ES2616180T3 - Sacáridos modificados con estabilidad mejorada en agua para su uso como medicamento - Google Patents

Abstract

Un sacárido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posición de grupo hidroxilo en al menos una de las unidades de monosacáridos del correspondiente sacárido capsular nativo para su uso como medicamento.

Description

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DESCRIPCION

Sacaridos modificados con estabilidad mejorada en agua para su uso como medicamento Campo tecnico

La presente invencion esta en el campo de la quimica de polisacaridos y se refiere a sacaridos modificados para su uso como medicamento, a procedimientos para su preparacion y a derivados conjugados. En particular, la invencion se refiere a sacaridos modificados que tienen una estabilidad mejorada en agua.

Antecedentes de la tecnica

Los polisacaridos son moleculas biologicas importantes y se han utilizado ampliamente en la industria farmaceutica para la prevencion y el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, se han utilizado polisacaridos capsulares durante muchos anos en las vacunas contra las bacterias encapsuladas, tales como los meningococos (Neisseria meningitidis), los neumococos (Streptococcus pneumoniae) y el Hib (Haemophilus influenzae tipo B).

Para potenciar la inmunogenicidad de estos polisacaridos, especialmente en ninos, se desarrollaron vacunas conjugadas. Estas comprenden un polisacarido capsular conjugado con una proteina vehiculo [por ejemplo, referencias 1, 2, 3]. La conjugacion puede convertir antigenos T-independientes en antigenos T-dependientes.

Un problema con muchos tipos de polisacaridos es su mala estabilidad en agua. La estabilidad de los polisacaridos en agua depende de la naturaleza de los enlaces O-glucosidicos que unen las unidades de sacaridos. La mala estabilidad en agua es resultado de que los enlaces O-glucosidicos se hidrolicen facilmente en presencia de acidos o glucosidasas. El polisacarido capsular del meningococo del serogrupo A es un ejemplo de un polisacarido que tiene una mala estabilidad en agua.

La estabilidad de los polisacaridos es un problema particular en la fabricacion de vacunas conjugadas. Con el fin de preparar un conjugado polisacarido-proteina, es necesario manipular grupos quimicamente funcionales en el polisacarido de manera que el polisacarido pueda unirse a una proteina. El polisacarido puede unirse ya sea directamente a la proteina [2, 4] o puede unirse a traves de un grupo de engarce. Se han propuesto muchos tipos diferentes de grupos de engarce para la union de polisacaridos a proteinas [por ejemplo, 3, 5].

La exposicion de un polisacarido a reactivos quimicos, principalmente acidos, puede dar como resultado la escision no deseada de enlaces glucosidicos y la consiguiente fragmentacion del polisacarido. Dicha fragmentacion es altamente indeseable, provocando perdidas en los rendimientos en la sintesis de conjugados polisacarido-proteina.

Los polisacaridos que son inestables de esta forma en general requieren una cuidadosa eleccion de los reactivos y condiciones para eludir los problemas descritos anteriormente. Sin embargo, esto limita los reactivos disponibles para la manipulacion del polisacarido, limitando de este modo la gama de enlaces que pueden realizarse entre el polisacarido y la proteina vehiculo. Ademas, la inestabilidad de estos polisacaridos significa que es dificil desarrollar procedimientos robustos, que puedan utilizase para preparar vacunas a escala industrial. Es un objeto de la invencion proporcionar formas de modificacion de sacaridos capsulares de modo que no experimenten problemas de inestabilidad y mantengan la inmunogenicidad.

Divulqacion de la invencion

La invencion se basa en el descubrimiento de que la modificacion de grupos hidroxilo en unidades de monosacaridos de sacaridos capsulares ofrece una estabilidad mejorada. Los sacaridos modificados obtenidos por el procedimiento de la invencion son mas estables a la hidrolisis que sus homologos sacaridos nativos.

Sacaridos modificados de la invencion

La invencion proporciona un sacarido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posicion de grupo hidroxilo sobre al menos una de las unidades de monosacaridos del correspondiente sacarido capsular nativo para su uso como medicamento.

La expresion "sacarido capsular modificado" significa un sacarido que es obtenible a partir de un sacarido capsular nativo mediante la modificacion adecuada. Por tanto, la secuencia basica de unidades de repeticion de monosacaridos en el sacarido capsular nativo se mantiene en los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion.

El termino "sacarido" abarca tanto los oligosacaridos (por ejemplo, que contienen de 2 a 39 unidades de monosacaridos) como los polisacaridos (por ejemplo, que contienen 40 unidades de monosacarido o mas). Como se encuentran de forma natural en las bacterias, los sacaridos capsulares nativos en general toman la forma de polisacaridos. Los polisacaridos pueden manipularse para proporcionar oligosacaridos mas cortos. Los oligosacaridos pueden obtenerse por purificacion y/o dimensionamiento del polisacarido nativo (por ejemplo, por hidrolisis en un acido suave, por calentamiento, por cromatografia de dimensionamiento etc.).

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Normalmente, los sacaridos modificados de la presente invencion son oligosacaridos. Los oligosacaridos pueden obtenerse a partir de polisacaridos por cualquiera de los procedimientos de dimensionamiento descritos anteriormente.

Los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion son obtenibles a partir de sacaridos capsulares nativos. Sin embargo, la presente invencion no se limita a sacaridos modificados obtenidos a partir de sacaridos capsulares nativos. Los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion pueden obtenerse por otros procedimientos, tales como la sintesis total o parcial.

El numero de unidades de monosacaridos que tienen grupos de bloqueo puede variar en la presente invencion. Por ejemplo, todas, o sustancialmente todas, las unidades de monosacaridos del sacarido capsular correspondiente pueden tener grupos de bloqueo. Como alternativa, al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % de las unidades de monosacaridos del sacarido capsular correspondiente pueden tener grupos de bloqueo. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 unidades de monosacaridos del sacarido capsular correspondiente pueden tener grupos de bloqueo.

Analogamente, el numero de grupos de bloqueo en una unidad de monosacarido puede variar. Por ejemplo, el numero de grupos de bloqueo en una unidad de monosacarido puede ser de 1,2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente de 1 - 4, mas preferentemente de 1-2.

En una realizacion, la al menos una unidad de monosacarido que tiene un grupo de bloqueo es una unidad de monosacarido no terminal. La expresion "unidad de monosacarido no terminal" significa una unidad de monosacarido que no es una de las unidades de monosacaridos terminales en la cadena de oligosacarido/polisacarido.

La presente invencion abarca sacaridos capsulares modificados en los que todas las posiciones de grupos hidroxilo de las unidades de monosacaridos terminales y no terminales tienen un grupo de bloqueo. Sin embargo, se prefiere que haya al menos un grupo amino o un grupo hidroxilo libre en el sacarido capsular modificado de la presente invencion. Un grupo hidroxilo o un grupo amino libre es ventajoso porque proporciona un asa para reacciones adicionales del sacarido capsular modificado, por ejemplo, para la conjugacion con una molecula vehiculo. Cuando el sacarido modificado contiene un grupo hidroxilo libre, es preferentemente un grupo hidroxilo anomerico, preferentemente un grupo hidroxilo anomerico terminal. Cuando el sacarido modificado contiene un grupo amino, preferentemente deriva de un grupo hidroxilo anomerico. Los grupos amino son facilmente accesibles a partir de grupos hidroxilo anomericos por aminacion reductora (utilizando, por ejemplo, NaBHaCN/NHUCl).

La expresion "grupo amino" incluye grupos de formula -NH2 o -NH-E, donde E es un grupo protector de nitrogeno. A continuacion se describen ejemplos de grupos protectores de nitrogeno tipicos.

La expresion "grupo de bloqueo" significa cualquier grupo que bloquee la reactividad de un grupo hidroxilo. El experto sera consciente de que existen muchos tipos diferentes de grupo de bloqueo. Los grupos de bloqueo preferidos para grupos hidroxilo son grupos que son directamente accesibles a traves de una reaccion de derivatizacion del grupo hidroxilo, es decir, mediante el reemplazo del atomo de hidrogeno del grupo hidroxilo por otro grupo. Los derivados adecuados de los grupos hidroxilo que actuan como grupos de bloqueo son, por ejemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, esteres, eteres (por ejemplo, silil eteres o alquil eteres) y acetales. Algunos ejemplos especificos de dichos grupos de bloqueo son alilo, Aloc, bencilo, BOM, t-butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM y THP.

Sin embargo, no es necesario que el grupo de bloqueo tenga que ser accesible directamente a traves de una reaccion de derivatizacion del grupo hidroxilo. El grupo de bloqueo puede reemplazar completamente el grupo hidroxilo. Por ejemplo, el grupo de bloqueo puede ser alquilo C1-12, alquilo C3-12, arilo C5-12, aril C5-12-alquilo C1-6, NR1R2 (donde R1 y R2 son como se definen a continuacion), H, F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquilo C1-6), CN, CF3CCI3, etc.

Preferentemente, el grupo de bloqueo es un grupo aceptor de electrones. Sin desear quedar ligado a teoria alguna, se cree que los enlaces glucosidicos son inestables a la hidrolisis debido a la ayuda de un ataque intramolecular nucleofilo de un grupo hidroxilo del sacarido en el enlace glucosidico (es decir, por formacion de un intermedio ciclico). Cuanto mayor sea la nucleofilia del grupo hidroxilo, mayor sera la tendencia a un ataque nucleofilo intramolecular. Un grupo de bloqueo aceptor de electrones tiene el efecto de deslocalizar el par solitario del oxigeno, disminuyendo de este modo la nucleofilia del oxigeno y disminuyendo la tendencia al ataque nucleofilo intramolecular.

Preferentemente, el grupo de bloqueo es de formula:

-O-X-Y o -OR3 en la que

X es C(O), S(O) o SO2;

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Y es alquilo C1-12, alcoxi C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C5-12 o aril C5-i2-alquilo C1-6, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquiloC1-6), CN, CF3 o CCh; o Y es NR1R2;

R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C5-12, aril C5-12-alquilo C1-6, o R1 y R2 pueden estar unidos para formar un grupo heterociclico saturado C3-12;

R3 es alquilo C1-12 o cicloalquilo C3-12, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, CO2(alquiloC1-6), CN, CF3 o CCl3, o R3 es arilo C5-12 o aril C5-12-alquiloC1-6, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados entre F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquiloC1-6), CN, CF3 o CCfo;

Preferentemente, cuando R3 es alquilo C1-12 o cicloalquilo C3-12, esta sustituido con 1, 2 o 3 grupos como se ha definido anteriormente.

Los grupos de bloqueo de formula -O-X-Y o -OR3 pueden prepararse a partir grupos hidroxilo por procedimientos de derivacion convencionales, tales como la reaccion del grupo hidroxilo con un haluro de acilo, haluro de alquilo, haluro de sulfonilo, etc. Por tanto, el atomo de oxigeno en -O-X-Y es, preferentemente, el atomo de oxigeno del grupo hidroxilo, mientras que el grupo -X-Y en -O-X-Y reemplaza preferentemente el atomo de hidrogeno del grupo hidroxilo.

Como alternativa, los grupos de bloqueo pueden ser accesibles a traves de una reaccion de sustitucion, tal como una sustitucion de tipo Mitsonobu. Estos y otros procedimientos de preparacion de grupos de bloqueo a partir de grupos hidroxilo son bien conocidos.

