ES2353370T3 - Promotor de sintasa mip del maíz. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un promotor que comprende las bases 7-2064 de SEQ ID. NO: 3 o una variante de esta secuencia que tiene al menos 95% de homología con la misma y que es funcional como un promotor específico del embrión.

Description

Campo de la invención

La invención proporciona secuencias de ADN y estructuras artificiales que son útiles en la manipulación genética de las plantas. Más particularmente, la invención proporciona nuevas secuencias reguladoras obtenidas a partir del gen de la sintasa mip, que se pueden utilizar para dirigir la expresión de una variedad de secuencias de ácido nucleico en el tejido embrionario de plantas transgénicas.

Antecedentes de la invención

Los proyectos de manipulación genética en las plantas requieren el acceso a diversos elementos genéticos que se usan para regular la expresión transgénica. Un ejemplo principal es el promotor que regula la iniciación de la transcripción.

Existe una carencia de una variedad de promotores para el uso en la manipulación genética de las plantas. En particular, Existe una carencia de promotores que dirijan la expresión de forma específica en el tejido embrionario, además de, por ejemplo, el promotor LEC1 de Arabidopsis (véase, el documento de patente WO 98/37184).

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO:1 es la secuencia de ADN para la sintasa mip del maíz.

SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos para la sintasa mip del maíz.

SEQ ID NO:3 es la secuencia de ADN para el promotor de sintasa mip del maíz específico del embrión.

Sumario de la Invención

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un promotor que comprende las bases 7-2064 de SEQ ID. NO 3 o una variante de esta secuencia que tiene al menos 95% de homología con la misma y que es funcional como un promotor específico del embrión.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona una estructura artificial de ácido nucleico que comprende un promotor que está ligado funcionalmente con una secuencia de ácido nucleico heteróloga, en donde el promotor comprende las bases 7-2064 de SEQ ID NO: 3 o una variante de esta secuencia que tiene al menos 95% de homología con la misma y que es funcional como un promotor específico del embrión.

Preferente, la estructura artificial comprende, ligado funcionalmente en dirección 5' a 3': a) el promotor; b) una secuencia de ADN de interés; y c) una UTR 3'. La estructura artificial puede ser un plásmido.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para producir un tejido vegetal capaz de expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga, comprendiendo el método la introducción en al menos una célula vegetal, una estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto.

El método puede comprender adicionalmente regenerar una planta a partir de al menos una de dicha célula vegetal, transmitir sexualmente dicha estructura artificial de ácido nucleico a la progenie y recoger las semillas producidas por dicha progenie.

En otro aspecto, la invención proporciona una planta transformada que comprende al menos una célula vegetal que contiene una estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto.

En otro aspecto, la invención proporciona una semilla o un grano que contiene una estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto.

La planta puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea. Las plantas preferidas son el maíz, el arroz, el algodón y el tabaco.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La secuencia de ADN de interés utilizada en las estructuras artificiales de la invención puede ser cualquier gen que se desee expresar o regular por disminución de la expresión en las plantas. Genes particularmente útiles son los que confieren tolerancia a herbicidas, insectos o virus, y los genes que proporcionan un valor nutricional mejorado o unas características de procesado de la planta mejoradas. Los ejemplos de genes agronómicamente útiles y adecuados incluyen el gen insecticida del Bacillus thuringiensis para conferir resistencia a los insectos, y el gen de la sintasa de 5'enolpiruvil-3'-fosfoshikimato (EPSPS) y cualquier variante suya para conferir tolerancia a los herbicidas de glifosato. Tal y como entenderán fácilmente los expertos en la técnica, se puede utilizar cualquier gen agronómicamente valioso que confiera un rasgo deseado o que produzca una proteína valiosa.

La UTR 3', o región 3' no traducida, que se emplea en las estructuras artificiales de la invención, es una que confiere un procesamiento eficaz del ARNm, que mantiene la estabilidad del mensaje y que dirige la adición de ribonucleótidos de adenosina en el extremo 3' de la secuencia de ARNm transcrita. La UTR 3' puede ser nativa con la región promotora, nativa con el gen estructural, o puede derivar de otra fuente. Está disponible una amplia variedad de regiones de terminación que se pueden obtener a partir de genes con capacidad de expresión en hospedadores vegetales, p. ej., genes bacterianos, de opinas, víricos y vegetales. Las UTRs 3' adecuadas incluyen, pero no están limitadas a: la UTR 3' per5 (solicitud de patente internacional WO98/56921), la UTR 3' del gen de la sintasa de nopalina (nos), tmL 3', o acp 3', por ejemplo.

La presente invención es aplicable, de manera general, a la expresión de genes estructurales tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Esta invención es particularmente adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas (monocot) que incluyen, pero no están limitados a, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, batatas, cebolla, plátano, coco y dátiles. Una aplicación preferida de la invención es en la producción de plantas de maíz transgénicas. La invención es particularmente aplicable a la familia Graminaceae, en particular al maíz, trigo, arroz, avena, cebada y sorgo. Las especies dicotiledóneas incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, remolacha azucarera, patata, lechuga, melón, soja y canola (semilla de colza).

La presente invención incluye secuencias de ADN que tienen una homología sustancial de la secuencia (al menos 95%) con SEQ ID NO:3, de modo que son capaces de proporcionar una expresión específica del embrión.

