ES2353701T3

ES2353701T3 - Análisis de vacunas de sacáridos sin interferencia.

Info

Publication number: ES2353701T3
Application number: ES05718447T
Authority: ES
Inventors: Angela Bardotti; Daniela Proietti; Stefano Ricci
Original assignee: Novartis AG; Novartis Vaccines and Diagnostics SRL; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis AG; GSK Vaccines SRL; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2011-03-04
Anticipated expiration: 2025-03-17
Also published as: RU2371725C2; CN1981195A; EP3035056A1; CY1111272T1; EP1725872B8; EP1725872B1; EP2290366A1; DE602005024523D1; DE602005026635D1; ATE487137T1; PT1725872E; US20080286300A1; HK1098192A1; JP2011013226A; EP1725871B8; JP4692852B2; CA2560224C; SI1725872T1; RU2006136270A; CN1981195B

Abstract

Un procedimiento para analizar el contenido en sacáridos de una composición, (a) la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis ; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) el procedimiento comprende una etapa de analizar el contenido en ácido siálico de la composición, y (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, una etapa de analizar el contenido en galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, una etapa de analizar el contenido en glucosa de la composición; (c) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido en sacárido del serogrupo W135 en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (d) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido en sacárido del serogrupo Y en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); y (e) el contenido en sacáridos del serogrupo C en la composición se determina comparando los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); o (iii) si la composición incluye tanto un sacárido del serogrupo W135 como un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa de la etapa (b).

Description

CAMPO TÉCNICO

La presente invención pertenece al campo del análisis y control de calidad de vacunas que incluyen sacáridos capsulares bacterianos, y en particular aquellas en las que los sacáridos están conjugados a un vehículo.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Los inmunogenes que comprenden antígenos de sacáridos capsulares conjugados a proteínas vehículo son bien conocidos en la técnica. La conjugación convierte antígenos T independientes en antígenos T dependientes, potenciando de ese modo respuestas de memoria y permitiendo el desarrollo de inmunidad protectora, y la vacuna del conjugado prototipo era para Haemophilus influenzae tipo b (Hib) [por ejemplo, véase capítulo 14 de ref. 1]. Desde la vacuna de Hib, se han desarrollado vacunas de sacáridos conjugados para proteger frente a Neisseria meningitidis (meningococcus) y frente a Streptococcus pneumoniae (pneumococcus). Otros organismos en los que las vacunas de conjugados son de interés son Streptococcus agalactiae (streptococcus grupo B) [2], Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphylococcus aureus [4].

Las vacunas conjugadas para el serogrupo C de N. meningitidis se han aprobado para uso humano, e incluyen Menjugate™ [5], Meningitec™ y NeisVac–C™. Se han reseñado las mezclas de conjugados de cada uno de los serogrupos A, C, W135 e Y [por ejemplo referencias 6 – 9], incluyendo el producto Menactra™. Otras mezclas de antígenos conjugados incluyen: (i) mezclas de meningococos A/C [10, 11]; (ii) el producto PrevNar™ [12] que contiene siete conjugados de pneumococos; (iii) conjugados de meningococos e Hib mezclados [13, 14]; y (iv) conjugados de meningococos, pneumococos e Hib combinados [15].

Los temas cuando se tratan con vacunas conjugadas incluyen estabilidad y consistencia por lotes. En las vacunas de Hib, por ejemplo, se ha reseñado la despolimerización catalítica del sacárido [16], y los conjugados de la cápsula de meningococos del serogrupo A se hidrolizan rápidamente [17]. La inestabilidad de los conjugados conduce de forma no deseada a una reducción en la dosis efectiva del conjugado inmunogénico sobre el tiempo, variación entre lotes, y aumenta los niveles de productos de descomposición no caracterizados. Las referencias 18 y 19 estudian temas que se refieren al análisis de la estabilidad de vacunas conjugadas de Hib.

El análisis cuantitativo de glucoconjugados implica típicamente una primera etapa de hidrólisis de sacáridos, estando basado entonces el análisis en los monosacáridos liberados.

Aunque este análisis es relativamente sencillo para conjugados individuales (por ejemplo, se han usado procedimientos cromatográficos de intercambio de aniones para analizar conjugados hidrolizados de Hib [20] y serogrupo A de meningococos [21]), la situación es más compleja en vacunas de combinación, en particular cuando los diferentes sacáridos comparten unidades de monosacáridos. Por ejemplo, los sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y de meningococos contienen todos ácido siálico, por lo que cualquier procedimiento basado en la medición de ácido siálico liberado no será capaz de distinguir los tres serogrupos.

Es un objeto de la invención proporcionar mejoras en la evaluación cuantitativa de sacáridos en vacunas conjugadas para evaluar la estabilidad e integridad. En particular, es un objeto proporcionar procedimientos que se puedan usar para medir conjugados individuales dentro de vacunas conjugadas de meningococos combinados, y de ese modo proporcionar mejoras en el control de calidad y consistencia de la vacuna.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención está basada en procedimientos que permiten el análisis de sacáridos de meningococo mezclados a partir de múltiples serogrupos aun cuando los sacáridos comparten unidades de monosacáridos. De ese modo, la invención proporciona un procedimiento para analizar el contenido en sacáridos de una composición en la que:

(a): la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis ; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis;

(b): el procedimiento comprende una etapa de analizar el contenido en ácido siálico de la composición, y (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, una etapa de analizar el contenido en galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, una etapa de analizar el contenido en glucosa de la composición;

(c): si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido en sacárido del serogrupo W135 en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b);

(d): si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido en sacárido del serogrupo Y en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b);

(e): el contenido en sacáridos del serogrupo C en la composición se determina comparando los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no

un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); o (iii) si la composición incluye tanto un sacárido del serogrupo W135 como un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa de la etapa (b).

Con una combinación de sacáridos de los serogrupos C, W135 e Y, por lo tanto, la invención analiza el contenido en ácido siálico, glucosa y galactosa. Los resultados de glucosa y galactosa se usan para cuantificar directamente los sacáridos de los serogrupos Y y W135, respectivamente, y el contenido combinado en glucosa y galactosa se sustrae del contenido en ácido siálico para cuantificar los sacáridos del serogrupo C. Los tres serogrupos se pueden resolver de este modo aun cuando el contenido en monosacáridos se solape. Los inventores han descubierto de forma ventajosa que los tres análisis de monosacáridos diferentes se pueden realizar sobre el mismo material, sin interferencia entre los monosacáridos y sin interferencia de cualquier otro material sacarídico en la composición (por ejemplo, estabilizantes de liofilización). El procedimiento se puede usar para analizar el sacárido libre y total en las vacunas conjugadas y simplifica el control de calidad de las vacunas que contienen sacáridos capsulares de serogrupos múltiples.

