ES2262242T3 - Uso de ligandos de mhc de clase ii como adyuvantes para la vacunacion y lag-3 en el tratamiento del cancer. - Google Patents

Uso de ligandos de mhc de clase ii como adyuvantes para la vacunacion y lag-3 en el tratamiento del cancer.

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Abstract

La presente invención se refiere a la utilización de un ligando CMH de clase II, como por ejemplo CD4 y LAG-3, para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar estados patológicos que implican una respuesta inmunitaria específica de antígeno, así como a la utilización de LAG-3 en la inmunoterapia contra el cáncer. La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un antígeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno junto con una cantidad eficaz de un ligando CMH de clase II, estando presente dicho ligando CMH de clase II como agente de tipo adyuvante.

Description

Uso de ligandos de MHC de clase II como adyuvantes para la vacunación y LAG-3 en el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere al uso de LAG-3 y de CD4, y de un modo más general, al uso de ligandos de MHC de clase II o a ligandos tipo MHC de clase II como adyuvantes para vacunas, con el fin de disparar una respuesta inmune específica de un antígeno, así como al uso de LAG-3 como agente terapéutico en la inmunoterapia de cáncer.
Hoy día se sabe que las proteínas codificadas por la región de MHC de Clase II participan en muchos aspectos del reconocimiento inmune, incluyendo la interacción entre diferentes células linfoideas tales como los linfocitos y las células que presentan antígenos. Diferentes observaciones también han demostrado que otros mecanismos que no tienen lugar vía CD4 participan en la función efectora de los linfocitos colaboradores T.
El gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) expresado en células T humanas activadas CD4+ y CD8+ así como en células NK activadas codifica una proteína de membrana de tipo I de 503 aminoácidos (aa) con cuatro dominios (1) de superfamilia de inmunoglobulina extracelular (IgSF) y es un ligando de moléculas de MHC de clase II (2). El análisis de esta secuencia reveló notables parcelas de identidad con extensiones de secuencias de aminoácidos en las correspondientes posiciones del CD4, aunque la homología global de secuencia de aminoácidos con CD4 humano apenas se encuentra por encima del nivel de ruido de fondo (aproximadamente un 20% de identidad de secuencia). También existen algunas homologías internas de secuencia en la molécula de LAG-3 entre los dominios 1 (D1) y 3 (D3), así como entre los dominios 2 (D2) y 4 (D4), lo que sugiere que el LAG-3 ha evolucionado como el CD4 mediante duplicación génica a partir de una estructura 2 IgSF preexistente (1). Adicionalmente, los genes LAG-3 y CD4 se encuentran en estrecha proximidad en la parte distal de la rama corta del cromosoma 12 (3). Por tanto, el LAG-3 y el CD4 pueden ser considerados como "primos hermanos" evolucionarios con respecto al IgSF
(2).
Al igual que el CD4, el hLAG-3 está compuesto por ectodominios tipo Ig con una estructura de firma WxC en los dominios 2 y 4; sin embargo una diferencia con el CD4 es la presencia de una secuencia de extralazo en el dominio 1 (reconocida por 17B4mAb) y una estructura intracitoplásmica rica en prolina (repeticiones EP) en el LAG-3 humano (hLAG-3). Recientemente, el gen de activación de linfocitos de murina 3 (mLAG-3, del inglés "murine lymphocyte activation gene 3") ha sido clonado y se descubrió aproximadamente un 70% de homología con el hLAG-3, con la misma estructura rica en prolina en la cola intracitoplásmica.
La estimulación específica de antígeno de los clones de célula T CD4+ en presencia de anti-LAG-3 mAb conduce a una proliferación extendida y a la producción de citoquinas (5). Se ha sugerido un papel regulador del hLAG-3 sobre T CD4+ activado por linfocito, por entrecruzamiento con moléculas de MHC de clase II expresadas en células T con proteínas de fusión Ig de LAG-3 (6). La interacción entre LAG-3 y MHC de clase II inhibe las señales a través de las moléculas de MHC de clase II expresadas sobre células T CD4+ (disminución de la proliferación y de la producción de citoquinas), lo que sugiere que tanto el LAG-3 como el MHC de clase II son moléculas efectoras de la regulación a la baja de la célula colaboradora T mediada por respuestas inmunes. Se descubrió que la proteína de fusión Ig hLAG-3 se unía a moléculas xenogénicas de MHC de clase II (murina y mono). Adicionalmente, se ha propuesto que el mLAG-3 transduce una señal positiva en las células efectoras, ya que ratones transgénicos con una mutación nula en LAG-3 presentan un defecto en el compartimiento de células NK (7).
Las líneas de células tumorales de ratón diseñadas para expresar membrana (B7.1, B7.2, CD95L, ...) o moléculas segregadas (IL-2, IL-12, ...) son usadas a menudo para investigar respuestas inmunes o efectos antitumorales. Esta estrategia implica que muchas células tumorales son potencialmente antigénicas (9), y se vuelven inmunogénicas cuando expresan moléculas. Los tumores de ratón experimentales se clasifican como intrínsecamente inmunogénicos cuando, después de una inyección sencilla en ratones singénicos como vacunas celulares no replicantes, provocan una respuesta inmune protectora contra un posterior episodio letal. Los tumores que no retienen esta inmunogenicidad residual se definen como poco inmunogénicos o como no inmunogénicos.
