ES2354360T3 - Anticuerpo anti-interleucina-9 o anticuerpo del receptor anti-interleucina-9 para el tratamiento de la hiperreactividad bronquial. - Google Patents

Abstract

Utilización de un anticuerpo que es un anticuerpo anti-interleucina-9 o un anticuerpo del receptor de anti-interleucina-9 que bloquea la unión de la interleucina-9 al receptor de la interleucina-9 para la preparación de un medicamento para la reducción de la hiperreactividad bronquial en un paciente.

Description

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Referencia Cruzada a la Solicitud Asociada

Esta solicitud está relacionada con la Solicitud Provisional de Estados Unidos con Número de Serie 60/002.765 que se presentó a 24 de agosto de 1995. 10

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a la actividad reguladora de IL-9 y al tratamiento de la hiperreactividad bronquial en base a la relación entre la IL-9 y 15 su receptor.

Antecedentes de la Invención

La inflamación es un proceso complejo en el que el sistema de defensa 20 del cuerpo lucha contra entidades extrañas. Aunque la lucha contra entidades extrañas pueda ser necesaria para la supervivencia del cuerpo, algunos sistemas de defensa responden inadecuadamente a entidades extrañas tanto inocuas como peligrosas y, con ello, dañan el tejido circundante en la lucha resultante. 25

La alergia atópica es un trastorno ecogenético en el que el antecedente genético dicta la respuesta a los estímulos ambientales. En general, el trastorno se caracteriza por un aumento de la capacidad de los linfocitos para producir anticuerpos IgE como respuesta a antígenos ubicuos. La activación del sistema 30 inmune por estos antígenos conduce a una inflamación alérgica y puede ocurrir después de la ingesta, penetración por la piel o después de su inhalación. Cuando se produce esta activación inmune y se origina la inflamación pulmonar, en general este trastorno se denomina como asma. Ciertas células son críticas en esta reacción inflamatoria e incluyen células T y células presentadoras de 35 antígenos, células B que producen IgE y mastocitos/basófilos, así como eosinófilos que se unen a IgE. Estas células inflamatorias se acumulan en el

sitio de inflamación alérgica y los productos tóxicos que liberan contribuyen a la destrucción del tejido relacionado con el trastorno.

Aunque en general se define el asma como un trastorno inflamatorio de las vías aéreas, de la obstrucción intermitente del flujo aéreo resultan síntomas 5 clínicos. Se trata de un trastorno crónico incapacitante que, según parece, está aumentando en cuanto a su frecuencia y gravedad1. Se estima que el 30-40% de la población padece de alergia atópica, un 15% de niños y un 5% de adultos de la población padece asma2. Por tanto, representa una enorme carga para nuestros recursos en materia del cuidado de la salud. 10

El mecanismo de sensibilidad a la atopía y al asma sigue siendo desconocido. Curiosamente, mientras la mayoría de los individuos experimenta exposiciones ambientales similares, sólo ciertos individuos desarrollan alergia atópica y asma. Esta hipersensibilidad a los alérgenos ambientales conocida por 15 “atopía” a menudo viene indicada por niveles elevados en suero de IgE o por una respuesta anormalmente importante a la prueba cutánea a los alérgenos en individuos atópicos en comparación con los no-atópicos10. La firme evidencia de una estrecha relación entre la alergia atópica y el asma deriva del hecho de que la mayoría de los asmáticos tienen evidencias clínicas y serológicas de atopía4-9. 20 En particular, los asmáticos más jóvenes tienen una alta incidencia de atopía10. Además, factores inmunológicos asociados a un incremento en los niveles de IgE total en suero están estrechamente relacionados con una función pulmonar dañada3.

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Tanto el diagnóstico como el tratamiento de estos trastornos son problemáticos1. Con frecuencia, la valoración del tejido pulmonar inflamado es difícil y, frecuentemente, no se puede determinar el origen de la inflamación. Sin conocimiento del origen de la inflamación de las vías aéreas y protección contra el agente o agentes ambientales extraños que inciden, no se puede interrumpir 30 el proceso inflamatorio. Ahora se acepta generalmente que la incapacidad de controlar la inflamación pulmonar conduce con el tiempo a una pérdida significativa de la función pulmonar.

Los tratamientos actuales presentan su propio conjunto de 35 inconvenientes. Los principales agentes terapéuticos, los agonistas β, reducen los síntomas, es decir que mejoran transitoriamente las funciones pulmonares, pero no influyen en la inflamación subyacente, de modo que el tejido pulmonar

sigue en peligro. Además, el uso constante de agonistas β resulta en una insensibilización que reduce su eficacia y seguridad2. Agentes que pueden disminuir la inflamación subyacente, esteroides antiinflamatorios, tienen su propia lista conocida de inconvenientes, que van desde inmunosupresión hasta pérdida ósea2. 5

Debido a los problemas asociados a las terapias convencionales, se han evaluado estrategias de tratamiento alternativas65-66. La glicoforina A64, la ciclosporina65 y un fragmento no peptídico de IL-263 inhiben todos la proliferación de linfocitos T dependientes de la interleucina-2 y, por tanto, la producción de IL-10 951; sin embargo, son conocidos por tener numerosos otros efectos1. Por ejemplo, la ciclosporina se utiliza como inmunosupresor después del transplante de órganos. Aunque estos agentes pueden representar alternativas a los esteroides en el tratamiento del asmático63-66, inhiben la proliferación de linfocitos T dependientes de la interleucina-2 así como funciones inmunes 15 potencialmente críticas asociadas a la homeostasis. En la técnica es necesaria la identificación de una vía crítica en el desarrollo del asma que explique la naturaleza episódica del trastorno y la estrecha asociación con la alergia que se desarrolla como consecuencia de estas funciones inmunes críticas. La naturaleza ha demostrado que esta vía es el objetivo apropiado para la terapia, 20 ya que habitualmente existe una variabilidad biológica en esta vía y generalmente estos individuos además no están inmunocomprometidos o enfermos excepto por sus síntomas de atopía.

Debido a las dificultades relacionadas con el diagnóstico y el tratamiento 25 del asma, la patofisiología compleja de este trastorno está siendo estudiada intensivamente. Aunque este trastorno es heterogéneo y puede ser difícil de definir debido a que puede adoptar muchas formas, se encuentran ciertas características comunes entre los asmáticos. Ejemplos de dichos rasgos incluyen niveles elevados de IgE en suero, respuesta anormal a la prueba 30 cutánea de alérgenos, hiperreactividad bronquial [BHR], reversibilidad broncodilatadora y obstrucción del flujo aéreo3-10. La expresión de estos fenotipos relacionados con el asma se puede estudiar en forma de medidas cuantitativas o cualitativas.

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Los altos niveles de IgE también se relacionan estrechamente con la BHR, respuesta broncoconstrictora intensificada a una variedad de estímulos4,6,8,9. Se piensa que la BHR refleja la presencia de inflamación de las

vías aéreas6,8 y se considera un factor de riesgo para el asma11-12. La BHR viene acompañada de inflamación bronquial y de diátesis alérgica en individuos asmáticos13-21. Incluso en niños sin síntomas de atopía ni de asma, la BHR se asocia frecuentemente con altos niveles de IgE19.

5

Múltiples estudios documentan un componente hereditario de la atopía y del asma4,10,21. Sin embargo, ha resultado difícil interpretar estudios de familias, ya que estos trastornos se ven influenciados notablemente por la edad y el género, así como por muchos factores ambientales tales como alérgenos, infecciones virales y contaminantes22-24. Además, debido a que no existe ningún 10 defecto bioquímico conocido asociado a la predisposición a estos trastornos, los genes mutantes y sus productos genéticos anormales sólo pueden ser reconocidos por los fenotipos anómalos que producen. Por tanto, una primera etapa importante en el aislamiento y caracterización de un componente hereditario es la identificación de las localizaciones cromosómicas de los genes. 15

Cookson y col. proporcionaron la primera descripción de una localización genética para la atopía heredada25. Estos investigadores aportaron pruebas de la conexión genética entre la atopía y un único marcador en una región cromosómica específica designada como 11q13.1. Más tarde, sugirieron la 20 evidencia de la herencia materna de la atopía en este locus26. Aunque se había observado la herencia materna [impresión genética] para la atopía, nunca se había explicado anteriormente. Sin embargo, en general los esfuerzos para confirmar esta conexión no tuvieron éxito27-31.

25

Recientemente, la subunidad β del receptor de alta afinidad de IgE se mapeó en el cromosoma 11q y se ha descrito en este gen una mutación putativa asociada a la atopía32,33. Sin embargo, debido a las dificultades por otros en la replicación de este enlace, el significado de este gen y del polimorfismo sigue sin aclarar. Aunque se requieran estudios adicionales para confirmar si esta 30 mutación putativa provoca atopía en la población general, los datos recogidos hasta ahora sugieren que es poco probable que este polimorfismo represente una causa frecuente de atopía.

Debido a que los niveles de IgE en suero están muy estrechamente 35 asociados al inicio y la gravedad de la alergia y del asma como trastornos clínicos, se ha centrado la atención en estudios de la regulación genética de los niveles totales de IgE en suero. Aunque estudios anteriores han proporcionado

la evidencia de la herencia mendeliana para los niveles totales de IgE en suero34-39, indicación de la existencia de un gen regulador, otros han encontrado evidencias de una herencia poligénica del IgE, es decir la existencia de varios genes responsables39.

5

Los técnicos han descubierto diversos genes que pueden resultar importantes en la regulación del IgE y en el desarrollo o la progresión de la inflamación bronquial asociada al asma en el cromosoma 5q. Incluyen genes que codifican varias interleucinas, tales como IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, factor estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos [GM CSF], un receptor para 10 el factor estimulante de colonias de macrófagos [CSF-1R], un factor de crecimiento para fibroblastos ácido, así como otros40. La reciente evidencia derivada de estudios de familias sugiere la conexión genética entre los niveles de IgE en suero y los marcadores de ADN en la región de estos genes candidatos en el cromosoma Sq41,42. En su conjunto, estas investigaciones 15 sugieren que uno o más genes principales cerca del complejo de las interleucinas en el cromosoma 5q regulan una cantidad significativa de la variabilidad biológica observada en el IgE en suero que, probablemente, es importante en el desarrollo de la atopía y del asma.

20

Se utilizó también el enlace [análisis sib-pair] antes de identificar una localización genética para BHR79. Ya que se sabía que la BHR estaba asociada a un gen mayor para la atopía, se examinaron las regiones cromosómicas consideradas como importantes en la regulación de los niveles de IgE en suero42. Se han identificado regiones candidatas para la atopía mediante 25 análisis de enlaces. Estos estudios identificaron la existencia de un gen mayor para la atopía en el cromosoma humano 5q31-q3343.

Por tanto, para determinar el emplazamiento cromosómico de un gen(es) que proporciona la predisposición a la BHR, que sería co-heredada con un gen 30 mayor para la atopía, se llevaron a cabo experimentos utilizando análisis de enlace entre la BHR y los marcadores genéticos en el cromosoma 5q42,79,82. Se identificaron los individuos con BHR por hiperreactividad a la histamina. Se muestran en la Figura 1 los marcadores útiles para mapear los genes asociados al asma. 35

Específicamente, los genes candidatos para el asma, la hiperreactividad bronquial y la atopía se muestran [a la derecha] en su emplazamiento

aproximado con relación a los marcadores mostrados. El mapa incluye los genes de las interleucinas IL-4, Il-13, IL-5 e IL-3; CDC25, ciclo-25 de la división celular; CSF2, factor estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos [GMCSF]; EGR1, gen-1 de respuesta de crecimiento temprano; CD14, antígeno 14 celular; ADRB2, receptor adrenérgico β2; GRL1, receptor de glucocorticoides 5 específicos de linfocitos; PDGFR, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas. Las bandas 5q31-q33 se extienden aproximadamente desde IL-4 hasta D5S410. Las distancias reportadas son fracciones de recombinación promediadas por sexo.

10

Los análisis sib-pair afectados demostraron una evidencia estadísticamente significativa de la conexión entre BHR y D5S436, D5S658 y otros marcadores localizados próximos al cromosoma 5q31-q3379. Estos datos se apoyan firmemente en la hipótesis de que uno o más gen(es) estrechamente espaciados en el cromosoma 5q31-q33 determinan la predisposición a la BHR, 15 atopía y asma 79,80,81,82.

Recientemente también se ha demostrado la conexión entre el fenotipo del asma y los marcadores genéticos en el cromosoma 5q31-q3383. Esta región del genoma humano se evaluó en cuanto a su conexión con el asma debido al 20 gran número de genes que representaban candidatos posicionales razonables para proporcionar la predisposición genética a la atopía y a la BHR.

Se demostró la conexión mediante los métodos descritos anteriormente42,82. Específicamente, se analizaron 84 familias procedentes de 25 Holanda tanto con sib-pair como con LODs para marcadores procedentes de esta misma región del cromosoma 5q para los que se había demostrado su conexión a la BHR y a la atopía42,82. Se utilizó un algoritmo para categorizar la enfermedad obstructiva de las vías aéreas en las probandas asmáticas y sus familias. Este esquema de clasificación se basó, tal como se ha descrito 30 anteriormente, en la presencia o ausencia de BHR hacia la histamina, síntomas respiratorios, historia de fumador significativa [> 5 paquetes al año], atopía según se define por la respuesta a la prueba cutánea, obstrucción de las vías aéreas [FEV1% previsto < 95% CI] y reversibilidad a un broncodilatador [> 9% previsto]. 35

Se encontraron evidencias para la conexión entre el asma y los marcadores en el cromosoma 5q mediante análisis sib-pair afectados (N=10, P

< 0,05) y mediante análisis de probabilidad máxima con un modelo dominante para el fenotipo asmático83.

El asma estaba relacionada con D5S658 con un LOD máximo de 3,64 a θ = 0,03, usando un modelo dominante [clase 1 afectado, clase 2-4 incierto, clase 5 5 no afectado] con una frecuencia génica de 0,015 [frecuencia del 3%]. Se observó un LOD máximo de 2,71 a θ = 0,0 para D5S470, lo cual es aproximadamente telomérico de 5cM o alejado de IL-9 con relación a D5S43683.

Posteriormente a la presentación original de esta solicitud, se sugirió la 10 posible importancia de la IL-9 o de un gen cercano para su uso en atopía y asma43. La sugerencia de IL-9 se basada en una fuerte correlación, en una población establecida al azar, entre el logaritmo de los niveles totales de IgE en suero y los alelos de un marcador genético en el gen de IL-942. Este tipo de asociación con uno o más alelos específicos de un marcador se denomina 15 “desequilibrio de conexión” y generalmente sugiere que un gen cercano determina la variabilidad biológica bajo estudio44.

Se ha mapeado el gen de IL-9 en la región q31-q33 del cromosoma 540. Solamente se encuentra una única copia del gen en el genoma humano45,46. Se 20 ha observado una similitud estructural para los genes de IL-9 murinos y humanos45,46. Cada gen consiste en cinco exones y cuatro intrones que se extienden a través de aproximadamente cuatro Kb de ADN. La expresión del gen parece estar restringida a las células T activadas45,46.

25

En la actualidad, las funciones de IL-9 se extienden mucho más allá de las originalmente reconocidas. Aunque la IL-9 sirve como factor de crecimiento de las células T, también se sabe que esta citoquina media el crecimiento de progenitores eritroides, células B, mastocitos y timocitos fetales45,46. La IL-9 actúa de manera sinérgica con la IL-3 causando la proliferación y activación de 30 mastocitos. Esta citoquina también potencia la producción inducida por IL-4 de IgE, IgG e IgM mediante linfocitos B humanos normales. IL-9 también potencia la liberación inducida por IL-4 de IgE e IgG1 mediante linfocitos B murinos49. También se ha demostrado un papel crítico para la IL-9 en la respuesta inflamatoria mucosal a la infección parásita50,51. 35

Además de la IL-9, el cromosoma 5q porta numerosos otros candidatos genéticos que incluyen IL-3, IRF1, EGR1, ITK, GRL1, ADRB2, CSF1R, FGFA,

ITGA2, CD14, PDGFR, CDC25, CSF2, IL-4, IL-5, IL-12B e IL-13. Todos ellos pueden ser importantes en la alergia atópica y ser objetivos potenciales para el desarrollo terapéutico. Además, la técnica carece de conocimiento respecto a cómo la secuencia de IL-9 o la función de IL-9 se correlaciona específicamente con la alergia atópica, el asma o la hiperreactividad bronquial. Sin tales 5 conocimientos, los técnicos no sabrían cómo o si usar la IL-9 para tratar o diagnosticar estos trastornos.

La técnica estipula que la IL-9 es una nueva citoquina que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente entre 20 y 30 kD según se determina 10 por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio bajo condiciones reductoras. Se produce como una proteína de 144 aminoácidos, que se procesa hasta una glicoproteína de 126 aminoácidos. Yang y col.85 describen que la secuencia de ADN que codifica la IL-9 comprende aproximadamente 630 nucleótidos, con aproximadamente 450 nucleótidos en el 15 marco de lectura apropiado para la proteína.

También es conocido en la técnica que se pueden generar múltiples isoformas proteicas a partir de un único locus genético mediante empalme alternativo. El empalme alternativo es un mecanismo eficaz por el cual se 20 pueden generar múltiples isoformas proteicas a partir de un único locus genético. Se utiliza el empalme alternativo en células terminalmente diferenciadas para modificar de manera reversible la expresión proteica sin cambiar el contenido genético de las células. Preferiblemente estas isoformas proteicas se expresan en tejidos diferentes o durante estados diferentes de la 25 diferenciación o activación celular. Las isoformas proteicas pueden tener funciones diferentes y Alms y White han clonado y expresado una variante de empalme de origen natural de IL-4, formado mediante la omisión del exón 2 denominada IL-4δ286. Se observó que la IL-4δ2 inhibe la proliferación de células T inducida por IL-4. 30

Sin embargo, la técnica carece de cualquier conocimiento sobre las isoformas proteicas de IL-9, las cuales se forman mediante deleciones de los exones 2 y 3, o de las funciones reguladoras mostradas por estas proteínas truncadas. Específicamente, su papel en la regulación de la actividad biológica, 35 a saber, la subregulación de la expresión o actividad de IL-9, no está clara. Además, no se ha observado o usado previamente la formación de tales

isoformas mediante empalme alternativo para proporcionar variantes de IL-9 que funcionen como agonistas o antagonistas de las citoquinas nativas.

La técnica también carece de cualquier conocimiento sobre el papel del receptor de IL-9 en los trastornos relacionados con el asma. Se sabe que la IL-9 5 se une a un receptor específico expresado sobre la superficie de las células diana46,52,53. En realidad, el receptor consiste en dos cadenas proteicas: una cadena proteica, conocida como receptor de IL-9, se une específicamente con la IL-9 y la otra cadena proteica es la cadena que se tiene en común con el receptor de IL-246. Además, se ha clonado el ADNc del receptor de IL-9 10 humano46,52,53. Este ADNc codifica una proteína de 522 aminoácidos la cual muestra una homología significativa con el receptor de IL-9 murino. La región extracelular del receptor está altamente conservada, existiendo una homología del 67% entre las proteínas murinas y las humanas. La región citoplásmica del receptor está menos altamente conservada. El dominio citoplásmico humano es 15 mucho mayor que la región correspondiente del receptor murino.

