ES2315016T3

ES2315016T3 - Moleculas llamadas b7l-1.

Info

Publication number: ES2315016T3
Application number: ES99942040T
Authority: ES
Inventors: Peter Robert Baum
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: US7939640B2; IL140938A; NZ510357A; AU5550499A; CA2337712A1; US20100168399A1; US20020164686A1; IL196509A; AU771640B2; WO2000008057A3; ATE415480T1; IL140938A0; US20080075724A1; DE69939982D1; EP1108042A2; WO2000008057A2; EP1108042B1; US6512095B2; IL196509A0

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se muestra en los SEQ ID NO: 2, 4, o 6, donde el polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.

Description

Moléculas llamadas B7L-1.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido novedoso, denominado B7L-1. B7L-1 tiene una débil homología con numerosas proteínas incluyendo B7-1, (CD80) y es una proteína de unión para LDCAM. La invención incluye moléculas B7L-1, ADN que codifica las moléculas de B7L-1, procedimientos para la producción de polipéptidos B7L-1 recombinantes, y composiciones farmacéuticas que contienen tales polipéptidos B7L-1.

Antecedentes de la invención

B7-1 (CD80) es una molécula co-estimuladora de las células T que se encuentra en la superficie de las células presentadoras de antígenos (CPA). Originalmente descrita como molécula de adherencia celular, se sabe ahora que B7-1 envía importantes señales co-estimuladoras a través de sus dos receptores de la superficie de las células T, CD28 y CTLA4 (CD152). B7-1 interacciona con CD28 para señalizar la producción de citoquinas, la proliferación celular, y la generación de células T efectoras y de memoria. Si la señal a través de CD28 es bloqueada se puede producir anergia o desviación inmunitaria de las células T, dando como resultado una respuesta inmunitaria gravemente deprimida o alterada. Por ejemplo, cuando B7-1 y (B7-2) interaccionan con CD28 (y CTLA4) es bloqueado con CTLA4Ig soluble, se han observado tolerancia a aloinjertos y resistencia a enfermedades autoinmunitarias.

B7-1 también interacciona con el receptor CTLA4 de las células T. Su señalización es compleja, pero un componente proporciona una señal de retroalimentación negativa, haciendo que la célula T atenúe la señal de CD28. En ausencia de esta señal durante un período de tiempo prolongado, la proliferación de células T rampantes y la activación de las células efectoras continúan. No obstante, la intervención a un plazo más corto puede ser beneficiosa conduciendo a una respuesta inmunitaria más vigorosa. Por ejemplo, cuando la interacción de B7-1 (y B7-2) es bloqueada con anticuerpos para CTLA4 se ha observado un aumento del rechazo de tumores. Cuando esta regulación por retroalimentación funciona mal, se pueden producir enfermedades autoinmunitarias y linfoproliferación (refs). Por ejemplo, cuando la interacción de CTLA4 y B7-1 es bloqueada con CTLA4Ig soluble, se ha observado tolerancia a los aloinjertos y resistencia a las enfermedades autoinmunitarias.

Además de B7-1, se sabe que otras moléculas envían señales co-estimuladoras a las células T. Por ejemplo, B7-2 (CD86), que es expresado en diferentes células y en diferentes fases de la activación de las CPA a partir de la de B7-1, también libera su señal co-estimuladora para las células T a través de CD28 y CTLA4. La señal de B7-2 puede conducir respuestas inmunitarias que son idénticas (refs), o diferentes (refs) de las respuestas inmunitarias resultantes de la señalización de B7-1. La naturaleza de la señalización de B7-2 depende del contexto celular y del programa de co-estimulación.

Cierta evidencia sugiere que se unen moléculas adicionales a CTLA4 (ref). También existe evidencia de que otras moléculas están implicadas en el envío de señales co-estimuladoras importantes independientes de CD28 a las células T (ref).

Incluso aunque se unan a los mismos receptores celulares, B7-1 y B7-2 sólo están débilmente relacionados a nivel de aminoácidos. Ambos, sin embargo, son miembros de la superfamilia que contiene dominios de inmunoglobulina ampliados y mucha de su homología de secuencia compartida se debe a restos concretos compartidos por sus dominios de Ig comunes, que son característicos de la subfamilia con dominios de Ig.

Claramente, la señalización co-estimuladora por medio de receptores de la superficie de las células T juega un importante papel en el mantenimiento del equilibrio en el sistema inmunitario. Los sistemas con un predominio de señales activadoras, tales como la señalización co-estimuladora entre CD28 y B7-1, pueden conducir a autoinmunidad e inflamación. Los sistemas inmunitarios con un predominio de señales inhibidoras, tales como la señalización co-estimuladora entre CTLA4 y son menos capaces de sensibilizar células infectadas o células cancerosas. El aislamiento de nuevas moléculas implicadas en la señalización co-estimuladora es muy deseable para estudiar la señal o las señales biológicas transducidas por medio del receptor. Adicionalmente, la identificación de tales moléculas proporciona un método de regulación y tratamiento de enfermedades asociadas con la autoinmunidad, la inflamación y la infección. Por ejemplo, se puede utilizar el acoplamiento de una molécula que estimula la señalización inhibidora o negativa con un anticuerpo o compañero de señalización agonista para regular a la baja la función celular en enfermedades en las cuales el sistema inmunitario es demasiado activo y se encuentra presente inflamación o inmunopatología excesivas. Por otra parte, utilizando un anticuerpo antagonista específico para una molécula que estimula la señalización negativa, o utilizando una forma soluble de la molécula para bloquear la señalización, se puede activar la función inmunitaria específica en enfermedades asociadas con una supresión de la función inmunitaria. Por el contrario, se puede utilizar el acoplamiento de una molécula que estimula la señalización positiva con un anticuerpo agonista para regular al alza el efecto de la señalización de esa molécula.

A la vista de la evidencia de que existen moléculas co-estimuladoras de las células T indefinidas y adicionalmente a la vista de la continua investigación de nuevos agentes terapéuticos para tratar la infección, las enfermedades autoinmunitarias, y la inflamación, sería deseable identificar moléculas co-estimuladoras de las células T adicionales. En particular existe la necesidad de moléculas adicionales que alteren la co-estimulación de las células T durante una respuesta inmunitaria in vivo.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona polipéptidos B7L1 de mamífero en forma de proteínas aisladas u homogéneas. La presente invención incluye adicionalmente ADN aislados que codifican B7L1 y vectores de expresión que comprenden ADN que codifica B7L1 de mamífero. Dentro del alcance de esta invención se encuentran las células anfitrionas que han sido transfectadas o transformadas con vectores de expresión que comprenden un ADN que codifica B7L1, y los procedimientos para producir B7L1 cultivando tales células anfitrionas en condiciones que conducen a la expresión de B7L1. Adicionalmente se encuentran dentro de la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden formas solubles de las moléculas de B7L-1.

Descripción detallada de la invención

En la presente memoria se proporcionan proteínas novedosas, denominadas B7L-1, y el ADN que codifica las proteínas B7L-1. Los polipéptidos B7L-1 de la presente invención comparten una débil homología con B7-1 y son proteínas de unión para LDCAM, un polipéptido novedoso, descrito en la solicitud copendiente S/N 60/095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998. La secuencia de nucleótidos de LDCAM humana y murina se describe en el SEQ ID NO: 19 y el SEQ ID NO: 21, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos codificadas por el SEQ ID NO: 19 y el SEQ ID NO: 21 se muestran en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22, respectivamente. Las proteínas B7L-1 de mamífero existen en diferentes formas de empalme, denominadas formas extracelular larga y extracelular corta.

En el Ejemplo 1 se describe la identificación y EL aislamiento de un clon humano completo, denominado en la presente memoria B7L-1 extracelular largo. La secuencia de nucleótidos del ADN de B7L-1 extracelular largo humano, aislada como se describe en el Ejemplo 1, se presenta en el SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos codificada de ese modo se presenta en el SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de B7L-1 humano extracelular largo codificado (SEQ ID NO:2) tiene un dominio extracelular pronosticado de 364 aminoácidos (1-364) incluyendo una secuencia líder de 20 aminoácidos (1-20); un dominio transmembrana de 21 aminoácidos (365-385) y un dominio citoplásmico de 47 (386-432).

En el Ejemplo 3 se describe el aislamiento de un ADN de B7L-1 murino con una región extracelular más corta. Este ADN se describe en el SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3 se describe en el SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de B7L-1 murino extracelular corta codificada (SEQ ID NO:4) tiene un dominio extracelular pronosticado de 330 aminoácidos (1-330), incluyendo una secuencia líder de 20 aminoácidos (1-20); un dominio transmembrana de 21 aminoácidos (331-351); y un dominio citoplásmico de 47 aminoácidos (352-398). La secuencia líder del SEQ ID NO: 4 incluye los 8 primeros aminoácidos de la molécula larga de B7L-1 humana aislada.

En el Ejemplo 3 también se describe una forma "extracelular corta" de ADN de B7L-1 humana que se piensa que es una variante de B7L-1 empalmada alternativamente. La secuencia de nucleótidos para la forma "extracelular corta" se describe en el SEQ ID NO:5 y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del SEQ ID NO:5 se describe en el SEQ ID NO: 6. La secuencia de aminoácidos de B7L-1 humana extracelular corta codificada (SEQ ID NO:6) tiene un dominio extracelular pronosticado de 330 aminoácidos incluyendo una secuencia líder de 20 aminoácidos; un dominio transmembrana de 21 aminoácidos 331-351; y un dominio citoplásmico de 47 aminoácidos 352-398. Las secuencias descritas en los SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO: 6 se obtuvieron aislando un clon de ADNc humano con cebadores diseñados para flanquear el empalme alternativo potencial entre las formas "larga" y "corta" y comparando después un fragmento clonado resultante del SEQ ID NO:5 (nucleótidos 193-358), la forma extracelular corta murina descrita en el SEQ ID NO: 3 y el SEQ ID NO: 4 y la forma extracelular larga humana descrita en el SEQ ID NO:1 y el SEQ ID NO: 2. La comparación confirmó la existencia de una forma extracelular corta humana y proporcionó una base para las secuencias de los SEQ ID NOS: 5 y 6.

Las moléculas de B7L-1 de mamífero purificadas descritas en la presente memoria son proteínas transmembrana de Tipo I que tienen una homología limitada con B7-1, receptores de poliovirus, y proteína de activación y desarrollo de timocitos. Para estas y otras muchas proteínas débilmente homólogas, la homología reside en sus dominios Ig. Como se describe más abajo, las proteínas B7L-1 se expresan en tejido cerebral, células dendríticas, subgrupos de células dendríticas y células B activadas por el ligando CD40.