Mas preferentemente, el grupo de bloqueo es -OC(O)CF3 [6] o -OC(O)NR1R2.

Mas preferentemente, el grupo de bloqueo es un grupo carbamato de formula -OC(O)NR1R2, en el que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo C1-6. Mas preferentemente, R1 y R2 son ambos metilo, es decir, el grupo de bloqueo es -OC(O)NMe2.

Los grupos de bloqueo de carbamato tienen un efecto estabilizante sobre el enlace glucosidico y pueden prepararse en condiciones suaves. Un ejemplo de un procedimiento de manipulacion de un sacarido para proporcionar un grupo de bloqueo carbamato se describe a continuacion. Sin embargo, la invencion no se limita a los sacaridos modificados preparados mediante los procedimientos ejemplificados en el presente documento y otros procedimientos para la preparacion de sacaridos modificados de la invencion seran facilmente evidentes para el experto.

El termino "alquilo" se utiliza en el presente documento para referirse a grupos alquilo tanto en forma lineal como ramificada, el grupo alquilo puede estar interrumpido con 1,2 o 3 heteroatomos seleccionados entre -O-, -NH- o -S-. El grupo alquilo tambien puede estar interrumpido con 1, 2 o 3 dobles y/o triples enlaces. Sin embargo, el termino "alquilo" se refiere generalmente a grupos alquilo que no tienen interrupciones de heteroatomos ni interrupciones de doble o triple enlace. Cuando se hace referencia a alquilo C1-12, se entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier numero de atomos de carbono entre 1 y 12 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, Cs, C9, C10, C11, C12).

De forma similar, cuando se hace referencia a alquilo C1-6, se entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier numero de atomos de carbono entre 1 y 6 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6).

El termino "cicloalquilo" incluye cicloalquilo, policicloalquilo y cicloalquenilo, asi como combinaciones de estos con grupos alquilo, tales como grupos cicloalquilalquilo. El grupo cicloalquilo puede estar interrumpido con 1, 2 o 3 heteroatomos seleccionados entre -O-, -NH- o -S-. Sin embargo, el termino "cicloalquilo" se refiere generalmente a grupos cicloalquilo que no tienen interrupciones de heteroatomos. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen grupos ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, ciclohexilmetilo y adamantilo. Cuando se hace referencia a cicloalquilo C3-12, se entiende que el grupo cicloalquilo puede contener cualquier numero de atomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo, C3, C4, C5, C6, C7, Cs, C9, C10, C11, C12).

El termino "arilo" se utiliza en el presente documento para referirse a un grupo aromatico, tal como fenilo o naftilo. Cuando se hace referencia a arilo C5-12, se entiende que el grupo arilo puede contener cualquier numero de atomos de carbono entre 5 y 12 (por ejemplo, C5, C6, C7, Cs, C9, C10, C11, C12).

El termino "aril C5-12-alquilo C1-6" se refiere a grupos tales como bencilo, feniletilo y naftilmetilo.

Cuando R1 y R2 se unen para formar un grupo heterociclico saturado C3-12, significa que R1 y R2 junto con el atomo de nitrogeno forman un grupo heterociclico saturado que contiene cualquier numero de atomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo, C3, C4, C5, C6, C7, Cs, C9, C10, C11, C12). El grupo heterociclico puede contener 1 o 2 heteroatomos (tales como N, O o S) distintos del atomo de nitrogeno. Son ejemplos de grupos heterociclicos C3-12 saturados pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, imidazolidinilo, azetidinilo y aziridinilo.

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En todas las realizaciones descritas anteriormente, el sacarido capsular modificado es preferentemente un sacarido capsular modificado que tiene enlaces fosfodiester. Mas preferentemente, el sacarido capsular modificado es un sacarido modificado de Neisseria meningitidis serogrupo A. Los sacaridos de Neisseria meningitidis del serogrupo A son particularmente inestables a la hidrolisis.

Cuando el sacarido capsular modificado es un sacarido modificado de Neisseria meningitidis del serogrupo A, el grupo de bloqueo esta preferentemente en las posiciones 4 y/o 3, mas preferentemente en la posicion 4, del correspondiente sacarido de Neisseria meningitidis del serogrupo A. Los grupos de bloqueo en las posiciones 4 y/o 3 del sacarido de Neisseria meningitidis del serogrupo A han demostrado ser particularmente eficaces para mejorar la estabilidad a la hidrolisis.

La presente invencion tambien proporciona un sacarido de formula:

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en la que T es de formula (A) o (B):

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n es un numero entero de 1 a 100;

cada grupo Z se selecciona independientemente entre -OH o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente; y

cada grupo Q se selecciona independientemente entre -OH o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente;

W se selecciona entre -OH o un grupo de bloqueo como se ha definido anteriormente;

V se selecciona entre -NH2, -NHE, -NE1E2, -Oh o -O-D, donde: E, E1 y E2 son grupos protectores de nitrogeno, que pueden ser iguales o diferentes y D es un grupo protector de oxigeno.

y en la que mas de aproximadamente el 7 % (por ejemplo, el 8 %, el 9 %, el 10 % o mas) de los grupos Q son

grupos de bloqueo.

Preferentemente, n es un numero entero de 15 a 25.

Cada uno de los grupos n+2 Z pueden ser iguales o diferentes unos de otros. Analogamente, cada uno de los grupos n+2 Q pueden ser iguales o diferentes unos de otros.

5 V es preferentemente -NH2 o -NHE.

Son grupos protectores de nitrogeno adecuados los grupos sililo (tales como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acilo (tales como trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z o Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2-(trimetilsilil)etoxi carbonilo, aliloxicarbonilo (Alloc), 2,2,2- tricloroetoxicarbonilo (Troc)), derivados de sulfonilo (tales como p-trimetilsililetanosulfonilo (SES)), derivados de 10 sulfenilo, alquilo C1-12, bencilo, bencidrilo, tritilo, alilo, 9-fenilfluorenilo, etc. Un grupo protector de nitrogeno preferido es Fmoc.

Los grupos protectores de nitrogeno divalentes, que pueden utilizarse como E1E2, incluyen derivados de imida ciclicos (tales como N-ftalimidas, N-ditiasuccinimidas, N-2,3-difenilmaleimidas), derivados de imina (tales como N- 1,1-dimetiltiometilenaminas, N-bencilidenaminas, N-p-metoxibencilidenaminas, N-difenilmetilenaminas), derivados de 15 enamina (tales como N-(5,5-dimetil-3-oxo-1-ciclohexenil)aminas), etc. Un grupo protector de nitrogeno divalente preferido es N-ftalimidilo.

Los grupos protectores de oxigeno adecuados incluyen esteres, eteres (por ejemplo, silil eteres o alquil eteres) y acetales. Los ejemplos especificos incluyen alilo, acetilo, Aloc, bencilo, benciloximetilo (BOM), t-butilo, tritilo, terc- butildimetilsililo (TBS), terc-butildifenilsililo (TBDpS), trietilsililo (TES), trimetilsililo (TMS), tri-isopropilsililo (TlPS), 20 parametoxibencilo (PMB), MEM, metoximetilo (MOM), MTM y tetrahidropiranilo (THP).

Todos los grupos Z pueden ser OH. Como alternativa, al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 % o el 60 % de los grupos Z pueden ser OAc. Preferentemente, aproximadamente el 70 % de los grupos Z son OAc, siendo el resto de los grupos Z OH o grupos de bloqueo como se han definido anteriormente.

Al menos aproximadamente el 7 % de los grupos Q son grupos de bloqueo. Preferentemente, al menos el 10 %, el 25 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % de los grupos Q son grupos de bloqueo. Como

alternativa, todos los grupos Q pueden ser grupos de bloqueo.

La invencion tambien proporciona una molecula que comprende un resto de sacarido de formula:

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en la que T es de formula (A) o (B):

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n, Z, Q y W son como se han definido anteriormente, y: L es O, NH, NE, S o Se.

El enlace covalente libre de L puede unirse a cualquier resto adecuado, por ejemplo a -H, -E, un engarce, una proteina vehiculo, etc. L es preferentemente N u O. Tambien es posible que L sea N, unido a un engarce divalente, a un grupo protector divalente o a una proteina vehiculo divalente.

Procedimiento para producir un sacarido modificado

La invencion proporciona un procedimiento para modificar un sacarido capsular que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un sacarido capsular que tiene al menos un grupo hidroxilo en una unidad de monosacarido; y

(b) convertir dicho al menos un grupo hidroxilo en un grupo de bloqueo.

El grupo de bloqueo puede ser cualquiera de los grupos de bloqueo definidos anteriormente.

El sacarido capsular puede ser un sacarido (oligosacarido o polisacarido) capsular nativo. Como alternativa, el sacarido capsular puede ser, por ejemplo, un sacarido capsular des-O-acetilado y/o un sacarido capsular que tenga un grupo amino terminal (por ejemplo, obtenido por aminacion reductora).

Un procedimiento preferido para la modificacion de un sacarido en el que el grupo de bloqueo es -OCXCONR1R2 es cuando la etapa (b) comprende las etapas de:

(b1) hacer reaccionar el sacarido capsular con un reactivo bifuncional en un disolvente organico; y (b2) hacer reaccionar el producto de la etapa (b1) con un compuesto amino de formula (I):

HNR1R2 (I)

en la que R1 y R2 son como se han definido anteriormente.

La expresion "reactivo bifuncional" significa cualquier reactivo que sea capaz de realizar la doble funcion de (i) proporcionar en la etapa (b1) un primer atomo de carbono electrofilo para el acoplamiento con el grupo o grupos hidroxilo en el sacarido; y (ii) proporcionar un segundo atomo de carbono electrofilo para el acoplamiento con el grupo amino utilizado en la etapa (b2). En general, el segundo atomo de carbono electrofilo se regenera a partir del primer atomo de carbono electrofilo durante la etapa (b). El reactivo bifuncional proporciona un enlace -C(O)- entre el polisacarido y el compuesto amino.

Los reactivos bifuncionales para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, 1,1'- carbonildiimidazol (CDI), carbonil di-1,2,4-triazol (CDT), carbonil di-1,2,3-benzotriazol (CDB), carbonato de difenilo, bromuro de cianogeno, fosgeno o trifosgeno. El experto sera consciente de que existen otros reactivos bifuncionales que pueden realizar la misma funcion que estos.

Un reactivo bifuncional preferido es CDI. CDI tiene la ventaja de ser un reactivo mas suave que, por ejemplo, el fosgeno o el bromuro de cianogeno. En particular, las reacciones de acoplamiento utilizando CDI no generan gases de hidracidos halogenados, tales como HCl o HBr. La generacion de gas de HCl o HBr no es deseable, porque estos gases requieren la limpieza de la salida de la camara de reaccion para evitar su escape a la atmosfera. Por otra parte, la generacion de gas de HCl o HBr puede afectar a los grupos funcionales sensibles en el sacarido, dando como resultado una perdida en los rendimientos debido a la descomposicion o fragmentacion del sacarido.

