ES2253813T3 - Induccion de esterilidad masculina en plantas por la expresion de niveles elevados de estreptavidina. - Google Patents

Abstract

Una molécula de DNA aislada que comprende un promotor específico de anteras unido operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica estreptavidina.

Description

Inducción de esterilidad masculina en plantas por la expresión de niveles elevados de estreptavidina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para controlar la fertilidad de plantas usando moléculas de DNA que codifican estreptavidina. En particular, esta invención se refiere a procedimientos para producir plantas con esterilidad masculina transgénicas las cuales expresan estreptavidina. Además, esta invención se refiere a procedimientos para restaurar la fertilidad masculina en la progenie de plantas con esterilidad masculina. La invención se refiere también a procedimientos para la producción de semillas híbridas, en particular, semillas híbridas con uno o más rasgos deseados del grano o la semilla, usando plantas con esterilidad masculina las cuales expresan estreptavidina.

Antecedentes de la invención

El control de la fertilidad del polen es esencial en producción de cosechas híbridas. Véase, por ejemplo, J.M. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3ª edición (Van Nostrand and Reinhold, Nueva York, NY, 1987). En la producción de maíz híbrido, por ejemplo, el control de la fertilidad del polen se lleva a cabo típicamente eliminando físicamente la inflorescencia masculina, o penacho, antes de la emisión polínica. La eliminación manual del penacho es un trabajo altamente intensivo. Aunque la eliminación mecánica del penacho es un trabajo menos intensivo que la eliminación manual del penacho, es menos fiable y requiere el examen subsiguiente de la cosecha y comúnmente, es de refuerzo de la eliminación manual del penacho. Ambos procedimientos de eliminación del penacho causan una pérdida de la producción parental femenina.

La mayoría de las plantas de cultivo principales de interés, sin embargo, tienen tanto órganos masculinos como femeninos funcionales en la misma flor; por lo tanto, la emasculación no es un procedimiento simple. Mientras que es posible eliminar manualmente los órganos formadores de polen antes de que el polen se emita, esta forma de producción híbrida es extremadamente intensiva y cara como tarea.

La fertilidad del polen también se puede controlar aplicando un pulverizador foliar que tiene propiedades gametocidas contra los gametos masculinos. Cross y col., Sex Plant Reprod. 4: 235 (1991). Por ejemplo, la aplicación de ethrel a las anteras da como resultado mitosis polínica adicional en trigo, degeneración de las células tapetales en cebada, y polen malformado o abortado en Eragrostis. Bennet y col., Nature 240: 566 (1972), Colhoun y col., Plant Cell Environ. 6: 21 (1983); Berthe y col., Crop Sci. 18: 35 (1978). Sin embargo, la aproximación química es intensiva como trabajo, presenta problemas potenciales con la toxicidad de los productos químicos introducidos en el ambiente, y puede ser muy sensible al momento de la aplicación.

Además, la producción comercial de semilla híbrida usando gametocidas está limitada por el gasto y la disponibilidad de los productos químicos, igual que por la fiabilidad y duración de acción de las aplicaciones. Una seria limitación de los gametocidas es que tienen efectos fitotóxicos, la gravedad de los cuales depende del genotipo. Otras limitaciones incluyen que estos productos químicos pueden no ser efectivos para cultivos con un periodo de floración prolongado debido a que las nuevas flores producidas no se afectan. Consecuentemente, se requiere la aplicación repetida de productos químicos.

Muchos sistemas de producción de semillas híbridas comerciales actuales para cultivos de campo dependen de un medio genético de control de la polinización. Las plantas que se usan como hembras bien fallan al emitir polen, bien producen polen que es bioquímicamente incapaz de efectuar autofertilización, o bien fallan al fabricar polen. Las plantas que son incapaces de autofertilizarse se dice que son "autoincompatibles". Las dificultades asociadas con el uso de un sistema de autoincompatibilidad incluyen disponibilidad y propagación de la línea femenina autoincompatible, y estabilidad de la autocompatibilidad. En muchos casos, la autoincompatibilidad se puede superar químicamente, o los brotes inmaduros se pueden polinizar manualmente antes de que los mecanismos bioquímicos que bloquean el polen se activen. Los sistemas de autoincompatibilidad que se pueden desactivar son a menudo muy vulnerables a las condiciones climáticas estresantes que rompen o reducen la efectividad del bloque bioquímico de autopolinización.

De interés más amplio para la producción comercial de semillas son los sistemas genéticos basados en control del polen que causan esterilidad masculina. Estos sistemas son de dos tipos generales: (1) esterilidad masculina nuclear, la cual es el fallo de la formación de polen debido a mutaciones en uno o más genes nucleares o (2) esterilidad masculina citoplásmica-genética, referida comúnmente a como "esterilidad masculina citoplásmica" (CMS), en la cual la formación de polen se bloquea o aborta debido a una alteración en un orgánulo citoplásmico, el cual generalmente es la mitocondria.

La esterilidad nuclear puede ser bien dominante o bien recesiva. Típicamente, la esterilidad dominante sólo se puede usar para la formación de semillas híbridas si la propagación vegetativa o clonal de la línea femenina es posible. La esterilidad recesiva se puede usar si las plantas estériles y fértiles se discriminan fácilmente. La utilidad comercial de sistemas de esterilidad dominantes y recesivos está limitada, sin embargo, por el gasto de la propagación clonal y el enrojecimiento de las líneas femeninas de las plantas autofertilizables, respectivamente.

\newpage

Aunque hay esquemas de hibridación que implican el uso de CMS, hay limitaciones para su valor comercial. Un ejemplo de un sistema CMS es una mutación específica en la mitocondria situada en el citoplasma la cual puede, cuando está en el adecuado antecedente nuclear, conducir al fallo de la formación de polen maduro. En algunos ejemplos, el antecedente nuclear se puede compensar por la mutación citoplásmica y tiene lugar la formación de polen normal. Los genes restauradores nucleares específicos permiten la formación de polen en plantas con mitocondria de CMS. Generalmente, el uso de CMS para producción comercial de semillas implica el uso de tres líneas de cría: una línea con esterilidad masculina (parental femenina), una línea mantenedora la cual es isogénica a la línea masculina estéril pero contiene mitocondria plenamente funcional, y una línea parental masculina. La línea parental masculina puede o no puede llevar los genes restauradores específicos en el citoplasma.

Para cultivos tales como vegetales para los cuales la recuperación de semillas del híbrido no es importante, un sistema CMS se puede usar sin restauración. Para cultivos para los cuales la fruta o semilla del híbrido es el producto comercial, la fertilidad de la semilla del híbrido se debe restaurar mediante los genes restauradores específicos en el progenitor masculino o se debe polinizar el híbrido con esterilidad masculina. La polinización de híbridos no restaurados se puede lograr incluyendo un pequeño porcentaje de plantas fértiles masculinas para llevar a cabo la polinización. En la mayoría de las especies, la característica CMS se hereda maternalmente, dado que todos los orgánulos citoplásmicos se heredan usualmente sólo de la célula huevo.

Los sistemas CMS poseen limitaciones que pueden descartarlos como una solución única para la producción de plantas con esterilidad masculina. Por ejemplo, un tipo particular de CMS en maíz (citoplasma T) confiere sensibilidad a la toxina producida mediante infección por un hongo particular. Aunque usados aún para un número de cultivos, los sistemas CMS pueden fallar bajo ciertas condiciones ambientales.

Es patente por lo tanto que un medio de controlar la producción polínica mediante un procedimiento diferente a los procedimientos manuales, mecánicos, químicos y genéticos tradicionales es grandemente deseable.

Sumario de la invención

De acuerdo con ello, es un objeto de la presente invención proporcionar una molécula de DNA aislada que comprende un promotor específico de anteras unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina.

Es un objeto adicional de esta invención proporcionar un vector de expresión que comprende la molécula de DNA aislada de acuerdo con la invención. En una realización preferida de la presente invención, el vector de expresión es uno en el que una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal está unida operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina. En una realización adicional, el vector de expresión es uno en el que dicha secuencia señal es la secuencia señal de la alfa amilasa de levadura.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona una planta transgénica en la que dicha planta comprende el vector de expresión de acuerdo con la invención. En realizaciones preferidas la planta transgénica es una planta de maíz, una planta de soja, una planta de colza, o una planta de girasol.

Es otro objeto de la invención proporcionar un procedimiento de producir una planta con esterilidad masculina transgénica, que comprende introducir dentro de las células de la planta un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina y que regenera una planta transgénica a partir de dichas células transformadas, en la que dicho promotor controla la expresión de dicho gen, y a través de la cual dicha expresión genética causa esterilidad masculina de dicha planta transgénica.

En un aspecto adicional de la invención hay proporcionado un procedimiento de usar un gen de estreptavidina para producir una planta híbrida con fertilidad masculina, que comprende las etapas de: (a) producir una primera planta con esterilidad masculina que comprende una molécula de DNA que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina en el que la expresión de dicha estreptavidina causa esterilidad masculina; (b) producir una segunda planta parental transgénica la cual expresa un segundo gen extraño; y (c) fertilizar de forma cruzada dicho primer progenitor con dicho segundo progenitor para producir una planta híbrida; en el que dicha planta híbrida expresa dicho segundo gen extraño, y en el que el producto de dicho segundo gen extraño reduce la expresión de estreptavidina en dicha planta híbrida, produciendo de este modo una planta híbrida con fertilidad masculina.

En una realización preferida de este aspecto de la invención se selecciona el segundo gen extraño del grupo que consta de un gen antisentido, un gen de ribozima y un gen de secuencia guía externa. En realizaciones adicionales preferidas la molécula de DNA de la primera planta parental comprende adicionalmente un operador LexA el cual se une operativamente al citado promotor, en el que el segundo gen extraño es el gen represor de LexA.

