ES2353753T3

ES2353753T3 - Procedimiento para la producción de lisados de células tumorales inducidas por temperatura para usar como compuestos inmunógenos.

Info

Publication number: ES2353753T3
Application number: ES03792365T
Authority: ES
Inventors: Steffen Goletz; Hans Baumeister; Ute Schober
Original assignee: Glycotope GmbH
Current assignee: Glycotope GmbH
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2003-08-18
Publication date: 2011-03-04
Anticipated expiration: 2023-08-18
Also published as: AU2003260426A1; EP1530628A1; US7595192B2; ATE482720T1; DE60334382D1; DK1530628T3; EP1530628B1; SI1530628T1; US20060127419A1; WO2004018659A1

Abstract

Un lisado que se puede obtener por un procedimiento que comprende las etapas de (a) inducir necrosis en células NM-F9 (depósito DSMZ nº DSM Acc2606) o en células NM-D4 (depósito DSMZ nº DSM Acc2605) a una temperatura de más de 41,2ºC durante al menos 15 minutos; y (b) lisar dichas células necróticas para así obtener un lisado, en el que el lisado que se puede obtener por dicho procedimiento es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral contra el antígeno TF.

Description

La presente invención se refiere a un lisado que se puede obtener por un procedimiento para la producción de un compuesto inmunógeno, que comprende inducir necrosis mediante temperatura en células 5 tumorales y lisar dichas células tumorales necróticas para así obtener el lisado. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el lisado que se puede obtener por el procedimiento mencionado. Además, se proporcionan usos del lisado para la vacunación contra cánceres o células dendríticas cargadas con el lisado celular.

La vacunación implica la administración de un agente a un individuo, que estimulará el sistema 10 inmunitario para que reaccione contra los componentes “extraños” de la vacuna. La vacuna se puede administrar, entre otros, en la piel, músculo, por vía intraoral, subcutánea, intradérmica, intranodal, intraperitoneal, intra o peritumoral o intravenosa. Los componentes extraños de la vacuna se conocen como “antígenos”. Como resultado de un procedimiento de vacunación, un individuo desarrolla inmunidad de modo que una exposición posterior al o a los antígenos producirá una respuesta para eliminar o destruir las 15 células, organismos o partículas que llevan el antígeno, o mejorar los síntomas de la enfermedad, o proteger frente a una enfermedad relacionada. Las vacunas han sido muy eficaces para proteger a la gente frente a organismos infecciosos. Las vacunaciones para los agentes infecciosos bacterianos o víricos ahora se usan de forma rutinaria para: virus influenza, sarampión, varicela, polio, bacterias neumocócicas, y virus de la hepatitis y similares. 20

Debido al éxito en la inmunización de individuos frente a determinados organismos infecciosos, ha sido una tarea importante para los médicos y científicos desarrollar vacunas eficaces contra los cánceres.

La lucha contra las enfermedades infecciosas con las vacunas también enseña que la prevención de enfermedades infecciosas con vacunas es más fácil que la terapia de la misma enfermedad en desarrollo. Se ha interpretado que esta experiencia sugiere que la vacunación profiláctica contra el cáncer 25 puede ser más eficaz que la vacunación cuando la enfermedad está en un estado avanzado. Por lo tanto, hay varios tipos de vacunas para el cáncer o terapias inmunitarias en desarrollo y se dirigen a su uso para prevenir, mejorar y/o tratar el cáncer y/o enfermedades tumorales. En principio la hipótesis anterior era la siguiente: las células tumorales se pueden debilitar o atenuar, e inyectar como una vacuna en un mamífero, por ejemplo un ratón. Después, si se inyectan estas mismas células tumorales, con toda su fuerza, en el 30 ratón, el ratón rechazará o luchará contra las células tumorales y no se desarrollará el cáncer o disminuirá la carga tumoral. Sin embargo, si un ratón no se ha vacunado desarrollará cáncer.

Las inmunoterapias para prevenir, mejorar y/o tratar el cáncer y las enfermedades tumorales mediante el uso de vacunas de células enteras (WCV) tienen la ventaja de ser multivalentes con respecto a los antígenos tumorales, sin embargo las WCV a menudo son solo débilmente inmunógenas. En 35 general, hay que distinguir entre vacunas que comprenden células tumorales enteras vitales (WCV) y vacunas que comprenden células tumorales lisadas (TCLV) (Sivanandham (2000), Biological Therapy of cancer, Ed. Rosenberg, S.A., 632-647).

Las vacunas de células enteras (WCV) tienen la ventaja de que las células tumorales se pueden manipular genéticamente antes de la vacunación, y por lo tanto, usar como un vehículo para sustancias 40 que tienen un efecto inmunoestimulador (Mach (2000), Curr. Opin. Immunol. 12, 571-575). Sin embargo, las desventajas de esta terapia son el alto coste experimental de la manipulación genética de dichas células, los problemas de mantener un estándar de calidad alto en la producción de las vacunas de células enteras y los problemas éticos que acompañan a la administración de las células tumorales vitales como vacunas (Sivanandham (2000), citado antes). 45

Con respecto a las WCV, varias publicaciones mostraron que el tipo de muerte celular influye en la respuesta inmunitaria (Melcher (1999), J. Mol. Med. 77, 824-833). Además, se encontró que la expresión de proteínas de choque térmico influye en la respuesta inmunitaria contra las células (Galucci (2001), Curr. Opin. Immunol. 13, 114-119; Todryk (2000), Immunology 163,1398-1408). Además, existe un gran número de procedimientos para inducir la muerte celular, en particular la apoptosis, que influyen 50 mucho en la inmunogenicidad de las células tumorales apoptóticas (Restifo (2000), Curr. Opin. Immunol. 12, 597-603). Con respecto a las WCV, diferentes publicaciones mostraron que las células tumorales necróticas vitales tanto in vitro como in vivo, es decir, en el sistema de modelo animal, son más inmunógenas que células apoptóticas o no tratadas. En esas publicaciones la muerte celular se inducía químicamente mediante ganciclovir en las células tumorales, las cuales expresan la timidina cinasa del 55 virus del herpes simplex (HSV)(HSVtk). Dicha timidina cinasa del HSV funciona como un llamado “gen suicida” si es inducido, por ejemplo, con ganciclovir. Sin embargo, la muerte celular solo se produce después de aplicar ganciclovir si las células que llevan el gen de timidina cinasa de HSV recombinante, albergan además el gen antiapoptótico bcl-2. Por el contrario, las células positivas para la timidina cinasa de HSV y negativas para bcl-2, experimentan la muerte celular programada después de inducción de la 60 timidina cinasa de HSV por ganciclovir. Solo el uso de células tumorales enteras positivas para HSVtk y bcl-2 para la vacunación profiláctica de ratones y la posterior administración de ganciclovir, dieron como resultado una protección de los animales contra el desarrollo de tumores (Gough (2001), Cancer Res. 61, 7240-7247; Melcher (1998), Nat. Med. 4, 581-587). También se observó que los macrófagos fagocitaban tanto células tumorales necróticas como apoptóticas, sin embargo, reaccionaban de forma diferente con 5 respecto a dichas células tumorales. Por un lado, las citocinas inmunoestimuladoras, tales como TNFα o IL-1β, eran secretadas si los macrófagos fagocitaban las células necróticas, por otra parte las citocinas inmunosupresoras, como IL-10, eran secretadas si eran fagocitadas las células apoptóticas (Gough (2001), citado antes). Además, se ensayó el patrón de secreción de macrófagos que se cultivaban simultáneamente con células tumorales incubadas durante 1 hora a 45ºC o con células tumorales 10 incubadas durante 15 minutos a 45ºC. Si se estimulaban con células tumorales, que eran inducidas térmicamente durante 1 hora, los macrófagos reaccionaban de forma similar a los estimulados con células necróticas inducidas químicamente, con respecto a la secreción de citocinas. Mientas que las células tumorales que eran inducidas térmicamente durante 15 minutos parecían células apoptóticas en que producían la secreción de citocinas inmunosupresoras después de ser fagocitadas por macrófagos 15 (Gough (2001), citado antes). Somersan (2001), J. Immunol. 167, 4844-4852, describe que los lisados de tejidos tumorales primarios están enriquecidos en proteínas de choque térmico e inducen la maduración de células dendríticas humanas.

A diferencia de los descubrimientos mencionados, se encontró que las células tumorales apoptóticas vivas son tan inmunógenas como las células tumorales necróticas o incluso más 20 inmunógenas (Kotera (2001), Cancer Res. 61, 8105-8109; Restifo (2000), citado antes; Shaif-Muthana (2000), Cancer Res. 60, 6441-6447); Albert (1998), Nature 392, 86-89). En estas publicaciones se llevaron a cabo otros procedimientos distintos de los usados en la publicación mencionada antes para la inducción de la muerte celular. Por ejemplo, Kotera (2001) (citado antes) no pudo encontrar diferencias entre las células presuntamente necróticas, que se generaban por congelación y descongelación, y las 25 células apoptóticas que se generaban por tratamiento con UV-B, cuando se analizaba la activación de células dendríticas. Se observó lo mismo en un sistema modelo animal cuando se investigaba la eficacia profiláctica y terapéutica de las células dendríticas que habían absorbido las células supuestamente necróticas o apoptóticas. Shaif-Muthana (2000) (citado antes) comparó la inmunogenicidad de células apoptóticas irradiadas con radiactividad con células supuestamente necróticas incubadas durante 30 30 minutos a 50ºC. Se mostró que solo las células apoptóticas podían activar linfocitos T después de que las células dendríticas las hubieran fagocitado. Restifo (2000) (citado antes) señaló que la generación de células apoptóticas inmunógenas depende del procedimiento de inducción de la apoptosis. En particular, las células apoptóticas producidas por infección vírica mostraban ser muy inmunógenas.

En resumen, en vista de lo descrito antes, parece que influyen diferentes parámetros en la 35 inmunogenicidad de las vacunas de células enteras. En particular, las vacunas de células enteras pueden proceder de células apoptóticas o necróticas, y por lo tanto, pueden tener efectos estimuladores o supresores en las células del sistema inmunitario. Además, también varía la eficacia de las vacunas de células enteras en los componentes del sistema inmunitario, en particular, macrófagos, células dendríticas o linfocitos T. Otro parámetro variable, que parece que influye en la inmunogenicidad de las 40 vacunas de células enteras, es el tipo de técnica para inducir la muerte celular.

Las células tumorales también se han tratado con dinitrofenol o se han fijado con glutaraldehído, con el fin de mejorar la inmunogenicidad antes de usarlas como vacunas de células enteras (Berd (1997), J. Clin. Oncol. 15, 2359-2370; Sensi (1997), Clin. Invest. 99, 710-717; Fujiwara (1984), J. Immunol. 133, 509-514; Price (1979), Br. J. Cancer 40, 663-665). Además, las células tumorales también se han tratado 45 por medios físicos, es decir, aplicándoles alta presión antes de la administración como vacunas de células enteras (documento US 4.931.275). Hay que indicar que estas estrategias para mejorar la inmunogenicidad pueden ser problemáticas, en cuanto que los productos químicos usados deben eliminarse sin dejar ningún residuo.

Un enfoque diferente para tratar el cáncer es la hipertermia. Aquí, el tejido tumoral se trata con 50 calor. Este tratamiento térmico se basa en el descubrimiento de que las células tumorales son más sensibles al calor que las células normales (Cavaliere (1967), Cancer 20, 1351-1381; Dickson (1979), Lancet 1, 202-205). El objetivo de muchos de los que trabajan en el campo de la hipertermia era demostrar que se podían matar las células tumorales in vivo e in vitro mediante calor. Así, las células tumorales vitales se trataban con temperaturas en el intervalo de 39ºC a 46ºC para analizar su vitalidad 55 después del tratamiento en cultivo celular o en un sistema de modelo animal (Cavaliere (1967), citado antes; Giovanella (1970), Cancer Res. 6, 1623- 1631; Selawry (1957), Cancer Res. 17, 785-791). A parte de la vitalidad de las células tumorales tratadas, también se analizó la inmunogenicidad de dichas células (Bourdon (1981), Ann. Immunol. 1, 43-63; Mise (1990), Cancer Res. 50, 6199-6202; Check (1974), Cancer 34, 197-203; Mondovi (1972), Cancer, 4 885-888; Price (1979), citado antes). Mise (1990) (citado 60 antes) ha aislado linfocitos T citotóxicos de ratones a los que se habían administrado células tumorales y se analizó la capacidad de los linfocitos T para lisar las células tumorales in vitro. En estos experimentos se observó que las células tumorales que se habían incubado a 42ºC durante 30 minutos eran lisadas más eficazmente que las células tumorales no tratadas. Otros estudios también pudieron demostrar el efecto beneficioso de la hipertermia en la lisis de células tumorales por las células del sistema inmunitario.

En la práctica clínica, la hipertermia se usa aplicando una temperatura elevada al tumor in vivo, con el fin de lograr la muerte de las células in vivo. Por lo tanto, durante un tratamiento de hipertermia un 5 paciente no es inmunizado con vacunas derivadas de células tumorales.

Otro enfoque de la vacunación profiláctica y terapéutica contra tumores son las vacunas de lisados de células tumorales (TCLV). Las ventajas de las vacunas de lisados de células tumorales frente a los enfoques mencionados antes para la vacunación y el tratamiento del cáncer, son el sencillo procedimiento de producción, que no está sometido a fluctuaciones, o lo está mucho menos, 10 manteniendo un estándar de calidad alto, puesto que las células tumorales se matan o lisan antes de la administración. Dicha muerte o lisado se puede hacer de forma mecánica o mediante congelación/descongelación. Además, se ha descrito que los adyuvantes bacterianos o víricos, p. ej., Calmette-Guerin (BCG) (Mitchell (1988), Cancer Res. 48, 5883-93) o virus vaccinia (Berthier-Vergnes (1994), Cancer Res. 54, 2433-2439) mejoran la inmunogenicidad de las vacunas de lisados de células 15 tumorales.

Las TCLV se producen obteniendo de forma mecánica o enzimática células tumorales de tejido tumoral procedente de material de tumor primario, metástasis y similares, en pequeños trozos y posteriormente lisándolas y matándolas mediante congelación y descongelación repetidas, a diferencia de las vacunas de células enteras (WCV). Los lisados producidos de esta forma se llaman “lisados 20 necróticos" (Gallucci (1999), Nat. Med., 11, 1249-55; Kotera (2001), citado antes; Restifo (2000), citado antes; Sauter (2000), J. Ex. Med., 191, 423-34).

Durante el proceso de muerte necrótica “real” se activan una serie de genes que solo se conocen de forma fragmentaria, que, sin embargo, dan como resultado la secreción de proteínas en el medio que presentan una respuesta proinflamatoria. Sin embargo, es poco probable que tenga lugar la 25 activación alterada de la expresión de genes durante la congelación/descongelación rápida, como se describe en la técnica anterior. Por lo tanto, los efectos positivos mencionados antes se supone que están relacionados con las células necróticas “reales” (Melcher (1999) J. Mol. Med 77, 824-833) y no se aplican a los lisados de células supuestamente necróticas. Por lo tanto, los lisados de células supuestamente “necróticas” de la técnica anterior de hecho comprenden células necróticas relevantes en 30 el sentido de la invención.