Las respuestas inmunes antitumorales están mediadas principalmente por células T (12). Estudios recientes han implicado a un déficit en la presentación eficaz de antígenos y en la imprimación de células T como problemático para la implementación práctica de una vacuna tumoral ideal. De hecho, se ha demostrado que transfectar células tumorales con genes que codifican varias citoquinas, tales como IL-2, IL-4, IL-12 o GM-CSF, o con genes que codifican moléculas co-estimuladoras tales como B7 no sólo conducen a un rechazo primario de las células modificadas sino que a menudo provocan una inmunidad protectora contra posteriores agresiones de células tumorales no modificadas
(13).
Las células profesionales que presentan antígeno (APCs, del inglés "professional antigen presenting cells") son capaces de captar, procesar y presentar antígenos a las células T en el contexto de señales co-estimuladoras requeridas para la activación de células T, conduciendo a una presentación de antígenos óptima. En concreto, es bien sabido que las células dendríticas (DCs, del inglés "dendritic cells") de MHC de clase II+ desempeñan un papel crucial en el procesado y en la presentación de antígenos al sistema inmune. Los inventores propusieron la hipótesis de que la inmunogenicidad tumoral aumentaría si el tumor pudiera ser modificado para activar directamente APCs hospedantes tales como macrófagos y células dendríticas. De hecho, se ha publicado que el entrecruzamiento de moléculas de MHC de clase II específicamente expresadas por dichas células, usando mAb o superantígenos, transduce las señales dando como resultado una producción de TNF\alpha y de IL-12 (14, 15). Previamente habían publicado que el Gen de Activación de Linfocitos 3 (LAG-3), que se encuentra embebido en la posición de CD4 (1, 16), codifica una proteína que se une a moléculas de MHC de clase II humanas y de murina con mayores afinidades que el CD4 (17, 6).
También se ha descrito que el CD4 disminuye la carga de VIH cuando se administra junto con un antígeno de VIH (EP 0 385 909) o que interfiere con la unión de receptores de CD4 de célula T a VIH mediada por gp 120 (WO 81/02 922).
Además, las solicitudes de patente internacionales WO 96/20 245 y WO 96/17 874 describen ambas que los ligandos de MHC de clase II presentan un efecto inmunosupresor, por interferencia con la unión de moléculas activantes de MHC II o por regulación a la baja de la expresión molecular de MHC II.
Los inventores de la presente solicitud han investigado si la expresión de hLAG-3, CD4 humano (hCD4) y mLAG-3 sobre tres tumores de ratón de MHC de clase II (el sarcoma poco inmunogénico MCA 205 y el adenocarcinoma no inmunogénico TS/A+RENCA) pueden mediar una respuesta inmune para rechazar el tumor de ratón y si puede inducir inmunidad sistémica.
Como resultado, han descubierto que el LAG-3 de humano o de murina, cuando se expresa en forma de proteínas de membrana en líneas de células tumorales sólidas o cuando es inoculado en ratones en forma de proteína soluble, induce una potente inmunidad frente a tumores de murina altamente malignos. La inmunidad es dependiente de células T y es específica de antígeno.
También han investigado el papel del CD4 y han descubierto que el CD4 humano (hCD4) también induce una respuesta antitumoral sistémica.
Se ha descubierto que la inmunidad inducida está mediada por células T, ya que se obtuvo la misma respuesta antitumoral con ratones nude que carecían de linfocitos T.
El efecto antitumoral todavía era evidente cuando se usaron diferentes líneas de células tumorales que presentaban diferentes inmunogenicidades intrínsecas, así como diferentes cepas de ratones que expresaban diferentes genes de MHC.
Además, se observaron los efectos inducidos por hLAG-3 y por hCD4 cuando las líneas de células tumorales que expresan hLAG-3 o hCD4 fueron inyectadas en una posición distante de la posición inicial de inoculación de las líneas de células tumorales naturales.
Además, la administración sistémica de hLAG-3 soluble induce directamente una inhibición del crecimiento tumoral in vivo.
Todos los resultados anteriores demuestran que el LAG-3 y el CD4 son capaces de provocar una respuesta inmune mediada por células T específica de antígeno, y que pueden ser útiles como herramienta de inmunoterapia, con el fin de evitar la aparición de un cáncer en poblaciones de riesgo o, más generalmente, en cualquier inmunoterapia que incluya una respuesta inmune mediada por células T específica de antígeno, y que el LAG-3 además es útil como herramienta para inhibir el crecimiento tumoral in vivo.
Adicionalmente, los inventores han demostrado que el LAG-3 soluble, cuando se administra junto con un antígeno contra el que se busca una respuesta inmune, fue capaz de funcionar como adyuvante en una vacuna.
Este papel puede explicarse mediante una presentación mejorada del antígeno por APCs profesionales (células dendríticas y macrófagos) localizados debajo de la piel y activados vía MHC de clase II.
Del mismo modo, ya que la inducción de inmunidad de células T CD8+ participa en infecciones víricas (por ejemplo, SIDA, hepatitis y herpes) e intracelulares parasitarias y bacterianas (por ejemplo, tuberculosis leprosa) y en el cáncer, el LAG-3 será particularmente útil en la vacunación terapéutica contra los agentes patógenos que participan en estas enfermedades así como en el tratamiento de cáncer.
De acuerdo con uno de sus aspectos, la presente invención se refiere al uso de un ligando de MHC de clase II o a un ligando de tipo MHC de clase II para la fabricación de un medicamento para la prevención o para el tratamiento de afecciones patológicas que impliquen una respuesta inmune específica de antígeno, preferiblemente una respuesta inmune mediada por células T específica de antígeno.
En una primera realización, la molécula de unión de MHC de clase II es LAG-3 así como sus derivados, capaces de unirse al ligando de clase MHC del LAG-3.