En un aspecto adicional de la invención hay proporcionado un procedimiento para producir semillas que tienen una característica de grano deseada, que comprende las etapas de: (a) producir una primera planta transgénica que es estéril como macho y comprende una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina operativamente unida a una secuencia promotora; (b) producir una segunda planta parental la cual es fértil como macho y lleva uno o más genes que controlan dicha característica de grano deseada; (c) fertilizar de forma cruzada dicho primer padre con dicho segundo padre para producir semillas híbridas con dicha característica de grano, y (d) cosechar dichas semillas.

En una realización preferida de este aspecto de la invención la primera planta padre es una planta híbrida. En aún otras realizaciones, la citada característica del grano se selecciona del grupo que consta de contenido en aceite, proteína o almidón. En realizaciones preferidas la planta parental es maíz, soja, colza o girasol.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la secuencia promotora es un promotor específico de anteras que comprende una caja de anteras seleccionada del grupo que consta de la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 1; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 2, la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 3; y un fragmento funcional de la misma.

En aún otra realización preferida de la invención la caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 1 y en la que dicho promotor específico de anteras comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que consta de: el promotor esencial CaMV 35S; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y un fragmento funcional de la misma.

En aún otra realización preferida de la invención la caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 2, y en la que dicho promotor específico de anteras comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que consta de: el promotor esencial CaMV 35S; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y un fragmento funcional de la misma.

En aún otra realización preferida de la invención la caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 3, y en la que dicho promotor específico de anteras comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que consta de: el promotor esencial CaMV 35S; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y un fragmento funcional de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el plásmido codificante de avidina PHI5168 en el cual un promotor de ubiquitina de maíz (incluyendo su primer exón más su primer intrón) conduce la expresión de una secuencia señal de exportación de alfa amilasa de cebada y una región codificante de avidina.

La figura 1 muestra el plásmido codificante PHI6l0 que codifica el gen bar.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas 1. Definiciones

En esta descripción que sigue un número de términos se usan extensamente. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención.

Un gen estructural es una secuencia de DNA que se transcribe en RNA mensajero (RNAm) el cual se traduce después en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Un gen extraño se refiere en la presente descripción a una secuencia de DNA que está unida operativamente a al menos un elemento regulador heterólogo. Por ejemplo, cualquier gen distinto al gen estructural 5126 de maíz se considera que es un gen extraño si la expresión de ese gen se controla mediante un elemento regulador específico de anteras del gen 5126.

Un promotor es una secuencia de DNA que dirige la transcripción de un gen, tal como un gen estructural, un gen antisentido, un gen de ribozima o un gen de secuencia de guía externa. Típicamente, un promotor está situado en la región 5' de un gen, próximo al sitio de inicio de la transcripción. Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción se incrementa en respuesta a un agente de inducción. En contraste, la velocidad de transcripción no está regulada mediante un agente de inducción si el promotor es un promotor constitutivo. Un promotor vegetal es una secuencia promotora que dirigirá la transcripción de un gen en un tejido vegetal.

Un promotor esencial contiene secuencias nucleotídicas esenciales para la función del promotor, incluyendo la caja TATA y el inicio de transcripción. Mediante esta definición, un promotor esencial puede o no puede tener actividad detectable en la ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la actividad o conferir actividad específica de tejido. Por ejemplo, el promotor esencial SGB6 consta de aproximadamente 38 nucleótidos de la zona 5' del sitio de inicio transcripcional del gen SGB6, mientras que el promotor esencial de 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) consta de aproximadamente 33 nucleótidos de la zona 5' del sitio de inicio transcripcional del genoma de 35S.

Un promotor específico de tejido es una secuencia de DNA que, cuando se une operativamente a un gen, conduce a un nivel mayor de transcripción de ese gen en un tejido específico que en algunos o todos los otros tejidos en un organismo. Por ejemplo, un promotor específico de anteras es una secuencia de DNA que conduce a un nivel mayor de transcripción de un gen asociado en el tejido de las anteras de la planta. El promotor específico de anteras SGB6, por ejemplo, puede dirigir la expresión de un gen extraño en tejido de anteras, pero no en el tejido radical o tejido del coleoptilo.

Como se usa en el presente documento, un "promotor específico de anteras" comprende dos elementos funcionales: una "caja de anteras" y un promotor esencial. Una caja de anteras en particular posee las características funcionales de un potenciador clásico. La combinación de una caja de anteras y un promotor esencial puede estimular la expresión génica a una mayor extensión que un promotor esencial solo. Esto es verdad incluso en el caso de un promotor quimérico específico de anteras que contiene una caja de anteras y un promotor esencial derivado de diferentes genes. Tales elementos reguladores específicos de anteras quiméricos se describen a continuación.

Un operador es una secuencia de DNA que se localiza en la zona 5' de un gen y que contiene una secuencia de nucleótidos la cual se reconoce y une mediante una proteína represora. La unión de una proteína represora con su operador conocido como resultado la inhibición de la transcripción del gen. Por ejemplo, el gen LexA codifica una proteína represora que se une al operador LexA.

Una molécula de DNA aislada es un fragmento de DNA que se ha separado del DNA de un organismo. Por ejemplo, una molécula de DNA clonada que codifica un gen de avidina es una molécula aislada de DNA. Otro ejemplo de una molécula aislada de DNA es una molécula de DNA sintetizada químicamente, o de cDNA producido enzimáticamente, que no está integrado en el DNA genómico de un organismo.

Un potenciador es un elemento regulador de DNA que puede incrementar la eficiencia de la transcripción.

El DNA complementario (cDNA) es una molécula de cadena simple de DNA que se forma a partir de una plantilla de RNAm mediante la enzima transcriptasa reversa. Típicamente, un cebador complementario a partes de RNAm se emplea para la iniciación de transcripción reversa. Aquellos expertos en la técnica también usan el término "cDNA" para referirse a una molécula de DNA de doble cadena que consta de tal molécula de DNA de cadena simple y su cadena de DNA complementaria.

El término expresión se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica transcripción del gen estructural en RNAm y la traducción de RNAm en uno o más polipéptidos.

Un vector de clonación es una molécula de DNA, tal como un plásmido, cósmido, o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse autónomamente en una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los cuales las secuencias de DNA extraño se pueden insertar en un modo determinado sin pérdida de una función biológica esencial del vector, igual que un gen marcador que es adecuado para usar en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina.

Un vector de expresión es una molécula de DNA que comprende un gen que se expresa en una célula huésped. Típicamente, la expresión génica se sitúa bajo el control de ciertos elementos reguladores, incluyendo promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores específicos de tejido, y potenciadores. De un gen tal se dice que está "operativamente unido a" los elementos reguladores.

Un huésped recombinante puede ser una célula procariota o eucariota que contiene bien un vector de clonación o bien un vector de expresión. Este término también incluye aquellas células procariotas o eucariotas que se han modificado mediante ingeniería genética para contener el gen/los genes clonado(s) en el cromosoma o genoma de la célula huésped.

Una planta transgénica es una planta que tiene una o más células vegetales que contienen un gen extraño.

En eucariotas, la RNA polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir RNAm. Una molécula de DNA se puede diseñar para contener una plantilla de RNA polimerasa II en la cual el transcrito de RNA tiene una secuencia que es complementaria a aquella de un RNAm. El transcrito de RNA se llama un RNA antisentido y una secuencia de DNA que codifica el RNA antisentido se llama un gen antisentido. Las moléculas de RNA antisentido son capaces de unirse a moléculas de RNAm, dando como resultado una inhibición de traducción de RNAm.

Una ribozima es una molécula de RNA que contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de RNA, RNA con capacidad de "autosplicing", y RNA con capacidad de autoescisión. Una secuencia de DNA que codifica una ribozima se llama un gen de ribozima.

Una secuencia guía externa es una molécula de RNA que dirige a la ribozima endógena, RNAsa P, a una especie particular de RNAm intracelular, dando como resultado la escisión del RNAm mediante RNAsa P. Una secuencia de DNA que codifica una secuencia guía externa se llama un gen de secuencia guía externa.

Una propiedad de grano o semilla es una característica nutricional o fisiológica de la semilla, preferiblemente controlada mediante un gen dominante, la cual afecta significativamente al tipo industrial. Las propiedades de grano o semilla incluyen características tales como contenido en aceite, proteína y almidón, igual que calidad proteica y tipo de almidón.

Un cruce individual es un cruce entre dos líneas endogámicas.

Un cruce doble es un cruce entre dos cruces individuales.

Un cruce de tres caminos es la progenie de un cruce entre un cruce individual y una línea endogámica.

Un híbrido es un vástago de primera generación de un cruce entre dos individuos que difieren en uno o más genes.

Una línea endogámica es una línea pura originada usualmente mediante autopolinización y selección.

Una línea sintética es una mezcla de cepas, clones, endógamos o híbridos entre ellos, mantenidos mediante polinización abierta durante un número especificado de generaciones. Los componentes unidos se propagan y los compuestos de síntesis se reconstituyen a intervalos regulares.

La capacidad de combinación específica es la realización de combinaciones específicas de líneas genéticas en cruces en relación a la realización promedio de todas las combinaciones.

Una planta polinizadora es el padre fértil masculino el cual dona polen al progenitor femenino con esterilidad masculina. Una planta polinizadora puede tener uno cualquiera de muchos antecedentes genéticos diferentes y por lo tanto puede ser una línea endogámica, un híbrido, una línea polinizada abierta sintética o una reserva genética. Una planta polinizadora puede ser una línea transgénica. Una planta polinizadora puede llevar una o más características de grano o semilla de interés.

2. Visión general

La presente invención proporciona procedimientos para generar plantas masculinas estériles preparando plantas transgénicas que expresan estreptavidina. La estreptavidina se puede expresar constitutivamente, en una forma no específica de tejido, o se puede expresar en una forma específica de antera. Los procedimientos para restaurar la fertilidad masculina se proporcionan también.

