ES2201800T3 - Derivados de acido betulinico utiles para el tratamiento de tumores neuroectodermicos. - Google Patents
Derivados de acido betulinico utiles para el tratamiento de tumores neuroectodermicos.Info
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Abstract
Compuesto que tiene la estructura 3-a-28- (acetiloxi)lup-20(29)-en-3-il-a-D-glucopiranósido (28- acetil-3-a-D-glucosil betulina), su enantiómero D, su enantiómero L o racémico de éste, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
Derivados de ácido betulínico útiles para el
tratamiento de tumores neuroectodérmicos.
La presente invención tiene aplicación en el
campo del tratamiento del cáncer y se basa en el descubrimiento de
que el ácido betulínico o la betulina y sus derivados son potentes
agentes antineuroectodérmicos. Tal como se describen aquí, el ácido
betulínico o la betulina y sus derivados son útiles para el
tratamiento de tumores neuroectodérmicos debido a su marcado
mecanismo de acción, incluyendose los tumores neuroectodérmicos
resistentes a agentes quimioterapéuticos convencionales. Además del
nuevo uso de compuestos ya conocidos, la invención describe nuevos
compuestos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de
tumores neuroectodérmicos.
Los tumores neuroectodérmicos tales como el
neuroblastoma, el meduloblastoma y el sarcoma de Ewing son los
tumores sólidos más comunes en la infancia. La quimioterapia es el
tratamiento principal para muchos tipos de tumores
neuroectodérmicos. Dos terceras partes de los casos de neuroblastoma
se producen en niños de 5 años de edad o menos. Un ejemplo de
neuroblastoma precoz es el neuroblastoma prenatal, que se detecta
mediante ultrasonografía fetal (Jennings y col. 1993, J.
Ped. Surg. 28:1168-1174). El neuroblastoma se
origina en la médula adrenal o las zonas paraespinales donde existe
tejido del sistema nervioso simpático. El neuroblastoma tiene
consecuencias clínicas graves, incluyendo síntomas asociados con
masas tumorales o dolores óseos debidos a metástasis. Dado que se
originan en los ganglios paraespinales, los neuroblastomas pueden
invadir, a través de forámenes neurales, y comprimir la médula
espinal, provocando parálisis (Azizkhan y Haase, 1993,
Sem. Surg. Oncol. 9:493-501).
Aproximadamente un 70% de todos los pacientes con
neuroblastoma presentan metástasis cuando se les diagnostica. Véase,
por ejemplo, Brodeur y col., 1993, J. Clin. Oncol.
11:1466-1477; Adams y col., 1993, J. Ped.
Surg. 28:372-378; Evans y col., 1976,
Cancer 38:661-666.
La quimioterapia sigue siendo uno de los
tratamientos más eficaces para los tumores de neuroblastoma. Los
pacientes de neuroblastoma son sometidos, generalmente, a
quimioterapia con ciclofosfamida y doxorrubicina, cisplatino con
tenipósido o etopósido o vincristina con cisplatino y tenipósido o
etopósido para los tumores más resistentes. Para los pacientes de
menos de un año de edad generalmente se utiliza una quimioterapia
agresiva utilizando combinaciones de ciclofosfamida, doxorrubicina,
cisplatino y tenipósido o etopósido (Castleberry y col.,
1991, J. Clin. Oncol. 9:789-795; Bowman y
col., 1997, J. Natl. Cancer Inst.
89:373-380; Castleberry y col., 1992, J.
Clin. Oncol. 10:1299-1304).
La quimioterapia agresiva multiagente da como
resultado un índice de supervivencia de 2 años en aproximadamente un
20% de niños mayores con neuroblastoma en estadio IV (Bowman y
col., 1991, J. Clin. Oncol. 9:
1599-1608; Williams y col., 1995, Med.
Ped. Oncol. 24: 176-180). El neuroblastoma en
adolescentes o adultos tiene un pronóstico peor a largo plazo
independientemente del estadio o del lugar y, en muchos casos, un
curso más prolongado (Franks y col., 1997, Cancer 79:
2028-2035).
El sarcoma de Ewing (EWS) suele producirse en los
huesos y se diagnostica con mayor frecuencia en la segunda década de
vida. Los lugares más comunes donde se produce la afección primaria
son los huesos pelvianos, el fémur, el húmero y las costillas. Menos
común es el sarcoma de Ewing en puntos primarios no óseos, una
localización que se ha denominado históricamente como sarcoma de
Ewing extraóseo.
Sin embargo, las características morfológicas y
biológicas de los tumores de Ewing que se desarrollan en tejidos
blandos parecen ser indistinguibles de aquellos tumores que se
desarrollan en zonas óseas (Delattre y col., 1994, New
Engl. J. Med. 331: 294-299;
Llombart-Bosch y col., 1990, Cancer
66: 2589-2601).
Los tumores neuroectodérmicos primitivos (PNETs)
se denominan mediante diferentes términos dependiendo de su
localización y de la extensión de la diferenciación neural:
neuroepitelioma periférico, tumor de Askin, neuroblastoma adulto,
neuroblastoma periférico y tumores neuroectodérmicos primitivos. El
término colectivo es tumores neuroectodérmicos primitivos. El
sarcoma de Ewing y los PNETs representan un espectro biológico del
mismo tumor. Más de un 90% de estos tumores están caracterizados por
una translocación cromosómica 11/22. Dado que estos tumores sólo
presentan marcadores de diferenciación neuroectodérmicos, se ha
sugerido que se originan en células de cresta neural. Como el
tratamiento es igual en el caso de estos tumores, frecuentemente se
los denomina como sarcoma de Ewing.
Los estudios sugieren que más de un 50% de los
pacientes sin metástasis pueden sobrevivir durante un largo plazo
sin la enfermedad, en comparación con únicamente un
20-30% de los pacientes que presentan metástasis.
Véase, por ejemplo, Burgert y col., 1990, J. Clin.
Oncol. 8: 1514-1524; Grier y col., 1994,
Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: A-1443;
Rosen y col., 1981, Cancer 47:
2204-2213; Dunst y col., 1995, Int. J.