Por derivados de LAG-3, en el sentido de la presente invención, se entiende mutantes, variantes y fragmentos de LAG-3, a saber fragmentos solubles de LAG-3, siempre que mantengan la capacidad del LAG-3 para unirse a moléculas de MHC de clase II.
Por tanto, se pueden usar las siguientes formas de LAG-3:
\bullet
la proteína de LAG-3 completa,
\bullet
un fragmento de polipéptido soluble de la misma, que consiste en al menos uno de los cuatro dominios extracelulares de inmunoglobulina, a saber la parte soluble del LAG-3 compuesta por la región extracelular que se extiende desde el aminoácido 23 hasta el aminoácido 448 de la secuencia de LAG-3 descrita en la solicitud de Patente Francesa FR 90 00 126,
\bullet
un fragmento de LAG-3 que consiste en sustancialmente todo el primer y el segundo dominios,
\bullet
un fragmento de LAG-3 que consiste en sustancialmente todo el primer y el segundo dominios o todos los cuatro dominios, tal como se define en el documento WO 95/30750, tal como
\bullet
una forma mutante de LAG-3 soluble o un fragmento de la misma que comprende los dominios extracelulares D1 y D2 y que consiste en:
\bullet
una sustitución de un aminoácido en una de las siguientes posiciones:
-
posición 73 en la que ARG se sustituye por GLU,
-
posición 75 en la que ARG se sustituye por ALA ó GLU,
-
posición 76 en la que ARG se sustituye por GLU,
o una combinación de dos o más de dichas sustituciones,
\bullet
una sustitución de un aminoácido en una de las siguientes posiciones:
-
posición 30 en la que ASP se sustituye por ALA;
-
posición 56 en la que HIS se sustituye por ALA;
-
posición 77 en la que TYR se sustituye con PHE;
-
posición 88 en la que ARG se sustituye con ALA;
-
posición 109 en la que ASP se sustituye con GLU;
-
posición 115 en la que ARG se sustituye con ALA;
o una eliminación de la región comprendida entre la posición 54 y la posición 66,
o una combinación de dos o más de dichas sustituciones.
Esos mutantes se describen en PNAS, Junio de 1997 (4).
\bullet
o una variante fisiológica de LAG-3 que comprende una proteína soluble de 52 kD que contiene D1, D2 y D3.
De acuerdo con una segunda realización, la proteína de unión de MHC de clase II es CD4 o un derivado suyo capaz de unirse al ligando de MHC de clase II de CD4.
Los derivados de CD4 son tal como se ha definido para los derivados de LAG-3. Son mutantes, variantes y fragmentos de CD4, a saber fragmentos solubles de CD4, siempre que mantengan la capacidad del CD4 de unirse a moléculas de MHC de clase II.
El LAG-3 y el CD4, es decir el hLAG-3 y el hCD4 o sus derivados tales como los definidos anteriormente, pueden ser administrados como restos recombinantes que expresan dichas moléculas, por ejemplo células transfectadas o virus recombinantes.
De acuerdo con una realización preferida, la proteína de unión de MHC de clase II, a saber CD4 o LAG-3 o su derivado, se administra en una forma libre, es decir en una forma soluble, mediante inoculación sistémica, por ejemplo en la forma de una inyección s.c., i.m. ó i.v.
El medicamento de acuerdo con la invención puede ser usado como vacuna para prevenir los trastornos asociados a una respuesta inmune específica de antígeno, preferiblemente una respuesta inmune mediada por células T.
Con ese fin, se administra un vehículo adecuado junto con uno o varios antígeno(s) contra los que se busca la respuesta inmune. El antígeno puede ser un agente infeccioso desactivado o atenuado o un antígeno purificado, obtenido finalmente mediante procedimientos de recombinación de proteínas, tal como un antígeno de un agente infeccioso o un antígeno tumoral, que preferiblemente sean capaces de provocar una respuesta inmune mediada por
células T.
La vacuna puede ser usada para proteger a un sujeto frente a una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad vírica, bacteriana o parasitaria, en la que el agente infeccioso provoca una respuesta inmune específica de antígeno, preferiblemente una respuesta inmune mediada por células T.
La vacuna también puede ser usada para tratar un paciente frente a una enfermedad infecciosa tal como se ha mencionado anteriormente, que implique una respuesta inmune mediada por células T, es decir una respuesta inmune mediada por células T CD8+.
En la siguiente tabla se proporcionan ejemplos de enfermedades que requieren un estímulo de una inmunidad existente mediada por células T.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA
Patógenos Agentes Enfermedades
Virus VIH SIDA
VHB, VHC Hepatitis
HSV, CMV, HHV Rechazo de transplante, Sarcoma de Kaposi
HTLV1 Cáncer
Bacterias Listeria Listeriosis
intracelulares Micobacterias Leprosis, Tuberculosis
Parásitos Plamodium Malaria
intracelulares Etc.
Oncogenes La mayoría de carcinomas, melanomas, leucemia
Etc. 
\vskip1.000000\baselineskip
En dichos casos, el antígeno es troceado en las células y los correspondientes péptidos son cargados en moléculas de MHC de clase I y presentados en la superficie de las células, donde son reconocidas por células CD8+. Los resultados de los inventores, que demuestran que las moléculas de LAG-31g inducen una respuesta de células T eficaz en animales y que estimulan dendrítico inmaduro y monocitos in vitro, sugieren firmemente que el LAG-3 es un adyuvante natural de células T en las situaciones en las que puede entrecruzarse con moléculas de MHC de clase II en APCs profesionales.
La vacuna también puede usarse para proteger a un sujeto frente al cáncer, tanto de tumor sólido como de leucemia.
La vacuna también puede usarse para tratar a un paciente de cáncer.