Se ha descrito un procedimiento para analizar mezclas de aldosa, hexosamina y ácido siálico sin interferencia [22], pero está basado en tratamientos enzimáticos y derivación química. Por el contrario, el procedimiento de la invención no requiere tales etapas y por eso es más rápido y fácil de realizar. Además, la situación tratada en la referencia 22 no padece el problema inherente de tener que resolver diferentes sacáridos que compARTEN unidades de monosacáridos comunes.

La invención también proporciona un aparato informático adaptado para realizar un procedimiento de la invención. En particular, la invención proporciona un programa informático para analizar el contenido en sacáridos de una composición como se define anteriormente, que comprende un módulo de programa para: (a) recibir datos sobre el contenido en ácido siálico, y sobre el contenido en glucosa y/o galactosa, de una muestra; y (b) calcular a partir de esos datos el contenido en sacáridos capsulares del serogrupo C y del serogrupo W135 y/o Y. La invención también proporciona un producto de programa informático que comprende un medio de almacenamiento de lectura informático que tiene almacenado en el mismo el programa informático de la invención.

Los sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y

Los procedimientos de la invención son para analizar mezclas de sacáridos capsulares de meningococos. Las mezclas incluyen los sacáridos capsulares de (i) serogrupo C y (ii) uno de o ambos serogrupos W135 e Y, es decir, C+W135, C+Y, o C+W135+Y. También pueden

estar presentes sacáridos adicionales.

El sacárido capsular del serogrupo C es un homopolímero del ácido siálico alineado con (α2→9) (ácido neuramínico N–acetilo, o ‘NeuNAc’). La mayor parte de las cepas del serogrupo C tienen grupos O–acetilo en C–7 y/o C–8 de los residuos del ácido siálico, pero aproximadamente el 15% de los aislados clínicos carecen estos grupos O–acetilo [23, 24]. La acetilación no parece afectar la eficacia protectora (por ejemplo, a diferencia del producto Menjugate™, el producto NeisVac–C™ usa un sacárido des–O–acetilado, pero ambas vacunas son eficaces). La estructura sacarídica se muestra en la Figura 13 y se escribe como sigue: →9)–Neu p NAc 7/8 OAc–(α2→

El sacárido del serogrupo W135 es un polímero de unidades del disacárido ácido siálico

– galactosa. Al igual que el sacárido del serogrupo C, tiene O–acetilación variable, pero en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [25]. La estructura se muestra en la figura 14 y se escribe como sigue: →4)–D–Neu p 5Ac (7/9OAc)–α– (2→6)–D–Gal–α–(1→

El sacárido del serogrupo Y es similar al sacárido del serogrupo W135, salvo que la unidad que repite el disacárido incluye glucosa en lugar de galactosa (véase Figura 16). Al igual que el sacárido del serogrupo W135, tiene O–acetilación variable a en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [25]. La estructura del serogrupo Y se muestra en la Figura 15 y se escribe como sigue: →4)–D–Neup5Ac(7/9OAc)–α– (2→6)–D–Glc–α–(1→

Dentro de una composición que incluye sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y existen de ese modo tres monómeros constituyentes diferentes (glucosa, galactosa y ácido siálico), y estos tres monómeros están presentes un una mezcla post–hidrólisis. La cantidad de monómeros de glucosa en una mezcla como tal está directamente relacionada con la cantidad de sacárido del serogrupo Y en la composición original, y la cantidad de monómeros de galactosa está directamente relacionada con la cantidad de sacárido W135. Sin embargo, para el serogrupo C, la situación es más compleja: el ácido siálico es el único monómero disponible para cuantificar el sacárido del serogrupo C, pero cualquier medición de la cantidad de ácido siálico en la mezcla incluirá monómeros derivados de los sacáridos de los serogrupos W135 e Y. La invención supera la complejidad de este análisis midiendo el contenido en la mezcla de cada galactosa, glucosa y ácido siálico (por separado y/o simultáneamente), y después: (a) usar el contenido en galactosa para cuantificar el contenido en serogrupo W135 pre–hidrólisis; (b) usar el contenido en glucosa para cuantificar el contenido en serogrupo Y pre– hidrólisis; (b) usar la diferencia ente el contenido en ácido siálico y contenido en glucosa y galactosa combinado para cuantificar el contenido en serogrupo C pre–hidrólisis; esto es, la cantidad molar del serogrupo C se calcula de acuerdo con la cantidad molar de ácido siálico menos la cantidad molar de (glucosa + galactosa). La sustracción del contenido molar en glucosa y galactosa del contenido molar en ácido siálico corrige la interferencia de los seogrupos W135 e Y y solamente deja el ácido siálico del serogrupo C.

La invención se puede usar para analizar sacáridos capsulares de longitudes que varían. Por ejemplo, Menjugate™ y Meningitec™ incluyen fragmentos seleccionados por tamaño (oligosacáridos) del polisacárido del serogrupo C de longitud completa, mientras que NeisVac–C™ usa el polisacárido de longitud completa. La invención se puede usar con oligosacáridos y/o con polisacáridos de longitud completa. Los oligosacáridos tienen un grado de polimerización (abreviadamente en inglés, DP) menor que el encontrado en polisacáridos capsulares nativos presentes en bacterias, y pueden tener una media de DP <30, por ejemplo entre 10 y 25. El DP se puede medir de forma conveniente por medio de cromatografía de intercambio de iones o por medio de ensayos colorimétricos [26].

Análisis del contenido en monosacáridos

El procedimiento de la invención implica una etapa de analizar el contenido en ácido siálico, en galactosa (si está presente el serogrupo W135) y en glucosa (si está presente el serogrupo Y). Si se está realizando un procedimiento para controlar la presencia de unidades de monosacáridos en una composición (por ejemplo, simplemente para controlar los monosacáridos residuales de una etapa anterior en la producción, o para controlar una posible liberación hidrolítica de monómeros de un conjugado), entonces se puede realizar en la composición directamente. De forma típica, sin embargo, el procedimiento se usará para medir el contenido total en sacáridos de una composición, y de tal forma la composición se hidrolizará a monosacáridos antes del análisis. De esta forma, el procedimiento de la invención incluirá de forma típica una etapa para tratar la composición con el fin de despolimerizar los sacáridos capsulares para proporcionar sus monosacáridos constituyentes. El análisis del contenido en ácido siálico y en galactosa y/o glucosa puede continuar después en la mezcla despolimerizada de los monosacáridos liberados.