También se ha caracterizado el gen del receptor de IL-952. Se piensa que existe como copia única en el genoma de ratón y está compuesto de nueve exones y ocho intrones53. El genoma humano contiene al menos cuatro 20 pseudogenes del receptor de IL-9. Se ha mapeado el gen del receptor de IL-9 humano en la región subtelomérica de 320 kb de los cromosomas sexuales X e Y46. Aún así, a pesar de estos estudios, la técnica carece de cualquier conocimiento de una relación entre el receptor de IL-9 y la alergia atópica, el asma o la hiperreactividad bronquial. 25

Por tanto, en la técnica se desconoce cómo el gen de IL-9, su receptor y sus funciones están relacionados con la alergia atópica, el asma, la hiperreactividad bronquial y sus trastornos relacionados. Por tanto, existe una necesidad específica en la técnica de información genética sobre la alergia 30 atópica, el asma, la hiperreactividad bronquial y sobre la aclaración del papel de la IL-9 en la etiología de estos trastornos. También existe una necesidad de dilucidar el papel del receptor de IL-9 y del gen del receptor de IL-9 en estos trastornos. Además, de forma más significativa, e base a este conocimiento, existe la necesidad de identifica aquellos agentes que son capaces de regular la 35 interacción entre IL-9 y su receptor para tratar estos trastornos.

Sumario de la Invención

El solicitante ha satisfecho la necesidad que se sentía desde hacía mucho tiempo de un tratamiento para la reducción de la hiperreactividad bronquial al proporcionar información que demuestra el papel de la IL-9 (también 5 conocida como Factor-1 Asociado al Asma o AAFI) en la patogénesis de estos trastornos, información que ha llevado a compuestos que son capaces de regular la actividad de IL-9. El solicitante también ha demostrado la conexión conservada y las homologías por sintenía entre ratones y humanos para un gen que determina la variabilidad biológica en la hiperreactividad de las vías aéreas. 10 Estas relaciones identifican específicamente la IL-9 como candidato genético. Además, el solicitante ha determinado que la IL-9 es crítica en diversas respuestas inducidas por antígeno en ratones, incluyendo la hiperreactividad bronquial, la eosinofilia y recuentos celulares elevados en el lavado bronquial, así como una IgE total elevada en suero. Estos descubrimientos tipifican la 15 inflamación alérgica asociada al asma.

Además, el solicitante ha determinado en un aspecto referencial que una variación de ácido nucleico C a T en la posición 3365 del exón 5 del gen humano de IL-9 produce la sustitución prevista del aminoácido de una metionina 20 por una treonina en el codón 117 de IL-9. Cuando esta sustitución tiene lugar en ambos alelos en un individuo, se asocia con una menor evidencia de alergia atópica, incluido el asma, menos respuestas anormales a las pruebas cutáneas y un menor nivel de IgE total en suero. Por tanto, el solicitante ha identificado la existencia de un fenotipo no-asmático, no-atípico caracterizado por la metionina 25 en el codón 117 en ambos productos genéticos de IL-9 en un individuo. Como corolario significativo adicional, el solicitante ha identificado la existencia de una predisposición a un fenotipo asmático atópico caracterizado por una treonina en el codón 117. Por tanto, la invención incluye moléculas de ADN purificado y aislado que tienen dicha secuencia, así como los péptidos codificados por dicho 30 ADN.

La actividad biológica de IL-9 resulta de su unión al receptor de IL-9 y de la subsecuente propagación de una señal reguladora en células específicas. Así, las funciones de IL-9 pueden ser interrumpidas o reguladas por la 35 interacción de los agonistas o antagonistas de IL-9 con IL-9 o su receptor. La subregulación, es decir la reducción de las funciones controladas por IL-9, se consigue en unos días. La administración de los agonistas o antagonistas que

pueden interrumpir la unión de IL-9 a su receptor es un mecanismo clave y dichos agonistas y antagonistas están incluidos en la invención reivindicada. Los ejemplos incluyen la administración de productos polipeptídicos codificados por las secuencias de ADN de IL-9 o del receptor de IL-9, conteniendo las secuencias de ADN varias mutaciones. Estas mutaciones pueden ser 5 mutaciones puntuales, inserciones, deleciones o variantes empalmadas de IL-9 o su receptor.

Otro aspecto incluye la regulación de la actividad de IL-9 mediante la administración de "agonistas y antagonistas". El especialista en la técnica 10 reconocerá fácilmente que todas las moléculas que contienen la conformación estructural tridimensional requerida y que contienen los residuos esenciales o críticos para la unión al receptor se encuentran dentro del alcance de esta invención. Específicamente, los residuos 43-60 y 71-90 de la proteína madura parecen ser importantes para la unión del receptor. El solicitante ha demostrado 15 que los péptidos KP-16 (residuos 43-60) y KP-20 (residuos 71-90) actúan como antagonistas del receptor. Además, se prevé que estos residuos en la molécula nativa de IL-9 formen estructurales helicoidales antiparalelas. La estructura tridimensional de la proteína sugiere que específicamente la serina 52 y/o el ácido glutámico 53 interactúan con la lisina 85, la serina 56 interactúa con la 20 lisina 82 y la treonina 59 interactúa con la valina 78. Las coordenadas tridimensionales de estas hélices antiparalelas y grupos funcionales relacionados representan la conformación tridimensional requerida crítica para la unión del receptor y los compuestos que simulan estas relaciones se encuentran dentro del alcance de esta invención. 25

La actividad biológica del receptor de IL-9 (también denominada Factor 2 asociado al asma, AAF2) se puede modular mediante la utilización de moléculas solubles del receptor de IL-9. Tales moléculas impiden la unión de IL-9 al receptor unido a la célula y actúan como antagonistas para IL-9, encontrándose 30 también dentro del alcance de esta invención.

Los anticuerpos policlonales y monoclonales que bloquean la unión de IL-9 a su receptor están también dentro del alcance de esta invención y son agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de la alergia atópica, incluyendo el 35 asma y trastornos relacionados.

Otro aspecto referencial se refiere a la utilización de secuencias aisladas de ADN que contienen varias mutaciones, tales como mutaciones puntuaes, inserciones, deleciones o mutaciones empalmadas de IL-9 o del receptor de IL-9, en la terapia genética.

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La expresión de IL-9 y del receptor de IL-9 está subregulada también mediante la administración de una cantidad eficaz de secuencias de oligonucléotidos antisentido sintéticos. Los compuestos oligonucleotídicos se unen al ARNm que codifica para la IL-9 humana y el receptor de IL-9, inhibiendo así la expresión de estas moléculas. 10

Se ha examinado y analizado de forma muy detallada la estructura tanto de IL-9 como del receptor de IL-9 y se han identificado los residuos de aminoácidos de IL-9 críticos para la unión del receptor. En base a estudios estructurales y de las características de unión de este par específico de unión, 15 otro aspecto incluye además pequeñas moléculas adaptadas para que su conformación estructural proporcione a los residuos lo esencial para bloquear la interacción de IL-9 con el receptor de IL-9. Dicho bloqueo resulta en la modulación de la actividad del receptor y estas moléculas son, por tanto, útiles en el tratamiento de alergias atópicas. 20

Otro aspecto se dirige a la regulación de las vías de señalización aguas abajo necesarias para la función de IL-9. La IL-9 induce la fosforilación de la tirosina de States que parece ser única para la vía de señalización de IL-954 y que es útil como diana para los inhibidores. Los inhibidores específicos y no 25 específicos de la tirosina-quinasa, tales como las tirofostinas, son, por tanto, útiles en la regulación aguas abajo de la actividad fisiológica de IL-9. En otro aspecto, los compuestos aminoesterol son útiles también en el tratamiento de alergias atópicas y trastornos relacionados, debido a que también están involucrados en el bloqueo de la transducción de señales de la vía de 30 transducción de señales de IL-9.

Los productos expuestos más arriba representan diversos agentes terapéuticos eficaces en el tratamiento de alergias atópicas, el asma y otros trastornos relacionados. 35

Por tanto, el solicitante ha identificado el papel crítico de la vía de IL-9 en la patogénesis de la alergia atópica, en particular la hiperreactividad bronquial.

De forma más específica, el solicitante proporciona antagonistas y métodos para identificar antagonistas que son capaces de regular la interacción entre IL-9 y su receptor tal como se define en las reivindicaciones. El solicitante describe asimismo métodos para regular la actividad de IL-9 mediante: 1) la administración de un compuesto con actividad comparable a la IL-9 que 5 contiene metionina en el codón 117 y con capacidad para unirse a un receptor para IL-9 en una cantidad suficiente para subrregular la actividad de IL-9; y 2) la administración de productos proteicos truncados codificados por secuencias aisladas de ácido nucleico que comprenden deleciones de uno cualquiera o más de los exones 1, 2, 3, 4 ó 5. 10

Habiéndose identificado el papel crítico de la vía de IL-9 en la alergia atópìca, la hiperreactividad bronquial y el asma, el Solicitante describe asimismo como referencia un método para el diagnóstico de la predisposición a la alergia atópica, asma y trastornos relacionados. Por último, el solicitante describe un 15 método para someter a ensayo las funciones de IL-9 y su receptor para identificar compuestos o agentes que puedan ser administrados en una cantidad suficiente para subregular la expresión o las funciones de IL-9 y del receptor de IL-9.

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Las figuras adjuntas, que se incorporan y constituyen parte de esta especificación, ilustran varias realizaciones de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

Breve Descripción de las Figuras 25

Figura 1: Mapa que muestra el orden relativo y la distancia en centiMorgans [cM] entre los marcadores polimórficos genéticos útiles para mapear genes relacionados con el asma.

Figura 2: Ilustración del mapa genético de cromosoma humano 5q31-q33 y 30 regiones sinténicas en el ratón.

Figura 3: Curva de puntuación LOD en el cromosoma 13 de ratón para la reactividad de las vías aéreas inducida por atracurio en ratones con predisposición incrementada a estímulos broncoconstrictores.

Figura 4: Alineamiento de las secuencias de aminoácidos correspondientes 35 al exón 5 de los genes humanos y murinos de IL-9. La primera secuencia es traducida a partir del alelo Thr del gen humano. La

secuencia intermedia es traducida a partir del alelo Met del gen humano. La secuencia final es traducida a partir del gen murino.

Figura 5: Histograma de correlación entre los alelos del gen humano de IL-9 y los títulos de IgE total en suero, medida en unidades internacionales. S/S indica individuos con Thr/Thr, S/R indica 5 individuos con Thr/Met y R/R indica individuos con Met/Met.

Figura 6: Ilustración del polimorfismo de repetición de secuencia simple en el locus IL-9.

Figura 7: Secuencia traducida de ADNc de la versión Thr117 de IL-9.

Figura 8: Secuencia traducida de ADN de la versión Met117 de IL-9. 10

Figura 9: Mapa del constructo de expresión pFlag con Thr117.

Figura 10: Secuencia del constructo de expresión pFlag para la versión Thr117 del ADNc procedente de la región que rodea el sitio de ligación.

Figura 11: Mapa del constructo de expresión pFlag con Met117. 15

Figura 12: Secuencia del constructo de expresión pFlag para la versión Met117 del ADNc procedente de la región que rodea el sitio de ligación.

Figura 13: Western blot de proteínas recombinantes de IL-9.

Figura 14: Secuencias de aminoácidos para péptidos inhibidores. 20

Figura 15: Inhibición por KP-16 de la proliferación de MO7e mediada por IL-9.

Figura 16: Inhibición por KP-20 de la proliferación de MO7e mediada por IL-9.

Figura 17: Inhibición por KP-23 de la proliferación de MO7e mediada por IL-9.

Figura 18: Inhibición por varias tirofostinas de la proliferación de MO7e mediada por IL-9. 25

Figura 19: Inhibición por varios aminoesteroles de la proliferación de MO7e mediada por IL-9.

Figura 20: Caracterización del papel de IL-9 en la respuesta antigénica in vivo.

Figura 21: Examen histológico de pulmones procedentes de animales control 30 desafiados con OVA y pretratados con anti-IL-9.

Figura 22: Inhibición de la respuesta antigénica in vivo mediante bloqueo de anticuerpos al receptor murino de IL-9.

Figura 24: Expresión de Met117 IL-9 y Thr117 IL-9 humanos.

Figura 25: Unión de las formas recombinantes humanas Met117 y Thr117 de 35 IL-9 a un receptor soluble.

Figura 26: Niveles permanentes de IL-9 en esplenocitos murinos estimulados y no estimulados por IL-9.

Figura 27: Apéndice de las partes químicas.

Figura 28: Aminoesteroles aislados de tiburón perro.

Descripción Detallada de la Invención

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El solicitante ha resuelto las necesidades de la técnica al elucidar una vía de IL-9 y composiciones que afectan a dicha vía que pueden utilizarse en el diagnóstico, prevención o tratamiento de la alergia atópica, incluyendo el asma y trastornos relacionados. El asma abarca trastornos inflamatorios de las vías aéreas con obstrucción reversible del flujo de aire. La alergia atópica se refiere a 10 la atopía y trastornos relacionados que incluyen asma, hiperreactividad bronquial (BHR), rinitis, urticaria, trastornos alérgicos inflamatorios del intestino, así como varias formas de eczema. La atopía es una hipersensibilidad a los alérgenos ambientales expresados como un aumento del IgE total en suero o como respuestas anormales a la prueba cutánea a los alérgenos en 15 comparación con los controles. BHR se refiere a la hiperreactividad bronquial, aumento de la respuesta broncoconstrictora a una variedad de estímulos.

Al analizar el ADN de las familias que muestran trastornos relacionados con el asma, el solicitante ha identificado un polimorfismo en el gen de la IL-9 20 que se correlaciona con la variabilidad biológica del IgE total en suero como expresión medible de la atopía. El gen de la IL-9 (también conocido como Factor 1 Asociado al Asma o AAF1) se refiere al locus genético de la interleucina-9, citoquina que realiza diversas funciones que implican la regulación de los sistemas mieloide y linfoide humanos. El gen de la IL-9 se encuentra en la 25 región q31-q33 del cromosoma 5 humano y del cromosoma 13 en el ratón.

Por polimorfismo, el solicitante entiende un cambio en una secuencia específica de ADN denominada "locus" procedente de la secuencia predominante. En general, un locus se define como polimórfico cuando los 30 especialistas han identificado dos o más alelos que engloban aquel locus y el alelo menos común aparece con una frecuencia del 1% o superior.

El presente polimorfismo conduce a una sustitución de aminoácidos en el residuo 117 de la IL-9. De forma específica, en lugar del aminoácido hidrofílico 35 treonina, la IL-9 presenta el aminoácido hidrofóbico metionina (Met IL-9). A nivel genético, el polimorfismo es una sustitución de un residuo de timina por un residuo de citosina en la posición nucleotídica 3365 en el gen humano de la IL-9

tal como han descrito Renauld y col. (1990) [números de acceso al GenBank M30135 y M30136]54, o en la posición nucleotídica comparable 4244 de la secuencia del gen humano de IL-9 reportada por Kelleher y col. (1991) [número de acceso al GenBank M86593]55.

5

En general, los individuos con una treonina (Thr) en el aminoácido 117 de la IL-9 en uno o en ambos de sus alelos (Thr/Thr o Thr/Met) muestran una predisposición a un fenotipo alérgico asmático o atópico y estos genotipos se caracterizan por niveles medios más altos de IgE total en suero en las poblaciones estudiadas. Por el contrario, aquellos individuos con una metionina 10 (Met) en el codón 117 de la IL-9 en ambos alelos (Met/Met) no presentan asma, tienen menos respuestas anormales a la prueba cutánea y un nivel más bajo de IgE total en suero. Por tanto, parece que el genotipo Met/Met de la IL-9 protege contra el asma o la alergia atópica.

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En consecuencia, en un aspecto de referencia se describe una molécula de ADN purificado y aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la interleucina-9 humana que contiene metionina en la posición 117 (Met IL-9) o un fragmento de la misma. El aspecto incluye asimismo secuencias degeneradas de ADN así como secuencias que son sustancialmente 20 homólogas. El origen de la IL-9 es humano. Alternativamente, el ADN o un fragmento del mismo se pueden sintetizar por métodos conocidos en la técnica. También es posible producir el compuesto mediante técnicas de ingeniería genética, construyendo el ADN por medio de cualquier técnica aceptada, clonando el ADN en un vehículo de expresión y transfectando el vehículo al 25 interior de una célula que expresará el compuesto. Véase, por ejemplo, los métodos expuestos en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press [1985].

La hiperreactividad de las vías aéreas se presenta prácticamente en 30 todos los asmáticos y en algunas cepas de ratones endogámicos (DBA/2)84. La hiperreactividad de las vías aéreas es un factor de riesgo para el desarrollo del asma en humanos y se utiliza en modelos animales de asma como medida fisiológica para valorar la eficacia del tratamiento del asma. Estos datos, junto con los resultados del mapeo genético humano79 y murino (véase los Ejemplos 1 35 y 2), sugieren un papel crítico del producto genético murino de la IL-9 en la respuesta de las vías aéreas del ratón. En particular, los ratones DBA/2(D2) hiperreactivos difieren de los ratones C57BL/6(B6) hiporreactivos en su

expresión de los niveles permanentes de IL-9 (Véase el Ejemplo 14, Figura 26). Además, el pretratamiento con anticuerpos de bloqueo a la IL-9/receptor de IL-9 pueden proporcionar opcionalmente una protección completa contra la inflamación e hiperreactividad de las vías aéreas inducidas por el antígeno en ratones que muestran un papel regulador crítico para la IL-9 en estas respuestas 5 inmunes. Por tanto, estos datos demuestran que aunque diferentes cambios moleculares producen una variabilidad biológica en la reactividad de las vías aéreas en humanos y ratones, estos cambios surgen en el(los) mismo(s) gen(es) (IL-9/IL-9R) que regula(n) esta vía. Tomadas en su conjunto, estas observaciones confirman el papel crítico de la IL-9 y de los receptores de la IL-9 10 en la hiperreactividad de las vías aéreas, el asma y la alergia atópica. Además, estos datos demuestran que los agentes de la convención, que bloquean la interacción de la IL-9 con sus receptores, protegen contra una respuesta inducida por el antígeno tal como la detallada anteriormente.

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Otra evidencia que define el papel crítico de la IL-9 en la patogénesis de la alergia atópica, la hiperreactividad bronquial, el asma y trastornos relacionados deriva directamente de la observación de los solicitantes de que la IL-9 es crítica para diversas respuestas inducidas por el antígeno en ratones. Cuando las funciones de IL-9 son subreguladas por el pretratamiento con 20 anticuerpos antes del desafío con el antígeno en aerosol, los animales pueden estar protegidos completamente contra las respuestas inducidas por el antígeno. Estas respuestas incluyen hiperreactividad bronquial, eosinofilia y altos recuentos celulares en el lavado bronquial, cambios histológicos en el pulmón asociados a la inflamación e IgE total elevada en suero. Por tanto, el tratamiento 25 de la hiperreactivdad bronquial, que es crítica para la patogénesis de la alergia atópica y que caracteriza la inflamación alérgica asociada al asma por la subregulación de las funciones de IL-9, se encuentra dentro del alcance de esta invención.

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El solicitante describe asimismo la regulación de la actividad de IL-9 mediante la administración de los "agonistas y antagonistas" al receptor de la IL-9. El especialista en la técnica reconocerá fácilmente que todas las moléculas que contienen la conformación estructural tridimensional necesaria y que contienen los residuos esenciales o críticos para la unión del receptor se 35 encuentran dentro del alcance de esta invención. El solicitante ha demostrado que los péptidos KP-16 (residuos 43-60 de IL-9) y KP-20 (residuos 70-90 de IL-9) (producidos mediante técnicas estándar de síntesis automática de los

péptidos, por ejemplo, con un Applied Biosystems Model 431A Peptide Synthesizer) actúan como antagonistas de la IL-9. Específicamente, el solicitante demuestra que parece que los residuos 43-60 y 71-90 de la proteína madura son importantes para la unión del receptor. Además, estos residuos incluyen la mayor parte del exón 4 (aminoácidos 44-88) y se prevé que formen 5 estructuras helicoidales antiparalelas. La estructura tridimensional de la proteína sugiere que específicamente la serina 52 y/o el ácido glutámico 53 interactúan con la lisina 85, la serina 56 interactúa con la lisina 82 y la treonina 59 interactúa con la valina 78. Las coordenadas tridimensionales de estas hélices paralelas y grupos funcionales relacionados representan la conformación tridimensional 10 requerida crítica para la unión del receptor y los compuestos que simulan estas relaciones se encuentran dentro del alcance de esta invención.