En ese caso, la proteína de unión de MHC de clase II, es decir LAG-3 ó CD4, es administrada a un sujeto subcutáneamente, intradermalmente o como spray nasal junto con uno o varios antígenos capaces de provocar una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta inmune mediada por células T. El antígeno puede ser un péptido, un lipopéptido, una proteína recombinante o un ADN que codifica estos antígenos.
La vacuna contra el cáncer puede ser inoculada a poblaciones de riesgo identificadas por su genotipo (vacuna preventiva) o a pacientes (vacuna terapéutica) que portan un tumor o que presentan un elevado riesgo de recaída después de ser sometidos a cirugía.
Tanto si la vacuna se usa como vacuna convencional (preventiva) o como vacuna terapéutica, puede administrarse como un plásmido "desnudo" (19) que incorpora una secuencia de ADN que codifica LAG-3 ó CD4, preferiblemente bajo el control de un promotor potente.
Asimismo, preferiblemente el plásmido contiene ADN que codifica el antígeno contra el cual se busca una respuesta inmune.
Un objetivo adicional de la presente invención es, por tanto, una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un ligando de MHC de clase II en combinación con una cantidad eficaz de un antígeno capaz de estimular el sistema inmune, preferiblemente mediante una respuesta a células T.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de LAG-3 como un medicamento para inmunoterapia contra el cáncer en pacientes que tienen un tumor canceroso.
En ese caso, el LAG-3 es administrado preferiblemente como una proteína de LAG-3 libre o como un derivado de la misma en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un derivado soluble tal como se ha definido previamente.
El LAG-3 puede administrarse como una inyección intratumoral o como una inyección sistémica, por ejemplo s.c., i.v. ó i.m.
Los siguientes ejemplos demuestran la actividad del LAG-3 y del CD4 en la prevención o en el tratamiento de afecciones patológicas que impliquen una respuesta inmune mediada por células T.
Para facilitar la comprensión de la invención, se hace referencia a las figuras incorporadas al presente documento:
\bullet La figura 1 representa el tamaño tumoral medio correspondiente a ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales MCA 205 naturales (MCA WT), con células tumorales MCA 205 transfectadas con hCD4 (MCA hCD4) y células tumorales MCA 205 transfectadas con hLAG-3 (MCA hLGA-3);
\bullet La figura 2 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos después de enfrentar los mismos ratones con células tumorales MCA naturales en una dosis tumorigénica mínima;
\bullet La figura 3 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos después de enfrentar los mismos ratones con la línea de células tumorales irrelevantes MC 38;
\bullet La figura 4 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos con una cepa de ratones diferente (BALB/c) y con una línea de células tumorales diferente (TS/A), tanto natural (TS/A wt) o transfectada con hCD4 (TS/A hCD4) o con hLAG-3 (TS/A hLAG-3);
\bullet La figura 5 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos con tumores existentes tratados con diferentes dosis de células MCA que expresan hLAG-3;
\bullet La figura 6 representa los resultados (tamaño tumoral medio) obtenidos con LAG-3 soluble inyectado junto con células MCA (MCA wt, MCA wt + 25 \mug de LAG-3 y MCA wt + 250 \mug de LAG-3);
la figura que está dentro del marco de la figura 6 representa el porcentaje de ratones con tumor;
\bullet Las figuras 7 y 8 representan los resultados de expresión de LAG-3 en la membrana de linfocitos que se infiltran en el tumor (TILs, del inglés "tumor infiltrating lymphocytes") en cinco pacientes (P1-P5) que tienen un carcinoma de célula renal (RCC, del inglés "renal cell carcinoma");
\bullet La figura 9 ilustra el rechazo de células tumorales hLAG-3+ mediado por linfocitos CD8+.
a) análisis FACS de expresión de CD8 por TILs de ratones de control (wt MCA 205) en comparación con TILs de ratones MCA 205 hLAG-3. b) las células T CD8+ contribuyen al control del crecimiento tumoral de hLAG-3 TS/A. Los ratones recibieron i.p. 200 \mug purificados de CD4 ó de mAb específico de CD8 en los días -3, -2, -1, +4 y +8. Las células tumorales naturales o de hLAG-3 TS/A (MTD) fueron inoculadas s.c. en el día 0. Los datos son las medias \pm s.e.m. de 5 ratones en cada grupo a partir de un único experimento. Estos experimentos fueron realizados por duplicado con resultados similares. c) Actividad incrementada de CTLs antitumorales en ratones que habían rechazado células hLAG-3 TS/A. Los ratones recibieron transplantes s.c. de 5 x 10^{4} células hLAG-3 TS/A y fueron expuestos en el día nº 30 a 2,5 x 10^{5} células TS/A originales. Se extrajeron los bazos en el día nº 60 en los ratones sin tumor y las células fueron co-cultivadas durante 6 horas con las células objetivo indicadas que habían sido irradiadas. Se examinó la actividad citolítica contra las células objetivo indicadas en un ensayo de liberación de ^{51}Cr estándar de 4 h con diferentes relaciones efector/objetivo (E:T, del inglés "Effector:Target"). Se muestran los resultados correspondientes a dos ratones. Estos experimentos fueron llevados a cabo dos veces sobre 4 ratones con resultados similares.
\bullet La figura 10 representa los resultados (tamaño tumoral medio) de ratones (ratones 20 C57BL/6) a los que se había injertado un MTD de células de sarcoma MCA 205 singénicas que recibieron una única inyección de vacuna de LAG-3Ig. En el sexto día, se formaron 4 grupos de 5 ratones y se les administró una única inyección s.c. de vacuna (200 \muL). El Ag está representado por células MCA 205 irradiadas (100 Gy).