El disolvente organico utilizado en la etapa (b1) es preferentemente un disolvente aprotico. Los disolventes aproticos son bien conocidos por el experto en la materia y no contienen atomos de hidrogeno ionizables. Estos disolventes son ventajosos porque facilitan la reaccion del grupo o grupos hidroxilo del sacarido con el reactivo bifuncional, mediante la potenciacion de la nucleofilia del grupo o grupos hidroxilo. Los disolventes aproticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), formamida, triamida de hexametilfosforamida (HMPT), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU), dimetilacetamida (DMAC) o

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hexametilfosforamida (HMPA). Se prefiere el DMSO.

En la etapa (b2) del procedimiento de la invencion, el producto de la etapa (b1) se hace reaccionar con un compuesto amino para formar el polisacarido modificado. El compuesto de amino utilizado en el procedimiento de la presente invencion es de formula (I), como se ha definido anteriormente. En la formula (I), preferentemente, R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo C1-6. Mas preferentemente, R1 y R2 son los dos metilo.

Son compuestos de amino adecuados que pueden utilizarse en la invencion metilamina, dimetilamina, etilamina, N- etilmetilamina, dietilamina, N-metilpropilamina, N-etilpropilamina, isopropilamina, butilamina, N-metil-butilamina, N- etilbutilamina, N-propilbutilamina, N-metilciclopentilamina, N-etilciclopentilamina, ciclohexilamina, N-

metilciclohexilamina, N-etilciclohexilamina, bencilamina, N-etilbencilamina, N-metilbencilamina, isobutilamina, terc- butilamina, ciclopentilamina, dibencilamina, pirrolidina, piperidina, morfolina, piperazina, imidazolidina, azetidina, aziridina, anilina, N-metilanilina y N-etilanilina. Estos pueden utilizarse en forma de sal (por ejemplo sal de clorhidrato).

Preferentemente, el compuesto de amino utilizado en la presente invencion es una amina secundaria. Mas preferentemente, la amina es dimetilamina.

Un procedimiento preferido de la invencion se ejemplifica en el Esquema 1 a continuacion:

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En este esquema, el sacarido (por ejemplo, el polisacarido u oligosacarido MenA) se activa primero a traves de al menos uno de sus grupos hidroxilo en una unidad de monosacarido con CDI en disolvente DMSO. El carbamato de imidazol intermedio resultante es atrapado por la amina R1R2NH (por ejemplo, dimetilamina) para proporcionar el sacarido modificado.

Los sacaridos modificados pueden prepararse como alternativa en un procedimiento de una etapa haciendo reaccionar uno o mas grupos hidroxilo en un sacarido capsular con un reactivo de formula XC(O)NR1 R2, en el que X es un grupo saliente y R1 y R2 son como se han definido anteriormente. Los grupos salientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, -Cl, -Br, -CF3,-OC6F5 o -CCL.

Como alternativa, los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion pueden prepararse por medios de sintesis, por ejemplo, a partir de unidades de monosacaridos adecuados. Normalmente, la sintesis total de un sacarido capsular modificado comprende la formacion de enlaces glucosidicos (por ejemplo, enlaces fosfodiester) entre unidades de monosacaridos adecuados y despues la modificacion del sacarido resultante de cualquier manera descrita anteriormente. Como alternativa, las unidades de monosacaridos pueden modificarse antes de formar los enlaces glucosidicos para proporcionar el mismo sacarido capsular modificado.

Los sacaridos capsulares modificados de la presente invencion son preferentemente oligosacaridos. A partir de polisacaridos consulares nativos, pueden obtenerse oligosacaridos capsulares modificados mediante cualquiera de dos procedimientos: (1) modificacion del polisacarido capsular seguida del dimensionamiento del polisacarido modificado para formar un oligosacarido modificado; o (2) dimensionamiento del polisacarido capsular seguido de la modificacion del oligosacarido resultante para formar un oligosacarido modificado. Ambos procedimientos estan incluidos dentro de la presente invencion. Sin embargo, se prefiere el primer procedimiento, ya que este procedimiento asegura que un grupo hidroxilo terminal estara disponible para la posterior conjugacion del oligosacarido modificado con una molecula vehiculo, tal como una proteina.

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La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para la modificacion de un polisacarido de Neisseria meningitidis del serogrupo A que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un polisacarido de Neisseria meningitidis serogrupo A;

(b) dimensionamiento de dicho polisacarido para proporcionar un oligosacarido; y

(c) conversion de al menos un grupo hidroxilo del oligosacarido en un grupo de bloqueo, como se ha descrito anteriormente.

La etapa (b) de este procedimiento puede ir opcionalmente seguida de una etapa o etapas conocidas de derivatizacion antes de la etapa (c). Las etapas de derivatizacion conocidas incluyen, por ejemplo, la aminacion reductora seguida de la proteccion del grupo -NH2 resultante y/o des-O-acetilacion.

La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para la modificacion de un polisacarido de Neisseria meningitidis serogrupo A que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un polisacarido de Neisseria meningitidis serogrupo A;

(b) conversion de al menos un grupo hidroxilo del polisacarido en un grupo de bloqueo, como se ha descrito anteriormente; y

(c) dimensionamiento del polisacarido resultante para proporcionar un oligosacarido.

La etapa (c) de este procedimiento puede ir opcionalmente seguida de una etapa o etapas conocidas de derivatizacion. Las etapas de derivatizacion conocidas incluyen, por ejemplo, la aminacion reductora seguida de la proteccion del grupo -NH2 resultante y/o des-O-acetilacion.

Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente puede ir seguido de una etapa en la que se retiran los contaminantes (por ejemplo, los contaminantes de bajo peso molecular).

Materiales de partida de sacaridos capsulares

Los sacaridos capsulares modificados de la invencion son obtenibles a partir de sacaridos capsulares nativos. La expresion "sacarido capsular nativo" se refiere a polimeros que contienen azucar (por ejemplo, polimeros de azucares, acidos de azucares, amino azucares, alcoholes polihidricos, alcoholes de azucar y fosfatos de azucar, etc.) que pueden encontrarse en la capsula de bacterias (tanto grampositivas como gramnegativas), tales como N. meningitidis, S. pneumoniae y H. influenzae. Por otra parte, "sacarido capsular nativo" incluye tanto los polisacaridos como los oligosacaridos. Pueden obtenerse oligosacaridos capsulares nativos mediante el dimensionamiento de polisacaridos nativos.

La "posicion de grupo hidroxilo" de un sacarido capsular nativo es una posicion en el sacarido capsular nativo que tiene un grupo hidroxilo. Sin embargo, no incluye posiciones en enlaces glucosidicos ni los residuos de los mismos, que tienen grupos hidroxilo (por ejemplo un grupo hidroxilo que es parte de un enlace fosfato no ocupa una posicion de grupo hidroxilo). Tampoco se incluyen las posiciones ocupadas por un grupo hidroxilo anomerico en una unidad de monosacarido terminal. Las posiciones donde hay un grupo acetoxi (AcO) en el sacarido capsular nativo tampoco son posiciones de grupos hidroxilo.

El sacarido capsular nativo puede comprender unidades de sacarido unidas por enlaces fosfodiester. Los sacaridos que comprenden enlaces fosfodiester son inestables frente a la hidrolisis.

El sacarido capsular nativo y el sacarido capsular modificado de la invencion son preferentemente inmunogenicos en mamiferos (por ejemplo, seres humanos). El mamifero puede ser un ser humano adulto o un nino.

El sacarido capsular nativo es preferentemente un polisacarido (o un fragmento de oligosacarido del mismo) de N. meningitidis (incluyendo los serogrupos A, B, C, W135 e Y), S. pneumoniae (incluyendo los serotipos 1,4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F), H. influenzae de tipo B, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y/o Pseudomonas aeruginosa.

Aunque la invencion puede ser aplicable a cualquier serogrupo de N. meningitidis, se prefiere utilizar un sacarido capsular del serogrupo A ("MenA"). El sacarido capsular MenA es particularmente inestable en solucion acuosa, lo que significa que deben utilizarse procedimientos especiales para realizar manipulaciones quimicas (por ejemplo, la conjugacion con proteinas vehiculo) en esta molecula. Sin embargo, se ha descubierto que los sacaridos MenA modificados de acuerdo con la invencion son ventajosamente estables en solucion acuosa.

El polisacarido capsular MenA |^6)-D-ManpNAc(3/4OAc)-a-(1^OPO3^| se compone de restos de N- acetilmanosamina unidos entre si por enlaces fosfodiester a1-6 que tienen las unidades de repeticion que se muestran a continuacion.

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De acuerdo con las definiciones anteriores, el 93 % de las posiciones 4 son posiciones de grupos hidroxilo y el 30 % de las posiciones 3 son posiciones de grupos hidroxilo. El grupo 1 -hidroxi terminal tambien ocupa una posicion de grupo hidroxilo. El grupo 1 -hidroxi terminal es un grupo hidroxilo anomerico terminal. El grupo hidroxilo que es parte 5 del grupo -OP(O)(OH)O- no es una posicion de grupo hidroxilo.

Conjugados sacarido-proteina

Los sacaridos modificados de la invencion pueden someterse a cualquier procesamiento corriente abajo habitual que se aplique a sacaridos (por ejemplo, derivatizacion, conjugacion, fragmentacion, etc.). Para potenciar la inmunogenicidad, los sacaridos modificados de la invencion se conjugan preferentemente con una proteina vehiculo. 10 La conjugacion a proteinas vehiculo es particularmente util para vacunas pediatricas [7] y es una tecnica bien conocida [por ejemplo, revisado en las referencias 8-16 etc.].

La invencion proporciona por tanto un conjugado de una proteina y un sacarido modificado de la invencion. La proteina puede conjugarse con el sacarido directamente o puede utilizarse un engarce. Puede utilizarse cualquier engarce quimico adecuado. La estabilidad mejorada del polisacarido modificado permite que se utilice 15 ventajosamente una amplia gama de enlaces.

Como se ha descrito anteriormente, se prefiere que el sacarido capsular modificado tenga al menos un grupo hidroxilo o grupo amino libre que pueda utilizarse como asa para el posterior enlace a una proteina vehiculo.

Un sacarido capsular modificado que tiene un grupo hidroxilo libre puede obtenerse mediante el bloqueo selectivo de grupos hidroxilo en un sacarido capsular o mediante el desbloqueo selectivo de un sacarido capsular modificado en 20 el que todos los grupos hidroxilo estan bloqueados. Como alternativa, puede revelarse un grupo hidroxilo libre mediante el dimensionamiento de un sacarido capsular modificado. Preferentemente, el al menos un grupo hidroxilo libre es un grupo hidroxilo anomerico terminal. Se prefiere el grupo hidroxilo anomerico terminal como grupo hidroxilo libre porque un grupo hidroxilo anomerico terminal puede revelarse mediante el dimensionamiento de un sacarido capsular modificado.

Un sacarido capsular modificado que tiene un grupo amino libre puede obtenerse por aminacion reductora de un grupo hidroxilo anomerico terminal, opcionalmente seguida de la proteccion del grupo -NH2 resultante. La reaccion de aminacion reductora puede realizarse antes o despues de la etapa de modificacion de la presente invencion. Preferentemente, la aminacion reductora se realiza antes de la etapa de modificacion de la presente invencion ya 5 que el grupo -NH2 resultante puede protegerse/desprotegerse selectivamente en presencia de grupos hidroxilo/grupos de bloqueo.