También se proporciona un procedimiento para producir semillas híbridas que tienen una o más características de grano o semilla de interés. En una realización preferida de esta invención un primer híbrido, el cual es estéril como macho y tiene una o más copias del gen de estreptavidina, se cruza como el progenitor femenino con un segundo híbrido, el cual es fértil como macho y lleva una o más características de semilla o grano de interés. Las semillas híbridas se producen con una o más características de semilla o grano del progenitor masculino.

Un gen de estreptavidina se aísla e inserta dentro de un vector de expresión adecuado para introducción en el tejido vegetal. El vector de expresión comprende adicionalmente un promotor el cual puede ser un promotor constitutivo, un promotor no específico de tejido, tal como el promotor de ubiquitina, un promotor específico de tejido tal como un promotor específico de anteras, o un promotor inducible. El vector de expresión puede comprender una secuencia señal de exportación. La expresión de alto nivel de un producto génico el cual se acumula entonces en el citoplasma puede resultar en toxicidad para la célula vegetal. La eliminación del producto génico del citoplasma puede dar como resultado así citotoxicidad reducida. Se conocen genes vegetales y sus secuencias señal de exportación. Véase Jones y Robinson, Tansley Review 17: 567-597 (1989). El vector de expresión se introduce en el tejido vegetal mediante procedimientos estándar y las plantas transgénicas se seleccionan y propagan. Las plantas trasgénicas que expresan estreptavidina son estériles como machos. La fertilidad masculina se puede restaurar mediante coexpresión en las plantas transgénicas de un segundo gen que inhibe la transcripción del gen de estreptavidina, o inhibe la traducción de RNAm de estreptavidina. De acuerdo con esta realización, la supresión temporal del gen de avidina se logra si el gen supresor está unido operativamente a un promotor inducible. Alternativamente, la fertilidad masculina se puede restaurar pulverizando plantas en desarrollo con disoluciones de biotina.

3. Aislamiento de Moléculas de DNA que Codifican Avidina

Las secuencias de nucleótidos que codifican avidina se pueden aislar mediante procedimiento conocidos. Por ejemplo, se conoce la secuencia de nucleótidos del gen de la estreptavidina. Argarana y col., Nucleic Acids Res., 14(4): 1871-1882 (1986). Alternativamente, un cDNA que codifica avidina blanca de huevo de pollo se puede aislar a partir de una biblioteca de cDNA de oviducto de pollo mediante los procedimientos descritos mediante Gope y col., Nucleic Acids Res., 15: 3595 (1987).

Los clones genómicos del gen de avidina se pueden obtener a partir del DNA genómico de organismos que son conocidos por producir avidina. Por ejemplo, un gen de avidina de pollo se puede clonar a partir de DNA genómico de pollo mediante los procedimientos descritos en Keinanen y col, Eur. J. Biochem. 220: 615 (1994).

Los genes de avidina se pueden aislar también usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando procedimientos estándar. Véase Erlich, PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (Stockton Press, NY, 1989) y Innis y col., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Academic Press, San Diego, 1990). Los procedimientos para amplificación de PCR de secuencias largas de nucleótidos, tales como el sistema ELONGASE™ (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) se pueden usar también para obtener secuencias nucleotídicas más largas, tales como clones genómicos que codifican avidina. Los cebadores de PCR complementarios a los extremos 5' y 3' de las secuencias génicas conocidas de avidina se pueden sintetizar usando sintetizadores de oligonucleótidos comerciales, tales como aquellos suministrados por Applied Biosystems (Foster City, CA). En una realización preferida, los cebadores incluyen secuencias de nucleótidos adicionales que contienen sitios de escisión de endonucleasas de restricción. La presencia de tales sitios permite la clonación direccional de productos de PCR en vectores de clonación adecuados después del tratamiento con una enzima de restricción apropiada. Véase Finney, "Molecular Cloning of PCR Products" en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel y col. Eds. (John Wiley & Sons, Nueva York, 1987) p. 15.7.1.

La plantilla de DNA para el PCR puede bien ser cDNA o bien DNA genómico, y se puede preparar a partir de un organismo apropiado usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). El DNA genómico se puede preparar directamente a partir de tejido aviar, reptiliano o de anfibio usando reactivos comerciales, tales como Triazol™ (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Alternativamente, el cDNA que codifica avidina se puede preparar usando RNAm extraído del tejido de oviducto de pollo usando un kit comercialmente disponible (Pharmacia, Piscataway, NJ). La preparación de RNAm se usa como una plantilla para la síntesis de cDNA usando poli(dT) o cebadores hexámeros aleatorios mediante técnicas estándar. Véase Sambrook y col., supra. La síntesis de cDNA se lleva a cabo después usando un kit comercialmente disponible (Pharmacia), y el cDNA se usa directamente para PCR usando el procedimiento de Saiki y col., Science 239: 487 (1988).

El DNA genómico o los fragmentos de cDNA aislados mediante los procedimientos descritos anteriormente se pueden insertar en un vector, tal como un vector bacteriófago o cósmido, de acuerdo con técnicas convencionales, tales como el uso de digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, el uso de tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable de moléculas de DNA, y la ligazón con ligasas apropiadas. Las técnicas para la manipulación de tales vectores se describen por Ausubel y col. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, páginas 3.0.5-3.17.5 (1990) ["Ausubel"].

Alternativamente, las secuencias nucleotídicas que codifican avidina se pueden obtener sintetizando moléculas de DNA que codifican avidina usando oligonucleótidos largos que se sirven como cebadores mutuamente. Véase, por ejemplo, Ausubel en páginas 8.2.8 a 8.2.13. Además, véase Wosnick y col., Gene 60: 115 (1987). Las técnicas actuales que usan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad para sintetizar genes tan largos como 1,8 kilobases de longitud. Adang y col., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot y col., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993). La secuencia de nucleótidos de un gen de avidina sintetizado se puede basar en cualquier molécula de DNA codificadora de avidina conocida. Véase, por ejemplo, Gope y col., supra.

Estos clones se pueden analizar usando una diversidad de técnicas estándar tales como análisis de restricción, análisis de Southern, análisis de extensión de cebadores, y análisis de secuencia de DNA. El análisis de extensión de cebadores o análisis de protección de la nucleasa S1, por ejemplo, se pueden usar para localizar el sitio de inicio teórico de transcripción del gen clonado. Ausubel en páginas 4.8.1-4.8.5; Walmsley y col., "Quantitative and Qualitative Analisys of Exogenous Gene Expression by the S1 Nuclease Protection Assay", en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (ed.), páginas 271-281 (Humana Press Inc. 1991). Estas técnicas y técnicas relacionadas bien conocidas para alguien experto en la técnica se emplean para aislamiento de otros genes de interés, y su clonación y expresión.

4. Clonación de un Gen de Avidina dentro de un Vector de Expresión y Preparación de Plantas Transgénicas

Una vez un gen de avidina se ha aislado se sitúa dentro de un vector de expresión mediante procedimientos estándar. Véase Sambrook y col., supra. La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del procedimiento de introducir el vector de expresión dentro de las células huésped. Típicamente, un vector de expresión contiene: (1) elementos de DNA procariótico que codifican para un origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a antibióticos para proporcionar para el crecimiento y selección del vector de expresión en el huésped bacteriano; (2) un sitio de clonación para inserción de una secuencia de DNA exógena, por ejemplo un gen de avidina; (3) elementos de DNA eucariótico que controlan la iniciación de transcripción del gen exógeno, tales como un promotor; (4) elementos de DNA que controlan el procesamiento de transcriptos, tales como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación; y (5) un gen que codifica una proteína marcadora (por ejemplo un gen comunicador), en el que el gen está unido operativamente a los elementos de DNA que controlan la iniciación de la transcripción. Adicionalmente, el vector de expresión puede comprender una secuencia de DNA que codifica una secuencia señal de exportación unida operativamente a la secuencia de DNA exógeno. Las descripciones generales de los vectores de expresión vegetales y los genes comunicadores se pueden encontrar en Gruber y col., "Vectors for Plant Transformation", en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick y col. (eds.), páginas 89-119 (CRC Press, 1993).

\newpage

En una realización preferida de la presente invención un sistema promotor de ubiquitina vegetal se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea 0 342 926. El promotor de ubiquitina es un promotor constitutivo.

Un promotor inducible se usa para permitir la regulación inducible de la expresión de avidina. Un ejemplo de un promotor inducible tal es el sistema glutation S-transferasa en maíz. Véase Wiegand y col., Plant Mol. Biol. 7: 235 (1986). Este procedimiento permite también la inducción reversible de esterilidad masculina. Así, la expresión de avidina y la esterilidad masculina concomitante, se puede controlar como se desea mediante activación del promotor. Cuando el promotor no se activa, la avidina no se expresa, y las plantas son fértiles como machos.

La expresión puede comprender un marcador seleccionable o rastreable. Muchos de los genes marcadores seleccionables positivos usados comúnmente para la transformación vegetal se aislaron a partir de bacterias y codifican para enzimas que detoxifican metabólicamente un agente químico selectivo el cual puede ser un antibiótico o un herbicida. Otros genes marcadores selectivos positivos codifican una diana alterada la cual es insensible al inhibidor.

Un gen marcador seleccionable comúnmente usado para la transformación vegetal es el gen de la neomicina fosfotransferasa II (npyII), aislado a partir de Tn5, el cual cuando se sitúa bajo el control de las señales reguladoras vegetales confiere resistencia a kanamicina. Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803 (1983). Otro marcador seleccionable comúnmente usado es el gen de la higromicina fosfotransferasa el cual confiere resistencia a antibióticos incluyendo gentamicinacetiltransferasa, estreptomicinfosfotransferasa, aminoglucósido-3'-adeniltransferasa y el determinante de la resistencia a bleomicina. Hayford y col., Plant Physiol. 86: 1216 (1988); Jones y col., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svab y col., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille y col., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986).