Tal y como se emplea en la presente solicitud, la expresión "homología sustancial de la secuencia" se emplea para indicar que una secuencia de nucleótidos (en el evento de ADN o ARN) o una secuencia de aminoácidos (en el evento de una proteína

o polipéptido) muestra una equivalencia sustancial, funcional o estructural con otra secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Cualquier diferencia funcional o estructural entre las secuencias que tienen una homología sustancial de la secuencia, será insignificante; ya que no afectará a la capacidad de la secuencia para actuar tal y como se indica en la presente solicitud. Las secuencias que tienen una homología sustancial de la secuencia con las secuencias descritas en esta memoria, son generalmente variantes de la secuencia descrita, tales como mutaciones, pero también pueden ser secuencias sintéticas.

En la mayoría de los eventos, las secuencias que tienen un 95% de homología con las secuencias descritas específicamente en esta memoria, actuarán como equivalentes. La localización de las partes de estas secuencias que no son decisivas puede llevar mucho tiempo, pero se realiza de manera rutinaria y se conoce bien en la técnica.

Se contempla que las secuencias que se corresponden con las secuencias mencionadas anteriormente, pueden contener una o varias modificaciones en las secuencias procedentes del tipo silvestre (SEQ ID. NO:3) pero presentarán todavía los elementos respectivos, comparables en cuanto a las explicaciones de esta invención. Por ejemplo, tal y como se ha indicado anteriormente, se pueden utilizar fragmentos. Se pueden incorporar modificaciones en las secuencias aisladas que incluyen la adición, la deleción o la sustitución no conservadora de un número limitado de diversos nucleótidos o la sustitución conservadora de muchos nucleótidos. Además, en la construcción de tales moléculas de ADN, se pueden emplear fuentes que hayan mostrado que confieren una mejora de la expresión de los genes heterólogos situados bajo su control regulador. Técnicas a modo de ejemplo para modificar secuencias de oligonucleótidos, incluyen el uso de mutagénesis mediada con polinucleótidos, mutagénesis dirigida al sitio. Véase, Zoller y col. (1984), DNA, 3:479-488; Higuchi y col. (1988), Nucl. Acids Res., 16:7351-7367, Ho y col. (1989), Gene, 77:51-59, Horton y col. (1989), Gene, 77:61; y tecnología de la PCR: "Principles and Applications for DNA Amplification", (compilador) Erlich (1989)).

Las tecnologías convencionales para introducir material biológico en células hospedadoras incluyen la electroporación (véase, Shigekawa y Dower (1988), Biotechniques, 6:742; Miller y col. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:856-860; y Powell y col. (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54:655-660); mecanismos de absorción directa de ADN (véase, Mandel e Higa (1972), J. Mol. Biol., 53:159-162; Dityatkin y col. (1972), Biochimica et Biophysica Acta, 281:319-323; Wigler y col. (1979), Cell, 16:77; y Uchimiya y col. (1982), En: "Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture", A. Fujiwara (compilador), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokio, págs. 507-508); mecanismos de fusión (véase, Uchidaz y col. (1980), En: "Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells", Baserga y col. (compiladores) Wistar Symposium Series, 1:169-185); agentes infecciosos (véase, Fraley y col. (1986), CRC Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46); y Anderson (1984), Science, 226:401-409); mecanismos de microinyección (véase, Crossway y col. (1986), Mol. Gen. Genet., 202:179-185); y mecanismos de proyectiles con alta velocidad (véase la solicitud de patente europea EPO 0 405 696, de Miller, Schuchardt, Skokut y Gould, (The Dow Chemical Company).

El procedimiento apropiado para transformar una célula hospedadora seleccionada se puede elegir de acuerdo con la célula hospedadora usada. Basándose en la experiencia hasta la fecha, parece haber poca diferencia en la expresión de los genes, una vez insertados en las células, lo que es atribuible al propio método de transformación. Una vez introducido en el tejido vegetal, la expresión del gen estructural se puede someter a ensayo en un sistema de expresión transitoria, o puede ser determinada después de la selección por la integración estable dentro del genoma de la planta.

Se conocen técnicas para el cultivo in vitro de tejido vegetal y, en varios eventos, para la regeneración en plantas enteras. El procedimiento apropiado para producir plantas transgénicas maduras se puede elegir de acuerdo con la especie vegetal usada. La regeneración varía de especie a especie en las plantas. Una regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Una vez que se han obtenido las plantas, se pueden reproducir sexualmente o por clonación de modo que al menos una copia de la secuencia esté presente en las células de la progenie. Se puede recoger una semilla de las plantas regeneradas para un uso futuro y las plantas crecidas a partir de esta semilla. Los procedimientos para transferir el gen introducido procedente de la planta transformada originalmente, a cultivos comercialmente útiles, son conocidos por los expertos en la técnica.

