tabla 11):
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.2cm
\newpage
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere a cualquier método como se describe
anteriormente, caracterizado además porque la amplificación del exón
4 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes cebadores
directos:
\hskip1.2cm
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere a cualquier método como se describe
anteriormente, caracterizado además porque la amplificación del exón
2 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes cebadores
inversos:
\hskip1.2cm
En una realización muy específica, la presente
invención se refiere a cualquier método como se describe
anteriormente, caracterizado además porque:
- -
- la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes conjuntos de cebadores:
\hskip1.2cm
- -
- la amplificación del exón 3 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes conjuntos de cebadores:
\hskip1.2cm
- -
- la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes conjuntos de cebadores:
\hskip1.2cm
La persona experta entenderá que estos cebadores
(SEC ID NO 1 a 314) se pueden adaptar mediante adición o supresión
de uno o más nucleótidos en sus extremidades. Tales adaptaciones
pueden ser necesarias, por ejemplo, si se cambian las condiciones de
amplificación, si el material amplificado es ARN en lugar de ADN,
como es el caso, por ejemplo, en el sistema de NASBA.
Adicionalmente se describe aquí un cebador como
se describe anteriormente, para uso en la amplificación del exón 2
de los alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C, hibridándose específicamente dicho cebador a
una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 de
respectivamente HLA-A, HLA-B o
HLA-C; más específicamente, hibridándose
específicamente dicho cebador a una secuencia diana específica del
locus situada en la posición:
- -
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A (Fig. 1); o
- -
- 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B (Fig. 2); o
- -
- 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C (Fig. 3);
más específicamente, eligiéndose dicho cebador
de la tabla 1 (para la amplificación del exón 2 de
HLA-A), de la tabla 5 (para la amplificación del
exón 2 de HLA-B), o de la tabla 9 (para la
amplificación del exón 2 de HLA-C).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe adicionalmente un cebador como se
describe anteriormente, para uso en la amplificación del exón 3 de
los alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C, hibridándose específicamente dicho cebador a
una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 (cebador
directo) o una secuencia diana específica del locus en el intrón 3
(cebador inverso) de respectivamente HLA-A,
HLA-B o HLA-C; más específicamente,
hibridándose específicamente dicho cebador a una secuencia diana
específica del locus situada en la posición:
- -
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A (Fig. 1) o 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150 del intrón HLA-A 3 (Fig. 4); o
- -
- 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B (Fig. 2) o 42, 46, 65, 68, 96, del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5); o
- -
- 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C (Fig. 3);
más específicamente, eligiéndose dicho cebador
de la tabla 2 o la tabla 3 (para la amplificación del exón 3 de
HLA-A), o de la tabla 6 o tabla 7 (para la
amplificación del exón 3 de HLA-B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe adicionalmente un cebador como se
describe anteriormente, para uso en la amplificación del exón 4 de
los alelos HLA-A, HLA-B o
HLA-C, hibridándose específicamente dicho cebador a
una secuencia diana específica del locus en el intrón 3 de
respectivamente HLA-A, HLA-B o
HLA-C; más específicamente, hibridándose
específicamente dicho cebador a una secuencia diana específica del
locus situada en la posición:
- -
- 501, 525, 561 ó 571 del intrón 3 de HLA-A (Fig. 4); o
- -
- 438, 502, 524, 547 ó 571 del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5); o
- -
- 461, 477, 527, 545 ó 561 del intrón 3 de HLA-C (Fig. 6);
más específicamente, eligiéndose dicho cebador
de la tabla 4 (para la amplificación del exón 4 de
HLA-A), de la tabla 8 (para la amplificación del
exón 4 de HLA-B), o de la tabla 11 (para la
amplificación del exón 4 de
HLA-C).
HLA-C).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe adicionalmente un conjunto de
cebadores que consiste en una combinación de un cebador directo y un
cebador inverso como se define anteriormente, para uso en la
amplificación del exón 2 de los alelos HLA-A,
HLA-B o HLA-C. Se describe
específicamente la combinación del cebador directo 5APBio (SEC ID NO
144) para HLA-A, IBPin1 (SEC ID NO 145) para
HLA-B o 5CIN1 (SEC ID NO 146) para
HLA-C y un cebador inverso que se hibrida
específicamente a una secuencia diana específica del locus en el
intrón 2 de respectivamente HLA-A,
HLA-B o HLA-C; más específicamente,
hibridándose específicamente dicho cebador inverso a una secuencia
diana específica del locus situada en la posición:
- -
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A;
- -
- o 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B; o
- -
- 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C;
más específicamente, eligiéndose dicho cebador
inverso de la tabla 1 (para la amplificación del exón 2 de
HLA-A), de la tabla 5 (para la amplificación del
exón 2 de HLA-B), o de la tabla 9 (para la
amplificación del exón 2 de HLA-C).