Los experimentos ilustrados en los ejemplos fueron llevados a cabo usando los siguientes materiales y métodos.
Materiales y métodos 1 Líneas de células tumorales
Las líneas de células tumorales de MHC de Clase I^{+} y de Clase II^{-} fueron: la línea de células de sarcoma MCA 205 poco inmunogénico inducido con metilcolantreno, (singénica de ratones C57BL/6 H-2^{b}), la línea de células de carcinoma renal inmunogénico RENCA y la línea de células de adenocarcinoma espontáneo mamario TS/A no diferenciado y no inmunogénico (ambas singénicas de ratones BALB/C H-2^{d}). La línea de células de carcinoma de colon MC38 (singénica de ratones C57BL/6) fue usada en un experimento de repetición como tumor de control. Las células fueron mantenidas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10% en aire humidificado, en un medio completo (medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con glutamina, piruvato sódico, penicilina/estreptomicina, suero fetal de ternero libre de endotoxinas al 10% y 2-p-mercaptoetanol 0,05 M). Para los experimentos de inmunotinción y para los experimentos in vivo, las células fueron extraídas de sus recipientes de cultivo con PBS que contenía EDTA 1 mM. Antes de la inyección sub-cutánea (s.c.), las células fueron lavadas tres veces en PBS frío 1X y fueron resuspendidas en el mismo tampón. Las células no fueron cultivadas por más de dos semanas.
2 Ratones
Se compraron ratones C57BU6 hembra, de 6 u 8 semanas de edad, a IFFRA-CREDO Laboratories (Lyon, Francia). Se compraron ratones BALB/c hembra, de 4 a 8 semanas de edad, a JANVIER Laboratories, (Francia). Todas estas cepas de ratones fueron criadas en condiciones específicamente libres de patógenos. Se compraron hembras Nude en las instalaciones de animales del Instituto Gustave Roussy y fueron mantenidas en microentornos protegidos.
3 Constructos genéticos
Los cADNs de hLAG-3, mLAG-3 y hCD4 fueron clonados en vector de plásmido de higromicina NT (las posiciones de clonación son XbaI para el hLAG-3 y el hCD4 y Xhol para el mLAG-3, bajo promotor SR\alpha (1B). Como control negativo se usó el hcADN de LAG-3 clonado con una orientación inversa. Todas las líneas de células tumorales (2,5 x 10^{6} células) fueron transfectadas mediante electroporación usando un aparato Eurogentec (Bélgica): células MCA 205 a 200 V, células TS/A y RENCA a 300 V, 1500 \muF y resistencia de derivación infinita. Los transfectantes fueron seleccionados en higromicina B (Sigma): MCA 205 en 100 \mug/mL, transfectantes de RENCA y de TS/A en 200 \mug/mL. Las células resistentes que expresan las moléculas transfectadas fueron identificadas usando un citofluorímetro Elite (Coulter, Hialeah, FL) y fueron clonadas mediante dilución limitante. En este estudio se usó el mejor clon para cada construcción de cada una de las líneas de células tumorales.
4 Análisis citofluorimétrico
Las células resistentes que expresan las moléculas transfectadas fueron teñidas mediante inmunofluorescencia indirecta, con cantidades de saturación de mAbs purificado de fluidos de ascites. En primer lugar las células fueron incubadas con mAbs: 17B4 (anti-hLAG-3.1) (2), OKT4 (anti-hCD4), con un pre-inmunosuero de conejo (denominado PIS) usado como control negativo y con un inmunosuero de conejo anti-mLAG-3 (denominado IS). La expresión de moléculas de MHC de murina de clase I y II sobre los tumores fue detectada con los siguientes mAbs: 34-1-2S para H-2 K^{d} y D^{d}, 28-8-6S para H-2 K^{b} y D^{b}, 14-4-4S (para E^{d}), M50114 (para IA e IE).
A continuación las células fueron lavadas e incubadas con suero anti-ratón de cabra conjugado con FITC (GAM Coulter) o con suero anti-conejo de cabra conjugado con FITC (GAR Southern Biotechnologies Inc.). Para estudiar la presencia de células infiltrantes o el reclutamiento de células en la periferia del tumor, se mató algunos ratones y se les extrajeron los tumores. Las células fueron sometidas a tinción mediante inmunofluorescencia directa, con 17B4-FITC o con los siguientes mAbs (Pharmingen): anti-mCD4-PE (L3T4), anti-mCD8 (Ly-2 y Ly-3.2), anti-mNK (2B4) y anti-mCD22 (Lyb-8.2). Las células fueron clasificadas usando un citofluorímetro Elite (Coulter).
A continuación las líneas de células positivas fueron clonadas limitando la dilución. Los clones LAG-3+ o CD4+ fueron congelados para su uso posterior.
Para generar moléculas de LAG-3 solubles, los dominios extracelulares de hLAG-3 y de mLAG-3 fueron fusionados a las porciones hIgG1 y mIgG2a Fc, respectivamente, tal como se describe en (6). Las proteínas recombinantes resultantes, hLAG-3Ig y mLAG-3Ig, fueron producidas en células CHO y purificadas en columnas de proteína-A.
5 Experimentos con tumores in vivo 5.1. Establecimiento del crecimiento tumoral y vacunación
El establecimiento de las líneas de células tumorales se llevó a cabo s.c. usando la dosis tumorigénica mínima (MTD, del inglés "minimal tumorigenic dose") con 2\cdot10^{5} células/ratón para MCA 205, 5\cdot10^{4} células para TS/A y 10^{5} células para RENCA o cinco veces la MTD. Los ratones que no tenían tumor 30 días después de la inyección fueron enfrentados a la línea de células tumorales original (5 x MTD). Se usó la línea de células de carcinoma de colon MC38 con 10^{5} células como control del tumor en ratones C57BL/6 que rechazaron el tumor de TS/A. Se inyectaron líneas de células tumorales a ratones naive C57BU6 ó BALB/c de edad igualada.