El descubrimiento de las secuencias de ADN descritas en los SEQ ID NO: 1, 3 y 5 permite la construcción de vectores de expresión que comprenden ADN que codifican proteínas B7L-1 humanas y de ratón; de células anfitrionas transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; de B7L-1 biológicamente activa en forma de proteínas homogéneas; y de anticuerpos inmunorreactivos con B7L-1.

Puesto que B7L-1 se encuentra en células dendríticas derivadas de médula ósea y derivadas de monocitos de la sangre periférica, estas moléculas se pueden utilizar para regular la inflamación en un entorno terapéutico. Los resultados de los estudios de unión descritos en el Ejemplo 13 muestran la unión de B7L-1 en líneas de células tumorales. De este modo, la señalización biológica mediada por B7L1 podría mediar los efectos anti-tumorales funcionales en estos tipos de tumores.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "B7L-1" hace referencia a un género de polipéptidos que son proteínas de unión para LDCAM, polipéptidos novedosos descritos en la solicitud copendiente S/N 60/095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998, y estructuras complejas encontradas en una variedad de líneas celulares incluyendo, pero no limitadas a, células epiteliales de pulmón, células linfoblastoides B y células B. El término B7L-1 abarca polipéptidos que tienen la secuencia de los aminoácidos 1-432 del SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos 1-398 del SEQ ID NO: 4; y los aminoácidos 1-398 del SEQ ID NO: 6. Además, B7L-1 abarca los polipéptidos que tienen un alto grado de similitud o un alto grado de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, y la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6, y cuyos polipéptidos son biológicamente activos y se unen con su contraestructura, LDCAM.

El término "B7L-1 murino" hace referencia a productos génicos biológicamente activos del ADN del SEQ ID NO: 3 y el término "B7L-1 humano" hace referencia a productos génicos biológicamente activos del ADN de los SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5. Además están abarcadas en el término "B7L-1" las proteínas solubles o truncadas que incluyen la porción de unión de la proteína y conservan la actividad biológica. Tales ejemplos específicos de semejantes proteínas solubles son aquellas que comprenden la secuencia de los aminoácidos 1-364 del SEQ ID NO: 2; aquellas que comprenden la secuencia de los aminoácidos 1-330 del SEQ ID NO: 4; y 1-330 del SEQ ID NO: 6. Alternativamente, tales proteínas solubles pueden excluir una secuencia líder y de este modo abarcan los aminoácidos 21-364 del SEQ ID NO: 2; los aminoácidos 21-330 del SEQ ID NO: 4; y los aminoácidos 21-330 del SEQ ID NO: 6.

El término "biológicamente activo" cuando se refiere a B7L-1, significa que B7L-1 es capaz de unirse a LDCAM, descrita en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos copendiente S/N 60/095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998. LDCAM y B7L-1 se denominan contraestructuras porque B7L-1 es una proteína de unión para LDCAM.

"Aislado" significa que B7L-1 está libre de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, en forma de producto de purificación de un cultivo de células anfitrionas recombinantes o en forma de extracto purificado.

Según se refiere en la presente memoria una "variante de B7L-1", representa un polipéptido sustancialmente homólogo al B7L-1 nativo, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de B7L-1 nativo (humano, murino o de otras especies de mamífero) debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones. (Para el estado contratante de Chipre solamente). La secuencia de aminoácidos de la variante es preferiblemente idéntica al menos en 80% a una secuencia de aminoácidos de B7L-1 nativa, muy preferiblemente idéntica al menos en 90%. El porcentaje de identidad puede ser determinado, por ejemplo, comparando la información de la secuencia utilizando el programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y asequible del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación pesada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, como describen Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada espacio y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada espacio; y (3) sin penalización para los espacios finales. Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservativamente, que significa que un resto aminoácido dado es remplazado por un resto que tiene características fisioquímicas similares. Los ejemplos de las sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala entre sí, o sustituciones de un resto polar por otro, por ejemplo entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Son bien conocidas otras de tales sustituciones conservativas, por ejemplo, las sustituciones de regiones completas que tienen características de hidrofobicidad similares. Las variantes o alelos de B7L-1 de origen natural también están incluidas en la invención. Los ejemplos de tales variantes son proteínas que resultan de eventos de empalme de ARNm alternativos o de la escisión proteolítica de la proteína B7L-1, donde se conserva la propiedad de unión de B7L-1. El empalme alternativo del ARNm puede producir una proteína B7L-1 truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble de origen natural de la proteína, por ejemplo. Las variantes atribuibles a la proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N y C tras la expresión en diferentes tipos de células anfitrionas, debido a la separación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína B7L-1 (generalmente de 1-5 aminoácidos terminales).

Como se ha mencionado antes, el Ejemplo 1 describe la identificación y aislamiento de la región codificante completa del ADN de B7L-1 extracelular largo humano. Este proceso implicó la búsqueda en un banco de datos de secuencias de nucleótidos utilizando una secuencia de nucleótidos B7-1 humana como secuencia problema. Se identificaron dos archivos de etiquetas de secuencia expresada (EST), números de acceso GenBank T08949 EST06841 y T32071 EST 43348, que tenían homología con una porción de B7-1 humana. El registro de GenBank no describe una región codificante para los polipéptidos codificados por estas EST.

En el Ejemplo 5 se describe la construcción de una proteína de fusión B7L-1/Fc humana novedosa que puede ser utilizada en el escrutinio de líneas celulares para la unión a B7L-1 y en el estudio de las características de B7L-1. Otras regiones Fc de anticuerpos pueden ser sustituidas por la región Fc de IgG1 humana descrita en el Ejemplo. Otras regiones Fc adecuadas, son aquellas que se pueden unir con elevada afinidad a una proteína A o una proteína G, e incluyen fragmentos de la región Fc de IgG1 humana o murina, p. ej., fragmentos que comprenden al menos la región bisagra de manera que se forman enlaces disulfuro intercatenarios. Además, la región Fc puede ser alterada o mutada a una forma que tenga características de unión al receptor de Fc inferiores. La proteína de fusión B7L-1/Fc ofrece la ventaja de ser fácilmente purificada. Otra ventaja es la formación de enlaces disulfuro entre las regiones Fc de dos cadenas de proteínas de fusión separadas, creando de este modo dímeros.

Como se ha descrito supra, un aspecto de la invención son los polipéptidos B7L-1 solubles. Los polipéptidos B7L-1 solubles comprenden todo o parte del dominio extracelular de una B7L-1 nativa pero carecen de la señal que ocasionaría la retención del polipéptido sobre la membrana de una célula. Los polipéptidos B7L-1 solubles comprenden ventajosamente el péptido señal nativo (o uno heterólogo) cuando se sintetizan inicialmente para promover la secreción, pero el péptido señal es escindido tras la secreción de B7L-1 desde la célula. Los polipéptidos B7L-1 solubles abarcados por la invención conservan al menos una característica funcional y en una realización son capaces de unirse a una contraestructura descrita en la solicitud copendiente S/N 60/095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998. En efecto, el B7L-1 soluble también puede incluir parte de la señal o parte del dominio citoplásmico u otras secuencias, siempre que se pueda secretar la proteína B7L-1 soluble.

La B7L-1 soluble puede ser identificada (y distinguida de sus contrapartes unidas a membrana no solubles) separando las células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, p. ej., mediante centrifugación, y analizando el medio o el sobrenadante en cuanto a la presencia de la proteína deseada. La presencia de B7L-1 en el medio indica que la proteína fue secretada de las células y de este modo es una forma soluble de la proteína deseada.

Las formas solubles de B7L-1 poseen muchas ventajas sobre la proteína B7L-1 unida nativa. La purificación de las proteínas de las células anfitrionas recombinantes es factible, puesto que las proteínas solubles son secretadas desde las células. Adicionalmente, las proteínas solubles son generalmente más adecuadas para la administración intravenosa.

Los ejemplos de los polipéptidos B7L-1 solubles incluyen aquellos que comprenden una porción sustancial del dominio extracelular de una proteína B7L-1 nativa. Un ejemplo de una proteína B7L-1 soluble comprende los aminoácidos 1-364 del SEQ ID NO: 2 y los aminoácidos 1-330 del SEQ ID NO: 4, y 1-330 del SEQ ID NO: 6. Además, las proteínas B7L-1 solubles truncadas que comprenden menos del dominio extracelular completo están incluidas en la invención. Cuando se expresa inicialmente en una célula anfitriona, la B7L-1 soluble puede comprender adicionalmente uno de los péptidos señal heterólogos descritos más abajo que es funcional en las células anfitrionas empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender el péptido señal nativo. En una realización de la invención, la B7L-1 soluble puede ser expresada como una proteína de fusión que comprende (desde el extremo N al C) el péptido señal del factor \alpha de levadura, un péptido FLAG® descrito más abajo y en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.011.912, y la B7L-1 soluble que consiste en los aminoácidos 21-364 del SEQ ID NO: 2 o 21-330 del SEQ ID NO: 4, o 21-330 del SEQ ID NO: 6. Esta proteína de fusión recombinante es expresada y secretada de las células de levadura. El péptido FLAG® facilita la purificación de la proteína, y puede ser escindido con posterioridad de la B7L-1 soluble utilizando enteroquinasa de mucosa bovina. Las secuencias de ADN aisladas que codifican las proteínas B7L-1 solubles están incluidas en la invención.

La B7L-1 truncada, incluyendo los polipéptidos solubles, se pueden preparar mediante cualquiera de las numerosas técnicas convencionales. Se puede sintetizar químicamente una secuencia de ADN deseada utilizando mecanismos conocidos per se. También se pueden producir fragmentos de ADN mediante digestión con enzimas de restricción de una secuencia de ADN clonada completa, y aislarlos mediante electroforesis sobre geles de agarosa. Se pueden emplear conectores que contienen uno o varios sitios de escisión para endonucleasas de restricción para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o se puede digerir el fragmento en los sitios de escisión naturalmente presentes allí. También se puede emplear el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa bien conocido para amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento de proteína deseado. Como alternativa adicional, se pueden emplear técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de terminación en un punto deseado, p. ej., inmediatamente aguas abajo del codón para el último aminoácido del dominio de unión al receptor.