Rad. Oncol. Biol. Phy. 32: 919-930; Arai y
col., 1991, Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phy. 21:
1501-1508.
La cirugía en el caso de sarcoma de Ewing se
limita habitualmente a la biopsia de diagnóstico inicial del tumor
primario. Normalmente los pacientes se someten a quimioterapia de
inducción seguida de radioterapia para el control local. Para tratar
con éxito a pacientes con sarcoma de Ewing es necesario utilizar una
quimioterapia multifármaco. La quimioterapia de combinación para el
sarcoma de Ewing ha incluido tradicionalmente vincristina,
doxorrubicina, ciclofosfamida y dactinomicina (VAdriaC o VAC). La
importancia de la doxorrubicina se ha demostrado en ensayos
comparativos aleatorios con un aumento de la dosis de doxorrubicina
durante los primeros meses de terapia, lo que resulta en una mayor
supervivencia sin consecuencias. Véase, por ejemplo, Nesbit y
col., 1990, J. Clin. Oncol. 8: 1664-1674;
Kinsella y col., 1991, Int. J. Radiat. Oncol. Biol.
Phy. 20: 389-395; Smith y col., 1991,
J. Natl. Cancer Inst. 83: 1460-1470.
Existen diferentes referencias relacionadas con
el tratamiento de tumores neuroectodérmicos (Schmidt y col.,
Eur. J. Cancer (1997), 33(12),
2007-2010; Fulda y col., Cancer Res.
(1997), 57(21), 4956-4964;
WO-A-96/29068).
Aunque muchos tumores neuroectodérmicos responden
inicialmente a la quimioterapia, el pronóstico en niños que recaen o
presentan la enfermedad diseminada sigue siendo malo, debido al
desarrollo de resistencia a los fármacos. Algunos agentes
quimioterapéuticos, como la doxorrubicina, se basan en la presencia
del sistema CD95 funcional en las células tumorales diana para poder
ejercer sus actividades antitumorales. Las células que carecen de
CD95 funcional son resistentes a la doxorrubicina. Otros agentes
quimioterapéuticos se basan en la presencia de un sistema p53
funcional para desarrollar sus actividades antitumorales. Estos
agentes quimioterapéuticos son ineficaces ante células carentes de
proteína p53 funcional.
Por tanto, existe una gran necesidad de
desarrollar fármacos quimioterapéuticos dirigidos a tumores
neuroectodérmicos y, en particular, a tumores neuroectodérmicos
resistentes a los fármacos.
De esta manera, la presente invención proporciona
composiciones químicas y se refiere al uso de las mismas para el
tratamiento de tumores neuroectodérmicos. Estas composiciones no se
basan en los sistemas CD95 o p53 para ejercer sus actividades
antitumorales.
La presente invención proporciona nuevos
compuestos útiles para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos,
seleccionados de entre los siguientes:
3-\beta-28-(acetiloxi)lup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
(28-acetil-3-\beta-D-glucosil
betulina)
3-\beta-28-hidroxilup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
3-\beta-3-hidroxilup-20(29)-en-28-il-\beta-D-glucopiranósido
etil éster de ácido
3-(\beta-D-glucopiranosiloxi)lup-20(29)-en-28-oico
etil éster de ácido
3-\beta-D-galactosil-betulínico
sus enantiómeros D, sus enantiómeros L y
racémicos de éstos; así como sales farmacéuticamente aceptables de
los mismos.
La presente invención también proporciona
composiciones útiles para el tratamiento de tumores
neuroectodérmicos, que comprenden una cantidad terapéuticamente
eficaz de:
3-\beta-28-(acetiloxi)lup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
(28-acetil-3-\beta-D-glucosil
betulina)
3-\beta-28-hidroxilup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
3-\beta-3-hidroxilup-20(29)-en-28-il-\beta-D-glucopiranósido
etil éster de ácido
3-(\beta-D-glucopiranosiloxi)lup-20(29)-en-28-oico
etil éster de ácido
3-\beta-D-galactosil-betulínico
sus enantiómeros D, sus enantiómeros L y
racémicos de éstos; así como sales farmacéuticamente aceptables de
los mismos.
Estas composiciones también pueden comprender un
soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención también prevé el uso de los
compuestos arriba mencionados para preparar una composición
farmacéutica con el fin de emplearla en el tratamiento de tumores
neuroectodérmicos, consistente en administrar a un paciente que
necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de
tales compuestos.
En una materialización de la invención, el
compuesto de la presente invención se administra dentro de una
composición que comprende un soporte o excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Los compuestos de la presente invención se pueden
administrar de diversas formas, incluyendo la vía oral, sublingual,
intranasal, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intravaginal,
transdérmica, lineal, por inhalación o como enjuague bucal.
Las composiciones de la invención y los métodos
aquí descritos son particularmente ventajosos en el tratamiento de
tumores neuroectodérmicos resistentes a los agentes
quimioterapéuticos normalmente utilizados. En un ejemplo práctico,
el método incluye la administración de forma sistémica de derivados
de ácido betulínico o derivados de betulina y/o composiciones que
los comprenden los mismos a un individuo. En otra realización, el
método incluye la administración local de derivados de ácido
betulínico o derivados de betulina en un tumor. En una realización
preferente se administran de forma sistémica derivados de ácido
betulínico o derivados de betulina a un paciente afectado por un
tumor neuroectodérmico resistente a la doxorrubina.
Figuras 1A-C: muestran la
inducción de apoptosis por ácido betulínico.
Figuras 2A-E: muestran la
activación de caspasa inducida por ácido betulínico.
Figuras 3A-B: muestran la
inducción de apoptosis independiente de CD95.
Figuras 4A-B: muestran una
perturbación de la función mitocondrial inducida por ácido
betulínico.
Figuras 5A-D: muestran la
participación de proteínas relacionadas con Bcl-2 y
proteínas p53 en la apoptosis inducida por ácido betulínico.