Se siguió la evolución del crecimiento tumoral dos o tres veces por semana midiendo dos diámetros perpendiculares del tumor usando calibres. El día de los experimentos tumorales in vivo, las células fueron analizadas con un citofluorímetro y se realizó un ensayo de proliferación in vitro.
5.2. Modelos de terapia de tumores
En el día 0, se inocularon líneas de células tumorales naturales s.c. en el dorso izquierdo (MTD). En los días 0, 3 ó 6, se inyectaron células tumorales de LAG-3+ en el dorso derecho (MTD ó cinco veces MTD) para determinar los efectos antitumorales sobre las células transfectadas en una posición distante. El crecimiento tumoral fue seguido como se ha descrito anteriormente.
5.3. Para los análisis citométricos, se inoculó ratones s.c. con 5 x MTD células tumorales tal como se ha descrito anteriormente. En el día 8 los tumores fueron disociados y analizados con los mAbs CD3-PE, CD4-PE, CD8-PE, CD80-FITC, CD86-FITC, 2B4-PE (célula NK), CD22-PE (célula B) ó hLAG-3 con un citofluorímetro Elite (Coulter).
5.4. Para el agotamiento de linfocitos, los ratones recibieron i.p. 200 \mug de mAb purificado (18) anti-CD4 (YTS 191.1.2) o anti-CD8 (YTS 169.4.2.1) en los días -3, -2, -1, +4 y +8. Se inocularon s.c. células tumorales naturales o de hLAG-3 TS/A en el día 0 (MTD). El análisis citofluorimétrico de los ratones de control que recibieron estas dosis de mAb mostró más de un 95% de reducción de la población objetivo en el bazo (datos no mostrados).
6 Estudios in vitro
Para los análisis de citotoxicidad, se generaron CTL específicos de tumor a corto plazo usando un cultivo mixto de células tumorales y linfocitos. En resumen, en el día 30 se recogieron 3 x 10^{7} células de bazo de ratones que habían rechazado tumores establecidos. Estas células fueron estimuladas con 3 x 10^{6} células tumorales originales irradiadas en un medio completo durante 4 días, y a continuación fueron suplementadas con 50 UI/mL de hIL-2 recombinante (CETUR) durante 2 días. Se evaluaron las funciones efectoras de los esplenocitos en el día 6 en un ensayo estándar de 4 h de liberación de ^{51}Cr (relaciones efector/objetivo de 25/1 a 200/1) contra células objetivo marcadas: células tumorales antólogas, un sarcoma irrelevante H-2^{d} WEHI 164 y una línea de células YAC sensibles a NK. El porcentaje de lisis de por triplicado fue calculado como [(cpm experimental media - cpm espontánea media) / (cpm máximo medio - cpm espontáneo medio)] x 100. Definimos la lisis específica como la lisis de esplenocitos de ratón que rechazaron células tumorales menos la lisis de esplenocitos de ratón naive.
Resultados Ejemplo I Expresión superficial de moléculas de hCD4, hLAG-3, mLAG-3 y MHC sobre líneas de células tumorales
Los clones de tumor transfectado fueron sometidos a tinción tal como se detalla en la sección 2.2, y fueron analizados para comparar el nivel de expresión de hCD4, hLAG-3 y mLAG-3. En este estudio se usó el mejor clon de cada constructo. Las siguientes líneas de células tumorales TS/A expresan niveles elevados de moléculas de MHC de clase I y las MCA 205 expresan niveles bajos de MHC de clase I. No se observó ninguna diferencia significativa entre la expresión de MHC de clase I sobre las líneas de células tumorales originales en comparación con los clones transfectados.
Ejemplo II Modelos de establecimiento de tumores y vacunación: Efectos comparativos de hCD4 y hLAG-3
Estos experimentos fueron llevados a cabo para examinar la tumorigenicidad de las células después de la transfección génica: MCA 205 y TS/A tal como se muestra en las figuras 1 y 4 y RENCA. La inducción de inmunidad antitumoral del tumor LAG-3+ fue comparada con las líneas de células tumorales originales.
Las células naturales de MCA 205, TS/A y RENCA crecieron progresivamente una vez que fueron implantadas subcutáneamente en ratones singénicos C57 BL/6 o en ratones BALB/C o en ratones nu/nu. Las células tumorales transfectadas establemente después de la selección de hidromicina con el cADN de hLAG-3 clonado con una orientación inversa presentaron una tasa de crecimiento similar.
Los animales que recibieron MCA-LAG-3 rechazaron su tumor. Los animales que recibieron MCA-CD4 presentaron un menor crecimiento tumoral que los animales que recibieron MCA natural. Dos de ellos (de un total de 5) rechazaron completamente el tumor (figura 1).
Se obtuvieron resultados similares con el mLAG-3 (datos no mostrados).
Estos resultados indican que la expresión ectópica de hLAG-3, mLAG-3 y hCD4 aumenta la inmunogenicidad de la línea de células de sarcoma de MCA y evita la formación de tumores de transfectante de MCA, es decir, induce una potente inmunidad frente a un tumor de murina altamente maligno.
Se obtuvieron resultados similares con las células tumorales de TS/A en ratones BALB/c (figura 2).
Además, se obtuvieron resultados similares con las células tumorales de RENCA en ratones singénicos BALB/C.