Otros genes marcadores seleccionables positivos para transformación vegetal no son de origen bacteriano. Estos genes incluyen dihidrofolato reductasa de ratón, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfatosintasa vegetal y acetolactatosintasa vegetal. Eichholz y col., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Sha y col., Science 233: 478 (1986); Charest y col., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).

Otros genes marcadores seleccionables comunes para plantas confieren resistencia a inhibidores herbicidas de la glutaminasintetasa. La Solicitud de Patente Europea Nº.: 0 333 033 cedida a Kumada y col. y la Patente de los Estados Unidos Nº.: 4.975.374 cedida a Goodman y col. describen las secuencias de nucleótidos de los genes de glutaminasintetasa los cuales confieren resistencia a herbicidas tales como L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen de la fosfinotricin-acetiltransferasa se proporciona en la Solicitud Europea Nº.: 0 242 246 cedida a Leemans y col. De Greef y col., Bio/Technology 7: 61 (1989), describe la producción de plantas transgénicas que expresa genes bar quiméricos que codifican para la actividad fosfinotricin-acetil-transferasa.

Otra clase de genes marcadores para transformación vegetal requiere rastreo de células vegetales transformadas presumiblemente más que selección genética directa de células transformadas para resistencia frente a una sustancia tóxica tal como un antibiótico. Estos genes son particularmente útiles para cuantificar o visualizar el patrón espacial de expresión de un gen en tejidos específicos y se refieren frecuentemente como genes comunicadores debido a que se pueden fusionar a un gen o secuencia reguladora génica para la investigación de la expresión génica.

Los genes comúnmente usados para rastrear células presumiblemente incluyen \beta-glucuronidasa (GUS), \beta-galactosidasa, luciferasa y cloranfenicolacetiltransferasa. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987); Teeri y col., EMBO J. 8: 343 (1989); Koncz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 131 (1987); De Block y col., EMBO J. 3: 1681 (1984). Se ha usado otra aproximación a la identificación de los eventos de transformación relativamente raros de un gen que codifica un regulador constitutivo dominante de la vía de pigmentación con antocianina de Zea mays. Ludwig y col., Science 247: 449 (1990).

Los vectores de expresión pueden comprender el gen de avidina unido operativamente a una secuencia de DNA que codifica para una secuencia señal de exportación de péptidos. Véase Hones y Robinson, supra. El vector se hace de tal forma que una secuencia señal se fusiona al extremo N-terminal de la secuencia proteica de avidina madura, permitiendo el procesamiento celular normal para escindir con seguridad la molécula de proteína y producir avidina activa madura. En una realización particularmente preferida, la secuencia señal es la secuencia señal alfa amilasa de cebada. Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985).

Los vectores de expresión que contienen un gen de avidina se pueden introducir dentro de protoplastos, o dentro de tejidos intactos, tales como embriones inmaduros y meristemos, o dentro de cultivos de callos, o dentro de células aisladas. Preferiblemente, los vectores de expresión se introducen dentro de tejidos intactos. Los procedimientos generales de cultivar tejidos vegetales se proporcionan, por ejemplo, por Miki y col., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick y col. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993), y por Phillips y col., "Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation", en CORN AND CORN IMPROVEMENT, 3ª Edición, Sprague y col. (eds.), páginas 345-387 (American Society of Agronomy, Inc. y col. 1988).

Los procedimientos de introducir vectores de expresión dentro del tejido vegetal incluyen la infección directa o co-cultivo de tejido vegetal con Agrobacterium tumefasciens, Horsch y col., Science 227: 1229 (1985). Preferiblemente, un Ti-plásmido desarmado se usa como un vector para secuencias de DNA extrañas. La transformación se puede llevar a cabo usando procedimientos descritos, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Europea Nº^{s}.: 116 718 (1984) y 270 822 (1988). Los vectores del Ti-plásmido preferidos contienen la secuencia de DNA extraño entre las secuencias fronterizas, o al menos localizado con anterioridad en la cadena a la secuencia fronteriza derecha.

Otros tipos de vectores se pueden usar para transformar las células vegetales usando procedimientos tales como transferencia génica directa (véase, por ejemplo, la Solicitud PCT WO 85/01856 y la Solicitud Europea 275 069), transformación in vitro de protoplastos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos Nº.: 4.684.611), transformación de plantas mediadas por virus (por ejemplo, Solicitud Europea Nº.: 067 553 y Patente de los Estados Unidos Nº.: 4.407.956), y transformación mediada por liposomas (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº. 4.536.475). Procedimientos adecuados para la transformación del maíz se proporcionan por Fromm y col., Bio/Technology 8: 833 (1990), y mediante Gordon-Kamm y col., The Plant Cell 2: 603 (1990). Los procedimientos estándar para la transformación del arroz se describen por Christou y col., Trends in Biotechnology 10: 239 (1992), y mediante Lee y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 6389 (1991). El trigo se puede transformar usando procedimientos que son similares a las técnicas para transformar maíz o arroz. Además, Casas y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993), describe un procedimiento para transformar sorgo, mientas que Wan y col., Plant Physiol. 104: 37 (1994), describe un procedimiento para transformar cebada.

En general, los procedimientos de transferencia directa se prefieren para la transformación de una planta monocotiledónea, particularmente un cereal tal como arroz, maíz, sorgo, cebada o trigo. Los procedimientos de transferencia directa adecuados incluyen administración mediada por microproyectiles, inyección de DNA, electroporación, y similares. Véase, por ejemplo, Gruber y col., supra, Miki y col, supra, y Klein y col., Bio/Technology 10: 268 (1992). Más preferiblemente, los vectores de expresión se introducen en tejidos de una planta monocotiledónea que usan administración mediada por microproyectiles con un dispositivo biolístico.

5. Regulación de la Fertilidad Masculina A. Producción de Plantas con Esterilidad Masculina

Para inducir esterilidad masculina se construye un vector de expresión en el cual una secuencia de DNA que codifica avidina está unida operativamente a las secuencias de DNA que regulan la transcripción de genes en tejido vegetal. Los requerimientos generales de un vector de expresión se describen anteriormente. Con el fin de lograr esterilidad masculina mediante expresión de avidina se prefiere que la avidina no se exprese meramente en una forma transitoria, sino que el vector de expresión se introduce dentro del tejido embrionario vegetal en una forma tal que la avidina se expresará como una fase posterior de desarrollo en la planta adulta. Por ejemplo, la estabilidad mitótica se puede lograr usando vectores virales vegetales que proporcionan replicación epicromosomal.

Un procedimiento preferido de obtener estabilidad mitótica se proporciona mediante la integración de secuencias de vector de expresión en el cromosoma huésped. Tal estabilidad mitótica se puede proporcionar mediante la administración con microproyectiles de un vector de expresión a tejido vegetal, o usando otros procedimientos estándar como se describe anteriormente. Véase, por ejemplo, Fromm y col., Bio/Technology 8: 833 (1990), Gordon-Kamm y col., The Plant Cell 2: 603 (1990), y Walters y col., Plant Molec. Biol. 18: 189 (1992).

La transcripción del gen de avidina después de la introducción dentro del tejido vegetal se controla preferiblemente mediante un promotor constitutivo que estimula no específicamente la expresión génica en tejidos vegetales. Un ejemplo de un promotor constitutivo adecuado para este propósito es el promotor de ubiquitina, como se describe supra.

La transcripción del gen de avidina puede controlarse también mediante un promotor el cual un promotor el cual estimula la expresión génica de una manera específica de tejido. Un promotor específico de anteras particularmente preferido es el promotor 5126 el cual se aisló de la línea endogámica de maíz línea B73. El promotor 5126 estimula la expresión de un gen extraño desde anteras en cuarteto hasta anteras en fase de microspora uninucleada temprana.

Otro promotor específico de anteras adecuado es el promotor SGB6, el cual se aisló también a partir de la línea B73. El promotor SGB6 puede inducir expresión de un gen extraño en las células tapetales de las anteras desde la fase de cuarteto hasta la fase semiuninucleada del desarrollo de microspora.

Alternativamente, la expresión de genes específicos de anteras se puede proporcionar usando una combinación de una caja de anteras y un promotor esencial. Una caja de anteras particularmente preferida es una caja de anteras 5126 la cual comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:

1

2

Otra caja de anteras adecuada reside en un fragmento de DNA de 94 pares de bases definido por nucleótidos 583 a 490 corriente arriba del sitio de inicio de transcripción de SGB6. La secuencia de nucleótidos de la caja de anteras de SGB6 de 94 pares de bases es:

3

Alternativamente, una caja de anteras adecuada se obtienen a partir del promotor G9 de maíz, el cual estimula la expresión de genes durante las etapas de desarrollo de la meiótica a la de cuarteto. La caja de anteras G9 comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:

4

Las cajas de anteras 5126, SGB6 y G9 se pueden obtener sintetizando oligonucleótidos, como se describe anteriormente. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el análisis de deleción se puede llevar a cabo para localizar una o más secuencias reguladoras específicas de anteras en las cajas de anteras descritas. Tales "fragmentos funcionales" de las cajas de anteras también se pueden usar para regular la expresión de genes de avidina en una forma específica de anteras.

Los promotores nucleares preferidos se derivan del promotor esencial 5126, el promotor esencial SGB6, el promotor esencial G9 y el 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.

Un promotor esencial particularmente preferido es el promotor de núcleo 5126 el cual comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:

5

El promotor esencial SGB6 consta de aproximadamente 38 nucleótidos anteriores en la cadena al sitio de inicio transcripcional del gen SGB6. Un promotor esencial apropiado de SGB6 tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:

6

Un promotor esencial adecuado derivado del gen G9 comprende la secuencia de nucleótidos:

7

Los promotores nucleares apropiados también se proporcionan mediante fragmentos funcionales de promotores nucleares 5126, SGB6 y G9. Los procedimientos para obtener tales fragmentos funcionales se describen anteriormente.

