ES2430420T3 - Método para la amplificación de alelos HLA Clase I - Google Patents
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Abstract
Método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra que comprende lassiguientes etapas: (i) si es necesario, la liberación, aislamiento y/o concentración de los ácidos nucleicos presentes en dichamuestra; (ii) amplificación separada locus-específica, del exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-B, haciendo uso de almenos tres conjuntos de cebadores, en donde: - para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivolocus-específica en el intrón 2 de HLA-B; -para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivolocus-específica en el intrón 2 de HLA-B y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuenciaobjetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-B; y -para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivolocus-específica en el intrón 3 de HLA-B; (iii) tipificación del alelo específico de HLA-B presente en dicha muestra.
Description
Método para la amplificación de alelos HLA Clase I
La presente invención se refiere a un método para la tipificación o subtipificación de HLA-B. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada, locus-específica del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B.
El complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) está incluido dentro de aproximadamente 4 Mbp de ADN en el brazo corto del cromosoma 6 en 6p21.3 (Campbell y Trowsdale, 1993). El MHC humano se divide en regiones de clase I, clase II y clase III. Los genes de clase I y clase II codifican moléculas de la superficie celular altamente polimórficas que se unen y presentan antígenos procesados en forma de péptidos a los linfocitos T, iniciando tanto las respuestas inmunes celulares como humorales.
Las moléculas clase I del MHC humano, HLA-A, -B, y -C, se encuentran en la mayoría de las células nucleadas. Son glicoproteínas de la superficie celular que se unen y presentan péptidos procesados derivados de las proteínas
endógenamente sintetizadas de las células T CD8+. Estos heterodímeros consisten en una cadena α de HLA codificada asociada con un polipéptido monomórfico no MHC codificado β-microglobulina (Townsend y Bodmer, 1989; Spencer y Parham, 1996). Las moléculas de clase II del MHC humano se codifican en la región HLA-D. Estas glicoproteínas de la superficie celular consisten en cadenas α-, y β- HLA- codificadas, asociadas como heterodímeros sobre la célula superficie de células presentadoras de antígenos tales como células B y macrófagos. Las moléculas de clase II sirven como receptores para péptidos procesados. Sin embargo, estos péptidos se derivan predominantemente de las proteínas de membrana y extracelular y se presentan a las células T CD4+. La región HLA-D contiene diversos genes clase II y tiene tres subregiones principales: HLA-DR, -DQ, y -DP. Tanto las regiones HLA-DQ como -DP contienen un gen funcional por cada una de sus cadenas α-y β-. La subregión HLA-DR contiene un gen funcional para la cadena α; el número de genes funcionales para la cadena β varía de uno a dos de acuerdo con el haplotipo (Andersson y otros, 1987; Apple y Erlich,
1996).
Existe polimorfismo extensivo en la mayoría de los loci. En vista de la importancia biológica y médica de estos antígenos, se requiere una técnica altamente sensible y rápida para la tipificación de HLA. Una variedad de técnicas se usan actualmente para detectar el polimorfismo de HLA, incluyendo serológicas, bioquímicas, reconocimiento de células T y, más recientemente, los métodos de biología molecular.
La serología continua siendo el método soporte principal para la tipificación de HLA -especialmente de clase I- en muchos laboratorios de rutina de histocompatibilidad. El ensayo de micro-linfocitotoxicidad (Kissmeyer y otros, 1969; Terasaki y McClelland, 1964) es la aproximación estándar: células mononucleares viables de sangre periférica (clase I) o células B separadas (clase II) se mezclan con el antisuero (policlonal o monoclonal) de especificidad HLA conocida.
La detección del polimorfismo se puede lograr buscando en la diferente composición de aminoácidos de las moléculas de HLA a través de técnicas bioquímicas tal como focalización isoeléctrica unidimensional (IEF; Yang, 1987). Este método descansa en las substituciones de aminoácidos que contribuyen a los cambios en la carga de la molécula de HLA.
Otro método de tipificación de HLA es la reacción mixta de linfocitos (MLR). En conjunto con las observaciones que se realizan usando antisuero HLA-específico, se observó que los linfocitos procedentes de dos fuentes no relacionadas, pueen proliferar cuando se mezclan en el cultivo (Hirschom y otros, 1963).
Los análisis de las especificidades de HLA a partir de ADN proporcionan un nuevo enfoque para definir sus diferencias polimórficas. En lugar de observar las diferencias en la molécula expresada, el polimorfismo se caracteriza a nivel de nucleótido.
Un desarrollo importante y poderoso en el campo de la biología molecular ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Mullis y otros, 1986; Mullis and Faloona, 1987). En la tipificación de tejidos, se usa el PCR para amplificar las regiones polimórficas de genes HLA. Este producto HLA de PCR puede analizarse después por sus diferencias polimórficas, para establecer el tipo de tejido. Varios enfoques de este tipo se desarrollaron, incluyendo análisis heterodúplex de los productos de PCR (Clay y otros, 1994), análisis corformacional del polimorfismo de simple cadena del producto de PCR (PCR-SSCP; Yoshida y otros, 1992), ltipificación basada en la secuencia (SBT; Santamaria y otros, 1992 y 1993), el uso de cebadores específicos de secuencia en la reacción de PCR (PCR-SSP; Olerup y Zetterquist, 1991), el uso de PCR en combinación con el sondeo del oligonucleótido secuencia-específico (PCR-SSOP; Saiki y otros, 1986) o sondeo en membrana de transferencia puntual reversa (Saiki y otros, 1989). Estos enfoques, usados simplemente o en combinación, se han aplicado como métodos basados en ADN para la tipificación de tejidos de especificidades de HLA clase I y clase II. Los métodos de tifipicación de ADN deben preferirse a los métodos serológicos proporcionados, siempre que está disponible un método de tipificación de ADN fácil, rápido y seguro. Algunas diferencias nivel de subtipo que son detectables por los métodos de ADN pueden no ser detectadas con los métodos actuales de tipificación serológica, aunque estas diferencias pueden provocar el rechazo del aloinjerto (Fleischhauer y otros, 1990).
El sistema HLA es el sistema genético humano más polimórfico se conoce todavía. Los genes de HLA Clase I comparten una estructura similar (de 5' a 3'): una región de flanqueo no traducida en 5’, un primer exón (exón 1) que tiene una longitud de aproximadamente 73 pares de bases, un primer intrón (intrón 1) que tiene una longitud de aproximadamente 130 pares de bases, un segundo exón (exón 2), que tiene una longitud de aproximadamente 250 pares de bases, un segundo intrón (intrón 2), que tiene una longitud de aproximadamente 272 pares de bases, un tercer exón (exón 3), que tienen una longitud de aproximadamente 276 pares de bases, un tercer intrón (intrón 3), que tiene una longitud de aproximadamente 588 pares de bases y cuarto exón (exón 4), que tiene un longitud de aproximadamente 276 pares de bases. Las sustituciones polimórficas dentro de los alelos HLA Clase I están ubicados principalmente tanto en el exón 2 como en el exón 3, que codifica la hendidura de unión del péptido de la molécula de clase I. Estos polimorfismos hacen diferenciación entre alelos alcanzables a través una variedad de técnicas de biología molecular tales como secuenciación o hibridación con sondas competentes. En los estuches de diagnóstico actuales el exón 2 y exón 3 se amplifican juntos, resultando en amplicones de aproximadamente 1 kb, que está formado por al menos el exón 2, intrón 2 y exón 3. Los cebadores locus-específico están disponibles para la amplificación de estos amplicones de 1 kb. Sin embargo, dichos amplicones grandes son difíciles de amplificar y mostrar la formación de estructura secundaria que resulta en la hibridación ineficiente de algunas sondas. Adicionalmente, debido a la aparición de nuevos alelos HLA-clase I, ciertas combinaciones de alelos no pueden distinguirse más sólo por la detección de polimorfismo en el exón 2 y el exón 3 y se requiere la tipificación adicional en el exón 4. Esto plantea la necesidad de la amplificación adicional del exón 4, lo que resulta en un amplicón aún más grande. Por lo tanto, una amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 puede desearse resultando en productos de amplificación que permiten una tipificación más eficiente de los alelos HLA Clase I. Sin embargo, como los sitios de hibridación de cebador locus-específico son escasos y no se pueden encontrar en el exón 2, exón 3 o exón 4, no es tan evidente la amplificación separada y locus-específica del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A, HLA -B y HLA -C.
Los métodos y estuches para la tipificación de HLA-B basada en la amplificación de los exones 2 y 3 se describen por ejemplo en WO 99/07 883 y WO 97/23 645. Los cebadores específicos para HLA-B se describen por ejemplo en EP-A-0 414 469, WO 97/20 197.
Es un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la amplificación separada locus-específica del exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-B.
Es un objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método de una amplificación de única etapa, locusespecífica, separada de los tres exones, exón 2, exón 3 y exón 4, de los alelos HLA-B.
En la presente descripción se describen además cebadores para usar en un método para la amplificación separada locusespecífica del exón 2 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C, cebadores para usar en un método para la amplificación separada locus-específica del exón 3 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C, cebadores para usar en un método para la amplificación separada locus-específica del exón 4 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C, un conjunto cebador para usar en un método para la amplificación separada locus-específica del exón 2 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C, un conjunto cebador para usar en un método para la amplificación separada locus-específica del exón 3 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C
Un conjunto cebador para usar en un método para la amplificación separada locus-específica del exón 4 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C, una mezcla cebador multiplex para usar en un método para la amplificación separada locus-específica de una etapa del exón 2 y exón 3 de HLA-A, HLA-B o HLA-C, una mezcla cebador multiplex para usar en un método para la amplificación separada locus-específica de una etapa del exón 2 y exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C y una mezcla cebador multiplex para usar en un método para la amplificación separada locus-específica de una etapa del exón 3 y exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C.
Es otro objetivo más específico de la presente invención proporcionar una mezcla cebador multiplex para usar en un método para la amplificación separada locus-específica de una etapa del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C.
Es otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método mejorado para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra.
Es otro objetivo de la presente invención es proporcionar un estuche mejorado de diagnóstico para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra.
Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar un ensayo de sonda de línea mejorado para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra.
La presente invención se refiere a un método para la amplificación locus-específica, separada del exón 2, exón 3 y el exón 4B de los alelos HLA-B, haciendo uso de al menos un conjunto cebador en donde:
- •
- para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locusespecífica en el intrón 2 de HLA-B;
- •
- para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locusespecífica en el intrón 2 de HLA-B y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-B;
- •
- para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locusespecífica en el intrón 3 de HLA-C.
Los métodos de amplificación de la descripción hacen uso de un conjunto cebador de los cuales al menos uno de los cebadores se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 o en el intrón 3 del gen de HLA Clase I para obtener la amplificación separada del exón 2 (sin exón 3 o exón 4), exón 3 (sin exón 2 o exón 4) y/o exón 4 (sin exón 2 o exón 3).
En el caso donde se amplifica el exón 2, el cebador inverso se hibrida con una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2, mientras que el cebador directo puede seleccionarse para hibridar con una región corriente arriba al exón 2 (por ejemplo, en intrón 1 o en exón 1) o a los nucleótidos iniciales del exón 2. En una modalidad preferida, el cebador directo se hibrida a una región locus-específica corriente arriba al exón 2 (por ejemplo, en intrón 1 o en exón 1) o a los nucleótidos iniciales locus-específicos del exón 2 y el cebador inverso se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 .
En el caso donde se amplifica el exón 3, el cebador directo se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2, mientras que el cebador inverso puede seleccionarse para hibridar con los nucleótidos finales del exón 3 o corriente abajo del exón 3 (por ejemplo, en intrón 3) o el cebador inverso se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3, mientras que el cebador directo puede seleccionarse para hibridar con una región corriente arriba al exón 3 (por ejemplo, intrón 2) o a los nucleótidos iniciales del exón 3. En una modalidad preferida, el exón 3 se amplifica mediante el uso de un conjunto cebador de los cuales el cebador directo se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 y el cebador inverso se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3.