Por tanto, se obtiene un efecto antitumoral:
\bullet
en diferentes cepas de ratones que expresan diferentes genes complejos de MHC;
\bullet
usando diferentes líneas de células tumorales (que presentan diferentes inmunogenicidades intrínsecas, TS/A < MCA).
Se inocularon ratones Nude (nu/nu) con células tumorales de tipo MCA wt, MCA hLAG-3 y MCA hCDA, y los transfectantes crecieron de forma similar.
Esto sustenta el hecho de que las inmunidades sistémicas, de larga duración, específicas de tumor, activadas por hLAG-3 o por hCD4, están mediadas por células T.
Los ratones que habían sido inoculados previamente con MCA wt, MCA hLAG-3 y MCA hCD4, y que no presentaban tumor después de 30 días desde la inyección con MTD, fueron expuestos de nuevo (1 vez) a cinco veces la MTD de línea de células tumorales original o a una línea de células de carcinoma de colon MC 38 singénica no relacionada.
Los resultados se representan en las figuras 2 y 3.
Después de esta exposición, el crecimiento de MCA wt se retrasó en los animales supervivientes, tanto en los que recibieron células MCA-LAG-3 como en los que recibieron células MCA-CD4 (figura 2).
Dicho efecto no se observó en los animales que fueron expuestos de nuevo a MC38 tumoral irrelevante (figura 3).
Esto indica que tanto la expresión ectópica de hLAG-3 como la de hCD4 presentan un efecto adyuvante e inducen una inmunidad específica de antígeno de larga duración contra el tumor original no modificado.
Ejemplo III Terapia de tumores de MCA wt en ratones C57BL/6 con MCA-hLAG-3
Se usaron tres grupos de cinco ratones cada uno para el experimento.
Cada grupo fue inoculado en un dorso con MCA wt y tres días después, con MCA wt (grupo 1), con MCA-hLAG-3 con 2\cdot10^{5} células (grupo 2) y con MCA-hLAG-3 con 1\cdot10^{6} células (grupo 3).
Se midió el tamaño del tumor original en cada grupo a lo largo de 30 días. Los resultados se presentan en la figura 5.
La inyección de MCA-hLAG-3 retrasó el crecimiento tumoral de un modo dependiente de la dosis.
Este experimento confirma el efecto sistémico del LAG-3 sobre el crecimiento tumoral, e indica que el LAG-3 constituye un agente terapéutico contra los tumores sólidos.
Ejemplo IV Terapia de tumores de MCA 205 en ratones C57BU6 con LAG-3 soluble
Se inoculó simultáneamente a tres grupos de cinco ratones cada uno con MCA wt suspendido en PBS (grupo 1) o en PBS que contenía LAG-3 humano soluble (shLAG-3 D1D4) en cantidades de 25 \mug (grupo 2) o de 250 \mug (grupo 3).
Se midió el tamaño de los tumores correspondiente a cada grupo a lo largo de un periodo de 30 días.
Los resultados se presentan en la figura 6.
La co-administración de hLAG-3 D1D4 indujo un retardo en el crecimiento tumoral dependiente de la dosis.
Esto demuestra que la administración sistémica de hLAG-3 soluble induce directamente una inhibición en el crecimiento tumoral in vivo.
Ejemplo V Expresión in vivo de LAG-3 en linfocitos tumorales humanos (TILs) que se infiltran en carcinoma de célula renal (RCC)
En humanos, el LAG-3 se expresa en tejidos (es decir, en órganos linfoideos secundarios inflamados) pero no sobre la superficie de PBMCs (3), ni siquiera en PBMCs CD25+ o CD69+ activados in vivo. El LAG-3 es expresado con niveles más elevados en las células CD8+ restringidas de MHC de clase I activado que en las células CD4+ restringidas de MHC de clase II (3) y la inducción de expresión de LAG-3 por IL-12, o por la combinación más potente de IL-2 + IL-12, es más fuerte sobre células CD8+ que sobre células CD4+. El LAG-3 es un antígeno de activación de expresión débil tanto in vitro como in vivo, y a veces es difícil determinar el porcentaje y/o la especificidad del marcado por fluorescencia en tumores recién disociados. Puesto que el LAG-3 puede interferir con APCs de MHC de clase II+ en los tumores humanos, establecimos su expresión en una serie de tumores de los que se sabe que son infiltrados por células T, usando inmunohistoquímica (el procedimiento APAAP). En todas las muestras evaluadas se detectó expresión de LAG-3 sobre TILs, incluyendo 5 melanomas, 10 adenocarcinomas de célula renal y 7 linfomas de célula B.
Se investigó con ocho pacientes para evaluar la expresión de LAG-3 sobre linfocitos que se infiltran en el tumor en los tumores de carcinoma de célula renal.
Los tumores disociados fueron usados para los experimentos con ensayos citofluorimétricos. La expresión de LAG-3 fue estudiada entre la población de linfocitos, determinada por su tamaño y granulosidad. Las células muertas fueron excluidas del estudio por tinción con yoduro de propidio. Las TILs fueron teñidas positivamente con 17B4, un anticuerpo monoclonal específico del epítopo del extralazo de LAG-3.
Los resultados se presentan en la figura 7 para los pacientes P1-P3 y en la figura 8 para los pacientes P4 y P5.
Para todos los pacientes, se observó un cambio en el pico de fluorescencia que mostró la unión del anticuerpo 17B4 en la superficie de los linfocitos.
Por tanto, en todos los pacientes, las TILs expresaron realmente LAG-3 con un porcentaje significativo (30%) de RCC-TIL en los pacientes no relacionados.