La ventana de desarrollo de expresión del gen de la avidina se puede extender usando un elemento regulador quimérico que comprende una caja de anteras de un gen y un promotor específico de anteras de un segundo gen. Por ejemplo, las secuencias reguladoras SGB6 estimulan expresión de genes desde la fase de desarrollo de cuarteto a través de las fases de desarrollo semiuninucleadas, mientras las secuencias reguladoras de G9 estimulan la expresión génica durante la meiosis y a través del estado de desarrollo de cuarteto. Aún la combinación de una caja de anteras SGB6 y un promotor G9 estimula la transcripción de un gen extraño durante la meiosis y a través de la fase de desarrollo semiuninucleada. Así, diversas combinaciones de cajas de anteras y promotores específicos de anteras son particularmente útiles para la presente invención.

Se puede usar también un promotor esencial viral. Ejemplos de promotores nucleares virales adecuados incluyen un promotor esencial (CaMV) del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV), un promotor esencial del Virus del Mosaico de la Escrofularia, y similares. Gruber y col., supra. Preferiblemente, el promotor esencial viral es el promotor esencial 35S de CaMV, o una variante del mismo.

Con el fin de seleccionar células transformadas, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable, tal como un gel de resistencia a herbicidas. Por ejemplo, tales genes pueden conferir resistencia a fosfinotricina, glifosato, sulfonilureas, atrazina, o imidazolinona. Preferiblemente, el gen marcador seleccionable es el gen bar o el gen pat los cuales codifican fosfinotricinacetiltransferasa. Las secuencias de nucleótidos de los genes bar se pueden encontrar en Leemans y col., Solicitud de Patente Europea Nº.: 0-242-246 (1987), y en White y col., Nucleic Acids Res. 18: 1062 (1990). Wohlleben y col., Gene 70: 25 (1988), describen la secuencia de nucleótidos del gen pat. La expresión del gen bar o pat confiere resistencia a herbicidas tales como glufosinato (vendido como Basta® e Ignite®, entre otros) y bialafos (vendido como Herbi-ace® y Liberty®).

El vector de expresión puede contener secuencias de DNA que codifican avidina bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor específico de anteras, igual que el gen marcador seleccionable bajo el control de un promotor constitutivo. Alternativamente, el gen del marcador seleccionable se puede administrar a las células huéspedes en un vector de expresión de selección separada mediante cotransformación del tejido embrionario.

B. Restauración de Fertilidad Masculina en el Híbrido F1

Los procedimientos descritos anteriormente se pueden usar para producir plantas con esterilidad masculina transgénicas para la producción de híbridos de F1 en cruces dirigidos a gran escala entre líneas endogámicas. Si todas las células huéspedes de las plantas con esterilidad masculina no contienen el gen de avidina recombinante, después una proporción de híbridos F1 tendrá un fenotipo de fertilidad masculina. Por otro lado, los híbridos F1 tendrán un fenotipo de esterilidad masculina si el gen de avidina recombinante está presente en todas las células huevo de las plantas con esterilidad masculina transgénicas. Así, debía ser deseable usar un sistema de restauración de fertilidad masculina para proporcionar producción de híbridos F1 con fertilidad masculina. Un sistema de restauración de la fertilidad tal tienen valor particular en las especies autógamas cuando el producto cosechado es la semilla.

La aproximación comúnmente propuesta para restaurar la fertilidad en una línea de plantas con esterilidad masculina transgénicas requiere la producción de una segunda línea "restauradora" de plantas transgénicas. Por ejemplo, una planta transgénica que es estéril como macho debido a la expresión de barnasa se puede cruzar con una planta con fertilidad masculina que expresa el inhibidor de barnasa, como se describe anteriormente. Mariani y col., Nature 357: 384 (1992).

En el presente caso, una aproximación análoga requeriría la producción de una línea restauradora de las plantas transgénicas que expresan ribozimas dirigidas a RNAm de avidina o que expresan avidina antisentido. Por ejemplo, las ribozimas se pueden diseñar para expresar actividad endonucleasa que se dirige hacia una cierta secuencia diana en una molécula de RNAm. Por ejemplo, Steinecke y col., EMBO J. 11: 1525 (1992), logró hasta el 100% de inhibición de expresión del gen de neomicina fosfotransferasa mediante ribozimas en protoplastos de tabaco. Más recientemente, Perrizan y col., Antisense Res. & Devel. 3: 253 (1993), inhibieron actividad cloranfenicolacetiltransferasa en protoplastos de tabaco usando un vector que expresó una ribozima con estructura en cabeza de martillo modificada. En el contexto de la presente invención, el RNAm de avidina proporciona la molécula de RNA diana apropiada para las ribozimas.

En una aproximación similar, la fertilidad se puede restaurar mediante el uso de un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un RNA antisentido. La unión de las moléculas de RNA antisentido a las moléculas de RNAm diana resulta en la detención traducción por hibridación. Paterson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4370 (1987). En el contexto de la presente invención, una molécula de RNA antisentido adecuada tendría una secuencia que es complementaria al RNAm de avidina. En una realización preferida de la invención, el RNA antisentido está bajo el control de un promotor inducible. La activación de este promotor permitirá la restauración de la fertilidad masculina.

En una aproximación alternativa adicional, se pueden construir vectores de expresión en los cuales un vector de expresión codifica transcriptos de RNA capaces de promover escisión mediada por RNasa P de moléculas de RNAm de avidina. De acuerdo con esta aproximación, se puede construir una secuencia guía externa para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, al RNAm de avidina, el cual se escinde subsiguientemente mediante la ribozima celular. Altman y col., Patente de los Estados Unidos Nº.: 5.168.053; Yuan y col., Science 263: 1269 (1994). Preferiblemente, la secuencia guía externa comprende una secuencia de diez a quince nucleótidos complementaria con RNAm de avidina, y una secuencia de nucleótidos de 3'-NCCA, en la que N es preferiblemente una purina. Id. Los transcriptos de secuencia guía externa se unen a las especies de RNAm diana mediante la formación de pares de bases entre el RNAm y las secuencias guía externas complementarias, promoviendo así la escisión de RNAm mediante RNasa P y el nucleótido situado en el lado 5' de la región de pares de bases. Id.

En un procedimiento alternativo para restaurar la fertilidad masculina, las plantas transgénicas con esterilidad masculina contienen un vector de expresión que, además de un secuencia promotora unida operativamente a un gen de avidina, también contiene un elemento regulador procariótico. Se producen plantas transgénicas con fertilidad masculina que expresan un polipéptido procariótico bajo el control del promotor. En los híbridos F1, el polipéptido procariótico se une a la secuencia procariótica reguladora y reprime la expresión de avidina.

Por ejemplo, el sistema operador gen LexA/Lex A se puede usar para regular la expresión génica según la presente invención. Véase J.S. Patente Nº.: 4.833.080 ("la Patente '080") y Wang y col., Mol. Cell Biol. 13: 1805 (1993). Más específicamente, el vector de expresión de la planta con esterilidad masculina contendría la secuencia operadora LexA, mientras que el vector de expresión de la planta con fertilidad masculina contendría las secuencias codificantes del represor LexA. En el híbrido F1, el represor LexA uniría a la secuencia operadora de LexA e inhibiría la transcripción del gen de avidina.

Las moléculas de DNA del operador LexA se pueden obtener, por ejemplo, sintetizando fragmentos de DNA que contienen la secuencia del operador LexA bien conocida. Véase, por ejemplo, la Patente '080 y Garriga y col., Mol. Gen. Genet. 236: 125 (1992). El gen LexA se puede obtener sintetizando una molécula de DNA que codifica el represor LexA. Las técnicas de síntesis genética se discuten anteriormente y las secuencias génicas de LexA se describen, por ejemplo, por Garriga y col., supra. Alternativamente, las moléculas de DNA que codifican el represor LexA se pueden obtener a partir del plásmido pRB500, American Type Culture Collection número de acceso 67758.

Aquellos expertos en la técnica pueden idear otras estrategias de restauración de la fertilidad masculina usando sistemas de regulación procarióticos, tales como el sistema represor lac/operón lac o el sistema represor trp/operón trp.

Aún otro procedimiento para restaurar la fertilidad utiliza la alta afinidad de avidina por biotina, pulverizando las plantas en desarrollo con una disolución de biotina. La disolución de biotina puede comprender una mínima cantidad de un codisolvente orgánico tal como DMSO para asegurar la solubilidad completa de la biotina. Sin embargo, la disolución de biotina puede no contener ningún codisolvente orgánico. La pulverización puede comenzar tan pronto como la fase inicial de desarrollo del polen. La pulverización puede comenzar también más tarde en el desarrollo del polen. La pulverización se repite generalmente a intervalos regulares hasta que se observa la emisión del polen. Los intervalos entre pulverización variarán entre 1 y 7 días. En una realización preferida de la invención, la pulverización se repite cada 3-5 días.

6. Producción de Semillas Híbridas con Características de Grano Deseadas

Las semillas híbridas con una o más características de grano o semilla deseadas se pueden producir ventajosamente usando las líneas vegetales con esterilidad masculina como se describe anteriormente. Una línea transgénica que lleva el gen de avidina se cruza como el progenitor femenino con esterilidad masculina con una planta polinizadora con fertilidad masculina la cual lleva uno o más genes para una característica de grano o semilla deseada. La línea vegetal polinizadora con fertilidad masculina es preferiblemente homocigótica para el/los gene(s) que controlan la característica de grano o semilla deseada. Las semillas híbridas tienen característica de grano o semilla deseada producida por medio de este procedimiento y se cosechan. El procedimiento para la producción de semillas híbridas en las cuales un progenitor con esterilidad masculina se cruza con una línea polinizadora con fertilidad masculina se menciona algunas veces como el procedimiento de cruzamiento principal. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº.: 5.196.636.

Las líneas con esterilidad masculina y con fertilidad masculina cruzadas para producir las semillas híbridas de la presente invención pueden ser cualquier combinación de líneas híbridas, endogámicas o sintéticas. Una línea transgénica que lleva el gen de avidina unido operativamente a un promotor constitutivo e inducible se produce usando los procedimientos anteriormente descritos. La línea con esterilidad masculina puede llevar una o más copias del gen de avidina.