Figuras 6A-B: muestran el efecto
del ácido betulínico en células resistentes a los fármacos.
Figura 7: muestra que el ácido betulínico activa
dilinealmente la transición de permeabilidad mitocondrial.
Figuras 8A-C: muestran que la
transición de permeabilidad mitocondrial inducida por ácido
betulínico activa la fragmentación nuclear.
Figuras 9A y B: muestran que la disociación de
caspasas inducida por ácido betulínico depende de la transición de
permeabilidad mitocondrial.
Figuras 10A-C: muestran que el
ácido betulínico provoca la liberación de uno o más factores
apoptogénicos de mitocondrias aisladas.
Figuras 11A-C: muestran que las
proteínas apoptogénicas liberadas de las mitocondrias inducen la
disociación de caspasas.
Figuras 12A-D: muestran la
apoptosis y la transición de permeabilidad micotondrial inducidas
por fármacos.
Figuras 13A-C: muestran que la
activación del sistema CD95 por la doxorrubicina se produce
"corriente arriba" de las mitocondrias.
Figuras 14A-B: muestran la
relación funcional entre la ruptura de \Delta\Psi_{m} y la
activación de la cascada de caspasas.
Figuras 15A-B: muestran la
activación de caspasas en CFS.
Figuras 16A-B: muestran la
disociación de caspasas por Cit. c y AIF.
Figuras 17A-C: muestran la
inducción de apoptosis por derivados de ácido betulínico.
La invención se basa, en parte, en el
descubrimiento inesperado por parte de los inventores de que
derivados del ácido betulínico o derivados de la betulina inhiben
eficazmente el crecimiento de diversas células neuroectodérmicas. La
invención también se basa, en parte, en el descubrimiento inesperado
de que los derivados del ácido betulínico o derivados de la betulina
ejercen su actividad a través de rutas diferentes a las de los
agentes quimioterapéuticos utilizados convencionalmente. Tal como se
ha descrito más arriba, Sección I, el tratamiento de tumores
neuroectodérmicos requiere frecuentemente una quimioterapia de
combinación a largo plazo. Los pacientes a menudo desarrollan
resistencia a los agentes quimioterapéuticos después del uso
prolongado de los mismos. En efecto, es sabido que muchos agentes
quimioterapéuticos ejercen su actividad antitumoral induciendo la
apoptosis en células tumorales diana. Un gran número de tales
agentes inducen la apoptosis de células tumorales a través de
sistemas de señalización de apoptosis, en particular los sistemas
CD95 y p53, en las células tumorales diana. Sin embargo, con
frecuencia las células tumorales diana desarrollan resistencia a los
fármacos mediante mutación de los componentes de la ruta de
señalización de apoptosis. Por ejemplo, la pérdida de CD95 o p53
confiere a las células tumorales resistencia a los fármacos.
Actuando a través de una ruta de apoptosis diferente e independiente
de los sistemas CD95 y p53, las composiciones y métodos de la
invención ofrecen la ventaja de ser eficaces contra tumores que son
resistentes a los agentes quimioterapéuticos normalmente utilizados
los cuales actúan a través de CD95 y/o p53.
Así, en general, la invención se refiere a
derivados del ácido betulínico y derivados de la betulina, y a su
uso en el tratamiento de tumores neuroectodérmicos. Más
específicamente, la presente invención se refiere a nuevos derivados
de ácido betulínico y betulina y a los métodos de síntesis de los
mismos. Además, la presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas útiles para el tratamiento de tumores
neuroectodérmicos que comprenden los nuevos compuestos de la
invención y junto a un soporte farmacéuticamente aceptable.
La inducción de apoptosis de células tumorales
(muerte celular programada) es un potente método terapéutico para
el tratamiento de tumores. El término apoptosis se refiere a una
forma morfológicamente característica de muerte celular asociada con
fisiología normal (Kerr y col., 1972, Brit. J. Cancer
26: 239). La apoptosis es diferente de la necrosis asociada con
daños críticos a las células. Morfológicamente, la apoptosis se
caracteriza por la condensación de cromatina nuclear, la contracción
citoplasmática, la dilución del retículo endoplasmático y la
formación de ampollas en la membrana.
Los inventores han descubierto que el ácido
betulínico, la betulina y sus derivados inducen apoptosis en líneas
celulares de neuroblastoma (SH-EP), meduloblastoma
(Daoy), sarcoma de Ewing (A 17/95) y melanoma
(A-378). Aunque ya era conocido previamente que el
ácido betulínico ejercía citotoxicidad contra una línea celular de
melanoma (MEL-2), ni se sabía ni era previsible que
el ácido betulínico fuera activo frente a una amplia variedad de
células cancerosas. Véase Dascupta y Pezzuto, PCT/US96/04016,
documento en el que se indica que el ácido betulínico sólo tiene
efectos citotóxicos en MEL-2 de entre diez células
tumorales diferentes ensayadas. Resulta un descubrimiento
sorprendente el que el ácido betulínico y sus derivados induzcan
apoptosis en células neuroectodérmicas.
La muerte celular por apoptosis se puede activar
mediante una amplia gama de estímulos, y no todas las células
morirán forzosamente en respuesta al mismo estímulo. Entre los
estímulos mortales más estudiados se encuentra el deterioro del ADN,
es decir, mediante irradiación o fármacos utilizados en
quimioterapia cancerosa, que en muchas células conduce a una muerte
apoptósica via una ruta dependiente de p53. Algunas hormonas
tales como corticosteroides, conducen a la muerte de determinadas
células, por ejemplo timocitos, aunque pueden inducirla en otros
tipos de células. Algunas células expresan Fas, una proteína de
superficie que inicia una señal de muerte intracelular como
respuesta al entrecruzamiento. En otros casos, las células parecen
tener una ruta de muerte por defecto que se ha de bloquear
activamente mediante un factor de supervivencia para permitir la
supervivencia celular.