En el caso en que se amplifica el exón 4, el cebador directo se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3, mientras que el cebador inverso puede seleccionarse para hibridar con los nucleótidos finales del exón 4 o corriente abajo al exón 4 (por ejemplo, en intrón 4). En una modalidad preferida, el cebador directo se hibrida a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3, mientras que el cebador inverso se hibrida con secuencias objetivos locus-específicas en el extremo del exón 4 o corriente abajo al exón 4 (por ejemplo, en intrón 4) .
Este nuevo método de amplificación resultará en la amplificación de fragmentos de ADN más cortos, que sólo contiene el exón 2, sólo exón 3 o sólo exón 4, que son mucho más fáciles para amplificar y mucho más fácil de usar en diferentes métodos de tipificación tales como secuenciación o hibridación con diferentes sondas específicas al alelo. De la sección de ejemplos es evidente que conjuntos de cebadores que contiene un cebador que hibrida con una secuencia objetivo en el intrón 2 o intrón 3 proporcionan una amplificación mucho mejor y más fácil del exón 2, exón 3 o exón 4 de alelos HLA Clase I y un patrón de hibridación más claro y pronunciado con las sondas de tipificación de alelos. Ha sido el mérito de los presentes inventores definir cebadores específicos que permiten esta amplificación separada del exón 2, exón 3 o exón 4 de un solo locus de HLA, mientras que dichos exones de otros loci de HLA (es decir, otros genes HLA clásicos, genes HLA no clásicos o pseudogenes) no se co-amplifican. Como los amplicones específicos pueden dar lugar a una tipificación fallida en el producto de amplificación, el método de amplificación de la invención ciertamente mejorará la seguridad de los actuales métodos de tipificación.
El término "locus-específico" significa así que el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de solamente un locus (es decir, HLA-A, HLA-B o HLA-C) se amplifica mientras que el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de los otros loci de HLA (es decir otros genes HLA clásicos, genes HLA no clásicos o pseudogenes) no se amplifican. Así, cuando se usan los cebadores específicos para la amplificación del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-A, exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B, HLA-C o de otros loci de HLA no se amplifican. Igualmente, cuando se usan los cebadores específicos para la amplificación del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-A, HLA-C o de otros loci de HLA no se amplifican. Igualmente, cuando se usan los cebadores específicos para la amplificación del exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-A, HLA-B o de otros loci de HLA no se amplifican. A partir de esto es evidente que el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de 2, 3 o más loci de HLA pueden nunca ser amplificados juntos. Así, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-A pueden nunca ser amplificados en el mismo tubo de reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B. Igualmente, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-A pueden nunca ser amplificados en el mismo tubo de reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-C. Igualmente, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B pueden nunca ser amplificados en el mismo tubo de reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-C. Igualmente, el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-A pueden nunca ser amplificados en el mismo tubo de reacción con el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-B y el exón 2, exón 3 y/o exón 4 de HLA-C. Como consecuencia, la presente invención se relaciona con un método para la amplificación separada locus-específica, de los alelos HLA-B del exón 2, exón 3 y exón 4. Esto significa que la invención se relaciona con un método para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B.
El término "cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleótido de cadena simple capaz de actuar como un punto de iniciación para la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a la cadena de ácido nucleico que se copia. La longitud y la secuencia del cebador deben ser tales que permitan cebar la síntesis de los productos de extensión. En una modalidad específica, la longitud del cebador es aproximadamente 5-50 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es aproximadamente 10-30 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud de los cebadores es aproximadamente 20-25 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad del objetivo ADN o ARN requerido, así como de las condiciones en las que se usa el cebador, tales como temperatura y fuerza iónica.
La expresión "conjunto cebador" o "par cebador" se refiere a un par cebador que permiten la amplificación de parte o de todo el exón 2, exón 3 o exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Un conjunto cebador consiste siempre en un cebador directo (o cebador 5’) y un cebador inverso (o cebador 3').
Los términos "hibridar específicamente" y "se hibrida específicamente" significa que, durante la etapa de amplificación, dicho cebador forma un dúplex con parte de su secuencia objetivo o con toda la secuencia objetivo en las condiciones experimentales usadas, y que bajo esas condiciones dicho cebador no forma un dúplex con otras secuencias de los ácidos polinucleicos presentes en la muestra que se analiza. Se debe entender que los cebadores que se diseñan para hibridar específicamente con una secuencia objetivo de un ácido nucleico, pueden caer dentro de dicha secuencia objetivo o puede, superponerse en gran medida con dicha secuencia objetivo (es decir, forma un dúplex con nucleótidos externos, así como dentro de dicha secuencia objetivo).
El término "secuencia objetivo" de un cebador de acuerdo con la presente invención es una secuencia dentro del intrón 2 o intrón 3 de los alelos HLA Clase I a la cual el cebador es completamente complementario o parcialmente complementario (es decir, con no coincidencias de hasta 20%, 15%, 10% o 5%). Es de entenderse que el complemento de dicha secuencia objetivo es también una secuencia objetivo adecuada en algunos casos. El hecho de que los cebadores de amplificación no tengan que coincidir exactamente con la secuencia objetivo correspondiente en el molde para garantizar la amplificación apropiada es ampliamente documentado en la literatura (Kwok y otros, 1990). Sin embargo, cuando los cebadores no son completamente complementarios a su secuencia objetivo, se debe tomar en cuenta que los fragmentos amplificados tendrán la secuencia de los cebadores y no de la secuencia objetivo.
En una modalidad, la amplificación se realiza en un tubo de reacción con un conjunto cebador para la amplificación del exón 2 como se describió anteriormente (el cebador inverso se hibrida con una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2) y, consecuentemente sólo se amplifica el exón 2. En otra modalidad, la amplificación se realiza en un tubo de reacción con un conjunto cebador para la amplificación del exón 3 como se describió anteriormente (cebador directo se hibrida con una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2) y, consecuentemente sólo se amplifica el exón 3.
En otra modalidad, la amplificación se lrealiza en un tubo de reacción con un conjunto cebador para la amplificación del exón 3 como se describió anteriormente (el cebador inverso se hibrida con una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3) y, consecuentemente sólo se amplifica el exón 3.
En otra modalidad, la amplificación se realiza en un tubo de reacción con un conjunto cebador para la amplificación del exón 3 como se describió anteriormente (cebador directo se hibrida con una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 y el cebador inverso se hibrida con una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3) y, consecuentemente sólo se amplifica el exón 3.
En otra modalidad, la amplificación se realiza en un tubo de reacción con un conjunto cebador para la amplificación del exón 4 como se describió anteriormente (cebador directo se hibrida con una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3) y, consecuentemente sólo se amplifica el exón 4.
En consecuencia, en la presente descripción se describen métodos para la amplificación separada del exón 2, exón 3 o exón 4 de los alelos HLA Clase I.
En otra modalidad, los diferentes conjuntos cebadores involucrados en la amplificación del exón 2 y la amplificación del exón 3 se mezclan y se realiza en un único tubo de reacción la amplificación separada tanto del exón 2 como el exón 3. Así, la presente descripción se refiere también a un método descrito anteriormente, caracterizado además tanto porque tanto el exón 2 como el exón 3 de HLA-A, HLA-B o HLA-C se amplifican mediante el uso de una mezcla cebador múltiple que contiene al menos un par cebador para la amplificación del exón 2 y al menos un par cebador para la amplificación del exón
3. En consecuencia, la presente descripción se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2 y exón 3 de alelos HLA Clase I.
En otra modalidad, los diferentes conjuntos cebadores involucrados en la amplificación del exón 2 y la amplificación del exón 4 se mezclan y se realiza en un único tubo de reacción la amplificación separada tanto del exón 2 como el exón 4. Así, la presente descripción se refiere además a un método descrito anteriormente, caracterizado además porque tanto el exón 2 como el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C se amplifican mediante el uso de una mezcla cebador múltiple que contiene al menos un par cebador para la amplificación del exón 2 y al menos un par cebador para la amplificación del exón 4. En consecuencia, la presente descripción se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2 y exón 4 de alelos HLA Clase I.
En otra modalidad, los diferentes conjuntos cebadores involucrados en la amplificación del exón 3 y la amplificación del exón 4 se mezclan y se realiza en un único tubo de reacción la amplificación separada tanto del exón 3 como el exón 4. Así, la presente descripción también se refiere a un método descrito anteriormente, caracterizado además porque tanto el exón 3 como el exón 4 de HLA-A, HLA-B o HLA-C se amplifican mediante el uso de una mezcla cebador múltiple que contiene al menos un par cebador para la amplificación del exón 3 y al menos un par cebador para la amplificación del exón 4. En consecuencia, la presente descripción se refiere a un método para la amplificación separada del exón 3 y exón 4 de alelos HLA Clase I.
En otra modalidad, los diferentes conjuntos cebador involucrados en la amplificación del exón 2, la amplificación del exón 3 y la amplificación del exón 4 se mezclan y se realiza en un único tubo de reacción la amplificación separada de los tres exones, el exón 2, exón 3 y el exón 4. Así, la presente invención se refiere además a un método descrito anteriormente, caracterizado además porque los tres exones, el exón 2, exón 3 y el exón 4, de HLA-A, HLA-B o HLA-C se amplifican por el uso de una mezcla cebador múltiple que contiene al menos un par cebador para la amplificación del exón 2, al menos un par cebador para la amplificación del exón 3 y al menos un par cebador para la amplificación del exón 4. En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de alelos HLA Clase I.
El método de amplificación usado puede ser ya sea la reacción en cadena de polimerasa (PCR; Saiki y otros, 1988), reacción en cadena de la ligasa (LCR; Landgren y otros, 1988; Wu y Wallace, 1989; Barany, 1991), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA; Guatelli y otros, 1990; Compton, 1991), sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS; Kwoh y otros, 1989), amplificación del desplazamiento de la cadena (SDA; Duck, 1990) o amplificación por medio de la Qß replicasa (Lomeli y otros, 1989) o cualquier otro método adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico conocidas en la técnica. Además, las técnicas TMA (Guatelli y otros, 1990) o bDNA (Sanchez-Pescador y otros, 1988; Urdea y otros, 1991) se pueden usar en el método de la presente invención. En una modalidad específica, el exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B se amplifican por PCR.
En una modalidad específica, la presente invención se refiere a un método descrito anteriormente, caracterizado, además porque la secuencia objetivo locus-específica está situada en una de las siguientes posiciones:
• 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B (Fig. 2) y 42, 46, 65, 68, 96, 438, 502, 524, 547 o 571 del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5)
Según estas posiciones todas contienen nucleótidos locus-específicos, estas posiciones son particularmente adecuadas para diseñar un cebador eficaz en la amplificación locus-específica del exón 2, exón 3 o exón 4. Los cebadores pueden ser de diferente longitud. En una modalidad específica, la longitud del cebador es aproximadamente 5-50 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es aproximadamente 10-30 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud de los cebadores es aproximadamente 20-25 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad del objetivo ADN o ARN requerido, así como de las condiciones en las que se usa el cebador, tales como temperatura y fuerza iónica.