Las proteínas de choque térmico están entre los productos génicos, lo que sugiere que están implicados en los efectos inmunológicos de las células necróticas sobre el sistema inmunitario (Gallucci (2001), Curr. Opin. Immunol. 13, 114-119; Todryk (2000), citado antes). Hasta ahora se han identificado muchas señales que causan un aumento de la expresión de las HSP. Las proteínas de choque térmico 35 (HSP) pertenecen al grupo de las proteínas de estrés que estén presentes en todas las células en todas las formas de vida. Son inducidas cuando una célula experimenta diferentes tipos de estrés medioambiental tales como calor, frío o privación de oxígeno.

Las HPS también están presentes en condiciones perfectamente normales. Actúan como “chaperonas”, asegurando que las proteínas de las células tienen la forma correcta y están en el sitio 40 correcto en el momento correcto. Por ejemplo, las HSP ayudan a las proteínas nuevas o distorsionadas a doblarse en su forma, que es esencial para su función. También transportan las proteínas de un compartimento a otro dentro de la célula, y transportan proteínas viejas a “los vertederos de desechos” dentro de la célula.

Durante décadas se ha sabido que los animales, p. ej., los ratones, se pueden vacunar contra el 45 cáncer y después de muchos experimentos, se ha encontrado que un elemento responsable de las respuestas inmunológicas en ratones eran las proteínas de choque térmico. En particular, se ha demostrado que la expresión de Hsp70 está relacionada con la inducción de la muerte celular. De esta manera, parece que Hsp70 es al menos un factor importante implicado en los efectos inmunoestimuladores de las células necróticas (Dressel (2000), J. Immunol. 164, 2362-2371; Melcher 50 (1998), citado antes; Todryk (2000), citado antes). Feng (Feng (2001), Blood 11, 3505-3512) ha inducido la expresión de Hsp70 unido a membrana en células, lo que produjo la mejora de la inmunogenicidad en un sistema modelo animal. En un experimento de control, estas células se han inyectado como un lisado en ratones sin provocar una respuesta antitumoral.

Además, se ha demostrado la función inmunoestimuladora de determinadas HSP aisladas, en 55 particular de Hsp70 y gp96 (documentos US 6.168.793; US 5.948.646; US 5.961.979; Schild (2000), Nat. Immunol. 1, 100-101; Binder (2000), J. Immunol. 165, 6029-6035; Wells (2000), Immunol. Today 21, 129-132). Además, también se han descrito las HSP purificadas a partir de lisados celulares como moléculas muy inmunógenas, que presentan péptidos frente al sistema inmunitario. Por lo tanto, se usan en el comercio para el desarrollo de vacunas para tumores. 60

Como conclusión, hay problemas o inconvenientes asociados con las vacunas de células enteras (WCV) o hipertermia y con las vacunas de lisados de células tumorales (TCLV), y con el fin de desarrollar u obtener potentes vacunas es importante aumentar notablemente la inmunogenicidad. Por lo tanto hay una necesidad médica y un interés comercial para una vacuna para tumor eficaz, que se pueda producir fácilmente, sea barata y muy reproducible. 5

Por lo tanto, el problema técnico que subyace en la presente invención es proporcionar medios y procedimientos para mejorar la vacunación contra cánceres, enfermedades tumorales, infecciones y enfermedades autoinmunes.

La solución a dicho problema técnico se obtiene proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. 10

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un lisado que se puede obtener por un procedimiento que comprende las etapas de

(a) inducir necrosis de células NM-F9 (depósito DSMZ nº DSM Acc2606) o células NM-D4 (depósito DSMZ nº DSM Acc2605) a una temperatura de más de 41,2ºC durante al menos 15 minutos; y

(b) lisar dichas células tumorales necróticas para así obtener un lisado, en el que el lisado que 15 se puede obtener por dicho procedimiento es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral contra el antígeno TF.

Sorprendentemente, se ha encontrado que la inducción de necrosis mediante temperatura conduce a una mayor inmunogenicidad de los lisados de células tumorales tanto in vitro como in vivo. Fue incluso más sorprendente el descubrimiento de que los lisados de células tumorales que albergan 20 una gran cantidad de proteínas de choque térmico no son tan inmunógenas como los lisados de células tumorales que se generaban con el procedimiento de la invención, que albergaban una cantidad de proteínas de choque térmico comparable a la de los lisados de células tumorales de células tumorales no tratadas, es decir, no necróticas. Esto indica que la expresión de las proteínas de choque térmico no se correlaciona con el mayor efecto inmunógeno de los lisados según la invención. 25

Las células tumorales aplicadas para la producción del lisado celular de la presente invención, son células NM-F9 (depósito DSMZ nº Acc2606) o células NM-D4 (depósito DSMZ nº Acc2605). El término "NM-F9" (denominado también en el presente documento "F9" o “células F9 positivas para TF") o "NM-D4" significa líneas celulares o células derivadas de la línea celular de leucemia mieloide humana K562 (ATCC: CCL-243). NM-F9 y NM-D4 se depositaron en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen 30 und Zellkulturen GmbH ("DSMZ") el 14 de agosto, 2003. El DSMZ está situado en Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania. El depósito DSMZ se hizo siguiendo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

Cuando se usa en el presente documento, la expresión “células tumorales” significa líneas 35 celulares o células que se pueden cultivar en condiciones de cultivo in vitro, o líneas de células tumorales y cultivos de células primarias, o células tumorales derivadas de tumor primario o secundario o metástasis, como se cita en el presente documento. Las células pueden ser de origen autólogo, alogénico, singénico o xenogénico, en relación con la persona, paciente o animal tratado y del mismo o diferentes tejidos, órganos u origen de las células en una especie (p. ej., en el caso del tratamiento o 40 prevención del cáncer, en relación con el tipo de cáncer tratado o prevenido). Las células tumorales usadas en el procedimiento también pueden ser mezclas de las células tumorales mencionadas antes.

En una realización preferida, estas células tumorales se pueden alterar por mutagénesis, infección con partículas patógenas, tal como virus, bacterias, hongos, parásitos o por procedimientos de manipulación genética, introduciendo nuevos antígenos o inmunógenos o partes de los mismos. En 45 particular, los antígenos o inmunógenos o partes de los mismos introducidos, pueden proceder de tumores o de enfermedades infecciosas o pueden estar relacionados con estas enfermedades.

Según la presente invención, la expresión “células tumorales necróticas” significa una población de células que contiene al menos 15% de células necróticas, determinado, por ejemplo, por las técnicas mencionadas en el presente documento más adelante. 50

Cuando las células tumorales se obtienen de tumores o metástasis, incluyendo también micrometástasis, se pueden obtener, por ejemplo, por cirugía, biopsia o similares.

Las células tumorales se pueden obtener de cualquier tipo posible de tumor. Los ejemplos son carcinomas de piel, mama, cerebro, cuello uterino, carcinomas de testículo, cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema genitourinario, sistema ginecológico, mama, sistema 55 endocrino, piel, en la infancia, de sitio primario desconocido o metastásico, un sarcoma de tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, un neoplasma del sistema nervioso central, un linfoma, una leucemia, un síndrome paraneoplásico, una carcinomastosis peritoneal, un tumor maligno relacionado con inmunosupresión y/o cáncer metastásico. Las células tumorales pueden obtenerse, por ejemplo, de: cabeza y cuello, que comprenden tumores de la cavidad nasal, senos paranasales, nasofaringe, cavidad oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, glándulas salivares y paragangliomas, un cáncer de pulmón, que 5 comprende cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, un cáncer de mediastino, un cáncer del tracto gastrointestinal, que comprende cáncer de esófago, estómago, páncreas, hígado, árbol biliar, intestino delgado, colon, recto y región anal, un cáncer del sistema genitourinario, que comprende cáncer de riñón, uretra, vejiga, próstata, uretra, pene y testículos, un cáncer ginecológico, que comprende cáncer de cuello uterino, vagina, vulva, cuerpo uterino, 10 enfermedades trofoblásticas gestacionales, ovario, trompas de Falopio, peritoneal, un cáncer de mama, un cáncer del sistema endocrino, que comprende un tumor del tiroides, paratiroides, corteza suprarrenal, tumores endocrinos pancreáticos, tumores carcinoides y síndrome carcinoide, neoplasias endocrinas múltiples, un sarcoma del tejido blando y hueso, un mesotelioma, un cáncer de piel, un melanoma, que comprende melanomas cutáneos y melanomas intraoculares, un neoplasma del sistema nervioso central, 15 un cáncer en la infancia, que comprende retinoblastoma, tumor de Wilms, neurofibromatosis, neuroblastoma, tumores de la familia del sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma, un linfoma, que comprende linfomas de no Hodgkin, linfomas de linfocitos T cutáneos, linfoma del sistema nervioso central primario, y enfermedad de Hodgking, una leucemia, que comprende leucemias agudas, leucemias mieloides crónicas y linfocíticas, neoplasmas de células del plasma y síndromes mielodisplásicos, un 20 síndrome paraneoplásico, un cáncer de sitio primario desconocido, una carcinomatosis peritoneal, un tumor maligno relacionado con inmunosupresión, que comprende tumores malignos relacionados con el SIDA, que comprenden sarcoma de Kaposi, linfomas asociados con el SIDA, linfoma del sistema nervioso central primario asociado con el SIDA, enfermedad de Hodgking asociada con el SIDA y cánceres anogenitales asociados con el SIDA, y tumores malignos relacionados con trasplantes, un 25 cáncer metastásico del hígado, cáncer metastásico del hueso, efusiones pleurales y pericárdicas malignas y ascitis maligna. Se prefiere mucho más que dicho cáncer o enfermedad tumoral sea cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema genitourinario, sistema ginecológico, mama, sistema endocrino, piel, en la infancia, cáncer metastásico o de sitio primario desconocido, un sarcoma del tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, un neoplasma del 30 sistema nervioso central, una carcinomatosis peritoneal, un tumor maligno relacionado con inmunosupresión y/o cáncer metastásico. Por consiguiente, la expresión “célula tumoral” cuando se usa en el presente documento, incluye en particular una célula afectada por una cualquiera de las afecciones identificadas antes, peso no se limita a las afecciones mencionadas.

Las células tumorales se proporcionan en la etapa (a) del procedimiento según la invención, en 35 una forma que permite inducir necrosis mediante temperatura.

Las células tumorales pueden estar en cualquier estado o forma, que permita inducir necrosis. Pueden estar, p. ej., en forma de material reciente o se pueden haber recogido de material previamente congelado. En una realización preferida, el material previamente congelado en forma de células tumorales se descongela completamente y se cultiva. Si se usa material de tumor, preferiblemente es 40 material que ya se ha tratado mecánica y/o enzimáticamente para así proporcionar trozos de tejido más pequeños y/o células separadas.

Las células o trozos de tejido resultantes después se tratan mediante temperatura con el fin de inducir necrosis o se cultivan in vitro durante un tiempo adecuado.

En el contexto de la presente invención, el término “necrosis” significa cambios morfológicos en 45 las células. La necrosis se caracteriza, entre otras cosas, por ejemplo por la “pérdida” de la membrana celular, es decir, una mayor permeabilidad que también conduce a una salida del contenido de las células y una entrada de sustancias que perturban la homeostasis y equilibrio iónico de la célula, fragmentación del ADN, y finalmente, a la generación de estructuras granulares que se originan a partir de células colapsadas, es decir, residuos celulares. Normalmente, la necrosis da como resultado la 50 secreción de proteínas en los alrededores, lo cual, cuando ocurre in vivo, conduce a una respuesta proinflamatoria.

Los procedimientos para determinar si una célula es necrótica o no son conocidos en la técnica anterior y también se describen en los ejemplos del presente documento. No es importante qué procedimiento escoge el experto en la materia, puesto que se conocen diferentes procedimientos. 55

Sin embargo, es importante distinguir entre una célula apoptótica que sufre la llamada muerte celular programada y una célula necrótica. Las células necróticas según la presente invención se pueden determinar, p. ej., por técnicas de microscopía óptica, de fluorescencia o electrónica, usando, p. ej, la tinción clásica con azul de tripán, mediante la cual las células necróticas absorben el colorante azul, y por lo tanto, se tiñen de azul, o se pueden distinguir las células necróticas mediante cambios morfológicos, 60 que incluyen pérdida de la integridad de la membrana, disgregación de orgánulos y/o floculación de cromatina. Otros procedimientos incluyen la citometría de flujo, p. ej., por tinción de células necróticas con yoduro de propidio. La tinción con yoduro de propidio preferida se describe con detalle en los ejemplos del presente documento. Las células apoptóticas se pueden determinar, p. ej, por procedimientos de citometría de flujo, p. ej., llevada a cabo con Anexina V-FITC, con el fluorocromo: Flura-red, Quin-2, con 7-amino-actinomicina D (7-AAD), disminución de la acumulación de rodamina 123, 5 detección de la fragmentación del ADN por endonucleasas: procedimiento del TUNEL (desoxinucleotidil transferasa terminal producido por marcaje de mella X-UTP), por microscopía óptica tiñendo con el colorante Hoechst 33258, por análisis de transferencia Western, p. ej., por detección de la actividad de caspasa 3 marcando el producto de 89kDa con un anticuerpo específico o detectando el eflujo de citocromo C mediante marcaje con un anticuerpo específico, o mediante análisis de ADN en gel de 10 agarosa detectando la fragmentación de ADN característica mediante una escala de ADN específica.

Las tecnologías preferidas se describen con detalle en los ejemplos del presente documento, y son la tinción con yoduro de propidio para células necróticas y la tinción con anexina para células apoptóticas, de modo que las células apoptóticas sólo se tiñen con anexina V y las células necróticas se tiñen con yoduro de propidio y anexina V (Vermes (1995), J. Immun. Meth. 184, 39-51). Esta citometría 15 de flujo permite las mediciones cualitativas y cuantitativas rápidas y fáciles.

Preferiblemente, la necrosis se determina por citometría de flujo, y es incluso más preferida la citometría de flujo usando la tinción con anexina V/yoduro de propidio y el más preferido es el procedimiento como se describe en los ejemplos de la presente invención.

La expresión “inducir necrosis mediante temperatura” en el contexto de la presente invención 20 significa que en un porcentaje de al menos 15%, preferiblemente en más de 40% y en el presente documento se prefiere al menos 70% de las células de la población de células de las células tumorales cambia dando como resultado la necrosis.

Los procedimientos para medir dicha temperatura, que se usa para inducir necrosis, son conocidos por el experto en la materia. Preferiblemente, dicha temperatura se puede medir por medios 25 físicos. Dichos medios físicos son preferiblemente un termómetro óptico, mecánico o eléctrico, en el que se entiende que la fluctuación física normal en la medición de la temperatura debida a errores en la medición o inercia física de los medios, están en un intervalo aceptable de tolerancias de medición. Lo más preferiblemente, dichos medios físicos para medir las temperaturas han sido incorporados por el proveedor en el medio o en el aparato usado para la inducción térmica. Sin embargo, se prefiere también 30 que la temperatura se pueda medir directamente en la muestra de las células tumorales que sufren la inducción con temperatura.