Se ha demostrado que fármacos citotóxicos,
independientemente de su diana intracelular, provocan la muerte de
células diana sensibles mediante la inducción de apoptosis
(Fisher, 1994, Cell, 78:539-542). El
sistema CD95 (APO-1/Fas) es un mediador clave de
apoptosis inducida por fármacos en células de leucemia y
neuroblastoma (Friesen y col., 1996, Mature Med., 2:
574-577; Faldo y col., 1997, Cancer
Res. 57: 3823-3829). Mediante tratamiento con
fármacos citotóxicos se ha inducido el ligando CD95
(CD95-L) y se ha provocado la apoptosis de un modo
autocrino o paracrino. El CD95-L es una molécula
transmembrana de tipo II M_{r} = 40.000, de la familia de
ligandos TNF/factor de crecimiento nervioso (Suda y col.,
1993, Cell 75: 1169-1178), que también se
puede encontrar en forma soluble liberada después de la disociación
proteolítica de la superficie celular (Tonaka y col., 1995,
EMBO J. 14: 1129-1135).
Los inventores han descubierto que,
sorprendentemente, el ácido betulínico y sus derivados inducen la
apoptosis de una célula tumoral independientemente del estado del
CD95 en la célula tumoral. Por ejemplo, tal como se describe
posteriormente, el ácido betulínico induce apoptosis en las células
de neuroblastoma SH-EP sin inducir la expresión de
CD95-L, mientras que el tratamiento con
doxorrubicina induce la expresión de CD95-L. Cuando
las células se tratan con anticuerpos
anti-APO-1
(anti-CD95) para bloquear la función del CD95, la
inducción de apoptosis por el ácido betulínico no resulta afectada
(véase más abajo). En cambio, los anticuerpos
anti-CD95 bloquean de forma significativa la
apoptosis inducida por doxorrubicina.
Además del CD95, el gen p53 también representa un
papel crucial en la ejecución de apoptosis. Diversas evidencias
muestran la participación del p53 en la apoptosis. Si el p53 muta
en una célula cancerosa, las células son menos propensas a sufrir
apoptosis al ser tratadas con dichos agentes quimioterapéuticos. La
radiación y los fármacos quimioterapéuticos que deterioran el ADN
tienden a actuar a través de rutas que incluyen el p53. La pérdida
de la función del p53 podría conducir a un notable incremento de la
quimiorresistencia celular y puede contribuir a la proporción
significativa de fracasos terapéuticos observados en estos tumores.
Véase por ejemplo Buttitta y col., 1997, Proc. Ann. Meet.
Am. Assoc. Cancer Res. 38: A713.
\newpage
Tal como se muestra más abajo, el tratamiento con
doxorrubicina induce la acumulación de proteína p53. En cambio, el
ácido betulínico no induce la acumulación de proteína p53, lo que
sugiere que la actividad inductora de apoptosis del ácido betulínico
es independiente de la proteína p53.
Sin pretender vincularse con ninguna teoría en
particular, los Ejemplos 3 y 4 descritos más abajo muestran que el
ácido betulínico activa dilinealmente la transición de permeabilidad
PT en mitocondrias aisladas y la inducción de PT parece ser el
suceso inicial en la apoptosis activada por ácido betulínico. Las
mitocondrias que experimentan PT liberan proteínas apoptogénicas
tales como citocromo c o factor inductor de apoptosis (AIF)
del espacio intermembranoso mitocondrial en el citosol, donde
activan caspasas y endonucleasas (Kroemet y col., 1997,
Immunol. Today 18: 44-51; Susin y
col., J. Exp. Med. 186: 25-37).
Tal como muestran más abajo los Ejemplos 3 y 4,
la inhibición de PT (permeability transition, transición de
permeabilidad) mediante sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o mediante el ácido bongkrékico
inhibidor específico mitocondrial evitó todas las manifestaciones de
apoptosis en células intactas y en un sistema libre de células,
mediante la ruptura del potencial mitocondrial transmembrana
(\Delta\Psi_{m}), activación de caspasas, disociación de
sustratos (PARP) y fragmentación nuclear. A diferencia del ácido
betulínico, los fármacos citotóxicos clásicos tales como la
doxorrubicina, el cisplatino o el etopósido no indujeron
perturbaciones mitocondriales en mitocondrias aisladas, lo que
sugería que la PT mitocondrial, que tuvo lugar en células intactas
durante la apoptosis activada por estas sustancias, era consecuencia
de una activación primaria de otras rutas o sistemas.
Al ser añadido a células intactas, el ácido
betulínico indujo específicamente alteraciones mitocondriales en
células de neuroblastoma SHEP, pero no en líneas celulares
linfoides. Sin embargo, mitocondrias tratadas con ácido betulínico
aisladas de la línea celular linfoblastoide B SKW6.4 activaron la
PT mitocondrial e intervinieron en la fragmentación nuclear similar
de las mitocondrias de células SHEP. Por consiguiente, la
especificidad del ácido betulínico para tumores neuroectodérmicos
puede explicarse por una absorción y/o translocación celular
específica del compuesto al compartimento mitocondrial más que por
diferencias entre las propias mitocondrias.
De acuerdo con la presente invención, los
compuestos útiles para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos
son:
3-\beta-28-(acetiloxi)lup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
(28-acetil-3-\beta-D-glucosil
betulina)
3-\beta-28-hidroxilup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
3-\beta-3-hidroxilup-20(29)-en-28-il-\beta-D-glucopiranósido
etil éster de ácido
3-(\beta-D-glucopiranosiloxi)lup-20(29)-en-28-oico
etil éster de ácido
3-\beta-D-galactosil-betulínico,
sus enantiómeros D, sus enantiómeros L y
racémicos de éstos; así como sales farmacéuticamente aceptables de
los mismos.
Estas sales farmacéuticamente aceptables son
conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitarse a
ellas, sales de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, zinc o
hierro.
Los compuestos de la presente invención,
incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos,
contienen como mínimo un centro quiral y por lo tanto pueden
encontrarse en forma de enantiómeros individuales, mezclas de
enantiómeros enriquecidas enantioméricamente, y racémicos. Por
consiguiente, los compuestos de la presente invención son útiles
para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos cuando se
encuentran en forma enantiómero-D,
enantiómero-L o racémico.