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe un conjunto de cebadores que
consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador
inverso como se describe anteriormente, para uso en la amplificación
del exón 3 de los alelos HLA-A,
HLA-B o HLA-C. Se describe
específicamente la combinación de un cebador directo que se hibrida
específicamente a una secuencia diana específica del locus en el
intrón 2 de respectivamente HLA-A,
HLA-B o HLA-C; más específicamente,
hibridándose específicamente dicho cebador directo a una secuencia
diana específica del locus situada en la
posición:
posición:
- -
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó 181 del intrón 2 de HLA-A; o
- -
- 35 ó 170 del intrón 2 de HLA-B; o
- -
- 84, 107 ó 142 del intrón 2 de HLA-C;
más específicamente, eligiéndose dicho cebador
directo de la tabla 2 (para la amplificación del exón 3 de
HLA-A), o de la tabla 6 (para la amplificación del
exón 3 de HLA-B) o de la tabla 10 (para la
amplificación del exón 3 de HLA-C), y un cebador
inverso que se hibrida específicamente a una secuencia diana
específica del locus en el intrón 3 de respectivamente
HLA-A, HLA-B o
HLA-C; más específicamente, hibridándose
específicamente dicho cebador inverso a una secuencia diana
específica del locus situada en la posición:
- -
- 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150 (Fig. 4) del intrón 3 de HLA-A; o
- -
- 42, 46, 65, 68, 96, del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5);
más específicamente, eligiéndose dicho cebador
inverso de la tabla 3 (para la amplificación del exón 3 de
HLA-A), de la tabla 7 (para la amplificación del
exón 3 de HLA-B), o de 3CIN3 (SEC ID NO 149) (para
la amplificación del exón 3 de HLA-C).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe adicionalmente un conjunto de
cebadores que consiste en una combinación de un cebador directo y un
cebador inverso como se describe anteriormente, para uso en la
amplificación del exón 4 de los alelos HLA-A,
HLA-B o HLA-C. Se describe
específicamente la combinación de un cebador directo que se hibrida
específicamente a una secuencia diana específica del locus en el
intrón 3 de respectivamente HLA-A,
HLA-B o HLA-C; más específicamente,
hibridándose específicamente dicho cebador directo a una secuencia
diana específica del locus situada en la posición:
- -
- 501, 525, 561 ó 571 del intrón 3 de HLA-A (Fig. 4); o
- -
- 438, 502, 524, 547 ó 571 del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5); o
- -
- 461, 477, 527, 545 ó 561 del intrón 3 de HLA-C (Fig. 6);
más específicamente, eligiéndose dicho cebador
directo de la tabla 4 (para la amplificación del exón 4 de
HLA-A), de la tabla 8 (para la amplificación del
exón 4 de HLA-B) o de la tabla 11 (para la
amplificación del exón 4 de HLA-C), y un cebador
inverso 3ex4APbio (SEC ID NO 311) para HLA-A,
3ex4IBbio (SEC ID NO 312) para HLA-B, o 3ex4ICbio
(SEC ID NO 313) para HLA-C.
\vskip1.000000\baselineskip
Específicamente, los cebadores se usan en una
mezcla que permite la amplificación separada del exón 2 y del exón
3. En consecuencia, se describe una mezcla de cebadores múltiple que
contiene al menos un par de cebadores como se describe anteriormente
para la amplificación del exón 2 y un par de cebadores como se
describe anteriormente para la amplificación del exón 3.
Específicamente, la mezcla de cebadores múltiple
para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 comprende los
siguientes conjuntos de cebadores:
- -
- para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 de HLA-A:
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 de HLA-B:
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3 de HLA-C:
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Específicamente, los cebadores se usan en una
mezcla que permite la amplificación separada del exón 2, exón 3 y
exón 4. En consecuencia, se describe una mezcla de cebadores
múltiple que contiene al menos un par de cebadores como se describe
anteriormente para la amplificación del exón 2, un par de cebadores
como se describe anteriormente para la amplificación del exón 3, y
un par de cebadores como se describe anteriormente para la
amplificación del exón 4.