Una línea con esterilidad masculina la cual lleva el gen de avidina se puede autocruzar suprimiendo la fertilidad masculina mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos. Por ejemplo, las ribozimas se pueden diseñar para expresar actividad endonucleasa que está dirigida a una cierta secuencia diana en la molécula de RNAm de avidina. El gen que codifica la ribozima se une operativamente a un promotor inducible. La planta con esterilidad masculina se trata con el inductor, la ribozima se expresa, y el RNAm de avidina inactivado conduce a la restauración de la fertilidad masculina. Alternativamente, la fertilidad se restaura mediante el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica un RNA antisentido. La unión de moléculas de RNA antisentido para marcar moléculas de RNAm da como resultado detención mediante hibridación de traducción. Una molécula de RNA antisentido adecuada tendría una secuencia que es complementaria a RNAm de avidina. En una realización preferida de la invención, el RNA antisentido está bajo el control de un promotor inducible. La activación de este promotor permite después la restauración de la fertilidad masculina.

En una aproximación alternativa adicional, los transcriptos de RNA capaces de promover escisión mediada por RNasa P de moléculas de RNAm de avidina se producen en la línea con esterilidad masculina. De acuerdo con esta aproximación, se puede construir una secuencia guía externa para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, a RNAm de avidina, la cual se escinde subsiguientemente mediante la ribozima celular. Los transcriptos de la secuencia guía externa se unen a las especies de RNAm marcados mediante la formación de pares de bases entre el RNAm y las secuencias guía externas complementarias, promoviendo así la escisión de RNAm mediante RNasa P al nucleótido localizado en el lado 5' de la región de las bases emparejadas.

En aún otra aproximación para restaurar la fertilidad masculina, se producen líneas vegetales con esterilidad masculina transgénicas las cuales contienen un vector de expresión que, además de una secuencia promotora unida operativamente a un gen de avidina, también contiene un elemento regulador procariótico. Se producen líneas transgénicas que contienen este gen de avidina conjuntamente con un gen que codifica un gen procariótico unido operativamente a un promotor inducible. La línea vegetal transgénica se trata con inductor para producir el polipéptido procaritótico el cual se une a la secuencia reguladora procariótica, reprimiendo la expresión de avidina y restaurando la fertilidad masculina.

Aún otro procedimiento para restaurar la fertilidad utiliza la alta afinidad de avidina por biotina. Las líneas estériles masculinas trasgénicas se pulverizan con una disolución de biotina. La biotina se une a la avidina y la inactiva restaurando de este modo la fertilidad masculina. Las líneas transgénicas con esterilidad masculina se pulverizan generalmente con biotina al mismo tiempo que comienza la fase meiótica del desarrollo del polen aunque la pulverización con biotina pueda comenzar más tarde. En una realización preferida, la supresión de la esterilidad masculina se logra pulverizando la planta con biotina.

Las líneas polinizadoras con esterilidad masculina o con fertilidad masculina utilizadas para la producción de semillas híbridas con una característica deseada de grano o semilla, de acuerdo con los procedimientos de la presente invención, son líneas endogámicas, líneas híbridas, líneas polinizadas de forma abierta sintéticas o reserva genética. Las líneas endogámicas, líneas híbridas, líneas polinizadas de forma abierta sintéticas o reserva genética se producen mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos por los productores de plantas expertos. Véase, por ejemplo, J.M. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3ª edición (Van Nostrand y Reinhold, Nueva York, NY, 1987). Los cruces de prueba entre líneas seleccionadas endogámicas y/o híbridas se hacen para evaluar capacidad de combinación específica. Se identifican las combinaciones aceptables comercialmente.

Se selecciona una línea vegetal polinizadora con fertilidad masculina la cual (1) lleva uno o más genes para una característica deseada de grano o semilla y (2) es compatible con la línea con esterilidad masculina con la cual se cruzará. El/los gene(s) que controlan la característica de grano o característica de semilla seleccionada puede(n) ser dominante(s) de tal forma que la característica se expresa fácilmente en las semillas híbridas. Sin embargo, el/los gene(s) que controlan la característica de grano o característica de semilla seleccionada puede(n) ser recesivo(s). En el caso de que el/los gene(s) que controlan la característica de grano o de semilla de interés sea(n) recesivo(s), la línea con esterilidad masculina y la línea polinizadora se cultivan cada una para llevar este recesivo. En el caso de que el/los gene(s) que controla(n) la característica de interés de grano o semilla sea(n) recesivo(s), tanto el estéril como macho como el polinizador son preferiblemente homozigotos para el/los gene(s) de tal forma que el fenotipo deseado se exprese en todas las semillas producidas mediante el cruce. De acuerdo con ello, las líneas con esterilidad masculina y polinizadora con fertilidad masculina pueden cada una de ellas llevar genes los cuales controlan una característica de grano o semilla en las semillas de la progenie. El/los gene(s) para la característica de grano o semilla deseada se introducen en la línea con esterilidad masculina o la línea polinizadora con fertilidad masculina mediante procedimientos de cultivo tradicionales y/o técnicas de ingeniería genética.

La característica deseada de grano o semilla es una característica nutricional o fisiológica de la semilla la cual afecta significativamente el tipo industrial, la germinación o la resistencia a enfermedades. La característica deseada de grano o semilla incluye características tales como contenido en aceite, proteína y almidón, igual que calidad de proteínas y tipo de almidón. Los procedimientos de la invención actual se usan para producir tipos de semillas o granos especializados los cuales se usan en mercados diferentes. Se usa maíz con alto contenido en aceite, por ejemplo, para reemplazar grasas animales añadidas a la alimentación del ganado. Se usa maíz con alto contenido en amilosa para fabricar adhesivos, películas plásticas degradables y material de empaquetamiento. Se usa almidón de maíz ceroso en muchos alimentos diferentes tales como sopas y pudines.

La línea polinizadora con fertilidad masculina puede llevar uno o más genes que afectan características de almidón y proteínas. Los genes los cuales afectan a las características de almidón y proteínas incluyen, pero no se limitan a, azucarado (su), extendedor de amilosa (ae), frágil (bt), apagado (du), harinoso (fl), opaco (o), calloso (h), encogido (sh) y ceroso (wx). Véase, por ejemplo, Hannah y col., Sci. Hortic. 55: 177-197 (1993). Se han caracterizado las propiedades de almidón obtenido a partir de plantas de maíz homocigóticas recesivas para ae, du, wx, ae y aewx. Véase Brockett y col., Starch/Starke 40: 175-177 (1988) y Patente de los Estados Unidos Nº.: 5.516.939.

Alternativamente, la línea polinizadora se puede transformar con un gen que afecta al contenido en almidón. Por ejemplo, el polinizador con fertilidad masculina se puede transformar con un gen bacteriano que codifica ADP-glucosa-fosforilasa la cual se activa en la presencia de metabolitos los cuales inhiben la enzima vegetal. La semilla resultante tiene un contenido más elevado en almidón. Véase Sivak y col., J. of Environ. Polymer Degradation 3(3): 145-152 (1995).

La línea polinizadora puede llevar uno o más genes que afectan el contenido en ácidos grasos. Por ejemplo, el gen fan1 que controla ácido graso linolénico bajo en soja. Hammond y col., Crop Sci. 231: 192 (1993). El, gen fas controla el contenido de ácido graso esteárico alto en soja. Graef y col., Crop Sci. 25: 1076 (1985). Los genes fap1 y fap2 controlan el contenido de ácido palmítico bajo y el contenido de ácido palmítico alto, respectivamente, en soja. Ericson y col., Crop Sci. 18: 644 (1988).

La línea polinizadora se puede transformar con un gen el cual afecta el contenido de aceite de la semilla. Por ejemplo, la línea polinizadora puede llevar un gen que codifique proteína transportadora de estearoilo-acilo (estearoilo-ACP) desaturasa la cual cataliza la primera etapa de desaturación en la biosíntesis de aceite en semillas. El gen de la estearoilo-ACP desaturasa se puede unir operativamente a un promotor específico de semillas. Las plantas tales como girasol, maíz, colza o soja transformadas con el gen de la estearoilo-ACP desaturasa produce niveles de ácido esteárico alterados y se pueden usar para producir aceite de semillas que contiene niveles modificados o alterados de ácidos grasos saturados e insaturados. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº.: 5.443.974.

Alternativamente, la línea polinizadora puede llevar un gen antisentido el cual inhibe la expresión de un gen diana en la ruta biosintética de la característica del grano o semilla. Por ejemplo, la línea polinizadora lleva un gen antisentido que inhibe la expresión de estearoilo-ACP desaturasa. El gen antisentido se puede unir operativamente a un promotor de semilla específico. Las plantas transformadas con el gen antisentido de la estearoilo-ACP desaturasa producen niveles incrementados de estearato en semillas. Véase, por ejemplo, Knutzon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624-2628 (1992).

La razón de las semillas plantadas del progenitor con esterilidad masculina frente a las del progenitor polinizador con fertilidad masculina en el campo de producción de semillas de acuerdo con el procedimiento del Cruzamiento Principal depende de las genéticas de cada progenitor y se varía con el fin de optimizar la producción. La razón del progenitor con esterilidad masculina frente al progenitor polinizador con fertilidad masculina varía de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1. Preferiblemente, la razón del progenitor con esterilidad masculina frente al progenitor polinizador con fertilidad masculina es aproximadamente 8:1. Más preferiblemente, la razón del progenitor con esterilidad masculina frente al progenitor polinizador con fertilidad masculina es aproximadamente 9:1.

Los siguientes ejemplos no son realizaciones de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de maíz transgénico con esterilidad masculina mediante expresión constitutiva alta de avidina

Un procedimiento para la formación de plantas de maíz transgénico se ha descrito en la Solicitud de Patente Europea Nº.: 0 442 174A1. Sigue una breve descripción de esa metodología.