En todas las muestras se observó que las células T CD3+ expresan LAG-3 (intervalo del 11% al 48%) con una mayor expresión en las células T CD8+.
Por el contrario, en estos pacientes las células mononucleares sanguíneas periféricas fueron LAG-3^{-}, lo que demuestra que la expresión de LAG-3 sobre linfocitos es un fenómeno relacionado con la activación de células T en tumores.
Además, usando un ensayo ELISA, se descubrieron elevadas concentraciones (de aproximadamente 1 ng/mL) de LAG-3 soluble en la sangre de los pacientes con cáncer.
Estos datos demuestran que el LAG-3 es una molécula implicada en la respuesta antitumoral que se produce de forma natural en los humanos, y apoyan el uso de LAG-3 para activar la inmunovigilancia de células tumorales en humanos.
Ejemplo VI Las células T CD8+ median en el rechazo primario
El rechazo de transfectantes de hLAG-3 MCA 205 y de TS/A fue dependiente de linfocitos T, ya que no se observó rechazo alguno en ratones nu/nu deficientes en células T. Después de la inyección de 5 x MTD de estas células, se escindieron tumores de 10 mm de diámetro en el octavo día, y se analizaron tanto células tumorales disociadas como linfocitos infiltrados mediante FACS. Los tumores naturales, así como los transfectantes de LAG-3, inicialmente CD80^{-} y CD86^{-}, se mantuvieron negativos para estas tres marcas después de la inoculación, mientras que el LAG-3 fue detectado constantemente sobre los tumores hLAG-3 usando el mAb anti-LAG-3 17B4 (datos no mostrados). En el octavo día de los tumores extraídos, el porcentaje de células CD8+ fue de aproximadamente del 31% en los tumores hLAG-3 MCA 205 frente a un 4% en los tumores MCA wt 205 (Figura 9a), mientras que no se observó diferencia alguna cuando se analizaron los subconjuntos de células CD4+, B ó NK. Se obtuvieron resultados similares con los tumores TS/A (datos no mostrados). Finalmente, se examinó la contribución respectiva de las células T CD4+ y CD8+ a la respuesta antitumoral mediante el agotamiento de estos subconjuntos de células en los ratones. Como se muestra en la Figura 9b, la administración del mAb específico de CD8 en el momento de la inoculación de MTD de hLAG-3/TS/A abroga el rechazo de células tumorales hLAG-3/TS/A. Se sugiere la participación de células T colaboradoras CD4+ por el efecto parcial observado con el mAb específico de CD4 (Figura 9b).
Ejemplo VII La respuesta CTL específica de tumor se ve potenciada por hLAG-3
Para definir aún más el mecanismo que se esconde detrás de la actividad antitumoral del LAG-3, evaluamos su efecto sobre la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL), la eliminación de células TS/A no inmunogénicas. Se tomaron esplenocitos de ratones a los que se había implantado el tumor hLAG-3/TS/A y que fueron capaces de rechazar 5 x MTD wt de células tumorales en los experimentos de exposición, y fueron reestimulados in vitro durante 6 días con células TS/A irradiadas. Se detectó actividad CTL en los esplenocitos de ratones con implantes de células tumorales hLAG-3 (Figura 9c), mientras que los esplenocitos procedentes de animales naive no presentaron ninguna actividad citotóxica (datos no mostrados). Parece ser que la actividad CTL es selectiva para las células TS/A no inmunogénicas, ya que las células de sarcoma de WEHI singénicas, así como las células YAC sensibles a NK, no se vieron sometidas a lisis (Figura 9c).
Ejemplo VIII Terapia de tumores establecidos
Los inventores han demostrado que se puede lograr el control del crecimiento tumoral usando una molécula de LAG soluble como adyuvante de una vacuna. Una única inyección de una mezcla del antígeno (células tumorales irradiadas) junto con el activador (mLAG-3Ig, 1 \mug ó 0,1 \mug) fue eficaz (Figura 10).
Se asume que las moléculas de LAG-3 solubles in vivo podrían señalizar células de Langerhans (o cualquier APC presente en la localización de la vacuna) a través de moléculas de MHC de clase II para imprimar eficazmente células T CD8+.
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Claims (11)

1. El uso de un ligando de MHC de clase II que provoca una respuesta inmune específica de antígeno y que es seleccionado del grupo que consiste en CD4, LAG-3, y un derivado de CD4 o de LAG-3 que mantenga la capacidad de unirse a moléculas de MHC de clase II a las que se unen el CD4 o el LAG-3, respectivamente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa o de cáncer.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ligando de MHC de clase II provoca una respuesta inmune mediada por células T específica de antígeno.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho ligando de MHC de clase II activa una inmunidad mediada por células T existente.
4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ligando de MHC de clase II se administra en combinación con un antígeno frente al cual se busca una respuesta inmune.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígenos víricos, bacterianos y parasitarios.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho antígeno es un antígeno tumoral.
7. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho derivado de LAG-3 que mantiene la capacidad de unirse a las moléculas de MHC de clase II a las que se une el LAG-3 es un mutante o un fragmento soluble de LAG-3.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho fragmento soluble de LAG-3 se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos D_{1}-D_{2} y D_{1}-D_{4} de LAG-3.
9. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicho tratamiento de una enfermedad infecciosa o de cáncer implica una respuesta inmune que depende de células T CD8^{+}.
10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad vírica, una enfermedad bacteriana y una enfermedad parasitaria.
11. El uso de LAG-3 soluble de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, para la fabricación de un medicamento para la inmunoterapia contra el cáncer y para la inmunoterapia contra una enfermedad infecciosa.
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