Una secuencia se considera que proporciona un promotor "funcional" para los fines de esta solicitud, si otorga una expresión transitoria de GUS superior a los niveles de fondo, cuando se somete a ensayo como en el Ejemplo 4. Los expertos en la técnica entenderán que se pueden realizar diversas deleciones de la secuencia de 2058 pb (7-2064 pb de SEQ ID NO:3) sin destruir la funcionalidad de la secuencia como promotor. Los experimentos de deleción están dentro de los conocimientos de la técnica. Preferentemente, un promotor de la invención comprenderá 200 pares de bases contiguas que son idénticas a 200 pares de bases contiguas de la secuencia definida por 7-2064 pb de SEQ ID NO:3. Más preferentemente, son promotores que comprenden 500 pares de bases contiguas que son idénticas a 500 pares de bases contiguas de la secuencia definida por 7-2064 pb de SEQ ID NO:3.

En los siguientes ejemplos, se emplearon métodos convencionales de purificación del ADN, digestión con enzimas de restricción, análisis con gel de agarosa, aislamiento de fragmentos de ADN, ligación y transformación, tal y como se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989); "Molecular Cloning a Laboratory Manual", segunda edición. (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press), Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Smith, J., Seidman, J. y Struhl, K., compiladores (1987); y "Current Protocols in Molecular Biology". (Nueva York: John Wiley and Sons).

Ejemplo 1 Clonación de un ADNc de maíz que codifica la sintasa mip

A. Aislamiento de una sonda para la sintasa mip del maíz empleando cebadores degenerados

Se aisló una sonda mediante amplificación con PCR de ADNc embrionario de maíz, empleando cebadores degenerados diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos de la sintasa mip de levadura. En ese momento, se conoció la secuencia de la sintasa mip de levadura (Johnson, M. y Henry, S. (1989). "Biosynthesis of Inositol in Yeast: Primary Structure of Myo-Inositol-1-Phosphate Synthase (EC 5.5.1.4) and Functional Analysis of its Structural Gene, the INO1 Locus". J. Biol. Chem. 264: 1274-1283) así como la secuencia de la sintasa mip del maíz (documento de patente WO 99/05298). Los aminoácidos que están codificados sólo por uno o dos codones, se identificaron en la secuencia proteica de la levadura. Se seleccionaron tramos de cinco

o más de estos aminoácidos con baja redundancia, como las regiones para el diseño del cebador.

Se identificó un clon (MP18) que se podía traducir una proteína que tenía identidad con la sintasa mip de levadura. El inserto de MIP18 se purificó en gel, se marcó con 32P y se empleó como sonda en una genoteca lambda de ADNc de embrión de maíz.

B. Aislamiento de los ADNc positivos para el MIP de maíz

Los protocolos para la extensión en placas de los fagos, la purificación de las placas y las escisiones in vivo, eran como los que recomendaba el fabricante (Stratagene, La Jolla CA). Se introdujeron algunos cambios que se apuntan más abajo.

E. coli XL-1 Blue se dejaron crecer en medio NZY que contenía 0,2% de maltosa hasta llegar a una densidad óptica de 1,0 a 520 nm. Las células se recogieron por centrifugación a velocidad baja y se resuspendieron hasta tener la misma densidad en MgSO4 10 mM. Las células se almacenaron durante varios días a 4°C con poca pérdida de eficacia en la formación de placas. Los fagos se absorbieron previamente a 200 µL de células durante 15 minutos a temperatura ambiente, en tubos Falcon 2059, seguido de 15 minutos a 37°C. Las células se extendieron en placas en 3 mL de agarosa NZY a 48°C sobre placas NZY. Las placas se incubaron durante una noche a 37°C.

Las placas se enfriaron rápidamente, se aplicaron suavemente filtros de nilón de 0,22 micras sobre la placa y se permitió la absorción de los fagos durante 2 minutos. Los filtros se transfirieron a papel para transferencia, saturado con NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M, durante 5 minutos. Se permitió que los filtros se secaran durante 5 minutos y a continuación se transfirieron a papel de transferencia saturado con unas solución de neutralización de Tris 0,5 M pH 7,6, NaCl 1,5 M, durante 15 minutos. Los filtros se reticularon a continuación empleando un reticulador UV de Stratagene sobre el fraguado "automático". Los filtros se lavaron con dos cambios de 2X SSC, 0,1% de SDS. La prehibridación se realizó durante un mínimo de 6 horas en 6X SSC, 10X de solución Denhardt, 0,1% de SDS, 200 mg/mL de ADN a 42°C.

Los fragmentos de ADN se aislaron empleando los métodos de purificación de Qiaex de Qiagen Inc., (Chatsworth, CA). El equipo de reactivos para marcar al azar el ADN cebado de Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN) se utilizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante filtración en gel a través de una columna PUSH de Stratagene, siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La solución para la hibridación con condiciones poco rigurosas era 6X SSC, 10X de solución de Denhardt, 0,1% de SDS, 200 mg/mL de ADN, 42°C, 6 horas. Los lavados con condiciones poco rigurosas eran 40°C, 6X SSC, 1% de SDS, 4 cambios con un total de 2 litros. La solución para la hibridación con condiciones muy rigurosas era como la anterior, excepto que se ajustaba a 50% de formamida desionizada. Las condiciones del lavado eran 0,1% de SSC, 0,1% de SDS, 60°C, 4 cambios con un total de 2 litros.

Con el rastreo primario se obtuvieron muchas placas positivas que aparecían sobre los filtros por duplicado. La frecuencia de las placas positivas se aproximaba al 1%, indicando que el gen se expresaba mucho en el embrión. Se escogieron diversas placas y se rastrearon dos y tres veces. Se escogieron ocho placas aisladas procedentes de reservas puras y se rescataron los plásmidos para el análisis del inserto de ADNc.