Como se ha establecido antes, la invención proporciona polipéptidos B7L-1 aislados u homogéneos, tanto recombinantes como no recombinantes. Se pueden obtener variantes y derivados de proteínas B7L-1 nativas que conservan la actividad biológica deseada (p. ej., la capacidad para unirse a LDCAM) por medio de mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos B7L-1 nativos. Se pueden lograr alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa mediante cualquiera de los numerosos métodos convencionales. Se pueden introducir mutaciones en loci concretos sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución, o deleción deseada.

Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis de sitio específico dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado donde los codones predeterminados pueden ser alterados por sustitución, deleción o inserción. Los métodos ilustrativos de elaboración de las alteraciones mostradas antes son descritas por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); y Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.518.584 y 4.737.462.

Se puede modificar B7L-1 para crear derivados de B7L-1 formando productos conjugados covalentes o agregativos con otros radicales químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Se pueden preparar derivados covalentes de B7L-1 conectando los radicales químicos con grupos funcionales de las cadenas laterales de los aminoácidos de B7L-1 o en el extremo N o en el extremo C de un polipéptido B7L-1 o en el dominio extracelular del mismo. Otros derivados de B7L-1 dentro del alcance de esta invención incluyen productos conjugados covalentes o agregativos de B7L-1 o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo mediante síntesis en cultivo recombinante en forma de fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el producto conjugado puede comprender una secuencia polipeptídica señal o líder (p. ej., el líder del factor \alpha de Saccharomyces) en el extremo N de un polipéptido B7L-1. El péptido señal o líder dirige co-traduccionalmente o post-traduccionalmente la transferencia del producto conjugado desde su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o la pared celular.

Las fusiones del polipéptido B7L-1 pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de B7L-1. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.011.912 y Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204,1988.

La invención incluye adicionalmente polipéptidos B7L-1 con o sin glicosilación de patrón nativo asociado. La B7L-1 expresada en sistemas de expresión de levadura o de mamífero (p. ej., células COS-7) puede ser similar o significativamente diferente del polipéptido B7L-1 nativo en el peso molecular y el patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos B7L-1 en sistemas de expresión bacteriana, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas.

Los constructos de ADN equivalente que codifican adiciones o sustituciones de restos aminoácido o secuencias, o deleciones de restos terminales o internos o secuencias no necesarios para la actividad biológica o la unión están incluidos en la invención. Por ejemplo, se pueden modificar los sitios de N-glicosilación del dominio extracelular de B7L-1 para imposibilitar la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido en sistemas de expresión de mamífero y levadura. Los sitios de N-glicosilación en los polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, donde X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las proteínas B7L-1 murina y B7L-1 humana comprenden dos de tales tripletes. En la B7L-1 extracelular larga humana, los sitios de glicosilación se encuentran en los aminoácidos 25-27 y en los aminoácidos 324-326. En la B7L-1 extracelular corta murina y extracelular corta humana mostradas en el SEQ ID NO: 6, los sitios de glicosilación se encuentran en los aminoácidos 25-27 y en los aminoácidos 290-292. Las sustituciones, adiciones o deleciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes darán como resultado la prevención del anclaje de restos carbohidratados a la cadena lateral de Asn. La alteración de un solo nucleótido, elegido de manera que la Asn sea remplazada por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para inactivar los sitios de N- glicosilación en las proteínas incluyen aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos 5.071.972 y EP 276.846.

En otro ejemplo, se pueden alterar secuencias que codifican restos Cys que no son esenciales para la actividad biológica para hacer que los restos Cys sean suprimidos o remplazados por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. Otros equivalentes se preparan mediante modificación de restos aminoácido dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en sistemas de levadura en los cuales se encuentra presente la actividad proteasa KEX2. En la publicación EP 212.914 se describe el uso de la mutagénesis específica del sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 son inactivados suprimiendo, añadiendo o sustituyendo restos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar la aparición de estos restos alcalinos adyacentes. Los emparejamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles de escisión con KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un enfoque conservativo y preferido para inactivar los sitios KEX2. La B7L-1 humana y la B7L-1 murina contienen un sitio de procesamiento de la proteasa KEX2 en los aminoácidos 109-110 y 200-201 del SEQ ID NO: 2 y los aminoácidos 75-76 y 166-167 del SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.

Las secuencias de ácido nucleico dentro del alcance de la invención incluyen secuencias de ADN y ARN aisladas que hibridan con las secuencias de nucleótidos de B7L-1 descritas en la presente memoria en condiciones de restricción moderada o severa, y que codifican la B7L-1 biológicamente activa. Las condiciones de restricción moderada, según definen Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1, págs. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), incluyen el uso de una solución de prelavado de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de aproximadamente 55ºC, 5 X SSC, durante la noche. Las condiciones de restricción severa incluyen temperaturas de hibridación y lavado más elevadas. El experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración salina de la solución de lavado pueden ser ajustadas según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la molécula de ácido nucleico.

Debido a la conocida degeneración del código genético en la que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de aquella mostrada en el SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5 y todavía codificar una proteína B7L-1 que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. Tales secuencias de ADN variantes pueden ser el resultado de mutaciones silenciosas (p. ej., que se producen durante la amplificación mediante PCR), o pueden ser el producto de una mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

La invención proporciona secuencias de ADN aisladas equivalentes que codifican la B7L-1 biológicamente activa, seleccionada entre: (a) ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos presentada en el SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO:5; (b) ADN capaz de hibridar con un ADN de (a) en condiciones moderadamente restrictivas y que codifica B7L-1 biológicamente activa; y, (c) ADN que es degenerado como resultado del código genético a un ADN definido en (a), o (b) y que codifica la B7L-1 biológicamente activa. Las proteínas B7L-1 codificadas por semejantes secuencias equivalentes de ADN están incluidas en la invención.

Los ADN que son equivalentes a la secuencia de ADN del SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO:5 hibridarán en condiciones moderadamente y severamente restrictivas con secuencias de ADN que codifican polipéptidos que comprenden los SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o fragmentos y variantes de los SEQ ID NO: 2, 4, y 6. Los ejemplos de las proteínas B7L-1 codificadas por semejante ADN incluyen, pero no están limitados a, fragmentos de B7L-1 (solubles o unidos a membrana) y proteínas B7L-1 que comprenden uno o varios sitios de N-glicosilación inactivados, uno o varios sitios de procesamiento de proteasa KEX2 inactivados, o una o varias sustituciones de aminoácidos conservativas, como se ha descrito antes. Las proteínas B7L-1 codificadas por ADN derivado de otras especies de mamíferos, donde el ADN hibridará con el ADNc del SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 5 también están incluidas en la presente invención.

Las variantes que poseen la capacidad para unirse a contraestructuras de B7L-1, o compañeros de unión, p. ej., LDCAM pueden ser identificadas mediante cualquier análisis adecuado. La actividad biológica de B7L-1 puede ser determinada, por ejemplo, mediante competición por la unión al ligando que se une al dominio de LDCAM (esto es análisis de unión competitiva).

Un tipo de análisis de unión competiva para un polipéptido B7L-1 utiliza una B7L-1 soluble, radiomarcada, y células intactas que expresan una contraestructura de B7L-1, o células que expresan LDCAM. En lugar de células intactas, se podrían sustituir las proteínas de fusión de la contraestructura de B7L-1 soluble con Fc (tales como una proteína de fusión LDCAM/Fc) unidas a una fase sólida por medio de la interacción de una Proteína A, Proteína G o un anticuerpo para la contraestructura o porciones de Fc de la molécula, por la región Fc de la proteína de fusión. Otro tipo de análisis de unión competitiva utiliza proteínas de unión a B7L-1 solubles radiomarcadas y células intactas que expresan B7L-1.

Los análisis de unión competitiva se pueden realizar siguiendo la metodología convencional. Por ejemplo, se puede utilizar B7L-1 radiomarcado para competir con un supuesto homólogo de B7L-1 para analizar la actividad de unión frente a una proteína de unión a B7L-1 unida a la superficie o una contraestructura de unión, p. ej., LDCAM. Se pueden obtener resultados cualitativos mediante análisis de unión competitiva en placa autorradiográfica, o se pueden utilizar gráficos Scatchard para generar resultados cuantitativos.

Las proteínas de unión para una contraestructura de B7L-1, tales como la propia B7L-1 y anticuerpos anti-ligando de B7L-1, se pueden unir a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para identificar, separar o purificar células que expresan la proteína de unión a B7L-1 en su superficie. La unión de una proteína de unión a la contraestructura de B7L-1 a una fase sólida en contacto con la superficie se puede completar utilizando numerosas técnicas diferentes. Por ejemplo, se puede construir una proteína de fusión B7L-1/Fc y después anclarla a la fase sólida por medio de la interacción de la Proteína A o la Proteína G. Se conocen en la técnica otros diversos métodos para fijar proteínas a una fase sólida y son arrogantes adecuados para su uso en la presente invención. Por ejemplo, se pueden recubrir microesferas magnéticas con B7L-1 y mantenerlas en el recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de las mezclas celulares que contienen células que expresan una contraestructura de B7L-1 se ponen en contacto con la fase sólida que tiene los polipéptidos B7L-1 en ella. Las células que tienen la contraestructura de B7L-1 en su superficie se unen a los B7L-1 fijados y las células no unidas se lavan. Este método de unión por afinidad es útil para purificar, escrutar o separar tales células que expresan la contraestructura de B7L-1 de la solución. En particular, este método es útil para separar las células que expresan LDCAM de las células que no expresan una proteína de unión a B7L-1 o una contraestructura de B7L-1.

Los métodos de liberación de las células positivamente seleccionadas de la fase sólida son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células y están dirigidas preferiblemente a escindir la pareja de unión de la superficie celular. En el caso de las interacciones LDCAM-B7L-1, la enzima escindiría preferiblemente LDCAM liberando la suspensión celular resultante del material B7L-1 "foráneo".

Alternativamente, se pueden incubar primero las mezclas de células que se sospecha que contienen células LDCAM+ con B7L-1 biotinilada. Los períodos de incubación tienen típicamente al menos una hora de duración para asegurar una unión a B7L-1 suficiente. La mezcla resultante se hace pasar después a través de una columna cargada con cuentas recubiertas de avidina, con lo que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de la célula a las cuentas. El uso de cuentas recubiertas con avidina es conocido en la técnica. Véase Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de las células unidas se realizan utilizando métodos convencionales.