Las condiciones para la despolimerización de sacáridos capsulares a sus monosacáridos constituyentes son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el sacárido del serogrupo C se puede hidrolizar para el análisis del contenido total en sacáridos por medio del tratamiento con HCl 100 mM a 80° C durante 2 horas [27]. La hidrólisis ácida usando ácido trifluoroacético (TFA) se puede usar para la hidrólisis de todos los serogrupos C, W135 e Y, siendo preferida una temperatura de incubación ligeramente inferior para el serogrupo C para evitar la degradación de su ácido siálico (90°C en lugar de 100°C). Un tratamiento con TFA típico implica la adición de TFA hasta una concentración final de 2 M, seguido de calentamiento a 90ºC – 100ºC durante 90 minutos. Después de la despolimerización, los hidrolizados de sacáridos se pueden secar por ejemplo usando un secador por vacío.

Después de la despolimerización, una composición contendrá monosacáridos mezclados derivados de los serogrupos C y W135 y/o Y. Las cantidades de estos monosacáridos en la mezcla están directamente relacionadas con las cantidades de sacáridos en la composición original pre–hidrólisis, y de esta forma las cantidades de los sacáridos de partida se pueden determinar como se describe anteriormente. Las cantidades se pueden determinar en lo que se refiere a números (por ejemplo, moles) de moléculas, masas, relaciones o concentraciones. Es típico trabajar en moles, ya que el ácido siálico tiene una masa molecular diferente a la glucosa/galactosa, pero cualquiera de estas medidas se puede usar e intercambiar para evaluar el contenido en sacáridos de las mezclas. Para la medición cuantitativa, los resultados analíticos se pueden comparar a un patrón con un contenido conocido de un sacárido particular.

La mezcla despolimerizada preferiblemente se hidroliza completamente a monosacáridos. Los inventores han descubierto que algunas veces se produce la hidrólisis incompleta, proporcionando mezclas en las que están presentes los fragmentos de disacáridos (esto es, Gal–NeuNAc para MenW135, y Glc–NeuNAc para MenY). Sin embargo, los monosacáridos se liberan con la relación teórica correcta, y los disacáridos no interfieren con análisis de los monosacáridos, por lo que la presencia no tiene por qué producir dificultades.

El progreso de la despolimerización (por ejemplo para comprobar la hidrólisis total a monosacáridos en lugar de hidrólisis parcial a oligosacáridos) se puede comprobar midiendo el grado de polimerización (abreviadamente en inglés, DP) en una mezcla, usando técnicas conocidas, como por ejemplo NMR, espectrometría de masas, etc.

Los procedimientos para cuantificar monosacáridos de glucosa, galactosa y ácido siálico son bien conocidos en la técnica. Los procedimientos pueden ser directos o indirectos (por ejemplo pueden implicar la derivación de los monosacáridos seguido de un análisis que está correlacionado con el contenido original en monosacáridos). Los procedimientos pueden implicar la separación de dos/tres monosacáridos diferentes unos de otros, seguido de análisis separado, y en tal caso la medición real del contenido en monosacáridos podría ser la misma en cada caso, con especificidad que procede de la separación. Sin embargo, se prefieren usar procedimientos que puedan analizar los sacáridos en presencia uno del otro, de tal forma que no necesiten estar separados uno del otro antes del análisis. Además, los procedimientos se pueden usar para sacáridos conjugados en los que, después de la desconjugación, el vehículo y el sacárido no se tienen que separar. Un procedimiento preferido es cromatografía de aniones, y en particular, cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC), normalmente con detección amperométrica pulsada (PAD) [28, 29]. Los sistemas HPAEC–PAD se proporcionan de Dionex™ Corporation (Sunnyvale, Calif.), por ejemplo, el sistema BioLC™, que usa una columna tal como PA1 [sustrato de poliestireno al 2% de 10 µm de diámetro reticulado con divinilbenceno, aglomerado con 500 nm látex funcionalizado con amonio cuaternario MicroBead (reticulado al 5%)] o PA10 [sustrato de etilvinilbenceno al 55% de 10 µm de diámetro reticulado con divinilbenceno, aglomerado con 460 nm ión de amonio cuaternario difuncional MicroBead (reticulado al 5%)]. Estos sistemas pueden analizar de forma cuantitativa sacáridos individuales dentro de las mezclas sin la necesidad de derivación o separación pre–análisis. Para el análisis de sacáridos, puede ser conveniente filtrar otros compuestos antes de entrar en la columna, y Dionex™ produce trampas y protectores en pre– columnas para este efecto, por ejemplo, una trampa amino para eliminar aminoácidos, una trampa de borato, etc.

Un procedimiento alternativo para cuantificar monosacáridos de glucosa, galactosa y ácido siálico dentro de una mezcla despolimerizada es resonancia magnética nuclear (NMR). Sin embargo, para facilitar el uso y para obtener una sensibilidad elevada, se prefieren los procedimientos cromatográficos de la invención.

Una vez que se ha determinado el contenido en ácido siálico y contenido en glucosa y/o galactosa, es simple comparar las cantidades molares de cada monosacárido en la mezcla, y calcular de ese modo la cantidad de sacáridos capsulares en la composición original.

El procedimiento de la invención es típicamente destructivo. En lugar de realizar el procedimiento en una composición completa, por lo tanto, es más típico tomar una muestra de una composición de interés y después realizar el análisis sobre la muestra.

Conjugados

La invención es útil para analizar el contenido en sacáridos de vacunas, y en particular para vacunas que incluyen un sacárido conjugado. La conjugación covalente se usa para potenciar la inmunogenicidad de sacáridos convirtiéndolos de antígenos T–independientes a antígenos T–dependientes, permitiendo de ese modo el cebado de memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo revisado en las referencias 30 a 39]. Los sacáridos pueden estar unidos a vehículos directamente [40, 41], pero por lo general se usa un enlace o espaciador, como por ejemplo ácido adípico, β–propionamido [42], nitrofenil–etilamina [43], haluros de haloacilo [44], y enlaces glucosídicos [45], ácido 6–aminocaproico [46], ADH [47], restos C 4 a C 12 [48], etc.