En una modalidad específica, la presente invención se refiere a un método descrito anteriormente caracterizado además porque dichas posiciones constituyen el extremo 3' del cebador que se usa para la amplificación del exón 2, exón 3 o exón
4. Así, de las posiciones descritas anteriormente, se pueden diseñar los cebadores directos así como inversos que tengan su extremo 3' en estas posiciones específicas. El cebador inverso que tiene su extremo 3' en una de las posiciones específicas del intrón 2 mencionadas anteriormente permitirá la amplificación locus-específica del exón 2 del alelo HLA-B. El cebador directo que tiene su extremo 3' en una de las posiciones específicas del intrón 2 mencionadas anteriormente permitirá la amplificación locus-específica del exón 3 del alelo HLA-B. El cebador inverso que tiene su extremo 3' en una de las posiciones específicas del intrón 3 mencionadas anteriormente permitirá la amplificación locus-específica del exón 3 del alelo HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivo. El cebador directo que tiene su extremo 3' en una de las posiciones específicas del intrón 3 mencionadas anteriormente permitirá la amplificación locus-específica del exón 4 del alelo HLA-B. Los cebadores pueden ser de diferente longitud. En una modalidad específica, la longitud del cebador es aproximadamente 5-50 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud del cebador es aproximadamente 10-30 nucleótidos. En otra modalidad específica, la longitud de los cebadores es aproximadamente 20-25 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad del objetivo ADN o ARN requerido, así como de las condiciones en las que se usa el cebador, tales como temperatura y fuerza iónica.
La presente descripción se refiere además a un método para la tipificación de HLA-A caracterizado además porque el cebador se elige de la siguiente lista:
• para la amplificación del exón 2 de HLA-A (tabla 1):
5'ATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (sec. con núm. de ident. 1)
5'GATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (sec. con núm. de ident. 2)
5'GGATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (sec. con núm. de ident. 3)
5'YGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (sec. con núm. de ident. 4)
5'GYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (sec. con núm. de ident. 5)
5'GGYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (sec. con núm. de ident. 6)
5'GGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3' (sec. con núm. de ident. 7)
5'GGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3' (sec. con núm. de ident. 8)
5'AGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3' (sec. con núm. de ident. 9)
5'AAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3' (sec. con núm. de ident. 10)
5'CAAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT3' (sec. con núm. de ident. 11)
5'CTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3' (sec. con núm. de ident. 12)
5'TCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3' (sec. con núm. de ident. 13)
5'CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3' (sec. con núm. de ident. 14)
5'CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3' (sec. con núm. de ident. 15)
5'GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3' (sec. con núm. de ident. 16)
5'GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG3' (sec. con núm. de ident. 17)
5'TCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3' (sec. con núm. de ident. 18)
5'CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3' (sec. con núm. de ident. 19)
5'CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3' (sec. con núm. de ident. 20)
5'GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3' (sec. con núm. de ident. 21)
5'GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3' (sec. con núm. de ident. 22)
5'GGGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC3' (sec. con núm. de ident. 23)
5'CCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3' (sec. con núm. de ident. 30)
5' GCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3' (sec. con núm. de ident. 31)
5'CGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3' (sec. con núm. de ident. 32)
5'GCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3' (sec. con núm. de ident. 33)
5'GGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3' (sec. con núm. de ident. 34)
5'AGGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA3' (sec. con núm. de ident. 35)
5'AGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3' (sec. con núm. de ident. 36)
5'AAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3' (sec. con núm. de ident. 37)
5'WAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3' (sec. con núm. de ident. 38)
5'TWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3' (sec. con núm. de ident. 39)
5'GTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3' (sec. con núm. de ident. 40)
5'GGTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG3' (sec. con núm. de ident. 41)
5'CCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3' (sec. con núm. de ident. 42) 5'ACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3' (sec. con núm. de ident. 43) 5'AACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3' (sec. con núm. de ident. 44) 5'AAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3' (sec. con núm. de ident. 45) 5'GAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3' (sec. con núm. de ident. 46) 5'TGAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC3' (sec. con núm. de ident. 47) 5'YCCVGCCCCGACCAACCYGG3' (sec. con núm. de ident. 48) 5'GYCCVGCCCCGACCAACCYGG3' (sec. con núm. de ident. 49) 5'YGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3' (sec. con núm. de ident. 50) 5'CYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3' (sec. con núm. de ident. 51) 5'CCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3' (sec. con núm. de ident. 52) 5'CCCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG3' (sec. con núm. de ident. 53)
• para la amplificación del exón 3 de HLA-A (tabla 2; tabla 3):
5'CGGACGGGCCRGGTSRCCCA3' (sec. con núm. de ident. 54) 5'ACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3' (sec. con núm. de ident. 55) 5'CACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3' (sec. con núm. de ident. 56) 5'CCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3' (sec. con núm. de ident. 57) 5'CCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3' (sec. con núm. de ident. 58) 5'CCCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA3' (sec. con núm. de ident. 59) 5'GGTCCGAGATCCRCCCCGAA3' (sec. con núm. de ident. 60) 5'GGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3' (sec. con núm. de ident. 61) 5'CGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3' (sec. con núm. de ident. 62) 5'CCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3' (sec. con núm. de ident. 63) 5'TCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3' (sec. con núm. de ident. 64) 5'CTCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA3' (sec. con núm. de ident. 65) 5'CCCCGAAGCCGCGGGACYCC3' (sec. con núm. de ident. 66) 5'RCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3' (sec. con núm. de ident. 67) 5'CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3' (sec. con núm. de ident. 68) 5'CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3' (SEQ NO 69) 5'TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3' (sec. con núm. de ident. 70) 5'ATCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC3' (sec. con núm. de ident. 71) 5'CCCGAAGCCGCGGGACYCCG3' (sec. con núm. de ident. 72) 5'CCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3' (sec. con núm. de ident. 73) 5'RCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3' (sec. con núm. de ident. 74) 5'CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3' (sec. con núm. de ident. 75) 5'CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3' (sec. con núm. de ident. 76) 5'TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG3' (sec. con núm. de ident. 77) 5'CGCGGGACYCCGAGACCCTT3' (sec. con núm. de ident. 84) 5'CCGCGGGACYCCGAGACCCTT3' (sec. con núm. de ident. 85) 5'GCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3' (sec. con núm. de ident. 86) 5'AGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3' (sec. con núm. de ident. 87) 5'AAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3' (sec. con núm. de ident. 88) 5'GAAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT3' (sec. con núm. de ident. 89) 5'GACYCCGAGACCCTTGDCCC3' (sec. con núm. de ident. 90) 5'GGACYCCGAGACCCTTGDCCC3' (sec. con núm. de ident. 91) 5'GGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3' (sec. con núm. de ident. 92) 5'CGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3' (sec. con núm. de ident. 93) 5'GCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3' (sec. con núm. de ident. 94) 5'CGCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC3' (sec. con núm. de ident. 95) 5'GACCCTTGDCCCGGGAGAGG3' (sec. con núm. de ident. 96) 5'AGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3' (sec. con núm. de ident. 97) 5'GAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3' (sec. con núm. de ident. 98) 5'CGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3' (sec. con núm. de ident. 99) 5'CCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3' (sec. con núm. de ident. 100) 5'YCCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG3' (sec. con núm. de ident. 101) 5'GTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (sec. con núm. de ident. 102) 5'AGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (sec. con núm. de ident. 103) 5'CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (sec. con núm. de ident. 104)
5'TCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (sec. con núm. de ident. 105) 5'TTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (sec. con núm. de ident. 106) 5'TTTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (sec. con núm. de ident. 107) 5'AGCCCGGGAGATCTAYAGGC3' (sec. con núm. de ident. 150) 5'CAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3' (sec. con núm. de ident. 151) 5'CCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3' (sec. con núm. de ident. 152) 5'GCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3' (sec. con núm. de ident. 153) 5'GGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3' (sec. con núm. de ident. 154) 5'AGGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC3' (sec. con núm. de ident. 155) 5'CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3' (sec. con núm. de ident. 156) 5'CCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3' (sec. con núm. de ident. 157) 5'TCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3' (sec. con núm. de ident. 158) 5'CTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3' (sec. con núm. de ident. 159) 5'TCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3' (sec. con núm. de ident. 160) 5'GTCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG3' (sec. con núm. de ident. 161) 5'CCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3' (sec. con núm. de ident. 162) 5'TCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3' (sec. con núm. de ident. 163) 5'GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3' (sec. con núm. de ident. 164) 5'GGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3' (sec. con núm. de ident. 165) 5'TGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3' (sec. con núm. de ident. 166) 5'TTGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT3' (sec. con núm. de ident. 167) 5'CTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3' (sec. con núm. de ident. 168) 5'TCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3' (sec. con núm. de ident. 169) 5'TTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3' (sec. con núm. de ident. 170) 5'ATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3' (sec. con núm. de ident. 171) 5'TATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3' (sec. con núm. de ident. 172) 5'ATATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT3' (sec. con núm. de ident. 173) 5'GGGYGATATTCTAGTGTTGG3' (sec. con núm. de ident. 174) 5'AGGGYGATATTCTAGTGTTGG3' (sec. con núm. de ident. 175) 5'GAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3' (sec. con núm. de ident. 176) 5'GGAGGGYGATATrCTAGTGTTGG3' (sec. con núm. de ident. 177) 5'GGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3' (sec. con núm. de ident. 178) 5'AGGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG3' (sec. con núm. de ident. 179) 5'GGAGGGYGATATTCTAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 180) 5'GGGAGGGYGATATTCTAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 181) 5'AGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 182) 5'GAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 183) 5'AGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 184) 5'CAGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 185) 5'CCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3' (sec. con núm. de ident. 186) 5'ACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3' (sec. con núm. de ident. 187) 5'AACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3' (sec. con núm. de ident. 188) 5'AAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3' (sec. con núm. de ident. 189) 5' GAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3 ' (sec. con núm. de ident. 190) 5'GGAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC3' (sec. con núm. de ident. 191) 5'AGGATCTGGAAACCCAGGAG3' (sec. con núm. de ident. 192) 5'CAGGATCTGGAAACCCAGGAG3' (sec. con núm. de ident. 193) 5'ACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3' (sec. con núm. de ident. 194) 5'TACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3' (sec. con núm. de ident. 195) 5'GTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3' (sec. con núm. de ident. 196) 5'GGTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG3' (sec. con núm. de ident. 197) 5'TCAGAGTCACTCTCTGGTAC3' (sec. con núm. de ident. 198) 5'CTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3' (sec. con núm. de ident. 199) 5'CCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3' (sec. con núm. de ident. 200) 5'ACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3' (sec. con núm. de ident. 201) 5'AACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3' (sec. con núm. de ident. 202) 5'GAACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC3' (sec. con núm. de ident. 203)
• para la amplificación del exón 4 de HLA-A (tabla 4): 5'TTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3' (sec. con núm. de ident. 204) 5'GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3'(sec. con núm. de ident. 205) 5'GGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3' (sec. con núm. de ident. 206) 5'GGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3' (sec. con núm. de ident. 207) 5'TGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3' (sec. con núm. de ident. 208) 5'CTGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT3' (sec. con núm. de ident. 209) 5'GGTGTCCTGTCCATTCTCAA3' (sec. con núm. de ident. 24) 5'RGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3' (sec. con núm. de ident. 25) 5'CRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3' (sec. con núm. de ident. 26) 5'CCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3' (sec. con núm. de ident. 27) 5'CCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3' (sec. con núm. de ident. 28) 5'TCCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA3' (sec. con núm. de ident. 29) 5'CTGGWGGAGTGTCCCATKAC3' (sec. con núm. de ident. 210) 5'GCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3' (sec. con núm. de ident. 211) 5'TGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3' (sec. con núm. de ident. 212) 5'RTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3' (sec. con núm. de ident. 213) 5'YRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3' (sec. con núm. de ident. 214) 5'GYRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC3' (sec. con núm. de ident. 215) 5'GTCCCATKACAGATRCMMAA3' (sec. con núm. de ident. 216) 5'TGTCCCATKACAGATRCMMAA3' (sec. con núm. de ident. 217) 5'GTGTCCCATKACAGATRCMMAA3' (sec. con núm. de ident. 218) 5'AGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3' (sec. con núm. de ident. 219) 5'GAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3' (sec. con núm. de ident. 220) 5'GGAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA3' (sec. con núm. de ident. 221)
En una modalidad de la invención, los cebadores usados en el método se escogen de la lista:
• para la amplificación del exón 2 de HLA-B (tabla 5):
5'ACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 108) 5'AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 109) 5'CAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 110) 5'CCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 111) 5'MCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 112) 5'GMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 113) 5'YGMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 314)