Los ocho clones positivos para la sintasa mip se digirieron con las endonucleasas de restricción Eco RI y Xho I para liberar los insertos del vector. Basándose en la secuencia de la levadura, se esperaba un inserto de ADNc de aproximadamente 2 kb, este incluye 500 aminoácidos con capacidad codificadora y varios cientos de pares de bases de secuencia sin traducir. Dos clones contenían insertos que migraban junto con el marcador de 2 kb. Los otros seis clones contenían insertos significativamente más pequeños de tamaño y no se caracterizaron adicionalmente. Un clon con un inserto de ADNc de aproximadamente 2 kb, se escogió para el análisis de la secuencia de ADN, se denominó clon pMIP-7.

C. Análisis de la secuencia de ADN del ADNc de la sintasa mip del maíz

La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida para la sintasa mip del maíz, se muestran en SEQ ID NO:1. El ADNc tiene 1959 nucleótidos de longitud. La ATG más 5' está localizada en la posición 137, dando una región putativa no codificante en 5' de 136 nucleótidos. Un marco de lectura abierto largo se extiende desde la ATG en la posición 137 hasta un codón de detención en la posición 1667. El marco de lectura codifica un polipéptido de 510 aminoácidos. Un codón de detención está localizado en la posición 1667, seguido de 248 nucleótidos de la región 3' no traducida. Un tractor corto de poli (A) está localizado en la posición 1918.

Ejemplo 2

Análisis de patrones específicos del tejido y del desarrollo en semillas

Los genotipos de maíz de marca comercial Mycogen CS608, HO1, CQ806, OQ414 y HiII y un B73 endogámico disponible corrientemente, se dejaron crecer bajo condiciones convencionales de invernadero. Para el análisis de la expresión génica específica del tejido del promotor de sintasa mip, se recogieron tejidos en momentos interesantes del desarrollo y se congelaron a -70°C, hasta la extracción del ARN. Para la determinación del patrón de expresión temporal de MIP en los embriones de las semillas, se diseccionaron los granos de las espigas de CQ806 y HO1 diferentes días después de la polinización (DDP). Después de la recogida, se diseccionaron inmediatamente los granos de las espigas, se recogieron los embriones y se congelaron en tubos cónicos de 50 ml sobre hielo seco. El ARN se extrajo y se preparó para el análisis con transferencia de tipo northern, empleando técnicas convencionales. La sonda para la hibridación de la sintasa mip se preparó a partir del plásmido pMIP7 (para una descripción, véase el Ejemplo 1) mediante digestión con EcoR1 y Xho1, seguida de purificación en gel del inserto de aproximadamente1950 pb. Se marcaron 25 ng del fragmento purificado en el gel con 50 µCi de [�-32P]-dCTP (NEN Research Products) utilizando perlas de marcación READY-TO-GO (Pharmacia), siguiendo las instrucciones del fabricante y se purificaron en columnas de ajuste NUCTRAP (Stratagene). La sonda marcada se desnaturalizó hirviéndola durante 5 minutos y enfriándola en hielo durante 5 minutos y se añadió directamente a los filtros prehibridados. Se realizó la hibridación en bolsas SEAL-A-MEAL (DAZEY Corp., Industrial Airport, KA) a 42°C durante 16 horas. Se lavaron los filtros seis veces durante 30 minutos con gran exceso (500 ml) de una disolución de lavado calentada previamente [fosfato de sodio 20 mM, pH 6,5, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM y SDS al 0,1%] a 60°C. Los resultados de la hibridación indicaban que la sintasa mip se expresaba en tejidos de embrión, procedentes de cada uno de los genotipos de maíz sometidos a ensayo. La expresión máxima en los embriones se observó 18-27 DDP. No se observó una expresión significativa en las hojas ni en las raíces. Estos datos sugerían que la expresión de la sintasa mip estaba regulada preferentemente en los tejidos del embrión.

Ejemplo 3

Clonación de las regiones 5' no traducidas procedentes del gen de la sintasa mip de maíz

Las secuencias flanqueantes en 5' de la sintasa mip del maíz se aislaron a partir del ADN genómico de maíz, var. OQ414 (marca comercial de Agrigenetics Inc., d/b/a Mycogen Seeds). La secuenciación del ADN se llevó a cabo usando el equipo de reactivos para la secuenciación de ADN ABI Prism con polimerasa FS de AmpliTaq®, tal y como describe el fabricante (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA). Las reacciones de secuenciación se ejecutaron en un secuenciador de ADN 373A de Applied Biosystem (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division). La secuencia de ADN para el promotor de sintasa mip se proporciona en SEQ ID NO:3.

Descripción de los vectores

Se construyeron cuatro vectores de expresión, los cuales incorporaban el promotor de sintasa mip, aguas arriba del gen de la �-glucuronidasa (GUS) sobre un esqueleto de pUC19,

pMipGP339-1 y pMipGN345-1 se diseñaron para someter a ensayo la expresión de GUS en ensayos transitorios. La diferencia entre estos dos vectores era que las secuencias 3' no traducidas se emplearon como terminadores de la transcripción.

pMipGP339-1 empleaba la UTR 3' per5; pMipGN345-1 empleaba la UTR 3' nos.

pMipGP341 y pMipGN350-1 son derivados de pMipGP339-1 y pMipGN345-1 que añaden un gen marcador seleccionable (el gen de la fosfinotricin acetil transferasa (BAR) de Streptomyces hygroscopicus (White y col., (1989) Nucleic Acids Res.