La temperatura para inducir la necrosis en las células se puede aplicar a las células mediante medios y procedimientos conocidos para el experto en la materia. Los posibles procedimientos son, p. ej., la incubación en aire o agua calentados o irradiación. Los medios adecuados son, p. ej., bloques 35 térmicos, calentadores térmicos, incubadores de baños de agua, rodillos de caletamiento y similares.

Se encontró sorprendentemente, que los lisados de células producidos a partir de células tumorales de la presente invención en las que se había inducido la necrosis mediante temperatura como se describe en el presente documento, son superiores a los de la técnica anterior, puesto que su inmunogenicidad es significativamente mayor. 40

Es importante indicar que los lisados de células necróticas consisten en poblaciones de células con los porcentajes mencionados de células necróticas relevantes, como se ha definido antes, mientras que los lisados celulares que se denominan a veces en la bibliografía lisados de células necróticas y que corresponden a células lisadas directamente sin inducción de necrosis mediante congelación/descongelación rápidas, en los ejemplos del presente documento se denominan células no 45 tratadas o lisados de células no tratadas.

Según la presente invención, el término “lisar” se refiere a diferentes procedimientos conocidos en la materia para abrir/destruir células. El procedimiento para lisar una célula no es importante y se puede usar cualquier procedimiento que logre la lisis de las células tumorales. El adecuado lo puede escoger el experto en la materia, p. ej., la apertura/destrucción de células se pueden hacer enzimática, 50 química o físicamente. Los ejemplos no limitantes de enzimas y cócteles de enzimas son proteasas, tales como proteinasa K, lipasa o glicosidasas; los ejemplos no limitantes de productos químicos son ionóforos, como nigromicina, detergentes, como dodecilsulfato sódico, ácidos o bases; y los ejemplos no limitantes de medios físicos son presión alta, como prensa de French, osmolaridad, temperatura, como calor o frío. Además, también se puede usar un procedimiento que usa una combinación adecuada de 55 una enzima distinta de la enzima proteolítica, un ácido, una base y similares.

Según la presente invención, el término “lisado” significa una disolución o suspensión en un medio acuoso de células que están rotas. Sin embargo, el término no debe considerarse de ninguna forma limitante. El lisado de células comprende, p. ej., macromoléculas, como ADN, ARN, proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos y similares y/o micromoléculas, como aminoácidos, azúcares, ácidos lipídicos y similares, o fracciones de los mismos. Además, dicho lisado comprende restos celulares que pueden ser de estructura lisa o granular. Los detalles de las preparaciones se describen específicamente en los ejemplos de la presente memoria descriptiva. Por consiguiente, los expertos en la materia pueden preparar los lisados deseados, por referencia a las explicaciones generales anteriores y 5 explicaciones específicas en los ejemplos, y modificando o alterando de forma adecuada esos procedimientos, si es necesario. Preferiblemente, dicho medio acuoso es agua, disolución salina fisiológica, o una disolución tampón, de modo que no se pueda observar ninguna masa sólida sin la ayuda de medios ópticos, y que los sistemas dispersos puedan ser fagocitados por las células presentadoras de antígeno. Una ventaja del lisado de células tumorales que se puede obtener por el 10 procedimiento de la presente invención, es que se puede producir fácilmente como se describe en los ejemplos adjuntos y almacenar de forma barata, ya que se necesitan menos instalaciones técnicas.

Sin embargo, dicho lisado no está limitado a células necróticas, puesto que, por ejemplo, debido a la diferente sensibilidad de las células tratadas o debido a las condiciones aplicadas para la inducción mediante temperatura de las células, las células apoptóticas también pueden formar parte de la 15 población de células a partir de las cuales se obtiene el lisado. No obstante, las células necróticas deben ser al menos 15% de la población de células, preferiblemente más de 40%, en particular más de 70%. La determinación de los porcentajes puede variar de un experimento a otro, debido a las imprecisiones de la medición que se produce en la tecnología de citometría de flujo y la posibilidad de las diferentes interpretaciones de los datos y ajuste de las puertas. Por consiguiente, se puede producir una desviación 20 de 10%, preferiblemente de 5% y más preferiblemente de 1%, si se usa un procedimiento distinto del descrito específicamente en los ejemplos.

Preferiblemente, las células tumorales se lisan por congelación y descongelación, más preferiblemente se congelan a temperaturas inferiores a -70ºC y se descongelan a temperaturas de más de 30º, en particular se prefieren la congelación a temperaturas inferiores a -75ºC y la descongelación se 25 prefiere a temperaturas de más de 35ºC y se prefieren más temperaturas para la congelación inferiores a -80ºC y temperaturas para la descongelación superiores a 37ºC. También se prefiere que dicha congelación/descongelación se repita durante al menos 1 vez, más preferiblemente durante al menos 2 veces, incluso más preferiblemente durante al menos 3 veces, en particular se prefiere durante al menos 4 veces y los más preferiblemente durante al menos 5 veces. 30

Según la invención, los lisados también son preparaciones de fracciones de moléculas de los lisados mencionados antes. Estas fracciones se pueden obtener por procedimientos conocidos para los expertos en la materia, p. ej., cromatografía, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de fase inversa y cromatografía con otro material cromatográfico en columna o procedimientos de lotes, otros 35 procedimientos de fraccionamiento, p. ej., procedimientos de filtración, p. ej., ultrafiltración, diálisis, diálisis y concentración con exclusión por tamaños en centrifugación, centrifugación en gradientes de densidad o matrices por pasos, precipitación, p. ej. precipitaciones por afinidad, solubilización por adición de sal o precipitación por adición de sal (precipitación por sulfato amónico), precipitaciones con alcoholes u otros productos químicos proteínicos, procedimientos de biología molecular, bioquímicos, 40 inmunológicos, químicos o físicos para separar los componentes anteriores de los lisados. En una realización preferida, se prefieren aquellas fracciones que son más inmunógenas que otras. Los expertos en la técnica pueden elegir un procedimiento adecuado y determinar su potencial inmunógeno en relación con las explicaciones generales anteriores y explicaciones específicas en los ejemplos del presente documento y alterar o modificar de forma adecuada estos procedimientos, si es necesario. 45

La inducción de necrosis mediante temperatura según la etapa (a) del procedimiento según la invención, se logra preferiblemente por incubación de las células tumorales a una temperatura que es superior a la temperatura media del cuerpo del organismo del que se obtienen las células, es decir a una temperatura de más de 41,2ºC.

Se prefiere que la temperatura se elija de modo que aunque se induzca la necrosis, no se 50 induzca o aumente poco la expresión de hsp70. Por que “aumente poco”, se entiende un aumento de preferiblemente no más de un factor de 2. La temperatura correspondiente puede depender del tipo de célula específica usada, pero la puede determinar fácilmente el experto en la materia mediante experimentación rutinaria, p. ej., incubando las correspondientes células a diferentes temperaturas y determinando la cantidad de células necróticas y el nivel de expresión de hsp70 a diferentes 55 temperaturas usando procedimientos como los que se muestran en los ejemplos en el presente documento.

En una realización incluso más preferida, las células tumorales se incuban a una temperatura de más de 42ºC, más preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 45 a 55ºC, incluso más preferido en el intervalo de 45,5 a 47ºC. En una realización más preferida, las células se incuban a una 60 temperatura en el intervalo de 46,0 a 46,4ºC, en particular a aproximadamente 46,2ºC.

Como se muestra en los ejemplos del presente documento, las temperaturas de aproximadamente 46,2ºC usadas para inducir necrosis conducen a una cantidad sorprendentemente alta de células necróticas y a un aumento inesperadamente alto de inmunogenicidad.

Además, se demuestra en los ejemplos del presente documento, que los lisados de células tumorales producidos a partir de las células tumorales en las que se ha inducido la necrosis mediante 5 una temperatura de aproximadamente 46,2ºC, también tienen efectos sorprendentes in vivo. También se lograron resultados comparables con lisados de células de la misma línea celular inducidas a 46ºC.

En particular, los ratones inmunizados con los lisados de células tumorales de la presente invención, mostraron reacciones inmunitarias frente a los antígenos presentados en las células tumorales usadas para la producción de lisados celulares. Dichos ratones desarrollaron anticuerpos del tipo IgG 10 que sólo pueden ser producidos si ha ocurrido un llamado cambio de clase. Dicho cambio de clase sólo es posible si son inducidas linfocitos T cooperadores en la respuesta inmunitaria contra los antígenos. Además, también se encontró sorprendentemente que los ratones inmunizados desarrollaron dichos anticuerpos de tipo IgG contra antígenos hidratos de carbono, para los cuales los ratones hasta ahora sólo habían desarrollado anticuerpos de tipo IgM. Sin embargo, los anticuerpos de tipo IgM se pueden 15 producir sin un cambio de clase, lo que significa que los linfocitos T cooperadores no estaban implicadas. Por lo tanto, los lisados de células tumorales de la presente invención son ventajosos en relación con la inmunogenicidad y son favorables para la vacunación contra el cáncer, enfermedades tumorales, infecciones y/o enfermedades autoinmunes, puesto que producen una respuesta inmunitaria en la que sólo están implicadas células B y T. 20

La incubación de las células tumorales a una temperatura específica, se lleva a cabo durante un periodo de tiempo suficiente para inducir la necrosis y depende de la temperatura y los medios y procedimientos para producirla, es decir, durante al menos 15 minutos.

Más preferiblemente, la incubación dura al menos 1 hora, incluso más preferiblemente al menos 2 horas y en particular se prefiere al menos 3 horas. Más preferiblemente, entre 1,5 y 5 horas. La 25 incubación más preferida es entre 2 y 3 horas.

En principio no hay límite superior para el tiempo de incubación. Sin embargo, se prefiere que no sea más largo de 48, 36, 24,12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ó 4 horas.

En una realización preferida ventajosa, las células necróticas se lisan directamente después de la inducción de necrosis por temperatura. 30

En una realización preferida, las células necróticas obtenidas después de la etapa (a) del procedimiento según la invención, se incuban más antes de la lisis de las mismas. Como se muestra en los ejemplos del presente documento, está incubación adicional también influye en la cantidad y la inmunogenicidad de las células necróticas. Se prefiere realizar dicha incubación adicional a una temperatura de más de 35ºC, incluso más preferiblemente a una temperatura de más de 36ºC, se 35 prefiere en particular una temperatura de aproximadamente 37ºC. Se prefiere que el tiempo para esta incubación adicional sea al menos 1 hora, más preferiblemente que sea al menos 2 horas, incluso más preferido que sea al menos 3 horas, se prefiere en particular que sea al menos 6 horas, incluso en particular se prefiere más que sea al menos 12 horas y lo más preferido que sea al menos 22 horas.

En una realización preferida de la invención, se contempla que en el procedimiento de la 40 presente invención más de 15% de dichas células tumorales inducidas son necróticas.

Como se ha mencionado antes, debido, por ejemplo, a la diferente sensibilidad de las células tratadas, debido a las condiciones aplicadas para la inducción por temperatura de las células o debido a las diferentes condiciones de cultivo, las células tumorales que consisten en una población de células que también comprende células apoptóticas que posteriormente se lisan junto con las otras células de la 45 población, también comprenden las células necróticas según el procedimiento descrito.

Con el fin de obtener una inmunogenicidad eficaz, es conveniente obtener un determinado porcentaje de células necróticas en el lisado. Por consiguiente, el procedimiento se diseña de modo que dé como resultado más de 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 94, 96, 98, 99% de las células tumorales inducidas por temperatura sean necróticas. 50 Más preferiblemente, más de 40% o 70% de dichas células tumorales son necróticas. Hay que indicar que la cantidad de células necróticas también puede depender de la temperatura, el tiempo y el tiempo de regeneración después de inducir la necrosis mediante temperatura como se demuestra en los ejemplos del presente documento, así como del tipo y fuente de las células tumorales.

Las células tumorales usadas en el procedimiento según la invención pueden ser genéticamente 55 manipuladas, mutadas o infectadas por virus oncogénicos.

La expresión “manipuladas genéticamente” se usa en su sentido más amplio para los procedimientos conocidos por los expertos en la materia para modificar los ácidos nucleicos deseados in vitro e in vivo, de modo que se realicen modificaciones genéticas y se alteren los genes mediante tecnología de ADN recombinante. Por consiguiente, se prefiere que dichos procedimientos comprendan clonación, secuenciación y transformación de ácidos nucleicos recombinantes. Para este propósito se pueden usar vectores, cebadores, enzimas, células huésped adecuados, y similares, y son conocidos 5 para los expertos en la materia. Preferiblemente, las células tumorales manipuladas genéticamente comprenden células que albergan ácidos nucleicos recombinantes que codifican antígenos o inmunógenos o partes de los mismos, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y similares. Los antígenos e inmunógenos pueden ser, por ejemplo, uno o más antígenos tumorales o partes de los mismos, antígenos de microorganismos infecciosos o parásitos tales como bacterias, hongos, virus y 10 similares. Además, entre los inmunógenos están, por ejemplo, las moléculas que aumentan la inmunogenicidad, tales como los epítopos de linfocitos T o multímeros de las mismas, como epítopos PADRE, o fragmentos del toxoide tetánico que provocan un efecto inmunoestimulador adicional por activación de los procedimientos mediados por MHC de clase II.

También se contemplan las células tumorales manipuladas genéticamente con ácidos nucleicos 15 que codifican moléculas efectoras, tales como factores de transcripción, componentes de las rutas de transducción de señales o cascadas de señalización, o citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y similares, que pueden modular directa o indirectamente la expresión de moléculas endógenas, p. ej., ácidos nucleicos, polipéptidos, polipéptidos y lípidos modificados postraduccionalmente y similares. Más preferiblemente, las células tumorales son transfectadas de forma transitoria o estable con una molécula 20 de ácido nucleico deseada.

También se contempla que las células tumorales se manipulen genéticamente para así expresar un polipéptido contra el que se producirán anticuerpos. Si los lisados celulares de estas células tumorales se producen y se administran a un individuo, se espera que los individuos desarrollen una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, preferiblemente esta respuesta inmunitaria comprende 25 respuestas de anticuerpos y/o respuestas de linfocitos T cooperadores y/o respuestas de linfocitos T citotóxicas.

El término “mutado” significa una modificación o modificaciones permanentes de material genético, es decir ácidos nucleicos, causadas, por ejemplo, de forma natural o por medios físicos o compuestos/sustancias/agentes químicos. Dichas modificaciones incluyen mutaciones puntuales, tales 30 como transiciones o transversiones, delección/inserción/adición de una o más bases en un ácido nucleico/gen/cromosoma, de modo que se modifique el ácido nucleico/gen/cromosoma que puede producir, entre otros, expresión/transcripción/traducción de genes aberrantes o productos génicos inactivos, productos génicos constitutivos activos/inactivos que conducen, p. ej., a efectos negativos dominantes. Por lo tanto, también se prefiere que las células tumorales comprendan células que 35 alberguen una mutación o mutaciones en un gen o genes deseados o en las que la o las mutaciones en el o los genes deseados sean inducidas por procedimientos conocidos para el experto en la materia. También se sabe de la técnica anterior que las células mutadas o genéticamente manipuladas se pueden seleccionar por cualquier procedimiento/fenotipo adecuado.