• para la amplificación del exón 3 de HLA-B (tabla 6; tabla 7):
5'CYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 114) 5'CCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 115) 5'GCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 116) 5'GGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 117) 5'CGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 118) 5'CCGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 119) 5'CCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 120) 5'ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 121) 5'TACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 122) 5'TTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 123) 5'TTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 124) 5'GTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 125) 5'CGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 222) 5'GCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 223) 5'CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 224) 5'CGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 225) 5'TCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 226) 5'CTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 227) 5'TCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 228) 5'TTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 229) 5'CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 230) 5'TCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 231)
5'TTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 232)
5'CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 233)
5'TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 234)
5'YTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 235)
5'CYTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 236)
5'GATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 237)
5'TGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 238)
5'CTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 239)
5'GCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 240)
5'CGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 241)
5'GCGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 242)
5'GCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 243)
5'CGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 244)
5'GCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 245)
5'AGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 246)
5'TAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 247)
5'CTAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 248)
5'TCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 249)
5'CTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 250)
5'TCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 251)
5'TTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 252)
5'ATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 253)
5'CATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 254)
• para la amplificación del exón 4 de HLA-B (tabla 8):
5'AGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 255)
5'GAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 256)
5'GGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 257)
5'AGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 258)
5'TAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 259)
5'ATAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 260)
5'TGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 261)
5'GTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 262)
5'GGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 263)
5'AGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 264)
5'CAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 265)
5'CCAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 266)
5'TCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 267)
5'GTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 268)
5'GGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 269)
5'TGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 270)
5'CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 271)
5'KCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 272)
5'GKCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 273)
5'TSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 274)
5'GTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 275)
5'TGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 276)
5'GTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 277)
5'GGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 278)
5'GGGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 279)
5'GWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 280)
5'TGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 281)
5'CTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 282)
5'CCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 283)
5'GCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 284)
5'CGCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 285)
En la presente descripción se describen además métodos en donde los cebadores se seleccionan de la siguiente lista:
• para la amplificación del exón 2 de HLA-C (tabla 9):
5'GTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (sec. con núm. de ident. 126)
5'GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (sec. con núm. de ident. 127)
5'CGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (sec. con núm. de ident. 128)
5'CCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (sec. con núm. de ident. 129)
5'YCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (sec. con núm. de ident. 130)
5'CYCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (sec. con núm. de ident. 131)
• para la amplificación del exón 3 de HLA-C (tabla 10):
5'CGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (sec. con núm. de ident. 132)
5'TCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (sec. con núm. de ident. 133)
5'GTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (sec. con núm. de ident. 134)
5'GGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (sec. con núm. de ident. 135)
5'GGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (sec. con núm. de ident. 136)
5'CGGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT3' (sec. con núm. de ident. 137)
5'CGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3' (sec. con núm. de ident. 138)
5'TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3' (sec. con núm. de ident. 139)
5'CTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3' (sec. con núm. de ident. 140)
5'CCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3' (sec. con núm. de ident. 141)
5'CCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3' (sec. con núm. de ident. 142)
5' ACCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3 ' (sec. con núm. de ident. 143)
• para la amplificación del exón 4 de HLA-C (tabla 11):
5'GTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3' (sec. con núm. de ident. 286)
5'GGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3' (sec. con núm. de ident. 287)
5'AGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3' (sec. con núm. de ident. 288)
5'CAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3' (sec. con núm. de ident. 289)
5'CCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3' (sec. con núm. de ident. 290)
5'CCCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC3' (sec. con núm. de ident. 291)
5'TGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3' (sec. con núm. de ident. 292)
5'CTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3' (sec. con núm. de ident. 293)
5'GCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3' (sec. con núm. de ident. 294)
5'GGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3' (sec. con núm. de ident. 295)
5'AGGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3' (sec. con núm. de ident. 296)
5'CAGGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC3' (sec. con núm. de ident. 297)
5'CTCAGGATRGTCACATGGSC3' (sec. con núm. de ident. 298)
5'TCTCAGGATRGTCACATGGSC3' (sec. con núm. de ident. 299)
5'TTCTCAGGATRGTCACATGGSC3' (sec. con núm. de ident. 300)
5'RTTCTCAGGATRGTCACATGGSC3' (sec. con núm. de ident. 301)
5'CRTTCTCAGGATRGTCACATGGSC3' (sec. con núm. de ident. 302)
5'CCRTTCTCAGGATRGTCACATGGSC3' (sec. con núm. de ident. 303)
5'GCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3' (sec. con núm. de ident. 78)
5'GGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3' (sec. con núm. de ident. 79)
5'GGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3' (sec. con núm. de ident. 80)
5'TGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3' (sec. con núm. de ident. 81)
5'ATGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3' (sec. con núm. de ident. 82)
5'CATGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA3' (sec. con núm. de ident. 83)
5'SCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 304)
5'CSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 305)
5'TCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 306)
5'GTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 307)
5'TGTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 308)
5'GTGTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT3' (sec. con núm. de ident. 309)
En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a cualquier método descrito anteriormente, caracterizado además porque la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con al menos los siguientes cebadores directos:
• para HLA-B: IBPinl: B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG (sec. con núm. de ident. 145) En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a cualquier método descrito anteriormente, caracterizado además porque la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con al menos los siguientes cebadores inversos:
• para HLA-B: 3ex4IBbio: B-TCGGCAGCCCCTCATGCTGT (sec. con núm. de ident. 312);
En una modalidad muy específica, la presente invención se relaciona con cualquier método descrito anteriormente, caracterizado además porque:
- -
- la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:
● para HLA-B: IBPin1 (B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG; sec. con núm. de ident. 145) y IB3Pin2bio (B-AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC; sec. con núm. de ident. 109);
- -
- la amplificación del exón 3 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:
● para HLA-B: IB5Pin 2bio (B-CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG; sec. con núm. de ident. 224) y IB3Pin3bio (B-TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC; sec. con núm. de ident. 234);
- -
- la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:
● para HLA-B: 5ex4IBbio (B-TCACATGGGTGGTCCTAGG; sec. con núm. de ident. 267) y 3ex4IBbio (B-TCGGCAGCCCTCATGCTGT; sec. con núm. de ident. 312);
El experto entenderá que estos cebadores (sec. con núms. de ident. 1 a 314) pueden adaptarse mediante la adición o supresión de uno o más nucleótidos en sus extremidades. Tales adaptaciones pueden ser necesarias, por ejemplo, si se cambian las condiciones de amplificación, si el material amplificado es ARN en lugar de ADN, según sea el caso, por ejemplo, en el sistema NASBA.
La presente descripción se refiere además a un cebador como el descrito anteriormente, para su uso en la amplificación del exón 2 de los alelos HLA-A, HLA-B, o HLA-C, dicho cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locusespecífica en el intrón 2 de HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivamente; más específicamente, dicho cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica situada en la posición:
- •
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 o 181 del intrón 2 de HLA-A (Fig. 1); o
- •
- 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B (Fig. 2); o
- •
- 84, 107 o 142 del intrón 2 de HLA-C (Fig. 3);
más específicamente, dicho cebador se elige de la tabla 1 (para la amplificación del exón 2 de HLA-A) de la tabla 5 (para la amplificación del exón 2 de HLA-B) o de la tabla 9 (para a amplificación del exón 2 de HLA-C).
La presente descripción también se refiere adicionalmente a un cebador como el descrito anteriormente, para su uso en la amplificación del exón 3 de los alelos HLA-A, HLA-B, o HLA-C, dicho cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 (cebador directo) o a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 (cebador inverso), de HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivamente; más específicamente, dicho cebador se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica situada en la posición:
- •
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 o 181 del intrón 2 de HLA-A (Fig. 1) o 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150 del intrón 3 de HLA-A (Fig. 4); o
- •
- 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B (Fig. 2) o 42, 46, 65, 68, 96, del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5); o
- •
- 84, 107 o 142 del intrón 2 de HLA-C (Fig. 3).
más específicamente, dicho cebador se elige de la tabla 2 o tabla 3 (para la amplificación del exón 3 de HLA-A) de la tabla 6
o tabla 7 (para la amplificación del exón 3 de HLA-B).
La presente descripción se refiere además a un cebador como se describió anteriormente, para usar en la amplificación del exón 4 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C, dicho cebador hibrida específicamente una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivamente; más específicamente, dicho cebador hibrida específicamente una secuencia objetivo locus-específica situada en la posición:
- •
- 501, 525, 561 o 571 del intrón 3 de HLA-A (Fig. 4); o
- •
- 438, 502, 524, 547 o 571 del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5); o
- •
- 461, 477, 527, 545 o 561 del intrón 3 de HLA-C (Fig. 6).
más específicamente, dicho cebador se elige de la tabla 4 (para la amplificación del exón 4 de HLA-A) de la tabla 8 (para la amplificación del exón 4 de HLA-B) o de la tabla 11 (para a amplificación del exón 4 de HLA-C).
La presente descripción se refiere además a un conjunto cebador que consiste en una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió anteriormente, para uso en la amplificación de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C del exón 2. En un aspecto específico, la presente descripción se refiere a la combinación del cebador directo 5APBio (sec. con núm. de ident. 144) para HLA-A, IBPin1 (sec. con núm. de ident. 145) para HLA-B o 5CIN1 (sec. con núm. de ident. 146) para HLA-C y un cebador inverso que hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 de HLA-A, HLA-B
o HLA-C respectivamente; más específicamente, dicho cebador inverso hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica situada en la posición:
- •
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 o 181 del intrón 2 de HLA-A; o
- •
- 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B; o
- •
- 84, 107 o 142 del intrón 2 de HLA-C;
más específicamente, dicho cebador inverso se elige de la tabla 1 (para la amplificación del exón 2 de HLA-A) de la tabla 5 (para la amplificación del exón 2 de HLA-B) o de la tabla 9 (para a amplificación del exón 2 de HLA-C).
La presente descripción se refiere además a una conjunto cebador que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como descrito anteriormente, para su uso en la amplificación del exón 3 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C En un aspecto específico, la presente descripción se refiere a la combinación de un cebador directo que hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 de HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivamente; más específicamente, dicho cebador directo hibrida específicamente a unas secuencias objetivos locus-específicas situadas en la posición:
- •
- 67, 96, 109, 110, 118, 123, 131 o 181 del intrón 2 de HLA-A; o
- •
- 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B; o
- •
- 84, 107 o 142 del intrón 2 de HLA-C;
más específicamente, dicho cebador directo se elige de la tabla 2 (para la amplificación del exón 3 de HLA-A), de la tabla 6 (para la amplificación del exón 3 de HLA- B) o de la tabla 10 (para la amplificación del exón 3 de HLA- C) y un cebador inverso que hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-A, HLA-B o HLA-C respectivamente; más específicamente, dicho cebador inverso hibrida específicamente a unas secuencias objetivo locusespecíficos situadas en la posición:
- •
- 32, 50, 62, 73, 83, 86, 118, 130, 150 (Fig. 4) del intrón 3 de HLA-A; o
- •
- 42, 46, 65, 68, 96, del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5);
más específicamente, dicho cebador inverso se elige de la tabla 3 (para la amplificación del exón 3 de HLA-A) de la tabla 7 (para la amplificación del exón 3 de HLA-B) o de 3CIN3 (sec. con núm. de ident. 149) (para la amplificación del exón 3 de HLA-C).