Los compuestos de fórmula (I) se pueden aislar
dilinealmente de fuentes naturales o se pueden sintetizar
químicamente a partir de materiales iniciales o reactivos, naturales
o sintéticos, y ser aislados a continuación de una mezcla de
reacción. En cualquier caso, los compuestos de la presente invención
se pueden obtener en forma pura a través de técnicas de purificación
estándar incluyendo, sin limitarse a ellas, cromatografía de
columna, recristalización, recuperación enzimática u otros medios
conocidos por los expertos en la técnica.
Los compuestos de la presente invención se pueden
obtener a través de síntesis orgánica convencional tal como se
describe posteriormente.
En general, los compuestos de la presente
invención se pueden obtener a partir de métodos descritos en, por
ejemplo, Ohara y col., 1994, Mokuzai Gakkaishi
40(4): 444-51 y Uravova y col., 1980,
Carbohydrate Research 83: 33-42.
Además, la síntesis de los compuestos de la
presente invención se puede llevar a cabo por los siguientes
métodos:
Acceso sintético a los compuestos que comienza
con la betulina o el ácido betulínico.
En el curso de la síntesis de un compuesto de la
presente invención cuya fórmula (I) es:
donde las posiciones R^{1} o R^{2} se pueden
proteger temporalmente. Como ejemplos de grupos protectores
adecuados se incluyen grupos acetilo y otros grupos protectores de
acilo para R^{1} y para R^{2} cuando R^{2} = CH_{2}OH. Si
R^{2} es -CO_{2}H, este grupo se puede proteger formando
cualquier éster, por ejemplo éster metílico, etílico o isopropílico.
Los grupos protectores se pueden introducir mediante procedimientos
estándar, por ejemplo tal como se describen en Greene y Wuts,
Protective Groups in Organic Synthesis, (2ª ed., 1991) y
referencias citadas en dicho documento. Además, según el
procedimiento descrito por O. Pancharoen y col., 1994,
Phytochemistry 35(4): 987-92, se puede
lograr una protección selectiva del grupo -R^{2} (-CH_{2}OH) de
la betulina en presencia de un grupo hidroxilo en
C-3.
Para obtener compuestos de fórmula (I) en los que
R^{1} forma un enlace éter con el átomo de oxígeno al que está
unido, o en los que R^{2} contiene un enlace éter -CH_{2}O-, por
ejemplo si R^{1} o R^{2} son un grupo alquilo
-C_{1}-C_{20} de cadena lineal o ramificada, un
alquenilo -C_{2}-C_{20} de cadena lineal o
ramificada, un alquinilo -C_{2}-C_{20} de cadena
lineal o ramificada, mioinositol, esciloinositol, ciclitol,
coduritol A, quebrachitol, o cadenas de polietilenglicol
\hbox{(-(CH _{2} CH _{2} O) _{n} H},
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{3} o
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{3}), la unión se
logra a través de un enlace tipo éter.
Para este fin, la betulina o el ácido betulínico
pueden reaccionar, bajo condiciones de formación de enlaces éter
estándar, con el alquilo -C_{1}-C_{20} de
cadena lineal o ramificada, alquenilo
-C_{2}-C_{20} de cadena lineal o ramificada,
alquinilo -C_{2}-C_{20} de cadena lineal o
ramificada, mioinositol, esciloinositol, ciclitol, coduritol A,
quebrachitol, o cadena polietilenglicol
(-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}H,
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{3} o
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{3}). El grupo alquilo
-C_{1}-C_{20} de cadena lineal o ramificada,
alquenilo -C_{2}-C_{20} de cadena lineal o
ramificada, alquinilo -C_{2}-C_{20} de cadena
lineal o ramificada, mioinositol, esciloinositol, ciclitol,
coduritol A, quebrachitol, o cadena polietilenglicol
(-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}H,
\hbox{-(CH _{2} CH _{2} O) _{n} CH _{3} } o
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{3}) se puede activar
como un derivado halógeno, por ejemplo de cloro, bromo o yodo, o
como un derivado de éster, por ejemplo tosilato, triflato, mesilato
o brosilato. La reacción de eterificación se puede llevar a cabo
siguiendo un procedimiento de Williamson estándar o de acuerdo con
protocolos perfeccionados, por ejemplo tal como se describe en R.
A. W. Johnston y col., Tetrahedron 35: 2196 (1979).
Para obtener derivados con enlaces glicosídicos,
por ejemplo en los que R^{1} es un monosacárido o disacárido o un
oligosacárido, o en los que R^{2} es -CH_{2}O (monosacárido),
-CH_{2}O (disacárido), -CH_{2}O (oligosacárido), -CO_{2}
(monosacárido), -CO_{2} (disacárido), -CO_{2} (oligosacárido),
un derivado de la betulina o del ácido betulínico adecuadamente
protegido puede reaccionar bajo condiciones de formación de enlaces
glicosídicos estándar con un derivado de sacárido activado y/o
adecuadamente protegido.
El derivado sacárido se puede unir al átomo de
oxígeno del C-3, o a la parte -CH_{2}- de R^{2}
de los compuestos de fórmula (I) de forma estereoespecífica.
Preferentemente, el derivado de sacárido se une al átomo de oxígeno
en C-3, o a la parte -CH_{2}- de R^{2}, de tal
forma que se genera un enlace \alpha-glicosídico.
Esto ocurre particularmente en el caso de la glucosa y la
galactosa. Entre los protocolos útiles para este fin se incluye el
procedimiento Koenigs Knorr (W. Koenigs y col., Ber.
Dtsch. Chem. Ges. 34: 957 (1901), en el que un
bromuro de glicosilo reacciona en presencia de un catalizador de
plata, por ejemplo carbonato de plata) y el procedimiento Helferich
(B. Helferich y col., Ber. Dtsch. Chem. Ges.
73: 532 (1940) y N. I. Uvarova y col.,
Carbohydrate Research 83: 33-42
(1980)).