Los enlaces directos a la proteina pueden comprender la oxidacion del polisacarido seguida de la aminacion reductora con la proteina, como se describe en, por ejemplo, las referencias 2 y 4.

Los enlaces a traves de un grupo de engarce pueden hacerse utilizando cualquier procedimiento conocido, por 10 ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 3 y 5. Un tipo de enlace preferido es un engarce de carbonilo, que puede formarse mediante la reaccion de un grupo hidroxilo libre del sacarido modificado con CDI [17, 18] seguida de la reaccion con una proteina para formar un enlace carbamato. Otro tipo de enlace preferido es un engarce de acido adipico, que puede formarse mediante el acoplamiento de un grupo -NH2 libre en el sacarido modificado con acido adipico (utilizando, por ejemplo, la activacion de diimida) y despues el acoplamiento de una 15 proteina con el intermedio sacarido-acido adipico resultante. [12, 19, 20]. Otros engarces incluyen B-propionamido [21], nitrofenil-etilamina [22], haluros de haloacilo [23], enlaces glucosidicos [24], acido 6-aminocaproico [25], ADH [26], restos C4 a C12 [27] etc.

La conjugacion puede implicar: la reduccion del extremo anomerico a un grupo hidroxilo primario, la proteccion/desproteccion opcional del grupo hidroxilo primario; la reaccion del grupo hidroxilo primario con CDI para 20 formar un intermedio de carbamato de CDI; y el acoplamiento del intermedio de carbamato de CDI con un grupo amino en una proteina.

El esquema 2 muestra dos ejemplos diferentes de como un sacarido capsular puede conjugarse con una proteina vehiculo, de acuerdo con la presente invencion. En el primer ejemplo, la proteina esta conjugada a traves de un grupo hidroxilo terminal. En el segundo ejemplo, la proteina esta unida a traves de un grupo amino terminal.

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Las proteinas vehiculo preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoides diftericos o tetanicos. Estos se utilizan habitualmente en las vacunas conjugadas. El toxoide difterico CRM197 se prefiere en particular [28]. Otras proteinas vehiculo adecuadas incluyen la proteina de membrana externa de N. meningitidis [29], peptidos 5 sinteticos [30,31], proteinas de choque termico [32,33], proteinas pertusicas [34,35], la proteina D de H. influenzae [36], citocinas [37], linfocinas [37], hormonas [37], factores de crecimiento [37], toxina A o B de C. difficile [38], proteinas de captacion de hierro [39] etc. Es posible utilizar mezclas de proteinas vehiculo.

Despues de la conjugacion, los sacaridos libres y conjugados pueden separarse. Existen muchos procedimientos adecuados, incluyendo la cromatografia hidrofoba, la ultrafiltracion tangencial, la diafiltracion etc. [veanse tambien 10 las referencias 40, 41, etc.].

Una proteina vehiculo unica puede llevar multiples sacaridos diferentes [42].

Composiciones y procedimientos farmaceuticos

La invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende (a) un sacarido modificado de la invencion y/o un conjugado de la invencion y (b) un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

15 Cuando esta presente un conjugado, la composicion tambien puede comprender proteina vehiculo libre [43].

Los "vehiculos farmaceuticamente aceptables" incluyen cualquier vehiculo que no induzca por si mismo la produccion de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composicion. Los vehiculos adecuados son tipicamente grandes, macromoleculas que se metabolizan lentamente tales como proteinas, polisacaridos, acidos

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polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polimericos y copolimeros de aminoacidos, trehalosa [44], agregados de lipidos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y particulas de virus inactivos. Dichos vehiculos son bien conocidos por los expertos habituales en la materia. Las vacunas tambien pueden contener diluyentes, tales como agua, solucion salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Un analisis completo de excipientes farmaceuticamente aceptables esta disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences.

Normalmente, las composiciones se preparan en forma de inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas; pueden prepararse formas solidas adecuadas para solucion o suspension en vehiculos liquidos antes de la inyeccion tambien. La preparacion tambien puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para potenciar el efecto adyuvante. La administracion directa de las composiciones sera, en general, por via parenteral (por ejemplo, por inyeccion, ya sea subcutanea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se entregara al espacio intersticial de un tejido). Las composiciones tambien pueden administrarse en una lesion. Otros modos de administracion incluyen la administracion oral y pulmonar, rectal (supositorios) y aplicaciones transdermicas o transcutaneas [por ejemplo, Ref. 45], agujas y hipopulverizaciones. La pauta de dosificacion puede ser un programa de dosis unica o de dosis multiple (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo).

La composicion de la invencion es preferentemente esteril, tamponada y/o apirogena.

La composicion es preferentemente una composicion inmunogena (por ejemplo, una vacuna). Las vacunas a base de sacaridos o conjugados sacarido-proteina son bien conocidas en la tecnica.

Las composiciones inmunogenicas comprenden una cantidad inmunologicamente eficaz de antigeno sacaridico, asi como cualquier otro de los otros componentes especificados, segun sea necesario. Por "cantidad inmunologicamente eficaz", se quiere decir que la administracion de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis unica o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevencion. Esta cantidad varia dependiendo de la salud y condicion fisica del individuo que se trata, la edad, el grupo taxonomico del individuo que se trata por ejemplo, (primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de proteccion deseado, la formulacion de la vacuna, la valoracion de la situacion medica por parte del medico especialista y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad este incluida en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos frecuentes. La pauta de dosificacion puede ser un programa de dosis unica o de dosis multiple (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo). La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores.

La composicion inmunogenica puede incluir un adyuvante. Los adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composicion incluyen, pero no se limitan a: (A) compuestos de aluminio, por ejemplo, hidroxidos de aluminio (por ejemplo, oxihidroxidos), fosfatos de aluminio (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos de aluminio, etc. [por ejemplo, veanse los capitulos 8 y 9 de la Ref. 46]) o mezclas de diferentes compuestos de aluminio, tomando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, forma de gel, cristalina, amorfa, etc.) y prefiriendose la adsorcion; (B) MF59 (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formulados en particulas submicrometricas utilizando un microfluidificador) [vease el capitulo 10 de la Ref. 46; vease tambien la Ref. 47]; (C) liposomas [veanse los Capitulos 13 y 14 de la Ref. 46]; (D) ISCOM [vease el capitulo 23 de la Ref. 46], que puede estar desprovisto de un detergente adicional [48]; (E) SAF, que contiene escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, L121 polimero de bloque con Pluronic al 5 % y thr-MDP, ya sea microfluidificado en una emulsion submicrometrica o agitado con formacion de vortice para generar una emulsion de mayor tamano de particula [vease el capitulo 12 de la Ref. 46]; (F) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lipido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (G) adyuvantes de saponina, tales como QuilA o QS21 [vease el capitulo 22 de la Ref. 46], tambien conocido como Stimulon™; (H) quitosano [por ejemplo, 49]; (I) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (J) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferon-Y), factor estimulante de colonias de macrofagos, factor de necrosis tumoral, etc. [veanse los capitulos 27 y 28 de la Ref. 46]; (K) microparticulas (es decir, una particula de ~ 100 nm a ~ 150 pm de diametro, mas preferentemente de ~200 nm a ~30 pm de diametro y mucho mas preferentemente de ~500 nm a ~10 pm de diametro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y atoxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiacido), un acido polihidroxibutirico, un poliortoester, un polianhidrido, una policaprolactona etc.); (L) monofosforil lipido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) [por ejemplo, capitulo 21 de la Ref. 46]; (M) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [50]; (N) oligonucleotidos que comprenden motivos CpG [51] es decir, que contienen al menos un dinucleotido CG, utilizandose 5-metilcitosina opcionalmente en lugar de citosina, y/o motivo CI; (O) un eter de polioxietileno o un ester de polioxietileno [52]; (P) un tensioactivo de ester de sorbitano polioxietilenado en combinacion con un octoxinol [53] o un polioxietilen alquil eter o tensioactivo de ester en combinacion con al menos un agente tensioactivo no ionico adicional tal como un octoxinol [54]; (Q) un oligonucleotido inmunoestimulante (por ejemplo, un oligonucleotido CpG) y una saponina [55]; (R) un inmunoestimulante y una particula de sal metalica [56]; (S) una saponina y una emulsion de aceite-en-agua; (T) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [58]; (U) la enterotoxina labil al calor de E. coli ("LT") o mutantes destoxificados de los mismos, tales como los mutantes K63 o R72 [por ejemplo, Capitulo 5 de la Ref. 59]; (V) la toxina colerica ("CT") o mutantes destoxificados de la misma [por ejemplo, Capitulo 5

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Una vez formuladas, las composiciones de la invencion pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos que se tratan pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos. Las vacunas son particularmente utiles para vacunar a ninos y adolescentes.

Las vacunas de acuerdo con la invencion pueden ser tanto profilacticas (es decir para prevenir la infeccion) o terapeuticas (es decir, para tratar la enfermedad despues de la infeccion), pero normalmente seran profilacticas.

Ademas de los sacaridos modificados, la composicion puede comprender otros componentes antigenicos. Por ejemplo, la composicion puede incluir uno o mas sacaridos (esten o no modificados de acuerdo con la invencion). Por ejemplo, la composicion puede comprender sacaridos de los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis (por ejemplo, ademas de un sacarido modificado MenA). Estos normalmente estaran conjugados con proteinas vehiculo y pueden conjugarse sacaridos de diferentes serogrupos de N. meningitidis con las mismas o diferentes proteinas vehiculo. Cuando una mezcla comprenda sacaridos capsulares de ambos serogrupos A y C, se prefiere que la relacion (p/p) de sacarido MenA:sacarido MenC sea mayor que 1 (por ejemplo, 2:1,3:1,4:1,5:1, 10:1 o superior). Se ha observado una mejora de la inmunogenicidad del componente MenA cuando esta presente en exceso (masa/dosis) respecto al componente MenC. [63]

La composicion tambien puede comprender antigenos proteinicos.

Los antigenos que pueden incluirse en la composicion de la invencion incluyen:

- antigenos de Helicobacter pylori tales como CagA [64 a 67], VacA [68, 69], NAP [70, 71, 72], HopX [por ejemplo 73], HopY [por ejemplo, 73] y/o ureasa.

- un antigeno proteinico de N. meningitidis serogrupo B, tal como los de las Ref. 74 a 80, prefiriendose en particular la proteina '287' (vease a continuacion) y derivados (por ejemplo, 'AG287').

- una preparacion de vesicula de membrana externa (OMV) a partir de N. meningitidis serogrupo B, tal como las descritas en las referencias. 81,82, 83, 84 etc.

- un antigeno sacaridico de N. meningitidis serogrupo C, tal como el oligosacarido descrito en la Ref. 85 del serogrupo C [vease tambien la Ref. 86].

- un antigeno sacaridico de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo 87, 88, 89].

- un antigeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo 90, 91].

- un antigeno del virus de la hepatitis B, tal como los antigenos superficiales y/o nucleares [por ejemplo 91,92].

- un antigeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo 93].

- un antigeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina pertusica (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de

B. pertussis, opcionalmente tambien en combinacion con pertactina y/o los aglutinogenos 2 y 3 [por ejemplo, las Ref. 94 y 95].