La presente descripción se refiere además a una conjunto cebador que consiste en una combinación de un cebador directo y un cebador inverso como descrito anteriormente, para su uso en la amplificación del exón 4 de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C. En un aspecto específico, la presente descripción se refiere a la combinación de un cebador directo hibridarse específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de respectivamente HLA-A, HLA-B o HLA-C; más específicamente, dicho cebador hibrida específicamente a unas secuencias objetivas locus-específicas situadas en la posición:
- •
- 501, 525, 561 o 571 del intrón 3 de HLA-A (Fig. 4); o
- •
- 438, 502, 524, 547 o 571 del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5); o
- •
- 461, 477, 527, 545 o 561 del intrón 3 de HLA-C (Fig. 6).
más específicamente, dicho cebador directo se elige de la tabla 4 (para la amplificación del exón 4 de HLA-A), de la tabla 8 (para la amplificación del exón 4 de HLA- B) o de la tabla 11 (para la amplificación del exón 4 de HLA-C) y un cebador inverso 3ex4APbio (sec. con núm. de ident. 311) para HLA-A, 3ex4IBbio (sec. con núm. de ident. 312) para HLA-B o 3ex4ICbio (sec. con núm. de ident. 313) para HLA-C.
En un aspecto específico, los cebadores se usan en una mezcla que permite la amplificación separada del exón 2 y exón 3. Como consecuencia, la presente descripción se relaciona con una mezcla cebador múltiple que contiene al menos un par cebador como se describió anteriormente para la amplificación del exón 2 y un par cebador como se describió anteriormente para la amplificación del exón 3.
10 En un aspecto específico, la mezcla cebador múltiple para la amplificación separada del exón 2 y exón 3 comprende los siguientes conjuntos de cebadores:
- -
- para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-A:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec con núm. de ident.
- Exón 1-2
- 5APbio (5') B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC 144
- 3ex2APbio (3') B-ATCTCGGACCCGGAGACTGT 1
- Exón 3
- 5ex3APbio (5') B-CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 104
- 3ex3APbio (3') B-CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 156
- -
- para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-B:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec con núm. de ident.
- Exón 2
- IBPinlbio (5') B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG 145
- IB3Pin2bio (3') B-AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 109
- Exón 3
- IB5Pin2bio(5') B-CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 224
- IB3Pin3bio (3') B-TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 234
20 - para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-C:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec con núm. de ident.
- Exón 2
- 5CIN1(5') B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA 146
- IC3Pin2bio(3') B-GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 127
- Exón 3
- IC5Pin2bio(5') B-TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 139
- 3CIN3 (3') B-GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT 149
En un aspecto específico, los cebadores se usan en una mezcla que permite la amplificación separada del exón 2, exón 3 y 25 exón 4. Como consecuencia, la presente descripción se relaciona con una mezcla cebadora múltiple que contiene al menos un par cebador como se describió anteriormente para la amplificación del exón 2 , un par cebador como se describió anteriormente para la amplificación del exón 3 y un par cebador como se describió anteriormente para la amplificación del exón 4.
30 En un aspecto específico, la mezcla cebadora múltiple para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 comprende los siguientes conjuntos de cebadores:
- -
- para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec con núm. de ident.
- Exón 1-2
- 5APbio (5') B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC 144
- 3ex2APbio (3') B-ATCTCGGACCCGGAGACTGT 1
- Exón 3
- 5ex3APbio (5') B-CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 104
- 3ex3APbio (3') B-CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 156
- Exón 4
- Sex4APbio (5') B-GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 205
- 3ex4APbio (3') B-TTGGGCAGACCCTCATGCTGC 311
- -
- para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec con núm. de ident.
- Exón 2
- IBPin1bio (5') B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG 145
- IB3Pin2bio (3') B-AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 109
- Exón 3
- IB5Pin2bio(5') B-CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 224
- IB3Pin3bio (3') B-TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 234
- Exón 4
- 5ex4IBbio (5') B-TCACATGGGTGGTCCTAGG 267
- 3ex4IBbio (3') B-TCGGCAGCCCCTCATGCTGT 312
- -
- para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-C:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec con núm. de ident.
- Exón 2
- 5CIN1(5') B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA 146
- IC3Pin2bio(3') B-GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 127
- Exón 3
- IC5Pin2bio(5') B-TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 139
- 3CIN3 (3') B-GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT 149
- Exón 4
- Sex4ICbio(5') B-TCTCAGGATRGTCACATGGSC 299
- 3ex4ICbio(3') B-CATCTCAGGGTGMRGGGCTT 313
Los cebadores se pueden marcar. El marcaje se puede llevar a cabo por cualquier método conocido por la persona 10 experimentada en la técnica. La naturaleza del marcador puede ser isotópica (32P, 35S, etc.) o no isotópica (biotina, digoxigenina, etc.).
Los oligonucleótidos usados como cebadores pueden comprender además análogos de nucleótidos tales como fosforodiatos (Matsukura y otros 1987), alquilfosforodiatos (Miller y otros, 1979) o ácidos nucleicos peptídicos (Nielsen y 15 otros , 1991; Nielsen y otros, 1993) o pueden contener agentes intercalantes (Asseline y otros, 1984). Como la mayoría de las otras variaciones o modificaciones introducidas dentro de las secuencias originales de ADN, estas variaciones requerirán adaptaciones con respecto a las condiciones bajo las que el oligonucleótido debe ser usado para obtener la especificidad y sensibilidad requerida. Sin embargo, los resultados eventuales de la hibridación serán esencialmente los mismos que aquellos obtenidos con los oligonucleótidos sin modificar. La introducción de estas modificaciones puede ser 20 ventajosa para influenciar positivamente las características tales como la cinética de hibridación, reversibilidad de la formación del híbrido, estabilidad biológica de las moléculas de oligonucleótidos, etc.
La presente descripción se relaciona además con el uso de los cebadores, los conjuntos de cebadores y/o la mezcla cebadora de la descripción en un método para la amplificación locus-específica y separada del exón 2, exón 3 y/o exón 4 25 de HLA-A, HLA-B o HLA-C.
La presente descripción se relaciona además con un método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- si es necesario, la liberación, aislamiento y/o concentración de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- amplificación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención;
(iii) tipificación específica de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C presentes en dicha muestra.
La liberación, concentración y aislamiento de los ácidos nucleicos de la muestra se puede hacer por cualquier método conocido en la técnica. En la actualidad, diversos estuches comerciales están disponibles, tales como el estuche QIAamp Blood de Qiagen (Hilden, Alemania) para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras de sangre o el 'Estuche de Preparación de molde de PCR de pureza alta' (Roche Diagnostics, Bruselas, Bélgica). Otros procedimientos bien conocidos para el aislamiento de ADN o ARN a partir de una muestra biológica están además disponibles (Sambrook y otros, 1989). Los ácidos nucleicos se amplifican posteriormente por el método de la invención descrito anteriormente. Los productos de esta etapa de amplificación son después idealmente adecuados para la tipificación del alelo específico presente en la muestra. Actualmente se conocen 169 alelos diferentes de HLA-A, 332 alelos diferentes de HLA -B y 87 alelos diferentes de HLA-C. La tipificación de estos alelos se puede hacer por cualquier método conocido en la técnica, tales como el análisis dúplex de los productos de PCR (Clay y otros, 1994) , análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple del producto de PCR (PCR-SSCP; Yoshida y otros, 1992), tipificación basada en la secuencia (SBT; Santamaria y otros, 1992 y 1993) , el uso de cebadores específicos a la secuencia en la reacción de PCR (PCR-SSP; Olerup y Zetterquist, 1991), el uso de PCR en combinación con el sondeo de oligonucleótido específico a la secuencia (PCR -SSOP; Saiki y otros, 1986), Membrana de transferencia puntual convencional, transferencia Southern, sándwich o sondeo por Membrana de transferencia puntual inverso (Saiki y otros, 1989). Para obtener resultados rápidos y fáciles si se involucra una multitud de sondas, puede ser conveniente un formato de hibridación inversa. Como consecuencia, en una modalidad preferida, las sondas seleccionadas se inmovilizan a ciertos lugares sobre un soporte sólido y los ácidos polinucleicos amplificados se marcan para permitir la detección de los híbridos formados. El término "soporte sólido" puede referirse a cualquier sustrato al que una sonda de oligonucleótido se puede acoplar, con tal que conserve sus características de hibridación y con tal que el nivel de fondo de la hibridación se mantenga bajo. Por lo general, el sustrato sólido será una placa de microtitulación (por ejemplo, en la técnica de DEIA), una membrana (por ejemplo, nilón o nitrocelulosa) o una microesfera (perla) o un chip. Antes de la aplicación a la membrana o fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico para facilitar la fijación o mejorar la eficiencia de hibridación. Dichas modificaciones pueden abarcar poner la cola al homopolímero, acoplar con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH2, grupos SH, grupos carboxílicos, o acoplar con biotina, haptenos o proteínas.
La presente descripción además se relaciona con un estuche de diagnóstico para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra que comprende los siguientes componentes:
- (i)
- cuando sea adecuado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- un conjunto cebador o una mezcla cebadora de acuerdo con la descripción;
- (iv)
- un medio para la tipificación de los alelos específicos de HLA-A , HLA-B o HLA-C presentes en dicha muestra.
Un estuche de diagnóstico específico y muy fácil de usar es el Ensayo de Sonda de una Línea para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C en una muestra que comprende los siguientes componentes:
- (i)
- cuando sea adecuado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- un par cebador o una mezcla cebadora de acuerdo con la invención;
(iii) al menos una sonda que se híbrida específicamente con uno de los alelos HLA-A, HLA-B o HLA-C, fijado a un soporte sólido;
- (iv)
- un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;
- (v)
- una solución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha solución;
- (vi)
- cuando sea adecuado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.
En esta modalidad, el conjunto de sondas seleccionadas se inmoviliza a una tira de membrana en una forma de línea. Dichas sondas se pueden inmovilizar individualmente o como mezclas a los lugares delineados. Los ácidos polinucleicos de HLA-A, HLA-B o HLA-C amplificados se pueden marcar con biotina, y el híbrido se puede después detectar con un sistema de desarrollo de color no radiactivo, a través de un acoplamiento con biotina-estreptavidina.
El término "tampón de hibridación" significa un tampón que permite una reacción de hibridación entre las sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los productos amplificados, bajo las condiciones de rigurosidad adecuadas.
El término "solución de lavado" significa una solución que permite el lavado de los híbridos formados bajo las condiciones de rigurosidad adecuadas.
La presente descripción se relaciona además con el uso de los cebadores, los conjuntos de cebadores y/o las mezclas cebadoras de la invención para la fabricación de un estuche de diagnóstico o Ensayo de sonda de Línea para la tipificación de HLA Clase I.