Como se ha descrito antes, se puede utilizar B7L-1 para separar las células que expresan una proteína a la cual se une. En un método alternativo, se puede conjugar B7L-1 o un dominio extracelular o un fragmento de la misma con un radical detectable tal como I^{125} para detectar las células que expresan una proteína de unión a B7L-1. El radiomarcaje con I^{125} se puede realizar mediante cualquiera de los numerosos métodos convencionales que producen una molécula de B7L-1-I^{125} funcional marcada a una actividad específica elevada. O se podría utilizar un anticuerpo yodado o biotinilado frente a una región de B7L-1 o la región Fc de la molécula. Se puede utilizar otro radical detectable tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorimétrica, biotina o avidina. Por ejemplo, las células que se van a someter a ensayo en cuanto a la expresión de LDCAM se pueden poner en contacto con B7L-1 marcada. Tras la incubación, la B7L-1 marcada no unida se separa y se mide la unión utilizando el radical detectable.

Las características de la unión de B7L-1, los fragmentos de B7L-1 y las variantes de B7L-1 también se pueden determinar utilizando la proteína de unión a B7L-1 marcada (por ejemplo, LDCAM:Fc-I^{125}) en análisis de competición similares a los descritos antes. En este caso, no obstante, las células intactas que expresan LDCAM unidas a un sustrato sólido, se utilizan para medir el grado en el que una muestra que contiene una supuesta variante de B7L-1 compite por la unión con una proteína de unión a B7L-1.

Otros métodos para analizar la B7L-1 incluyen el uso de anticuerpos anti-B7L-1, líneas celulares que proliferan en respuesta a B7L-1, o líneas celulares recombinantes que expresan LDCAM y proliferan en presencia de B7L-1.

Las proteínas B7L-1 descritas en la presente memoria también pueden ser empleadas para medir la actividad biológica de las proteínas LDCAM en términos de su afinidad por B7L-1. Como ejemplo, se puede utilizar B7L-1 para determinar si la actividad biológica es conservada tras la modificación de una LDCAM (p. ej., modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La actividad biológica de una proteína LDCAM se puede averiguar de este modo antes de que sea utilizada en un estudio de investigación, o posiblemente en estudios clínicos, por ejemplo.

Las proteínas B7L-1 encuentran uso como reactivos que pueden ser empleados por aquellos que realizan estudios de "garantía de calidad", p. ej., para controlar la vida media en el estante y la estabilidad de las proteínas a las cuales se une B7L-1 en diferentes condiciones. Para ilustrar, se puede emplear B7L-1 en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de su proteína de unión que ha sido almacenada a diferentes temperaturas, o producida en tipos celulares diferentes. La afinidad de unión de la proteína modificada para B7L-1 se compara con la de una proteína no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones sobre la actividad biológica de la proteína de unión a B7L-1.

Los polipéptidos B7L-1 también encuentran uso como portadores para liberar agentes anclados a ellos en células que portan su contraestructura, LDCAM u otro receptor de la superficie celular al cual se une B7L-1. Por ejemplo, se pueden conjugar formas solubles de B7L-1 con agentes tales como toxinas, inhibidores, o antígenos y el agente conjugado resultante se puede liberar en las células que portan la contraestructura de B7L-1 (LDCAM). Tales células incluyen células dendríticas linfoides que son productoras conocidas de IL-12 durante una respuesta inmunitaria y pueden inhibir la producción de citoquinas por las células T. De este modo, estas células son una diana para la inducción de tolerancia a antígenos y se pueden utilizar productos conjugados con B7L-1 para bloquear, potenciar o modificar la actividad de las células dendríticas linfoides.

Los agentes diagnósticos y terapéuticos que se pueden anclar a un polipéptido B7L-1 incluyen, pero no están limitados a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorimétrica, y similares, seleccionándose el agente concreto de acuerdo con la aplicación pretendida. Los ejemplos de los fármacos incluyen aquellos utilizados en el tratamiento de diversas formas de cáncer, p. ej., mostazas nitrogenadas tales como mostazas nitrogenadas con L-fenilalanina o ciclofosfamida, agentes intercalantes tales como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo, alcaloides de vinca tales como vincristina, y antibióticos tales como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, y derivados de los mismos. Entre las toxinas se encuentran ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadoras de ribosomas, micotoxinas tales como tricotecenos, y derivados y fragmentos (p. ej., cadenas sencillas) de los mismos. Los radionúclidos adecuados para el uso diagnóstico incluyen, pero no están limitados a, I^{123}, I^{131}, Tc^{99m}, In^{111}, y Br^{76}. Los radionúclidos adecuados para
el uso terapéutico incluyen, pero no están limitados a, I^{131}, At^{211}, Br^{77}, Re^{186}, Re^{188}, Pb^{212}, Bi^{212}, Pd^{109}, Cu^{64}, y Cu^{67}.

Tales agentes pueden ser anclados a B7L-1 mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. B7L-1, que es una proteína, comprende grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos que se pueden hacer reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la proteína o agente puede ser transformado para generar o anclar un grupo funcional reactivo deseado. La transformación puede implicar el anclaje de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales asequibles para anclar diversas moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen numerosas técnicas de radiomarcaje de proteínas. Se pueden anclar metales radionúclidos a B7L-1 utilizando un agente quelante bifuncional adecuado, por ejemplo.

De este modo se preparan los productos conjugados que comprenden B7L-1 y un agente diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente unidos covalentemente). Los productos conjugados se administran o se emplean de otro modo en una cantidad apropiada para la aplicación concreta.

Otro uso de la B7L-1 de la presente invención es como herramienta de investigación para estudiar el papel que puede jugar B7L-1, junto con LDCAM, en la señalización y proliferación de las células T. Los polipéptidos B7L-1 de la presente invención también pueden ser empleados en análisis in vitro para la detección de LDCAM o B7L-1 o las interacciones de los mismos.

Como se ha comentado antes, cuando se analizaron varios tejidos en busca de ARNm para B7L-1, se detectaron transcritos en células dendríticas derivadas de CD34+ derivadas de médula ósea humana y células dendríticas derivadas de sangre periférica, células B tras la estimulación con CD40L, células dendríticas de cerebro y esplénicas de ratón, células B esplénicas y de cerebro estimuladas con CD40L. Debido al patrón de expresión restringido de B7L-1, se pueden utilizar anticuerpos para B7L-1 para identificar, aislar, y purificar células presentadoras de antígenos potentes, incluyendo células dendríticas y células B activadas con el ligando CD40. Adicionalmente, se puede explotar la presencia y el nivel de ARNm para B7L-1 para determinar la pureza de preparaciones de células dendríticas derivadas de médula ósea y derivadas de sangre. Otros usos de anticuerpos para las moléculas de B7L-1 incluyen el redireccionamiento de antígenos a células dendríticas mieloides o la eliminación de células dendríticas mieloides mediante agotamiento mediado por anticuerpos anti-B7L-1 o con un producto conjugado de una toxina y el anticuerpo.

Se pueden utilizar fragmentos solubles de B7L-1, incluyendo, pero no restringidos a los dominios extracelulares de los SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 6 para intensificar o inhibir la actividad de las células dendríticas linfoides y/o las células B activadas para la presentación por CD40-L.

Una realización de la presente invención está dirigida a un método de tratamiento de trastornos mediados por la interacción de B7L-1 y un compañero de unión e implica administrar B7L-1 a un mamífero que tiene el trastorno. Los polipéptidos B7L-1 de la invención pueden ser formulados de acuerdo con los métodos conocidos utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Se puede combinar B7L-1 en una mezcla, o bien en forma de una única sustancia activa o con otras sustancias activas conocidas, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (p. ej., Timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, coadyuvantes y/o portadores. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Co. Además, tales composiciones pueden contener B7L-1 formando complejo con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporado a compuestos poliméricos tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc., o incorporado a liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos fantasma o esferoblastos. Tales composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo, y la tasa de aclaramiento in vivo de B7L-1. También se puede conjugar B7L-1 con anticuerpos contra receptores específicos de tejidos, ligandos o antígenos, o acoplar a ligandos de receptores específicos de tejidos. Para las células tumorales en las que se encuentra LDCAM, se puede conjugar B7L-1 con una toxina por medio de lo cual se utiliza B7L-1 para liberar la toxina en el sitio celular específico.

Se puede administrar B7L-1 tópicamente, parenteralmente, o mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas, intramusculares, intracisternales, o técnicas de infusión. Estas composiciones contendrán típicamente una cantidad eficaz de B7L-1, sola o combinada con una cantidad eficaz de cualquier otra sustancia activa. Tales dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones pueden variar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso pretendido, el peso corporal del paciente y la edad, y la ruta de administración. Las dosis preliminares pueden ser determinadas de acuerdo con animales de ensayo, y se puede realizar el aumento a escala de las dosificaciones para la administración a seres humanos de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica.

Los polipéptidos B7L-1 pueden existir en forma de oligómeros, tales como dímeros o trímeros unidos covalentemente o unidos no covalentemente. Los oligómeros pueden estar unidos por enlaces disulfuro formados entre restos cisteína de diferentes polipéptidos B7L-1. En una realización de la invención, se crea un dímero de B7L-1 fusionando B7L-1 a la región Fc de un anticuerpo (p. ej., IgG1) de manera que no interfiera en la unión de B7L-1 al dominio de unión al ligando de B7L-1. El polipéptido Fc se fusiona preferiblemente con el extremo C de una B7L-1 soluble (que comprende solamente la unión al receptor). La preparación general de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, p. ej., por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) y Bym et al. (Nature 344:677, 1990), incorporadas aquí como referencia. Se inserta una fusión génica que codifica la proteína de fusión B7L-1:Fc en un vector de expresión apropiado. Se deja que las proteínas de fusión B7L-1:Fc ensamblen moléculas de anticuerpo muy similares, después de lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los polipéptidos Fc, produciendo B7L-1 divalente. Si las proteínas de fusión se forman con las cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero B7L-1 hasta con cuatro regiones extracelulares de B7L-1. Alternativamente, se pueden unir dos dominios de B7L-1 solubles con un conector peptídico.

Las células anfitrionas adecuadas para la expresión de B7L-1 incluyen procariotas, levaduras o células eucarióticas superiores. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con anfitriones celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, o de mamífero los describen, por ejemplo, Pouwels et al. en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). También se podrían emplear sistemas de traducción sin células para producir polipéptidos B7L-1 utilizando ARN derivados de constructos de ADN descritos en la presente memoria.

Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células anfitrionas procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula anfitriona procariótica, tal como E. coli, un polipéptido B7L-1 puede incluir un resto metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula anfitriona procariótica. La Met N-terminal puede ser escindida del polipéptido B7L-1 recombinante expresado.