La demostración de una secuencia de IL-9 asociada a un fenotipo de tipo asmático y de una asociada a la ausencia de un fenotipo de tipo asmático indica 15 que la respuesta inflamatoria de los pulmones al antígeno depende de IL-9 y, por tanto, que la subregulación de la función de IL-9 debe proteger contra la respuesta inducida por el antígeno. Además, el solicitante describe también métodos para diagnosticar la predisposición a la alergia atópica y trastornos relacionados y para tratar estos trastornos basándose en relación entre la IL-9 y 20 su receptor.

Un receptor es un componente soluble o un componente unido a membrana que reconoce y se une a moléculas, y el receptor de la IL-9 (también conocido como Factor 2 Asociado al Asma o AAF2) de la invención es el 25 componente que reconoce y se une a la IL-9. Las funciones del receptor de la IL-9 consisten en unir una molécula de tipo IL-9 y propagar su señal reguladora en células específicas57-60. Una interrupción de esta función conducirá a una subregulación, es decir, a la reducción de la expresión o de la IL-9 o de las funciones controladas por la IL-9. En consecuencia, en virtud de esta interacción 30 entre la IL-9 y el receptor de IL-9, se modulan o controlan ciertas funciones del organismo. Para una discusión general sobre receptores véase Goodman y Gilman's, The Pharmacologic Basis of Therapeutics (Seventh Edition, MacMillan Publishing Company, N.Y. USA, 1965).

35

Un aspecto diagnóstico implica el reconocimiento de variaciones en la secuencia de ADN de la IL-9. Un método implica la introducción de una molécula de ácido nucleico (también conocida como sonda) con una secuencia

complementaria de la IL-9 en condiciones suficientes de hibridación, como será evidente para el especialista en la técnica. En un aspecto, la secuencia se unirá específicamente a Met117 IL-9 o a Thr117 IL-9, y en otra realización se unirá tanto a Met117 IL-9 como a Thr117 IL-9. Otro método para reconocer la variación de secuencia de ADN asociada a estos trastornos es el análisis de 5 secuencia directa de ADN por variados métodos bien conocidos en la técnica77. Otro aspecto involucra la detección de la variación de la secuencia de ADN en el gen de la IL-9 asociado a estos trastornos73-77. Éstos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa, el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y el análisis conformacional de una sola hebra. En un 10 aspecto preferente, el solicitante prevé específicamente un método para reconocer, a nivel genético, el polimorfismo en la IL-9 asociada a los alelos de Thr y Met utilizando un Styl RFLP tal como se describe aquí. En otro aspecto, se pueden utilizar RFLPs con Nla, Pfim1, PflM1 y Ncol para distinguir estos dos alelos de los genes de la IL-9. 15

Otro aspecto implica el tratamiento de la alergia atópica y trastornos relacionados. En un aspecto preferente, el solicitante proporciona un método para administrar un compuesto que tiene una actividad comparable con Met IL-9 y la capacidad de unirse a un receptor de la IL-9 en una cantidad suficiente para 20 subregular la actividad de la IL-9. Un compuesto que tiene una actividad comparable con Met IL-9 es un compuesto que funciona de forma similar pero no forzosamente de forma idéntica. Por tanto, puede unirse al receptor de la IL-9 pero sin los mismos efectos fisiológicos. Los ejemplos incluyen secuencias de aminoácidos de IL-9 que contienen varias mutaciones puntuales y/o deleciones 25 y secuencias sustancialmente homólogas a las mismas. Por ejemplo, dicho compuesto puede interrumpir la unión de Thr IL-9 al receptor de la IL-9 según se mide por técnicas conocidas en este campo. La invención engloba asimismo fragmentos funcionalmente efectivos de las secuencias de aminoácidos anteriores. En una de estas técnicas, se puede considerar Thr IL-9 como un 30 "ligando" para el receptor de la IL-9 y la unión entre ambos puede ser valorada por ensayos de unión de ligando, bien conocidos en la técnica, tal como se establece en Goodman y Gilman's, The Pharmacologic Basis of Therapeutics (Seventh Edition, MacMillan Publishing Company, N.Y., USA, 1985).

35

En otro aspecto, el compuesto puede parecerse al alelo Met de la IL-9 en su estructura. Por tanto, dicho compuesto puede incorporar una metionina en el codón 117 de la IL-9 o puede incorporar otro aminoácido hidrofóbico. Así, otros

aspectos son variantes de la IL-9, comprendiendo sustituciones de Thr en la posición 117 por aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Alternativamente, el compuesto puede existir como un fragmento de IL-9 con una composición estructural similar a Met IL-9. En otro aspecto, el compuesto 5 puede conservar funciones comparables con Met IL-9, pero puede no parecerse a Met IL-9 en su estructura. Por ejemplo, la composición del compuesto puede incluir otras moléculas distintas a aminoácidos.

Los ensayos específicos pueden basarse en la regulación conocida de la 10 IL-9, en parte, de la proliferación de linfocitos T, síntesis de IgE y liberación de mastocitos54-60. Otro ensayo implica la capacidad de la IL-9 humana para inducir específicamente una fosforilación rápida y transitoria en la tirosina de múltiples proteínas en células M07e57. Como esta respuesta depende de la expresión y activación del receptor de la IL-9, representa un método o ensayo sencillo para 15 la caracterización de compuestos potencialmente valiosos. La fosforilación en la tirosina del factor transcripcional Stat3 parece estar relacionada específicamente con las acciones de IL-958 y esta respuesta representa un método o ensayo sencillo para la caracterización de los compuestos en la invención. Todavía otro método para caracterizar la función de la IL-9 y de moléculas de tipo IL-9 implica 20 el bien conocido clon TS1 murino y el clon D10 de ATCC utilizados para valorar la función de la IL-9 humana en ensayos de proliferación celular59. La Met IL-9 que forma parte de la invención se puede considerar como un "agonista débil" del receptor de IL-9. El término agonista según esta invención incluye compuestos que imitan al menos algunos de los efectos de los compuestos 25 endógenos mediante la interacción o unión a un receptor. Los agonistas que interactúan o se unen al receptor de la IL-9 en la superficie de ciertas células inician una serie de cambios bioquímicos y fisiológicos que son característicos de las acciones de estas citoquinas. Para identificar otros agonistas débiles de la invención, se puede someter a prueba la unión del receptor de la IL-9 o las 30 funciones de tipo IL-9 tal como se describe aquí y en la literatura mencionada2,45-51,54-60.

La presente invención incluye asimismo antagonistas de la IL-9 y de su receptor. Los antagonistas son compuestos que están desprovistos de actividad 35 farmacológica, pero que causan efectos al impedir la acción de un agonista. Para identificar un antagonista de la invención, se puede someter a prueba la

unión competitiva con un agonista conocido o la subregulación de las funciones de tipo IL-9 tal como se describe aquí y en la literatura mencionada1,45-51,54-60.

La unión del agonista o del antagonista puede implicar todos los tipos conocidos de interacciones, incluyendo fuerzas iónicas, puentes de hidrógeno, 5 interacciones hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals y enlaces covalentes. En muchos casos, los enlaces de múltiples tipos son importantes en la interacción de un agonista o un antagonista con un receptor.

En otro aspecto, estos compuestos pueden ser análogos de la IL-9. Los 10 análogos de la IL-9 se pueden producir mediante mutaciones puntuales en la secuencia de ADN aislado para las sustituciones y/o deleciones de genes, nucleótidos que pueden ser creados por métodos bien descritos en la técnica62. Esta especificación incluye también variantes empalmadas de la IL-9 y describe secuencias de ácido nucleico aislado de la interleucina-9 que contienen 15 deleciones de uno o más de sus cinco exones. El término "variantes empalmadas", tal como se utiliza aquí, indica una molécula de ADN purificado y aislado que codifica la IL-9 humana comprendiendo al menos un exón. No existe evidencia en la técnica de mutantes empalmados expresados de forma natural. Por tanto, el presente aspecto proporciona un ácido nucleico aislado que 20 contiene los exones 1, 4 y 5 de la IL-9 humana. Otras variantes incluyen secuencias que comprenden los exones 1, 2, 3, 4 y 5; los exones 1, 2, 3 y 4; los exones 1, 2, 4 y 5 y los exones 1, 3, 4, y 5. Se debe entender que estos exones pueden contener varias mutaciones puntuales.

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Ejemplos específicos de péptidos antagonistas derivados de la IL-9 incluyen KP-16 (SEQ ID NO. 13) y KP-20 (SEQ ID NO. 14) que proceden del exón 4. El exón 4 codifica 44 aminoácidos mientras que los péptidos mencionados anteriormente contienen respectivamente 16 y 20 aminoácidos y no se solapan. Estos péptidos muestran una actividad inhibidora considerable 30 tanto individualmente como cuando se ensayan en combinación. Además, KP-23 (SEQ ID NO. 15) y KP-24 (SEQ ID NO. 16) proceden del exón 5 y muestran también una actividad similar. Las variantes empalmadas de la IL-9 se pueden formar por deleción de uno cualquiera o de más de los exones 1 a 5 de la IL-9. Tal como se muestra anteriormente, los péptidos derivados de estos exones 35 muestran una capacidad reguladora y, en consecuencia, son útiles en el tratamiento de alergias atópicas, incluyendo el asma.

Es sabido en la técnica que, en sistemas multienzimáticos, la primera enzima o enzima reguladora puede ser activada o inhibida por el producto final del sistema multienzimático. Cuando la concentración del producto final aumenta por encima de la concentración permanente, el producto final actuará como activador o inhibidor específico de la enzima reguladora en la secuencia. 5 Dicho mecanismo de contrarreacción también es relevante en el sistema de IL-9 y se observa que los diversos polipéptidos son capaces de ejercer dicha activación o control inhibidor sobre la actividad del receptor de la IL-9 y posiblemente la expresión o función de otras citoquinas y sus receptores, que desempeñan un papel en la patogénesis del asma. 10

La invención incluye asimismo modificaciones de los agonistas o los antagonistas que se pueden realizar utilizando los conocimientos de los especialistas en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de un compuesto por un receptor está estrechamente relacionada con la estructura química del 15 compuesto. Por tanto, se pueden aplicar las relaciones estructura-actividad para modificar los agonistas y antagonistas de la invención. Por ejemplo, se pueden emplear técnicas de cristalografía/difracción de rayos X y NMR para realizar modificaciones de la invención.

20

Por ejemplo, se puede crear una estructura tridimensional de la IL-9 humana para utilizar como plantilla en la construcción de modelos estructurales de mutantes por deleción utilizando gráficos moleculares. Estos modelos se pueden utilizar para identificar y construir una molécula de IL-9 mutante con afinidad por el receptor de la IL-9 comparable con IL-9, pero con una actividad 25 biológica menor. Se entiende por actividad biológica menor una actividad de 2 a 100.000 veces menor que la IL-9, preferentemente de 100 a 1.000 veces menor que la IL-9.

En todavía otro aspecto, estos compuestos se pueden utilizar también 30 como sondas dinámicas para la estructura del receptor y para desarrollar antagonistas del receptor utilizando líneas celulares dependientes de la IL-9.

Además, se describen también compuestos que impiden la síntesis o reducen la estabilidad biológica de la IL-9 o del receptor de la IL-9. La 35 estabilidad biológica es una medida del tiempo entre la síntesis de la molécula y su degradación. Por ejemplo, la estabilidad de una proteína, péptido o péptido mimético89 terapéutico se puede prolongar utilizando D-aminoácidos o se puede

acortar mediante la alteración de su secuencia para que se convierta en más sensible a la degradación enzimática.

En otra realización, los agonistas y antagonistas de la invención son anticuerpos contra la IL-9 y el receptor de la IL-9. Los anticuerpos contra la IL-9 5 y su receptor pueden obtenerse monoclonales o policlonales por técnicas estándar bien conocidas en este casmpo (véase Harlow & Lane's Antibodies - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Se pueden utilizar para bloquear la IL-9 contra su unión al receptor. En una realización, los anticuerpos interactúan con la IL-9. En otra realización, los anticuerpos 10 interactúan con el receptor de la IL-9. La IL-9 utilizada para obtener estos anticuerpos puede ser cualquiera de las variantes de la IL-9 expuestas anteriormente.

Los anticuerpos se producen también a partir de secuencias peptídicas 15 de la IL-9 o del receptor de la IL-9 por técnicas estándar bien conocidas (véase Protocols in Immunology, Chapt. 9, Wiley). Las secuencias peptídicas procedentes del receptor de la IL-9 murina que se pueden utilizar para producir antisueros de bloqueo han sido identificadas como: GGQKAGAFTC (residuos 1-10) (SEQ ID NO: 19); LSNSIYRIDCHWSAPELGQESR (residuos 11-32) (SEQ ID 20 NO: 20) y CESYEDKTEGEYYKSHWSEWS (residuos 184-203 con un residuo Cys añadido al N-terminal para acoplar el péptido a la proteína portadora) (SEQ ID NO: 21). Además, se ha identificado un epítopo que se une a un anticuerpo de bloqueo dirigido al receptor de la IL-9 humana como residuos 8-14 del receptor de la IL-9 humana madura (TCLTNNI) (SEQ ID NO: 22) así como dos 25 epítopos que se unen a anticuerpos de bloqueo dirigidos a la IL-9 humana también como residuos 50-67 (CFSERLSQMTNTTMQTRY) (SEQ ID NO: 17) y residuos 99-116 (TAGNALTFLKSLLEIFQK) (SEQ ID NO: 16). Los epítopos humanos así como los péptidos humanos que corresponden a los péptidos que producen anticuerpos de bloqueo en las secuencias murinas son muy 30 probablemente útiles para la producción de anticuerpos terapéuticos.

En todavía otra realización, los compuestos de la invención se pueden acoplar a fracciones químicas, incluidas proteínas que alteran las funciones o la regulación de la vía de la IL-9 para su beneficio terapéutico en la alergia atópica 35 y el asma61. Estas proteínas pueden incluir en combinación otras citoquinas y factores de crecimiento que incluyen67 L-4, IL-5, IL-3, IL-2, IL-13 e IL-10 que pueden ofrecer una ventaja terapéutica adicional en la alergia atópica y el asma.

Además, la IL-9 de la invención puede ser conjugada también por fosforilación y ser conjugada a biotinilato, tioato, acetilato, yodinato y cualquiera de los reactivos de reticulación mostrados en la Figura 27 (Pierce).

En otra realización, la invención incluye la subregulación de la expresión 5 o función de la IL-9 mediante la administración de moléculas solubles del receptor de la IL-9 que se unen a IL-9. Renauld y col.59 han demostrado la existencia de una forma soluble del receptor de IL-9. Se puede utilizar esta molécula para impedir la unión de IL-9 al receptor unido a células actuando como antagonista de la IL-9. Se han utilizado receptores solubles para unir 10 citoquinas u otros ligandos con el fin de regular su función97. Un receptor soluble es una forma de receptor unido a membrana que se encuentra en solución o fuera de la membrana. Pueden aparecer receptores solubles debido a que el segmento de la molécula que se asocia comúnmente a la membrana está ausente. Este segmento se denomina habitualmente en la técnica dominio 15 transmembrana del gen o segmento de unión a membrana de la proteína. Así, en una realización de la invención, un receptor soluble puede representar un fragmento o un análogo de un receptor unido a membrana. En otra realización de la invención, la estructura del segmento que se asocia a la membrana puede modificarse (por ejemplo, por polimorfismo o mutación de la secuencia de ADN 20 en el gen) de manera que el receptor no está insertado en la membrana, o el receptor está insertado pero no está retenido en la membrana. Por tanto, un receptor soluble, a diferencia de la forma unida a membrana correspondiente, difiere en uno o más segmentos del gen o de la proteína del receptor que son importantes para su asociación con la membrana52,53. 25

Estos compuestos pueden ser formas conocidas de un receptor soluble de la IL-9 que actúan para unirse a la IL-9. Alternativamente, estos compuestos pueden parecerse a formas conocidas del receptor de la IL-9, pero pueden existir como fragmentos. En otra realización de la invención, el compuesto 30 puede conservar funciones comparables las del receptor soluble de la IL-9, pero puede no parecerse al receptor soluble de la IL-9 en su composición. Por ejemplo, la composición del compuesto puede incluir moléculas distintas de aminoácidos. Por tanto, estos compuestos se unirán a la IL-9 e impedirán que la IL-9 actúe en su receptor de la superficie celular. 35

Otro aspecto se refiere a la terapia antisentido o genética. Se sabe ahora en la técnica que las moléculas alteradas de ADN se pueden adaptar para

proporcionar un efecto elegido específico cuando están previstas como terapia antisentido o genética. El segmento de ADN nativo que codifica para el receptor de la IL-9 posee, al igual que otras hebras de ADN de mamíferos, dos hebras; una hebra sentido y una hebra antisentido, mantenidas juntas por enlaces de hidrógeno. El ARNm que codifica para el receptor tiene una secuencia de 5 nucleótidos idéntica a la hebra sentido, con la sustitución esperada de la timidina por la uridina. Por tanto, basándonos en el conocimiento de la secuencia receptora, se pueden sintetizar oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos se pueden unir al ADN y al ARN que codifican para el receptor. Los fragmentos activos de la invención, que son complementarios del ARNm y 10 de la hebra de codificación del ADN, son normalmente de al menos 15 nucleótidos aproximadamente, más habitualmente de al menos 20 nucleótidos, particularmente de 30 nucleótidos y en especial pueden ser de 50 nucleótidos o más. La fuerza de unión entre las hebras sentido y antisentido depende de los enlaces totales de hidrógeno. Por tanto, en base al número total de bases en el 15 ARNm, el especialista puede calcular fácilmente la longitud óptima de la secuencia de oligonucleótidos.

La secuencia puede ser complementaria de cualquier porción de la secuencia del ARNm, es decir que puede encontrarse próxima al 5'-terminal o 20 sitio de terminación, o aguas abajo del sitio de terminación, entre el sitio de terminación y el codón de iniciación y puede cubrir la totalidad o sólo una parte de la región no codificante o de la región codificante. El(los) sitio(s) particular(es) al(a los) que se une la secuencia antisentido variará(n) dependiendo del grado de inhibición deseado, de la unicidad de la secuencia, de la estabilidad de la 25 secuencia antisentido, etc.

En la práctica de este aspecto, la expresión del receptor de la IL-9 se subregula mediante la administración de una cantidad efectiva de las secuencias de oligonucleótidos antisentido sintéticos descritas anteriormente. 30 Los compuestos oligonucleotídicos de la invención se unen al ARNm que codifica para la IL-9 o los receptores de la IL-9 humana inhibiendo así la expresión (traducción) de estas proteínas. Véase Gruss y col., "Interleukin 9 is expressed by primary and cultural Hodgkin and Reed-Sternberg cells", Cancer Res. 52: 1026-31 (15 de febrero de 1992). 35

Las secuencias de ADN aislado que contienen varias mutaciones tales como mutaciones puntuales, inserciones, deleciones o mutaciones empalmadas de la IL-9 son también útiles en la terapia genética.