18:1062)) dirigido por un promotor 35S doblemente potenciado, pMipGP341 y pMipGN350-1 se emplearon para someter a ensayo las fusiones del promotor de sin-tasa mip/GUS en embriones de maíz transformado de forma estable.

El plásmido UGP232-4 se empleó como testigo positivo en los estudios de expresión transitoria. El UGP232-4 es similar a pMipGP339, excepto que el gen GUS está dirigido por el promotor de la ubicuitina 1 (ubi) y el intrón I del maíz en lugar del promotor de sintasa mip.

El plásmido pDAB305 se utilizó como testigo en los estudios de la expresión transitoria para estandarizar la expresión de GUS a lo largo de experimentos múltiples, pDAB305 es similar a pMipGN345-1, pero emplea el promotor 35S doblemente potenciado utilizado en pMipGN350-1 para dirigir la expresión del gen GUS.

La producción de la proteína GUS a partir de genes controlados por diferentes versiones de promotor, se comparó frecuentemente en relación con un gen testigo interno que producía la luciferasa de luciérnaga (De Wet y col. (1987). Mol. Cell. Biol. 7(2), 725-37). Un plásmido (pT3/T7-1 LUC) que contenía la región codificadora de la luciferasa (LUC) se obtuvo de CLONTECH (Palo Alto, CA), y la región codificadora se modificó en sus extremos 5' y 3' mediante métodos convencionales, para permitir el aislamiento de la región codificadora intacta de la luciferasa sobre un fragmento de 1702 pb, después de la digestión con NcoIy BglII. Este fragmento se utilizó para sustituir el gen GUS del plásmido pDAB305, de modo que la región codificadora de la luciferasa se expresaba a partir del promotor 35S potenciado, dando como resultado el plásmido pDeLux.

Ejemplo 4

Ensayo transitorio de las estructuras artificiales de la sintasa mip-GUS

A. Expresión transitoria histoquímica de GUS en embriones.

Se emplearon tres genes aislados para someter a ensayo la expresión transitoria de GUS, dirigida por el promotor de sintasa mip en embriones de maíz. pUGP232-4 (que codifica el promotor de la ubicuitina del maíz fusionado con GUS con la UTR 3' per5) servía como testigo positivo. pMipGP339-1 y pMipGN345-1 contenían una fusión del promotor de sintasa mip-GUS con los extremos 3' per5 y Nos, respectivamente. Embriones cigóticos inmaduros procedentes del genotipo "Hi-II" (Armstrong y col. (1991) Maize Genet. Coop. News Lett. 65:92-93) se recolectaron los días 12, 18 y 20 después de la polinización (DDP). Los embriones se cultivaron uno o dos días sobre un medio de iniciación de callo 15Ag10 que consiste en sales N6 y vitaminas (Chu y col., (1978)). "The N6 medium and its application to another culture of cereal crops". Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1,0 mg/L de ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D), L-prolina 25 mM, 100 mg/L de material hidrolizado de caseína, 10 mg/L de AgNO3, 2,5 g/L de GELRITE (Schweizerhall, South Plainfield, NJ) y 20 g/L de sacarosa, con un pH de 5,8 antes de esterilizar en el autoclave. Antes de la transformación, los embriones se transfirieron a medio 15Ag10+SM (15Ag10 con sorbitol 0,2 M y manitol 0,2 M) durante cuatro horas de pretratamiento osmótico. Para el bombardeo con helio, se dispusieron 12 embriones en un área diana de aproximadamente 1 cm2 sobre el medio de bombardeo y se recubrió con un tamiz de acero inoxidable con 230 µm de malla. El medio para el bombardeo difería del medio 15Ag10+SM en que carecía de nitrato de plata, sólo contenía L-prolina 6 mM y estaba solidificado con 20 g/L de agar TC (PhytoTechnology Laboratories, LLC, Shawnee

15 Mission, KS).El ADN se preparó para el bombardeo, empleando cantidades equivalentes molares de los plásmidos GUS. Se diluyó un total de 70 µg de ADN, ADN del ensayo más ADN de Bluescript® (Stratagene, La Jolla, CA) cuando era necesario, en agua estéril hasta llegar a un volumen de 150 µL. Se añadió el ADN y el agua a 30 mg de partículas de oro esféricas de 1,0 µm, de superficie esterilizada (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La mezcla fue agitada brevemente en un vórtex (aproximadamente 15 segundos) antes de añadir 37 µl de cloruro cálcico 2,5 M y 15 µl de espermidina 0,1 M (base libre). Después de agitar en vórtex durante 30 segundos, se dejó precipitar el ADN y el oro en la solución. Se retiró el material sobrenadante y se añadió 1 ml de etanol. La mezcla ADN/oro se diluyó 1:4 antes del uso para la transformación. El bombardeo con helio aceleraba las partículas de oro revestidas con ADN suspendidas, hacia las dianas del tejido preparado y dentro de las mismas. El dispositivo utilizado fue un prototipo anterior al descrito en el documento de patente de los EE.UU. nº 5.141.131 que se incorpora en la presente memoria como referencia. Los tejidos se situaron bajo un vacío parcial de 635 mm de Hg en la cámara del dispositivo. Las partículas de oro revestidas con ADN se aceleraron hacia cada una de las dianas del embrión, empleando una presión de helio de 105,58 kg/cm2, disparando con cada bombardeo 20 µL de la suspensión de ADN/oro. Después de la propulsión, los embriones se transfirieron de vuelta al medio 15Ag10+SM y se incubaron en la oscuridad a 27°C durante 18-24 horas antes del ensayo histoquímico de GUS.