Los polipéptidos B7L-1 pueden ser expresados en células anfitrionas de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (p. ej., S. cerevisiae). También se pueden emplear otros géneros de levadura, tales como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Los vectores de levadura a menudo contendrán una secuencia de un origen de replicación de un plásmido de levadura de 2 \mu, una secuencia autónomamente replicante (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para la metalotioneína, la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la purivato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y la glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras los describen adicionalmente Hitzeman, EPA-73, 657 o Fleer et. al., Gene, 107: 285-195 (1991); y van den Berg et. al., Bio/Technology, 8: 135-139 (1990). Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Se pueden construir vectores lanzadera replicables tanto en levadura como en E. coli insertando secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos antes.

Se puede emplear la secuencia líder del factor \alpha de levadura para dirigir la secreción del polipéptido B7L-1. La secuencia líder del factor \alpha se inserta a menudo entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. Véase, p. ej., Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; Patente de los Estados Unidos 4.546.082; y publicación EP 324.274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes a partir de anfitriones de levadura son conocidas por los expertos en la técnica. Una secuencia líder se puede modificar cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.

Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por los expertos en la técnica. Uno de tales protocolos es descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, donde el medio selectivo consiste en bases nitrogenadas de levadura al 0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células anfitrionas de levadura transformadas por vectores que contienen la secuencia promotora ADH2 se pueden hacer crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es aquel que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa al 1% con un suplemento de 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La des-represión del promotor ADH2 se produce cuando se agota la glucosa del medio.

También se podrían emplear sistemas de cultivo de células anfitrionas de mamífero o de insecto para expresar polipéptidos B7L-1 recombinantes. Los sistemas de Baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto son revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). Asimismo se pueden emplear líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de las líneas celulares anfitrionas de mamífero adecuadas incluyen la línea de células de riñón de mono COS-7 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), las células L, las células C127, las células 3T3 (ATCC CCL 163), las células de ovario de hámster Chino (CHO), las células HeLa, y las líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular derivada de CV-1/EBNA-1 derivada de la línea celular de riñón de mono verde Africano CVI (ATCC CCL 70) como describen McMahan et al. (EMBO J. 10:2821,1991).

Las secuencias de control transcripcional y traduccional para vectores de expresión en células anfitrionas de mamífero pueden ser separadas por corte de genomas virales. Las secuencias promotoras y las secuencias intensificadoras comúnmente utilizadas derivan de virus Polioma, Adenovirus 2, Virus de Simios 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen, promotor temprano y tardío, intensificador, empalme, y sitios de poliadenilación de SV40 se pueden utilizar para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia del gen estructural en una célula anfitriona de mamífero. Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral en forma de un fragmento que también puede contener un origen de replicación viral (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). También se pueden utilizar fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el sitio del origen de replicación viral de SV40.

Los vectores de expresión ilustrativos para su uso en células anfitrionas de mamífero se pueden construir como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Se puede construir un sistema útil para la expresión de elevado nivel estable de ADNc de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 sustancialmente como describen Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de expresión elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984 ha sido depositado como ATCC 39890. Se describen vectores de expresión en mamífero útiles adicionales en la publicación EP-A-0367566, y en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie 07/701.415, presentada el 16 de Mayo de 1991. Los vectores pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa, y además de una metionina iniciadora, se puede añadir una secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para la IL-7 descrita en la Patente de los Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de IL-2 descrita por Cosman et al., Nature 312:768 (1984); el péptido señal de IL-4 descrito en la publicación EP 367.566; el péptido señal del receptor de IL-1 de tipo 1 descrito en la Patente de los Estados Unidos 4.968.607; y el péptido señal del receptor de IL-1 de tipo II descrito en la publicación EP 460.846.

La B7L-1 como proteína purificada u homogénea, aislada de acuerdo con la invención puede ser producida mediante sistemas de expresión recombinante como se ha descrito antes o purificada de células de origen natural. La B7L-1 puede ser purificada hasta una homogeneidad sustancial, como indica una única banda de proteína tras el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE).

Un procedimiento para producir B7L-1 comprende cultivar una célula anfitriona transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica B7L-1 en condiciones suficientes para promover la expresión de B7L-1. La B7L-1 es recuperada después del medio de cultivo o de extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como es sabido por el experto en la técnica, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células anfitrionas empleadas y si la proteína recombinante es secretada o no al medio de cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede ser concentrado primero utilizando un filtro de concentración de proteína disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentración, el producto concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) empleando medio de RP-HPLC hidrófobo, (p. ej., gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes) para purificar adicionalmente la B7L-1. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, son bien conocidas y se pueden emplear para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea. Es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión a B7L-1 de una proteína a la cual se une B7L-1, tal como LDCAM, para purificar por afinidad los polipéptidos B7L-1 expresados. Los polipéptidos B7L-1 pueden ser separados de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, p. ej., en un tampón de elución con alto contenido de sal y después sometidos a diálisis en un tampón con un bajo contenido de sal para su uso o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un anticuerpo que se une a B7L-1. En el Ejemplo 5 se describe un procedimiento para emplear la B7L-1 de la invención para generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra B7L-1.

La proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano puede ser aislada mediante desorganización inicial de las células anfitrionas, centrifugación, extracción de sedimentos celulares si es un polipéptido insoluble, o del sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación por adición de sal, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaños. Finalmente, se puede emplear la RP-HPLC para las etapas de purificación finales. Las células microbianas pueden ser desorganizadas mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, desorganización mecánica, o utilización de agentes de lisis celular.

Las células anfitrionas de levadura transformadas son empleadas preferiblemente para expresar B7L-1 en forma de un polipéptido secretado con el fin de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de células anfitrionas de levadura puede ser purificado mediante métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. describen dos etapas de HPLC en fase reversa sucesivas para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Los fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de B7L-1 incluyen oligonucleótidos antisentido o efectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra sencilla (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse para buscar secuencias de ARNm de B7L-1 (efector) o ADN de B7L-1 (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o efectores, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante del ADNc de B7L-1. Semejante fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o efector, basándose en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada la describen, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o efectores a secuencias de ácido nucleico diana da como resultado la formación de dúplex que bloquean la transcripción o la traducción de la secuencia diana mediante uno de los diversos métodos, incluyendo el aumento de degradación de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o la traducción, o mediante otros métodos. Los oligonucleótidos antisentido se pueden utilizar de este modo para bloquear la expresión de proteínas B7L-1. Los oligonucleótidos antisentido o efectores comprenden adicionalmente oligonucleótidos que tienen esqueletos de azúcar-fosfodiéster modificados (u otros enlaces azúcar, tales como los descritos en la publicación W091/06629) y donde tales enlaces azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estables in vivo (esto es, capaces de resistir la degradación enzimática) pero conservan una especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos efectores o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a radicales orgánicos, tales como los descritos en la publicación WO 90/10448, y otros radicales que aumentan la afinidad del oligonucleótido hacia una secuencia de ácido nucleico diana, tal como poli-(L-lisina). Más aún, se pueden anclar agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos a oligonucleótidos efectores o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o efector hacia la secuencia de nucleótidos diana.

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Se pueden introducir oligonucleótidos antisentido o efectores en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante cualquier método de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, la transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, la electroporación, o utilizando vectores de transferencia génica tales como el virus Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o efectores son introducidos preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante inserción del oligonucleótido antisentido o efector en un vector retroviral adecuado, poniendo en contacto después la célula con el retrovirus vector que contiene la secuencia insertada, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de doble copia denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la Solicitud PCT US 90/02656).

También se pueden introducir oligonucleótidos efectores o antisentido en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un producto conjugado con una molécula de unión al ligando, como se describe en la publicación WO 91/04753. Las moléculas de unión al ligando adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no interfiere sustancialmente en la capacidad de la molécula de unión al ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido efector o antisentido o su versión conjugada en la célula.

Alternativamente, se puede introducir un oligonucleótido efector o antisentido en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en la publicación WO 90/10448. El complejo oligonucleótido efector o antisentido-lípido es disociado preferiblemente dentro de la célula por medio de una lipasa endógena.

Además de lo anterior, se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar realizaciones concretas y no para limitar el alcance de la invención.

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Ejemplo 1 Identificación de la Forma Extracelular Larga de B7L-1 humana

Se utilizó el ADN que codifica la B7L-1 humana, una molécula co-estimuladora de las células T y una proteína SMARTLIST, en un análisis de secuencia BLAST para identificar las EST que tenían homología con B7-1. Este análisis BLAST dio como resultado la identificación de dos EST de GENBANK Núm. de Archivo T08949 (EST06841) y Núm. de Archivo T32071 (EST 43348), TIGR (?) que tenía una homología baja pero significativa con una porción de la molécula B7-1.

Las dos secuencias EST de GENBANK se utilizaron para diseñar cebadores de PCR para sondear genotecas de ADNc con el fin de identificar una fuente de ADNc para las EST. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes:

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5' AGGGCGAGTACACCTG 3' (SEQ ID NO: 7) (bases efectoras 22-37 de EST T32071)

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5' GTGGATCTGTCAGCTCC 3' (SEQ ID NO: 8) (bases anti-sentido 376-360 de EST T32071)

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Los cebadores oligonucleotídicos identificados en los SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 se utilizaron para escrutar genotecas de ADNc mediante PCR. De las 16 genotecas de ADNc examinadas, el producto de la PCR se obtuvo solamente de una genoteca lambda de cerebro humano (adquirida de Clonetech HL3002b). El producto se clonó en bacterias y se secuenció para verificar que el producto incluía un marco de lectura abierto.

La secuencia EST clonada se marcó radiactivamente y se utilizó para sondear la genoteca lambda de cerebro empleando técnicas de sondeo normalizadas, con el fin de aislar los clones de la genoteca lambda de cerebro que incluían la secuencia derivada de EST. Un clon, denominado 32071-2, ampliaba la secuencia de EST en el extremo 5' en 140 bases. El posterior análisis BLAST de la base de datos de EST de GENBANK utilizando la secuencia EST ampliada como secuencia problema condujo a la identificación de una EST solapante (H15268) derivada del clon núm. 44904 de IMAGE Consortium.

Se obtuvo el clon de IMAGE Consortium (Research Genetics, 07002) y se secuenció completamente para revelar un marco de lectura abierto y una nueva secuencia de ADNc humano completo que codificaba B7L-1. El SEQ ID NO: 1 proporciona el ADNc completo de la B7L-1 humana y el SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc. La proteína completa codificada tiene una región extracelular pronosticada de 364 aminoácidos (1-364), incluyendo una secuencia líder de 20 aminoácidos (1-20); un dominio transmembrana de 21 aminoácidos (365-385) y un dominio citoplásmico de 47 aminoácidos (386-432).