Además de la regulación directa del receptor de la IL-9, un aspecto de 5 referencia engloba también métodos de regulación aguas abajo que implican la inhibición de la transducción de señales. En particular, otro aspecto se refiere a la inhibición de la fosforilación de tirosina. Se sabe en la técnica que reacciones altamente exergónicas de transferencia de fosforilo son catalizadas por varias enzimas conocidas como quinasas. En otras palabras, una quinasa transfiere 10 grupos fosforilo entre el ATP y un metabolito. La IL-9 induce la fosforilación de la tirosina en múltiples proteínas; se conoce en la técnica que, además de la activación de las tirosina quinasas JAK1 y JAK3, la IL-9 induce también la fosforilación en tirosina de Stat356. La fosforilación de Stat3 es única para la vía de transducción de señales de la IL-9 y por ello es un objetivo clave para los 15 inhibidores54. Este aspecto incluye tirofostinas que son inhibidores específicos de las proteínas tirosina quinasas. Así, las tirofostinas (obtenidas por ejemplo de Calbiochem) y otros inhibidores similares de estas quinasas son útiles en la modulación de la transducción de señales y son útiles en el tratamiento de alergias atópicas y del asma. 20

En todavía otro aspecto, se descubrió sorprendentemente que los compuestos de aminoesterol son útiles también en la inhibición de la transducción de señales debido al estímulo de la IL-9. Los compuestos de aminoesterol que son útiles vienen descritos en la solicitud de patente de 25 Estados Unidos Nº de serie 08/290.826 y sus solicitudes relacionadas 08/416.883 y 08/478.763 así como en la 08/483.059 y sus solicitudes relacionadas 08/483.057, 08/479.455, 08/979.957, 08/475.572, 08/476.855, 08/474.799 y 08/487.443.

30

Además, se incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los derivados del petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite 35 de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferente cuando la composición farmacéutica se administra de forma intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se pueden emplear también como

vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Se describen vehículos farmacéuticamente adecuados en Martin, E.W., Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los compuestos utilizados en el método de tratamiento se pueden 5 administrar de manera sistémica o tópica, dependiendo de consideraciones tales como la condición a tratar, la necesidad de tratamiento específico del sitio, la cantidad de medicamento a administrar y similares.

Se puede utilizar la administración tópica. Se puede emplear cualquier 10 formulación tópica común tal como solución, suspensión, gel, ungüento, o bálsamo y similares. La preparación de tales formulaciones tópicas está bien descrita en la técnica de las formulaciones farmacéuticas tal como se ilustran, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Science, Edition 17, Mack Publising Company, Easton, Pa. Para la aplicación tópica, estos compuestos 15 también se podrían administrar como polvo o pulverización, particularmente en forma de aerosol. El ingrediente activo se puede administrar en composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración sistémica. Tal como se conoce, si un medicamento se va a administrar de manera sistémica, se puede elaborar en forma de polvo, píldora, comprimidos o similares, o como jarabe o elixir para 20 la administración oral. Para la administración intravenosa, intraperitoneal o intralesional, el compuesto se preparará como una solución o suspensión capaz de ser administrada mediante inyección. En ciertos casos, puede ser útil formular estos compuestos en forma de supositorio o como una formulación de liberación prolongada para depositarla bajo la piel o por inyección intramuscular. 25 En una realización preferente, los compuestos de la presente invención se pueden administrar mediante inhalación. Para la terapia de inhalación, el compuesto puede estar en una solución útil para la administración mediante inhaladores de dosis medidas, o en una forma adecuada para un inhalador de polvo seco. 30

Una cantidad eficaz es aquella cantidad que subregulará la expresión de la IL-9 o las funciones controladas por la IL-9. Una cantidad eficaz determinada variará de una condición a otra y en ciertos casos puede variar con la gravedad de la condición que se está tratando y con la sensibilidad del paciente al 35 tratamiento. En consecuencia, la cantidad eficaz se determinará mejor en el momento y lugar a través de la experimentación rutinaria. Sin embargo, se anticipa que en el tratamiento de los trastornos relacionados con el asma de

acuerdo con la presente invención, una formulación que contiene entre el 0,001 y el 5 por ciento en peso, preferentemente alrededor del 0,01 al 1%, constituirá normalmente una cantidad terapéuticamente eficaz. Cuando se administra de manera sistémica, una cantidad entre 0,01 y 100 mg por kg de peso corporal al día, pero preferentemente alrededor de 0,1 a 10 mg/kg, obtendrá un resultado 5 terapéutico en la mayoría de los casos.

El solicitante también proporciona un método para investigar los compuestos que subregulan la expresión de la IL-9 o las funciones controladas por la IL-9. Se puede determinar si las funciones expresadas por la IL-9 se 10 subregulan por medio de técnicas estándar en la materia57−60. En una realización específica, el solicitante proporciona un método de identificación de compuestos con funciones comparables a Met IL-9. Por tanto, en un aspecto, se puede medir el IgE total en suero mediante técnicas bien conocidas42 para valorar la eficacia de un compuesto en el momento de subregular las funciones de la IL-9 in vivo. 15 En otro aspecto, se puede medir la hiperreactividad bronquial, el lavado broncoalveolar y la eosinofilia por técnicas bien conocidas62 para valorar la eficacia de un compuesto en la subregulación de las funciones de la IL-9 in vivo. En aún otro aspecto, se pueden valorar las funciones de la IL-9 in vitro. Tal como es sabido por los especialistas en la técnica, la IL-9 humana induce 20 específicamente la rápida y transitoria fosforilación en tirosina de múltiples proteínas en células MO7e. La fosforilación en tirosina del factor transcripcional Stat3 parece estar relacionada específicamente con las acciones de IL-9. Otro método para caracterizar la función de la IL-9 y de las moléculas de tipo IL-9 que depende de la “expresión estable” del receptor de la IL-9 utiliza los bien 25 conocidos clones TS1 murinos para valorar la función de la IL-9 humana en ensayos de proliferación celular59.

Un aspecto incluye también un ensayo de exploración simple para la unión de ligando específica y saturable en líneas celulares que expresan el 30 receptor de IL-946,50. El receptor de IL-9 se expresa en una amplia variedad de tipos celulares, que incluyen K562, CB166-45, células B, células T, mastocitos, neutrófilos, megacariocitos (células UT-7)53, líneas celulares MO7e de leucemia megacarioblástica humana57, TF159, macrófagos, timocitos fetales, línea celular 293 renal humana53 y líneas celulares progenitoras hipocampales embrionarias 35 murinas46,52,53. En otro aspecto, se puede utilizar el receptor de IL-9 soluble para evaluar la unión de ligando y los antagonistas potenciales del receptor.

La práctica de la presente invención empleará los términos y técnicas convencionales de la biología molecular, farmacología, inmunología y bioquímica que se encuentran dentro de la especialización de los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press [1985], o 5 Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. [1994].

Sin embargo, ofrecemos la siguiente información básica de fondo. El material genético del cuerpo, o ADN, se organiza en 46 cromosomas, 10 comprendiendo cada uno dos brazos unidos por un centrómero. Cada cromosoma se divide en segmentos designados "p" o "q". El símbolo "p" se utiliza para identificar el brazo corto de un cromosoma, tal como se mide desde el centrómero hasta el telómero más cercano. El brazo largo de un cromosoma es designado por el símbolo "q". El emplazamiento en un cromosoma se 15 proporciona por el número del cromosoma (es decir, cromosoma 5) así como las coordenadas de la región de "p" o de "q" (es decir, q31-q33). Además, el cuerpo porta los cromosomas sexuales X e Y. Durante la meiosis, los cromosomas X e Y intercambian información de las secuencias de ADN en zonas conocidas como regiones pseudoautosómicas. 20

El ADN, ácido desoxirribonucleico, se compone de dos hebras complementarias de nucleótidos que incluyen los cuatro diferentes compuestos base adenina [A], timina [T], citosina [C] y guanina [G]. A de una hebra se une a T de la otra hebra mientras C de una hebra se une a G de la otra para formar 25 "pares de bases" complementarios, teniendo cada par una base en cada hebra.

Un agrupamiento secuencial de tres nucleótidos [un "codón"] codifica para un aminoácido. Así, por ejemplo, los tres nucleótidos CAG codifican para el aminoácido Glutamina. Los 20 aminoácidos de origen natural y sus códigos de 30 una letra, son los siguientes:

Alanina Ala A

Arginina Arg R

Asparagina Asn N 35

Ácido aspártico Asp D

Asparagina o ácido aspártico Asx B

Cisteína Cys C

Glutamina Gln Q

Ácido de glutamina Glu E

Glutamina o ácido glutámico Glx Z

Glicina Gly G

Histidina His H 5

Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Fenilalanina Phe F 10

Prolina Pro P

Serina Ser S

Treonina Thr T

Triptófano Trp W

Tirosina Tyr Y 15

Valina Val V

Los aminoácidos comprenden proteínas. Los aminoácidos pueden ser hidrofílicos, es decir que muestran afinidad por el agua, o hidrofóbicos, es decir que tienen aversión al agua. Así, los aminoácidos designados por G, A, V, L, I, 20 P, F, Y, W, C y M son hidrofóbicos y los aminoácidos designados por S, Q, K, R, H, D, E, N y T son hidrofílicos. En general, la naturaleza hidrofílica o hidrofóbica de los aminoácidos afecta al plegamiento de la cadena peptídica y, por consiguiente, a la estructura tridimensional de una proteína.

25

El ADN se relaciona con la proteína como sigue:

ADN genómico ––> ARNm ––> proteína

↕

↕ 30

ADNc

El ADN genómico comprende todas las secuencias de ADN encontradas en una célula del organismo. Se "transcribe" en ARN mensajero ["ARNm"]. El ADN complementario ["ADNc"] es una copia complementaria del ARNm 35 realizada por transcripción inversa del ARNm. A diferencia del ADN genómico, tanto el ARNm como el ADNc contienen sólo regiones codificantes de proteína o

codificantes de polipéptido del ADN, los llamados "exones". El ADN genómico puede incluir también "intrones" que no codifican proteínas.

De hecho, los genes eucariotas son discontinuos con las proteínas codificadas por ellos, consistentes en exones interrumpidos por intrones. 5 Después de la transcripción en ARN, los intrones son eliminados por empalme para generar el ARN mensajero (ARNm) maduro. Los puntos de empalme entre los exones son determinados típicamente por secuencias consenso que actúan como señales para el proceso de empalme. El empalme consiste en una deleción del intrón desde la transcripción primaria del ARN y en una unión o 10 fusión de los extremos del ARN restante en cualquiera de los lados del intrón suprimido. La presencia o ausencia de intrones, la composición de los intrones, y el número de intrones por gen puede variar entre las cepas de la misma especie y entre especies que tienen el mismo gen básico funcional. Aunque en la mayoría de los casos se supone que los intrones son no-esenciales y 15 benignos, su categorización no es absoluta. Por ejemplo, un intrón de un gen puede representar un exón de otro. En algunos casos, modelos alternos o diferentes de empalme pueden generar diferentes proteínas a partir del mismo único fragmento de ADN. De hecho, las características estructurales de los intrones y los mecanismos de empalme subyacentes forman la base de la 20 clasificación de los distintos tipos de intrones.

En cuanto a los exones, éstos pueden corresponder a dominios o motivos discretos, tales como, por ejemplo, dominios funcionales, regiones de plegamiento o elementos estructurales de una proteína; o a secuencias 25 polipeptídicas cortas, tales como turnos inversos, bucles, señales de glicosilación y otras secuencias señal o regiones enlazadoras de polipéptidos no-estructuradas. Los módulos de los exones del presente método combinatorio pueden comprender secuencias de ácido nucleico correspondientes a secuencias de exones de origen natural o a secuencias de exones de origen 30 natural mutadas (por ejemplo mutaciones puntuales, truncaciones, fusiones).

Volviendo ahora a la manipulación de ADN, el ADN puede ser cortado, empalmado y manipulado de otro modo mediante las "enzimas de restricción" que cortan el ADN en ciertos sitios conocidos y las ADN ligasas que se unen al 35 ADN. Dichas técnicas son bien conocidas por los especialistas en la técnica, tal como se establece en textos como el de Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory

Press [1985] o Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. [1994].

Puede insertarse ADN de un tamaño y secuencia específicos entonces en un "replicón", que es cualquier elemento genético, tal como un plásmido, 5 cósmido o virus, que es capaz de replicación bajo su propio control. Un "vector recombinante" o un "vector de expresión" es un replicón en el que se inserta un segmento de ADN para permitir la expresión del ADN, es decir la producción de la proteína codificada por el ADN. Los vectores de expresión pueden ser construidos en el laboratorio, ser obtenidos de otros laboratorios o ser 10 comprados a fuentes comerciales.

El vector recombinante [conocido por varios términos en la técnica] se puede introducir en un huésped mediante un proceso genéticamente conocido como "transformación". Transformación significa la transferencia de un 15 segmento de ADN exógeno por medio de cualquiera de múltiples métodos, incluyendo infección, captación directa, transducción, acoplamiento-F, microinyección o electroporación en una célula huésped. Las células huésped unicelulares conocidas según el caso como células huésped recombinantes, células y cultivo celular incluyen bacterias, levaduras, células de insectos, 20 células vegetales, células de mamíferos y células humanas. En realizaciones particularmente preferentes, las células huésped incluyen células de E. coli, Pseudonas, Bacillis, Streptomyces, Levadura, CHO, R1-1, B-W, LH, COS-J, COS-7, BSC1, BSC40, BMT10 y S69. Las células de levadura incluyen especialmente Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula y Torulopis. 25

Como es conocido por los especialistas en la técnica, la expresión del segmento de ADN por la célula huésped necesita secuencias o elementos reguladores adecuados. Las secuencias reguladoras varían según la célula huésped empleada, pero incluyen, por ejemplo en las procariotas, un promotor, 30 un sitio de unión ribosómica y/o un sitio de terminación de la transcripción. En las eucariotas, dichas secuencias reguladoras incluyen un promotor y/o un sitio de terminación de la transcripción. Como es bien sabido por los especialistas en la técnica, la expresión del polipéptido puede ser intensificada, es decir incrementada por encima de los niveles estándar, mediante la selección y 35 colocación cuidadosa de estas secuencias reguladoras.

En otras realizaciones, los promotores que se pueden utilizar incluyen el promotor del citomegalovirus humano (CMV), promotor inducible por tetraciclina, promotor del virus del simio (SV40), promotor de repeticiones terminales largas (LTR) de la leucemia murina de Moloney, promotor del virus del tumor mamario murino (MMTV) inducible por glucocorticoides, promotor de la timidina quinasa 5 del Herpes, promotores de la β-actina humana y murina, región flanqueante 5' de la IL-9 del HTLV1 y del VIH , región flanqueante 5' del receptor de la IL-9 humana y de ratón, promotor tac bacteriano y elementos potenciadores de la región de unión a andamiaje (SAR) de choque térmico de la Drosophila.

10

El ADN se puede expresar como polipéptido de cualquier longitud tal como péptidos, oligopéptidos y proteínas. Los polipéptidos incluyen asimismo modificaciones traduccionales como glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares.

15

Otra técnica de biología molecular de interés de la presente invención consiste en el "análisis de enlaces". El análisis de enlaces es un método analítico utilizado para identificar el cromosoma o la región cromosómica relacionada con un rasgo o un trastorno44. Los cromosomas son las unidades básicas de la herencia en las que se organizan los genes. Además de los genes, 20 los especialistas han identificado "marcadores de ADN" en los cromosomas. Los marcadores de ADN son secuencias conocidas de ADN cuya identidad y secuencia se puede determinar fácilmente. La metodología de análisis de enlaces ha sido aplicada al mapeo de genes causantes de enfermedades, por ejemplo genes relacionados con la predisposición al asma en cromosomas 25 específicos42,44.

Otras realizaciones de la invención se evidenciarán a los especialistas en la técnica a partir de la especificación y aplicación de la invención descrita. Se pretende que las especificaciones y ejemplos se consideren como ilustrativos, 30 indicando las reivindicaciones solamente el verdadero alcance de la invención.

Métodos

Al llevar a cabo los experimentos descritos en los ejemplos a 35 continuación, el solicitante utilizó los métodos siguientes:

Poblaciones de Pacientes

Se reclutaron familias con asma de dos fuentes27,42,29-93,44. En cada caso, se genotiparon los pacientes con respecto al polimorfismo en la posición 3365 del gen de IL-9 humana [número de acceso al GenBank M30136]. 5

Se determinó al azar una tercera población de 74 individuos con respecto al asma y la atopía procedente de la Costa Este de Estados Unidos. La frecuencia de la sustitución de Met en el codón 117 se utilizó como estimación no sesgada de la prevalencia de esta variante en la población general.

Se determinó al azar una cuarta población de 49 individuos con respecto 10 al asma y la atopía procedente de Philadelphia, región de Pennsylvania. Se sometió a ensayo el IgE total en suero mediante el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas [ELISA, Genzyme, Cambridge, Massachusetts]. Se extrajo ADN de WBC en sangre periférica procedente de cada individuo. Los análisis de los marcadores genéticos (genotipos) y de los genes candidatos se realizaron 15 en el ADN genómico extraído. Una vez más, la frecuencia de la sustitución de Met en el codón 117 se utilizó como estimación insesgada de la prevalencia de esta variante en la población general.

Cebadores Oligonucleotídicos 20

Se diseñaron todos los cebadores mediante OLIGO 4.0. La caracterización del gen de la IL-9 se llevó a cabo utilizando los cebadores que rodean cada uno de los 5 exones de la secuencia reportada. Las secuencias de los cebadores que rodean cada exón eran: exón 1 [superior] [5' GCT CCA GTC 25 CGC TGT CAA 3'] e [inferior] [5' CTC CCC CTG CAG CCT ACC 3'] [tamaño del producto 150 pb]; exón 2 [superior] [5' CGC GGC TGA CTA AAG GTT CT 3'] e [inferior] [5' GTT CTT AAA GAG CAT TCA CT 3'] [tamaño del producto 99 pb]; exón 3 [superior] [5' ATT TTC ACA TCT GGA ATC TTC ACT 3'] e [inferior] [5' AAT CCA AGG TCA ACA TTA TG 3'] [tamaño del producto 113 pb]; exón 4 30 [superior] [5' TTT CTT TGA ATA AAT CCT TAC 3'] e [inferior] [5' GAA ATC ACC AAC AGG AAC ATA 3'] [tamaño del producto 206 pb]; y exón 5 [superior] [5' ATC AAC TTT CAT CCC CAC AGT 3'] e [inferior] [5' GGA TAA ATA ATA TTT CAT CTT CAT 3']. En primer lugar se examinó cada exón mediante un ensayo conformacional de polimorfismos en una sola hebra [SSCP]. Los cebadores para 35 el exón 5 produjeron un producto de 160 pb después de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa [PCR], que se examinó también mediante análisis directo de secuencias en fase sólida72,77. El cebador superior se

sintetizó con una marca de biotina 5' y, después de la amplificación, el producto PCR fue capturado con perlas paramagnéticas ligadas a estreptavidina [Dynal] y fue caracterizado mediante la secuenciación de Sanger tal como se describe en otro momento77. Los polimorfismos secuenciales se distinguieron del artefacto mediante repetidos análisis. 5

Análisis SSCP

El SSCP, método para la detección de polimorfismos en base a cambios en la migración del ADN de una sola hebra expuesto a un campo eléctrico71, se 10 llevó a cabo tal como se establece en Schwengel y col., (1994) a temperatura ambiente con y sin glicerol al 10%, utilizando electrofóresis en gel de poliacrilamida al 6% a una concentración de monómeros reticulantes del 2,67%77. Se mezclaron cuatro μl de producto de PCR con 5 μl de tampón de parada 2X [95% formamida, 20 mM EDTA, 0,05% BPB, 0,05% xilenocianol] y 1 15 μl de SDS al 5% así como 50 μM de EDTA, desnaturalizado a 85-90ºC durante 8 minutos, y luego colocado inmediatamente sobre hielo. Se llevó a cabo la electroforesis a 12 vatios durante aproximadamente 24 horas para los geles que contienen glicerol y durante 12 horas para los geles sin glicerol. Después se secaron los geles y se expusieron a una película Kodak XAR®. 20

Secuenciación del ADN

La secuenciación directa del ADN de los productos de PCR se realizó mediante técnicas en fase sólida tras averiguar la presencia de producto de 25 PCR de tamaño correcto en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio, tal como se establece en Schwengel y col., 1994. Se incubaron veinte μl de producto de PCR con 40 μl de Dynabeads® m-280 [Dynal] durante 15 minutos. Se lavaron las perlas y se diluyeron siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se lavó posteriormente cada muestra con tampón B&W que contenía 30 10 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2M NaCl, desnaturalizado con 0,1N NaOH, y después se lavó con 0,1N NaOH, tampón B&W y 10 mM Tris-HCl pH 8 y 1 mM EDTA [TE]. El granulado de perlas se resuspendió con 10 μl de H2O.