Específicamente, la mezcla de cebadores múltiple
para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 comprende
los siguientes conjuntos de cebadores:
- -
- para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A:
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B:
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-C:
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores se pueden marcar. El marcado se
puede llevar a cabo por cualquier método conocido por la persona
experta en la técnica. La naturaleza del marcador puede ser
isotópica (^{32}P, ^{35}S, etc.) o no isotópica (biotina,
digoxigenina, etc.).
Los oligonucleótidos usados como cebadores
también pueden comprender análogos nucleotídicos tales como
fosforotioatos (Matsukura et al., 1987), alquilfosforotioatos
(Miller et al., 1979) o ácidos nucleicos peptídicos (Nielsen
et al., 1991; Nielsen et al., 1993), o pueden contener
agentes intercalantes (Asseline et al., 1984). Como la
mayoría de las otras variaciones o modificaciones introducidas en
las secuencias de ADN originales, estas variaciones necesitarán
adaptaciones con respecto a las condiciones en las que el
oligonucleótido se debería de usar para obtener la especificidad y
sensibilidad requeridas. Sin embargo, los resultados eventuales de
la hibridación serán esencialmente los mismos que los obtenidos con
los oligonucleótidos no modificados. La introducción de estas
modificaciones puede ser ventajosa a fin de influir positivamente en
características tales como la cinética de hibridación,
reversibilidad de la formación de híbridos, estabilidad biológica de
las moléculas oligonucleotídicas, etc.
Se describe aquí el uso de los cebadores, los
conjuntos de cebadores y/o las mezclas de cebadores de la invención
en un método para la amplificación separada y específica del locus
del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-A,
HLA-B o HLA-C.
La presente invención también se refiere a un
método para tipar o subtipar uno o más alelos HLA-A
en una muestra, que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- si es necesario, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- amplificar los ácidos nucleicos descritos aquí;
- (iii)
- tipar los alelos HLA-A específicos presentes en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La liberación, concentración y aislamiento de
los ácidos nucleicos procedentes de la muestra se puede realizar
mediante cualquier método conocido en la técnica. Actualmente,
existen diversos kits comerciales tales como el QIAamp Blood Kit de
Qiagen (Hilden, Alemania) para el aislamiento de ácidos nucleicos a
partir de muestras de sangre, o el "High pure PCR Template
Preparation Kit" (Roche Diagnostics, Bruselas, Bélgica). También
existen otros procedimientos bien conocidos para el aislamiento de
ADN o ARN a partir de una muestra biológica (Sambrook et al.,
1989). Los ácidos nucleicos se amplifican subsiguientemente mediante
el método de la invención descrito anteriormente. Los productos de
esta etapa de amplificación son entonces idealmente adecuados para
tipar el alelo específico presente en la muestra. Actualmente se
conocen 169 alelos diferentes de HLA-A, 332 alelos
diferentes de HLA-B, y 87 alelos diferentes de
HLA-C. El tipado de estos alelos se puede realizar
mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como el
análisis dúplex de los productos de la PCR (Clay et al.,
1994), el análisis de polimorfismo conformacional monocatenario del
producto de la PCR (PCR-SSCP; Yoshida et al.,
1992), tipado a base de secuencias (SBT; Santamaria et al.,
1992 y 1993), el uso de cebadores específicos de secuencias en la
reacción de la PCR (PCR-SSP; Olerup y Zetterquist,
1991), el uso de PCR en combinación con un sondaje oligonucleotídico
específico de secuencias (PCR-SSOP; Saiki et
al., 1986), la transferencia de punto convencional, la
transferencia Southern, el sándwich o sondado mediante transferencia
de punto inversa (Saiki et al., 1989). A fin de obtener
resultados rápidos y fáciles si están implicadas una multitud de
sondas, puede ser conveniente un formato de hibridación inversa. En
consecuencia, en una realización preferida, las sondas seleccionadas
se inmovilizan en ciertas localizaciones sobre un soporte sólido, y
los ácidos polinucleicos amplificados se marcan a fin de permitir la
detección de los híbridos formados. La expresión "soporte
sólido" se puede referir a cualquier sustrato al que se puede
acoplar una sonda oligonucleotídica, con la condición de que retenga
sus características de hibridación y con la condición de que el
nivel de fondo de la hibridación permanezca bajo. Habitualmente, el
sustrato sólido será una placa de microtitulación (por ejemplo en la
técnica de DEIA), una membrana (por ejemplo nailon o nitrocelulosa)
o una microesfera (perla) o un chip. Antes de la aplicación a la
membrana o fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de
ácido nucleico a fin de facilitar la fijación o mejorar la eficacia
de la hibridación. Tales modificaciones pueden englobar la unión de
un homopolímero de ácido nucleico a un trozo de ADN, el acoplamiento
con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos
NH_{2}, grupos SH, grupos carboxílicos, y el acoplamiento con
biotina, aptenos o proteínas.