A lo largo de esta descripción y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra forma, la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa indicada o grupo de número entero o etapas indicadas pero no a la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
La presente invención se relaciona con métodos, un estuche de diagnóstico, y un estuche de ensayo de sonda de línea como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas 1 a 12
Figura 1. Alineación de 29 secuencias del intrón 2 de HLA-A. La secuencia consenso se muestra en la parte superior de la figura. Los nucleótidos conformes a la secuencia consenso se indican con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia consenso se indican. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo con el ejemplo 1. Figura 2. Alineación de 38 secuencias del intrón 2 de HLA-B. La secuencia consenso se muestra en la parte superior de la figura. Los nucleótidos conformes a la secuencia consenso se indican con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia consenso se indican. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo con el ejemplo 1. Figura 3. Alineación de 13 secuencias del intrón 2 de HLA-C. La secuencia consenso se muestra en la parte superior de la figura. Los nucleótidos conformes a la secuencia consenso se indican con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia consenso se indican. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo con el ejemplo 1. Figura 4. Alineación de 12 secuencias del intrón 3 de HLA-A. La secuencia consenso se muestra en la parte superior de la figura. Los nucleótidos conformes a la secuencia consenso se indican con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia consenso se indican. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. Figura 5. Alineación de 22 secuencias del intrón 3 de HLA-B. La secuencia consenso se muestra en la parte superior de la figura. Los nucleótidos conformes a la secuencia consenso se indican con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia consenso se indican. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. Figura 6. Alineación de 12 secuencias del intrón 3 de HLA-C. La secuencia consenso se muestra en la parte superior de la figura. Los nucleótidos conformes a la secuencia consenso se indican con una línea vertical. Los nucleótidos que difieren de la secuencia consenso se indican. N indica la ausencia de un nucleótido en esa posición. Figura 7. Resultados de un Ensayo de sonda de línea para la tipificación de HLA-A como se indica en el ejemplo 5. Los ácidos nucleicos se amplificaron mediante uso de: ( A) 5APBio (cebador directo; sec. con núm. de ident. 144) y 3APBio (cebador inverso; sec. con núm. de ident. 147) para la amplificación del exón 2 y el exón 3 de HLA-A en un amplicón sencillo; (B) la mezcla cebadora múltiple para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A. Las sondas con los números 1, 4, 9, 10, 12 y 13 claramente muestran una señal más fuerte después de la hibridación con los amplicones obtenidos mediante el uso de la mezcla cebadora múltiple (banda B) . Figura 8. Resultados de un Ensayo de sonda de línea para la tipificación de HLA-B tal como se indica en el ejemplo 6. Los ácidos nucleicos se amplificaron mediante uso de: (B) IBPin1 (cebador directo; sec. con núm. de ident.145) e IBPin3 (cebador inverso; sec. con núm. de ident.148) para la amplificación del exón 2 y el exón 3 de HLA-B en un amplicón simple;
(B) la mezcla cebadora múltiple para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-B. Las sondas con los números 9, 10, 18, 19, 20, 34 y 35 evidentemente muestran una señal más fuerte después de la hibridación con los amplicones obtenidos mediante el uso de la mezcla cebadora múltiple (tiras B).
TABLAS
Tabla 1. Cebadores inversos usados para la amplificación del exón 2 de HLA-A.
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 67
- ATCTCGGACCCGGAGACTGT 1
- GATCTCGGACCCGGAGACTGT 2
- GGATCTCGGACCCGGAGACTGT 3
- YGGATCTCGGACCCGGAGACTGT 4
- GYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT 5
- GGYGGATCTCGGACCCGGAGACTGT 6
- 96
- GGTCTCGGRGTCCCGCGGCT 7
- GGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT 8
- AGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT 9
- AAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT 10
- CAAGGGTCTCGGRGTCCCGCGGCT 11
- 109
- CTCCCGGGDCAAGGGTCTCG 12
- TCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG 13
- CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG 14
- CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG 15
- GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG 16
- GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTCG 17
- 110
- TCTCCCGGGDCAAGGGTCTC 18
- CTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC 19
- CCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC 20
- GCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC 21
- GGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC 22
- GGGCCTCTCCCGGGDCAAGGGTCTC 23
- 118
- CCTGGGCCTCTCCCGGGDCA 30
- GCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA 31
- CGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA 32
- GCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA 33
- GGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA 34
- AGGCGCCTGGGCCTCTCCCGGGDCA 35
- 123
- AGGCGCCTGGGCCTCTCCCG 36
- AAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG 37
- WAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG 38
- TWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG 39
- GTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG 40
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- GGTWAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCG 41
- 131
- CCGGGTWAAGGCGCCTGGGC 42
- ACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC 43
- AACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC 44
- AAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC 45
- GAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC 46
- TGAAACCGGGTWAAGGCGCCTGGGC 47
- 181
- YCCVGCCCCGACCAACCYGG 48
- GYCCVGCCCCGACCAACCYGG 49
- YGYCCVGCCCCGACCAACCYGG 50
- CYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG 51
- CCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG 52
- CCCYGYCCVGCCCCGACCAACCYGG 53
Tabla 2. Los cebadores directos usados para la amplificación del exón 3 de HLA-A. Tabla 3. Cebadores inversos usados para la amplificación del exón 3 de HLA-A.
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 67
- CGGACGGGCCRGGTSRCCCA 54
- ACGGACGGGCCRGGTSRCCCA 55
- CACGGACGGGCCRGGTSRCCCA 56
- CCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA 57
- CCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA 58
- CCCCACGGACGGGCCRGGTSRCCCA 59
- 96
- GGTCCGAGATCCRCCCCGAA 60
- GGGTCCGAGATCCRCCCCGAA 61
- CGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA 62
- CCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA 63
- TCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA 64
- CTCCGGGTCCGAGATCCRCCCCGAA 65
- 109
- CCCCGAAGCCGCGGGACYCC 66
- RCCCCGAAGCCGCGGGACYCC 67
- CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC 68
- CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC 69
- TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC 70
- ATCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCC 71
- 110
- CCCGAAGCCGCGGGACYCCG 72
- CCCCGAAGCCGCGGGACYCCG 73
- RCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG 74
- CRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG 75
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- CCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG 76
- TCCRCCCCGAAGCCGCGGGACYCCG 77
- 118
- CGCGGGACYCCGAGACCCTT 84
- CCGCGGGACYCCGAGACCCTT 85
- GCCGCGGGACYCCGAGACCCTT 86
- AGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT 87
- AAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT 88
- GAAGCCGCGGGACYCCGAGACCCTT 89
- 123
- GACYCCGAGACCCTTGDCCC 90
- GGACYCCGAGACCCTTGDCCC 91
- GGGACYCCGAGACCCTTGDCCC 92
- CGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC 93
- GCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC 94
- CGCGGGACYCCGAGACCCTTGDCCC 95
- 131
- GACCCTTGDCCCGGGAGAGG 96
- AGACCCTTGDCCCGGGAGAGG 97
- GAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG 98
- CGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG 99
- CCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG 100
- YCCGAGACCCTTGDCCCGGGAGAGG 101
- 181
- GTTTAGGCCAAAAATCCCCC 102
- AGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 103
- CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 104
- TCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 105
- TTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 106
- TTTCAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 107
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 32
- AGCCCGGGAGATCTAYAGGC 150
- CAGCCCGGGAGATCTAYAGGC 151
- CCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC 152
- GCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC 153
- GGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC 154
- AGGCCAGCCCGGGAGATCTAYAGGC 155
- 50
- CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 156
- CCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 157
- TCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 158
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- CTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 159
- TCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 160
- GTCTCCCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 161
- 62
- CCCAAWTGTCTCCCCTCCTT 162
- TCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT 163
- GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT 164
- GGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT 165
- TGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT 166
- TTGGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT 167
- 73
- CTAGTGTTGGTCCCAAWTGT 168
- TCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT 169
- TTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT 170
- ATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT 171
- TATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT 172
- ATATTCTAGTGTTGGTCCCAAWTGT 173
- 83
- GGGYGATATTCTAGTGTTGG 174
- AGGGYGATATTCTAGTGTTGG 175
- GAGGGYGATATTCTAGTGTTGG 176
- GGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG 177
- GGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG 178
- AGGGAGGGYGATATTCTAGTGTTGG 179
- 86
- GGAGGGYGATATTCTAGTGT 180
- GGGAGGGYGATATTCTAGTGT 181
- AGGGAGGGYGATATTCTAGTGT 182
- GAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT 183
- AGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT 184
- CAGAGGGAGGGYGATATTCTAGTGT 185
- 118
- CCCAGGAGGAKTCCTCTCCC 186
- ACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC 187
- AACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC 188
- AAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC 189
- GAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC 190
- GGAAACCCAGGAGGAKTCCTCTCCC 191
- 130
- AGGATCTGGAAACCCAGGAG 192
- CAGGATCTGGAAACCCAGGAG 193
- ACAGGATCTGGAAACCCAGGAG 194
- TACAGGATCTGGAAACCCAGGAG 195
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- GTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG 196
- GGTACAGGATCTGGAAACCCAGGAG 197
- 150
- TCAGAGTCACTCTCTGGTAC 198
- CTCAGAGTCACTCTCTGGTAC 199
- CCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC 200
- ACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC 201
- AACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC 202
- GAACCTCAGAGTCACTCTCTGGTAC 203
Tabla 4. Cebadores directos usados para la amplificación del exón 4 de HLA-A.
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 501
- TTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 204
- GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 205
- GGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 206
- GGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 207
- TGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 208
- CTGGGTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 209
- 525
- GGTGTCCTGTCCATTCTCAA 24
- RGGTGTCCTGTCCATTCTCAA 25
- CRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA 26
- CCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA 27
- CCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA 28
- TCCCRGGTGTCCTGTCCATTCTCAA 29
- 561
- CTGGWGGAGTGTCCCATKAC 201
- GCTGGWGGAGTGTCCCATKAC 211
- TGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC 212
- RTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC 213
- YRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC 214
- GYRTGCTGGWGGAGTGTCCCATKAC 215
- 571
- GTCCCATKACAGATRCMMAA 216
- TGTCCCATKACAGATRCMMAA 217
- GTGTCCCATKACAGATRCMMAA 218
- AGTGTCCCATKACAGATRCMMAA 219
- GAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA 220
- GGAGTGTCCCATKACAGATRCMMAA 221
Tabla 5. Cebadores inversos usados para la amplificación del exón 2 de HLA-B. Tabla 6. Cebadores directos usados para la amplificación del exón 3 de HLA-B.
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 170
- ACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 108
- AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 109
- CAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 110
- CCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 111
- MCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 112
- GMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 113
- YGMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 314
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 35
- CYGGGGCGSAGGTCACGACT 114
- CCYGGGGCGSAGGTCACGACT 115
- GCCYGGGGCGSAGGTCACGACT 116
- GGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT 117
- CGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT 118
- CCGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT 119
- 170
- CCCGGTTTCATTTTCAGTTG 120
- ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 121
- TACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 122
- TTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 123
- TTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 124
- GTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 125
- CGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 222
- GCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 223
- CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 224
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 42
- CGTKGGAGSCCATCCCCGSC 225
- TCGTKGGAGSCCATCCCCGSC 226
- CTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC 227
- TCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC 228
- TTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC 229
- CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC 230
- 46
- TCTCGTKGGAGSCCATCCCC 231
- TTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 232
- CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 233
- TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 234
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- YTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 235
- CYTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 236
- 65
- GATCCCATTTTCCTCYTCTT 237
- TGATCCCATTTTCCTCYTCTT 238
- CTGATCCCATTTTCCTCYTCTT 239
- GCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT 240
- CGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT 241
- GCGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT 242
- 68
- GCTGATCCCATTTTCCTCYT 243
- CGCTGATCCCATTTTCCTCYT 244
- GCGCTGATCCCATTTTCCTCYT 245
- AGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT 246
- TAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT 247
- CTAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT 248
- 96
- TCCATTCAAGGGAGGGCGAC 249
- CTCCATTCAAGGGAGGGCGAC 250
- TCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC 251
- TTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC 252
- ATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC 253
- CATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC 254
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 438
- AGATTATCCCAGGTGCCTGC 255
- GAGATTATCCCAGGTGCCTGC 256
- GGAGATTATCCCAGGTGCCTGC 257
- AGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC 258
- TAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC 259
- ATAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC 260
- 502
- TGTCCTGYCCATTCTCAGKC 261
- GTGTCCTGYCCATTCTCAGKC 262
- GGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC 263
- AGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC 264
- CAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC 265
- CCAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC 266
- 524
- TCACATGGGTGGTCCTAGG 267
- GTCACATGGGTGGTCCTAGG 268
- GGTCACATGGGTGGTCCTAGG 269
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- TGGTCACATGGGTGGTCCTAGG 270
- CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG 271
- KCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG 272
- GKCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG 273
- 547
- TSCCATGARAGATGCMAAGC 274
- GTSCCATGARAGATGCMAAGC 275
- TGTSCCATGARAGATGCMAAGC 276
- GTGTSCCATGARAGATGCMAAGC 277
- GGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC 278
- GGGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC 279
- 571
- GWAWTTTCTGACTCTTCCCA 280
- TGWAWTTTCTGACTCTTCCCA 281
- CTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA 282
- CCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA 283
- GCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA 284
- CGCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA 285
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 107
- GTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 126
- GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 127
- CGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 128
- CCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 129
- YCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 130
- CYCCGGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 131
Tabla 10. Cebadores directos usados para la amplificación del exón 3 de HLA-C.