Para obtener derivados de éster, por ejemplo en
los que R^{2} es -CO_{2} (alquilo
-C_{1}-C_{20} de cadena lineal o ramificada),
-CO_{2} (alquenilo -C_{2}-C_{20} de cadena
lineal o ramificada), -CO_{2} (alquinilo
-C_{2}-C_{20} de cadena lineal o ramificada),
-CO_{2} (mioinositol), -CO_{2} (esciloinositol), -CO_{2}
(ciclitol), -CO_{2} (coduritol A), -CO_{2} (quebrachitol),
-CO(OCH_{2}OCH_{2})_{n}
OH, -CO(OCH_{2}OCH_{2})_{n}OCH_{3} y -CO(OCH_{2}OCH_{2})_{n}OCH_{2}CH_{3}, se ha de activar el grupo carboxilo de un derivado de ácido betulínico adecuadamente protegido (por ejemplo a través de R^{1}). Entre los derivados de ácido betulínico adecuadamente activados se incluyen, sin limitarse a ellos, derivados de carboxil-haluro y dicilohexilcarbodiimida. El derivado de ácido carboxílico activado puede reaccionar bajo condiciones de formación de enlaces éster estándar con un grupo que contenga una función hidroxilo. Esta reacción se puede llevar a cabo de acuerdo con un procedimiento Schotten-Baumann estándar o siguiendo protocolos tales como los descritos por Kaiser y col., 1970, J. Org. Chem 35: 1198.
OH, -CO(OCH_{2}OCH_{2})_{n}OCH_{3} y -CO(OCH_{2}OCH_{2})_{n}OCH_{2}CH_{3}, se ha de activar el grupo carboxilo de un derivado de ácido betulínico adecuadamente protegido (por ejemplo a través de R^{1}). Entre los derivados de ácido betulínico adecuadamente activados se incluyen, sin limitarse a ellos, derivados de carboxil-haluro y dicilohexilcarbodiimida. El derivado de ácido carboxílico activado puede reaccionar bajo condiciones de formación de enlaces éster estándar con un grupo que contenga una función hidroxilo. Esta reacción se puede llevar a cabo de acuerdo con un procedimiento Schotten-Baumann estándar o siguiendo protocolos tales como los descritos por Kaiser y col., 1970, J. Org. Chem 35: 1198.
En aquellos casos en los que para obtener un
compuesto de fórmula (I) es necesario proteger uno o los dos grupos
hidroxilo de la betulina, o el grupo hidroxilo o el carboxilo del
ácido betulínico, las reacciones de protección o desprotección se
pueden llevar a cabo de acuerdo con procedimientos estándar, por
ejemplo tales como los descritos por Greene y Wuts,
Protective Groups in Organic Synthesis (2ª ed., 1991) y las
referencias citadas en dicho documento.
En caso de emplear grupos protectores acilo para
R^{2}, cuando se encuentra en forma de -CH_{2}OZ, siendo Z el
grupo protector acilo, se utilizan preferentemente soluciones
acuosas de hidróxido de sodio a temperatura ambiente para
desproteger el grupo Z.
Los suministradores de productos químicos
habituales comercializan glicosilhaluros, que son útiles para
glicosidaciones, cadenas alifáticas (alcanilo, alquenilo y
alquinilo) y cadenas polietilenglicol, así como derivados de
halogenados de éstas.
Los compuestos de fórmula (I) en los que R^{3}
= -CH(CH_{3})_{2} se pueden obtener a partir de
los compuestos de fórmula (I) en los que R^{3} =
-C(CH_{3})( = CH_{2}). Para obtener compuestos de fórmula
(I) en los que R^{3} = -CH(CH_{3})_{2}, los
compuestos en los que R^{3} = -C(CH_{3})( = CH_{2}) se
pueden hidrogenar en condiciones de catálisis utilizando paladio o
carbón vegetal de acuerdo con los métodos descritos en T. Fuijoka
y col., 1994, J. Nat. Prod.
57(2):243-47.
Además de los métodos arriba mencionados, los
compuestos de la presente invención se pueden obtener mediante
métodos de síntesis orgánica convencionales conocidos normalmente
por los expertos en la técnica.
Una vez se han sintetizado los compuestos de la
presente invención, éstos se pueden purificar o purificar
sustancialmente mediante cromatografía convencional,
recristalización u otras técnicas de purificación conocidas por los
expertos en la técnica.
Los compuestos de la presente invención son
útiles para métodos y composiciones adecuadas al tratamiento de
tumores, especialmente para tumores neuroectodérmicos y sus
metástasis, en un individuo que requiera dicho tratamiento. El
individuo es normalmente un mamífero, preferentemente un humano.
Tal como se demuestra aquí, los compuestos y las
composiciones farmacéuticas descritas son útiles para el tratamiento
de tumores neuroectodérmicos, incluyendo, sin limitarse a ellos,
neuroblastoma, meduloblastoma y sarcoma de Ewing. El diagnóstico de
tumores neuroectodérmicos y sus metástasis es conocido por los
expertos en la técnica. Los métodos de la invención comprenden la
administración de composiciones farmacéuticas que incluyen una
cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención
seleccionado y un soporte farmacéuticamente aceptable (véase más
abajo), al individuo que lo necesite, es decir, a un individuo
afectado por un tumor neuroectodérmico.
En algunas realizaciones específicas, los
compuestos y composiciones de la invención descritos son útiles para
el tratamiento de tumores neuroectodérmicos resistentes a ciertos
agentes quimioterapéuticos. En una de estas realizaciones, se
utilizan para tratar tumores neuroectodérmicos resistentes a la
doxorrubicina. En otra de estas realizaciones preferentes, como
mínimo una de las composiciones de la invención se administra de
forma sistémica junto con otros agentes quimioterapéuticos como la
doxorrubina.