El término “infectada” significa células que han sido infectadas con un virus o viroide, y/o 40 estructura proteica. Dicho virus o viroide, y/o estructura proteica también se puede usar como un vehículo para la manipulación genética de dichas células. Se prefiere que dicho virus que infecta células tumorales sea un virus oncogénico, sin embargo, no se limita a virus oncogénicos. Más preferiblemente, dicho virus oncogénico se selecciona del grupo que consiste en retrovirus o virus de ADN, p. ej. papovavirus tales como los virus del papiloma humano (VPH), oncovirus de tipo C, virus de leucemia de 45 linfocitos T humano (VLLT), virus del herpes, tales como virus de Epstein-Barr (VEB), hepadnavirus, como el virus de la hepatitis B (VHB), y lentivirus, como el virus de deficiencia humana (VIH). También se prefiere que las células tumorales ya estén infectadas con uno cualquiera de los virus mencionados antes. Además las células tumorales infectadas o los lisados de las mismas pueden ser importantes cuando se usan para la vacunación profiláctica/terapéutica contra enfermedades infecciosas causadas 50 por ejemplo por virus tales como VIH, VHB, virus de la hepatitis C (VHC), VPH. Preferiblemente, el o los componentes infecciosos comprendidos por los lisados producidos a partir de estas células infectadas deben ser inactivados adicionalmente. Los procedimientos que se usan son conocidos para los expertos en la materia, p.ej., inactivación térmica, inactivación por ácido y/o filtración estéril, o similares.

Las células tumorales pueden ser autólogas. 55

En el contexto de la presente invención, el término “autólogo” significa que las células tumorales derivan del mismo individuo al que más tarde se administrará el lisado resultante del procedimiento según la invención. Una ventaja del uso de células del tumor autólogo, es que hay una gran variedad de antígenos relevantes y adecuados en el lisado para tratar cánceres o enfermedades tumorales del individuo o prevenir su recurrencia o recaída. 60

Las células tumorales pueden ser alogénicas. En el contexto de la presente invención, el término “alogénico” significa que las células tumorales derivan de un individuo que es diferente del individuo al que más tarde se va a administrar el lisado resultante del procedimiento según la presente invención. Una realización adicional preferida del presente documento de las células tumorales alogénicas para usar en un cuadro alogénico, son células tumorales de un paciente, o células procedentes de esas células, que se usaron satisfactoriamente para la inmunización del último paciente 5 en un cuadro autólogo dando como resultado una reducción parcial o completa de la carga tumoral.

En el contexto de la presente invención, la expresión “células tumorales alogénicas” comprende además líneas celulares, incluyendo, p. ej., líneas de células tumorales, o líneas celulares o cultivos de material primario y similares, que no proceden del individuo al que se administrará el lisado. La ventaja de las células tumorales alogénicas es que los antígenos o inmunógenos no son compartidos con los 10 cánceres o enfermedades tumorales que se van a tratar o prevenir, dando como resultado una respuesta inmunitaria que comprende una señal de peligro fuerte y/o respuesta auxiliar, que pueden ser favorables para superar anergias o tolerancias.

Las células tumorales pueden ser xenógenas. En el contexto de la presente invención el término “xenógeno” significa que las células tumorales comprenden células tumorales de tumores primarios o 15 secundarios o de metástasis, líneas celulares, p. ej., líneas de células tumorales, líneas de células inmortalizadas o líneas de células o cultivos de material primario y similar, que no proceden de la misma especie a la que más tarde se administrará el lisado.

Alternativamente, las células tumorales pueden ser alogénicas, autólogas o xenógenas y pueden ser de diferente fuente tisular o celular o la misma que los cánceres o tumores, p. ej., las células 20 tumorales de una línea de células tumorales de mamífero se usan para generar un lisado según el procedimiento de la invención, que se administra a un individuo para la profilaxis o el tratamiento de cánceres de colon o gástricos, o enfermedades tumorales, o un lisado según la invención de una línea de células de mieloma mutadas para usar en un individuo para la profilaxis o el tratamiento de carcinomas. Preferiblemente, estas líneas celulares tienen uno o más antígenos que son compartidos con los 25 cánceres o enfermedades tumorales que se van a tratar. La ventaja es una respuesta fuerte adicional contra antígenos o inmunógenos extraños a los cánceres o enfermedades tumorales que se van a tratar o prevenir, p. ej., antígenos específicos para la célula tumoral que no están compartidos con el cáncer o tumores que se van a tratar o prevenir, que comprenden una señal fuerte de peligro y/o respuesta auxiliar, que pueden ser favorables para superar anergias y/o tolerancias. En una realización preferida, 30 las células tumorales son, además, de una fuente alogénica que además puede tener una alorespuesta fuerte que puede ser además favorable para superar anergias y/o tolerancias.

Por ejemplo, el lisado se puede preparar a partir de células tumorales de diferentes tipos o se usan diferentes lisados preparados a partir de diferentes tipos de células tumorales en combinación para la administración a un individuo. 35

Por ejemplo, las células tumorales del lisado o la combinación de lisados pueden ser células tumorales alogénicas y autólogas. En concreto, son una mezcla de células tumorales del mismo tejido o fuente celular, y similares, junto con aquellas de tejido o fuente celular diferente, y similares. Es decir, p. ej., se puede usar un lisado celular de una línea de células de mieloma mutadas alogénicas con un lisado de células de cáncer de colon del individuo al que más tarde se administrará el o los lisados. La ventaja 40 es la combinación de grandes cantidades de antígenos compartidos del material autólogo con la parte alogénica, y por lo tanto, una respuesta auxiliar mayor y/o señales de peligro con el fin de romper las potenciales tolerancias y/o anergias de los cánceres o tumores. Otro ejemplo es la mezcla de la línea de células de mieloma alogénicas anteriores con otra línea de células de cáncer de colon o gástrico para la administración a un individuo, para tratar o prevenir el carcinoma de colon. La ventaja de esto último es la 45 posibilidad de generar una potente vacuna “de disponibilidad inmediata” con una mezcla de cantidades grandes de antígenos tumorales y una mayor respuesta auxiliar, respuesta alogénica y/o señales de peligro, con el fin de romper las potenciales tolerancias y/o anergias.

Las células tumorales se pueden mezclar antes de la inducción de la necrosis mediante inducción por temperatura o después de inducción pero antes de la lisis o después de la lisis. El experto 50 en la materia puede determinar cuál es favorable para el uso de producción, problemas de regulación, aplicación a un individuo y para los cánceres o enfermedades tumorales.

Los ejemplos de la presente invención demuestran que se puede usar tanto un sistema autólogo como alogénico para aumentar la inmunogenicidad. Como se ha descrito en lo que antecede, el procedimiento de la presente invención permite producir compuestos inmunógenos muy eficaces 55 mediante inducción de necrosis en las células tumorales y posterior lisis de las células. Los lisados de células tumorales obtenidos, se pueden usar para el tratamiento terapéutico o profiláctico del cáncer, enfermedades tumorales, infecciones y/o enfermedades autoinmunes.

En este contexto, la expresión “compuesto inmunógeno” significa compuestos que tienen la capacidad de producir reacciones inmunitarias de las células del sistema inmunitario como macrófagos, 60 células dendríticas, células de Langerhan, células B (B1 y B2) y/o linfocitos T (linfocitos T citótoxicas (Tc), linfocitos T cooperadores (ThO, Th1 y Th2)), células asesinas naturales (células NK), células con memoria y similares. Preferiblemente, la expresión “compuesto inmunógeno” significa compuestos que tienen la capacidad de producir respuesta inmunitaria humoral y/o celular, en la que están implicados al menos una de las células/grupos de células de células efectoras inmunes o productos celulares de 5 dichas células efectoras inmunes, por ejemplo una o más de las células mencionadas antes. El experto en la materia es consciente de los diferentes procedimientos para determinar si se ha producido una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de los procedimientos usados para este propósito se muestran en los ejemplos y son transferidos, cuando sea necesario, por los expertos en la materia para determinar la respuesta en un individuo o paciente tratado con los lisados según la invención. Además, otros 10 procedimientos conocidos en la materia pueden complementar estas técnicas. En general, un compuesto inmunógeno conduce a una respuesta inmunitaria que comprende respuestas humorales y/o celulares, que normalmente comprenden que los genes o productos génicos que afectan al nivel de respuestas inmunitarias sean expresados/activados, p. ej., los de clase del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) I y II, los de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos, los de miembros de la superfamilia de 15 inmunoglobulinas, los de compuestos receptores/receptores de linfocitos T, los de citocinas o los de cascadas de transducción de señales implicados en la transmisión de respuestas inmunitarias.

Como se ha mencionado antes, la presente invención también se refiere a un lisado que se puede obtener por el procedimiento según la presente invención y a células dendríticas cargadas con dicho lisado.

Además, la presente invención también se refiere a una composición que comprende un lisado o 20 células dendríticas según la presente invención.

En una realización preferida, dicha composición es una composición farmacéutica. Según la presente invención, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a composiciones que comprenden los lisados de células descritos en lo que antecede que se pueden obtener por los procedimientos mencionados antes y que tienen la actividad farmacológica deseada. Dichas composiciones farmacéuticas 25 comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de los lisados celulares de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se puede administrar con un vehículo fisiológicamente aceptable a un paciente, como se describe en el presente documento. En una realización específica, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por la agencia reguladora u otra farmacopea generalmente reconocida para usar en animales, y más en particular en seres humanos. El 30 término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen del petróleo, animal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden usar disoluciones salinas y disoluciones 35 acuosas de glicerol y dextrosa como vehículos líquidos, en particular para disoluciones inyectables. Dichos excipientes farmacéuticos aceptables incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes 40 del pH. Estas composiciones pueden tener forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y similares. La composición se puede formular en forma de supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico, etc. Los ejemplos de 45 vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del lisado celular, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe ser adecuada para el modo de administración. 50

En otra realización preferida, la composición se formula según los procedimientos rutinarios, como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para la administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico y estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección. En general, los 55 ingredientes se suministran por separado o mezclados entre sí en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua, en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o sobres que indican la cantidad de principio activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o disolución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra por inyección, 60 se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o disolución salina, de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración. El lisado celular de la invención se puede formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y las formadas con cationes tales como los obtenidos de hidróxidos sódico, potásico, amónico, de calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

La cantidad del lisado celular de la invención que será eficaz en el tratamiento o prevención (en particular por vacunación) de cánceres, tumores y/o enfermedades tumorales, se puede determinar por 5 técnicas clínicas estándar. Además, se pueden usar opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta que se va a usar en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar de las curvas de dosis-respuesta obtenidas de sistemas de ensayo de modelos in vitro o animales. 10

En otra realización preferida, la composición es una composición de vacuna.

Según la presente invención, la expresión “composición de vacuna” se refiere a cualquier composición que se pueda usar como una vacuna.

Las formas o procedimientos para fabricar composiciones de vacunas según la presente invención no están particularmente limitadas, y una composición en una forma deseada se pueden preparar aplicando 15 un único procedimiento disponible en el campo de la técnica, o procedimientos en una combinación adecuada. Para la fabricación de una composición de vacuna, se pueden usar medios acuosos, tales como agua destilada para inyección y disolución salina fisiológica, así como uno o más tipos de aditivos farmacéuticos disponibles en el campo de la técnica. Por ejemplo, se pueden usar agentes de tamponamiento, agentes de ajuste del pH, ayudantes de solubilización, agentes estabilizantes, agentes 20 calmantes, antisépticos y similares, y los ingredientes específicos de los mismos son bien conocidos para el experto en la materia. La composición de vacuna también se puede preparar en forma de una preparación sólida tal como una preparación liofilizada, y después preparar como una inyección añadiendo antes de usar un agente solubilizante tal como agua destilada para inyección. Dependiendo de la forma de introducción, los compuestos se pueden formular en una variedad de formas como se discute a continuación. La 25 concentración de compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar de aproximadamente 0,1 a 100% en peso. La composición de vacuna se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, es decir, radiación u otros agentes quimioterapéuticos o agentes anticancerígenos.

En una realización preferida, las composiciones de vacunas están en una forma soluble en agua, tal como sales farmacéuticamente aceptables, que se entiende que incluye sales de adición tanto de ácidos 30 como bases.

Las composiciones de vacunas se pueden preparar en diferentes formas, tales como disoluciones para inyección, comprimidos, píldoras, supositorios, cápsulas, suspensiones, y similares. Se pueden usar vehículos y/o diluyentes orgánicos o inorgánicos de calidad farmacéutica, para el uso oral y tópico para hacer composiciones que contienen los compuestos terapéuticamente activos. Los diluyentes conocidos en 35 la técnica incluyen medios acuosos, aceites y grasas animales y vegetales. Se pueden usar como agentes auxiliares agentes de estabilización, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la presión osmótica o tampones para asegurar un valor de pH adecuado, y potenciadores de penetración en la piel. Las composiciones de vacunas también pueden incluir uno o más de los siguientes: proteínas vehículo tales como albúmina de suero; tampones; cargas tales como celulosa microcristalina, lactosa, almidones de maíz 40 y otros; agentes aglutinantes; edulcorantes y otros agentes de sabor; agentes colorantes y polietilenglicol. Los aditivos son conocidos en la materia y se usan en una variedad de formulaciones.

Se puede usar una composición de vacuna según la presente invención para la inmunización contra el cáncer, enfermedades tumorales, enfermedades autoinmunes y/o enfermedades infecciosas.

En otra realización preferida, la composición según la presente invención, en particular la 45 composición de vacuna, se combina opcionalmente con un adyuvante o células dendríticas.

Según la presente invención, “células dendríticas” se refiere a células presentadoras de antígeno profesionales que capturan antígenos y migran a los nódulos linfáticos y bazo, donde son particularmente activas en la presentación del antígeno procesado a linfocitos T. La expresión “células dendríticas” también significa células que tienen una actividad y función similares a las células dendríticas. Las células dendríticas 50 se pueden obtener de linajes de linfoides o fagocitos mononucleares. Dichas células dendríticas se pueden encontrar en tejido linfático y no linfático. Parece que éste último induce una respuesta de linfocitos T solo cuando es activado y ha migrado a tejidos linfáticos.