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 84
- CGCCCCRAGTCTCCSSGTCT 132
- TCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT 133
- GTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT 134
- GGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT 135
- GGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT 136
- CGGGTCGCCCCRAGTCTCCSSGTCT 137
- 142
- CGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 138
- TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 139
- CTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 140
- CCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 141
- posición 3' en el intrón 2
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- CCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 142
- ACCCTCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 143
Tabla 11. Cebadores directos usados para la amplificación del exón 4 de HLA-C.
- posición 3' en el intrón 3
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 461
- GTGCCTGTGTCCAGGCTGGC 286
- GGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC 287
- AGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC 288
- CAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC 289
- CCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC 290
- CCCAGGTGCCTGTGTCCAGGCTGGC 291
- 477
- TGGCGTCTGGGTTCTGTGCC 292
- CTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC 293
- GCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC 294
- GGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC 295
- AGGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC 296
- CAGGCTGGCGTCTGGGTTCTGTGCC 297
- 527
- CTCAGGATRGTCACATGGSC 298
- TCTCAGGATRGTCACATGGSC 299
- TTCTCAGGATRGTCACATGGSC 300
- RTTCTCAGGATRGTCACATGGSC 301
- CRTTCTCAGGATRGTCACATGGSC 302
- CCRTTCTCAGGATRGTCACATGGSC 303
- 545
- GCGCTGTTGGAGTGTCGCAA 78
- GGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA 79
- GGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA 80
- TGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA 81
- ATGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA 82
- CATGGGCGCTGTTGGAGTGTCGCAA 83
- 561
- SCAAGAGAGAWRCAAAGTGT 304
- CSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT 305
- TCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT 306
- GTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT 307
- TGTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT 308
- GTGTCSCAAGAGAGAWRCAAAGTGT 309
Los ácidos nucleicos se prepararon a partir de diferentes muestras de sangre mediante el uso del estuche QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Parte del exón 1, intrón 2, exón 2, intrón 2 y exón 3 de HLA-A se amplificaron mediante el uso del siguiente conjunto cebador:
- Cebador
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 5APBio (5')
- B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC 144
- 3APBio (3')
- B-CCGTGCGCTGCAGCGTCTCCTTCCCG 147
- B = biotina.
El exón 2, intrón 2 y exón 3 de HLA-B se amplificaron mediante el uso del siguiente conjunto cebador:
- Cebador
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- IBPin1 (5')
- B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG 145
- IBPin3 (3')
- B-GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT 148
- B = biotina.
El exón 2, intrón 2 y exón 3 de HLA-C se amplificaron mediante el uso del siguiente conjunto cebador:
- Cebador
- Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- 5CIN1 (5')
- B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA 146
- 3CIN3 (3')
- B-GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT 149
- B = biotina.
El ciclo de reacción PCR se compuso de las siguientes etapas:
1 min a 96°C;
20 5 veces (30 s a 96°C; 50 s a 64°C; 50 s a 72°C); 5 veces (30 s a 96°C; 50 s a 62°C; 50 s a 72°C); 10 veces (30 s a 96°C; 50 s a 60°C; 50 s a 72°C); 15 veces (30 s a 96°C; 50 s a 55°C; 50 s a 72°C); 5 min a 72°C.
25 La reacción de amplificación se llevó a cabo en 50 mM Tris-HCl pH 9.2, 16 mM (NH4)2SO4, 200 μM dNTPs, 2.5 U de polimerasa Taq, 1.5 mM de MgCl2, 15 pmol de cada cebador y 0.1 a 0.5 μg de ADN.
El amplicón resultante se clonó en el vector pGEMT (Promega, Madison, WI, Estados Unidos). El análisis de la secuencia de
30 nucleótidos se realizó usando un secuenciador de ADN automatizado Modelo 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) con nucleótidos didesoxi marcados con fluorescencia (Estuche de secuenciación cíclica de la reacción del terminador colorante PrismTM Ready, Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). Los cebadores usados para la reacción de secuenciación fueron los mismos que para la etapa de amplificación. 29 secuencias del intrón 2 se obtuvieron para HLA-A, 38 para HLA-B y 13 para HLA-C. Las secuencias se muestran en las Figuras 1, 2 y 3, respectivamente.
Ejemplo 2: Amplificación del exón 2 y el exón 3 de HLA-A
Los ácidos nucleicos se prepararon a partir de diferentes muestras de sangre mediante el uso del estuche QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Basado en la alineación de secuencia de las
40 secuencias del intrón 2 de HLA-A (Figura 1), un cebador inverso y uno directo locus-específico se diseñó para la amplificación específica del exón 2 de HLA -A y el exón 3, respectivamente. Con estos cebadores, una mezcla cebadora se construyó para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA -A consistente de los siguientes 2 conjuntos de cebadores:
- •
- para el exón 2: 5APBio (sec. con núm. de ident. 144) como cebador directo y 5'ATCTCGGACCCGGAGACTGT3' (sec. con núm. de ident. 1) como un cebador inverso;
- •
- para el cebador 3: 5'CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC3' (sec. con núm. de ident. 104) como cebador directo y 3APBio (sec. con núm. de ident. 147) como cebador inverso.
El ciclo de reacción PCR se compuso de las siguientes etapas:
5 min a 96°C;
35 veces (30 s a 96°C; 20 s a 58°C; 30 s a 72°C);
10 min a 72°C.
La reacción de PCR se llevó a cabo en 10 mM Tris.HCl pH 8.3, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCl2, 0.001% (p/v) gelatina, 200μM dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmol de cada cebador y 1U de AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La longitud de los productos de PCR obtenidos se verificó en un gel de agarosa de acuerdo con Sambrook y otros (1989).
Ejemplo 3: Amplificación del exón 2 y el exón 3 de HLA-B
Los ácidos nucleicos se prepararon a partir de diferentes muestras de sangre mediante el uso del estuche QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Basada en la alineación de secuencia de las secuencias del intrón 2 de HLA-B (Figura 2), un cebador inverso y uno directo, locus-específico se diseñó para la amplificación específica del exón 2 de HLA-B y el exón 3, respectivamente. Con estos cebadores, una mezcla cebadora se construyó para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-B consistente de los siguientes 2 conjuntos de cebadores:
- •
- para el exón 2: IBPin1 (sec. con núm. de ident. 145) como cebador directo y 5'ACCCGCGGGGATTTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 310) como un cebador inverso;
- •
- para el exón 3: 5'ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 121) como cebador directo y IBPin3 (sec. con núm. de ident. 148). como un cebador inverso
El ciclo de reacción PCR se compuso de las siguientes etapas:
5 min a 96°C;
35 veces (30 s a 96°C; 20 s a 58°C; 30 s a 72°C);
10 min a 72°C.
La reacción de PCR se llevó a cabo en 10 mM Tris.HCl pH 8.3, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCl2, 0.001% (p/v) gelatina, 200μM dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmol de cada cebador y 1U de AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). La longitud de los productos de PCR obtenidos se verificó en un gel de agarosa de acuerdo con Sambrook y otros (1989).
Ejemplo 4: Amplificación del exón 2 y el exón 3 de HLA-C
Los ácidos nucleicos se prepararon a partir de diferentes muestras de sangre mediante el uso del estuche QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Basado en la alineación de secuencia de las secuencias del intrón 2 de HLA-C (Figura 3), un cebador inverso y uno directo, locus-específico se diseñó para la amplificación específica del exón 2 de HLA-C y el exón 3, respectivamente. Con estos cebadores, una mezcla cebadora se construyó para la amplificación separada del exón 2 y el exón 3 de HLA-C consistente de los siguientes 2 conjuntos de cebadores:
- •
- para el exón 2: 5CIN1 (sec. con núm. de ident. 146) como cebador directo y 5'GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT3' (sec. con núm. de ident. 127) como un cebador inverso;
- •
- para el exón 3: 5'TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT3' (sec. con núm. de ident. 139) como cebador directo y 3CIN3 (sec. con núm. de ident. 149) como un cebador inverso.
El ciclo de reacción PCR se compuso de las siguientes etapas:
5 min a 96°C;
5 35 veces (30 s a 96°C; 20 s a 58°C; 30 s a 72°C);
10 min a 72°C.
La reacción PCR se llevó a cabo en 10 mM Tris.HCl pH 8.3 50 mM de KCI, 1.5 mM de MgCl2, 0.001% (p/v) gelatina, 200μM DNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20 pmol de cada cebador y 1U AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA,
10 Estados Unidos). La longitud de los productos de PCR obtenidos se verificó en un gel de agarosa de acuerdo con Sambrook y otros (1989).
Ejemplo 5: Amplificación del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A
15 Las muestras de sangre se recogieron a partir de un donante caucásico en B.A.R.C. (Gent, Bélgica). Los ácidos nucleicos se prepararon a partir de diferentes muestras de sangre mediante el uso del estuche QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
20 Una mezcla cebadora se usó para la amplificación separada del exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A consistente de los siguientes conjuntos de cebadores:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- Exón 1-2
- 5APbio (5') B-TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC 144
- 3ex2APbio (3') B-ATCTCGGACCCGGAGACTGT 1
- Exón 3
- 5ex3APbio(5') B-CAGTTTAGGCCAAAAATCCCCC 104
- 3ex3APbio (3') B-CCCTCCTTGTGGGAGGCCAG 156
- Exón 4
- 5ex4APbio (5') B-GTTCTGTGCTCYCTTCCCCAT 205
- 3ex4APbio (3') B-TTGGGCAGACCCTCATGCTGC 311
- B = biotina.
25 El ciclo de reacción PCR se compuso de las siguientes etapas:
1 min a 96 °C;
5 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 64 °C; 50 s a 72 °C);
5 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 62 °C; 50 s a 72 °C);
30 10 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 60 °C; 50 s a 72 °C); 15 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 55 °C; 50 s a 72 °C); 5 min a 72 °C; 4°C.
35 La reacción PCR se llevó a cabo en 50 mM Tris.HCl pH 9.2, 16 mM (NH4)2SO4, 1.5 mM MgCl2, 200μM dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5 U de Taq polimerasa. (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems, Branchburg, Nueva Jersey, Estados Unidos), 20 pmol de cebador 5APbio, 20 pmol de cebador 3ex2APbio, 40 pmol de cebador 5ex3APbio, 40 pmol de cebador 3ex3APbio, 15 pmol de cebador 5ex4APbio, 15 pmol de cebador 3ex4APbio y 0.1-0.5 μg de ADN.
40 La longitud de los productos de amplificación obtenidos se verificó en un gel de agarosa 3% de acuerdo con Sambrook y otros (1989). 3 bandas de diferentes longitudes relativas se obtuvieron respectivamente al exón 2 (559 pb), exón 3 (439 pb) y exón 4 (380 pb) de HLA -A. Mediante el uso de este protocolo, los exones HLA-A se amplificaron lo suficientemente fuerte para la posterior tipificación en un ensayo de hibridación.