Ejemplo 2 Expresión de B7L-1 Extracelular Larga Humana

Para preparar un constructo vector para expresar la B7L-1 extracelular larga humana, se obtuvo la región codificante completa del SEQ ID NO: 1 a partir del clon núm. 49904. Primero, se separó por corte el inserto de B7L-1 del clon utilizando los sitios HindIII y Not l del clon. Después se utilizaron los oligonucleótidos identificados en los SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 como adaptadores para cambiar el extremo cohesivo HindIII a un extremo cohesivo SalI recociendo y ligando los oligonucleótidos al inserto separado por corte que contenía los restos nucleotídicos 1-1820 del SEQ ID NO: 1. El constructo resultante se ligó en el vector de expresión pDC409 que había sido cortado con SalI y NotI.

El constructo vector de expresión fue transfectado después en células CV1/EBNA y B7L-1 fue expresada utilizando las técnicas descritas por McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991.

Después de que las células fueron sometidas a choque e incubadas durante varios días, las células sobrenadantes que contenían cualquier forma soluble de la proteína se recogieron y se recuperó la proteína B7L-1 utilizando técnicas de HPLC. Para recuperar las formas de B7L-1 que están unidas a la membrana, se cosecharon las células transfectadas, se fijaron en paraformaldehído al 1%, se lavaron y se utilizaron en su forma intacta.

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Ejemplo 3 Aislamiento de B7L-1 Extracelular Corta Murina y Humana

Para identificar una fuente de ADNc de B7L-1 murina, se utilizó la información de la secuencia obtenida a partir de B7L-1 humana identificada en el Ejemplo 1 anterior para diseñar cebadores de la PCR, uno de los cuales es el oligonucleótido del SEQ ID NO: 12; el segundo de los cuales se describe en el SEQ ID NO: 13. Estos cebadores de PCR se utilizaron para identificar genotecas de ADNc que proporcionan productos de PCR cuando se utilizan como moldes en reacciones de PCR. El producto de la PCR se identificó en reacciones de PCR utilizando una genoteca de ADNc lambda de cerebro de ratón (Clonetech ML3000a).

La genoteca de ADNc lambda de cerebro de ratón se escrutó y se identificó un clon y se secuenció utilizando técnicas convencionales. El clon secuenciado carecía del extremo 5' de la región codificante como se determinó comparando el clon con la B7L-1 humana. La RT-PCR off de ARN de cerebro de ratón utilizando el oligonucleótido de entrada del vector gt10 lambda y el oligonucleótido específico de B7L-1 humana del SEQ ID NO: 7 amplió la secuencia desde el extremo 3' hasta el extremo de la secuencia y 5' hasta casi la longitud completa. El clon codifica un marco de lectura abierto que comienza en una posición análoga al resto aminoácido 9 de la B7L-1 humana (SEQ ID NO: 2) y termina en una posición que es análoga al aminoácido terminal de la B7L-1 humana. El ADNc de la B7L-1 murina clonada que tiene un líder compuesto murino/humano es proporcionado en el SEQ ID NO: 3 y su polipéptido codificado es proporcionado en el SEQ ID NO: 4. La secuencia líder compuesta murina/humana incluye 7 aminoácidos de la secuencia humana y 12 aminoácidos de la secuencia murina. El clon de B7L-1 murino es idéntico en 95% a la B7L-1 humana del SEQ ID NO: 1 como se determina mediante el programa GCG GAP. El clon murino tiene un único espacio y representa una variante de empalme más corta de B7L-1.

Para investigar la existencia de una variante de empalme más corta humana de B7L-1, se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos descritos en el SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 en reacciones de RT-PCR para sondear el ARN de cerebro humano. Utilizando metodologías de análisis en gel de agarosa con bromuro de etidio y Transferencia Southern convencionales, se demostró que existía y predominaba una forma de empalme más corta. El producto de la reacción de RT-PCR se clonó y se sometió a análisis de la secuencia con un terminador didesoxinucleotídico convencional. El SEQ ID NO: 5 proporciona la secuencia de nucleótidos de la forma extracelular larga humana de la B7L-1 y el SEQ ID NO: 6 proporciona la secuencia de aminoácidos codificada.

Los resultados de este trabajo indican que existen al menos 2 formas de empalme diferentes de B7L-1 y la forma predominante es la forma corta que fue identificada primero mientras se clonaba el homólogo de la B7L-1 murina.

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Ejemplo 4 Expresión del Polipéptido B7L-1 de la Forma Extracelular Corta Murina

A continuación se describen métodos para expresar un fragmento soluble y la forma extracelular corta murina unida a la membrana de B7L-1.

Para preparar un constructo vector para expresar la forma extracelular corta murina unida a membrana de B7L-1, se preparó la región codificante del SEQ ID NO: 3 utilizando una técnica de PCR SOEing. Los oligonucleótidos utilizados se describen en los SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. El oligonucleótido 5' más interno (SEQ ID NO: 16) incluyó las bases para codificar la Met iniciadora y 5 aminoácidos más que forman los primeros 6 restos del péptido señal de B7L-1 humana extracelular larga. El oligonucleótido 5' más externo (SEQ ID NO: 17) estuvo presente en un exceso de 9 veces con respecto al oligonucleótido 5' más interno e incluyó un sitio de restricción SalI. El oligonucleótido 3', descrito en el SEQ ID NO: 18, incluyó un sitio de restricción NotI.

El producto de la PCR SOEing se sometió a digestión con enzimas de restricción con SalI y NotI y después se ligó en un vector de expresión pDC412. El vector de expresión fue transfectado después en E. coli DH10B mediante electroporación.

La B7L-1 se expresó utilizando técnicas descritas por McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991. Para recuperar las formas de B7L-1 que están unidas a la membrana, se cosecharon las células transfectadas, se fijaron en paraformaldehído al 1%, se lavaron y se utilizaron en su forma intacta.

Para preparar un constructo vector para expresar un polipéptido B7L-1 extracelular corto murino soluble, se preparó la región codificante extracelular del SEQ ID NO: 3 utilizando una técnica PCR SOEing. Los oligonucleótidos utilizados fueron idénticos a los utilizados para preparar el constructo vector para el polipéptido unido a la membrana completo murino excepto que el oligonucleótido del SEQ ID NO: 12 fue el oligonucleótido 3', sustituyendo de este modo el SEQ ID NO: 18.

El producto de la PCR SOEing se sometió a digestión con enzimas de restricción con los sitios SalI y BglII y después se ligó en un vector Bluescript SK. Esta fusión de clones se separó por corte con una digestión doble SalI//BglII y se ligó en un vector de expresión pDC412 digerido con SalI/BglII. El vector de expresión se transfectó después en E. coli DH10B por electroporación y el polipéptido B7L-1 murino se expresó como se ha descrito antes para la proteína B7L-1 murina completa.

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Ejemplo 5 Preparación de la Proteína de Fusión B7L-1/Fc

A continuación se describe la generación de la proteína B7L-1/Fc humana que se utilizó para estudiar las características de unión de B7L-1. La proteína de fusión incluye la región extracelular pronosticada de la B7L-1 humana y la región Fc humana de la muteína.

Para aislar los nucleótidos que codifican el dominio extracelular del SEQ ID NO: 2 (nucleótidos 108-1249 del SEQ ID NO: 1), se utilizaron los oligonucleótidos que flanquean la región extracelular de B7L-1 (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12) como cebadores en una reacción de PCR para obtener un producto de PCR del clon núm. 44904 que fue el molde en la reacción. El producto de la PCR resultante fue digerido con las enzimas de restricción SalI y BglII en los sitios SalI y BglII incorporados por los cebadores. El fragmento resultante se ligó en un vector de expresión (pDC409) que contenía la región Fc de la IgG1 humana mutada para disminuir la unión al receptor Fc.

El constructo de ADN resultante se transfectó en la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA (con la transfección simultánea de psv3neo). Después de 7 días de cultivo en medio que contenía suero bovino con bajo contenido de inmunoglobulina al 0,5%, se añadió al sobrenadante una solución de azida al 0,2% y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. Después se hizo pasar aproximadamente 1 L de sobrenadante de cultivo a través de un sistema de purificación de proteína mediante HPLC BioCad Protein A utilizando una columna de Proteína A de 4,6 x 100 mm (POROS 20A de PerSeptive Biosystems) a 10 mL/min. La columna de Proteína A se une a la Porción Fc de la proteína de fusión del sobrenadante, inmovilizando la proteína de fusión y permitiendo que otros componentes del sobrenadante pasen a través de la columna. La columna se lavó con 30 mL de solución de PBS y la proteína de fusión unida se hizo eluir de la columna de HPLC con ácido cítrico ajustado a pH 3,0. La proteína de fusión purificada eluida se neutralizó a medida que eluía utilizando solución HEPES 1M a pH 7,4.

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Ejemplo 6 Preparación de Proteína de Fusión B7L-1 Extracelular Corta Murina-Fc

A continuación se describe la preparación de una proteína de fusión con Fc murina que incluía la porción extracelular soluble de la B7L-1 extracelular corta murina y el péptido Fc de la muteína descrito en el Ejemplo 5. La región codificante del dominio extracelular de la B7L-1 corta extracelular murina se separó por corte del vector descrito en el Ejemplo 4 utilizando las enzimas de restricción SalI y BglII. El fragmento separado por corte se ligó en un vector de expresión pDC412 que incluía la región IgG1Fc humana.

El constructo de ADN resultante se transfectó en la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA. Las células se cultivaron y la proteína de fusión se recogió y se purificó como se describe en el Ejemplo 5.

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Ejemplo 7 Preparación de la Proteína de Fusión B7L-1/poliHis

A continuación se describe la preparación de una proteína de fusión B7L-1/poliHis humana (B7L-1/poliHis). El procedimiento incluyó la preparación de un constructo de ADN que codifica la proteína de fusión, la transfección en una línea celular con el constructo de ADN, y la recogida de los sobrenadantes de las células transfectadas.