Las reacciones de secuenciación Sanger se llevaron a cabo por medio de Sequenasa [United States Biochemical Co.]35. Se incorporó S-dATP o 35P-dATP 35 en las reacciones de secuenciación y los productos se sometieron a electroforesis mediante un 5% o un 6% de geles de poliacrilamida que contenían urea 7M. Se secaron los geles sin fijación y se expusieron a una película de

rayos X. Se determinaron los alelos mediante la comparación de los genotipos de los padres y de los descendientes. Se distinguieron fácilmente los artefactos infrecuentes de los polimorfismos secuenciales verdaderos mediante repetición.

Se disponía de ADN y se extrajo de leucocitos periféricos. Se diluyó el ADN genómico hasta una concentración de 200 μg/ml para la amplificación27-42. 5 Las repeticiones de secuencia simple [SSR] que incluyen DXYS154 se seleccionaron de la Base de Datos del Genoma [GDB; Welch library, Johns Hopkins University, Baltimore, MD]. Se llevó a cabo la genotipificación del marcador sKK-1 mediante los siguientes cebadores sKK-1U [5' CAA ATC TGA AGA GCA AAC TAT 3'] y sKK-1L [5' TTA AAA AAT TCA TTT CAG TAT TCT 3'] 10 que producen un producto de 90 pb. Cada producto de SSR se amplificó por PCR72 y se dimensionó de acuerdo con los métodos previamente descritos27,42. La manipulación de las muestras se llevó a cabo tal como se describe en Weber y col., con modificaciones menores71,27,42. Se determinaron los genotipos a partir de dos lecturas independientes de cada autorradiografía. Los individuos que 15 genotipificaban las familias no eran conocedores de los datos clínicos.

Análisis RFLP

Como resultado del polimorfismo C a T en la posición 3365, se produjo un 20 polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Styl [RFLP] en la posición 52 del producto de PCR para el exón 5 de la IL-9. Para investigar la presencia de esta variante de secuencia de ADN, se marcó en el extremo el cebador inferior procedente del exón 5 antes de la amplificación por PCR. El producto de PCR fue digerido después con Styl produciendo dos fragmentos con una 25 longitud de 108 pb [marcado] y 52 pb [no marcado]. Este RFLP se utilizó junto con SSCP para confirmar la presencia de este polimorfismo en familias e individuos.

Análisis de Enlaces y Gestión de Datos 30

Se realizaron análisis de enlaces por métodos sib-pair afectados [SIBPAL, S.A.G.E.]76, aproximación establecida para la investigación de las bases genéticas de rasgos complejos, tales como BHR, atopía y asma. Los sib-pairs afectados se someten a ensayo normalmente en primer lugar, ya que una 35 proporción de sib-pairs no-afectados puede seguir siendo un vehículo genético pero no sin expresar el rasgo. A diferencia de los métodos de puntuación LOD en los que el modelo de herencia [dominante, recesiva, etc.] debe ser

especificado exactamente, los análisis por sib-pair no hacen suposiciones explícitas al respecto. Por tanto, en los análisis sib-pair, la información clínica sobre los padres no se utiliza en las pruebas de enlaces. La observación pertinente en estos métodos es con qué frecuencia dos descendientes afectados comparten copias del mismo alelo parental del marcador44. Si se 5 observa la misma copia de un alelo parental del marcador en distintos descendientes se dice que son herederos "idénticos por ascendencia". Se sugiere el enlace cuando sib-pairs afectados son idénticos por ascendencia para un alelo de marcador significativamente más frecuente que lo que se espera por azar [50%]. Cuando el mismo alelo de marcador es transmitido con el gen 10 causante de la enfermedad en distintos descendientes, ello implica que el locus del marcador está enlazado o que debe encontrarse lo suficientemente cerca en el mismo cromosoma del gen causante de la enfermedad como para que se co-segreguen durante la meiosis. El rasgo después es mapeado al conocer la localización cromosómica del marcador. 15

Los enlaces en los humanos también se pueden establecer por el método de coeficientes de probabilidad. Este método implica la comparación de la probabilidad que los datos de la familia observada originaría bajo una hipótesis, por ejemplo, enlaces entre dos marcadores de ADN, con respecto a la probabilidad que originaría bajo una hipótesis alternativa, típicamente sin 20 enlaces. El coeficiente de estas probabilidades se llama coeficiente impar para una hipótesis comparada con la otra. Por convención, los genetistas de mamíferos prefieren el logaritmo del coeficiente impar o puntuación LOD. Generalmente, el enlace se considera demostrado cuando los impares a favor del enlace contra el no-enlace se convierten en abrumadores o cuando alcanzan 25 1.000:1 [LOD = 3]. Se rechaza el enlace cuando los impares caen a 100:1 contra esta hipótesis [LOD = -2]. La estimación de probabilidad máxima es la fracción de recombinación donde el coeficiente de probabilidad es mayor. Por tanto, se añaden los LODs procedentes de múltiples razas hasta que la puntuación suba a 3 [lo que significa 1.000:1 impares] o caiga a -2 [lo que indica 100:1 impares]. 30

Todos los datos clínicos y sobre genotipos se gestionan con EXCELL® en un ordenador MacIntosch® o de Sun Microsystems®. Los análisis estadísticos se realizaron por JMP [SAS Institute, Inc. Cary, NC]. Se utilizaron los ensayos Wilcoxon/Kruskal-Wallis [suma de rangos] para saber si los individuos que eran homocigotos [Met/Met], heterocigotos [Met/Thr] u homocigotos [Thr/Thr] en el 35 codón 117 diferían en su IgE total en suero. Todos los valores-P son de dos colas excepto los análisis sib-pair afectados, en los que se utilizó un test de una cola debido a que se espera sólo una distribución aumentada de alelos.

Habiendo proporcionado esta información básica, el solicitante describe ahora los aspectos preferentes de la invención.

Ejemplo 1: Análisis de Enlaces Entre BHR y el Cromosoma 13 Murino

5

Como ayuda en la disección de determinantes genéticos complejos de BHR, el solicitante ha desarrollado modelos murinos que difieren en su predisposición genética a diversos estímulos broncoconstrictores. Los modelos de animales endogámicos, por medio de cepas endogámicas recombinantes [BXD], pueden facilitar estudios continuos en humanos para determinar el 10 número de genes que regulan la predisposición a BHR, la magnitud de su efecto y su emplazamiento cromosómico preciso. En particular, la localización en un modelo animal de un gen que determina la predisposición a un factor de riesgo crítico al asma puede ayudar en la clonación posicional de este gen en humanos. 15

Aunque el(los) gen(es) predispuesto(s) a BHR y a la atopía no había(n) sido identificado(s) todavía antes de esta invención, se sabía que el cromosoma 5q31-q33 era sintético con porciones de los cromosomas de ratón 11, 13 y 18. La Figura 2 ilustra las regiones sintéticas que contienen numerosos candidatos posicionales que pueden desempeñar potencialmente un papel en la inflamación 20 de las vías aéreas asociada a la BHR, atopía y asma. Específicamente, la región del cromosoma humano 5q31-q33 que muestra una evidencia significativa de enlaces con BHR es homóloga a las porciones de cromosomas de ratón 11, 13 y 18 que contienen numerosos genes candidatos84.

En particular, se ha sugerido recientemente que la IL-9 o un gen cercano 25 son candidatos probables en base al desequilibrio de enlaces entre el logaritmo de los niveles de IgE total en suero y un marcador en este gen utilizando una población determinada al azar43.

A pesar de las comparaciones con intervalos de cuatro candidatos, se descubrió la evidencia de enlaces para una región solamente, designada Alb 1 30 [broncoconstricción 1 inducida por atracurio]. La Figura 3 proporciona los resultados. Específicamente, la Figura 3 expone la curva de puntuación LOD en el cromosoma 13 de ratón para la reactividad de las vías aéreas inducida por atracurio en 24 cepas BXD RI que proceden de cepas progenitoras C57BL/6J hiporreactivas y DBA/2J hiperreactivas [línea continua]. Se muestra también la 35 curva de puntuación LOD que resulta de la genotipificación selectiva de 20 cepas BXD [línea discontinua]. No se utilizaron las cepas BXD -2, -6, -18 y -32 en el segundo análisis ya que estaban en el medio en el fenotipo que mostraba

una respuesta media superior a la desviación estándar 1 de las respuestas medias por debajo de DBA/2 y por encima de C578L/6. La respuesta broncoconstrictora al atracurio, 20 mg/kg aplicados vía intravenosa, fue valorada por el cambio en la presión inspiratoria máxima con el tiempo [4 min], denominado índice presión-tiempo de las vías aéreas [APTI]. El APTI inducido 5 por atracurio se midió en 2-8 animales por cada cepa RI. Se obtuvieron los datos del marcador a partir de la base de datos RWE en el programa de análisis de datos Map Manager. La distancia genética [cM] entre marcadores se indica en la abscisa. Se calcularon las puntuaciones LOD mediante el programa de enlaces MAPMAKER/QTL. Se detectó un QTL en esta región y se denominó 10 broncoconstricción-1 inducida por atracurio [Alb1].

La Figura 3 indica que este locus de carácter cuantitativo [QTL] se encuentra en la mitad del cromosoma 13 murino y alcanzó este intervalo un logaritmo de probabilidad máximo de los impares [LOD] de 2,42. Un cuarenta y cuatro por ciento de la varianza total en la broncoconstricción inducida por 15 atracurio se explicó en Alb1 cuando se analizó la totalidad de los marcadores en el mapa BXD. El LOD para el cromosoma 13 aumentó hasta 2,85 cuando se realizaron los análisis de QTL tras haber excluido las cuatro cepas [BXD-2, -6, -18 y -32] que eran respondedores intermedios al atracurio. Los candidatos posicionales conocidos en la región enlazada del cromosoma 13 incluyen: el 20 receptor de dopamina D1 [Drd1], el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos [Fgfr4], el antígeno linfocitario 28 [Ly28], tiopurina metiltransferasa [Tpmt] e IL-9.

Como el solicitante estaba sometiendo a prueba específicamente los enlaces a cuatro regiones candidatas en el ratón, basándose en datos previos 25 de mapeo en humanos, los datos presentados aquí son muy significativos. Tal como se establece en la literatura de referencia de Lander y Botstein, una tasa de falsos positivos para el enlace resultará en el umbral de LOD, (T) se elige para que T = 1/2(log 10e) (2α/n)2 (donde n es igual al número de intervalos sometidos a prueba). Típicamente, se requiere un LOD mínimo de 3,3 como 30 evidencia del enlace67. Sin embargo, este umbral se basa en la suposición de que se está buscando el genoma entero. Estos mismos autores señalan que un LOD de 0,83 es suficiente cuando se examina solamente una región. En este caso, con cuatro regiones candidatas, se requiere un valor P(α) de 0,0125 para cada región para obtener un verdadero P ≤ 0,05 cuando se corrigen las 35 múltiples comparaciones independientes. Al adoptar un 5% de tasa de error, que tendrá lugar incluso en un único falso positivo, tal como se sugiere en Soller y Brody68, y resolviendo la ecuación 1/2(log10e) (Z α/n)2, se obtiene un umbral de

LOD de al menos 1,36. Se obtuvo un LOD máximo de 1,48 para el gen candidato de la IL-9. La reducción de la tasa de errores aceptable de falsos positivos a ≤ 0,1%, aumenta el umbral de LOD a 2,36. Por tanto, el LOD máximo generado de 2,42 para el intervalo candidato en el cromosoma 13 (Alb1) es muy significativo. 5

Estos datos sobre el umbral de LOD proporcionan la evidencia de un enlace conservado para la BHR en humanos y ratones. La BHR en humanos se une a la región en el cromosoma 5q que contiene diversos factores de crecimiento y citoquinas que incluyen el gen de IL-9 y los mapas del locus de Alb1 a la región de IL-9 del cromosoma 13 murino. 10

Ejemplo 2: Identificación de un Polimorfismo del Gen de IL-9

El solicitante demostró el enlace conservado entre el ratón y los humanos para la BHR. Estos datos sugieren que la variación en las funciones de este gen o de la secuencia de ADN puede ser importante en la regulación de la 15 reactividad bronquial en el ratón. Mediante los métodos descritos anteriormente, se identificó un único producto de tamaño adecuado mediante electroforesis en gel para cada uno de los exones de la IL-9 humana después de la PCR. Se identificó por SSCP un único polimorfismo en el exón 5 del gen humano de IL-9. El análisis directo de la secuencia de ADN demostró una sustitución de los 20 nucleótidos C a T en la posición 3365 [número de acceso al GenBank M30136] del gen humano de IL-9 como causa del nuevo conformador de SSCP. Este cambio en la secuencia de ADN predice una sustitución no-conservadora de una metionina [hidrofóbica] por una treonina [hidrofílica] en el aminoácido 117 de la proteína de IL-9. 25

El exón 5 codifica para este segmento de la proteína que se encuentra dentro del intervalo más altamente conservado de la IL-9 humana en comparación con la secuencia de IL-9 de ratón (véase la Figura 4).

Se genotipificaron individuos procedentes de varias poblaciones para examinar la frecuencia de estos alelos mediante análisis directo de la sustitución 30 de nucleótidos en la secuencia codificante de IL-9 humana. Dos de los 394 individuos procedentes de un grupo de familias asmáticas eran homocigotos [Met/Met] en el codón 117 [0,5%]. Había 91 individuos [23,1%] heterocigotos y 301 [76,4%] homocigotos [Thr/Thr]. Es probable que la verdadera prevalencia para esta variante de IL-9 sea significativamente más alta debido a que se 35 determinó la población de familias italianas a través de pacientes sintomáticos con asma. A partir de una población individual étnicamente diversa determinada

al azar con respecto a la atopía y el asma, había 1 de 49 individuos homocigotos para [Met/Met] en el codón 117 [2,0%]. Había 11 [22,4%] individuos heterocigotos y 37 [75,5%] homocigotos [Thr/Thr]. La prevalencia de los heterocigotos Met/Thr era del 18,9% en una cuarta población determinada al azar con respecto a la atopía y al asma. Así, es probable que aproximadamente 5 el 20% de la población represente vehículos del alelo T en la posición 3365 en comparación con la secuencia reportada [número de acceso al GenBank M30136]. Como es bien conocido en la técnica que la frecuencia de cualquier alelo en la población es p2 + 2pq + q2, entonces, se espera que aproximadamente un 4% de la población sea homocigoto Met/Met en el codón 10 117 de la IL-9.

Globalmente, el IgE total en suero alcanzó una media de 44,5 I.U. para los individuos homocigotos [Met/Met], lo cual era significativamente diferente de los que eran de tipo salvaje homocigotos [Thr/Thr] [351,7 I.U.] o heterocigotos [Met/Thr] [320,9 I.U.]. Véase la Figura 5. Los individuos homocigotos protegidos 15 [Met/Met] no pudieron mostrar evidencias de alergia atópica excepto para una única prueba cutánea positiva en un individuo. Estos datos indican que este nuevo polimorfismo de ADN, cuando se hereda en el estado homocigoto, se asocia a la protección contra la alergia atópica, incluido una IgE total en suero más baja. 20

La Figura 6 ilustra la amplificación por PCR del polimorfismo de repeticiones de secuencia simple de IL-9. Se compara este marcador con el genotipo para estos individuos en cuanto al polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción producido por el polimorfismo de nucleótido en la posición 3365 en comparación con la secuencia reportada [número de acceso al 25 GenBank M30136]. Se muestran dos familias. Los individuos en las calles 1 y 2 son los padres [Thr/Met] de los individuos en las calles 3 [Met/Thr] y 4 [Met/Met]; las calles 5 [Thr/Thr] y 6 [Met/Met] son los padres de los descendientes de las calles 7 [Met/Thr] y 8 [Met/Thr]. El alelo más pequeño para el polimorfismo de repeticiones de secuencia simple de IL-9 (la banda inferior en cada figura es de 30 248 nucleótidos de longitud) está en completo desequilibrio de enlace con el alelo de Met117 (sustitución del nucleótido en la posición 3365) en comparación con la secuencia reportada [número de acceso al GenBank M30136] en estos individuos y en todos los individuos procedentes de poblaciones sometidas a prueba en el mundo entero. Esto fue verdadero en los individuos tanto italianos 35 como en todos los individuos étnicamente diversos determinados al azar estudiados y, por tanto, se puede utilizar este marcador de forma diagnóstica para detectar la presencia del alelo de Met117. Estos datos son los más

coherentes con la hipótesis de que esta variante está ampliamente distribuida en las poblaciones del mundo entero y surgió antes de que se separese un buen número de estas poblaciones.

Ejemplo 3: Expresión del receptor de IL-9 y ensayo de unión de ligando 5

Thr IL-9, Met IL-9 purificadas recombinantes y los compuestos que se parecen potencialmente a Met IL-9 en estructura o función se radiomarcan con el reactivo de Bolton y Hunter tal como se describe en Bolton AE y Hunter WM, Biochem J. 133:529-539 (1973). Este material se marca para una alta actividad 10 específica de 2.300 cpm/fmol o superior. Se cultivan células humanas K562 y MO7e y se resuspenden a 30ºC en 0,8 ml de medio de Eagle modificado con Dulbecco suplementado con un 10% (vol/vol) de suero bovino fetal, 50 mM 2 -mercaptoetanol, 0,55 mM L-arginina, 0,24 mM L-asparagina y 1,25 mM L-glutamina. Las células K562 o MO7e se utilizan tal cual o después de 15 transfección con el gen del receptor de la IL-9 tal como se describe más abajo. El ADN del plásmido que contiene el receptor de IL-9 de longitud total se clona en el plásmido pRC/RSV (Invitrogen, San Diego) y se purifica por centrifugación a través de CsC12. Se añade el ADN del plásmido (50 microgramos) a las células en cubetas de 0,4 cm justo antes de la electroporación. Después de un 20 doble impulso eléctrico (750 V/74 ohms/40 microFaradays y 100 V/74 ohms/2100 microFaradays), se diluyen inmediatamente las células en medio fresco suplementado con la IL-9. Después de 24 horas, se lavan las células y se incuban en G418 (2,5 mg/ml, GIBCO) sin ligante o con varias concentraciones de ligando marcado 125l a 20ºC durante 3 horas. Se utiliza un exceso de ligando 25 no-marcado en experimentos paralelos para estimar la unión no-específica. Luego se lavan las células, se filtran y se recogen para su recuento. Se calcula la incorporación específica mediante análisis de Scatchard. Se realizan ensayos competitivos similares con la IL-9 Thr 117 marcada 125I y varias cantidades de ligandos fríos putativos para valorar la unión específica. 30

El receptor soluble de IL-9 incluyendo los aminoácidos 44 a 270 (R&D Systems) se incubó con distintas formas de IL-9 recombinante humana. Se incubaron varias cantidades de FlagMet117 y FlagThr117 (descritos en el Ejemplo 7) en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos con 0,5 μg de receptor soluble. Se añadió tampón (300 μl) EBC (50 mM Tris pH 7,5; 0,1M 35 NaCl; 0,5% NP4O) junto con 1 μg de anticuerpo monoclonal anti-FLAG (IBI) y se incubó durante 1 hora en hielo. Cuarenta microlitros de solución de proteína A sefarosa se añadieron a cada muestra y se mezclaron durante 1 hora a 4ºC. Se

centrifugaron las muestras durante 1 minuto a 11.000g y se lavaron los gránulos 4 veces con 500 μl de EBC. Se disolvieron los gránulos en 26 μl de tampón 2X SDS, se hirvieron durante 4 minutos y se sometieron a electroforesis con un gel de poliacrilamida SDS al 18%. Se realizaron Western blots tal como se describe en el Ejemplo 15, salvo las manchas, que se sometieron a prueba con un 5 anticuerpo del receptor de anti-IL-9 (R&D Systems).