Las proteínas vehículo típicas en conjugados son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide diftérico o toxoide tetánico. El derivado de la toxina diftérica CRM197 [49 – 51] es la proteína vehículo en Menjugate™ y Meningitec™, mientras que el toxoide tetánico se usa en NeisVac™. El toxoide diftérico se usa en forma de vehículo en Menactra™. Otras proteínas vehículo conocidas incluyen la proteína de la membrana externa N. meningitidis [52], péptidos sintéticos [53, 54], proteínas de choque por calor [55, 56], proteínas pertussis [57, 58], citoquinas [59], linfoquinas [59], hormonas [59], factores del crecimiento [59], proteínas artificiales que comprenden epitopes de células CD4+ T humanas múltiples de diversos antígenos derivados de patógenos [60], proteína D de H. influenzae [61, 62], proteína superficial pneumocócica PspA [63], proteínas de recaptación de hierro [64], toxina A o B de C. difficile [65], etc. Las composiciones pueden usar más de una proteína vehículo por ejemplo para reducir el riesgo de supresión del vehículo, y una sola proteína vehículo puede llevar más de un antígeno de sacáridos [66]. Por lo general los conjugados tienen una relación sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir, proteína en exceso) y 5:1 (es decir, sacárido en exceso). Las composiciones pueden incluir la proteína vehículo libre además de los conjugados [67].

En general, las composiciones que incluyen sacáridos conjugados se pueden analizar usando la invención en dos formas. En primer lugar, la concentración total en sacáridos para cada serogrupo en una composición se puede medir por ejemplo antes de la liberación de una vacuna (a efectos de regulación o control de calidad), o para comprobar las concentraciones después de que se mezclen los conjugados. En segundo lugar, el sacárido no conjugado libre en una composición se puede medir por ejemplo para comprobar una conjugación incompleta,

o para seguir la hidrólisis del conjugado por medio de la monitorización del aumento del sacárido libre en el transcurso del tiempo. Realizando ambos tipos de análisis, la relación de sacárido libre a sacárido total se puede evaluar para cada serogrupo, que se puede usar a efectos de regulación o control de calidad. En general, es conveniente asegurar que una vacuna incluye <25% (por ejemplo, <20%, <15%, <10% etc.) de cada sacárido en forma libre. Los niveles altos de sacáridos libres significan una dosis inmunogénica inferior de conjugado.

De ese modo, la invención proporciona un procedimiento para analizar una composición, en la que:

(a): la composición comprende un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis;

(b): la composición puede comprender los sacáridos capsulares en forma no conjugada;

(c): el contenido de cualquier sacárido capsular no conjugado se determina por medio de un procedimiento de la invención, como se describe anteriormente;

(d): el contenido de sacáridos capsulares conjugados se determina por medio de un procedimiento de la invención, como se describe anteriormente; y, opcionalmente:

(e): la relación de sacárido conjugado:no conjugado se calcula para uno o más de los sacáridos capsulares. Las etapas (c) y (d) se pueden realizar en cualquier orden, o simultáneamente. La invención también proporciona un procedimiento para liberar una vacuna para usar

por parte de los facultativos, que comprende las etapas de: (a) fabricar una vacuna que contiene un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) analizar la cantidad de sacárido conjugado y/o no conjugado en la vacuna para cada uno de dichos sacáridos capsulares; y, si los resultados de la etapa (b) indican un contenido en sacáridos aceptable para uso clínico, (c) liberar la vacuna para usar por parte de los facultativos. La etapa (b) puede implicar la evaluación de la concentración mínima en sacáridos (por ejemplo entre 1 µg – 20 µg de sacárido total por serogrupo), evaluación de la relación de sacárido conjugado: no conjugado (por ejemplo ≤20% en peso de sacárido no conjugado, preferiblemente ≤10% o ≤5%), etc. La etapa (b) se puede realizar en una vacuna envasada, o se puede realizar en una vacuna a granel antes de envasar.

Para evaluar de forma separada sacáridos conjugados y no conjugados, éstos se deben separar. Los sacáridos libres (es decir, no conjugados) en una composición acuosa se pueden separar del sacárido conjugado en diversas formas. La reacción de la conjugación cambia diversos parámetros químicos y físicos para el sacárido, y las diferencias se pueden explotar para la separación. Por ejemplo, la separación por tamaño se puede usar para separar los sacáridos libres y conjugados, ya que el material conjugado tiene una masa superior debido a la proteína vehículo. La ultrafiltración es un procedimiento de separación por tamaño preferido, y el sacárido libre puede pasar a través de una membrana de ultrafiltración con un límite apropiado (por ejemplo, 30 kDa para un vehículo CRM 197), mientras que se retendrá el conjugado. Un procedimiento alternativo es usar la extracción de fase sólida (abreviadamente en inglés, SPE) usando una columna o membrana que retenga el conjugado pero que deje que el sacárido libre pase a través en forma de un eluato. La SPE tiende a ser más rápida y más consistente, pero la separación por tamaño es más aplicable universalmente. Como una alternativa adicional, si los conjugados se han adsorbido a un adyuvante entonces la centrifugación separará el conjugado adsorbido (sedimento) del sacárido libre (sobrenadante) que se desadsorbe después de la hidrólisis.

De ese modo el sacárido libre se puede separar del sacárido total y se puede analizar de forma separada, permitiendo así una determinación de la cantidad de material no conjugado en una composición. Comparar la cantidad libre con la cantidad total es más fácil que analizar de forma separada las dos reservas después de la separación, en particular si el material conjugado está retenido en un soporte durante la separación.

Componentes de sacáridos capsulares adicionales

La invención permite el análisis de composiciones que comprenden sacáridos capsulares de los serogrupos C y W135 y/o Y de N. meningitidis. También se puede usar para el análisis de composiciones que incluyen sacáridos capsulares adicionales, por ejemplo un sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis, un sacárido capsular de H. influenzae b, etc.

El sacárido capsular del serogrupo A de meningococo es un homopolímero de N–acetil– D–manosamina–1–fosfato unido a (α1→6), con O–acetilación parcial en las posiciones C3 y C4 (Figura 17). Los grupos acetilo se pueden reemplazar con grupos de bloqueo para prevenir la hidrólisis [17], y dichos sacáridos modificados son todavía sacáridos del serogrupo A dentro del significado de la presente invención. Las condiciones de despolimerización para el sacárido capsular del serogrupo A son conocidas [21], por ejemplo, la hidrólisis por TFA a 100°C, como se describe anteriormente para otros serogrupos. Un procedimiento alternativo implica Dowex 50 H+ seguido de calentamiento durante 1 hora a 100°C [68]. Los monómeros de fosfato monsamina liberados se pueden analizar en paralelo con glucosa, galactosa y ácido siálico, por ejemplo por medio de HPAEC–PAD [21].