Los cebadores oligonucleotídicos descritos en los SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, que contenían un sitio de restricción SpeI, se utilizaron para aislar los nucleótidos que codificaban los aminoácidos 1-364 del SEQ ID NO: 2 del clon de IMAGE Consortium (H15268, clon núm. 49904). El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción SpeI y PstI, cortando la enzima PstI el producto de la PCR en un sitio dentro de la región codificante de B7L-1. El producto separado por corte se ligó en un vector basado en Bluescript digerido con SpeI/PstI que contenía un líder viral de CMV aguas arriba y en marco con el sitio SpeI. El constructo de ADNc que codificaba el líder viral y la B7L-1 fue separado por corte del vector utilizando digestiones con las enzimas de restricción SalI y PstI y el constructo separado por corte se ligó después en una ligación de tres vías con un fragmento PstI/NotI que contenía el resto del ADNc de la B7L-1 humana y un vector de expresión pDC409 (McMahon et al., EMBO J. 10:2821, 1991).

El constructo de fusión poliHis se preparó utilizando un cebador oligonucleotídico que ceba aguas arriba en el vector preparado como se ha descrito antes (?) y un cebador que incluye 1) nucleótidos complementarios a aquellos presentes en el ADNc de la B7L-1 humana que están situados justo antes del dominio transmembrana; 2) nucleótidos complementarios a los nucleótidos poliHis; y, un sitio NotI. El fragmento que contiene poliHis fue digerido con SalI y NotI y después ligado en un vector pDC409 digerido de una manera similar.

El constructo de fusión de ADN resultante se transfectó transitoriamente en la línea celular de riñón de mono COS-1 (ATCC CRL-1650). Después de un cultivo de 7 días en medio que contenía suero bovino con bajo contenido de inmunoglobulina al 0,5%, se recogieron los sobrenadantes celulares y se añadió una solución de azida de sodio al 0,2% a los sobrenadantes. Los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum, se concentraron 10 veces con un concentrador a escala prep (Millipore; Bedford, MA) y se purificaron en una purificación de proteína mediante HPLC BioCad equipada con una columna de resina auto-empaquetada Nickel NTA Superflow (Qiagen, Santa Clarita, CA). Después de que el sobrenadante pasara a través de la columna, se lavó la columna con Tampón A (NaPO_{4} 20 mM, pH 7,4; NaCl 300 mM; Imidazol 50 mM). Después se hizo eluir la proteína de la columna utilizando técnicas de elución en gradiente. Las fracciones que contenían la proteína se recogieron y se analizaron en un gel reductor de SDS-PAGE al 4-20%. Las fracciones que contenían la proteína de fusión B7L-1/poliHis soluble se reunieron, se concentraron 2 veces, y después se sometieron a diálisis en PBS. La proteína de fusión B7L-1/poliHis soluble resultante se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 \mum.

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Ejemplo 8 Escrutinio de Líneas Celulares para la Unión a B7L-1

La proteína de fusión B7L-1/Fc preparada como se describe en el Ejemplo 5 se utilizó para escrutar líneas celulares en cuanto a la unión utilizando estudios de unión cuantitativos de acuerdo con las metodologías de citometría de flujo convencionales. Para cada línea celular escrutada, el procedimiento implicó incubar aproximadamente 250.000 a 1.000.000 de las células bloqueadas con FCS (suero de ternera fetal) al 2%, suero de cabra normal al 5% y suero de conejo al 5% en PBS durante 1 hora. Después las células bloqueadas se incubaron con 5 \mug/mL de proteína de fusión en FCS al 2%, suero de cabra al 5% y suero de conejo al 5% en PBS. Después de la incubación la muestra se lavó 2 veces con tampón FACS (FCS al 2% en PBS) y después se trató con Fc/biotina antihumana de ratón (adquirida de Jackson Research) y SAPE (estreptavidina-ficoeritrina adquirida de Molecular Probes). Este tratamiento hace que la Fc/biotina antihumana se una a cualquier B7L-1/Fc unida y la SAPE se una a la Fc/biotina antihumana dando como resultado una marca de identificación fluorescente en la B7L-1/Fc que está unida a las células. Se analizaron las células en busca de cualquier proteína unida utilizando la citometría de flujo de detección fluorescente. Los resultados indicaron que la B7L-1 humana se une bien a la línea epitelial de pulmón humano (WI-26), a líneas linfoblastoides B humanas (Daudi y PAE8LBM1, a células B tonsilares recientes humanas, a células dendríticas CD8+ murinas de bazos/nódulos linfáticos de animales tratados con flt3-L y a linfoma de células T murino (S49.1).

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Ejemplo 9 Preparación de Anticuerpos Monoclonales para B7L-1

Este ejemplo ilustra un método de preparación de anticuerpos monoclonales para B7L-1. Se pueden utilizar B7L-1 purificada, un fragmento de la misma tal como el dominio extracelular, péptidos sintéticos o células que expresan la B7L-1 para generar anticuerpos monoclonales contra B7L-1 utilizando técnicas convencionales, por ejemplo aquellas técnicas descritas en la Patente de los Estados Unidos 4.411.993. Brevemente, se inmunizan roedores con B7L-1 como inmunógeno en coadyuvante completo de Freund, y se inyecta en cantidades que oscilan entre 10-100 \mug subcutáneamente o intraperitonealmente. Diez a doce días más tarde, los animales inmunizados reciben un refuerzo de B7L-1 adicional emulsionada en coadyuvante incompleto de Freund. Los animales reciben refuerzo periódicamente después de eso en un programa de inmunización semanal a bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero mediante sangría retro-orbital o extirpación de la punta de la cola para realizar un ensayo en busca de anticuerpos para B7L-1 mediante análisis de transferencia puntual, ELISA (Análisis de Inmunoabsorción con Enzima Ligada), inmunoprecipitación, u otros análisis adecuados, incluyendo el análisis FACS.

Tras la detección de un título de anticuerpo apropiado, se suministra a los animales positivos una última inyección intravenosa de B7L-1 en solución salina. Tres a cuatro días más tarde, los animales se sacrifican, se recogen células del bazo, y se fusionan las células del bazo con una línea celular de mieloma murina, p. ej., NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se cultivan en placa en múltiples placas de microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridoma se escrutan mediante ELISA en busca de reactividad contra B7L-1 purificada mediante adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971 y en la Patente de los Estados Unidos 4.703.004. Una técnica de escrutinio preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones BALB/c singeneicos para producir ascitis que contienen elevadas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti- B7L-1-L. Alternativamente, se pueden hacer crecer células de hibridoma in vitro en matraces o botellas rodadoras mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitis de ratón pueden ser purificados mediante precipitación con sulfato de amonio, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también se pueden utilizar la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a proteína A o proteína G, como se puede utilizar la cromatografía de afinidad basada en la unión a B7L-1.

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Ejemplo 10 Determinación de Tejido y Células que Expresan B7L-1 Humana y Murina

A continuación se describen los experimentos de RT-PCR y Transferencia Northern que se llevaron a cabo para identificar tipos de tejidos y células que expresan los polipéptidos B7L-1 humanos y murinos de la presente invención.

El procedimiento de RT-PCR implicó la transcripción inversa de aproximadamente 1 \mug de ARN total de diversas fuentes de tejidos y células humanos para elaborar ADNc de la primera hebra utilizando Pharmacia, First Strand cDNA Synthesis Kit siguiendo las instrucciones del fabricante. Las líneas celulares a partir de las cuales se transcribió el ARN total incluyeron células dendríticas derivadas de médula ósea humana; células CD34+ y células CD34-; células B de sangre periférica humana cultivadas en IL-4, SAC o CD40L; células dendríticas derivadas de monocitos humanos; monocitos humanos cultivados en IFN gamma; cerebro humano y de ratón; células B esplénicas de ratón cultivadas +/- CD40L; células T esplénicas de ratón +/- estimulación con ConA.

Los resultados de la RT-PCR indicaron que B7L-1 es expresada células dendríticas derivadas de CD34+ de médula ósea humana y derivadas de sangre periférica y células B de sangre periférica humana tras la estimulación con CD40L. Adicionalmente se encontró ARNm en cerebro y se encontró una débil señal de PCR en células de médula ósea CD34-. Los resultados mostraron que la B7L-1 murina es expresada en células dendríticas esplénicas murinas, células esplénicas estimuladas con CD40L, y en cerebro murino.

Se realizó el análisis de Transferencia Northern fraccionando 5 \mug o 10 \mug de ARN total sobre geles de agarosa al 1,2% que contenían formaldehído. Después se transfirió el ARN sobre membranas Hybond Nylon utilizando técnicas de transferencia convencionales. Las transferencias de tejidos múltiples Poli A+ que contenían 1 \mug de ARNm de ratón de numerosas fuentes diferentes se adquirieron de Clonetech. Las transferencias adquiridas fueron prehibridadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante al menos 6 horas a 68ºC. Se generaron ribosondas, que contenían la región codificante de la B7L-1 murina, utilizando Riboprobe Combination Kit de Promega y ARN Polimerasa de T7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron procedimientos que generaban Transferencias Northern convencionales como describe Maniatis, (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).

Los resultados del sondeo de las transferencias Northern con las ribosondas y la visualización de la película de rayos x resultante en busca de sondas que se unían positivamente demuestran que se detectaba ARN hibridante en cerebro, hígado, músculo esquelético y corazón. En el cerebro, se observaron dos tamaños de bandas. Un ARN tenía aproximadamente 4,0 kB y el otro aproximadamente 2,7 kB. En el hígado la banda predominante indicó un ARN hibridante mayoritariamente de 2,7 kB y en el músculo esquelético y el corazón solamente se observó la banda de ARN de 2,7 kB.

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Ejemplo 11 Estudios de Unión Celular

Con el fin de estudiar la unión a células NK murinas, se separaron células de bazo de ratones CB-17/SCID tratados con IL-15 y se utilizaron como fuente para células NK murinas altamente enriquecidas y activadas. Las células de bazo aisladas de los ratones SCID tratados con IL-15 son DX-5 positivas en 60-80%. DX-5 es un marcador pan-NK que es expresado en células NK de muchas cepas de ratones diferentes. El análisis citométrico de flujo se realizó para detectar la unión de B7L1 y LDCAM a células NK murinas activadas con IL-15 in vivo DX-5+. La Tabla I proporciona los resultados de un estudio de unión con células NK murinas.

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TABLA I

1

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La unión de LDCAM y B7L1 se puede detectar en células NK murinas activadas in vivo.

Los resultados de los experimentos dirigidos al estudio de la unión de B7L1 y LDCAM a células endoteliales humanas no demostraron unión en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) de diferentes donantes. Sin embargo, para las HUVEC de un donante, la B7L1 indujo niveles bajos de CD62E y CD106 en comparación con la Fc de control.