La presente invención se refiere además a un kit
de diagnóstico para el tipado o subtipado de uno o más alelos
HLA-A en una muestra, que comprende los siguientes
componentes:
- (i)
- cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- un conjunto de cebadores o una mezcla de cebadores como se describe aquí;
- (iv)
- un medio para tipar los alelos HLA-A específicos presentes en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Un kit de diagnóstico específico y muy
compatible con el usuario es el ensayo de sondas en líneas para el
tipado o subtipado de uno o más alelos HLA-A en una
muestra, que comprende los siguientes componentes:
- (i)
- cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- un par de cebadores o una mezcla de cebadores como se describe aquí;
- (iii)
- al menos una sonda que se hibrida específicamente con uno de los alelos HLA-A, fijada a un soporte sólido;
- (iv)
- un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;
- (v)
- una disolución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha disolución;
- (vi)
- cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta realización, el conjunto seleccionado de
sondas se inmoviliza a una tira de membrana en forma de líneas.
Dichas sondas se pueden inmovilizar individualmente o como mezclas a
las localizaciones delineadas. Los ácidos polinucleicos de
HLA-A amplificados se pueden marcar con biotina, y
el híbrido se puede detectar entonces, vía un acoplamiento con
biotina-estreptavidina, con un sistema de desarrollo
del color no radioactivo.
La expresión "tampón de hibridación"
significa un tampón que permite una reacción de hibridación entre
las sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los
productos amplificados, en las condiciones de restricción
apropiadas.
La expresión "disolución de lavado"
significa una disolución que permite lavar los híbridos formados en
las condiciones de restricción apropiadas.
También se describe aquí el uso de los
cebadores, los conjuntos de cebadores y/o las mezclas de cebadores
de la invención para la fabricación de un kit de diagnóstico o
ensayo de sondas en líneas para el tipado de HLA de Clase I.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las
reivindicaciones a continuación, excepto que el contexto requiera
otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender", y
variaciones tales como "comprende" y "que comprende",
implican la inclusión de un todo o etapa señalado o grupo de todos o
etapas señalados, pero no la exclusión de ningún otro todo o etapa o
grupo de todos o etapas.
Figura 1. Alineamiento de 29 secuencias del
intrón 2 de HLA-A. En la parte superior de la figura
se muestra la secuencia de consenso. Los nucleótidos que conforman
la secuencia de consenso se indican con una línea vertical. Se
indican los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso. N
indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. La
secuenciación se llevó a cabo según el ejemplo 1.
Figura 2. Alineamiento de 38 secuencias del
intrón 2 de HLA-B. En la parte superior de la figura
se muestra la secuencia de consenso. Los nucleótidos que conforman
la secuencia de consenso se indican con una línea vertical. Se
indican los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso. N
indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. La
secuenciación se llevó a cabo según el ejemplo 1.
Figura 3. Alineamiento de 13 secuencias del
intrón 2 de HLA-C. En la parte superior de la figura
se muestra la secuencia de consenso. Los nucleótidos que conforman
la secuencia de consenso se indican con una línea vertical. Se
indican los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso. N
indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. La
secuenciación se llevó a cabo según el ejemplo 1.
Figura 4. Alineamiento de 12 secuencias del
intrón 3 de HLA-A. En la parte superior de la figura
se muestra la secuencia de consenso. Los nucleótidos que conforman
la secuencia de consenso se indican con una línea vertical. Se
indican los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso. N
indica la ausencia de un nucleótido en esa posición.
Figura 5. Alineamiento de 22 secuencias del
intrón 3 de HLA-B. En la parte superior de la figura
se muestra la secuencia de consenso. Los nucleótidos que conforman
la secuencia de consenso se indican con una línea vertical. Se
indican los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso. N
indica la ausencia de un nucleótido en esa posición.
Figura 6. Alineamiento de 12 secuencias del
intrón 3 de HLA-C. En la parte superior de la figura
se muestra la secuencia de consenso. Los nucleótidos que conforman
la secuencia de consenso se indican con una línea vertical. Se
indican los nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso. N
indica la ausencia de un nucleótido en esa posición.