- un antigeno de difteria, tal como un toxoide difterico [por ejemplo, capitulo 3 de la Ref. 96] por ejemplo el mutante CRM 197 [por ejemplo 97].

- un antigeno tetanico, tal como un toxoide tetanico [por ejemplo, capitulo 4 de la Ref. 96].

- un antigeno sacaridico de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 86].

- un antigeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo 74, 75, 76].

- un antigeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104].

- un antigeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 105].

- un antigeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 106].

- antigeno o antigenos de la polio [por ejemplo, 107, 108] tales como IPV u OPV.

- antigeno o antigenos de la rabia [por ejemplo, 109] taesl como el virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 110, RabAvert™].

- antigenos de sarampion, paperas y/o rubeola [por ejemplo capitulos 9, 10 y 11 de la Ref. 96].

- antigeno o antigenos de la gripe [por ejemplo, el capitulo 19 de la Ref. 96], tales como las proteinas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.

- un antigeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 111].

- un antigeno de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 112, 113].

- un antigeno sacaridico de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B).

- un antigeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 113, 114, 115].

- un antigeno de Staphilococcus aureus [por ejemplo, 116].

- un antigeno de Bacillus anthracis [por ejemplo, 117, 118, 119].

- un antigeno de un virus de la familia flaviviridae (genero flavivirus), tal como por ejemplo el virus de la fiebre

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amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, cuatro serotipos del virus del dengue, el garrapatas, el virus del Nilo Occidental.

- un antigeno de pestivirus, tal como el virus de la fiebre porcina clasica, el virus de la virus de enfermedad de la frontera.

- un antigeno de parvovirus por ejemplo, de parvovirus B 19.

- una proteina prionica (por ejemplo la proteina prionica de la ECJ)

- una proteina amiloide, tal como un peptido beta [120]

- un antigeno de cancer, tal como los enumerados en la Tabla 1 de la Ref. 121 o en las Tablas 3 y 4 de la Ref. 122.

La composicion puede comprender uno o mas de estos antigenos adicionales.

Los antigenos proteinicos toxicos pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo destoxificacion de toxina pertusica por medios geneticos y/o quimicos [95]).

Cuando hay un antigeno difterico incluido en la composicion se prefiere incluir tambien el antigeno tetanico y antigenos pertusicos. De forma similar, cuando se incluye un antigeno quimico se prefiere incluir tambien antigenos diftericos y pertusicos. De forma similar, cuando se incluye un antigeno pertusico se prefiere tambien incluir antigenos diftericos y tetanicos.

Los antigenos preferentemente se adsorben en una sal de aluminio.

Los antigenos en la composicion normalmente estaran presentes a una concentracion de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentracion de cualquier antigeno dado sera suficiente para provocar una respuesta inmune contra ese antigeno.

Como alternativa al uso de antigenos proteinicos en la composicion de la invencion, puede utilizarse el acido nucleico que codifique el antigeno [por ejemplo, las Ref. 123-131]. Los componentes proteinicos de las composiciones de la invencion pueden por tanto sustituirse por el acido nucleico (preferentemente ADN por ejemplo, en forma de un plasmido) que codifique la proteina.

La invencion tambien proporciona un procedimiento para generar una respuesta de anticuerpos en un mamifero, que comprende administrar una composicion farmaceutica de la invencion al mamifero. El mamifero es preferentemente un ser humano. El ser humano puede ser un adulto o, preferentemente, un nino. La respuesta de anticuerpos es preferentemente protectora contra la infeccion por N. meningitidis serogrupo A.

La invencion tambien proporciona un procedimiento para la inmunizacion de un mamifero, que comprende administrar una composicion farmaceutica de la invencion al mamifero.

Esta invencion tambien proporciona un sacarido modificado de la invencion o un conjugado de la invencion, para su uso como medicamento.

La invencion tambien proporciona el uso de un sacarido modificado de la invencion o de un conjugado de la invencion, en la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad provocada por bacterias encapsuladas. Las enfermedades provocadas por Neisseria incluyen la meningitis, la septicemia y la gonorrea. Las enfermedades provocadas por H. influenzae incluyen la otitis media, la bronquitis, la neumonia, la celulitis, la pericarditis y la meningitis. Las enfermedades provocadas por el neumococo incluyen la meningitis, la sepsis y la neumonia. Se prefieren por tanto la prevencion y/o el tratamiento de la meningitis bacteriana.

Definiciones

La expresion "que comprende" significa "que incluye" asi como "que consiste en" por ejemplo, una composicion "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

El termino "aproximadamente" en relacion con un valor numerico x significa, por ejemplo, x ± 10 %.

Se apreciara que los anillos de azucar pueden existir en forma abierta y cerrada y que, aunque en las formulas estructurales del presente documento se muestran las formas cerradas, las formas abiertas tambien estan incluidas en la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra el GPpromedio de muestras de MenA despues de la incubacion a 37, 49 y 57 °C representado en funcion del tiempo (h).

La Figura 2 muestra el GPpromedio de muestras MenA-CDI-DMA despues de la incubacion a 37, 49, 57 °C representado en funcion del tiempo (h).

La Figura 3 muestra un grafico de apilado de espectros de RMN 31P a 242,9 MHz de muestras de MenA-CDI-

virus de la encefalitis por diarrea viral bovina, y/o el

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DMA incubadas a 57 °C durante 0, 24, 48, 72, 96 horas. Se indican algunas marcas de senal.

La Figura 4 muestra el diagrama de GPpromedio frente al tiempo para comparar los procedimientos analiticos colorimetrico y de RMN 31P.

La Figura 5 muestra el GPpromedio de sacaridos MenA nativos y modificados a 2-8 °C a lo largo del tiempo.

La Figura 6 muestra el espectro a 600 MHz de RMM 1H marcado de MenA-CDI-DMA a 298 K. Se indican algunas asignaciones.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de ELISA competitivo realizado utilizando oligosacaridos MenA, MenA-CDI y MenA-CDI-DMA como agente de recubrimiento. La concentracion de competidores vario de 10° a 10-7 mg/ml.

La Figura 8 ilustra el esquema de reaccion para la conjugacion de oligosacaridos MenA.

La Figura 9 muestra el espectro a 600 MHz de RMM 1H a 25 °C de MenA modificado activado. Se indican algunas marcas de senal.

Las Figuras 10A y 10B muestran los espectros de RMN 1H, 13C hetero-correlacionados a 25 °C de MenA modificado activado. Tanto en la Figura 10A como en la 10B, el eje X se extiende aproximadamente desde 5,7 ppm a la izquierda hasta 1,8 ppm a la derecha. En la Figura 10A, el eje Y se extiende aproximadamente desde 145 ppm en la parte superior hasta 185 ppm en la parte inferior; en la Figura 10B se extiende aproximadamente desde 5 ppm en la parte superior hasta 105 ppm en la parte inferior.

La Figura 11 muestra espectros de RMN 1H superpuestos de MenA DP4 modificado activado y MenA DP4 nativo activado (sin la modificacion quimica por CDI y DMA).

La Figura 12 muestra un espectro de RMN 31P a 243 MHz a 25 °C de MenA modificado activado.

Las Figuras 13 y 14 muestran el aspecto del sacarido libre debido a la hidrolisis de los conjugados almacenados a 37 °C durante un periodo de cuatro semanas. Los sacaridos modificados se muestran como cuadrados, los naturales como triangulos vacios.

La Figura 15 muestra el aspecto del sacarido libre debido a la hidrolisis de los conjugados almacenados a 37 °C durante cuatro semanas a varios pH. La columna de la izquierda de cada par muestra el oligosacarido nativo.

La Figura 16 muestra los titulos de IgG anti-MenA-pS inducidos por (de izquierda a derecha) los conjugados del lote 3, lote 5 y lote 002011. Las barras muestran los limites del 95 % de confianza.

La Figura 17 muestra el analisis de las subclases de IgG de los sueros combinados de la inmunizacion con conjugados de MenA modificados y sin modificar (lotes 3, 5 y 002011). Los valores son la DO405 nm multiplicada por 1000.

La Figura 18 muestra los resultados de un ELISA competitivo utilizando MenA pS como competidor. El eje Y muestra los valores de DO405 nm multiplicados por 1000. El eje X muestra la dilucion de suero reciproca. El oligosacarido MenA sin modificar se muestra en circulos; los sacaridos modificados se muestran en cuadrados (lote 3) y en triangulos (lote 5). Los simbolos vacios muestran datos sin polisacarido competidor; los simbolos rellenos muestran los datos en presencia de polisacarido competidor.

Modos de realizacion de la invencion

Modificacion del oligosacarido MenA

El polisacarido capsular se purifico a partir de MenA y se hidrolizo para proporcionar el oligosacarido MenA. El polisacarido (2 g) se hidrolizo a 50 °C en tampon de acetato de sodio 50 mM, pH 4,75, a una concentracion de polisacarido de 10 mg/ml durante aproximadamente 4 horas [86]. Despues de la hidrolisis, la solucion se seco por evaporacion rotatoria.

El oligosacarido se activo utilizando el esquema de reaccion mostrado anteriormente en el Esquema 1. El oligosacarido se disolvio en DMSO para proporcionar una concentracion de sacarido de 10 mg/ml. De acuerdo con una relacion molar de oligosacarido:CDI de 1:20, se anadieron a continuacion, 21,262 g de CDI (Sigma™) y la mezcla de reaccion se agito durante 16 horas a temperatura ambiente. El compuesto MenA-CDI resultante se purifico por precipitacion selectiva en una mezcla de acetona:DMSO 80:20: (v/v) seguida de centrifugacion. La eficiencia de la reaccion de activacion se calculo que era aproximadamente el 67,9 % mediante la determinacion de la relacion de imidazol libre a imidazol unido.

En la segunda etapa de reaccion, el oligosacarido MenA-CDI se solubilizo en DMSO a a concentracion de sacarido de aproximadamente 10 mg/ml. De acuerdo con una relacion molar de unidad de MenA-CDI:DMA de 1:100 se

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anadieron 36,288 g de clorhidrato de dimetilamina al 99 % (Sigma™) y la mezcla de reaccion se agito durante 16 horas a temperatura ambiente. El producto de reaccion se liofilizo y volvio a solubilizar en solucion acuosa 10 mg/ml.

Para retirar el reactivo de reaccion de bajo peso molecular (en particular la dimetilamina (DMA)) de la preparacion de oligosacarido, se realizo una etapa de dialisis a traves de una membrana MWCO de 3,5 kDa (Spectra/Por®). Se realizaron cuatro etapas de dialisis: (i) 16 horas frente a 2 l de cloruro de sodio 1 M (factor de dialisis 1:20), (ii) 16 horas frente a 2 l de cloruro de sodio 5 M (factor de dialisis 1:20), (iii) y (iv) 16 horas frente a 2 l de WFI (factor de dialisis 1:20). Para mejorar la purificacion se realizo tambien una etapa de diafiltracion a traves de una membrana MWCO de 1 kDa (Centricon™).

El producto MenA-CDI-DMA purificado se tampono a pH 6,5 en L-histidina 25 mM (Fluka™).