El sacárido capsular de Hib es un polímero de ribosa, ribitol, y fosfato. El sacárido se conoce como ‘PRP’ (poli–3–β–D–ribosa–(1,1)–D–ribitol–5–fosfato) y se muestra en la figura

18. Los procedimientos para despolimerizar PRP a monosacáridos para análisis de HPAEC– PAD o 31 P–RMN son conocidos, por ejemplo por medio de incubación durante toda la noche con NaOH a temperatura ambiente [20]. La ribosa y ribitol liberados se pueden analizar en paralelo con glucosa, galactosa y ácido siálico.

El polisacárido capsular del serogrupo C es un homopolímero de ácidos siálicos unidos a α2→9 (también conocido como ácido colomínico). Se prefiere que una composición analizada por medio de la invención no incluya cualquier otro homopolímero de ácido siálico, por ejemplo, el sacárido capsular del serogrupo B de meningococo (ácidos siálicos unidos a α2→8), o el sacárido capsular de E. coli K12 (con enlaces α2→8y α2→9). De forma más general, si la composición que se va a analizar incluye un sacárido capsular que incluye un monómero de glucosa, galactosa o ácido siálico, entonces se prefiere que este sacárido capsular también incluya un monómero o monómeros adicionales que sea/sean únicos (dentro de la mezcla) a ese sacárido, con el fin de facilitar análisis mezclados. Incluso cuando los monómeros están compartidos entre sacáridos, la presencia de un único monómero permite que los diferentes sacáridos se analicen en paralelo usando los mismos principios como se describe para resolver los serogrupos C, W135 e Y de meningococo.

Componentes de sacáridos no capsulares

Cuando la invención está basada en el análisis de monosacáridos de una mezcla derivada de una composición bajo análisis, se prefiere que la composición no incluya ese monosacárido en forma libre (distinto a cualquier monosacárido anterior derivado de la hidrólisis de sacáridos capsulares). Por ejemplo, la inclusión de ácido siálico libre en una composición que se va a analizar podría dar como resultado que se sobreestime el contenido en serogrupo C. Se aplica el mismo principio si los disacáridos, etc. están incluidos y se hidrolizan después, por ejemplo la presencia de sacarosa (glucosa + fructosa), o de maltosa o trehalosa (ambos di–glucosa) podrían proporcionar una sobrestimación del contenido en serogrupo Y, y la presencia de lactosa (glucosa + galactosa) podrían proporcionar una sobrestimación de W135 e Y (y una subestimación del serogrupo C).

Sin embargo, dichos sacáridos se usan con frecuencia en la formulación de vacunas (por ejemplo en forma de estabilizantes [69, 70]), y existen dos formas generales en las que estos problemas de interferencia se pueden minimizar o evitar. En primer lugar, los niveles iniciales de estos componentes se pueden medir, y después sustraer de los niveles medidos en la mezcla despolimerizada. En segundo lugar, estos componentes se pueden eliminar de la composición antes del análisis, por ejemplo, por filtración o diálisis. Las membranas de ultrafiltración se pueden usar para eliminar componentes de peso molecular bajo, por ejemplo una membrana de 1K para eliminar sacarosa. (PM: 360).

La presencia de monosacáridos que tampoco se encuentran en los sacáridos capsulares que se están analizando normalmente no supone problemas de interferencia. Por ejemplo, se pueden incluir alcoholes de azúcar en una vacuna en forma de estabilizante de liofilización [71], pero el HPAEC–AED es capaz de distinguir entre un monosacárido simple y el monosacárido poliol correspondiente, por ejemplo entre los monosacáridos de manosa (como se encuentra en la cápsula de Aerobacter aerogenes [72]) y de mannitol (un estabilizante), y entre ribosa y ribitol [73].

Análisis de componentes no sacáridos

Así como el análisis del contenido en sacáridos de una composición, el procedimiento puede incluir el análisis de otros componentes o propiedades, por ejemplo, osmolaridad, pH, grado de polimerización para sacáridos o conjugados individuales, contenido en proteínas (en particular para proteínas vehículo), contenido en aluminio, contenido en detergente, contenido en conservante, etc.

La invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de vacuna, que comprende una etapa de análisis de una composición de acuerdo con la invención, incluyendo una etapa de medición de pH, seguido de una etapa de ajuste del pH de la composición hasta un valor deseado, por ejemplo entre 6 y 8, o aproximadamente 7.

La invención proporciona un procedimiento para envasar una vacuna, que comprende las etapas de: (a) fabricar una vacuna a granel que contiene un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) analizar la cantidad de sacárido conjugado y/o no conjugado en la vacuna a granel para cada uno de dichos sacáridos capsulares; (c) opcionalmente, analizar la vacuna a granel para detectar el pH y/u otras propiedades; y, si los resultados de la etapa (b) y (c) indican que la vacuna a granel es aceptable para uso clínico, (d) preparar y envasar la vacuna para uso humano del granel. La etapa (c) puede implicar (véase arriba) la evaluación de concentración mínima de sacáridos, evaluación de la relación de sacáridos no conjugados: conjugados, etc. La etapa (d) puede implicar el envasado en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiples, por ejemplo en viales o en jeringas. Una dosis humana típica para inyección tiene un volumen de 0,5 ml.

La etapa (c) y/o (d) puede estar precedida por el mezclado de la vacuna a granel con uno o más antígenos adicionales, por ejemplo con:

–: un antígeno de sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis.

–: un antígeno de proteína del serogrupo B de N. meningitidis.

–: preparaciones de microvesículas del serogrupo B de N. meningitidis [74], ‘OMV nativas’ [75], ampollas o vesículas de la membrana externa [por ejemplo, referencias 76 a 81 etc.].

– un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae tipo b.

–: un antígeno de Streptococcus pneumoniae, tal como antígenos de sacáridos conjugados polivalentes [por ejemplo, referencias 82 a 84].

– un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 85, 86].

–: un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como antígenos de superficie y/o del núcleo [por ejemplo, 86, 87].

– un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina pertussis (abreviadamente

en inglés, PT) y hemaglutinina filamentosa (abreviadamente en inglés, FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 88 y 89]. Se pueden usar antígenos celulares de pertussis.

– un antígeno de difteria, tal como un toxoide diftérico [por ejemplo, capítulo 13 de ref.

1] por ejemplo el mutante CRM 197 [por ejemplo, 90]. –un antígeno tetánico, tal como un toxoide tetánico [por ejemplo, capítulo 27 de ref. 1].

– antígeno(s) de polio por ejemplo, 91, 92], tal como IPV.