Figura 7. Resultado de un ensayo de sondas en
líneas para el tipado de HLA-A como se indica en el
ejemplo 5. Los ácidos nucleicos se amplificaron mediante uso de: (A)
5APBio (cebador directo; SEC ID NO 144) y 3APBio (cebador inverso;
SEC ID NO 147) para la amplificación del exón 2 y exón 3 de
HLA-A en un solo amplicón; (B) la mezcla de
cebadores múltiple para la amplificación separada del exón 2, exón 3
y exón 4 de HLA-A. Las sondas con los números 1, 4,
9, 10, 12 y 13 muestran claramente una señal más fuerte tras la
hibridación con los amplicones obtenidos mediante uso de la mezcla
de cebadores múltiple (tira B).
Figura 8. Resultados de un ensayo de sondas en
líneas para el tipado de HLA-B como se indica en el
ejemplo 6. Los ácidos nucleicos se amplificaron mediante uso de: (B)
IBPin1 (cebador directo; SEC ID NO 145) e IBPin3 (cebador inverso;
SEC ID NO 148) para la amplificación del exón 2 y exón 3 de
HLA-B en un solo amplicón; (B) la mezcla de
cebadores múltiple para la amplificación separada del exón 2, exón 3
y exón 4 de HLA-B. Las sondas con los números 9, 10,
18, 19, 20, 34 y 35 muestran claramente una señal más fuerte tras la
hibridación con los amplicones obtenidos mediante uso de la mezcla
de cebadores múltiple (tiras B).
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se prepararon ácidos nucleicos a partir de
diferentes muestras de sangre mediante el uso del kit QIAamp Blood
Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del
fabricante.
Parte del exón 1, del intrón 2, del exón 2, del
intrón 2 y del exón 3 de HLA-A se amplificaron
mediante uso del siguiente conjunto de cebadores:
El exón 2, el intrón 2 y el exón 3 de
HLA-B se amplificaron mediante uso del siguiente
conjunto de cebadores:
El exón 2, el intrón 2 y el exón 3 de
HLA-C se amplificaron mediante uso del siguiente
conjunto de cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo de reacción de la PCR estaba compuesto
de las siguientes etapas:
- 1 min. a 96ºC;
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 64ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 62ºC; 50 s a 72ºC);
- 10 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 60ºC; 50 s a 72ºC);
- 15 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 55ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 min. a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de amplificación se llevó a cabo en
50 mM de Tris-HCl pH 9,2, 16 mM de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 200 \muM de dNTPs, 2,5 U de Taq
polimerasa, 1,5 mM de MgCl_{2}, 15 pmoles de cada cebador y 0,1 a
0,5 \mug de ADN.
\newpage
El amplicón resultante se clonó en el vector
pGEMt (Promega, Madison, WI, USA). El análisis de la secuencia
nucleotídica se llevó a cabo mediante uso de un secuenciador de ADN
automatizado Modelo 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
con didesoxinucleótidos marcados para fluorescencia PrismTM Ready
Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit; Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA). Los cebadores usados para la reacción de
secuenciación fueron los mismos que para la etapa de amplificación.
Se obtuvieron 29 secuencias del intrón 2 para HLA-A,
38 para HLA-B y 13 para HLA-C. Las
secuencias se muestran en las Figuras 1, 2 y 3, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ácidos nucleicos a partir de
diferentes muestras de sangre mediante uso del QIAamp Blood Kit
(Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante.
Basándose en el alineamiento de secuencias de las secuencias del
intrón 2 de HLA-A (Figura 1) se diseñó un cebador
inverso y uno directo, específico del locus, para la amplificación
específica del exón 2 y del exón 3, respectivamente, de
HLA-A. Con estos cebadores, se construyó una mezcla
de cebadores para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3
de HLA-A, que consiste en los siguientes dos
conjuntos de cebadores:
- -
- para el exón 2: 5APBio (SEC ID NO 144) como cebador directo, y 5'ATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (SEC ID NO 1) como cebador inverso;
- -
- para el exón 3: 5'CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (SEC ID NO 104) como cebador directo, y 3APBio (SEC ID NO 147) como cebador inverso.
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo de la reacción de la PCR estaba
compuesto de las siguientes etapas:
- 5 min. a 96ºC;
- 35 veces (30 s a 96ºC; 20 s a 58ºC; 30 s a 72ºC);
- 10 min. a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de PCR se llevó a cabo en 10 mM de
Tris.HCl pH 8,3, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,001% (p/v) de
gelatina, 200 \muM de los dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmoles
de cada cebador y 1U AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). La longitud de los productos de la PCR obtenidos se verificó
en un gel de agarosa según Sambrook et al. (1989).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ácidos nucleicos a partir de
diferentes muestras de sangre mediante uso del QIAamp Blood Kit
(Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante.