La estabilidad de los productos MenA y MenA-CDI-DMA se evaluo mediante el uso de procedimientos colorimetricos y de RMN para determinar su grado de polimerizacion promedio (GPpromedio). Las muestras se incubaron en viales de vidrio en tampon His 25 mM, pH 6,5, durante 96 horas a una de las tres temperaturas (37, 49 o 57 °C) y, al final del periodo de incubacion, las muestras se almacenaron a 4 °C.

Estudio colorimetrico de estabilidad

El GPpromedio quimico se expreso por la relacion [Pt]/[Pme], en la que [Pt] es la concentracion total de fosforo y [Pme] es la concentracion de fosfato de monoester terminal. [Pt] se determino colorimetricamente como se describe en la Ref. 132. [Pme] se determino midiendo el fosfato inorganico Pi liberado por la reaccion enzimatica con fosfatasa acida de patata [133].

Las Figuras 1 y 2 muestran los GPpromedio de MenA y MenA-CDI-DMA en funcion del tiempo (t).

Se analizaron las constantes cineticas (k) de la hidrolisis sacaridica (se observa en las Figuras 1 y 2 como la caida del GPpromedio) como se describe en la referencia 134. Se analizaron dos aspectos distintos de k:

- k en funcion de GPpromedio y t en la ecuacion cinetica convencional; y despues

- k en funcion del factor de frecuencia (A), la energia de activacion (AGs) y la temperatura (T) en la ecuacion de Arrhenius.

Se asumio que la hidrolisis transcurrio hasta su finalizacion con cinetica de primer orden satisfactoria:

dGPprom

----------------= —kGPprom

dt

GPprom = GPpromQ exp(~kt)

en la que GPpromo = GPprom a t = 0. La forma logaritmica es: ln GPprom = ln GPprom - kt, k se define por la pendiente de la representacion de GPprom = f(t).

La ecuacion de Arrhenius indica la correlacion entre las constantes cineticas a diversos valores de temperatura y la energia de activacion para la reaccion de hidrolisis:

k = A exp(-AGa / RT)

\nk = \nA-AGa I RT

en la que R = 8,314 x 10-3 KJ/mol K. AGs se calcula a partir de la pendiente de la linea recta obtenida representando ln k en funcion de la temperatura reciproca (1/T). En este estudio se analizaron unicamente la energia de activacion total de la reaccion de hidrolisis, sin la separacion de las contribuciones individuales de la entalpia de activacion y la entropia de activacion (AGs = AHa + TASa).

La Tabla 1 resume los datos colorimetricos de GPprom y las constantes cineticas de la reaccion de hidrolisis a _________________________________diversas temperaturas:__________________________________

T (K) GPprom K (s-1)

0 h

24 h 48 h 72 h 96 h

MenA

310 21,453 17,452 14,197 11,550 9,396 2,4 x10-6

322

21,453 14,028 9,173 5,998 3,922 4,9 x 10-6

330

21,453 10,956 5,595 2,857 1,459 7,8 x 10-6

MenA-CDI-DMA

310 21,453 21,192 20,994 19,524 18,640 1,9 x 10-'

322

21,453 22,410 19,127 17,472 15,491 9,2 x 10-7

330

21,453 20,227 16,555 13,864 11,600 1,8 x 10-6

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Las representaciones de Arrhenius de las constantes de velocidad obtenidas a 37, 49 y 57 °C, indicaron que la energia de activacion de la reaccion de hidrolisis en tampon His 25 mM, pH 6,5, era de 50,1 KJ/mol (12,0 Kcal/mol) para MenA y 94,9 KJ/mol (22,7 Kcal/mol) para Mena-CDI-DMA. Los errores tipicos, que se estimaron por regresion lineal de minimos cuadrados de las representaciones de Arrhenius, eran de ± 5,0 KJ/mol (± 1,2 Kcal/mol) para los valores de AGa. Por tanto, el polisacarido modificado de la invencion era casi dos veces mas estable que su homologo sin modificar.

Estudio de estabilidad por NMR

Con el fin de verificar el GPprom obtenido mediante el procedimiento colorimetrico, se realizaron experimentos analiticos de RMN 31P. Los datos de GPprom se calcularon por la relacion de integracion entre las senales de Pme y Pen cadena (vease la Figura 3).

Las muestras de RMN 1H y 31P se prepararon disolviendo oligosacaridos liofilizados en 0,75 ml de D2O al 99,9 % (Aldrich™) para proporcionar soluciones concentradas a 10-15 mM. En todos los experimentos, se utilizaron tubos Wilmad™ de rMn de 5 mm. Los espectros de RMN se registraron a 298 K en un espectrometro Bruker™ NMR Spectrometer Avance DRX a 600 MHz con una unidad de BGU. Se utilizo una sonda de triple resonancia TBI de 5 mm con gradientes-z auto blindados. Para el procesamiento de datos se utilizo el software Bruker XWINNMR 3.0. Las condiciones de obtencion espectral convencionales de 1H eran recoger 32 mil puntos de datos en una ventana espectral de 6000 Hz con 4 exploraciones. Los espectros de RMN 1H se transformaron por Fourier despues de aplicar una funcion de ensanchamiento de linea de 0,1 Hz y y se referenciaron en relacion con la resonancia del anion acetato a 1,91 ppm o la del agua monodeuterada a 4,72 ppm. Las condiciones de obtencion espectral convencionales de 3P eran para recoger 32 mil puntos de datos a traves de una ventana espectral de 3000 Hz con 128 exploraciones. Se utilizo una funcion de ensanchamiento de linea de 2,0 Hz.

Como se muestra en la Figura 4, los procedimientos colorimetricos y de RMN 31P concordaban para todos los valores de temperatura, con solo un ligero desplazamiento a la baja evidente (sin efectos en ln GPprom = f(t)).

Los resultados de los procedimientos colorimetricos y de RMN 31P de analisis se resumen en la Tabla 2:

Procedimiento anali'tico

T (K) GPprom k (s-1)

0 h

24 h 48 h 72 h 96 h

Determinacion colorimetrica

310 21,453 21,192 20,994 19,524 18,640 1,9 x 10-7

322

21,453 22,410 19,127 17,472 15,491 9,2 x 10-'

330

21,453 20,227 16,555 13,864 11,600 1,8 x 10-6

Determinacion por RMN 31P

310 20,407 19,573 19,170 18,450 18,253 3,3 x 10-7

322

20,407 16,986 14,836 12,556 10,051 2,0 x10-6

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20,407 15,984 12,123 9,860 8,079 2,7 x 10-6

Mediante la mejorar del analisis de la forma espectral del Pme, se observo que se generaban dos especies moleculares diferentes (vease la Figura 3). Era evidente una velocidad constante cinetica mas baja para la senal ascendente.

Mediante la extrapolacion de los datos adquiridos a temperatura inferior (por ejemplo la temperatura de almacenamiento convencional de 2 a 8 °C), fue posible extrapolar estos datos a una escala de tiempo de 2 anos (vease la Figura 5).

Comparando los resultados obtenidos mediante estos ensayos acerca de la estabilidad de MenA y MenA-CDI-DMA, se observo un aumento significativo de la estabilidad del producto modificado. La extrapolacion a una escala de tiempo mas largo indico que la degradacion de MenA-CDI-DMA se reducia suficientemente para permitir la distribucion del producto durante 2 anos.

Caracterizacion estructural

La Figura 6 muestra un espectro de RMN 1H de una muestra de MenA-CDI-DMA a 298 K con asignaciones indicativas de senales. El perfil de RMN senalo una alta similitud entre el oligosacarido MenA y el oligosacarido MenA-CDI-DMA. Se observaron senales de metilo-1H de DMA en la region espectral de 2,6-3 ppm. El pico de 2,73 ppm correspondia al metilo-1H del DMA libre, como reactivo residual en solucion. El pico de 2,91 ppm se asigno tentativamente como el enlace de metilo-1H de DMA a la cadena de oligosacaridos.

Los perfiles de RMN 31P eran similares al oligosacarido MenA. Solo se observo un corto desplazamiento descendente de la senal de Pme (vease Figura 3).

Los sacaridos modificados de la invencion eran por tanto estructuralmente similares a sus homologos nativos, lo que significa que la antigenicidad y la inmunogenicidad no se vieron afectadas.

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Ensayos de ELISA competitivos

Se utilizo un ensayo de ELISA competitivo para correlacionar los oligosacaridos MenA, MenA-CDI y MenA-CDI-DMA con su capacidad para desplazar anticuerpos especfficos. El % de inhibicion representado en funcion de la concentracion de competidor (mg/ml) se muestra en la figura 7. Todas las muestras mostraron un comportamiento similar, alcanzando aproximadamente el 100 % de inhibicion a una concentracion competidor de 10-1 mg/ml.

Esto confirma que la modificacion de sacaridos utilizando la invencion no dio como resultado la perdida de antigenicidad.

Conjugacion

El sacarido MenA modificado (MenA-CDI-DMA) se conjugo con la protefna CRM197 mediante el procedimiento que se resume en la Figura 8. Las etapas basicas del procedimiento de conjugacion son:

- la hidrolisis de los polisacaridos MenA para proporcionar fragmentos de oligosacaridos

- dimensionamiento de los fragmentos de oligosacaridos

- aminacion reductora de grupos aldehfdo terminales en los oligosacaridos dimensionados

- proteccion de grupos -NH2 terminales mediante el grupo Fmoc antes de la reaccion con CDI

- desproteccion intrfnseca de los grupos -NH2 durante la reaccion con DMA

- activacion de grupos -NH2 terminales mediante SIDEA (acido N-hidroxisuccinimida adfpico)

- union covalente a la protefna CRM197

a) Hidrolisis

El polisacarido MenA se hidrolizo en tampon acetato de sodio 50 mM, pH 4,75 durante aproximadamente 3 horas a 73 °C. La hidrolisis se controlo con el fin de obtener oligosacaridos con un grado medio de polimerizacion (GP) de aproximadamente 15, como se determino por la relacion (p/p) entre el fosforo organico total y el fosfato de monoester.

b) Dimensionamiento

Esta etapa selecciono una poblacion definida de oligosacaridos generados durante el procedimiento de hidrolisis. El hidrolizado obtenido anteriormente se ultrafiltro a traves de una membrana de 30 kDa de corte (12 volumenes de diafiltracion de tampon acetato 5 mM, pH 6,5) para retirar las cadenas de longitud larga en la fraccion retenida.

c) Introduccion de un grupo amino primario en el extremo reductor

Se anadio acetato de amonio a la solucion de oligosacaridos dimensionados para obtener una concentracion final de 300 g/l y se anadio ciano-borohidruro de sodio a una concentracion final de 73 g/l. Despues de ajustar el pH a 6,5 ± 0,2, la mezcla se incubo a 37 °C durante 5 dfas.

Los amino-oligosacaridos se purificaron despues por ultrafiltracion a traves de una membrana de 3 kDa de corte utilizando 13 volumenes de NaCl 0,5 M. Esta etapa retiro las cadenas de sacaridos de longitud corta (GP < 6-7) proporcionando un grado final de polimerizacion promedio de ~15.

La fraccion retenida se diafiltro con 4 volumenes de TAB 10 mM (bromuro de tetrabutilamonio) y despues con 7 volumenes de H2O para el intercambio de Na+ por TAB+. El ion organico positivo mejoro la solubilidad del sacarido en DMSO (necesario para las siguientes etapas de derivatizacion) a aproximadamente 10 g/l.