Dichos antígenos se pueden adsorber a un adyuvante de sal de aluminio (por ejemplo, un hidróxido o un fosfato). Cualquier antígeno de sacárido adicional se incluye preferiblemente en forma de conjugados.

Consistencia por lotes

Para la fabricación de vacunas humanas, los sacáridos conjugados se deberían someter a control de calidad antes de la conjugación (por ejemplo, el sacárido y la proteína vehículo), después de la conjugación, después de la formulación y después del mezclado. Los procedimientos de la técnica anterior basados en el análisis de monosacáridos no se pueden usar para distinguir sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y de meningococo después de haberse mezclado, debido a la interferencia producida por tener fuentes múltiples de ácido siálico. Sin embargo, con la invención, el análisis de monosacáridos se puede usar para analizar conjugados mezclados. Además, los procedimientos de la invención son fiables y consistentes, y por eso permiten comparaciones válidas de diferentes lotes de conjugados mezclados, lo que no era posible con procedimientos de la técnica anterior. Los diferentes lotes de vacunas conjugadas mezcladas se pueden de ese modo preparar, ensayar, y después los lotes más consistentes se pueden seleccionar para liberar y usar, mientras que se pueden rechazar los lotes aberrantes.

La invención proporciona un procedimiento para cuantificar sacáridos de serogrupos individuales dentro de una mezcla de sacáridos capsulares de al menos dos serogrupos diferentes de meningococos, en la que (a) los diferentes serogrupos comprenden el serogrupo C y uno o ambos de: (i) serogrupo W135 y/o (ii) serogrupo Y; (b) el procedimiento comprende una etapa de despolimerización de sacáridos capsulares dentro de la mezcla, para proporcionar una mezcla despolimerizada; y (c) los diferentes serogrupos se cuantifican comparando la composición de monosacáridos de la mezcla despolimerizada.

La invención también proporciona n lotes de una vacuna, en la que: (a) cada uno de los n lotes de vacuna comprende: un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) la concentración del sacárido del serogrupo C conjugado en el primer lote es C1 ; (c) la concentración del sacárido del serogrupo C conjugado en el segundo lote es C2; si es aplicable, (d) la concentración del sacárido del serogrupo W135 conjugado en el primer lote es W1; si es aplicable, (e) la concentración del sacárido del serogrupo W135 conjugado en el segundo lote es W2; si es aplicable, (f) la concentración del sacárido del serogrupo Y conjugado en el primer lote es Y1; si es aplicable, (g) la concentración del sacárido del serogrupo Y conjugado en el segundo lote es Y2; (h) las relaciones C1/C2, W1 /W2 e Y1 /Y2 están cada una entre 0,90 y 1,10, y preferiblemente están cada una entre 0,95 y 1,05; e (i) el valor de n es 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más).

Las relaciones especificadas en (h) pueden estar basadas en una sola muestra de cada lote que se está comparando, pero de forma típica estarán basadas en los valores medios (por ejemplo, medias) de múltiples muestras de cada lote. De ese modo, cada uno de los lotes n puede estar sometido a múltiples muestras, y cada muestra se puede someter a múltiples mediciones de C1, C2, W1; W2, Y1, e Y2, calculándose después las medias de cada lote, y usándose las medias para calcular las relaciones necesarias.

Cada lote (o cantidad) de vacuna se prepararán de forma separada. Por ejemplo, se pueden realizar dos lotes diferentes por medio de mezclas separadas de los mismos conjugados individuales a granel, o mezclando conjugados individuales a granel que se prepararon de forma separada. Las muestras diferentes de la misma mezcla a granel no son lotes diferentes, ya que estas muestras no se someten a las variaciones por lotes que resultan de las diferencias que surgen cuando se preparan mezclas de conjugados diferentes.

Además de las características (a) a (i) como se especifica anteriormente, los n lotes se pueden caracterizar adicionalmente por medio de: (j) la concentración del sacárido del serogrupo C no conjugado en el primer lote es C3; (k) la concentración del sacárido del serogrupo C no conjugado en el segundo lote es C4; si es aplicable, (l) la concentración del sacárido del serogrupo W135 no conjugado en el primer lote es W3; si es aplicable, (m) la concentración del sacárido del serogrupo W135 no conjugado en el segundo lote es W4 si es aplicable, (n) la concentración del sacárido del serogrupo Y no conjugado en el primer lote es Y3 ; si es aplicable, (o) la concentración del sacárido del serogrupo Y no conjugado en el segundo lote es Y4; (p) las relaciones C3/C4, W3/W4e Y3/Y4están cada una entre 0,90 y 1,10, y preferiblemente están cada una entre 0,95 y 1,05. Los lotes también se pueden caracterizar por: (q) las relaciones C3 /C1, C4 /C2, W3 /W1, W4 /W2, Y3 /Y1, e Y4 /Y2 son cada una inferiores a 0,20 (por ejemplo, <0,15, <0,10, <0,05, <0,02, 0).

General

El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste en por”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir en exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X+Y.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. En caso necesario la palabra “sustancialmente” se puede omitir de la definición de la invención.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x se refiere, por ejemplo a x±10%.

Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en forma abierta y cerrada y que, aunque las formas cerradas se muestran en la fórmula estructural de la presente memoria descriptica, las formas abiertas también están abarcadas por la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1 y 2 muestran análisis de HPAEC–PAD de un conjugado del serogrupo A de meningococo, liofilizado usando un estabilizante de manitol. En las Figuras 3 y 4 se muestran análisis similares para material en el que se había usado sacarosa como estabilizante.

Las Figuras 5 y 6 muestran análisis similares para un conjugado del serogrupo Y que no se ha liofilizado, y las figuras 7 y 8 muestran el mismo análisis para un conjugado del serogrupo W135.

Las Figuras 9 a 12 muestran análisis HPAEC–PAD de conjugados mezclados de los serogrupos C, W135 e Y.

Las Figuras 13 a 15 muestran fórmulas estructurales para los sacáridos capsulares de los serogrupos C (13), W135 (14), e Y (15) de meningococos. La Figura 16 muestra la diferencia entre los serogrupos W135 e Y.

La Figura 17 muestra una fórmula estructural del sacárido capsular del serogrupo A de meningococo.

La Figura 18 muestra una fórmula estructural del sacárido capsular de H. influenzae tipo b

La Figura 19 muestra el cambio en sacárido libre (%) sobre seis puntos de tiempo en conjugados combinados de los serogrupos C (♦), W135 (■) and Y (▲).