Basándose en el alineamiento de secuencias de las secuencias del
intrón 2 de HLA-B (Figura 2), se diseñó un cebador
inverso y uno directo, específicos del locus, para la amplificación
específica del exón 2 y del exón 3, respectivamente, de
HLA-B. Con estos cebadores, se construyó una mezcla
de cebadores para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3
de HLA-B, que consiste en los siguientes 2 conjuntos
de cebadores:
- -
- para el exón 2: IBPin1 (SEQ ID NO 145) como cebador directo, y 5'ACCCGCGGGGATTTTTGGCCTC3' (SEC ID NO 310) como cebador inverso;
- -
- para el exón 3: 5'ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (SEC ID NO 121) como cebador directo, y IBPin3 (SEC ID NO 148) como cebador inverso.
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo de la reacción de la PCR estaba
compuesto de las siguientes etapas:
- 5 min. a 96ºC;
- 35 veces (30 s a 96ºC; 20 s a 58ºC; 30 s a 72ºC);
- 10 min. a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de PCR se llevó a cabo en 10 mM de
Tris.HCl pH 8,3, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,001% (p/v) de
gelatina, 200 \muM de los dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmoles
de cada cebador y 1U AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). La longitud de los productos de la PCR obtenidos se verificó
en un gel de agarosa según Sambrook et al. (1989).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ácidos nucleicos a partir de
diferentes muestras de sangre mediante uso del QIAamp Blood Kit
(Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante.
Basándose en el alineamiento de secuencias de las secuencias del
intrón 2 de HLA-C (Figura 3), se diseñó un cebador
inverso y uno directo, específicos del locus, para la amplificación
específica del exón 2 y del exón 3, respectivamente, de
HLA-C. Con estos cebadores, se construyó una mezcla
de cebadores para la amplificación separada del exón 2 y del exón 3
de HLA-C, que consiste en los siguientes 2 conjuntos
de cebadores:
- -
- para el exón 2: 5CIN1 (SEC ID NO 146) como cebador directo, y 5'GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (SEC ID NO 127) como cebador inverso;
- -
- para el exón 3: 5'TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3' (SEC ID NO 139) como cebador directo, y 3CIN3 (SEC ID NO 149) como cebador inverso.
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo de la reacción de la PCR estaba
compuesto de las siguientes etapas:
- 5 min. a 96ºC;
- 35 veces (30 s a 96ºC; 20 s a 58ºC; 30 s a 72ºC);
- 10 min. a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de PCR se llevó a cabo en 10 mM de
Tris.HCl pH 8,3, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,001% (p/v) de
gelatina, 200 \muM de los dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmoles
de cada cebador y 1U AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). La longitud de los productos de la PCR obtenidos se verificó
en un gel de agarosa según Sambrook et al. (1989).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron muestras de sangre a partir de un
donante caucásico en B.A.R.C. (Gante, Bélgica). Se prepararon ácidos
nucleicos a partir de las muestras de sangre mediante el uso del
QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una mezcla de cebadores para la
amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de
HLA-A, que consiste en los siguientes conjuntos de
cebadores:
El ciclo de reacción de la PCR estaba compuesto
de las siguientes etapas:
- 1 min. a 96ºC;
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 64ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 62ºC; 50 s a 72ºC);
- 10 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 60ºC; 50 s a 72ºC);
- 15 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 55ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 min. a 72ºC;
- 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de PCR se llevó a cabo en 50 mM de
Tris.HCl pH 9,2, 16 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 mM de
MgCl_{2}, 200 \muM de los dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2,5 U
de Taq polimerasa (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems,
Branchburg, New Jersey, US), 20 pmoles del cebador 5APbio, 20 pmoles
del cebador 3ex2APbio, 40 pmoles del cebador 5ex3APbio, 40 pmoles
del cebador 3ex3APbio, 15 pmoles del cebador 5ex4APbio, 15 pmoles
del cebador 3ex4APbio y 0,1-0,5 \mug de ADN.