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Ejemplo 12 Aislamiento de Una Contraestructura que se Une a B7L-1

Basándose en los resultados de los experimentos de unión descritos en el Ejemplo 8, se escrutaron reservas de ADNc de una genoteca de expresión de la línea celular WI-26 en busca de la unión a la proteína de fusión B7L-1/Fc purificada preparada como se describe en el Ejemplo 5. La genoteca de expresión se preparó utilizando metodologías convencionales. Las reservas de ADNc se transfectaron en células CV1/EBNA y después se incubaron durante 2 días con 1 \mug/mL de proteína de fusión B7L-1/Fc. Tras el período de incubación con B7L-1/Fc las células se incubaron con F(AB)_{2} anti-humano marcado con I^{125}. Se obtuvieron autorradiografías y se examinaron visualmente en busca de reservas de ADNc positivo que tuviera B7L-1/Fc unida. Las reservas identificadas positivamente se subdividieron y se volvieron a escrutar. Se identificó un único clon que cuando fue transfectado en células CV1/EBNA que se unía específicamente a la proteína de fusión B7L-1/Fc.

El clon, denominado LDCAM, se describe más completamente en la solicitud de patente copendiente S/N 60/
095.672 presentada el 7 de Agosto de 1998.

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Ejemplo 13 Estudios de Unión Celular en el Sistema Inmunitario

A continuación se describen experimentos de unión celular FACS que demuestran las características de unión de B7L-1 y una proteína para la cual es un compañero de unión, LDCAM. Las células estudiadas incluyeron células T murinas, células T humanas, células B murinas, células NK murinas, células endoteliales humanas, y líneas celulares tumorales humanas.

Para estudiar la unión a las células T murinas, se cultivaron células de nódulo linfático (LN) murino BALB/c en medio de cultivo solo y en presencia de diferentes estímulos durante 18-20 horas. Las células cultivadas se cosecharon y se prepararon para estudios de unión utilizando la proteína de fusión B7L1/Fc, la proteína de fusión LDCAM/Fc y una proteína Fc de control. Después de un cultivo durante la noche las células LN murinas BALB/c son típicamente CD3+ en >90%. La proteína unida se detectó utilizando un análisis citométrico de flujo. Los resultados mostrados en la Tabla I indican la unión observada expresada como las unidades de intensidad de fluorescencia media (MFI) en células T no estimuladas (medio) y en células T estimuladas (por medio de estímulos).

TABLA I

2

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Cuando se analizaron por subgrupos de células T, el 75-80% de las células T murinas LN CD4+ presentaron una unión a LDCAM detectable después de la estimulación con anti-TCR in vitro. Aproximadamente el 50% de las células T murinas LN CD8+ presentan una unión detectable. Además, las células T CD4+ muestran niveles superiores de unión a LDCAM que las células T murinas CD8+. Los resultados demuestran que LDCAM/Fc se une a bajos niveles a las células T vírgenes. Sin embargo, después de una activación durante la noche con estímulos policlonales la unión aumento 5-20 veces dependiendo del estímulo. De los estímulos estudiados, PMA induce la mínima unión de LDCAM a las células T murinas, y anti-TCR induce la unión más elevada.

Para estudiar las células T que se unen a LDCAM y su contraestructura, B7L-1, se cultivaron células T de sangre periférica humana (PB) en medio de cultivo solo o en presencia de diferentes estímulos durante 18-20 horas. Las células cultivadas se recogieron y se prepararon para los estudios de unión utilizando la proteína de fusión B7L1/Fc, la proteína de fusión LDCAM/Fc y una proteína Fc de control. La proteína unida en las células T PB humanas se determinó mediante análisis citométrico de flujo. En la Tabla II se detallan los resultados observados, expresados como MFI, en células T no estimuladas (medio) y en células T estimuladas (por medio de estímulos).

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TABLA II

3

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Los resultados muestran que, PMA induce una unión a LDCAM mayor en células T humanas que en células T murinas. La presencia de unión específica con LDCAM tanto a células T murinas como humanas en ausencia de unión con B7L1 sugiere que LDCAM se está uniendo a B7L1, o una molécula diferente y no a sí misma. Debido a que los estudios indican que las células T expresan poca o ninguna B7L1, LDCAM puede tener otro compañero de unión.

Se realizaron estudios similares a los descritos antes para evaluar la unión de LDCAM y B7L1 a células B esplénicas murinas. No se detectó la unión de B7L1 ni de LDCAM en células B murinas no estimuladas. El cultivo de células B esplénicas murinas con muCD40L o LPS indujo niveles bajos de unión a LDCAM pero no se detectó un nivel apreciable de unión a B7L1.

Con el fin de estudiar la unión de células NK murinas, se separaron los bazos de ratones CB-17/SCID tratados con IL-15 y se utilizaron como fuente de células NK murinas altamente enriquecidas y activadas. Las células del bazo aisladas de ratones SCID tratados con IL-15 son DX-5 positivas en 60-80%. DX-5 es un marcador pan NK que es expresado en células NK de muchas cepas de ratones diferentes. Se realizó un análisis citométrico de flujo como se a descrito antes para detectar la unión de B7L1 y LDCAM a células NK murinas activadas con IL-15 in vivo DX-5+. La Tabla II proporciona los resultados de un estudio de unión en células NK murinas.

TABLA III

4

En contraste con lo observado en las células T murinas y humanas, la unión de LDCAM y B7L1 puede ser detectada en células NK murinas activadas in vivo.

Los resultados de los experimentos dirigidos al estudio de la unión de B7L1 y LDCAM a células endoteliales humanas no demostraron unión en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) de diferentes donantes. Sin embargo, para una HUVEC de un donante, B7L1 indujo niveles bajos de CD62E y CD106 en comparación con la Fc de control.

La Tabla IV detalla los resultados de los experimentos dirigidos a evaluar la unión de B7L1 y LDCAM a líneas celulares tumorales humanas. Los resultados se expresan como el porcentaje de células que se unen a LDCAM o B7L1.

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TABLA IV

5

Los resultados muestran una unión a LDCAM significativa en la línea celular de carcinoma de ovario y 2 de las líneas tumorales de células B humanas (MP-1 y Tonsil G). B7L1 también se une a estas tres líneas celulares tumorales pero a niveles mucho menores. Estos resultados demuestran que LDCAM es un marcador para ciertos tipos de linfomas de células B o diferentes tipos de carcinomas. Además, la señalización biológica mediada por LDCAM o B7L1 podría mediar los efectos anti-tumorales funcionales en estos tipos de tumores.

<110> Baum, Peter

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<120> Moléculas llamadas B7L1

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<130> 2844-WO

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<140> - - - a asignar - - -

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<141> 1999-08-05

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<150> 60/095,663

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<151> 1998-08-07

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<160> 22

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1820

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<212> ADN

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<213> Forma Larga de B7L-1 Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Secuencia codificante

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<222> 157...1452

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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6

7

8

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<210> 2

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<211> 432

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<212> Proteína

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<213> Forma Larga de B7L-1 Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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9

10

\newpage

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<210> 3

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<211> 1273

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<212> ADN

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<213> B7L-1 de Múrido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Secuencia Codificante

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<222> 13...1206

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

11

12

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 398

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<212> Proteína

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<213> B7L-1 de Múrido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

13

14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 1718

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<212> ADN

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<213> Forma Corta de B7L-1 Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia Codificante

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<222> 157...1350

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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15

16

17

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<210> 6

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<211> 398

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<212> Proteína

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<213> Forma Corta de B7L-1 Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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18

19

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<210> 7

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<211> 16

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<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

20

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<210> 8

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<211> 17

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<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 16

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<212> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

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<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Múrido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 30

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<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Múrido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

26

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<210> 14

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<211> 21

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<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

28

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<210> 16

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<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Múrido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 24

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<212> Cebador de Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Múrido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

290

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 30

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<212> Cebador de Oligonucleótido

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<213> Múrido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 1535

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> LDCAM Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Secuencia Codificante

\vskip0.400000\baselineskip

<212> 16...1341

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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31

32

33

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<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 442

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

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<213> LDCAM Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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34

35

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 1935

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<212> ADN

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<213> LDCAM de Múrido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Secuencia Codificante

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<222> 2...1272

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 22

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<211> 423

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<212> Proteína

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<213> LDCAM de Múrido

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<400> 22

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39

40

Claims

1. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se muestra en los SEQ ID NO: 2, 4, o 6, donde el polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.

2. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO: 2;

b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 4;

c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 6; y

donde X_{1} es de 1 a 21, y donde el polipéptido se une a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Un ácido nucleico aislado que comprende un miembro del grupo que consiste en:

a) los nucleótidos X_{1} a 1452 del SEQ ID NO: 1, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217;

b) los nucleótidos X_{1}' a 1206 del SEQ ID NO: 3, donde X_{1}' es el nucleótido 13 o 73;

c) los nucleótidos X_{1} a 1350 del SEQ ID NO: 5, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217;

d) cualquiera de los ácidos nucleicos de a) a c) donde el ácido nucleico es ARN; y

e) un ácido nucleico que, debido a la degeneración del código genético, codifica un polipéptido B7L-1 que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por una secuencia de a), b), c) o d).

\vskip1.000000\baselineskip

4. Un polipéptido purificado codificado por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a) el nucleótido X_{1} a 1452 del SEQ ID NO: 1, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217;

c) los nucleótidos X_{1} a 1350 del SEQ ID NO: 5, donde X_{1} es el nucleótido 157 o 217; y

5. Un polipéptido purificado que tiene una secuencia como se muestra en los SEQ ID NO: 2, 4, o 6, donde el polipéptido purificado se une al polipéptido seleccionado del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 20 y el SEQ ID NO: 22.

6. Un polipéptido purificado que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO: 2;

b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 4;

c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 6; y

\vskip1.000000\baselineskip

7. Una proteína de fusión que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO: 2;

b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 4;

c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 6; y

8. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Una célula anfitriona transformada o transfectada con el vector de expresión recombinante de la reivindicación 8.

10. Un método para preparar un polipéptido, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 9 en condiciones que promueven la expresión del polipéptido.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente la recuperación del polipéptido del cultivo.

12. Un polipéptido producido a partir del cultivo de una célula anfitriona de la reivindicación 9 en condiciones adecuadas para expresar el polipéptido, donde el polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) los aminoácidos X_{1} a 364 del SEQ ID NO: 2;

b) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 4;

c) los aminoácidos X_{1} a 330 del SEQ ID NO: 6; y

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13. Una composición que comprende un portador adecuado y un polipéptido o proteína de cualquiera de las reivindicaciones 4-7.