Se sabe que las células dendríticas son o están entre los activadores y reguladores más potentes de respuestas inmunitarias. Una característica importante es que actualmente son las únicas células 55 presentadoras de antígeno que se sabe que estimulan linfocitos T no expuestos anteriormente. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por su capacidad para absorber y procesar antígenos, una función que se reduce notablemente en células dendríticas maduras, las cuales a su vez muestran una presentación potenciada de antígenos procesados en su superficie, unidos principalmente a moléculas MHC de clase I y clase II. La maduración también está asociada con la regulación positiva de moléculas coestimuladoras (tales como CD40, CD80 y CD86), así como determinadas otras proteínas de superficie celular (p. ej., CD83 y DC-Sign). La maduración de las células dendríticas normalmente también está asociada con la capacidad de migración potenciada, dando como resultado (in vivo) la migración de las células dendríticas a los 5 nódulos linfáticos regionales, donde las células dendríticas encuentran linfocitos T y B. Las células dendríticas se pueden obtener de individuos usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia, y que se describen con mayor detalle en los ejemplos del presente documento. Además, según la invención, las células dendríticas también son las células o líneas celulares que presentan características funcionales y/o fenotípicas comparables como células dendríticas, p. ej., células derivadas de MUTZ-3. 10

Las células dendríticas o sus precursores se diferencian usando factores de crecimiento adecuados y/o citocinas, p. ej., GM-CSF e IL-4, como se muestra en los ejemplos del presente documento, las células dendríticas inmaduras resultantes se cargan con un lisado según la invención. Las DC inmaduras (iDC) cargadas con un lisado según la invención se maduran más hasta DC maduras (mDC). En casos especiales las mDC pueden cargarse (pulsadas) con antígenos o inmunógenos del lisado. Las 15 composiciones de vacunas o composiciones farmacéuticas para prevenir o tratar cánceres, enfermedades tumorales y/o enfermedades infecciosas comprenden preferiblemente DCm cargadas, que proceden de iDC cargadas y maduras o que se han cargado después o durante la maduración. Las composiciones de vacunas para enfermedades autoinmunes comprenden preferiblemente iDC cargadas que preferiblemente son detenidas transitoriamente o establemente en el estado de iDC, usando procedimientos conocidos para 20 el experto en la materia.

En una realización preferida de la invención, el tratamiento o prevención de los cánceres y/o enfermedades tumorales, combina dosificaciones que comprenden un lisado según la invención cargado en células dendríticas, con dosificaciones que comprenden solo un lisado según la invención. La ventaja es combinar la carga ex vivo de células dendríticas autólogas y alogénicas con la “carga” in vivo de células 25 dendríticas que se produce por la administración del lisado a un individuo. Así, pueden ser preferibles diferentes rutas de aplicación. Se prefiere la administración de células dendríticas directamente a los nódulos linfáticos u otras zonas con contacto directo con las células inmunitarias importantes que se van a estimular mediante las células dendríticas. Se prefiere a administración del lisado por vía intradérmica, subcutánea o intrarrectal a los parches de Payers u otras zonas, cuando las células dendríticas o sus 30 precursores están localizados y preferiblemente concentrados.

Otra realización preferida de la invención son las composiciones de vacunas o composiciones farmacéuticas que comprenden un lisado según la invención cargado en células dendríticas adecuadas y adyuvantes o factores coestimuladores para la potenciación de la acción de las células dendríticas, p. ej., GM-CSF, interleucinas. 35

Con respecto a la presente invención, el término “adyuvante” significa que se puede modificar la capacidad natural de un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria, y en particular potenciarla alterando o mezclando o cargado en células dendríticas descritas en lo que antecede con otra sustancia. El término “adyuvante” también significa que las células tumorales a partir de las cuales se generan los lisados y/o las células dendríticas, están genéticamente modificadas con el fin de expresar adyuvantes u otros 40 factores que influyen en la respuesta inmunitaria, como por ejemplo factores coestimuladores. El procedimiento o la sustancia usada para potenciar respuestas inmunitarias se llaman un adyuvante. Durante mucho tiempo se han usado al menos tres clases de adyuvantes; son las emulsiones de aceite mineral, compuestos de aluminio y materiales tensioactivos tales como saponina, lisolecitina, retinal, Quil A. RTM., algunos liposomas, y formulaciones de polímero plurónicos. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, 45 editado por William E. Paul, en la pág. 1008, Raven Press, New York (este libro se denominará en lo sucesivo "Fundamental Immunology"). Los adyuvantes de aluminio usados solos o en combinación incluyen gel de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio y alumbres que comprenden alumbre de amonio (tal como (NH4)2 SO4.Al2 (SO4)3) y alumbre de potasio. El hidróxido de aluminio (en los sucesivo “AL”) es uno de los adyuvantes más antiguos y se considera tan seguro que se ha aplicado en vacunas 50 bacterianas y víricas a millones de personas en todo el mundo. El gel de fosfato de calcio (en los sucesivo “CP”) tiene propiedades similares y también se usa en las vacunas. Ambas sustancias están disponibles en calidades farmacéuticas en la mayoría de los países del mundo. Las técnicas para preparar preparaciones de antígeno-adyuvante para inyección son conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Terry M. Phillips, Analytical Techniques in Immunochemistry, pág. 307-10, Marcel Dekker, New York, 1992. Otros adyuvantes 55 incluyen adyuvante completo de Freund (una emulsión de agua en aceite en la que se suspenden en la fase de aceite micobacterias, normalmente M tuberculosis, muertas y secadas); adyuvante incompleto de Freund (análogo al adyuvante completo de Freund sin micobacterias); ISCOM (o complejo inmunoestimulante, que comprende partículas lipófilas formadas por la asociación espontánea de colesterol, fosfolípido y la saponina Quil A. RTM.; lipopolisacáridos (moléculas complejas que consisten en un núcleo lipídico, lípido A, con una 60 cadena lateral de polisacáridos que son componentes de determinados bacilos, el lípido A se incorpora en la membrana exterior de la bacteria y el polisacárido se proyecta fuera de la célula. Su potencia adyuvante se asocia con el lípido A; también son mitógenos para linfocitos B murinos); y adyuvantes micobacterianos (micobacterias enteras muertas por calor, y secadas, tales como M. tuberculosis, M. avium, M. phlei y M. smegmatis) que cuando se suspenden en aceite mineral y emulsionante, tienen actividad adyuvante con respecto a cualquier antígeno dado con ellos. Los extractos de algunas micobacterias, p. ej., peptidoglicolípidos micobacterianos, tienen actividades adyuvantes similares. Véase, por ejemplo, Dictionary of Immunology en las páginas 3, 7, 46, 94, 97, 105 y 116; R. B. Luftig, Microbiology and Immunology, pág. 5 228-29, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia 1998. Los adyuvantes microbianos incluyen Corynebacterium parvum y Bordetella pertussis. Véase por ejemplo, el Handbook of Inmunology en las páginas 115-16. El uso de preparaciones de liberación controlada y los materiales con actividad adyuvante y posibles sitios de acción se han descrito en Fundamental Inmunology en las páginas 1007-9. Los vehículos minerales tales como hidróxido de aluminio, sulfato de amonio y potasio, y sulfato de 10 aluminio y potasio, adsorben el antígeno sobre su superficie. Estos adyuvantes comunes se han usado en una concentración al 0,1% con hasta 1 mg de antígeno de proteína en 1 ml administrado a animales, con dosis de 0,2-0,5 ml/kg de peso corporal). Véase, Miroslav Ferencik, Handbook of Immunochemistry, pág. 115, Chapman & Hall 1993 (este libro se denominará en lo sucesivo "Handbook of Immunochemistry"). Aunque el adyuvante de Freund es tóxico y no se usa para la inmunización de seres 15 humanos, los adyuvantes minerales como el hidróxido de aluminio son comunes en medicina humana. Ídem, en pág. 116. Además del alumbre, otros adyuvantes en el grupo de los vehículos inertes incluyen bentonita, látex y partículas acrílicas. Véase Fundamental Inmunology en la pág. 1008. Las combinaciones de adyuvantes también pueden tener propiedades adyuvantes. Por ejemplo, se ha mostrado que la combinación de saponina y dipéptido muramilo en una emulsión de escualeno en agua, 20 es superior al alumbre como adyuvante para inducir determinadas respuestas en ratones. R. Bomford, M. Stapleton, S. Wilson, A. McKnight y T. Andronova, “The control of the antibody isotype responses to recombinant human immunodeficiency virus gp120 antigen by adjuvants”, AIDS Res. Hum. Retroviruses Vol. 8(1992) pág. 1765 y siguientes. Estos adyuvantes se complementan con nuevos adyuvantes que se han desarrollado durante los últimos 15 años. Véase, por ejemplo, Anthony C. Allison, “The Role of 25 cytokines in the Action of Immunological Adjuvants”, en Vaccine Design. The Role of cytokine Networks, editado por Gregory Gregoriadis and Brenda McCormack, NATO ASI Series A: Life Sciences Vol. 293, pág. 1-9, Plenum Press, New York 1997 (este libro se denominará en lo sucesivo "Vaccine Design"); Immunology en la pág. 116; H. Snippe, I. M. Fernandez y C. A. Kraaijeveld, “Adjuvant Directed Immune Specificity at the Epitope Level. Implications for Vaccine Development. A Model Study Using Semliki 30 Forest Virus Infection of Mice”, en Vaccine Design, en pág. 155-73. Un adyuvante se puede administrar antes, simultáneamente con o después de administrar el antígeno. La potenciación de la producción de antígeno producida por los adyuvantes no se entiende bien. Sin embargo, se han definido propiedades de adyuvantes que pueden existir solos o en diferentes combinaciones y que permiten que una sustancia o formulación se describa como adyuvante. Véase, por ejemplo, J. C. Cox y A. R. Coulter, “Adjuvants-A 35 classification and review of their modes of action”, Vaccine Vol. 15(1981) pág. 248 y siguientes; John Cox, Alan Coulter, Rod Macfarlan, Lorraine Beezum, John Bates, Tuen-Yee Wong y Debbie Drane, “Development of an Influenza-ISCOM.TM”. Vaccine, en Vaccine Design en página 33-49. Una de estas propiedades es la generación de depósito, de modo que la vacuna es retenida cerca del sitio de la dosis para producir la liberación por goteo a corto plazo o una liberación pulsada a largo plazo. Ídem en página 40 34.

Preferiblemente, la composición farmacéutica o vacuna se administra directamente o en combinación con un adyuvante mencionado antes en el presente documento o cargado en células presentadoras de antígeno, en particular células dendríticas. También se prefiere que tanto la composición farmacéutica o de vacuna como el adyuvante y la composición farmacéutica o de vacuna y 45 las células dendríticas cargadas se administren juntos o separados unos de otros, p. ej., en momentos de tiempo diferentes o en sitios diferentes. Además, también se prefiere que dicha composición farmacéutica y adyuvante se administren juntos con dicha composición farmacéutica cargada en células dendríticas. Puesto que las células dendríticas son células presentadoras de antígeno muy especializadas con la capacidad única para iniciar y regular respuestas inmunitarias específicas de 50 antígeno, se prefiere combinarlas con las composiciones farmacéuticas o de vacunas de la presente invención. Para la preparación de una vacuna tumoral, las células dendríticas se pueden generar a partir de sangre periférica de los pacientes con tumores, de otros donantes o de las líneas celulares mencionadas antes. En estudios clínicos, la eficacia de la vacunación con las células dendríticas se ha demostrado usando criterios de valoración inmunológicos y, en algunos casos, clínicos. 55

En los últimos años se han investigado ampliamente los procedimientos de inmunoterapia específica activa para el tratamiento de tumores. Se han descrito numerosos estudios que implican la vacunación de pacientes con sus propias células tumorales inactivadas. Estos estudios han demostrado que la inclusión de un adyuvante es necesaria para estimular el sistema inmunitario del paciente, en especial contra las células tumorales autólogas, o derivadas de las mismas. Por ejemplo, los 60 procedimientos que usan el adyuvante en partículas, células del bacilo de Calmette-Guerin (BCG), administrado de forma sistémica o mezclado con las propias células tumorales del paciente, han mostrado que inducen inmunidad específica de tumor en animales de laboratorio. Peters, L. C., Brandhorst, J. S., Hanna Jr., M. G., “Preparation of Immuno-Therapeutic Autologous Tumor Cell Vaccines from Solid Tumors”; Cancer Res. 39: 1353-1360 (1979). 65

En otra realización preferida, las células dendríticas usadas en la composición farmacéutica o de vacuna mencionada antes, son células dendríticas maduras cargadas (mDC) que proceden de células dendríticas inmaduras (iDC) cargas con lisado y después maduradas o que se cargaron después o durante la maduración. El término “inmadura” cuando se usa según la presente solicitud se refiere a células presentadoras de antígeno profesionales que se caracterizan por su capacidad para absorber y 5 procesar antígenos. El término “madura” cuando se usa según la presente solicitud, se refiere a células presentadoras de antígeno profesionales que expresan factores coestimuladores y antígenos en el contexto de moléculas de clase MHC o moléculas CD1 y pueden activar linfocitos T, células NKT reguladoras y/o células B.

Una composición farmacéutica o de vacuna que comprende células dendríticas y lisados de 10 células inducidas por temperatura, comprende a éstas preferiblemente como células dendríticas cargadas con lisado. Dichas células dendríticas se cargan preferiblemente en su estado inmaduro (DC inmaduras) con los lisados celulares de la presente invención y posteriormente se llevan a la maduración. Las DC maduras cargadas con el lisado según la invención, se usan preferiblemente para tratar o prevenir enfermedades tumorales o infecciosas. En el caso de que la composición farmacéutica o vacuna 15 se use para la vacunación contra enfermedades inmunes, las DC inmaduras se cargan y preferiblemente se detienen en su estado inmaduro para desarrollar tolerancia cuando se administran como se ha descrito en lo que antecede.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende la etapa de combinar un lisado celular que se puede obtener por el 20 procedimiento según la presente invención con un adyuvante o con células dendríticas.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende la etapa de combinar un lisado de células que se puede obtener por el procedimiento según la presente invención, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una cantidad terapéutica y 25 profilácticamente eficaz del lisado que se puede obtener por el procedimiento según la invención, en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer, p. ej., por vacunación, en el que el lisado se administra a un individuo.

En el contexto de la presente invención, el término “individuo” significa un sujeto que necesite un tratamiento o prevención del cáncer y/o enfermedades tumorales. 30

Preferiblemente, el sujeto es un animal vertebrado, incluso más preferiblemente un mamífero, particularmente preferido un ser humano.

El término “administrado” significa la administración de una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz del lisado celular de la invención, a un individuo. Por “cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz” se entiende una dosis que produce los efectos para los cuales se administra. La dosis exacta 35 dependerá del propósito del tratamiento, y lo puede determinar el experto en la materia usando técnicas conocidas. Como se sabe en la materia y se ha descrito antes, pueden ser necesarios los ajustes para el suministro sistémico frente a localizado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, interacción con fármacos y la gravedad de la afección, y lo podrá determinar mediante experimentación rutinaria el experto en la materia. 40

Según la presente invención, el término “vacunación” está relacionado con un procedimiento general de inmunización contra cánceres y/o enfermedades tumorales.