La longitud de los productos de amplificación
obtenidos se verificó en un gel de agarosa al 3% según Sambrook
et al. (1989). Se obtuvieron 3 bandas de diferente longitud
que se refieren respectivamente al exón 2 (559 pb), exón 3 (439 pb)
y exón 4 (380 pb) de HLA-A. Mediante el uso de este
protocolo, los exones de HLA-A se amplificaron de
forma suficientemente potente para el tipado subsiguiente en un
ensayo de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los amplicones de HLA-A se
tiparon subsiguientemente en un ensayo de hibridación inversa basado
en la tecnología de LiPA (Stuyver et al., 1993). Tras la
etapa de amplificación como se describe anteriormente, los ácidos
nucleicos amplificados se hibridaron a un panel de 36 sondas
mediante uso del kit de HLA-A de LiPA (Innogenetics,
Gante, Bélgica) según las instrucciones del fabricante. En la Figura
7 se muestran los resultados de esta hibridación inversa.
Para comparación, también se obtuvo un producto
de amplificación, que comprende el exón 2 y el exón 3 en un único
amplicón, mediante el uso de 5APBio (cebador directo; SEC ID NO 144)
y 3APBio (cebador inverso; SEC ID NO 147). En la Figura 7 también se
muestra la hibridación de este amplicón más grande a las sondas en
la tira de LiPA. La Figura 7 ilustra claramente que los amplicones
obtenidos mediante amplificación separada del exón 2 y del exón 3
permiten un tipado más claro y pronunciado que el amplicón más
grande obtenido mediante amplificación del exón 2 y del exón 3 en un
único amplicón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron muestras de sangre a partir de un
donante caucásico en B.A.R.C. (Gante, Bélgica). Se prepararon ácidos
nucleicos a partir de las muestras de sangre mediante el uso del
QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una mezcla de cebadores para la
amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de
HLA-B, que consiste en los siguientes conjuntos de
cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo de reacción de la PCR estaba compuesto
de las siguientes etapas:
- 1 min. a 96ºC;
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 64ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 62ºC; 50 s a 72ºC);
- 10 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 60ºC; 50 s a 72ºC);
- 15 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 55ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 min. a 72ºC;
- 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de PCR se llevó a cabo en 50 mM de
Tris.HCl pH 9,2, 16 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 mM de
MgCl_{2}, 200 \muM de los dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2,5 U
de Taq polimerasa (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems,
Branchburg, New Jersey, US), 35 pmoles del cebador IBPinIbio, 35
pmoles del cebador IBPin2bio, 50 pmoles del cebador IB5Pin2bio, 50
pmoles del cebador IB3Pin3bio, 10 pmoles del cebador 5ex4IBbio, 10
pmoles del cebador 3ex4IBbio y 0,1-0,5 \mug de
ADN.
La longitud de los productos de amplificación
obtenidos se verificó en un gel de agarosa al 3% según Sambrook
et al. (1989). Se obtuvieron 3 bandas de diferente longitud
que se refieren respectivamente al exón 2 (555 pb), exón 3 (446 pb)
y exón 4 (323 pb) de HLA-B. Mediante el uso de este
protocolo, los exones de HLA-B se amplificaron de
forma suficientemente potente para el tipado subsiguiente en un
ensayo de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los amplicones de HLA-B se
tiparon subsiguientemente en un ensayo de hibridación inversa basado
en la tecnología de LiPA (Stuyver et al., 1993). Tras la
etapa de amplificación como se describe anteriormente, los ácidos
nucleicos amplificados se hibridaron a un panel de 60 sondas
mediante uso del kit de HLA-B de LiPA (Innogenetics,
Gante, Bélgica) según las instrucciones del fabricante. En la Figura
8 se muestran los resultados de esta hibridación inversa.
Para comparación, también se obtuvo un producto
de amplificación, que comprende el exón 2 y el exón 3 en un único
amplicón, mediante el uso de IBPin1 (cebador directo; SEC ID NO 145)
y IBPin3 (cebador inverso; SEC ID NO 148). En la Figura 8 también se
muestra la hibridación de este amplicón más grande a las sondas en
la tira de LiPA. La Figura 8 ilustra claramente que los amplicones
obtenidos mediante amplificación separada del exón 2 y del exón 3
permiten un tipado más claro y pronunciado que el amplicón más
grande obtenido mediante amplificación del exón 2 y del exón 3 en un
único amplicón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ácidos nucleicos a partir de las
muestras de sangre mediante el uso del QIAamp Blood Kit (Qiagen,
Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se usó una
mezcla de cebadores para la amplificación separada del exón 2, exón
3 y exón 4 de HLA-C, que consiste en los siguientes
conjuntos de cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo de reacción de la PCR estaba compuesto
de las siguientes etapas:
- 1 min. a 96ºC;
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 64ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 62ºC; 50 s a 72ºC);
- 10 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 60ºC; 50 s a 72ºC);
- 15 veces (30 s a 96ºC; 50 s a 55ºC; 50 s a 72ºC);
- 5 min. a 72ºC;
- 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de PCR se llevó a cabo en 50 mM de
Tris.HCl pH 9,2, 16 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 mM de
MgCl_{2}, 200 \muM de los dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2,5 U
de Taq polimerasa (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems,
Branchburg, New Jersey, US), 20 pmoles de cada cebador y
0,1-0,5 \mug de ADN.