Los oligosacaridos purificados se secaron con un evaporador rotatorio para retirar el agua y despues se solubilizaron en DMSO a una concentracion de disolvente de aproximadamente 10 g/l.

La solucion de amino-oligosacaridos purificada se analizo para determinar el contenido de fosforo mediante el procedimiento de Chen [132] y para determinar la cantidad de grupos amino introducidos mediante el procedimiento de Habbeb [135].

Como alternativa a la ultrafiltracion para retirar los sacaridos de cadena corta, se utilizo una columna de flujo rapido de Q-Sepharose, pero entonces se necesito un procedimiento de intercambio adicional en una columna SP- Sepharose (Pharmacia™) para efectuar la conversion de Na+/TAB+.

d) Proteccion del grupo amino terminal con el reactivo Fmoc

Se hicieron reaccionar los amino-oligosacaridos con Fmoc-OSu (N-9-fluorenilmetoxicarboniloxi) (Sigma) de acuerdo con la relacion molar -NH2:Fmoc-OSu = 1:20. La mezcla se incubo durante la noche con agitacion a temperatura ambiente y se precipito con acetona (concentracion final del 80 % v/v). El precipitado se recogio por centrifugacion y se lavo varias veces con acetona para retirar el reactivo Fmoc-OSu sin reaccionar.

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e) Reaccion de estabilizacion con los reactivos DMA y CDI

Los amino-oligosacaridos protegidos se solubilizaron en DMSO a 10 g/l y se anadieron a CDI en una relacion molar de CDI:fosforo total = 20:1. La mezcla se incubo durante la noche con agitacion a temperatura ambiente y se precipito con acetona (concentracion final del 80 % v/v). El precipitado se recogio por centrifugacion y se lavo varias veces con acetona para retirar el reactivo CDI sin reaccionar.

El producto obtenido anteriormente se solubilizo en DMSO a 10 g/l y se anadio a una solucion de DMA en etanol (aproximadamente 5,6 M) de acuerdo con la relacion molar DMA:fosforo total = 20:1. La mezcla se incubo durante la noche con agitacion a temperatura ambiente y se precipito con acetona (concentracion final del 80 % v/v). El precipitado se recogio por centrifugacion y se lavo varias veces con acetona para retirar la DMA sin reaccionar.

Los oligosacaridos purificados se secaron despues al vacio para retirar las trazas de disolventes organicos.

f) Cromatografica de intercambio ionico

El oligosacarido seco se solubilizo en agua a 10 g/l y se cargo en una columna de flujo rapido SP-Sepharose (Pharmacia™) equilibrada en NaCl 1 M, con el fin de realizar el intercambio TAB+/Na+. Despues, la columna se lavo con 5 volumenes de columna (VC) de agua para recuperar trazas de producto adsorbido a la resina. El oligosacarido se seco despues con evaporador rotatorio para retirar el agua.

g) Derivatizacion a ester activo

El producto seco se solubilizo en agua a una concentracion de grupos amino 40 mM, despues se anadieron 9 volumenes de DMSO seguidos de TEA (trietilamina) a una concentracion final de 200 mM. A la solucion resultante, se le anadio N-hidroxisuccinimido diester del acido adipico (SIDEA) para una concentracion final de 480 mM.

La reaccion se mantuvo con agitacion a temperatura ambiente durante 2 horas, despues el oligosacarido activado se precipito con acetona (concentracion final del 80 % v/v). El precipitado se recogio por centrifugacion y se lavo varias veces con acetona para retirar el SIDEA sin reaccionar.

Los oligosacaridos purificados se secaron despues al vacio para retirar el disolvente.

La cantidad de grupos ester activos introducidos en la estructura del oligosacarido se determino mediante un procedimiento colorimetrico como se describe en la referencia 136.

Se analizo el oligosacarido activado por RMN 1H como se describio anteriormente para confirmar las modificaciones quimicas. Los perfiles de RMN de proton establecidos en experimentos anteriores se utilizaron para evaluar varios lotes de producto. Las senales de sacarido se asignaron mediante la inspeccion de los espectros de RMN hetero- correlacionados 1D (Figura 9) y 2D (1H, 13C; Figuras 10A y 10B) y se demostro que eran caracteristicas de MenA modificado.

Se disolvieron aproximadamente 5 mg de cada muestra en 750 pl de D2O y los espectros se registraron en un espectrometro Bruker Avance a 600 MHz.

La inspeccion de la relacion de los grupos CH3 DMA y H1 anlll°de sacando proporciono un rendimiento de la reaccion de estabilizacion de entre el 70 % y el 75 %.

El perfil de protones del sacarido modificado se mantuvo y no fueron evidentes modificaciones sustanciales relativas al estado de O-acetilo ni la conformacion estructural a partir del analisis de RMN. Sin embargo, los grupos carbamato cambiaron el campo magnetico local y por tanto la asignacion del espectro de RMN 1H fue complicada.

En la Figura 11, se muestran espectros superpuestos de oligosacaridos MenA modificados y nativos. Un desplazamiento descendente de las senales de H3, H4 y H2 fue evidente debido a que los grupos carbamato en las posiciones C3 y C4 del anillo estan mas cerca que otros nucleos, como por ejemplo H1. Los espectros senalan otros desplazamientos, pero su asignacion es no es completamente segura.

La Figura 12 muestra que la derivatizacion quimica no provoco ningun cambio en el espectro de RMN 31P.

h) Conjugacion a CRM197

Se anadio el oligosacarido activado secado a una solucion 45 mg/ml de CRM197 en tampon fosfato 10 mM, pH 7,2, de acuerdo con una relacion molar de grupos ester:proteina = 12:1. La reaccion se mantuvo con agitacion a temperatura ambiente durante la noche y el conjugado obtenido se purifico por ultrafiltracion tangencial a traves de una membrana de 30 kDa de corte utilizando 50 volumenes de tampon de fosfato 10 mM, pH 7,2. El producto se esterilizo por filtracion y se almaceno a -20 °C hasta la formulacion de la vacuna.

El conjugado purificado se analizo para determinar el contenido de proteina (ensayo de proteinas microBCA), el contenido de sacarido (determinacion colorimetrica de fosforo), el contenido de sacarido libre (analisis

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cromatografico), el perfil de HPLC (en TSKgel G4000SWXL DI de 7,5 mm x 30 cm), el perfil de RMN y el SDS- PAGE.

Estabilidad dependiente del tiempo del conjugado

La estabilidad del conjugado de CRM197 del oligosacarido MenA-CDI-DMA se evaluo mediante el seguimiento de la aparicion de sacarido libre en solucion, debido a la hidrolisis, durante cuatro semanas de almacenamiento a 37 °C, en comparacion a un conjugado de CRM197 de oligosacarido de MenA modificado.

El sacarido libre (es decir, no conjugado) se determino mediante cromatografia de fase inversa en una columna de cartucho ISOLUTE™ C4 (1ST™) para aislar las cadenas no conjugados y despues mediante el sacarido permeado por cromatografia HPAE-pAD.

El sacarido total (es decir, tanto conjugado como no conjugado) se determino mediante un procedimiento para el analisis cuantitativo de fosfato de N-acetil manosamina, que utiliza cromatografia de intercambio anionico de alto rendimiento con deteccion de amperometrica pulsada (HPAE-PAD) [137].

La relacion de sacarido no conjugado a sacarido total se expreso como porcentaje (% de SL).

En un primer experimento, el % de SL se desarrollo de la siguiente manera (Figura 13):

Tiempo (dias)

0 7 14 21 28

Modificado

16,8 14,7 23,8 21,7 23,3

Natural

11,0 - 27,0 36,6 39,5

En un segundo experimento, los resultados fueron los siguientes (Figura 14):

Tiempo (dias)

0 7 14 21 28

Modificado

1,8 1,5 4,2 4,9 8,2

Natural

4,8 5,5 19,3 22,7 28,3

El oligosacarido conjugado MenA modificado era claramente mucho mas resistente a la hidrolisis que su homologo natural a temperaturas elevadas. Despues de 28 dias a 37 °C, por ejemplo, el porcentaje de sacarido liberado era del 6,4 % para el oligosacarido modificado frente al 23,5 % para el azucar natural.

En trabajos adicionales para someter a ensayo la consistencia lote a lote utilizando el sacarido MenA modificado, la aparicion de sacarido libre a partir de conjugados se controlo durante 8 semanas a 37 °C. Los resultados para tres lotes fueron:

Tiempo (dias)

0 7 14 28 56

Lote A

1,7, 2,9 3,2 5,8 8,7

Lote B

1,0 4,2 4,5 6,5 10,9

Lote C

2,2 4,5 5,4 8,2 11,4

El conjugado modificado era por tanto estable durante un periodo prolongado. Un nivel de sacarido libre de menos de 12 % estaba bien dentro de los limites aceptables, incluso a temperatura superior a la normal.

Estabilidad dependiente del pH del conjugado

Se sometio a ensayo la estabilidad de los conjugados de oligosacaridos MenA modificados y no modificados mediante el control de la aparicion de sacarido libre a diferentes pH entre 6,0 y 8,0 despues de haber estado almacenados a 37 °C durante 28 dias. Los oligosacaridos modificados (Lote 5) y no modificados (Lote RS040101) se compararon y los aumentos del sacarido libre (A% de SL) entre los dias 0 y 28 fueron los siguientes (Figura 15):

pH *

6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

Modificado

10,3 5,4 8,9 8,3 26,1

nativo

43,5 30,1 36,1 20,3 30,5

* pH ± 0,1

El conjugado MenA modificado por tanto mostro una velocidad de reaccion de hidrolisis mucho menor que el conjugado del oligosacarido MenA nativo en el intervalo de pH 6,5 a 7,5. A pH 8,0, donde se retiraron los grupos de estabilizacion del carbamato, el efecto era menos marcado.

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Inmunogenicidad de conjugados modificados

Los conjugados de CRM197 purificada del oligosacarido MenA modificado se utilizaron para inmunizar ratones con el fin de verificar que la modificacion no eliminaba la inmunogenicidad del sacarido.

La vacuna se formulo para proporcionar una dosis humana unica (DHU) de 10 pg de sacarido en un volumen de 0,5 ml. Se fabricaron dos formulaciones: una formulacion liquida y una formulacion liofilizada. Ambas contenian un adyuvante de fosfato de aluminio a 0,6 mg de Al3+/ml en la forma de dosificacion final, utilizandose una suspension acuosa del adyuvante para reconstituir la formulacion liofilizada.

La formulacion liquida del conjugado de oligosacarido modificado se comparo con la formulacion liofilizada del conjugado de oligosacarido nativo (es decir, no modificado).

Los ratones se inmunizaron con 1/5 de la DHU, las vacunas se diluyeron con solucion salina antes de cada inmunizacion. Se inyectaron 10 ratones Balb/c (hembras, de 6-8 semanas de edad) por grupo de inmunizacion por via subcutanea con 0,5 ml de la vacuna a tiempo cero y despues cuatro semanas mas tarde. Se realizaron sangrados antes de la primera inmunizacion y en la semana 6 (sueros pre y post-II), almacenandose los sueros a - 70 2C.