PHI5168, un vector que lleva el gen de avidina bajo el control del promotor de ubiquitina y contiene también una secuencia terminadora de PINII, se usó para formar plantas de maíz transgénico. La estructura de PHI5168 se muestra en la figura 1. PHI610, un vector de expresión que lleva el gen bar bajo control del promotor 35S doble, y que lleva también una secuencia terminadora de PINII, se cotransformó junto con el constructo de avidina, permitiendo la selección de plantas transgénicas mediante tratamiento de la muestra de transformación con bialofos. La estructura de PHI610 se muestra en la figura 2. Los dos vectores de expresión se transformaron en cultivos de suspensión embriogénica derivándose del cultivo embriogénico de tipo II de acuerdo al procedimiento de Green y col., Molecular Genetics of Plants and Animals, editores Downey y col., Academic Press, NY, 20, 147 (1983). Los cultivos se mantuvieron en medio de Murashige y Skoog ("MS") como se describe en Murashige y col., Physio. Plant 15: 453 (1962) suplementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 2 mg/l y sacarosa a 30 g/l. Los cultivos de suspensión se hicieron pasar a través de un tamiz de 710 micrómetros 7 días antes del experimento y el filtrado se mantuvo en medio MS.

Las células se cosecharon a partir del cultivo en suspensión mediante filtración a vacío sobre un embudo Buchner (Whatman Nº.: 614), y 100 ml (peso fresco) de células se situaron en una placa de Petri de 3,3 cm. Las células se dispersaron en 0,5 ml de medio de cultivo fresco para formar una capa fina de células. La placa de Petri no cubierta se situó en una cámara de muestras de un dispositivo de disparo de partículas elaborado por Biolistics Inc. (Geneva, NY). Se usó una bomba de vacío para reducir la presión en la cámara a 0,1 atmósferas para reducir la deceleración de las micropartículas por la fricción del aire. Las células bombardeadas con partículas de tungsteno tienen un diámetro medio de aproximadamente 1,2 micrómetros (GTE Sylvania Precision Materials Group, Towanda, Pennsylvania). Una mezcla igual de PHI5168 y PHI610 se cargó sobre las micropartículas añadiendo 5 \mul de una disolución de DNA (1 \mul de DNA por 100 lamda) en tampón TE a pH 7,7 a 25 \mul de una suspensión de 50 mg de partículas de tungsteno por ml de agua destilada en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Las partículas llegan a agregarse y asentarse en el tubo.

Se cultivaron cultivos de células vegetales transformadas que contienen los genes extraños durante 4-8 semanas en 56OR (medio) (medio basado en N6 con bialafos a 1 mg/ml). Este medio selecciona células que expresan el gen bar.

La formación de embriones se indujo entonces en los cultivos embriogénicos y las células germinaron en plantas Se usó una secuencia de dos medios de cultivo para hacer germinar los embriones somáticos observados en medio de mantenimiento de callos. Los callos se transfirieron primero a un medio de cultivo (medio de maduración) que contiene 5,0 mg/l de ácido indolacético (IAA) durante 10 a 14 días mientras continúa la proliferación en los callos. La carga de los callos fue a 50 mg por placa para optimizar la recuperación por unidad de masa de material.

Los callos se transfirieron después desde medio de "maduración" a un segundo medio de cultivo que contiene un nivel reducido de IAA (1 mg/l) comparado con el primer medio de cultivo. Los cultivos se ponen a la luz en este punto. Los embriones somáticos que germinan se caracterizaban por un brote verde que se elongaba conectando con un acceso de raíz. Los embriones somáticos se transfirieron después a un medio en un tubo de cultivo (150 x 25 mm) durante unos 10-14 días adicionales. En este momento, las plantas eran de aproximadamente 7-10 cm de altas, y eran de tamaño y vigor suficiente para acostumbrarse a condiciones de invernadero.

Para acostumbrar a plantas regeneradas, las plantas para transferirse a la cámara de crecimiento se eliminaron de los contenedores estériles y el medio agar solidificado se aclaró de las raíces. Las plántulas se situaron en una mezcla de maceta comercial en una cámara de crecimiento con un dispositivo nebulizador para mantener la humedad relativa cerca del 100% sin humedecer excesivamente las raíces de las plantas. Después de 3-4 semanas en la cámara nebulizadora las plantas fueron suficientemente robustas para transplantarse en las condiciones del
campo.

Las plantas en el campo se analizaron observando esterilidad masculina. Las plantas seleccionadas se analizaron después adicionalmente en busca de la presencia del gen de avidina mediante PCR y realización de prueba de bandas de Southern, y en busca de la expresión de avidina mediante ELISA, mediante procedimientos estándar.

Se analizaron noventa y cuatro plantas mediante PCR, 53 de las cuales se encontró que eran fértiles y 41 estériles. Cuando la fertilidad de cada planta se comparó a la presencia en el gen de avidina mediante PCR, se halló un 98% de correlación entre presencia del gen y esterilidad de la planta. Se analizaron en detalle 5 plantas en busca de la presencia del gen de avidina realizando prueba de bandas de Southern. Todas las tres plantas mostraron esterilidad. Dos plantas que no tenían el gen de avidina fueron completamente fértiles. Hubo así un 100% de correlación entre la presencia del gen de avidina y la esterilidad masculina.

Ejemplo 2 Uso de unas cepas de Agrobacterium que contienen un vector binario que incluyen una secuencia de DNA que codifica avidina para generar plantas de soja transgénicas con esterilidad masculina

Un procedimiento para formar plantas de soja transgénicas es aquel descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con Nº. de Serie: 07/920.409. Se esteriliza en superficie semilla de soja (con glicina máxima), de la variedad Pioneer 9341, mediante exposición a gas de cloro desarrollada en un bote con forma de campana de vidrio. El gas se produce añadiendo 3,5 ml de ácido clorhídrico (del 34 al 37% p/p) a 100 ml de hipoclorito de sodio (5,25% p/p). La exposición es durante 16 a 20 horas en un contenedor de aproximadamente 0,028 m^{3} (1 pie cúbico) en volumen. La semilla esterilizada en superficie se almacena en placas de Petri a temperatura ambiente. La semilla se germina plaqueando un medio solidificado de agar de 1/10 de fuerza de acuerdo a Gambourg (medio basal B5 con compuestos orgánicos mínimos, Nº. del Catálogo de Sigma Chemical G5893, sacarosa a 0,32 gm/l; ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) al 0,2% peso/volumen, (3,0 mM)) sin reguladores de crecimiento vegetal y cultivándose a 28º con una duración del día de 16 horas e iluminación fluorescente blanca fría de aproximadamente 20 \muEm^{-2} \cdot s^{-1}. Después de 3 ó 4 días, se preparó la semilla mediante cocultivo. La cubierta de la semilla se eliminó y el radical que se elonga se retiró de 3 a 4 milímetros bajo los cotiledones.

Los cultivos durante toda una noche de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens que dan cobijo a un plásmido binario modificado que contiene el gen de avidina se dejan crecer a fase logarítmica en medio A mínimo que contiene tetraciclina, a 1 \mug/ml, y se almacenan y se toma una medida de densidad óptica a 550 nm. Se sitúa suficiente volumen del cultivo en tubos de 15 ml/cónicos de centrífuga tales que tras la sedimentación se recogen entre 1 x 10^{10} y 2 x 10^{10} células en cada tubo con 10^{9} células/ml. La sedimentación es mediante centrifugación a 6.000 x g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, se decanta el sobrenadante y los tubos se mantienen a temperatura ambiente hasta que se necesita el inóculo, pero no más de 1 hora.

Las inoculaciones se llevan a cabo en tandas tales que cada placa de semillas se trata con un sedimento recientemente resuspendido de Agrobacterium. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron individualmente en 20 ml de medio de inoculación, que contiene sales B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, al 2,0% p/v; 6-bencilaminopurina (BAP), a 45 \mum; ácido indolbutírico (IBA), a 0,5 \muM; acetosiringona (AS), a 100 \muM; tamponado a pH 5,5 con 10 mM de MES. La resuspensión se logró agitando. El inóculo se vertió después en una placa de Petri que contiene semilla preparada y los nódulos de los cotiledones se maceraron con una cuchilla quirúrgica. Esto se logró dividiendo las semillas por la mitad mediante sección longitudinal a través del ápice del brote, preservando los dos cotiledones completos. Las dos mitades del ápice del brote se desprendieron después de sus respectivos cotiledones separándolos con una cuchilla quirúrgica. El nódulo de los cotiledones se maceró después con una cuchilla quirúrgica rayando una vez y otra a lo largo del eje de simetría. Se tomó cuidado para no cortar enteramente a través del explante al eje axial. Los explantes se prepararon en 5 minutos aproximadamente y después se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con bacteria pero sin agitación. Después de 30 minutos, los explantes se transfirieron a placas del mismo medio solidificado con Gelrita (Merck & Company, Inc.), al 0,2% p/v. Los explantes se incrustaron con el lado adaxial arriba y se nivelaron con la superficie del medio y se cultivaron a 22ºC durante 3 días bajo luz fluorescente blanca fría, de aproximadamente 20 \muEm^{2}s^{-1}.

Después de 3 días, los explantes se mueven a medio de contraselección líquido que contiene sales de B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, al 2% p/v; BAP, a 5 \muM; IBA, a 0,5 \muM; vancomicina, a 200 \mug/ml; cefotaxima, a 500 \mug/ml; timentina, a 30 \mug/ml, tamponado a pH 5,7 con MES, a 3 mM. Los explantes se lavaron en cada placa de Petri con agitación giratoria a temperatura ambiente durante 4 días. El medio de contraselección se cambia 4 veces.