La longitud de los productos de amplificación
obtenidos se verificó en un gel de agarosa al 3% según Sambrook
et al. (1989). Se obtuvieron 3 bandas de diferente longitud
que se refieren respectivamente al exón 2, exón 3 y exón 4 de
HLA-C. Mediante el uso de este protocolo, los exones
de HLA-C se amplificaron de forma suficientemente
potente para el tipado subsiguiente en un ensayo de sondas en
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\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (12)
1. Método para tipar o subtipar uno o más alelos
HLA-A en una muestra, que comprende las siguientes
etapas:
- (i)
- si es necesario, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- amplificar de forma separada, específica del locus, el exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-A, haciendo uso de al menos tres conjuntos de cebadores, en los que
- -
- para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 de HLA-A,
- -
- para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 2 de HLA-A, y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 3 de HLA-A, y
- -
- para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia diana específica del locus en el intrón 3 de HLA-A;
- (iii)
- tipar el alelo HLA-A específico presente en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado además porque la secuencia diana específica del
locus está situada en la posición 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 ó
181 del intrón 2 de HLA-A (Fig. 1) y/o posición 32,
50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150, 501, 525, 561 ó 571 del intrón 3
de HLA-A (Fig. 4).
3. Método según la reivindicación 2,
caracterizado además porque dichas posiciones constituyen el
extremo 3' del cebador que se usa para la amplificación del exón 2,
exón 3 o exón 4.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado además porque el cebador se escoge de la
siguiente lista:
- -
- para la amplificación del exón 2 de HLA-A (tabla 1):
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\newpage
- -
- para la amplificación del exón 3 de HLA-A (tabla 2; tabla 3)
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- para la amplificación del exón 4 de HLA-A (tabla 4):
\hskip1.2cm
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque la
amplificación del exón 2 se lleva a cabo el siguiente cebador
directo:
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la
amplificación del exón 4 se lleva a cabo con el siguiente cebador
inverso:
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque:
- -
- la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con el siguiente conjunto de cebadores:
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la amplificación del exón 3 se lleva a cabo con el siguiente conjunto de cebadores:
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con el siguiente conjunto de cebadores:
\hskip1.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque tanto el
exón 2 como el exón 3 de HLA-A se amplifican
mediante uso de una mezcla de cebadores múltiple que contiene al
menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2 y al
menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque los tres
exones, exón 2, exón 3 y exón 4, de HLA-A se
amplifican mediante uso de una mezcla de cebadores múltiple que
contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón
2, al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3 y
al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 4.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque la etapa
de tipado se lleva a cabo mediante hibridación con una o más sondas
adecuadas.
11. Un kit de diagnóstico para tipar o subtipar
uno o más alelos HLA-A en una muestra, que comprende
los siguientes componentes:
- (i)
- cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- una mezcla de cebadores que contiene al menos
- -
- un conjunto de cebadores para la amplificación del exón 2, que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la amplificación del exón 2 de alelos HLA-A,
- -
- un conjunto de cebadores para la amplificación del exón 3, que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la amplificación del exón 3 de alelos HLA-A, y
- -
- un conjunto de cebadores para la amplificación del exón 4, que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la amplificación del exón 4 de alelos HLA-A;
- (iii)
- un medio para el tipado del alelo HLA-A específico presente en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Un kit de ensayo sondas en líneas para el
tipado o subtipado de uno o más alelos HLA-A en una
muestra, que comprende los siguientes componentes:
- (i)
- cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- una mezcla de cebadores que contiene al menos
- -
- un conjunto de cebadores para la amplificación del exón 2, que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la amplificación del exón 2 de alelos HLA-A,
- -
- un conjunto de cebadores para la amplificación del exón 3, que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la amplificación del exón 3 de alelos HLA-A, y
- -
- un conjunto de cebadores para la amplificación del exón 4, que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la amplificación del exón 4 de alelos HLA-A;
- (iii)
- al menos una sonda que se hibrida específicamente con el exón 2, exón 3 o exón 4 de HLA-A, fijada a un soporte sólido;
- (iv)
- un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;
- (v)
- una disolución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha disolución;
- (vi)
- cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.
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