La vacunación es una forma de inmunización artificial deliberada, por la cual se administran lisados celulares o células dendríticas cargadas con los lisados celulares de la presente invención. Los lisados celulares se administran en una forma como se describe en el presente documento, véase antes, 45 y pueden sensibilizar al sistema inmunitario de modo que si surgen en el cuerpo cáncer, enfermedades tumorales, infecciones y/o enfermedades autoinmunes, van a ser tratadas o prevenidas. Véase, por ejemplo, Immunology, en pág. 87-88; AMA Encyclopedia of Medicine en pág. 573-574 y 1034; S. J. Cryz, Jr., en Immunotherapy and Vaccines, editado por Stanley J. Cryz, pág. 3-11, VCH, Weinheim, Alemania 1991. Para una visión general del sistema inmunitario desde una perspectiva molecular, véase, por 50 ejemplo, Mary S. Leffell, “An Overview of the Immune System: The Molecular Basis for Immune Responses”, en Human Immunology Handbook pág. 1-45. La vacunación también se asocia con la inmunización.

Inmunización es un término general, y se usa el término vacunación cuando los pacientes son inmunizados. En general, la inmunización se puede usar como un tratamiento preventivo o terapéutico. El 55 uso preventivo de la inmunización es un tratamiento profiláctico, mientras que el uso de inmunización mientras la enfermedad se está desarrollando, es inmunoterapia. La inmunización proporciona dos tipos de inmunidad adquirida, activa y pasiva. La inmunoterapia es el tratamiento de una enfermedad por inmunización, activa o pasiva, o por el uso de agentes que modifican las acciones de los linfocitos. En particular, la inmunoterapia se refiere a la estimulación del sistema inmunitario, y convencionalmente usa una forma de inmunoestimulante, una sustancia que produce una estimulación general, no específica, del sistema inmunitario. The American Medical Association Encyclopedia of Medicine, pág. 576 (esta enciclopedia se denominará en lo sucesivo "AMA Encyclopedia of Medicine"). 5

Para inducir una respuesta inmunitaria para tratar o prevenir el cáncer y/o enfermedades tumorales, infecciones y/o enfermedades autoinmunes, se proporcionan uno o más lisados celulares o células dendríticas cargadas con los lisados celulares según la invención, y se inyecta una cantidad eficaz de uno o más de los lisados celulares o células dendríticas cargadas con lisados celulares, al menos una vez para permitir así la liberación de cantidades biológicamente activas del 10 inmunoestimulante a lo largo de un periodo de tiempo para inducir una respuesta inmunitaria frente a la presencia de células tumorales activas.

Un individuo para los propósitos de la presente invención, incluye tanto seres humanos como otros animales, preferiblemente vertebrados y más preferiblemente mamíferos. Por lo tanto, los usos de los lisados en los procedimientos son aplicables tanto a terapia humana como a aplicaciones 15 veterinarias. En una realización preferida, el individuo es un mamífero, p. ej., un ratón, y en una realización más preferida, el individuo es un ser humano.

Los compuestos descritos en el presente documento que tienen la actividad terapéutica o profiláctica deseada, se pueden administrar en un vehículo fisiológicamente aceptable a un paciente, como se describe en el presente documento. Dependiendo de la forma de introducción, los compuestos 20 se pueden formular en una variedad de formas como se describe a continuación. La concentración de compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar de aproximadamente 0,1-100% en peso. Sin embargo, también se contempla que el experto en la materia esté en una posición fácil para determinar la concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación, usando su conocimiento general común. Los agentes se pueden administrar solos o en combinación con otros 25 tratamientos, es decir, radiación u otros agentes quimioterapéuticos.

En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas están en una forma soluble en agua, tal como sales farmacéuticamente aceptables, que significa que incluye sales de adición tanto de ácidos como de bases.

La administración de los agentes candidatos de la presente invención se puede hacer en una 30 variedad de formas como se ha descrito antes, incluyendo, pero sin limitar, la vía oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, transdérmica, intranodal, peritumoral, intratumoral, intrarrectal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocular. En algunos casos, por ejemplo, en el tratamiento de heridas y de inflamación, los agentes candidatos se pueden aplicar directamente como una pulverización de disolución en seco. 35

Los lisados de células que se pueden obtener por los procedimientos mencionados antes, se pueden administrar al sujeto con una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas se puede realizar de diferentes formas, p. ej., por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal, intranodal, intrarrectal, peritumoral, intratumoral o intrabronquial. El médico que atiende y los factores clínicos determinarán el régimen de 40 dosificación. Como se sabe bien en medicina, las dosificaciones para cada paciente dependen de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, la superficie específica del cuerpo, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y otros fármacos que se administran simultáneamente. Una dosis típica de lisado puede ser desde aproximadamente 1000 a 1013 células y la dosis típica para células dendríticas es aproximadamente de 104 a 1012 células, sin 45 embargo están contempladas las dosis por encima y por debajo de este intervalo de ejemplo. Preferiblemente, la dosis de lisado corresponde a las cantidades generadas a partir de números de células entre 104 y 1012, más preferiblemente entre 105 y 1011 células, más preferiblemente entre 106 y 1010 células. Preferiblemente, la dosis para células dendríticas cargadas es entre 105 y 1011 células, más preferiblemente entre 106 y 109. La dosis puede variar entre individuos y se puede dividir en múltiples 50 inyecciones en diferentes sitios y/o por diferentes vías de administración. Las dosis óptimas y adecuadas las puede determinar el experto en la materia. La cantidad de lisado celular usado para cargar las células dendríticas la puede determinar el experto en la materia, por ejemplo mediante los ensayos in vitro y/o in vivo que se muestran como ilustración en los ejemplos. Las cantidades preferidas para los lisados se originan a partir de 103 a 1013 células, más preferible de 104 a 1012 células, más preferible de 105 a 1011 55 células, y más preferible de 106 a 1010 células. En general, el régimen como una administración regular de la composición farmacéutica o de vacuna debe estar en el intervalo de 0,1 µg a 10 g por dosis para los lisados, preferiblemente de 50 a 100 mg, y las cantidades para los lisados fraccionados pueden ser correspondientemente menores, pero pueden alcanzar las cantidades altas. Las dosificaciones preferiblemente se dan una vez a la semana, sin embargo, durante el desarrollo del tratamiento, las 60 dosificaciones se pueden dar en intervalos de tiempo más largos, y si es necesario, se pueden dar en intervalos de tiempo mucho más cortos, p. ej., diariamente. En un caso preferido, la respuesta inmunitaria se sigue usando los procedimientos descritos en el presente documento y otros procedimientos conocidos para los expertos en la materia, y las dosificaciones se optimizan, p. ej., en tiempo, cantidad y/o composición.

Si el régimen es una infusión continua, debe estar también en el intervalo de 0,1 µg a 10 mg por 5 kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. El avance se puede seguir mediante la evaluación periódica. Los lisados celulares de la invención se pueden administrar por vía local o sistémica. La administración será preferiblemente por vía parenteral, p. ej., intravenosa, intranodal, intraperitoneal, intratumoral, peritumoral. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas y no acuosas estériles. Los ejemplos de disolventes 10 no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo disolución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa en Ringer, dextrosa y cloruro sódico, disolución de lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen 15 reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa en Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

También se contempla que los lisados celulares se usan en procedimientos de terapia simultánea, es decir, en la coadministración con otros medicamentos o fármacos, por ejemplo, fármacos 20 anticancerígenos.

Cuando se lleva a cabo la terapia con vacuna usando los lisados celulares o las células dendríticas cargadas con lisados celulares de la presente invención, se pueden administrar solo una vez. Sin embargo, es conveniente repetir la administración en el mismo sitio de un cuerpo para lograr la coexistencia de un antígeno tumoral y una citoquina o un agente de inducción de citocinas siempre que 25 sea posible. Por ejemplo, ambos componentes pueden coexistir preferiblemente durante 3 horas o más, de modo que se puede inducir la reacción inflamatoria en el sitio de administración y se pueden lograr condiciones en las que las células inmunitarias se concentran y las células se mantienen en el sitio. En general, el lisado celular se puede administrar a un paciente del cual se obtiene el material tumoral; sin embargo, la vacuna también se puede administrar a un paciente que lleva un tumor que contiene, desde 30 el punto de vista del diagnóstico patológico, la misma especie o relacionada de un antígeno tumoral que el contenido en el material tumoral. El sitio en que se va a administrar no está particularmente limitado. Los sitios preferidos incluyen aquellos en los que las citocinas apenas se difunden y desaparecen, por ejemplo sitios intradérmicos, subcutáneos o intramusculares, en nódulos linfáticos, y en un órgano principal tal como el bazo. Sin embargo, eligiendo una forma de dosificación que prevenga la fácil 35 difusión de los principios activos de la vacuna tumoral, las administraciones locales a veces se pueden realizar en cualquier sitio de un cuerpo, o mediante aplicación de un sistema de suministro de fármacos a veces es posible la administración sistémica. La dosis y el periodo de administración de la vacuna tumoral de la presente invención no están particularmente limitados. Es conveniente determinar una dosis y un periodo de administración adecuados observando los efectos de la terapia con vacuna. La 40 administración se puede hacer, por ejemplo, por inyecciones y similares.

Los lisados celulares o las células dendríticas cargadas con lisado celular se pueden administrar a un individuo para el tratamiento o prevención de infecciones causadas, p. ej., por microorganismos tales como bacterias, hongos, virus y/o parásitos o enfermedades autoinmunes. Una enfermedad autoinmune puede surgir por el reconocimiento inmune y reacción contra las propias células del individuo 45 o partes del propio cuerpo. Otra realización preferida para la vacunación es una combinación de una inmunización con células dendríticas cargadas con un lisado celular según la presente invención, seguido del refuerzo con el lisado de células necróticas.

Los lisados de células tumorales, que se usan para la preparación de una composición farmacéutica o de vacuna, pueden ser autólogos o alógenos o xenógenos con respecto al individuo 50 tratado. También se contempla que el lisado de células tumorales se puede obtener de un tumor/material de células tumorales/metástasis y usar para la preparación de una composición farmacéutica o de vacuna o líneas celulares, incluyendo líneas celulares, p. ej., de células tumorales, o líneas de células primarias o líneas de células o cultivos de material primario y similares, administrados para tratar o prevenir otro tipo de tumor. Por ejemplo, las células tumorales obtenidas de leucemias o linfomas se 55 pueden usar para tratar o prevenir el carcinoma de colona. En otra realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica o de vacuna usada para la vacunación comprende uno o más lisados de células tumorales producidos a partir de diferentes tumores/material tumoral/células tumorales con el fin de evitar el llamado escape de tumor. Estos lisados se pueden cargar en células dendríticas o sus estados precursores como se ha descrito antes, y usar como tales como un componente de 60 composiciones farmacéuticas o de vacuna para la administración.

La invención también se refiere al uso del lisado que se puede obtener por el procedimiento según la invención para preparar una vacuna o composición farmacéutica para el tratamiento o prevención del cáncer y/o enfermedades tumorales.

En una realización preferida, el cáncer o enfermedad tumoral que se va a tratar o prevenir es un cáncer/enfermedad tumoral de cabeza y cuello, pulmón, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema 5 genitourinario, sistema ginecológico, mama, sistema endocrino, piel, en la infancia, cáncer metastásico o en sitio primario desconocido, un sarcoma de tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, un neoplasma del sistema nervioso central, un linfoma, una leucemia, un síndrome paraneoplásico, una carcinomatosis peritoneal, un tumor maligno relacionado con inmunosupresión y/o cáncer metastásico. Sin embargo, dicho cáncer/enfermedad tumoral también se puede seleccionar de los mencionados en lo 10 que antecede en relación con el procedimiento según la invención.

En vista de los resultados in vivo e in vitro de los ejemplos de la presente invención, se espera que la invención proporcione una vacuna ventajosa para el cáncer, enfermedad tumoral, infección y/o enfermedad autoinmune. En particular, los ratones desarrollaron una respuesta inmunitaria tanto humoral como celular cuando se estimularon con antígenos tumorales presentes en/sobre células tumorales, que 15 sirvieron como una fuente para el lisado celular producido. Además, incluso se desarrollaron anticuerpos contra antígenos de hidratos de carbono que no se habían observado o se habían observado raramente hasta ahora, cuando se habían administrado lisados de células tumorales producidos de forma convencional. Además, se encontró que los ratones con un sistema inmunitario humano implementado mostraban el mismo fenómeno. 20

Las figuras muestran:

la fig. 1 es un análisis de células tumorales NM-F9 inducidas con temperatura marcadas con anexina V-FITC y yoduro de propidio (A-C) y de células tumorales NM-F9 marcadas con anti-Hsp70 por citometría de flujo;

la fig. 2 es la detección de la expresión celular de Hsp 70 en células tumorales NM-F9 tratadas con 25 temperatura obtenidas de células tumorales K562 por tinción inmunocitoquímica; el panel a) muestra las células NM-F9 incubadas a 41,2ºC, la tinción de células positivas para Hsp70 se hizo usando un anticuerpo secundario marcado con Cy3; el panel b) muestra células NM-F9 incubadas a 46,2ºC en el control de campo oscuro; el panel c) muestra las mismas células NM-F9 incubadas a 46,2ºC, en las que las células positivas para Hsp70 30 están marcadas con un anticuerpo secundario marcado con Cy3;

la fig. 3 es un análisis in vitro de la estimulación de linfocitos T (CD8) mediante células dendríticas cargadas con lisado de células tumorales NM-F9 tratadas con temperatura;

la fig. 4 es un análisis in vitro de la activación de linfocitos T (CD4) por células dendríticas maduras que se incubaron con diferentes lisados tumorales NM-F9; 35

la fig. 5 es la inducción in vitro de respuestas de linfocitos T CD8+ con diferentes lisados de células NM-F9 necróticas después de una estimulación.

Las tablas muestran:

Tabla 1. Inducción de apoptosis, necrosis y expresión de la proteína HSP 70 unida a membrana en células tumorales NM-F9 derivadas de K562 por tratamiento con temperatura. 40

Temperatura: Porcentaje del total (%)

células: células apoptóticas células necróticas células positivas para Hsp 70

37,0 °C: 70 +/- 3,7 21 +/-1,9 9 +/- 3,2 5

38,0 °C: 64 25 9 1

40,0 °C: 48 40 12 3

41,2 °C: 44 40 15 33

42,0 °C: 34 45 20 1

42,4 °C: 25 +/- 10 59 +/- 11 16 +/-0,35 1

43,0 °C: 34 47 19 0,7

44,0 °C: 25 52 23 10

46,2 °C: 5 +/- 0,6 9 +/- 0,2 86 +/- 0,7 5

Tabla 2. Respuesta inmunitaria humoral en ratones NMRI pretratados con lisados de células tumorales NM-F9 inducidas por temperatura

Vacuna: Número de ratones con respuesta inmunitaria de IgG específica de antígeno/número total

AGP: TF Tn MUC1

Lisado de células tumorales necróticas 46,2ºC: 2/3 3/3 3/3 3/3

Lisado de células tumorales apoptóticas 42,4ºC: 2/3 0/3 0/3 1/3

Lisado de células tumorales con expresión aumentada de HSP 70 41,2ºC: 0/3 0/3 0/3 0/3

Lisado de células no tratadas 37ºC: 2/3 0/3 0/3 0/3

Tabla 3. Respuesta inmunitaria humoral en ratones NOD/SCID pretratados con lisados de 5 células tumorales NM-F9 inducidas por temperatura

AGP: TF Tn MUC1

Lisado de células tumorales necróticas 46,2ºC: 3/3 3/3 3/3 3/3

Lisado de células tumorales apoptóticas 42,4ºC: 1/3 1/3 1/3 0/3

Lisado de células no tratadas 37ºC: 0/3 1/3 1/3 0/3

Control negativo, lisado de células MeI624, AGP-, TF-, Tn-, MUC1-: 0/3 0/3 0/3 0/3

Los ejemplos ilustran la invención.