En particular los compuestos
28-acetil-3-\beta-D-glucosil
betulina ("B10"),
3-\beta-28-hidroxilup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
("B11"),
3-\beta-3-hidroxilup-20(29)-en-28-il-\beta-D-glucopiranósido
("B12"), etil éster de ácido
3-(\beta-D-glucopiranosiloxi)lup-20(29)-en-28-oico
("B13"),
3-\beta-D-galactosil
betulina ("B14") y etil éster de ácido
3-\beta-D-galactosil-betulínico
("B15") o sales aceptables de los mismos, han demostrado tener
una alta eficacia en la activación de la apoptosis en células
tumorales y se utilizan ventajosamente en veterinaria y medicina
humana para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos. Estos
derivados de betulina y de ácido betulínico, respectivamente, tienen
una mejor solubilidad en agua, una mayor penetración en las células
y, por consiguiente, son ventajosos en comparación con la betulina y
el ácido betulínico.
Cuando se administran a un paciente, por ejemplo
un mamífero para uso veterinario o un humano para uso clínico, los
compuestos de la presente invención se emplean preferentemente en
forma aislada. Por el término "aislado" quiere decirse que,
antes de la formulación de una composición, los compuestos se
separan de otros componentes de (a) una fuente natural tal como un
cultivo vegetal o celular, o (b) una mezcla de reacción química de
síntesis orgánica. Los compuestos se purifican mediante técnicas
convencionales preferentemente.
Para tratar con éxito casos que impliquen tumores
en el cerebro, tales como meduloblastoma primario, neuroblastoma
primario o sarcoma de Ewing, puede ser necesario que el compuesto
activo sea capaz de atravesar la barrera hematoencefálica,
dependiendo de en qué medida esté intacta dicha barrera
hematoencefálica en cada caso. En general, los compuestos
lipofílicos pequeños tales como el ácido betulínico y los derivados
descritos son adecuados para atravesar de forma pasiva la barrera
hematoencefálica. No obstante, compuestos que tengan residuos de
azúcar pueden resultar particularmente útiles, especialmente si son
residuos de glucosa, ya que pueden atravesar de forma activa la
barrera hematoencefálica a través de receptores y canales de
sacáridos, en particular canales de glucosa. Estos derivados de
betulina y ácido betulínico, respectivamente, tienen una mejor
solubilidad en agua, una mayor capacidad de penetración y transporte
en las células y, por consiguiente, son ventajosos en comparación
con la betulina y el ácido betulínico. Por consiguiente, los
compuestos que incluyen
28-acetil-3-\beta-D-glucosil
betulina ("B10"),
3-\beta-28-hidroxilup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
("B11"),
3-\beta-3-hidroxilup-20(29)-en-28-il-\beta-D-glucopiranósido
("B12"), etil éster de ácido
3-(\beta-D-glucopiranosiloxi)lup-20(29)-en-28-oico
("B13"),
3-\beta-D-galactosil
betulina ("B14") y etil éster de ácido
3-\beta-D-galactosil-betulínico
("B15") pueden resultar particularmente ventajosos para el
tratamiento de tumores localizados en el cerebro.
Cuando se administran a un paciente, por ejemplo
a un mamífero para uso veterinario o a un humano para uso clínico,
los compuestos de fórmula (I) se pueden utilizar solos o en
combinación con un soporte o excipiente fisiológicamente aceptable
adecuado para su administración via enteral o parenteral. Si
se utilizan para administración parenteral, el soporte o excipiente
fisiológicamente aceptable debe ser estéril y adecuado para su uso
in vivo en humanos o para su uso en una situación clínica
veterinaria.
Los compuestos aquí descritos o sus sales de
adición o hidratos farmacéuticamente aceptables de los mismos, se
pueden suministrar a los pacientes utilizando una gran variedad de
vías o modos de administración. Las vías de administración
adecuadas incluyen, sin estar limitadas a ellas, inhalación,
administración transdérmica, oral, rectal, transmucosa, intestinal y
parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e
intravenosas.
Los compuestos aquí descritos o sus sales y/o
hidratos farmacéuticamente aceptables, se pueden administrar
individualmente, en combinación con otros compuestos de la
invención, y/o en cócteles combinados con otros agentes
terapéuticos. Evidentemente, la elección de los agentes terapéuticos
que se pueden administrar conjuntamente con los compuestos de la
invención dependerá, en parte, de la situación a tratar.
Por ejemplo, cuando se administran a pacientes
que sufren tumores neuroectodérmicos o tumores resistentes a los
fármacos, los compuestos de la invención se pueden suministrar en
cócteles que contienen agentes utilizados para tratar el dolor, las
infecciones y otros síntomas y efectos secundarios asociados
normalmente con estos tumores. Dichos agentes incluyen, por ejemplo,
analgésicos, antibióticos, etc. Los compuestos también se pueden
administrar en cócteles que contienen otros agentes utilizados
normalmente para tratar tumores neuroectodérmicos, tales como
vincristina, doxorrubicina (o dactinomicina) y ciclofosfamida
(Grier y col., 1994, Proceedings of the American Society
of Clinical Oncology 13: A-1443, 421).
Cuando se administran a un paciente sometido a un
tratamiento de cáncer, los compuestos se puede administrar en
cócteles que contienen otros agentes anticancerosos y/o
potenciadores suplementarios. Los compuestos también se pueden
administrar en cócteles que contienen agentes para tratar los
efectos secundarios de la radioterapia, tales como antieméticos,
protectores de la radiación, etc.
Los fármacos anticancerosos que se pueden
administrar conjuntamente con los compuestos de la invención también
incluyen, por ejemplo, aminoglutetimida, asparaginasa, bleomicina,
busulfán, carboplatino, carmustina (BCNU), clorambucilo, cisplatino
(cis-DDP), ciclofosfamida, HCl citarabina,
dacarbazina, dactinomicina, HCl daunorrubicina, HCl doxorrubicina,
fosfato sódico de estramustina, etopósido (VP-16),
floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida,
hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón
alfa-2a y alfa-2b, acetato de
lueprolida (análogo de factor liberador LRRH), lomustina (CCNU), HCl
mecloretamina (mostaza nitrogenada), melfalán, mercaptopurina,
mesna, metotrexato (MTX), mitomicina, mitotano
(o.p'-DDD), HCl mitoxantrona, octreotida,
plicamicina, HCl procarbazina, estreptozocina, citrato de
tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, sulfato de
vincristina, amsacrina (m-AMSA), azacitidina,
hexametilmelamina (HMM), interleuquina-2,
mitoguazona (metil-GAG;
metil-glioxal-bis-guanilhidrazona;
MGBG), pentostatina, semustina (metil-CCNU),
tenipósido (VM-26), paclitaxel y otros taxanos, y
sulfato de vindesina.