La Figura 25 demuestra la unión de las proteínas recombinantes de IL-9 al receptor soluble de IL-9. La calle 1 representa marcadores de peso molecular, la calle 2 es FlagMet117 de la IL-9 incubada con el receptor, la calle 3 es FlagThr117 de la IL-9 incubada con el receptor. Estos datos demuestran que 10 ambas formas de la proteína recombinante de IL-9 están unidas al receptor soluble. Además, estos datos, junto con los del Ejemplo 2 (donde los individuos heterocigotos no difieren en IgE en suero de los individuos Thr117 homocigotos), son coherentes con la forma Met117 de IL-9 que representa un agonista débil. 15

Ejemplo 4: Expresión del receptor de IL-9 y ensayo funcional del ligando en células K562, C8166-95 y MO7e

Thr117 IL-9, Met117 IL-9 recombinantes y compuestos que se parecen 20 potencialmente a Met IL-9 en estructura o función se purificaron y prepararon para su utilización en medio de Eagle modificado por Dulbecco. Se utilizaron células K562, C8166-45 o MO7e tal cual o después de transfección con el gen del receptor de IL-9 tal como se describe en el Ejemplo 3. Tras 24 horas de privación de factores de crecimiento, se incubaron las células sin (control) o con 25 cantidades variables de Thr117 IL-9, Met117 IL-9 purificadas y compuestos que se parecen potencialmente a Met117 IL-9 en estructura o función. Se valoró la proliferación celular midiendo la actividad de la fosfatasa ácida. Brevemente, se cultivan muestras cuadruplicadas de células MO7e en placas de microtitulación de fondo redondo (150 o 200 pocillos de microtitulación) con o sin ligando 30 durante 72 a 96 horas a 37ºC. Se mide la fosfatasa ácida tal como lo sugiere el fabricante (Clontech, Palo Alto, CA). Se repiten todos los experimentos al menos dos veces.

Ejemplo 5: Aislamiento y Cultivo de Células 35

Células mononucleares de sangre periférica humana {PBMC} se aislaron de donantes sanos por centrifugación en gradiente de densidad por medio de

Ficoll-Plaque PLUS sometido a prueba con endotoxina de acuerdo con el fabricante (Pharmacia Biotech, AB Uppsala, Suecia). Se cultivaron PBMC (5 x 106), células de bazo de ratón (5 x 106) o células MO7e (5 x 106) en 7 ml de RPMI-1640 (Bethesda Research Labs (BRL), Bethesda, MD) suplementado hasta una concentración final del 10% con suero humano isogénico o FBS 5 inactivado por calor. Las células se cultivaron durante 24 horas a 37ºC no-estimuladas o estimuladas con 5 μg/ml de PMA/5 μg/ml de PHA o 5 μg/ml/rhIL2 50U de PHA (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Ejemplo 6: Aislamiento de ARN, RT-PCR, clonación y secuenciación de 10 productos por RT-PCR

Se extrajo ARN celular total después de 24 horas de PBMC cultivado, células de bazo de ratón y células MO7e utilizando PCR corekit de ARN (Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA) de acuerdo con el suministrador. Un μg de ARN 15 procedente de cada fuente se desnaturalizó durante 5 minutos a 65ºC y luego se sometió a transcripción inversa en ADNc utilizando 20 μl de una mezcla de reacción (PCR corekit de ARN, Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA) que contenía 50 U de Transcriptasa Inversa MuMLV, 1 U/μl del Inhibidor de ARNasa, 2,5 mM de cebador oligo d(T)16, 1 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, 20 dTTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 25 mM MgCl2. La mezcla de reacción se pipeteó en tubos de termociclador, se colocó en un ciclador térmico de PCR y se sometió a 1 ciclo (15 minutos a 42ºC, 5 minutos a 99ºC y 5 minutos a 4ºC). Se utilizó una reacción de transcripción inversa simulada como control negativo. 25

Después se añadió esta mezcla a un segundo tubo que contenía 2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 65,5 μl de agua DI, 2,5 U de Amplitaq ADN polimerasa y 1 μl (20 μM) de cada uno de los oligonucleótidos que representan el exón 1 de la IL-9 de ADNc humana (hacia adelante) y el exón 5 (inverso), para un volumen final de 100 μl. La mezcla de reacción se 30 sometió a las siguientes condiciones de PCR: 120 segundos a 98ºC, luego 30 ciclos a: 30 segundos a 94ºC; 40 segundos a 55ºC; 40 segundos a 72ºC. Finalmente, la mezcla de reacción se sometió a un ciclo una vez durante 15 minutos a 72ºC para su extensión.

Los productos de PCR que representan el ADNc de la hIL-9 se 35 sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los productos de una reacción con transcriptasa

inversa simulada, en la que el H2O se sustituyó por ARN, se utilizó como amplificación del control negativo en todos los experimentos.

Los pares de cebadores de oligonucleótidos de PCR utilizados en estos experimentos para amplificar el ADNc incluyen: el exón 1 hacia adelante de la interleucina 9 humana (hIL-9) 5'- TCT CGA GCA GGG GTG TCC AAC CTT 5 GGC G-3' (SEQ ID NO:1) y el exón 5 inverso 5' GCA GCT GGG ATA AAT AAT ATT TCA TCT TCA T-3' (SEQ ID NO:2); el exón 1 hacia adelante de la interleucina 9 de ratón (mIL-9) 5' - TCT CGA GCA GAG ATG CAG CAC CAC ATG GGG C-3' (SEQ ID NO:3) y el exón 5 inverso de ratón 5' - GCA GCT GGT AAC AGT TAT GGA GGG GAG GTT T-3' (SEQ ID NO:4); las secuencias de 10 reconocimiento de las enzimas de restricción Xhol y Pvull están subrayadas en los cebadores de la IL-9 humana y de ratón. Los productos PCR se subclonaron en el vector de Clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA). La amplificación del ADNc de ratón dio un producto de 438 pb y la amplificación del ADNc humano dio un producto de 410 pb. 15

Los ADN complementarios para la IL-9 humana y la mIL-9 murina se generaron y amplificaron por RT-PCR utilizando los cebadores específicos de los exones 1 y 5 de IL-9 que contenían sitios de digestión para las endonucleasas de restricción Xhol y Pvull. Los productos de amplificación para la hIL-9 y la mIL-9 se aislaron a partir de geles de agarosa al 2,5% utilizando 20 sílice (Sambrook, J. y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Después de la recuperación, los productos de ADNc se ligaron en el vector de Clonación TA (Invitrogen Corp., San Diego, CA) y luego se utilizaron para transformar las células competentes de INVαF' siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos que 25 contienen los insertos de ADNc de hIL-9 y mIL-9 se aislaron por técnicas convencionales (Sambrook, J. y col., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Después de la amplificación, la secuencia de ADN que incluía y rodeaba cada inserto se analizó en busca de errores inducidos por la PCR o inducidos por la clonación. 30

Se secuenciaron los insertos de ADNc de hIL-9 y mIL-9 por el método de terminación de cadena mediada por didesoxi (Sanger y col., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5963), utilizando el cebador hacia adelante M13 (-20) (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3') (SEQ ID NO:18) y SequenasaTM (USB), y se analizaron por electroforesis en gel (Sambrook, J. y col. (1989), Molecular 35 Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Los insertos de ADNc de hIL-9 y mIL-9 sin clonar y/o sin errores en secuencias inducidos por la Taq polimerasa (véase las secuencias traducidas de ADNc en

las Figuras 7 y 8) se subclonaron en vectores de expresión (véase las Figuras 9-12) o se utilizaron para crear mutaciones en sentido erróneo y mutantes por deleción.

Ejemplo 7: Clonación y expresión de constructos in vitro de IL-9. Métodos 5 Generales de Clonación para Constructos

Se subclonó hIL-9 en vectores de expresión procariotas. Los vectores met y thr de TA2AAF1 fueron digeridos por EcoRI y el fragmento de 0,410 kB (que contenía un sitio Xhol en el extremo 5' del ADNc de hIL-9) se clonó en el sitio de 10 EcoRI contenido con el poliligante de pBluescript (PBS) (Stratagene). Los clones en el sentido de orientación hacia el promotor T3 fueron digeridos entonces con Xhol (el fragmento contenía un sitio 5' Xhhol procedente del inserto de ADNc de la IL-9 procedente de los vectores TA y un sitio 3' Xhol procedente del poliligante PBS) y los insertos se subclonaron en los sitios Xhol de los vectores de 15 expresión procariotas pGEX y pFLAG.

Clonación y expresión de constructos de IL-9 en el vector de fusión con el gen de glutation-s-transferasa pGEX-4T-1

20

Para la expresión, purificación y detección de la proteína de IL-9, los insertos de ADNc de IL-9 se subclonaron en el sitio Xhol dentro del cassette de clonación múltiple del vector de fusión con el gen de glutation-s-transferasa pGEX-4T-1 de 4,9 Kb (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante técnicas estándar. Brevemente, los clones de TA que contenían secuencias intactas de 25 ADNc de IL-9 y el vector pGEX-4T-1 fueron digeridos durante una hora a 37ºC utilizando endonucleasas de restricción de Xhol y Pvull en presencia del tampón 1x React 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) (volumen total de 50 μl). Los productos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa preparativo al 1,5% con 10 μg/ml de bromuro de etidio. Se suprimió la banda de ADN 30 dimensionada adecuadamente, se fundió la agarosa a 45ºC durante 10 minutos en 3 volúmenes de solución stock de Nal. Se añadió una solución matriz de sílice en DI H2O (Geneclean II, La Jolla, CA) a la solución a 5 μl por cada 5 μg de ADN y 1 μl por cada 0,5 μg de ADN por encima de 5 μg. Se incubó la masa a 4ºC y se agitó de vez en cuando durante 30 minutos. Después, se granuló la 35 masa por microcentrifugación, se lavó 3 veces en un tampón bajo en sal y se resuspendió en 10 μl de DI H2O para eluir el ADN de la sílice. Una

microcentrifugación final proporcionó la solución de 10 μl que contenía el ADN purificado.

Los productos se resuspendieron en 50 μl de DI H2O y se precipitaron mediante la adición de 2 volúmenes de etanol y 1/10 volumen de acetato de sodio 3M. Se centrifugaron las muestras a temperatura ambiente a 14.000 r.p.m. 5 durante 10 minutos, se secaron al aire bajo presión negativa y se resuspendieron en un volumen apropiado de DI H2O. Las ligaciones y transformaciones de la bacteria DH5a (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) con los insertos de ADNc de mIL-9 y hIL-9 en el vector pGEX-4T-1 se llevaron a cabo utilizando técnicas estándar. 10

Para confirmar que los insertos de ADNc de hIL-9 contenidos en el vector pGEX-4T-1 pertenecían a la secuencia correcta de nucleótidos, los plásmidos que contenían el ADNc candidato de IL-9 se secuenciaron por el método de terminación de cadena mediada por didesoxi utilizando los oligonucleótidos específicos de ADNc de mIL-9 y hIL-9 mencionados anteriormente (cebadores 15 del exón 1 hacia adelante, exón 5 inverso).

Las proteínas de fusión recombinantes se obtuvieron a partir de cultivos a gran escala. El cultivo nocturno de E. coli (50 ml) transformado se inoculó en caldo fresco LB/amp. Se incubó el cultivo durante 4 horas a 37ºC con fuerte agitación, se añadió entonces isopropil β-D-tiogalactopiranósido hasta una 20 concentración final de 1 mM y se incubó el cultivo durante una 1,5 h adicional. Se cosecharon las células por centrifugación a 500g a 4ºC y se purificaron las variantes recombinantes mediante cromatografía de afinidad en una columna de glutation-sefarosa 4B (Pharmacia) para las proteínas de fusión GST. Algunas variantes se expresaron como cuerpos de inclusión y se purificaron a partir de 25 cuerpos de inclusión insolubles mediante el procedimiento descrito por Marston (1987, The purification of eukaryotic polypeptides expressed in E. coli in Clover D.M. ed. DNA cloning: A practical approach, IRL Press, Oxford, 59-88). Brevemente, se lisaron las células con lisozima seguido del tratamiento con ácido desoxicólico. Se eliminaron los ácidos nucleicos contaminantes mediante 30 tratamiento con DNAasa I. El material insoluble se lavó una vez con urea 2M y finalmente se solubilizó en tampón de lisis (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) que contenía urea 8M. Los componentes solubilizados procedentes de los cuerpos de inclusión se dializaron paso a paso contra concentraciones decrecientes de urea (empezando con 8, 6, 4 y 2M de urea) en 35 tampón de lisis para permitir el replegamiento de la proteína desnaturalizada. Finalmente, la muestra se dializó contra urea 2M y β-mercaptoetanol (β-ME) al 2,5% y se centrifugó a 10.000g durante 15 minutos. La proteína de fusión se

dializó finalmente contra 0,01M Tris-Cl, pH 8,0. Las proteínas de fusión expresadas en el vector pGEX-4T se segmentaron con 100 U de Trombina durante 6 horas a 37ºC y se recuperaron en el flujo a través de fracciones después de una cromatografía en columna de glutation-Sefarosa 4B. Se alcanzó la purificación final mediante cromatografía en columna Sephadex G-100 (100 x 5 1,5 cm), empacada y equilibrada con 0,05M de tampón bicarbonato de amonio.

Clonación y expresión de constructos de IL-9 en el Vector de Expresión pFLAG-1TM

10

Para la expresión, purificación y detección de la proteína humana de IL-9, se subclonaron insertos de ADNc de IL-9 en el sitio Xho2 del sitio de clonación múltiple (Xhol) del vector Flag de 5,37 Kb. La tecnología FLAG se centra en la fusión de un péptido de bajo peso molecular (1 kD), hidrofílico, como marcador FLAG, al N-terminal de una proteína recombinante expresada por el Vector de 15 Expresión pFLAG-1TM (1) (obtenido de IBI Kodak). Cada colonia de bacterias se cultivó en caldo LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina hasta que la densidad óptica a 590 nm alcanzara 0,6. Se añadió entonces IPTG a una concentración final de 1 mM y se incubaron los cultivos durante 1 hora más para inducir la síntesis de la proteína. Se cosecharon las células por centrifugación y la masa 20 celular se hirvió en 50 μl de tampón Laemmli (Laemmli, 1970) durante 10 minutos y se sometió a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. Se utilizó el anticuerpo monoclonal Anti-FLAGTM M1 para una detección específica y eficaz de la proteína de fusión FLAG en Western Blot (véase la Figura 13) o Dot Blots en toda su expresión, purificación por afinidad y eliminación del marcador 25 FLAG. La proteína de fusión FLAG se purificó rápidamente en condiciones suaves no desnaturalizantes en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad con el anticuerpo monoclonal murino Anti-FLAGTM IgG M1 unido a agarosa de forma covalente. Después de purificación por afinidad, se puede utilizar la proteína de fusión después de extracción de la columna de afinidad o 30 la proteína auténtica se puede recuperar en forma biológicamente activa mediante la eliminación proteolítica específica y eficaz del péptido FLAG con enteroquinasa. La purificación final se llevó a cabo por cromatografía en columna Sephadex G-100 (100 x 1,5 cm), empacada y equilibrada con 0,05M tampón bicarbonato de amonio. Se pueden utilizar también con la tecnología 35 FLAG los promotores descritos más arriba en este ejemplo.

SDS-PAGE y Análisis Inmunoblot

Se realizó un SDS-PAGE por medio del método de Laemmli (Laemmli U.K. (1970) Nature 227, 680-685) mediante un gel de poliacrilamida al 12,5% en un sistema mini gel (Unidad vertical SE 280, Hoefer). Para el análisis 5 inmunoblot, las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante la pequeña unidad de transferencia TE 22 Mighty (Hoefer) en tampón de 25 mM de Tris-glicina, pH 8,3, que contenía metanol al 15% (Towbin H., y col., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354). Los sitios de unión no ocupados en la membrana se bloquearon 10 mediante la incubación durante 1 hora con 20 mM de tampón Tris-HCl, pH 8,0, que contenía seroalbúmina bovina al 2%. Entonces se incubaron las membranas a una dilución 1:200 con anticuerpos durante toda la noche a 4ºC. Se lavaron las membranas y se trataron a 1:2.000 con IgG anti-conejo de cabra diluida conjugada con peroxidasa o fosfatasa alcalina durante 1 hora. Después 15 de lavado, se visualizaron los anticuerpos unidos mediante la adición del reactivo quimioluminiscente en súper-sustrato (Pierce) o el reactivo para revelado en color de 4-cloro-1-naftol. Se interrumpió la reacción sumergiendo las membranas en agua destilada. La Figura 13 demuestra que las proteínas de fusión FLAG IL-9 humanas recombinantes purificadas (Met117 y Thr117) tienen 20 el tamaño correcto y se encuentran en el marco de lectura correcto, ya que son reconocidas por el anticuerpo monoclonal Anti-FLAGTM M1.

Métodos Analíticos

25

La masa molecular de las proteínas purificadas se confirmó por espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz utilizando la estación de trabajo Perceptive Biosystems Voyager Biospectrometry. Los análisis de aminoácidos se realizaron después de la hidrólisis de la muestra en HCl 6N a 110ºC durante 24 horas en ampollas de vidrio evacuadas selladas. 30

Degradación automatizada de Edman

La secuencia parcial de aminoácidos de las proteínas purificadas se determina mediante la secuenciación automatizada paso a paso en un 35 secuenciador en fase gaseosa de Applied Biosystems, modelo 477A con un analizador en línea PTH, modelo 20A.

Ejemplo 8: Deleción del exón 2 y/o del exón 3: mutagénesis y secuenciación de los constructos

Las deleciones del exón 2 y del exón 3 humanos se obtienen con el kit de mutagénesis sitio-dirigida basado en PCR ExSite tal como sugiere el fabricante 5 (Stratagene, La Jolla, CA). Los cebadores de PCR son los siguientes: h9CD1U hacia adelante 5'-GTG ACC AGT TGT CTC TGT TTG-3' (SEQ ID NO:5); h9CD1L inverso 5'-CTG CAT CTT GTT GAT GAG GAA-3' (SEQ ID NO:6); h9CD2U hacia adelante 5'-GAC AAC TGC ACC AGA CCA TGC-3' (SEQ ID NO:7); h9CD2L inverso 5'-ATT AGC ACT GCA GTG GCA CTT-3' (SEQ ID 10 NO:8). Las deleciones del exón 2 se crean mediante el par de cebadores h9CD1L hacia adelante y h9CDIL inverso. Las deleciones del exón 3 se crean mediante h9CD2U hacia adelante y h9CD2L inverso. Las deleciones que incluían el exón 2 y el exón 3 utilizan el par de cebadores h9CD2U hacia adelante y h9CD1L inverso. 15

Las deleciones del exón 2 y del exón 3 de ratón se obtienen con el kit de mutagénesis sitio-dirigida basado en PCR ExSite tal como sugiere el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA). Los cebadores de PCR son los siguientes: m9CD1U hacia adelante 5'-GTG ACC AGC TGC TTG TGT CTC-3' (SEQ ID NO:9); m9CD1L inverso 5'-CTT CAG ATT TTC AAT AAG GTA-3' (SEQ ID NO:10); 20 m9CD2U hacia adelante 5'-GAT GAT TGT ACC ACA CCG TGC-3' (SEQ ID NO:11); m9CD2L inverso 5'-GTT GCC GCT GCA GCT ACA TTT-3' (SEQ ID NO:12). Las deleciones del exón 2 se crean mediante el par de cebadores m9CD1U hacia adelante y m9CD1L inverso. Las deleciones del exón 3 se crean mediante m9CD2U hacia adelante y m9CD2L inverso. Las deleciones que 25 incluían el exón 2 y el exón 3 utilizan el par de cebadores m9CD2U hacia adelante y m9CD1L inverso.