Los embriones se sometieron a un análisis histoquímico de GUS (Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) colocando en placas de microtitulación de 24 pocillos que contenían 250-500 µL del tampón del ensayo [fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0, ferricianuro potásico 0,5 mM, EDTA disódico 10 mM, 5-bromo-4-cloro-3-indolil

5 beta-D-glucurónido 0,95 mM y 0,6% (v/v) de TRITON X-100] por pocillo. Se llevó a cabo un vacío parcial durante 2-15 minutos antes de empezar con la incubación en la oscuridad durante 24-48 horas a 37°C.

La Tabla 3 resume los resultados de los tres experimentos en los que se sometía a ensayo la expresión transitoria de GUS, del promotor de sintasa mip en compara10 ción con el testigo de ubicuitina de maíz. Tres a cinco dianas (12 embriones/diana) se sometieron a bombardeo por cada estructura artificial en cada experimento. Aunque no era tan intensa como en el testigo, la estructura artificial de la sintasa mip con la UTR 3' per5, daba como resultado la expresión de GUS en los embriones recolectados 12, 18 y 20 DDP. El plásmido de la sintasa mip con el extremo 3' Nos, también mos

15 traba actividad de GUS en embriones 20 DDP. En conclusión, niveles moderados de expresión transitoria se observaron con el promotor de sintasa mip en embriones cigóticos inmaduros de maíz.

Tabla 3.

Expresión transitoria de GUS en las estructuras artificiales de sintasa mip-GUS en embriones de maíz

Días después de la polinización

Plásmido

pUGP232-4

pMipGP339-1 pMipGN345-1

12

+++ + NA

18

+++ ++ NA

20

+++ + hasta ++ +

NA = no analizado

20

B. Expresión transitoria cuantitativa de GUS en callos regenerables de maíz.

Los plásmidos pMipGP339-1 y pMipGN345-1 se sometieron a ensayo en callos de maíz regenerables para indicar el nivel con el que el promotor de sintasa mip dirige la expresión constitutiva. Una estructura artificial modificada de promotor 35S/GUS

25 (pDAB305), que se expresa en alto grado en el maíz, se empleó como testigo. La expresión de GUS dirigida por pMipGP339-1 o pMipGN345-1 se determinó como un porcentaje de GUS dirigido por pDAB305.

pMipGP339-1 y pMipGN345-1 cada uno daban como resultado de la expresión un 3% de pDAB305 lo que era estadísticamente diferente del testigo. Junto con los datos anteriores de los embriones, la expresión constitutiva no significativa indica firmemente que la sintasa mip es un promotor específico del embrión.

Ejemplo 5

Producción de callos de maíz transformados de forma estable

Se iniciaron cultivos de callos de tipo II a partir de embriones cigóticos inmaduros del genotipo "Hi-II." (Armstrong y col., (1991) Maize Genet. Coop. Newslett., 65: 92-93). Los embriones fueron aislados de espigas cultivadas en invernadero a partir de cruces entre padre Hi-II A y padre Hi-II B, ó embriones F2 derivados de una autopolinización o de una polinización entre hermanos de una planta Hi-II. Los embriones inmaduros (1,5 a 3,5 mm) se cultivaron sobre medio de iniciación de callo 15Ag10, tal y como se ha descrito en esta memoria. Después de cuatro a seis semanas, el callo fue subcultivado en medio de mantenimiento del callo (medio de iniciación en el que se omitió el AgNO3 y la L-prolina se redujo a 6 mM). La selección del callo de tipo II tuvo lugar durante aprox. 12-16 semanas.

Los plásmidos pMipGN350-1 y pMipGP341 se transformaron independientemente en tejido de callo embriogénico. En la preparación del bombardeo con helio, se precipitaron 140 µg de ADN plasmídico sobre 60 mg de partículas esféricas de oro, lavadas con alcohol (1,5 - 3,0 µm de diámetro, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) añadiendo 74 µL de CaCl2 H2O 2,5 M y 30 µL de espermidina 0,1 M (base libre) a 300 µL de ADN plasmídico y H2O. La disolución se mezcló en vórtice inmediatamente y las partículas de oro recubiertas de ADN se dejaron reposar. Se retiró el material sobrenadante transparente resultante y se volvieron a suspender las partículas de oro en 1 ml de etanol absoluto. Esta suspensión se diluyó con etanol absoluto para obtener 15 mg de oro revestido con ADN/ml.