Los explantes se cogieron entonces a medio de selección de agarosa solidificado que contiene sales de B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, al 2% p/v; BAP, a 5 \muM; IBA, a 0,5 \muM; sulfato de kanamicina, a 50 \mug/ml; vancomicina, 100 \mug/ml; cefotaxima, 30 \mug/ml; y timentina, 30 \mug/ml, tamponado a pH 5,7 con MES, 3 mM. El medio de selección se solidificó con Agarosa Seakem, al 0,3% p/v. Los explantes se incrustan en el medio, con el lado adaxial debajo y se cultivan a 28ºC con un día de 16 horas de duración en iluminación fluorescente blanca fría de 60 a 80 \muEm^{2}s^{-1}.

Después de 2 semanas los explantes se lavan de nuevo con medio líquido en el agitador giratorio. El lavado se lleva a cabo durante toda una noche en medio contraselección que contiene sulfato de kanamicina, a 50 \mug/ml. El día siguiente, los explantes se recogieron a un medio de selección de agarosa/solidificado. Se incrustan en el medio con el lado adaxial hacia abajo y se cultivan durante otro periodo de 2 semanas.

Después de 1 mes en medio de selección, el tejido transformado es visible en sectores verdes del tejido que se regenera frente a un precedente de tejido no saludable decolorado. Los explantes sin sectores verdes se descartan y los explantes con sectores verdes se transfieren a medio de elongación que contiene sales B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, al 2% p/v; IBA a 3,3 \muM; ácido giberélico, 1,7 \muM; vancomicina, 100 \mug/ml; cefotaxima, 30 \mug/ml; y timentina, 30 \mug/ml, tamponado a pH 5,7 con MES, 3 mM. El medio de elongación se solidifica con Gelrita, al 0,2% p/v. Los sectores verdes se incrustan con el lado adaxial arriba y se cultivan como antes. El cultivo se continúa en este medio con transferencias a placas frescas cada dos semanas. Cuando los brotes son de 0,5 cm de longitud se escinden en la base y se sitúan en medio de arraigado en tubos de ensayo de 13 x 100 ml. El medio de arraigado consta de sales de B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, a 15 g/l; ácido nicotínico, a 20 \muM, ácido piroglutámico (PGA), a 900 mg/l e IBA, a 10 \muM. El medio de arraigado se tampona a pH 5,7 con MES, a 3 mM y se solidificó con Gelrita al 0,2% p/v. Los sectores verdes se incrustan con el lado adaxial hacia arriba y se cultivan como anteriormente. El cultivo se continúa en este medio con transferencias a placas frescas cada dos semanas. Cuando los brotes don de 0,5 cm de longitud se escinden en la base y se sitúan en medio de arraigado en 13 tubos de ensayo de 100 ml. El medio de arraigado consta de sales de B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, a 15 g/l; ácido nicotínico, a 20 \muM, ácido piroglutámico (PGA), a 900 mg/l e IBA, a 10 \muM. El medio de arraigado se tampona a pH 5,7 con MES, a 3 mM y se solidificó con Gelrita al 0,2% p/v. Después de 10 días, los brotes se transfirieron al mismo medio sin IBA o PGA. Los brotes se arraigan y mantienen en estos tubos bajo las mismas condiciones ambientales como anteriormente.

Cuando un sistema radicular está bien establecido, la plántula se transfiere a suelo estéril. La temperatura, el fotoperiodo y la intensidad lumínica siguen siendo los mismos que anteriormente.

La expresión de avidina en plantas de soja transgénicas se confirma y cuantifica mediante ELISA, y la presencia del gen se confirma mediante PCR y prueba de manchas de Southern. La estabilidad de la expresión se puede evaluar mediante estos mismos procedimientos durante generaciones sucesivas. Se encuentra que los problemas de esterilidad correlacionan con la expresión de avidina en las sojas.

Ejemplo 3 Preparación de plantas de girasol con esterilidad masculina mediante expresión de avidina

Un cartucho de expresión que codifica avidina se usó para generar plantas y semillas de girasol transgénicas. La secuencia de DNA que codifica para avidina se insertó dentro de un cartucho de expresión bajo el control del promotor de ubiquitina. Este cartucho de expresión se subclonó después dentro de un vector binario tal como PHI 5765 usando el sitio EcoR1. El vector binario se transfirió después dentro de una cepa ayudante de Agrobacterium tumefaciens.

Las plantas de girasol se transformaron con la cepa LBA4404 de Agrobacterium después del bombardeo con micropartículas como se describe por Bidney y col., Plant. Mol. Biol. 18: 301 (1992). Brevemente, las semillas de la Línea SMF-3 de Girasol Pioneer se descascarillan y se esterilizan en su superficie. Las semillas se imbuyen en papel de filtro humedecido con agua en la oscuridad a 26ºC durante 18 horas. Los cotiledones y el radical de la raíz se eliminan y los explantes meristemáticos se cultivan en medio 374BGA (sales MS, vitaminas Shepard, sulfato de adenina a 40 mg/l, sacarosa al 3%, fitagar al 1,8% a pH 5,6 más 0,5 mg/ml de BAP, IAA a 0,25 mg/l, y GA a 0,1 mg/l). Veinticuatro horas más tarde, las hojas primarias se eliminan para exponer el meristemo apical y los explantes se sitúan con el domo apical orientado hacia arriba en un círculo de 2 cm en el centro de una placa de Petri de 60 mm por 20 mm que contiene agar con agua. Los explantes se bombardean dos veces con partículas de tungsteno suspendidas en tampón TE o con partículas asociadas con un plásmido de expresión que contiene el gen de avidina. Los explantes meristemáticos se co-cultivan en medio 374BGA a la luz a 26ºC durante 72 horas adicionales de co-cultivo.

Los meristemos tratados con Agrobacterium se transfieren después del periodo de co-cultivo de 72 horas a medio 374 (374BGA con sacarosa al 1% y nada de BAP, IAA o GA_{3}) y se suplementan con cefalotaxima a 250 \mug/ml. Las plántulas se dejan desarrollar durante dos semanas adicionales bajo condiciones de incubación de 16 horas de día y 26ºC para tomar color verde o decolorarse. Las plántulas se transfieren a medio que contiene kanamicina y se dejan crecer. Se confirma y cuantifica la presencia de avidina en las plantas como se describe en el ejemplo 2. Se encuentra que la presencia de esterilidad masculina correlaciona con la expresión de avidina por las plantas.

Claims (18)

1. Una molécula de DNA aislada que comprende un promotor específico de anteras unido operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica estreptavidina.

2. Un vector de expresión que comprende la molécula de DNA aislada de la reivindicación 1.

3. Una planta transgénica en la que dicha planta comprende dicho vector de expresión de la reivindicación 2.

4. Una planta transgénica de la reivindicación 3, en la que dicha planta se selecciona del grupo que consta de maíz, soja y girasol.

5. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia señal está operativamente unida a dicha secuencia nucleotídica que codifica estreptavidina.

6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en el que dicha secuencia señal es la secuencia señal de la alfa-amilasa de cebada.

7. Un procedimiento para producir una planta masculina estéril, que comprende introducir dentro de las células vegetales un vector de expresión que comprende un promotor operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina y regenera una planta transgénica a partir de dichas células transformadas, en el que dicho promotor controla la expresión de dicho gen, y donde la expresión de dicho gen causa la esterilidad masculina de dicha planta transgénica.

8. Un procedimiento que usa un gen de estreptavidina para producir una planta transgénica híbrida con fertilidad masculina, que comprende las etapas de:

(a) producir una primera planta progenitora con esterilidad masculina progenitora que comprende una molécula de DNA que comprende un promotor operativamente unido a una secuencia nucleotídica que codifica estreptavidina en la que la expresión de dicha estreptavidina causa esterilidad masculina;

(b) producir una segunda planta transgénica progenitora que expresa un segundo gen; y

(c) fertilizar de forma cruzada dicho primer progenitor con dicho segundo progenitor para producir una planta híbrida;

en el que dicha planta híbrida expresa dicho segundo gen extraño, y en el que el producto de dicho segundo gen extraño reduce la expresión de estreptavidina en dicha planta híbrida, produciendo de este modo una planta híbrida con fertilidad masculina.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho segundo gen extraño se selecciona del grupo que consta de un gen antisentido, un gen de ribozima y un gen de secuencia externa guía.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha molécula de DNA de dicha primera planta progenitora comprende adicionalmente un operador LexA el cual está unido operativamente a dicho promotor, y en el que dicho gen extraño es el gen represor LexA.

11. Un procedimiento para producir semillas que tienen una característica de grano deseada, que comprende las etapas de:

(a) producir una primera planta progenitora la cual es estéril como macho y comprende una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina operativamente unida a una secuencia promotora;

(b) producir una segunda planta progenitora la cual es fértil como macho y lleva uno o más genes que controlan dicha característica de grano deseada;

(c) fertilizar de forma cruzada dicho primer progenitor con dicho segundo progenitor para producir semillas híbridas con dicha característica de grano; y

(d) cosechar dichas semillas.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha planta progenitora es una planta híbrida.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha característica de grano se selecciona del grupo que consta de contenido de aceite, proteína y almidón.

\newpage

14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha primera y segunda planta se seleccionan del grupo que consta de maíz, soja, colza y girasol.

15. El procedimiento de las reivindicaciones 8 u 11, en las que dicha secuencia promotora es una secuencia promotora específica de anteras que comprende una caja de anteras seleccionada del grupo que consta de:

(a) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 1;

(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 2;

(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 3; y

(d) un fragmento funcional de (a), (b) o (c).

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 1, y en el que dicho promotor específico de anteras comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que consta de:

(a) promotor esencial 35S de CaMV;

(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4;

(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5;

(d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y

(e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d).

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 2, y en el que dicho promotor específico de anteras comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que consta de:

(a) promotor esencial 35S de CaMV;

(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4;

(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5;

(d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y

(e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d).

18. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 3, y en el que dicho promotor específico de anteras comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que consta de:

(a) promotor esencial 35S de CaMV;

(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4;

(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5;

(d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y

(e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d).