Los constructos mutagenizados de los insertos de ADNc de hIL-9 y mIL-9 se secuencian mediante el método de terminación de cadena mediada por didesoxi (Sanger y col. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5463), utilizando el 30 cebador hacia adelante M13 (-20) (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') (SEQ ID NO:18) y sequenasaTM (USB), con análisis por electroforesis en gel (Sambrook, J. y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Los mutantes que carecen del exón 2, exón 3 o tanto del exón 2 como del exón 3 y que no tienen errores en secuencias 35 inducidos por la Taq polimerasa pueden ser utilizados para crear vectores de expresión.

Ejemplo 9: Líneas celulares, ensayos de proliferación celular e inhibición de la actividad de IL-9

Se utilizaron líneas celulares para valorar la función de los péptidos, aminoesteroles, tirofostinas, rhIL-9, rmIL-9 y formas mutantes recombinantes de 5 estas proteínas así como todos los demás compuestos que bloquean la función de IL-9. Se midió la respuesta proliferativa y se comparó con cada una de las otras citoquinas, formas variantes o mutantes de IL-9 o antagonistas de IL-9. Además, los compuestos se sometieron a prueba en cuanto a su capacidad para antagonizar la respuesta proliferativa de la línea base. Una vez establecida 10 la respuesta proliferativa de la línea base para una citoquina, una pérdida de respuesta estadísticamente significativa en ensayos repetidos tres veces por triplicado se consideró como una evidencia de antagonismo. Se diferenció la respuesta antagonista verdadera de la tonicidad celular mediante observación directa, tinción con azul triptano (técnica bien conocida por los especialistas en 15 la técnica) y pérdida de actividad de la fosfatasa ácida. Se valoró la especificidad para el antagonista mediante la valoración de si la actividad se expresaba sustancialmente contra otros agentes proliferativos tales como el factor de Steel, interleucina 3 o interleucina 4.

La línea MO7e es una línea celular megacarioblástica humana, cultivada 20 en RPMI 1640 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), Suero Bovino Fetal al 20% (Hyclone) y 10 ng/ml de IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN). La línea MJ es una línea celular linfoblastoide humana independiente de la citoquina cultivada en RPMI 1640 (GIBCO/BRL), la K562 es una línea celular humana de la eritroleucemia, cultivada en RPMI 1640 (GIBCO/BRL) y suero bovino fetal al 25 10% (Hyclone). C8166-45 es una línea portadora del receptor de IL-9, cultivado en RPMI 1640 (GIBCO/BRL) y suero bovino fetal al 10% (Hyclone). Todas las líneas celulares responden a las citoquinas incluida la IL-9. Las líneas celulares son alimentadas y resembradas a 2 x 105 células/ml cada 72 horas.

Se centrifugaron las células durante 10 minutos a 2.000 r.p.m. y se 30 resuspendieron en RPMI 1640 con seroalbúmina bovina al 0,5% (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) y los cofactores de insulina-transferrina-selenio (ITS) (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD). Se hizo un recuento de las células mediante un hemocitómetro, se diluyeron hasta una concentración de 1 x 105 células/ml y se colocaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Cada pocillo 35 contenía 0,15 ó 0,2 ml, dando una concentración final de 2 x 104 células por pocillo.

Las células MO7e se estimularon con 50 ng/ml del Factor de Célula Madre (SCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) solo, 50 ng/ml de SCF más 50 ng/ml de IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN) o 50 ng/ml de SCF más 50 ng/ml de IL-9. Se incluyó un control que contenía únicamente células y medios base. Se añadieron diluciones seriadas de compuestos de prueba (es decir, proteínas 5 recombinantes de IL-9, péptidos, pequeñas moléculas) a cada condición de prueba por triplicado. Se utilizó la línea celular MJ como control independiente para la citotoxicidad no específica. Se incubaron los cultivos durante 72-96 horas a 37ºC en CO2 al 5%.

Se sometió a ensayo la proliferación celular utilizando el Kit de 10 Proliferación Celular Abacus (Clontech, Palo Alto, CA) que determina la cantidad de fosfatasa ácida intracelular presente como indicación del número celular. El fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) del sustrato fue convertido por la fosfatasa ácida en p-nitrofenol, lo cual se midió como indicador de la concentración enzimática. Se añadió pNPP a cada pocillo y se incubaron a 37ºC durante una hora. 15 Entonces, se añadió NaOH 1N para interrumpir la reacción enzimática y se cuantificó la cantidad de p-nitrofenol utilizando un lector de placas Dynatech 2000 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) a una longitud de onda de 410 nm. Se utilizaron curvas estándar que comparan el número celular con la absorbancia óptica para determinar el rango lineal del ensayo. Sólo se utilizan 20 los resultados del ensayo cuando las mediciones de absorbancia se encuentran dentro del rango lineal del ensayo.

La Figura 14 ilustra la secuencia de aminoácidos de tres antagonistas peptídicos de la función de IL-9. Se incubó cada péptido con células MO7e y se determinó la inhibición del crecimiento celular inducido por la IL-9 por 25 comparación con las condiciones control (sin péptido) (véase las Figuras 15-17). No había evidencia de citotoxicidad con ninguno de los péptidos. Se prevé que los péptidos KP-16 y KP-20 se encuentren dentro de dos hélices alfa antiparalelas y definan un dominio de unión crítica al receptor de la IL-9 para el ligando de la IL-9. El polimorfismo de la proteína en el codón 117 se encuentra 30 dentro de KP-23 y KP-24, que mostraban también propiedades antagonistas, demostrando además la importancia de esta región que rodea el sitio de variación genética.

La Figura 18 ilustra el efecto de las tirofostinas (obtenidas de Calbiochem) en el crecimiento dependiente de la IL-9 de células MO7e in vitro. Se incubó 35 cada tirofostina con células MO7e y se determinó la inhibición del crecimiento celular inducido por IL-9 mediante la comparación con condiciones de control (sin tratamiento). No había evidencia de citotoxicidad con ninguno de los

tratamientos. Las tirofostinas B46 y B56 proporcionaron la mayor inhibición, lo que sugiere una relación común de actividad estructural.

La Figura 19 ilustra el efecto de los aminoesteroles aislados del hígado de tiburón, tal como se expone en U.S.S.N. 08/290.826, 08/416.883, 08/478.763 y/o 08/483.059, sobre el crecimiento dependiente de la IL-9 de las células MO7e in 5 vitro. Se incubó cada aminoesterol con células MO7e a 20 μg/ml en los medios de cultivo y se determinó la inhibición del crecimiento celular inducido por IL-9 mediante comparación con las condiciones de control (sin tratamiento). No había evidencia de citotoxicidad con ninguno de los tratamientos. Los aminoesteroles 3 y 6 proporcionaron coherentemente la mayor inhibición de 10 crecimiento.

Ejemplo 10: Ensayo para la proliferación de células secretoras de IgE

Se pueden utilizar líneas de células B para valorar la función de la rIL-9 y 15 formas mutantes recombinantes de estas proteínas así como otros antagonistas de IL-9. La proliferación de células secretoras de IgE se mide para la rIL-9 y se compara con otras citoquinas o formas variantes de rIL-9. Además, se someten a prueba los compuestos en cuanto a su capacidad para antagonizar la respuesta proliferativa de la línea base de las células secretoras de IgE con 20 respecto a la rIL-9. Una vez establecida la respuesta a IgE de la línea base para una citoquina, una pérdida estadísticamente significativa (P < 0,05) de respuesta en los ensayos repetidos tres veces por triplicado se considera una evidencia de antagonismo. Se diferencia una respuesta antagonista verdadera de la toxicidad celular mediante tinción con azul triptano (técnica bien conocida por los 25 especialistas en la técnica).

Preparación celular y cultivos

Se aíslan linfocitos de sangre periférica (PBL) de sangre heparinizada de 30 donantes sanos o picando los bazos de ratones. Se separan por centrifugación células mononucleares en gradientes Ficoll/Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se obtienen linfocitos-B humanos semi-purificados mediante formación de rosetas con neuraminidasa (Behring, Marburg, FRG) - células de glóbulos rojos de oveja tratadas y adherencia plástica - durante 1 hora a 37ºC. Las 35 células B se purifican también por separación paramagnética con perlas magnéticas recubiertas con anti-CD20 (DYNAL) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La proporción relativa de células B, células T y monocitos se determina por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales específicos de CD23, CD3 y CD14, respectivamente (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Brevemente, se incuban 106 células/ml a una dilución 1:1.000 de anti-CD23 conjugado con ficoeritrina y anti-CD3 conjugado con fluoresceína así como 5 anticuerpos anti-CD14 durante 30 minutos a 4ºC. Después de 3 lavados con rotación con PBS estéril y seroalbúmina bovina al 1% (Sigma), se mide la fluorescencia en un citofluorógrafo (FACSTAR Plus, Becton Dickinson, Grenoble, France). Típicamente, hay un 45% de células CD20+, 35% de células CD3+ y 10% de células CD14+ en un recuento de 5.000 células por muestra. 10

Se cultivan las células a una densidad de 2 x 106 células/ml de RPM1 1640 suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (FCS), 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 20 mM HEPES (RPM1-FCS) a 37ºC en atmósfera humidificada al 5% de CO2 / 95% de aire. Se incuban los cultivos con concentraciones crecientes de IL-4, 15 rhIL-9, rmIL-9, o formas mutantes recombinantes de estas proteínas, solas, o en combinación. Se realizan experimentos de competición con mezclas de una o más de estas moléculas recombinantes u otros antagonistas de IL-9. Se mantienen los cultivos durante 9-13 días.

20

Frecuencia de las células B secretoras de IgE

La frecuencia de las células B humanas secretoras de IgE en respuesta a la IL-9 humana o murina se determina mediante un ensayo ELISA-spot (Dugas y col., 1993, Eur. J. Immunol. 23:1687-1692; Renz, H. y col., 1990. J. Immunology. 25 145:3641). Placas de 96 pocillos de fondo plano de nitrocelulosa se recubren durante toda la noche a 4ºC con mAb de IgE antihumano de cabra purificado diluido en tampón NaHCO3 0,1M (2,5 μg/ml). Después de un lavado con PBS-Tween 20, se incuban las placas durante 1 hora con RPMI-FCS para saturar los sitios de unión no-específicos. Las células B obtenidas después de 9-13 días de 30 cultivo se recogen, se lavan dos veces y se resuspenden a 101 células/ml en RPMI-FCS, luego se transfieren a las placas recubiertas de anti-IgE seguido de una incubación de 18 horas a 37ºC. IgE mAb antihumano de ratón conjugado con peroxidasa a varias diluciones se añade durante 2 horas a 37ºC después del lavado. Se visualizan manchas después de la adición de diaminobenzidina 35 diluida en Tris-HCl 0,1M que contiene un 0,03% de H2O2. Después de 24 horas, se cuentan las manchas con un microscopio invertido a una ampliación 25X. Los datos se expresan como número de células secretoras de IgE por 106 células.

Ejemplo 11: ELISA para IgE secretado por células co-estimuladas con IL-9

Se aíslan las células, se preparan y se estimulan tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 10. Placas de microtitulación de fondo plano (Nunc) se recubren con IgE anti-humano de conejo (dilución final 1:2.000; Serotec, 5 Oxford, GB) en 200 μl de 10 mM de tampón bicarbonato (pH 9,6). Después de incubación durante toda la noche a 4ºC, se lavan las placas cuatro veces con una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene un 0,05% de Tween (PBS-Tween; Merck, Hohenbrunn, FRG) y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con RPMI-FCS para saturar los sitios de unión a la 10 proteína no-específicos. Después de lavado, diluciones seriadas de 200 μl de IgE humano (Eurobio, Les Ulis, France) estándares en PBS-T se añaden a las respectivas placas para establecer curvas de calibración. Las diluciones de sobrenadantes de cultivos que se deben someter a prueba se añaden entonces y, después de 2 horas a temperatura ambiente, se lavan las placas y se añaden 15 200 μl de anti-IgE conjugado con fosfatasa alcalina específica diluido (1:250; Serotec), anti-IgG o anti-IgM (Behring) en las placas apropiadas. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se lavan las placas y se añaden 200 μl (0,5 mg/ml) de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) en tampón citrato. Se incuban las placas a 37ºC y se mide la absorbancia (A) a 405 nm utilizando un autolector 20 (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA). Las sensibilidades umbral de los ensayos son de 100 pg/ml para IgE, 1 ng/ml para IgG y 2 ng/ml para IgM y la variación entre determinaciones duplicadas de muestras no excede típicamente el 10%.

25

Ejemplo 12: Papel de la IL-9 en modelos murinos de asma: respuesta de las vías aéreas de los animales insensibilizados

Animales

30

Ratones machos certificados sin virus con una edad de 5 a 6 semanas se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los animales se alojaron en campanas de flujo laminar de aire filtrado particulado de alta eficacia (HEPA) en una condición libre de antígeno y virus y se permitió el libre acceso a la comida para roedores en gránulos y al agua durante 3 a 7 días antes de la 35 manipulación experimental. Las condiciones de los animales se mantuvieron a 22ºC y el ciclo luz:oscuridad se controló automáticamente (luz:oscuridad 10:14 h). Se compraron ratones DBA/2 (D2), C57BL/6 (B6) y (B6D2)F1 (F1) hembras y

machos de 5 a 6 semanas de edad del Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME o del National Cancer Institute, Frederick, MD. Se compraron ratones BXD del Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. La comida y el agua estaban presentes a voluntad.

5

Fenotipificación y eficacia del pretratamiento

Para determinar la respuesta broncoconstrictora, se midió la presión del sistema respiratorio en la tráquea y se registró antes y durante la exposición al medicamento. Se anestesiaron los ratones y se instrumentaron tal como se ha 10 descrito anteriormente (Levitt, R.C. and Mitzner, W., FASEB J., 2:2605-2608 (1988); Levitt, R.C. and Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1125-1132 (1989); Kleeberger, S., Bassett, D., Jakab, G.J. and Levitt, R.C., Am J. Physiol., 258 (2) L313-320 (1990); Levitt, R.C., Pharmacogenetics, 1:94-97 (1991); Levitt, R.C. and Ewart, S.L., Am J. of Respir. Crit. Care Med., 151:1537-1542 (1995); Ewart, 15 S., Levitt, R.C. and Mitzner, W., In press, J. Appl. Phys. (1995)). Se midió la reactividad de las vías aéreas con respecto a uno o más de: 5-hidroxitriptamina (5HT) (Sigma). Una construcción de ramificación adicional que se puede utilizar es la acetilcolina (Sigma), el atracurio (Glaxo Welcome). Se utilizó una medida simple y repetible del cambio en Ppi que sigue el desafío broncoconstrictor, el 20 cual se ha calificado como Índice Presión Tiempo de las Vías Aéreas (APTI) (Levitt, R.C. y Mitzner, W., FASEB J., 2:2605-2608 (1988); Levitt, R.C. y Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1125-1132 (1989)). Se valoró el APTI mediante el cambio en la presión inspiratoria pico (Ppi) integrada desde el momento de la inyección hasta la presión máxima devuelta a la línea base o la meseta. El APTI 25 era comparable con la resistencia de las vías aéreas (Rrs); sin embargo, el APTI incluye un componente adicional relacionado con la recuperación de la broncoconstricción.

Se identificó la distribución por cepa de la reactividad bronquial en múltiples cepas de ratones endogámicos en estudios previos (Levitt, R.C. y 30 Mitzner, W., FASEB J., 2:2605-2608 (1988); Levitt, R.C. y Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1125-1132 (1989)). Se determinó el Rrs y/o APTI en ratones A/J, C3H/HeJ, DBA/2J, C57BL/6J.

Antes de sacrificarlos, se recogió sangre total para las medidas de IgE en suero mediante punción con aguja de la vena cava inferior en los animales 35 completamente anestesiados. Se centrifugaron las muestras para separar las células, se recogió el suero y se utilizó para medir los niveles totales de IgE. Las muestras no medidas inmediatamente se congelaron a -20ºC.

Se preformaron el lavado broncoalveolar y los análisis celulares tal como ya se ha descrito (Kleeberger y col., 1990).

Se midieron todos las muestras de IgE en suero utilizando un ensayo ELISA de anticuerpos tipo “sándwich”. Se recubrieron placas de microtitulación (Corning #2585096, Corning, NY), 50 μl por pocillo, con anticuerpo IgE anti-ratón 5 de rata (Southern Biotechnology #1130-01, Birmingham, AL) a una concentración de 2,5 μg/ml en un tampón de recubrimiento de carbonato de sodio-bicarbonato de sodio con azida de sodio (Sigma #S-7795, #S-6014 y #S-8032, St. Louis, MO). Se recubrieron placas con un envoltorio plástico y se incubaron a 4ºC durante 16 horas. Las placas se lavaron tres veces con un 10 tampón de lavado Tween-20 al 0,05% (Sigma #P-7949) en solución salina tamponada con fosfato (BioFluids #313, Rockville, MD), con incubación durante cinco minutos de cada lavado. El bloqueo de los sitios de unión no específicos se efectuó añadiendo 200 μl por pocillo de seroalbúmina bovina al 5% (Sigma #A-7888) en PBS, recubriendo con envoltorio plástico e incubación durante 2 15 horas a 37ºC. Después de lavarlos tres veces con el tampón de lavado, se añadieron a los pocillos muestras de prueba de 50 μl duplicadas. Las muestras de prueba se sometieron a ensayo después de ser diluidas a 1:10, 1:50 y 1:100 con BSA al 5% en tampón de lavado. Además de las muestras de prueba, se sometió a ensayo un conjunto de estándares de IgE (PharMingen #03121D, San 20 Diego, CA) a concentraciones de 0,8 ng/ml a 200 ng/ml en BSA al 5% en tampón de lavado para generar una curva estándar. Se utilizó un blanco de sin muestra o estándar para poner a cero el lector de placa (fondo). Después de añadir las muestras y los estándares, se recubrió la placa con envoltorio plástico y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavarla tres 25 veces con tampón de lavado, se añadieron 50 μl del segundo conjugado de anticuerpo IgE anti-ratón de rata-peroxidasa de rábano (PharMingen #02137E) a una concentración de 250 ng/ml en BSA al 5% en tampón de lavado. Se recubrió la placa con el envoltorio plástico y se incubó 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavarla tres veces con tampón de lavado, se añadieron a 30 cada pocillo 100 μl del sustrato 0,5 mg/ml de O-fenilaminadiamina (Sigma #P-1526) en tampón citrato 0,1M (Sigma #C-8532). Después de 5-10 minutos, se interrumpió la reacción con 50 μl de H2SO4 al 12,5% (VWR #3370-4, Bridgeport, NJ) y se midió la absorbancia a 490 nm en un lector de placas Dynatech MR-5000 (Chantilly, VA). Se construyó una curva estándar a partir de las 35 concentraciones estándar de IgE con la concentración de antígeno en el eje “X” (escala logarítmica) y la absorbancia en el eje “Y” (escala lineal). Se interpoló la concentración de IgE en las muestras a partir de la curva estándar.