MODOS PARA REALIZAR LA INVENCIÓN

Producción de conjugados y procedimientos cromatográficos

Se prepararon antígenos de sacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis y se conjugaron a CRM 197 como se describe en la referencia 7.

Los cuatro conjugados se combinaron para proporcionar una composición “MenACWY” acuosa.

En un trabajo separado, el conjugado del serogrupo A se liofilizó en presencia de sacarosa o manitol, y se preparó una mezcla de los conjugados de los serogrupos C, W135 e Y (“MenCWY”). El análisis del contenido en sacáridos se realizó sobre un sistema de cromatografía de HPAEC–PAD Dionex™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El instrumento tenía un modulo de bomba de gradiente (GP40 o GP50), un detector amperométrico pulsado (ED40 o ED50) y un tomador de muestras automático (AS3500 o AS50). Los sacáridos se detectan midiendo la corriente eléctrica generada por su oxidación en la superficie de un electrodo de trabajo de oro (con electrodo de referencia Ag/AgCl). Se aplicó una forma de onda de potencial triple usando los siguientes ajustes: E1 = 0,05 V; t1 = 400 ms; E2 = 0,75 V; t2 = 200 ms; E3 = −0,15 V; t3 = 400 ms). La integración tuvo lugar desde 200 ms a 400 ms durante la aplicación E1. Los datos cromatográficos se integraron y se procesaron usando el programa de reducción de datos PeakNet 6.4.

Serogrupo A

La formulación liofilizada con manitol del sacárido del serogrupo A se analizó por medio de HPAEC– PAD después de almacenamiento a 4°C durante 3 meses. Las composiciones que contenían el conjugado se separaron del sacárido libre usando una columna de extracción en fase sólida (SPE) C4. La solución que contiene el sacárido libre se sometió a hidrólisis ácida usando TFA a 100°C durante 2 horas. La mezcla se aplicó después a una columna CarboPac PA1 de Dionex™ usando un protector PA1, elución de gradiente y detección de PAD, para la detección de manosamina–6–fosfato. Los resultados se muestran en la Figura 1.

Se realizó el mismo análisis, pero sin separación con SPE del sacárido libre. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 2. La comparación de las Figuras 1 y 2, teniendo en cuenta que el análisis de la Figura 1 usó una dilución 1:2 y el análisis de la Figura 2 usó una dilución 1:5, muestra que el pico de manosamina–6–fosfato es mucho más inferior en la Figura 1, mostrando un nivel bajo de sacárido libre en la composición. El análisis cuantitativo muestra 10,7 µg de sacárido total por vial, con el 3,7% libre.

El material liofilizado con sacarosa se analizó de la misma forma, después de la reconstitución con 600 µl de agua por vial, seguido de la combinación de muestras para proporcionar de 2 – 3 ml por análisis. Sin embargo, antes de la SPE C4, la composición se sometió a ultrafiltración usando una membrana de 1K (lavado con 2 ml de agua, carga con 2 ml de solución de la muestra, 3 ciclos de lavado con 2 ml de agua cada vez, recuperación del retenido y ajuste del volumen hasta 1 ml, diluido 1:1 para proporcionar una concentración final de NaCl al 0.9% para carga de SPE). La Figura 3 muestra que hubo un sacárido libre insignificante en la composición, pero un gran pico que corresponde al material conjugado (Figura 4).

Serogrupos W135 e Y

Antes de la combinación con otros conjugados, se analizó el conjugado del serogrupo Y a granel. El conjugado se separó del sacárido libre usando una membrana de ultrafiltración de 30 kDa. Se hidrolizó el material que se iba a analizar con TFA a 100°C, seguido de análisis cuantitativo de glucosa en la máquina Dionex™ usando una columna CarboPac PA1, una AminoTrap, una elución isocrática y etapa de regeneración, y la detección de PAD, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. No fue necesario eliminar el vehículo CRM197 antes de aplicar el hidrosilato a la columna. El material no conjugado era detectable (Figura 5), pero era menos abundante que la glucosa total (Figura 6). Tomando en cuenta las diferentes diluciones, el análisis de estas Figuras proporciona una fracción de sacárido libre del 1,8%. El material del serogrupo W135 a granel se trató y se analizó de la misma forma, pero con detección de galactosa en lugar de detección de glucosa (Figuras 7 y 8). Tomando en cuenta las diferentes diluciones, el análisis de estas Figuras proporciona una fracción de sacárido libre del 6%.

Conjugados combinados

Los conjugados para los serogrupos A, C, W135 e Y se combinaron con un adyuvante de fosfato de aluminio, como se describe en la referencia 7. Una combinación de conjugado MenCWY que se había almacenado durante dos semanas a 4ºC se usó para reconstituir el conjugado MenA liofilizado, y seguido de análisis 48 horas después, con centrifugación para separar el adyuvante de los conjugados. Los conjugados combinados se separaron de los sacáridos libres por medio de dos ciclos de ultrafiltración usando una membrana de 30kDa. El segundo ciclo disminuyó la contaminación con el glucoconjugado que alguna vez resultó pasar a través del perneado del primer ciclo. Se ensayaron los sacáridos, antes y después de la filtración por medio de hidrólisis ácida usando TFA a 90°C/100°C, seguido de dos análisis separados de HPAEC–PAD usando una columna CarboPac PA1 de Dionex™.

Para el análisis del serogrupo C, la columna tenía una protección CarboPac PA1 y usaba elución de etapa en gradiente. Está columna se procesó de un modo en el que no se resolvieron la glucosa y galactosa, ya que esta forma es más rápida. Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10. Para los serogrupos W135 e Y, la columna tenía una AminoTrap y usaba elución isocrática y regeneración, lo que resuelve la glucosa y galactosa. Los resultados se muestran en las Figuras 11 y 12.

Para calcular las cantidades de cada sacárido diferente, la cantidad de ácido siálico en

5 el análisis de las Figuras 9 / 10 se corrige para detectar la interferencia por medio de la sustracción de la cantidad combinada de glucosa y galactosa. Este valor proporciona la concentración de MenC. Las cantidades de galactosa y glucosa en el análisis de las Figuras 11 / 12 se usan después para cuantificar los serogrupos W135 e Y. Las cantidades combinadas de glucosa y galactosa de las Figuras 11 / 12 no se pueden corresponder a la cantidad tomada

10 de las Figuras 9 / 10 debido a la hidrólisis incompleta, como se describe anteriormente, pero tales discrepancias no afectan el análisis global. Las cantidades se calcularon por medio de la comparación de patrones que contienen cantidades conocidas de glucosa, galactosa y ácido siálico. Un análisis típico duplicado del sacárido MenC total y libre en un conjugado proporcionó

15 estos resultados:

Muestra: Glc + Gal (nmol/ml) SA total (nmol/ml) Diferencia (nmol/ml) Dilución MenC (µg/ml) Media MenC libre

Total: 9,26 8,72 14,93 14,46 5,67 5,74 10 x 17,5 17,8 17,6 < 5%

Libre: 2,45 2,53 2,35 2,33 0,10 0,20 2 x < 1,0 <1,0 < 1,0

↑ es decir, concentración del sacárido del serogrupo C.