1. Procedimiento de tratamiento con temperatura para preparar lisado de células tumorales apoptóticas y necróticas

En el siguiente ejemplo se pueden usar células K562 (ATCC: CCL-243). Sin embargo, se usan preferiblemente células F9 positivas para TF (NM-F9) obtenidas de células tumorales K562 (ATCC: CCL-243), que se cultivaron en medio RPMI con FCS al 10%, ácido glutámico al 1% (medio RPMI completo), 5 CO2 al 8%, humedad al 95% a 37ºC. Para cada preparación se recogieron 7,5x105 células K562. Antes de la inducción con temperatura, las células tumorales se volvieron a suspender en 450 µl de medio RPMI completo (para la vacunación de ratones, sección 5) o en medio AIMV exento de suero (para ensayo in vitro, sección 4). Para la inducción con temperatura se incubaron 4 partes alícuotas de 100 µl y 1 parte alícuota de 50 µl (tazas de 0,5 ml) de células tumorales, durante 2 h en un termociclador 10 previamente calentado (Eppendorf, Hamburg, Alemania). Después, las células tratadas con temperatura se volvieron a suspender en 25 ml de medio RPMI completo o medio AIMV y se volvieron a cultivar en las condiciones anteriores (en medio RPMI completo a 37ºC). Para la inducción de apoptosis y necrosis se encontró que era mejor un tiempo de 22 h que de 6 h y 14,5 h (resultados descritos en la sección 2, citometría de flujo). Antes de la lisis, las células tumorales se lavaron con PBS (para la vacunación de 15 ratón) o AIMV (para ensayo in vitro) 3 veces. Después, los recuentos de células se ajustaron a 5x106 células/75 microlitros de PBS (para la vacunación de ratón) o 1x106/500 µl de AIMV (para ensayo in vitro). La lisis de las células se realizó congelando en nitrógeno líquido y descongelando a 37ºC (baño de agua) durante 3 ciclos (30 s/fase en nitrógeno líquido). Los lisados celulares se almacenaron a -80ºC.

Para mejorar la inmunogenicidad y simplificar el procedimiento de inducción para preparar 20 células necróticas, se variaron la duración de la inducción con temperatura (2 h o 3 h) así como el tiempo de recultivo a 37ºC (0h, 3 h, 22 h). En estos experimentos la inducción con temperatura se produjo en PBS o medio AIMV exento de suero en un bloque térmico a 46,5ºC. Las células tratadas térmicamente se volvieron a cultivar en el mismo volumen y medio en tubos de microcentrífuga en los que se había llevado a cabo la inducción con temperatura. El lisado de células necróticas (en medio AIMV) se usó para el 25 análisis in vitro (Figura 5). Las siguiente preparaciones se lisaron mediante congelación y descongelación: 1) Inducción con temperatura 2 h (muestra A) y 3 h (muestra B) sin tiempo de recultivo. 2) Inducción con temperatura 2 h (muestra C) y 3 h (muestra D) y 3 h de tiempo de recultivo. 3) Inducción con temperatura 2 h y 22 h de tiempo de recultivo en tubos de microcentrífuga (muestra E). 4) como control: Inducción con temperatura 2 h y 22 h de tiempo de recultivo en medio resuspendido. 30

2. Determinación de las células vitales, apoptóticas y necróticas por citometría de flujo

Para la determinación de las células vitales, apoptóticas y necróticas, se usó el kit de detección de apoptosis I (Pharmingen, Heidelberg, Alemania) que contenía Anexina V-FITC y yoduro de propidio. Las células apoptóticas solo se teñían con Anexina V-FITC y las células necróticas se teñían con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Para el análisis se pueden usar 3x105 células K562 tratadas con calor y 35 recultivadas (ATCC: CCL-243). Sin embargo, se usaron células F9 positivas para TF obtenidas de células tumorales K562 (NM-F9) que se recogieron y lavaron dos veces en PBS. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender en 1x tampón de unión (Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 140 mM y CaCl2 2,5 mM) y se tiñeron con 5 µl de Anexina V-FITC y 2 µl de PI. Después de 15 min de tiempo de incubación a temperatura ambiente (en un sitio oscuro), las muestras se diluyeron en 400 µl de 1x tampón de unión. 40 Para el análisis por citometría de flujo, se usó el citómetro de flujo Coulter Epics XL de Beckman-Coulter (Miami, USA) con el software Expo 32 ADC (Beckman-Coulter). Para la investigación se usaron los siguientes parámetros:

"dispersión lateral": 807 V, "gain" 5, “dispersión directa": 26 V "ganancia" 1.

Anexina V: canal FL1, 707 V, "ganancia" 1, compensación FL1-FL3 0,4. PI: canal FL3, 729 V, 45 "ganancia" 1, compensación FL3-FL1 17,9.

La determinación proporcional de células vitales, apoptóticas y necróticas, de células F9 positivas para TF obtenidas de células K562 (NM-F9) tratadas con calor y recultivadas 22 h, se describe en los diagramas de “gráficas de puntos” en la figura 1. Las células tumorales K562 se incubaron en un termociclador durante 2 h a 37ºC (control, figura 1 A), a 42,4ºC (figura 1 B) y a 46,2ºC (figura 1C). 50 Después de la inducción con temperatura, las células se volvieron a cultivar 22h a 37ºC.

En un diagrama de “gráfico de puntos” se describe la intensidad de fluorescencia de las células teñidas con Anexina V-FITC/PI, por la posición de las manchas en el campo de coordenadas. El campo de coordenadas se divide en cuadrantes, cuya posición se determina mediante control negativo y positivo usando células teñidas con PI o Anexina V-FITC. La población no teñida en el cuadrante izquierdo 55 inferior representa las células vitales (no puede entrar colorante en la célula), la población en el cuadrante derecho inferior representa las células apoptóticas (solo puede entrar Anexina V-FITC en la célula) y la población en el cuadrante izquierdo y derecho superiores representa las células necróticas.

Para determinar la mejor temperatura de inducción de apoptosis y necrosis, las células F9 positivas para TF obtenidas de células K562 se incubaron durante 2 h a 10 temperaturas diferentes descritas en la tabla 1. Como se muestra en la figura 1B y C, la temperatura óptima para la inducción de células apoptóticas es 42,4ºC y la temperatura para la inducción de células necróticas es 46,2ºC.

3. Preparación de lisado de células tumorales con expresión alta de proteínas HSP 70 5 unidas a membrana.

En el siguiente ejemplo se pueden usar células K562 (ATCC: CCL-243). Sin embargo, se usan preferiblemente células F9 positivas para TF obtenidas de K562 (NM-F9). Con estas últimas células se observó que la preparación de células F9 positivas para TF tratadas con calor obtenidas de lisado de células tumorales K562 (NM-F9) con expresión alta de HSP 70 unido a membrana, es comparable a la 10 preparación de células necróticas y apoptóticas. El tiempo de recultivo óptimo para las células F9 positivas para TF obtenidas de células K562 (NM-F9) que expresan cantidades altas de HSP 70 era 14,5 h (resultados, sección 4).

Detección de la proteína HSP 70 unida a membrana por citometría de flujo.

Se recogieron 3x105 células F9 positivas para TF obtenidas de células K562 (NM-F9), las cuales 15 se usan preferiblemente, y se volvieron a suspender en 25 µl de medio RPMI completo. Después de 45 min de incubación con anticuerpo dirigido contra IgG1 deHSP 70 humana (diluido 1:100 en RPMI completo) a 4ºC, las células se lavaron en PBS/FCS al 10% 2 veces (5 min de centrifugación a 1500 upm, Heraeus Multifuge). Después, las células se cultivaron durante 30 min con un anticuerpo Cy3 secundario dirigido contra IgG de ratón ratón-a 4ºC (diluido 1:200 en PBS, Dianova, Hamburg, Alemania). 20 Las células se lavaron en PBS 2 veces y se volvieron a suspender en 200 µl de PBS. Para el análisis se usaron los siguientes parámetros: “dispersión lateral” y “dispersión directa” como se ha descrito.

Cy3: canal FL2, 740 V, “ganancia” 1.

Los resultados se describen en el histograma de superposición (figura 1D), que muestra la inducción de HSP 70 de las células de control (incubadas a 37ºC) y células F9 incubadas a 41,2ºC. 25 Como se ve en el histograma, en aproximadamente 33% de la población de células F9 incubadas a 41,2ºC, aumenta la expresión de proteínas HSP 70.

La expresión de HSP 70 de células F9 positivas para TF obtenidas de células K562 (NM-F9) incubadas durante 2 h a 10 temperaturas diferentes, se describe en la tabla 1. La expresión de HSP 70 óptima en células F9 positivas para TF tratadas con calor obtenidas de células K562 (NM-F9) se obtiene 30 por inducción con temperatura a 41,2ºC y 14,5 h de recultivo a 37ºC.

Detección de la expresión celular de HSP 70 por inmunocitoquímica

El procedimiento de tinción se produjo en una cámara húmeda.

Para recubrir el portaobjetos se añadieron gota a gota sobre el portaobjetos (en una cámara húmeda) 5 x 104 células en 50 µl, se incubaron durante 30 min a 37ºC en el incubador de CO2 y se 35 incubaron 1 h a temperatura ambiente. Después de separar el líquido sobrenadante, las muestras se secaron durante 15 min a temperatura ambiente y se almacenaron a -20ºC envueltas en papel de aluminio. Después de descongelar las células, se fijaron en formaldehído al 5% (diluido en PBS, 5 min de incubación a temperatura ambiente). Las células se lavaron en PBS 3 veces y se bloquearon por incubación 1 h con BSA/PBS al 5%. Después de lavar en PBS, las células se marcaron con anticuerpo 40 dirigido contraHSP 70 (como antes, diluido 1:200 en BSA/PBS al 1%, 90 min de incubación a T.a.). Después de lavar las células con PBS 3 veces, se incubaron células K562 durante 1 h con un anticuerpo Cy3 secundario dirigido contra IgG de ratón-(diluido 1:200 en BSA/PBS al 1%) a temperatura ambiente. Finalmente las células se insertaron en disolución Mowiol (6 g de glicerina, 2,4 g de mowiol 4-88 (Calbiochem, Bad Soden, Alemania), 6 ml de H2O, 12 ml de Tris-HCl 0,2 M pH 8,5, mezclando 2 h a T.a., 45 centrifugación 15 min a 5000xg, adición de diazobiciclooctano (Sigma)). El análisis inmunoquímico se llevó a cabo con un microscopio Zeiss Axioplan (Oberkochen, Alemania). Los resultados de la expresión celular de HSP 70 por F9 incubadas a 41,2ºC, incubadas a 42,4ºC (células apoptóticas) e incubadas a 46,2ºC (células necróticas) se muestran en la figura 2. El 80-90% de las células K562 incubadas a 41,2ºC tenían una mayor expresión de HSP 70. A diferencia de lo anterior, 2-5% de las células necróticas 50 incubadas a 46,2ºC mostraron mayor expresión de HSP 70.

Para los estudios de inmunogenicidad, se prepararon 4 poblaciones de células tratadas de diferente forma.

1) Lisado de células F9 positivas para TF necróticas obtenidas de células K562 (NM-F9) (2 h de inducción con temperatura a 46,2ºC, 22 h de recultivo a 37ºC), 2) lisado de células F9 positivas para TF 55 apoptóticas obtenidas de células K562 (NM-F9) (2 h de inducción con temperatura a 42,4ºC, 22 h de recultivo a 37ºC), 3) lisado de células F9 positivas para TF obtenidas de células K562 (NM-F9) con mayor expresión de HSP 70 (2 h de inducción con temperatura a 41,2ºC, 14,5 h de recultivo a 37ºC), 4) lisado de células F9 positivas para TF no tratadas obtenidas de células K562 (incubadas a 37ºC).

4. Activación específicas de linfocitos T CD8+ y CD4+ por lisados de células tumorales tratadas con calor, absorbidas, procesadas y presentadas por células dendríticas 5

Las células dendríticas se pueden incubar con células K562, sin embargo, se incuban preferiblemente con diferentes células F9 positivas para TF (NM-F9) obtenidas de lisados tumorales K562, durante la noche. Después de fagocitosis de las células F9 positivas para TF obtenidas de lisados de K562, se indujo la maduración de células dendríticas. Después, se analizó la activación de linfocitos T CD8+ (figura 3) y CD4+ (figura 4) por células dendríticas maduras, y las células dendríticas se incubaron 10 con CD8+, con el fin de estimular estas células de una forma específica de antígeno.

Preparación de células dendríticas humanas inmaduras

Las células dendríticas humanas inmaduras se prepararon por diferenciación de monocitos humanos (hmoDC) por el procedimiento de Romani N y col. 1994, J. Exp. Med. 180: 83-93). Los monocitos de sangre periférica se aislaron de sangre periférica de donantes humanos sanos, por 15 centrifugación con gradiente de Ficoll. Las células adherentes que se adherían al plástico se cultivaron durante 6 días en RPMI-1640, FCS al 10%, GM-CSF 1000 U/ml, TNFα 2,5 ng/ml y IL-4 1000 U/ml.

En segundo lugar, se prepararon las células dendríticas inmaduras (Nemod-iDC, que son células dendríticas inmaduras obtenidas de MUTZ-3 optimizadas, como se describe en el documento WO 03/023023, que se pueden adquirir en NEMOD Immuntherapie AG, Robert- Rössle-Strasse 10, D-13125 20 Berlín, Alemania); a partir de una línea celular humana según los procedimientos descritos en el documento WO 03/023023.

Carga y maduración de Nemod-iDC

Se incubaron las hmoDC o Nemod-iDC inmaduras (106 células/muestra) durante la noche con lisados de células tumorales en una proporción de 1:1. Después de lavar las células dendríticas con PBS, 25 se añadieron GM-CSF, IL-4 y TNFα 75 ng/ml. Las hmoDC, Nemod-mDC maduras se convirtieron en CD14-, CD1a+, CD80hi, CD86hi, CD40hi, MHCIIhi, CD83hi, DC-Sign+ (citometría de flujo, subíndice: - = no hay expresión, hi = expresión alta, + = expresión positiva). Antes de la sensibilización de los linfocitos T, las Nemod-mDC cargadas con antígeno se irradiaron con 30 Gy.