Ejemplo 13: Papel de la IL-9 en modelos murinos de asma: respuesta de las vías aéreas de los animales sensibilizados

Animales, fenotipificación y optimización de la sensibilización a antígeno

5

Los animales y la manipulación fueron esencialmente tal como se ha descrito en el Ejemplo 12. La sensibilización con albúmina de huevo de pavo (OVA) y el desafío con aerosol se llevaron a cabo para valorar el efecto sobre BHR, BAL e IgE en suero. Se inyectó OVA I.P. (25 μg) el día 0 antes de la aplicación de un aerosol con una solución salina o con OVA. Los ratones se 10 sometieron a un desafío con aplicación de aerosol con la solución salina o con OVA que se administró una vez al día durante 5 a 7 días empezando o bien el día 13 o el 14. Las mediciones fenotípicas de IgE en suero, BAL y BHR se llevaron a cabo el día 21. El efecto de una exposición a aerosol con OVA de 7 días sobre el desafío broncoconstrictor con 5-HT y acetilcolina se evaluó junto 15 con IgE total en suero, recuentos celulares totales de BAL y recuentos celulares diferenciales, así como la reactividad bronquial. Se examinó el efecto del pretratamiento con anticuerpo (Ab) o con solución salina sobre la inflamación pulmonar inducida por el aerosol con solución salina o por el aerosol con OVA mediante la medida de BHR, BAL e IgE en suero. Se administró Ab I.P. 2-3 días 20 antes de la aplicación de aerosol con solución salina o con OVA.

La histología del pulmón se llevó a cabo después de extraer los pulmones durante anestesia profunda. Como la instrumentación previa puede introducir artefactos, se utilizaron animales separados para estos estudios. Así, se trató un pequeño grupo de animales en paralelo exactamente igual que la cohorte que 25 recibió varios pretratamientos, excepto que estos animales no se utilizaron para otras pruebas aparte de las pruebas de reactividad bronquial. Después de las pruebas de reactividad bronquial, se extrajeron los pulmones y se sumergieron en nitrógeno líquido. La criosección y el examen histológico se llevaron a cabo de forma rutinaria. 30

Los anticuerpos policlonales neutralizantes para la IL-9 murina se compraron a “R & D Systems”, Minneapolis, MN y los anticuerpos bloqueantes para el receptor de IL-9 murina fueron obtenidos de Magainin Pharmaceuticals Inc. por Lampine Biological Laboratories”, Ottsville, PA por medio de conjugados peptídicos producidos en Magainin. Los antisueros policlonales se prepararon 35 en conejos contra secuencias peptídicas procedentes del receptor de IL-9 murina. Los péptidos utilizados para producir los antisueros fueron: GGQKAGAFTC (residuos 1-10) (SEQ. I.D. NO:19); LSNSIYRIDCHW-

SAPELGQESR (residuos 11-32) (SEQ. I.D. NO:20); y CESYEDKTEGEYYKS-HWSEWS (residuos 184-203 con un residuo de Cys añadido al terminal N para acoplar el péptido a la proteína portadora) (SEQ. I.D. NO:21). Los antisueros se obtuvieron por las técnicas descritas en Protocols in Immunology, Capítulo 9, Wiley. Brevemente se acoplaron los péptidos a la proteína portadora, Keyhole 5 Limpet, hemocianina, (Sigma), a través de la cadena lateral del residuo Cys utilizando el agente de reticulación bifuncional MBS (Pierce). Se utilizaron conjugados peptídicos para inmunizar conejos con adyuvantes apropiados y se obtuvieron antisueros útiles después de varias inyecciones de refuerzo del conjugado peptídico. Se utilizaron los anticuerpos terapéuticamente para 10 subregular las funciones de IL-9 y valorar la importancia de esta vía con respecto a la reactividad pulmonar de la línea de base, IgE en suero y BAL en ratones insensibilizados. Después del pretratamiento con Ab, se determinaron los niveles de IgE en suero, BHR y BAL sobre la línea base con relación a los controles. En experimentos adicionales, se administraron I.P. IL-9 murina y 15 humana recombinantes 1 día antes y diariamente durante la sensibilización por antígeno (días 12-18). A continuación, se realizó el fenotipo de los animales tal como se ha descrito.

En la Figura 20, panel 1 (arriba), se muestra la respuesta fenotípica de un animal representativo tratado con la solución salina I.P. el día cero y sometido a 20 desafío los días 14-20 con la solución salina (tal como se ha descrito en el Ejemplo 12). El IgE total en suero de la línea base (control) fue de 9,2 ng/ml. Los recuentos celulares totales del lavado broncoalveolar mostraron 182.500 células por mililitro de BAL. Estos animales no demostraron hiperreactividad bronquial en comparación con los controles históricos (Levitt, R.C. and Mitzner, W., J. 25 Appl. Physiol., 67(3):1125-1132; 1989).

La Figura 20, panel 2 (mitad superior) muestra un animal representativo procedente de un grupo presensibilizado con OVA I.P. el día cero y sometido a desafío con la solución salina los días 14-20. Estos animales no diferían en su respuesta al broncoconstrictor, IgE en suero o recuentos celulares de BAL de 30 los ratones insensibilizados (Figura 7, panel superior).

La Figura 20, panel 3 (mitad inferior) muestra un animal representativo procedente de aquellos presensibilizados con OVA I.P. el día cero y sometidos a desafío con antígeno (OVA) los días 14-20. Estos animales desarrollaron hiperreactividad bronquial (aproximadamente de dos a tres veces la de los 35 controles), IgE en suero elevado (casi mil veces la de los controles) y números aumentados de células inflamatorias en las vías aéreas, tal como se demostró por los recuentos celulares elevados de BAL (aproximadamente treinta veces)

en comparación con los controles (Figura 20, los 2 paneles superiores). La mayoría de las células reclutadas de las vías aéreas como resultado de este desafío con antígeno eran eosinófilas.

La Figura 20, panel 4 (inferior) muestra un animal representativo procedente de los presensibilizados con OVA I.P. el día cero, pretratado con 5 anticuerpos policlonales neutralizantes para la IL-9 murina (aproximadamente 200 μg/ratón I.P. en 0,5 ml de PBS) y sometido a desafío con antígeno (OVA) los días 14-20. Estos animales se protegieron contra la respuesta a antígeno. No diferían significativamente en su reactividad bronquial, IgE en suero o recuentos celulares de BAL de los controles (Figura 20, los 2 paneles 10 superiores).

La Figura 21 ilustra el efecto del desafío con antígeno con respecto a OVA (tal como se ha descrito anteriormente) con y sin pretratamiento con anticuerpos policlonales neutralizantes a la IL-9 murina I.P. tres días antes en animales representativos. La figura de la izquierda (A1-2-1B) es una sección 15 histológica procedente de los pulmones de los animales de control (sensibilizados a OVA pero expuestos solamente a un desafío con aerosol de solución salina). La Figura del medio (A1-3-5) es una sección histológica procedente de los pulmones de animales sensibilizados a OVA y expuestos a un desafío con aerosol de OVA. La figura de la derecha (A1-4-5) es una sección 20 histológica procedente de los pulmones de animales sensibilizados a OVA y expuestos a un desafío con aerosol de OVA que fueron pretratados tres días antes con anticuerpos policlonales neutralizantes a la IL-9 murina. El pretratamiento con el anticuerpo neutralizante produjo la confirmación histológica de la protección completa contra el desafío con antígeno. 25

La Figura 22, panel 1 (superior) muestra un animal representativo procedente de ratones presensibilizados con OVA I.P. el día cero y sometido a desafío con antígeno (OVA) los días 13-18. Estos animales desarrollaron hiperreactividad bronquial (aproximadamente de dos a tres veces la de los controles) y números aumentados de células inflamatorias que incluyen 30 eosinófilos en las vías aéreas, tal como quedó demostrado por los recuentos celulares elevados de BAL, en comparación con los controles (Figura 20, las 2 tablas superiores). Muchas de las células reclutadas de las vías aéreas como resultado de este desafío con antígeno eran eosinófilas.

La Figura 22, panel 2 (inferior) muestra un animal representativo 35 procedente de los presensibilizados con OVA I.P el día cero, pretratados con anticuerpos policlonales neutralizantes al receptor de la IL-9 murina (aproximadamente 1 mg/ratón I.P. en 0,5 ml de PBS) y sometidos a desafío con

antígeno (OVA) los días 13-18. Este animal representativo se protegió contra la respuesta a antígeno. Esta respuesta no difería significativamente en materia de reactividad bronquial, recuentos celulares de BAL, a los controles (Figura 20, los 2 paneles superiores). Estos datos demuestran la eficacia potencial del tratamiento de la alergia atópica con anticuerpos del receptor de IL-9. 5

Ejemplo 14: Aislamiento y Cultivos de Bazo Murino

Se anestesiaron ratones y se extrajeron asépticamente los bazos. Se picaron los bazos con tijeras y se pasaron suavemente por una rejilla metálica 10 (en autoclave) [criba de #60]. Se resuspendieron las células en 40 ml de RPMI-1640 [GIBCO, BRL, Rockville, MD] y se centrifugaron durante 5 minutos a 250g dos veces. Los gránulos se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis para eliminar los RBC [4,15 gm de NH4Cl, 0,5 gm de KHCO3; 0,19 g de EDTA a 500 ml con ddH20]. Se incubaron las células durante 5 minutos aproximadamente a 15 37ºC y 40 ml de RPMI-FCS [RPMI-1640, AFBS al 10%, 50 μm de BME, 2 mM de glutamina, que contenía penicilina y estreptomicina]. Se volvieron a centrifugar estas células durante 5 minutos a 250g y se resuspendieron en 20 ml de RPMI-FCS con o sin 5 μg/ml de concanavalina A [Sigma #C5275]. Se valoró la IL-9 a las 48 horas en esplenocitos no tratados y después del estímulo con 20 concanavalina A procedente de ratones DBA/2J (D2) y C57BL/6J (B6). Se amplificó la IL-9 por RT-PCR (tal como se expone en el Ejemplo 6) y se sometió a prueba con una sonda murina específica de IL-9 después de una transferencia Southern. Se realizaron los Southern blots por técnicas "estándar". Brevemente, los productos de RT-PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 25 2%. Se tiñeron los geles con bromuro de etidio y se fotografiaron con una regla para determinar el peso molecular del ADN en el Southern blot. Entonces, se impregnaron los geles en NaOH 0,5N durante 30 minutos y se neutralizaron en 0,5M Tris, pH 7,0 durante 30 minutos. El ADN se transfirió a una membrana de nylon Zeta probe (BioRAD) mediante transferencia capilar en 20X SSC durante 30 toda la noche. Al día siguiente, se secó al aire la membrana, se coció a 80ºC durante 15 minutos y se prehibridó en 6X SSC y SDS al 0,1% durante 1 hora a 42ºC. Se añadió una sonda p32 oligonucleótidos marcada en su extremo con quinasa (5'-AATTACCTTATTGAAAATCTGAAG-3') a la solución de hibridación más 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y se incubó durante 35 toda la noche a 42ºC. Al día siguiente, se lavó el filtro en 3X SSC y SDS al 0,1% a 37ºC durante 30 minutos y se expuso el filtro a una película durante 1 hora. La Figura 26 ilustra niveles permanentes de IL-9 tras 48 horas procedentes de cada

cepa de ratón. Se observó la IL-9 en esplenocitos no estimulados de D2 (D2-), mientras no se podía detectar IL-9 alguna en ratones B6 (B6-). Aunque había un aumento significativo de IL-9 después del estímulo con concanavalina A en los esplenocitos de D2 (D2+), no se podía detectar IL-9 alguna en ratones B6 (B6+) a pesar del tratamiento con concanavalina A. 5

Ejemplo 15: Expresión de la Met117 IL-9 humana y Thr117 IL-9 en PBMC SDS-PAGE y Análisis Inmunoblot

Después de obtener proteínas aisladas de PBMC humanos de donantes 10 sanos que muestran genotipos de IL-9 de tipo salvaje (Thr117) o Met117 tal como se expone en el Ejemplo 13 y se realizó el SDS-PAGE por el método de Laemmli (Laemmli U.K. (1970) Nature 227, 680-685) mediante un gel de poliacrilamida al 18% en un sistema mini-gel (unidad de gel vertical Xcell II, Novex). Para el análisis por inmunoblot, las proteínas separadas por SDS-PAGE 15 se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante la unidad de transferencia transblot SD (Biorad) en 25 mM de tampón de Tris-glicina, pH 8,3, que contenía metanol al 15% (Towbin H. y col., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354). Los sitios de unión no ocupados en la membrana se bloquearon mediante incubación durante 1 hora hasta toda la noche con 20 mM 20 de tampón Tris-HCl, pH 8,0, más Tween 20 al 0,05% (TBST) que contenía leche deshidratada al 5%. Luego se incubaron las membranas a una dilución 1:1.000 de anticuerpo policlonal IL-9 antihumana de cabra (R&D Systems) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las membranas con TBST y se trataron con una dilución de 1:10.000 de TgG anti-cabra de ratón conjugado con 25 peroxidasa de rábano durante 1 hora. Después del lavado con TBST, se visualizaron los anticuerpos unidos mediante la adición del sistema de quimioluminiscencia de sustrato Super-Signal (Pierce).

La Figura 24 demuestra la expresión de las proteínas de la IL-9 humana procedentes de PBMCs cultivados 48 horas después del estímulo con 30 mitógenos en individuos cuyos genotipos habían sido determinados por análisis genómico del gen de IL-9. La calle 1 representa marcadores de peso molecular, la calle 2 es un homocigoto Met117, la calle 3 es un heterocigoto Met117/Thr117, la calle 4 es un homocigoto Thr117. Se observó un único producto del tamaño aproximado esperado (14 kD) en los PBMC de cada 35 individuo después del estímulo con mitógenos. Estos datos demuestran que ambas formas de la proteína IL-9 se expresan y son estables permanentemente.

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LISTADO DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL

(i) SOLICITANTE: Magainin Pharmaceuticals Inc. 5

(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factores Asociados al Asma Como Dianas Para Tratar Alergias Incluida el Asma y Trastornos Relacionados.

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 22

(iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA

(A) DESTINATARIO: Finnegan, Henderson, Farabow, Garrett & 10 Dunner, L.L.P.

(B) CALLE: 1300 I Street, N.W.

(C) CIUDAD: Washington

(D) ESTADO: D.C.

(E) PAÍS: Estados Unidos 15

(F) CÓDIGO POSTAL: 20005-3315

(v) FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR

(A) TIPO DE MEDIO: Disquete

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS 20

(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versión #1.30

(vi) DATOS ACTUALES SOBRE LA SOLICITUD

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/12757

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 DE AGOSTO DE 1996

(C) CLASIFICACIÓN 25

(viii) INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO / AGENTE

(A) APELLIDO: Fordis, Jean B.

(B) NÚMERO DE REGISTRO: 32.984

(C) NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: 5387.056-304 30

(ix) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES

(A) TELÉFONO: (202) 408-4000

(B) TELEFAX: (202) 408-4400

35

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 28 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 5

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1

TCTCGAGCAG GGGTGTCCAA CCCTGGCG 28

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:2 10

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal 15

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2

GCAGCTGGGA TAAATAATAT TTCATCTTCAT 31

20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única 25

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3

TCTCGAGCAG AGATGCAGCA CCACATGGGG C 31 30

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:4

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 35

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4

GCAGCTGGTA ACAGTTATGG AGGGGAGGTT T 31

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:5 5

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal 10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5

GTGACCAGTT GTCTCTGTTT G 21

15

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:6

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única 20

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6

CTGCATCTTG TTGATGAGGA A 21 25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:7

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 30

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7

35

GACAACTGCA CCAGACCATG C 21

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:8

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal 5

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8

ATTAGCACTG CAGTGGCACT T 21

10

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:9

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única 15

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9

GTGACCAGCT GCTTGTGTCT C 21 20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:10

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 25

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10

30

CTTCAGATTT TCAATAAGGT A 21

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:11

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases 35

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11

GATGATTGTA CCACACCGTG C 21

5

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:12

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única 10

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12

GTTGCCGCTG CAGCTACATT T 21 15

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:13

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 18 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido 20

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13

25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:14

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 18 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido 30

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:15

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 18 aminoácidos 5

(B) TIPO: aminoácido

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15 10

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:16

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 18 aminoácidos 15

(B) TIPO: aminoácido

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16 20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:17

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 18 aminoácidos 25

(B) TIPO: aminoácido

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:18 5

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 17 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal 10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18

GTAAAACGAC GGCCAGT 17

15

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:19

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 10 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) HEBRAS: única 20

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19

25

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 22 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) HEBRAS: única 30

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:21

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 21 aminoácidos 5

(B) TIPO: aminoácido

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21 10

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. NO:22

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

(A) LONGITUD: 7 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido 15

(C) HEBRAS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22

20

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Utilización de un anticuerpo que es un anticuerpo anti-interleucina-9 o un anticuerpo del receptor de anti-interleucina-9 que bloquea la unión de la interleucina-9 al receptor de la interleucina-9 para la preparación de un 5 medicamento para la reducción de la hiperreactividad bronquial en un paciente.
2. 2. Anticuerpo, que es un anticuerpo anti-interleucina-9 o un anticuerpo del receptor de anti-interleucina-9, que bloquea la unión de la interleucina-9 al 10 receptor de la interleucina-9, para su utilización en la reducción de la hiperreactividad bronquial en un paciente.
3. 3. Utilización según la reivindicación 1 o anticuerpo para su utilización según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho anticuerpo se une a la 15 interleucina-9.
4. 4. Utilización según la reivindicación 1 o anticuerpo para su utilización según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho anticuerpo se une al receptor de la interleucina-9. 20
5. 5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4 o anticuerpo para su utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

   25
6. 6. Utilización de un receptor soluble de la interleucina-9 que bloquea la unión de la interleucina-9 al receptor de la interleucina 9 para la preparación de un medicamento para la reducción de la hiperreactividad bronquial en un paciente.

   30
7. 7. Receptor soluble de la interleucina-9 que bloquea la unión de la interleucina-9 al receptor de la interleucina-9 para su utilización en la reducción de la hiperreactividad bronquial en un paciente.
8. 8. Utilización según la reivindicación 6 o receptor soluble de la interleucina-9 35 para su utilización según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha proteína del receptor soluble de la interleucina-9 se une a la interleucina-9.
9. 9. Utilización según la reivindicación 1 ó 6 o anticuerpo para su utilización según la reivindicación 2 o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra en una cantidad suficiente para subregular la expresión de la 5 interleucina-9.
10. 10. Utilización según la reivindicación 1 ó 6 o anticuerpo para su utilización según la reivindicación 2 o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho 10 medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra en una cantidad suficiente para reducir la eosinofilia en el lavado bronquial de un paciente.
11. 11. Utilización según la reivindicación 1 ó 6 o anticuerpo para su utilización 15 según la reivindicación 2 o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra por inhalación.

    20
12. 12. Utilización o anticuerpo para la utilización o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra por medio de un inhalador de dosificación.

    25
13. 13. Utilización o anticuerpo para la utilización o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra mediante un inhalador de polvo seco.

    30
14. 14. Utilización según la reivindicación 1 ó 6 o anticuerpo para la utilización según la reivindicación 2 o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra mediante inyección. 35
15. 15. Utilización o anticuerpo para la utilización o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 14, caracterizado

    porque dicho medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra por inyección intravenosa.
16. 16. Utilización o anticuerpo para la utilización o receptor soluble de la interleucina-9 para su utilización según la reivindicación 14, caracterizado 5 porque dicho medicamento o anticuerpo o receptor soluble de la interleucina-9 se administra por inyección subcutánea.