Titulos anti-polisacarido

Se determinaron los anticuerpos IgG totales anti-polisacaridos MenA especificos en el suero de los animales inmunizados de acuerdo con el procedimiento CDC para el analisis de sueros humanos con MenA [138], adaptado para el analisis de sueros animales, con algunos cambios menores.

Cada suero de raton individual se analizo por duplicado mediante una curva de titulacion. Se calculo la MGT para los grupos de inmunizacion. El titulo de anti-polisacarido MenA se expreso en Unidades de Elisa en Raton (UER), utilizandose un software basado en el procedimiento de ensayo de la Linea de Referencia para el calculo de UER.

El analisis de las subclases de IgG se realizo con una mezcla de sueros post-II de los grupos de inmunizacion, utilizando fosfatasa alcalina-IgG 1 o IgG2a o IgG2b o IgG3 (Zymed) anti-raton como conjugado secundario en el procedimiento de ELISA. Los titulos se expresaron como DO405 nm obtenida a una dilucion 1:3200 de los sueros post- II combinados despues de 30 minutos de desarrollo del sustrato.

La Figura 16 muestra los titulos de IgG anti-MenA-pS (MGT) inducidos por los dos lotes de conjugado de MenA modificado (lotes 3 y 5) en comparacion con el conjugado de MenA modificado liofilizado (lote 002011) utilizando adyuvante de fosfato de aluminio. Ambos conjugados modificados indujeron un titulo muy similar al inducido por el conjugado MenA no modificado.

La Figura 17 muestra el analisis de subclases de IgG de la mezcla de sueros (diluidoa 1:3200) a partir de la inmunizacion con conjugados de MenA modificados y no modificados. La subclase mas representada en todos los sueros era IgG 1, la subclase predominantemente inducida en ratones por antigenos T-dependientes cuando se presentan como proteinas. Debido a que el sacarido capsular MenA es, naturalmente, un antigeno T-independiente que no es capaz de inducir memoria inmunologica, se demostro que la conjugacion logro su finalidad.

La especificidad del titulo anti-MenA pS se determino mediante un ELISA competitivo utilizando MenA pS como competidor a una concentracion final de 25 pg/ml. Como se muestra en la Figura 18, hubo muy buena inhibicion del titulo inducido por los conjugados modificados y no modificados, lo que indica que todos los conjugados fueron capaces de inducir titulos anti-MenA especificos de pS.

Ensayo bactericida en suero (EBS) contra N. meningitidis del serogrupo A

La funcionalidad de los anticuerpos inducidos mediante la inmunizacion con los conjugados se analizo en un ensayo bactericida in vitro para medir la lisis de las bacterias mediada por el complemento.

Se utilizaron sueros post-II combinados para cada grupo de inmunizacion. Se inactivaron durante 30 minutos a 56 °C antes de la utilizacion en el ensayo. Se utilizo complemento de cria de conejo al 25 % como fuente de complemento (Pel Freeze). El titulo bactericida se expreso como la dilucion de suero reciproca que producia el 50 % de destruccion de las bacterias. Se sometio a ensayo la actividad frente a dos cepas del serogrupo A: F8238 y F6124.

Los titulos fueron los siguientes:

Cepa objetivo

Lote 3 Lote 5 Lote 002011

F8238

2048-4096 2048 4096-8192

F6124

4096 2048 4096

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Por tanto, los tres conjugados indujeron buenos titulos bactericidas frente a ambas cepas y los titulos inducidos por los oligosacaridos modificados no fueron significativamente inferiores a los obtenidos utilizando las estructuras de azucar nativas. Ventajosamente, sin embargo, los oligosacaridos modificados fueron significativamente mas estables que los oligosacaridos nativos. Por tanto, la invencion proporciona antigenos que conservan el potencial inmunogenico del sacarido capsular nativo MenA, pero que ofrecen una resistencia mejorada a la hidrolisis durante el almacenamiento.

Se entendera que la invencion se ha descrito a modo de ejemplo solamente y que pueden realizarse modificaciones mientras permanezcan dentro del ambito de la invencion.

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Claims (43)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un sacarido capsular modificado que comprende un grupo de bloqueo en una posicion de grupo hidroxilo en al menos una de las unidades de monosacaridos del correspondiente sacarido capsular nativo para su uso como medicamento.
2. 2. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 1 en el que la al menos una unidad de monosacarido es una unidad de monosacarido no terminal.
3. 3. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 1 o 2 que comprende al menos un grupo amino o grupo hidroxilo libre.
4. 4. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 3 en el que el al menos un grupo hidroxilo libre es un grupo hidroxilo anomerico terminal.
5. 5. El sacarido capsular modificado electrones.
6. 6. El sacarido capsular modificado formula:

   -O-X-Y o -OR3

   en la que

   X es C(O), S(O) o SO2;

   Y es alquilo C1-12, alcoxi C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C5-12 o aril C5-12-alquilo C1-6, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquiloC1-6), CN, CF3 o CCh; o Y es NR1R2;

   R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C5-12, aril C5-12-alquilo C1-6, o R1 y R2 pueden estar unidos para formar un grupo heterociclico saturado C3-12;

   R3 es alquilo C1-12 o cicloalquilo C3-12, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos seleccionados independientemente entre F, Cl, Br, CO2(alquiloC1-6), CN, CF3 o CCh, o R3 es arilo C5-12 o aril C5-12-alquilo C1-6, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados entre F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquiloC1-6), CN, CF3 o CCh;
7. 7. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 6 en el que el grupo de bloqueo es -OC(O)NR1R2 o - OC(O)CF3.
8. 8. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 7 en el que el grupo de bloqueo es -OC(O)NR1R2 y R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo C1-6.
9. 9. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 8 en el que R1 y R2 son ambos metilo.
10. 10. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 6 en el que X es C(O).
11. 11. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 6 en el que Y es alquilo C1-12.
12. 12. El sacarido capsular modificado de cualquier reivindicacion precedente en el que al menos el 10 % de las unidades de monosacaridos comprende un grupo de bloqueo.
13. 13. El sacarido capsular modificado de cualquier reivindicacion precedente, en el que el sacarido capsular correspondiente comprende unidades de monosacaridos unidas por enlaces fosfodiester.
14. 14. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 13, en el que el sacarido capsular correspondiente es un sacarido de Neisseria meningitidis serogrupo A.
15. 15. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 14 en el que el grupo de bloqueo esta en cualquiera de las posiciones 4 y/o 3 del correspondiente sacarido de Neisseria meningitidis serogrupo A.
16. 16. El sacarido capsular modificado de la reivindicacion 14 en el que el grupo de bloqueo esta en cualquiera de las posiciones 4 del correspondiente sacarido de Neisseria meningitidis serogrupo A.
17. 17. El sacarido capsular modificado de las reivindicaciones 1 a 16 que es un oligosacarido.
18. 18. Un procedimiento de preparacion del sacarido capsular modificado de las reivindicaciones 1 a 17 que comprende las etapas de:

    (a) proporcionar un sacarido capsular que tenga al menos un grupo hidroxilo en una unidad de monosacarido; y

    (b) convertir dicho al menos un grupo hidroxilo en un grupo de bloqueo.

    de la reivindicacion 1 en el que el grupo de bloqueo es un grupo aceptor de de cualquier reivindicacion precedente en el que el grupo de bloqueo es de

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19. 19. El procedimiento de la reivindicacion 18 en el que el grupo de bloqueo es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11.
20. 20. El procedimiento de las reivindicaciones 18 o 19 en el que el grupo de bloqueo es -OC(O)NR1R2 y la etapa (b) comprende las etapas de:

    (b1) hacer reaccionar el sacarido capsular con un reactivo bifuncional en un disolvente organico; y (b2) hacer reaccionar el producto de la etapa (b1) con un compuesto de amino de formula (I):

    HNR1R2 (I)

    en la que R1 y R2 son como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 y 9.
21. 21. El procedimiento de la reivindicacion 20, en el que el disolvente organico es un disolvente aprotico.
22. 22. El procedimiento de la reivindicacion 21 en el que el disolvente aprotico se selecciona entre dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), formamida, hexametilfosforamida (HMPA), triamida de hexametilfosforo (HMPT), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1 H)-pirimidinona (DMPU) o dimetilacetamida (DmAC).
23. 23. El procedimiento de las reivindicaciones 21 o 22 en el que el disolvente aprotico es DMSO.
24. 24. El procedimiento de las reivindicaciones 20 a 23 en el que el reactivo bifuncional se selecciona entre 1,1'- carbonildiimidazol (CDI), carbonil di-1,2,4-triazol (CDT), carbonil di-1,2,3-benzotriazol (CDB), carbonato de difenilo, bromuro de cianogeno, fosgeno o trifosgeno.
25. 25. El procedimiento de la reivindicacion 24 en el que el reactivo bifuncional es CDI.
26. 26. El procedimiento de las reivindicaciones 18 a 25 en el que el sacarido capsular modificado es un oligosacarido capsular modificado.
27. 27. El procedimiento de la reivindicacion 26 en el que el sacarido capsular de la etapa (a) es un oligosacarido capsular obtenible mediante el dimensionamiento del correspondiente polisacarido capsular nativo.
28. 28. El procedimiento de la reivindicacion 26 en el que el sacarido capsular de la etapa (a) es un polisacarido capsular nativo y el procedimiento comprende adicionalmente una etapa (c) en la que el producto de la etapa (b) se dimensiona, proporcionando de este modo un oligosacarido capsular modificado.
29. 29. Un procedimiento de preparacion del sacarido capsular modificado de las reivindicaciones 1 a 17 que es un procedimiento de sintesis total que comprende la formacion de enlaces glucosidicos entre dos o mas unidades de monosacaridos.
30. 30. Un sacarido capsular modificado obtenible mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29.
31. 31. Un conjugado sacarido-proteina de un sacarido modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o 30.
32. 32. El conjugado de la reivindicacion 31, en el que la proteina es una toxina o toxoide bacteriano.
33. 33. El conjugado de la reivindicacion 32, en el que la toxina o toxoide bacteriano es una toxina o toxoide difterico.
34. 34. El conjugado de la reivindicacion 32, en el que la toxina o toxoide bacteriano es CRM197.
35. 35. Una composicion farmaceutica que comprende (a) un sacarido modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o 30 y/o un conjugado sacarido-proteina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34 y (b) un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
36. 36. La composicion de la reivindicacion 35, que comprende adicionalmente un antigeno sacaridico de uno o mas de los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis, siendo el sacarido opcionalmente un oligosacarido y estando opcionalmente conjugado con una proteina vehiculo.
37. 37. La composicion de la reivindicacion 35 o la reivindicacion 36, que comprende adicionalmente un adyuvante de vacuna.
38. 38. La composicion de la reivindicacion 37, en el que el adyuvante es un fosfato de aluminio.
39. 39. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, que es una vacuna contra una enfermedad provocada por Neisseria meningitidis.
40. 40. Una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 39 para generar una respuesta de anticuerpos en un marnffero.
41. 41. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34 para su uso como un medicamento.
42. 42. El sacarido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o 30, o el conjugado de una cualquiera 5 de las reivindicaciones 31 a 34 para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad provocada por una o mas

    bacterias encapsuladas.
43. 43. El sacarido modificado o conjugado de la reivindicacion 42, en el que la enfermedad es la meningitis bacteriana.