Aproximadamente 600 mg del tejido del callo embriogénico se diseminó sobre la superficie del medio osmótico de Tipo II, tal y como se ha descrito en esta memoria. Después de 4 horas de tratamiento previo, el tejido se transfirió a placas de cultivo que contenían medio de bombardeo tal y como se ha descrito en esta memoria. Las dianas se bombardean individualmente con una mezcla de ADN/oro empleando el dispositivo de bombardeo con helio descrito en esta memoria. Se cubrieron los tejidos con una rejilla de acero inoxidable (aberturas de 104 µm) y se colocaron a un vacío parcial de 635 mm de Hg en la cámara del dispositivo. Las partículas de oro recubiertas con ADN se diluyeron hasta 1:1 con etanol absoluto antes del bombardeo y se aceleraron en las dianas de los callos cuatro veces, mediante el uso de una presión de helio de 10,3 x 106 Pa, dispensándose con cada detonación 20 µl de la suspensión de ADN/oro. Las dianas se rotaron 180° después de cada bombardeo. El tejido también fue mezclado a mitad del procedimiento, para exponer el callo no bombardeado. Inmediatamente después del bombardeo, el tejido se transfirió de nuevo al medio osmótico de tipo II, durante un periodo de recuperación de 16-24 h. Después, el tejido se dividió en fragmentos pequeños y se transfirió al medio de selección (medio de mantenimiento que carecía de hidrolizado de caseína y L-prolina pero que contenía 30 mg/L de BASTA® (AgrEvo, Berlín, Alemania)). Cada cuatro semanas durante tres meses, los pedazos de tejido se transfirieron no selectivamente a un medio de selección de nuevo aporte. Después de 9 semanas y hasta 21 semanas en la selección, se retiraron y se aislaron los sectores de los callos que eran proliferantes frente a un contexto de tejido con el crecimiento inhibido. El tejido resultante resistente a BASTA® se subcultivó bisemanalmente en medio de selección de nuevo aporte.

Ejemplo 6

Desarrollo de los embriones somáticos maduros y regeneración de las plantas transgénicas

A partir de estos cultivos transformados de forma estable, los embriones somáticos se indujeron para desarrollarse como embriones de semilla haciendo crecer el callo embriogénico sobre medio basal de Murashige y Skoog, de aquí en adelante medio MS (Murashige y Skoog, Physiol. Plant. (1962) 15: 473-497) que contenía 60 g/L de sacarosa. El callo se dejó crecer durante siete días y, a continuación, los embriones somáticos se transfirieron individualmente a medio MS que contenía 60 g/L de sacarosa y ácido abscísico 10 µM, de aquí en adelante ABA, durante 7 días adicionales. Después de 14 días de maduración, los embriones somáticos procedentes de diferentes líneas transgénicas, se sometieron a ensayo para estudiar la expresión histoquímica del gen GUS, colocándolos en aproximadamente 400 µL de solución GUS, tal y como se ha descrito en esta memoria, excepto sin someter a vacío. Las líneas que expresaban GUS y las líneas que no expresaban GUS, se identificaron y se transfirieron a los medios de regeneración. La regeneración se inició transfiriendo tejido del callo embriogénico a un medio de inducción basado en citocinina, medio MS que contenía 30 g/L de sacarosa, 100 mg/L de mio-inositol, 30 g/L de manitol, 5 mg/L de 6bencilaminopurina, de aquí en adelante BAP, 0,025 mg/L de 2,4-D, 30 mg/L de BASTA® y 2,5 g/L de GELRITE a pH 5,7. Se colocaron los cultivos con poca luz (1345 lx) durante una semana y después otra semana con mucha luz (3497 lx). Después de un periodo de inducción de dos semanas, se transfirió el tejido de manera no selectiva a un medio de regeneración sin hormonas, que era idéntico al medio de inducción, salvo que carecía de 2,4-D y BAP, y se mantuvo con mucha luz. Se retiraron plántulas pequeñas (3-5 cm) y se colocaron en tubos de cultivo de 150 x 25 mm que contenían sales de Schenk y Hildebrandt y vitaminas, de aquí en adelante medio SH (Schenk y Hildebrandt, (1972) Can. J. Bot. 50:199-204), 10 g/L de sacarosa, 100 mg/L de mioinositol y 2,5 g/L de GELRITE, pH 5,8). Al menos una plántula individual de cada una de las líneas regenerables, se sacrificó para el ensayo histoquímico de GUS. Las plántulas intactas (3-10 cm) se colocaron en tubos cónicos para centrífuga de 15 mL y se sumergieron en aproximadamente 5-10 mL de tampón para el ensayo de GUS y se incubaron tal y como se ha descrito en esta memoria. Las plántulas que no se sometieron a ensayo, se transfirieron a macetas redondas de 12 cm que contenían aproximadamente 0,25 kg de METRO-MIX 360 (The Scotts Co. Marysville, OH) en el invernadero, en cuanto mostraron crecimiento y desarrollaron un sistema de raíces suficiente. Se cultivaron con un fotoperiodo de 16 h complementado mediante una combinación de lámparas de sodio y de haluros metálicos a gran presión, y se mojaron según se necesitara con una combinación de tres formulaciones de fertilizantes de Peters Excel independientes (Grace-Sierra Horticultural Products Company, Milpitas, CA). En la etapa de 6-8 hojas, las plantas se trasplantaron a macetas de diecinueve litros que contenían aproximadamente 4 kg de METRO-MIX 360, y se cultivaron hasta la madurez.