Preparación de linfocitos T de sangre periférica 30

Se aislaron linfocitos T de la fracción no adherente de las CMSP de donantes HLA-A2 positivos sanos mediante una columna de lana de nailon (Polysciences Inc., Eppelheim, Alemania). Alternativamente, se aislaron linfocitos T CD4+ o CD8+ de las CMSP mediante kits de aislamiento MACS de linfocitos T CD4- o CD8- (Miltenyi Biotec, Köln, Alemania).

Inducción de linfocitos T específicas de lisado de células tumorales. 35

Se incubaron linfocitos T totales, linfocitos T CD4+ o CD8+ en medio exento de suero (medio AIM-V) con hmoDC o Nemod-mDC maduras cargadas con el lisado celular en suero. La relación respondedor:estimulador (linfocitos T:DC) era 10-20:1. Después de incubación durante la noche, se añadieron IL-2 10 U/ml, IL-1β 1,5 U/ml e IL-7 5 ng/ml. Después de incubación durante 4 días, los linfocitos T se volvieron a estimular con hmoDC o Nemod-mDC maduras cargadas con antígeno. Los 40 linfocitos T se analizaron por ensayo de IFNγ-ELISPOT (figuras 3 y 5) seguido de incubación durante la noche, o después de 4 días (sin adición de citoquina) se analizó la proliferación celular por ensayo BrdU (figura 4).

Ensayo de IFNγ-ELISPOT

El análisis ELISPOT se realizó usando un kit (Mabtech, Nacka, Suecia) y placas de multicribado 45 de 96 pocillos con fondo de PVDF de Millipore (Bedford, EE.UU.). Antes del recubrimiento durante la noche con anticuerpos de ratón anti-IFNγ humano (15 µg/ml, a 4ºC), el PVDF se sumergió en etanol al 70% (50 µl/pocillo). Después de lavado con PBS, se incubaron 7x104 linfocitos T junto con el número relevante de hmoDC o Nemod-mDC maduras cargadas con antígeno en 200 µl de medio/pocillo, 16 h a 37ºC. Después se retiraron las células y las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween. El IFNγ secretado 50 se detectó por incubación con anticuerpo anti-IFNγ humano biotinilado (50 µl/pocillo en PBS, 2 h, T.a.), seguido de un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina (dilución 1:1000, 100 µl/pocillo, 1 h de incubación a T.a.). Después de lavado con PBS-Tween 4 veces, se logró la detección de la fosfatasa alcalina por tinción con BCIP (35 µl/10 ml de tampón de detección) y NBT (45 µl/10 ml de tampón de detección). La reacción se paró con agua. Antes del análisis con un lector de ELISPOT (Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Alemania) las placas de 96 pocillos se secaron durante 1 h a 40ºC.

Ensayo de proliferación de linfocitos T (incorporación de BrdU)

La BrdU se incorporó a los linfocitos T en proliferación según el protocolo del fabricante. Después de fijarlas, las células se incubaron con anticuerpo anti-BrdU marcado con POD. La posterior 5 reacción de tinción se paró mediante ácido sulfúrico 1 M. La detección del marcaje del anticuerpo se logró por fotometría con una densidad óptica de 450 nm (Ref. 690 nm).

Resultados de los análisis in vitro

Los experimentos in vitro pusieron de manifiesto que la inmunogenicidad de los lisados de células tumorales mejoraba por el pretratamiento con calor (figuras 3, 4 y 5). Los mejores resultados se 10 lograron por inducción con temperatura a 46,2ºC (aproximadamente 80% de células necróticas). Este resultado era inesperado. A diferencia de muchos autores que preparan células necróticas mediante lisis de células no tratadas (Gallucci, S. Nature Medicine 1999; Kotera, Y. Cancer Res. 2001; Restifo, N.P. Curr. Opin. Immunol. 2000; Sauter, B.J. y col. Exp. Med. 2000) los autores de la invención han mejorado la inmunogenicidad mediante necrosis inducida por temperatura de las células antes de la lisis. En 15 desacuerdo con otros autores (Dressel (2000), citado antes; Feng (2001), citado antes; Melcher (1998), citado antes; Todryk (2000), citado antes) no pudieron mejorar la inmunogenicidad aumentando la expresión de proteínas HSP 70 (temperatura de inducción de 41,2ºC) (figuras 3 y 4). Como se describe en la tabla 1, la expresión de HSP 70 determinada por citometría de flujo, aumentaba con la inducción con temperatura a 41,2ºC. Tanto en las células necróticas (46,2ºC) como en las células apoptóticas 20 (42,4ºC) inducidas con calor, se redujo la expresión de superficie de HSP 70 (células necróticas) o no cambió (células apoptóticas) (tabla 1). Estos resultados se confirmaron mediante ensayos de inmunofluorescencia (figura 2, 2-5% de células necróticas (46,2ºC) positivas para HSP 70, 80-90% de las células incubadas a 41,2ºC eran positivas para HSP 70).

La mayor inmunogenicidad celular (linfocitos T CD8+ citotóxicas y linfocitos T cooperadores 25 CD4+) se logró mediante lisados de células necróticas inducidas con temperatura. Comparado con los lisados de células no tratadas, los lisados celulares de células apoptóticas inducidas con temperatura también indujeron una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD8+ mejorada (figura 3). Se indujo una respuesta inmunitaria celular mejorada en el sistema autólogo (hmoDC) así como en el sistema semialogénico (NemodCD). Una respuesta inmunitaria fuerte se basa en la activación de linfocitos T 30 CD8+ y CD4+. Por lo tanto, el desarrollo de vacunas para tumores basadas en lisados de células tumorales, se puede mejorar usando lisados de células necróticas inducidas con temperatura. Para simplificar el procedimiento y mejorar la inmunogenicidad, se optimizó el procedimiento de preparación de células necróticas inducias con temperatura. Todas las células F9 positivas para TF obtenidas de células K562 (NM-F9) inducidas por una variedad de procedimientos de preparación (mencionados en la 35 sección 1), presentan inmunogenicidad alta en “ensayo in vitro” (figura 5). Los lisados de células necróticas inducidas por 2 h de incubación a 46,5ºC sin recultivo (sección 1, muestra A) indujeron un pequeño aumento en la reacción de linfocitos T CD8+.

5. Vacunación de ratones mediante lisado de células tumorales humanas tratadas con temperatura 40

a) Ratones NMRI “normales”

Se vacunaron ratones NMRI por vía subcutánea con lisados de células tumorales tratadas con temperatura (5x106 células/ratón) de células F9 obtenidas de K562 (NM-F9). Después de 2 semanas, los ratones se reforzaron con la misma vacuna tumoral. No hubo crecimiento del tumor ni se observaron otros efectos secundarios durante el periodo de vacunación. Un día antes de la inmunización y 9 y 27 45 días después de inmunización, se sacó sangre a los ratones para analizar en el suero anticuerpos para TF, Tn, MUC 1 y asialoglicoforina A mediante ELISA. Para estos análisis se recubrieron placas de 96 pocillos con conjugado de poliacrilamida-disacárido-Thomsen-Friedenreich (TF-PAA), conjugado de Tn-monosacárido-PAA (Synthesome, Munich, Alemania), asialoglicoforina A (AGPA, Sigma) (2 µg/ml en 50 µl de PBS) y MUC 1 (diluida 1:40 en PBS, la dilución óptima se determinó por el anticuerpo anti-MUC1 50 A76-A/C7) purificada del líquido sobrenadante de células tumorales como se describe en el documento PCT/EP03/08014 (Después de incubación durante la noche a 4ºC, las placas de 96 pocillos se lavaron con Tween 20 al 0,05% en PBS (tampón de lavado), se bloquearon con BSA al 5%, Tween 20 al 0,05% en PBS (1,5 h de incubación a T.a.) y se lavaron otra vez en tampón de lavado 3 veces. Las placas de 96 pocillos recubiertas se incubaron con diferentes diluciones de sueros de ratones durante 2 h a 55 temperatura ambiente. Los anticuerpos purificados A76-A/C7, A78-G/A7 (Cao (1997), Virchows Arch. 431, 159-166) y Tn-HB1 (diluido 1:500, Dako, Hamburg, Alemania) se usaron como controles positivos. Para el control negativo el anticuerpo primario se sustituyó por medio. Después de lavar 3 veces con el tampón de lavado, las placas se incubaron con IgM o IgG contra ratón marcada con peroxidasa (aislada de conejo, diluida 1:5000, Dianova). Finalmente las placas se lavaron con tampón de lavado 2 veces y con PBS 1 vez. El ELISA se desarrolló con o-fenildiamina 0,4 mg/ml (Sigma) en tampón de fosfato-citrato 25 mM pH 5,0 con H2O2 al 0,04% a temperatura ambiente (en la oscuridad). La reacción de color se paró por adición de ácido sulfúrico 2,5 N (concentración final 0,07 N) y se analizó con un lector de ELISA a 490 nm (filtro de referencia a 630 nm). 5

b) Activación específica de la respuesta inmunitaria de anticuerpo de IgG humana en el modelo de ratón NOD/SCDI por vacunación con diferentes lisados de células tumorales pretratadas con temperatura

Los ratones NOD-SCID proporcionan un modelo de ratón usado habitualmente, popular debido a su sistema inmunitario deficiente. En estos ratones, el sistema inmunitario humano se establece por 10 aplicación intraperitoneal de linfocitos de sangre periférica humana en ratones irradiados un día antes (PBL, preparación estándar, 5x107 células/ratón). 2-4 h después de la aplicación de PBL, los ratones se vacunaron por vía subcutánea con lisados de células tumorales de células no tratadas, apoptóticas, necróticas o que expresan HSP 70, en forma de una emulsión con adyuvante incompleto de Freund (5x106 células/ratón, células + adyuvante = 100 µl). Después de 14 días, los ratones se reforzaron con 15 los mismos lisados celulares. Los lisados celulares de células MI624 (5x106 células/ratón) se usaron como control negativo. No había pruebas de crecimiento de tumor ni otros efectos secundarios en los ratones NOD-SCID. Para analizar los sueros se sacó sangre a los ratones los días 13 y 28 después de la primera inmunización. Los análisis se llevaron a cabo por ELISA como se ha descrito antes, aquí la dilución del anticuerpo anti-IgG humano marcado con POD secundario era 1:10000. 20

Resultados de los análisis in vivo

Se indujo una respuesta inmunitaria humoral de IgG contra todos los antígenos ensayados en casi todos los ratones NMRI y ratones NOD-SCID vacunados con lisado de células necróticas inducidas con temperatura (tablas 2 y 3). Una respuesta inmunitaria de IgG contra el antígeno de hidratos de carbono TF y Tn es inusual porque la inmunización de ratones con antígeno TF normalmente induce una 25 respuesta inmunitaria de IgM. Esto debe indicar que la activación de la respuesta inmunitaria por lisados de células inducidas con temperatura es un procedimiento de inmunización superior que implica un cambio de la clase de anticuerpo asociada con una respuesta inmunitaria de linfocitos T cooperadores así como la inducción de respuestas inmunitarias de memoria contra los antígenos anteriores. Se indujo una respuesta inmunitaria de IgG humana específica en un sistema inmunitario murino así como en un 30 sistema inmunitario humano implantado. Los lisados celulares de células necróticas indujeron claramente una respuesta inmunitaria humoral específica más fuerte que los lisados celulares de células apoptóticas. Los lisados celulares de células tumorales con mayor expresión de HSP 70 (inducción con temperatura a 41,2ºC) no indujeron una respuesta inmunitaria humoral específica en ninguno de los modelos de ratones (tablas 2 y 3). Esto no está según los resultados de otros autores (Dressel (2000), citado antes; Feng 35 (2001), citado antes; Melcher, (1998), citado antes; Todryk (2000), citado antes) que describían una fuerte respuesta inmunitaria inducida por células con expresión aumentada de HSP 70. Los lisados celulares de células tumorales no tratadas indujeron solo respuestas inmunitarias humorales específicas pobres.

Claims

40 REIVINDICACIONES

1. Un lisado que se puede obtener por un procedimiento que comprende las etapas de

(a) inducir necrosis en células NM-F9 (depósito DSMZ nº DSM Acc2606) o en células NM-D4 (depósito DSMZ nº DSM Acc2605) a una temperatura de más de 41,2ºC durante al menos 15 minutos; y

(b) lisar dichas células necróticas para así obtener un lisado, 5

en el que el lisado que se puede obtener por dicho procedimiento es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral contra el antígeno TF.
2. El lisado de la reivindicación 1, en el que dicha inducción de necrosis se logra por incubación de dichas células a una temperatura de más de 42ºC.
3. El lisado de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha inducción de necrosis se logra por incubación 10 de dichas células a una temperatura de más de 45ºC a 55ºC.
4. El lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha inducción de necrosis se logra por incubación de dichas células a una temperatura en el intervalo de 45,5ºC a 47ºC.
5. El lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha inducción de necrosis se lleva a cabo en el intervalo de 2 a 3 horas. 15
6. Células dendríticas cargadas con el lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Una composición que comprende un lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o las células dendríticas de la reivindicación 6.
8. La composición de la reivindicación 7, que es una composición farmacéutica.
9. La composición de la reivindicación 7, que es una composición de vacuna. 20
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 o la composición de vacuna de la reivindicación 9, que se combina opcionalmente con un adyuvante.
11. Las células dendríticas de la reivindicación 6 o la composición de la reivindicación 7, en las que dichas células dendríticas son inmaduras.
12. Las células dendríticas de la reivindicación 6 o la composición de la reivindicación 7, en las que 25 dichas células dendríticas son maduras.
13. Un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende la etapa de combinar un lisado celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o las células dendríticas de la reivindicación 6, con un adyuvante.
14. Un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende la etapa de 30 combinar un lisado celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Uso del lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de las células dendríticas de la reivindicación 6, para preparar una composición farmacéutica o de vacuna para el tratamiento o prevención de cánceres o enfermedades tumorales. 35
16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicho cáncer o enfermedad tumoral es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema genitourinario, sistema ginecológico, mama, sistema endocrino, piel, en la infancia, cáncer metastásico o de sitio primario desconocido, un sarcoma del tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, un neoplasma del sistema nervioso central, un linfoma, una leucemia, un síndrome paraneoplásico, una carcinomatosis peritoneal, un tumor 40 maligno relacionado con inmunosupresión y/o cáncer metastásica.
17. El lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de las células dendríticas de la reivindicación 6, para usar en el tratamiento o prevención de cánceres o enfermedades tumorales.
18. El lisado o células dendríticas para usar según la reivindicación 17, en el que dicho cáncer o enfermedad tumoral es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema 45 genitourinario, sistema ginecológico, mama, sistema endocrino, piel, en la infancia, cáncer metastásico o de sitio primario desconocido, un sarcoma del tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, un neoplasma del sistema nervioso central, un linfoma, una leucemia, un síndrome paraneoplásico, una carcinomatosis peritoneal, un tumor maligno relacionado con inmunosupresión y/o cáncer metastásico.

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