45 5.2 Prueba de los productos de amplificación obtenidos en un ensayo de tipificación de HLA-A
[0093] Los amplicones de HLA-A se tipifican posteriormente en un ensayo de hibridación inversa basado en la tecnología de LiPA (Stuyver y otros, 1993). Después de la etapa de amplificación como se describió anteriormente, los ácidos nucleicos amplificados se hibridaron a un panel de 36 sondas mediante el uso del estuche LiPA de HLA -A (Innogenetics, Gante, Bélgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Los resultados de esta hibridación inversa se muestran en la Figura 7.
5 Para la comparación, un producto de amplificación que comprende además el exón 2 y exón 3 en un amplicón simple se obtuvo mediante el uso de 5APBio (cebador directo; sec. con núm. de ident. 144) y 3APBio (cebador inverso; sec. con núm. de ident. 147). La hibridación de este amplicón mayor a las sondas en la tira de LiPA se muestra además en la Figura 7. La Figura 7 ilustra evidentemente que los amplicones obtenidos mediante amplificación separada del exón 2 y el exón 3 permiten una tipificación más evidente y pronunciada después del amplicón mayor obtenido mediante la amplificación del
10 exón 2 y el exón 3 en un amplicón simple.
Ejemplo 6: Amplificación del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B
Las muestras de sangre se recogieron a partir de un donante caucásico en B.A.R.C. (Gent, Bélgica). Los ácidos nucleicos
15 se prepararon a partir de diferentes muestras de sangre mediante el uso del estuche QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
20 Una mezcla cebadora se usó para la amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B consistente de los siguientes conjuntos de cebadores:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- Exón 2
- IBPin1bio (5') B-GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG 145
- IB3Pin2bio (3') B-AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC 109
- Exón 3
- IB5Pin2bio (5') B-CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG 224
- IB3Pin3bio (3') B-TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC 234
- Exón 4
- 5ex4IBbio (5') B-TCACATGGGTGGTCCTAGG 267
- 3ex4IBbio (3') B-TCGGCAGCCCTCATGCTGT 312
- B = biotina.
El ciclo de reacción PCR se compuso de las siguientes etapas:
25 1 min a 96 °C; 5 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 64 °C; 50 s a 72 °C); 5 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 62 °C; 50 s a 72 °C); 10 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 60 °C; 50 s a 72 °C);
30 15 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 55 °C; 50 s a 72 °C); 5 min a 72 °C; 4°C
La reacción PCR se llevó a cabo en 50 mM Tris.HCl pH 9.2, 16 mM (NN4)2SO4, 1.5 mM MgCl2, 200μM dNTP's (dATP,
35 dGTP, dCTP, dTTP), 2.5 U de Taq polimerasa. (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems, Branchburg, Nueva Jersey, Estados Unidos), 35 pmol de cebador IBPinlbio, 35 pmol de cebador IBPin2bio, 50 pmol de cebador IB5Pin2bio, 50 pmol de cebador IB3Pin3bio, 10 pmol de cebador 5ex4IBbio, 10 pmol de cebador 3ex4IBbio y 0.1-0.5 μg de ADN.
La longitud de los productos de amplificación obtenidos se verificó en un gel de agarosa 3% de acuerdo con Sambrook y
40 otros (1989). 3 bandas de diferente longitud se obtuvieron relativas respectivamente al exón 2 de HLA-B (555 pb), exón 3 (446 pb) y exón 4 (323 pb). Mediante el uso de este protocolo, los exones HLA -B se amplificaron lo suficientemente fuerte para la tipificación posterior en un ensayo de sonda de línea.
45 Los amplicones de HLA -B se tipifican posteriormente en un ensayo de hibridación inversa basado en la tecnología LiPA (Stuyver y otros, 1993). Después de la etapa de amplificación como se describió anteriormente, los ácidos nucleicos amplificados se hibridaron a un panel de 60 sondas mediante el uso del estuche LiPA de HLA-B (Innogenetics, Gent, Bélgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados de esta hibridación inversa se muestran en la Figura
8.
Para la comparación, un producto de amplificación que comprende además el exón 2 y exón 3 en un amplicón simple se
5 obtuvo mediante el uso de IBPin1 (cebador directo; sec. con núm. de ident. 145) y IBPin3 (cebador inverso; sec. con núm. de ident. 148). La hibridación de este amplicón mayor a las sondas en la tira de LiPA se muestra además en la Figura 8. La Figura 8 ilustra evidentemente que los amplicones obtenidos mediante amplificación separada del exón 2 y exón 3 permiten una tipificación más evidente y pronunciada después del amplicón mayor obtenido mediante amplificación del exón 2 y el exón 3 en un amplicón sencillo.
Ejemplo 7: Amplificación del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-C
Los ácidos nucleicos se prepararon a partir de muestras de sangre mediante el uso del estuche QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una mezcla cebadora se usa para la amplificación separada
15 del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-C consistente de los siguientes conjuntos de cebadores:
- Amplicón
- Conjunto cebador Secuencia (5'-3') Sec. con núm. de ident.
- Exón 2
- SCIN1(5') B-AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA 146
- IC3Pin2bio(3') B-GGTCGAGGGTCTGGGCGGGTT 127
- Exón 3
- IC5Pin2bio(5') B-TCGRCCGGRGAGAGCCCCAGT 139
- 3CIN3 (3') B-GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT 149
- Exón 4
- Sex4ICbio(5') B-TCTCAGGATRGTCACATGGSC 299
- 3ex4ICbio(3') B-CATCTCAGGGTGMRGGGCTT 313
- B = biotina.
El ciclo de la reacción PCR se compone de las siguientes etapas:
20 1 min a 96 °C; 5 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 64 °C; 50 s a 72 °C); 5 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 62 °C; 50 s a 72 °C); 10 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 60 °C; 50 s a 72 °C); 15 veces (30 s a 96 °C; 50 s a 55 °C; 50 s a 72 °C);
25 5 min a 72 °C; 4°C.
La reacción PCR se lleva a cabo en 50 mM Tris.HCl pH 9.2, 16 mM (NH4)2SO4, 1.5 mM MgCl2, 200μM dNTP's (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5 U de polimerasa Taq (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems, Branchburg, Nueva Jersey, 30 Estados Unidos), 20 pmol de cada cebador y 0.1-0.5 μg de ADN.
La longitud de los productos de amplificación obtenidos se verifica en un gel de agarosa 3 % de acuerdo a Sambrook y otros. (1989). 3 bandas de diferente tamaño se obtuvieron relativas al exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-C. Mediante el uso de este protocolo, los exones de HLA-C se amplifican lo suficientemente fuerte para la posterior tipificación en un Ensayo de
35 Sonda de Línea.
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Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- si es necesario, la liberación, aislamiento y/o concentración de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- amplificación separada locus-específica, del exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-B, haciendo uso de al menos tres conjuntos de cebadores, en donde:
- -
- para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 de HLA-B; -para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 de HLA-B y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-B; y -para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-B;
(iii) tipificación del alelo específico de HLA-B presente en dicha muestra. -
- 2.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia objetivo locus-específica se sitúa en la posición 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B (Fig. 2) y/o posición 42, 46, 65, 68, 96, 438, 502, 524, 547 o 571 del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5).
-
- 3.
- El método de acuerdo con la reivindicación 2 caracterizado porque dichas posiciones constituyen el extremo 3' del cebador que se usa para la amplificación del exón 2, exón 3 o exón 4.
-
- 4.
- El método de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado porque el cebador se selecciona a partir de la siguiente lista:
- -
- para la amplificación del exón 2 de HLA-B (tabla 5):
5'ACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 108) 5'AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 109) 5'CAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 110) 5'CCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 111) 5'MCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 112) 5'GMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 113) 5'YGMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 314)- para la amplificación del exón 3 de HLA-B (Tabla 6; Tabla 7): 5'CYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 114) 5'CCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 115) 5'GCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 116) 5'GGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 117) 5'CGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 118) 5'CCGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 119) 5'CCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 120) 5'ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 121) 5'TACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 122) 5'TTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 123) 5'TTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 124) 5'GTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 125) 5'CGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 222) 5'GCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 223) 5'CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 224) 5'CGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 225) 5'TCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 226) 5'CTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 227) 5'TCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 228) 5'TTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 229)5'CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 230) 5'TCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 231) 5'TTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 232) 5'CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 233) 5'TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 234) 5'YTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 235) 5'CYTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 236) 5'GATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 237) 5'TGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 238) 5'CTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 239) 5'GCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 240) 5'CGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 241) 5'GCGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 242) 5'GCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 243) 5'CGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 244) 5'GCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 245) 5'AGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 246) 5'TAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 247) 5'CTAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 248) 5'TCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 249) 5'CTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 250) 5'TCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 251) 5'TTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 252) 5'ATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 253) 5'CATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 254)- -
- para la amplificación del exón 4 de HLA-B (tabla 8):
5'AGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 255) 5'GAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 256) 5'GGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 257) 5'AGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 258) 5'TAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 259) 5'ATAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 260) 5'TGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 261) 5'GTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 262) 5'GGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 263) 5'AGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 264) 5'CAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 265) S'CCAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 266) 5'TCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 267) 5'GTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 268) 5'GGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 269) 5'TGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 270) 5'CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 271) 5'KCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 272) 5'GKCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 273) 5'TSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 274) 5'GTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 275) 5'TGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 276) 5'GTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 277) 5'GGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 278) 5'GGGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 279) 5'GWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 280) 5'TGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 281) 5'CTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 282) 5'CCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 283) 5'GCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 284) 5'CGCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 285) -
- 5.
- El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con el siguiente cebador directo:
5'GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG3' (sec. con núm. de ident. 145). -
- 6.
- El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con el siguiente cebador inverso:
5'TCGGCAGCCCCTCATGCTGT3' (sec. con núm. de ident. 312). - 7. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque:
- -
- la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:
5'GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG3' (sec. con núm. de ident. 145) y 5'AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 109);- -
- la amplificación del exón 3 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:
5'CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 224) y 5'TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 234);- -
- la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:
S'TCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 267) y 5'TCGGCAGCCCCTCATGCTGT3' (sec. con núm. de ident. 312). -
- 8.
- El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque tanto el exón 2 como el exón 3 de HLA-B se amplifican mediante el uso de una mezcla cebadora múltiple que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3.
-
- 9.
- El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque todos los tres exones, exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B se amplifican mediante el uso de una mezcla cebadora múltiple que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2, al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 4.
-
- 10.
- El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque la etapa de tipificación se lleva a cabo por hibridación con una o más sondas adecuadas.
-
- 11.
- Un estuche de diagnóstico para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra que comprende los siguientes componentes:
- (i)
- cuando sea adecuado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii)
- una mezcla cebadora que contiene al menos:
- -
- un conjunto cebador para la amplificación del exón 2 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 2 de los alelos HLA-B. -un conjunto cebador para la amplificación del exón 3 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 3 de los alelos HLA-B, y
- -
- un conjunto cebador para la amplificación del exón 4 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 4 de los alelos HLA-B.
(iii) un medio para la tipificación del alelo específico de HLA-B presente en dicha muestra. -
- 12.
- Un estuche de ensayo de sonda de línea para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una
- muestra que comprende los siguientes componentes:
- 5
- (i) cuando sea adecuado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;
- (ii) una mezcla cebadora que contiene al menos
- 10
- - un conjunto cebador para la amplificación del exón 2 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 2 de los alelos HLA-B.
- -un conjunto cebador para la amplificación del exón 3 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la
- amplificación del exón 3 de los alelos HLA-B, y
- 15
- - un conjunto cebador para la amplificación del exón 4 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la
- amplificación del exón 4 de los alelos HLA-B.
- (iii) al menos una sonda que se hibrida específicamente con el exón 2, exón 3 o exón 4 de HLA-B, fijado a un
- 20
- soporte sólido; (iv) un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;
- (v) una solución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha solución;
- (vi) cuando sea adecuado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.
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