A pesar de la ausencia de un solo sacárido para cuantificar el sacárido del serogrupo C, 20 por lo tanto, la invención permite que este material se ensaye de forma cuantitativa en un fondo de sacáridos de los serogrupos W135 e Y.

Un análisis similar de las Figuras 9 y 11 revela que la cantidad de cada sacárido libre en la composición MenACWY, y permite al sacárido libre expresarse como un porcentaje del sacárido total en la composición. Este análisis se realizó en diversos momentos de tiempo

25 sobre un periodo de 1 año para una combinación de MenCWY formulada para contener 10 µg/dosis (es decir, 20 µg/ml) de cada sacárido. Los resultados fueron:

Tiempo (semanas): 0 2 4 13 34 52 Media SD CV

C: Total (µg/ml) 18,3 20,3 22,6 23,6 21,3 20,5 21,1 1,86 8,8

Libre (%): 5,0 5,0 5,0 5,0 5,2 5,0 — — —

W: Total (µg/ml) 21,0 20,3 20,1 21,7 20,2 21,9 20,9 0,79 3,8

Libre (%): 10,7 11,2 10,1 8,8 9,8 9,9 — — —

Y: Total (µg/ml) 19,5 17,3 17,0 18,7 19,1 22,4 19,0 1,94 10,2

Libre (%): 5,6 6,7 5,3 6,3 5,3 10,8 — — —

SD = Desviación estándar CV = coeficiente de variación, es decir (SD/media) x 100%

La variación en el porcentaje de sacárido libre en los seis puntos de tiempo se muestra en la Figura 19.

En una segunda serie de experimentos, las vacunas se formularon en media dosis (5 µg de cada sacárido por dosis) y un cuarto (2,5 µg) relativa al trabajo anterior. El procedimiento de la invención se usó para resolver los diferentes sacáridos de dentro de la combinación, y los resultados fueron:

5 µg/dosis (10 µg/ml): Tiempo (meses) 0 1 3 Media SD CV

C: Total (µg/ml) 8,0 9,1 8,2 8,43 0,59 7,0%

Libre (%): <10,0 <10,0 <10,0 — — —

W: Total (µg/ml) 9,4 9,8 8,9 9,37 0,45 4,8%

Libre (%): <10,6 11,5 <10,6 — — —

Y: Total (µg/ml) 10,5 12,3 11,2 11,33 0,91 8,0%

Libre (%): <10,6 <10,6 <10,6 — — —

2,5 µg/dosis (5 µg/ml): Tiempo (meses) 0 1 3 Media SD CV

C: Total (µg/ml) 4,1 4,3 5,5 4,63 0,76 16,3%

Libre (%): <20,0 <20,0 <20,0 — — —

W: Total (µg/ml) 4,7 4,4 5,2 4,77 0,40 8,5%

Libre (%): <21,2 <21,2 <21,2 — — —

Y: Total (µg/ml) 5,8 6,2 6,5 6,17 0,35 5,7%

Libre (%): <21,2 <21,2 <21,2 — — —

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para analizar el contenido en sacáridos de una composición, en el que:

(a)

la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis ; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis;

(b)

el procedimiento comprende una etapa de analizar el contenido en ácido siálico de la composición, y (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, una etapa de analizar el contenido en galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, una etapa de analizar el contenido en glucosa de la composición;

(c)

si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido en sacárido del serogrupo W135 en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b);

(d)

si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido en sacárido del serogrupo Y en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); y

(e) el contenido en sacáridos del serogrupo C en la composición se determina comparando los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); o

(iii) si la composición incluye tanto un sacárido del serogrupo W135 como un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa de la etapa (b).
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición comprende el sacárido capsular de todos los tres serogrupos C, W135 e Y de Neisseria meningitidis.
3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la composición comprende uno o más sacáridos capsulares adicionales.
4.

El procedimiento de la reivindicación 3, en el que uno o más sacáridos capsulares adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: un sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis; y un sacárido capsular de Haemophilus influenzae b.
5.

El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que incluye una etapa de tratar la composición con el fin de despolimerizar los sacáridos capsulares para proporcionar sus monosacáridos constituyentes.
6.

El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el contenido en ácido siálico, el contenido en glucosa y/o el contenido en galactosa se miden por medio de cromatografía de intercambio de aniones de alto rendimiento, opcionalmente con detección amperométrica pulsada.
7.

El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el procedimiento también incluye la(s) etapa(s) en la(s) que uno o más de los siguientes componentes o propiedades se analiza(n): osmolaridad, pH, grado de polimerización para sacáridos o conjugados individuales, contenido en proteínas, contenido en aluminio, contenido en detergente, y contenido en conservante.
8.

El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que los sacáridos capsulares se derivan de un conjugado de sacárido -proteína.
9.

El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la proteína en el conjugado es una toxina o toxoide bacteriano.
10.

El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la toxina o toxoide se seleccionan del grupo que está constituido por: toxoide diftérico; toxoide tetánico; el derivado de la toxina diftérica CRM197; y la proteína D de H. influenzae.
11.

Un procedimiento para analizar una composición, en el que:

(a)

la composición comprende un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis;

(b)

la composición puede comprender los sacáridos capsulares en forma no conjugada;

(c)

el contenido de cualquier sacárido capsular no conjugado se determina por medio del procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

(d)

el contenido de sacáridos capsulares conjugados se determina por medio del procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

y, opcionalmente:

(e) la relación de sacárido conjugado:no conjugado en la composición se calcula para uno o más de los sacáridos capsulares.

5 12. Un aparato ordenador adaptado para realizar el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Un programa de ordenador para analizar el contenido en sacáridos de una composición como se define en la reivindicación 1, que comprende un módulo de programa para: (a)

10 recibir datos sobre el contenido en ácido siálico, y sobre el contenido en glucosa y/o galactosa, de una muestra; y (b) calcular a partir de esos datos el contenido en sacáridos capsulares del serogrupo C y del serogrupo W135 y/o Y.