Los regenerantes primarios se cruzaron sin repetición de ancestros con la línea endogámica elite, OQ414. Las semillas R1 se recogieron aproximadamente 6 semanas después de la polinización.

Un total de 312 dianas de callo de tipo II se bombardearon con pMipGN350-1 y pMipGP341. Se recuperaron treinta y seis callos aislados resistentes a Basta® a partir de la selección, sin embargo, sólo se indujeron 29 para formar embriones somáticos maduros tal y como se describe en esta memoria. Veinte y cuatro de estos eventos producían algún nivel de tinción azul después del ensayo histoquímico de GUS, tal y como se ha descrito en esta memoria, estando en el intervalo desde azul muy claro hasta azul añil oscuro. Se regeneraron trece de estos eventos con expresión más un testigo positivo de maíz ubicuitina/GUS/Nos y un testigo negativo transgénico (sin GUS). A partir de cada una de estas líneas se regeneraron 16 plantas R0. Diez de los 13 regenerantes de MIP producían semilla R1.

Ejemplo 7

Análisis de GUS en plantas transgénicas

A. Análisis de GUS en los embriones.

Se recolectaron embriones procedentes de pMipGP341-06.06, pMipGN35005.01, pMipGN350-14.01, 1817-02.11 (testigo negativo transgénico), Whisker-12.12 y Whisker-12.14 (testigos positivos de maíz ubicuitina-GUS) 10 a 30 días después de la polinización (DDP) a intervalos de 5 días. Se recogieron hasta 10 granos por cada una de las espigas en cada recolección, dependiendo del grupo de semillas de las plantas R0. De acuerdo con el método de Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405 tal y como se describe en el mismo, los embriones se examinaron histoquímicamente para estudiar la expresión de GUS.

La falta de expresión de GUS se observó en embriones del testigo negativo transgénico (1817-02.11). De forma sorprendente, no se detectó GUS en embriones de los testigos negativos con ubicuitina (Whisker-12.12 y Whisker-12.14). El crecimiento de estas plantas estaba atrofiado y el conjunto de semillas era pobre. Sin embargo, cada uno de los tres eventos de la sintasa mip mostraba expresión de GUS en los embriones R1. En pMipGP341-06.06, la expresión no se observó antes de 10 DDP. En los eventos p350, GUS no se detectó hasta 15 DDP. La expresión en todas las líneas continuó hasta la madurez 30 DDP. La segregación seguía generalmente los patrones de la herencia mendeliana.

B. Análisis de GUS en las raíces y las hojas.

Se sacrificaron dos plantas por cada evento transgénico, así como dos testigos no transformados (OQ414), testigos negativos transformados (plantas 1817-02) y testigos positivos que expresaban GUS dirigido por la ubicuitina de maíz (eventos de Whisker-12) en diferentes etapas del desarrollo. Se recolectó una planta por evento en las etapas V6 (6 hojas) y VT (inflorescencia masculina del maíz emergente) y las hojas y las raíces se agruparon separadamente para el análisis. Adicionalmente, se recogieron las seis hojas de diversas plantas por evento en la etapa V6 y se evaluaron individualmente para estudiar la expresión de GUS.

No se detectó actividad GUS en las hojas o las raíces de los testigos no trans

5 formados (OQ414) o de los testigos negativos transformados (1817-02). Se observó una expresión de GUS variable, aunque significativa en el testigo positivo (evento Whisker-12, siete plantas), en el intervalo desde 0,45 hasta 2,34 ng de equivalente de GUS/µg de proteína en las hojas y 0,28 a 0,47 en las raíces. Los eventos transgénicos de sintasa mip-GUS no mostraban una actividad GUS significativa en las hojas ni en

10 las raíces, llevando a la conclusión de que el promotor de sintasa mip es específico del embrión.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Armstrong, Katherine Hey, Timothy D Folkerts, Otto Smith, Kelley A Hopkins, Nicole L

<120> PROMOTOR DE SINTASA MIP DEL MAIZ

<130> 50597

<140>

<141>

<150> US 60/168.612

<151> 02-12-1999

<160> 3

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1

<211> 1959

<212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (137)..(1699)

<400> 1

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<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2 <210> 3

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<211> 2069

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 3

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Claims (9)

1.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un promotor que comprende las bases 7-2064 de SEQ ID. NO: 3 o una variante de esta secuencia que tiene al menos 95% de homología con la misma y que es funcional como un promotor específico del embrión.

2.

Una estructura artificial de ácido nucleico que comprende un promotor ligado funcionalmente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, en donde el promotor comprende las bases 7-2064 de SEQ ID NO: 3 o una variante de esta secuencia que tiene al menos 95% de homología con la misma y que es funcional como un promotor específico del embrión.

3.

Un método para producir un tejido vegetal capaz de expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga, comprendiendo el método introducir en, al menos una célula vegetal, una estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

4.

Un método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende adicionalmente regenerar una planta a partir de dicha, al menos una, célula vegetal.

5.

Un método de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende adicionalmente transmitir sexualmente dicha estructura artificial de ácido nucleico a la progenie.

6.

Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende adicionalmente la recogida de las semillas producidas por dicha progenie.

7.

Una planta transformada que comprende al menos una célula vegetal que contiene una estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación

2.

8. Semilla o grano que contiene una estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.