Los agentes potenciadores suplementarios que se
pueden administrar conjuntamente con los compuestos de la invención
incluyen, por ejemplo, fármacos antidepresivos tricíclicos (por
ejemplo, imipramina, desipramina, amitriptilina, clomipramina,
trimipramina, doxepina, nortriptilina, protriptilina, amoxapina y
maprotilina), fármacos antidepresivos no tricíclicos (por ejemplo
sertralina, trazodona y citalopram), antagonistas de Ca^{++} (por
ejemplo verapamil, nifedipina, nitrendipina y caroverina),
anfotericina (por ejemplo Tween 80 y maleato de perhexilina),
análogos de triparanol (por ejemplo tamoxifeno), fármacos
antiarrítmicos (por ejemplo quinidina), fármacos antihipertensivos
(por ejemplo reserpina), consumidores de tiol (por ejemplo butionina
y sulfoximina), y leucovorina de calcio.
El o los compuestos activos se pueden administrar
per se o en forma de una composición farmacéutica en la que
el o los compuestos activos se encuentran mezclados con uno o más
soportes, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las
composiciones farmacéuticas aplicables según la presente invención
se pueden formular de modo convencional utilizando uno o más
soportes fisiológicamente aceptables, incluyendo excipientes y
sustancias auxiliares que facilitan el procesamiento de los
compuestos activos en preparados farmacéuticamente adecuados. La
formulación apropiada depende de la vía de administración
elegida.
Para la administración por inyección, los agentes
de la invención se pueden formular en soluciones acuosas,
preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como
solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico.
Para la administración transmucosa, en la formulación se utilizan
penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Estos
penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
Para la administración oral, los compuestos se
pueden formular fácilmente combinando el o los compuestos activos
con soportes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la
técnica. Estos soportes permiten formular los compuestos de la
invención en forma de tabletas, píldoras, grageas, cápsulas,
líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, otras suspensiones y
similares, para su ingestión por parte del paciente tratado. Los
preparados farmacéuticos para uso oral se pueden obtener con
excipientes sólidos, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y
procesando la mezcla de gránulos, después de añadir sustancias
auxiliares adecuadas si así se desea, para obtener tabletas o
núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular,
materiales de relleno tales como azúcares, incluyendo lactosa,
sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa, como por
ejemplo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón
de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o
polivinilpirrolidona (PVP). Si así se desea se pueden añadir agentes
desintegradores tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o
ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se proveen de
revestimientos adecuados. Para ello se pueden utilizar soluciones de
azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábiga,
talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o
dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos
adecuados o mezclas de los mismos. También se pueden añadir
colorantes o pigmentos a los revestimientos de tabletas o grageas
para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de dosis
de compuesto activo.
Los preparados farmacéuticos utilizables
via oral incluyen cápsulas fáciles de tragar hechas de
gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y
un plastificante como glicerol o sorbitol. Las primeras pueden
contener los principios activos mezclados con materiales de relleno,
como lactosa; aglutinantes, como almidones; y/o lubricantes; como
talco o estearato de magnesio; y opcionalmente estabilizantes. En
las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos
o suspendidos en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina
líquida o polietilenglicoles líquidos. También se pueden añadir
estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral se
deben realizar en las dosis adecuadas para cada administración.
Para la administración bucal, las composiciones
se pueden encontrar en forma de tabletas o pastillas en formas
convencionales.
Para la administración por inhalación, los
compuestos útiles de acuerdo con la presente invención se
suministran convenientemente en forma de aerosol en envases a
presión o como nebulizador, utilizando un propelente adecuado, por
ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
caso de un aerosol a presión, la dosificación se puede determinar
disponiendo una válvula para suministrar una dosis medida. Se pueden
formular cápsulas y cartuchos, por ejemplo de gelatina, para un
inhalador o insuflador que contienen una mezcla de polvo del
compuesto y una base de polvo adecuado tal como lactosa o
almidón.
Los compuestos se pueden formular para
administración parenteral por inyección, por ejemplo mediante
inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para
inyección se pueden presentar en forma de monodosis, por ejemplo en
ampollas, o en recipientes multidosis con un conservante añadido.
Las composiciones se pueden encontrar en formas diferentes tales
como suspensiones, soluciones o emulsiones en excipientes aceitosos
o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como
agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los
compuestos activos solubles en agua. Adicionalmente se pueden
preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones
para inyecciones aceitosas. Los disolventes o excipientes lipófilos
adecuados incluyen ácidos grasos tales como aceite se sésamo, o
ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo o
triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosa
pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la
suspensión, tales como carboximetilcelulosa, sorbitol o dextrano.
Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes
adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos
para permitir la preparación de soluciones de alta
concentración.
Alternativamente, el principio activo se puede
encontrar en forma de polvo para constituirlo con un excipiente
adecuado, por ejemplo agua esterilizada libre de pirógenos, antes de
su uso.
Los compuestos también se pueden formular en
composiciones para administración rectal, tales como supositorios o
enemas de retención, que pueden contener, por ejemplo, bases para
supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros
glicéridos.
Además de las formulaciones anteriormente
descritas, los compuestos también se pueden formular como un
preparado "depot". Estas formulaciones de acción prolongada se
pueden administrar por implantación o suministro transcutáneo (por
ejemplo por vía subcutánea o intramuscular), inyección intramuscular
o parche transdérmico. Por ejemplo, los compuestos se pueden
formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por
ejemplo en forma de emulsión en un aceite adecuado) o resinas de
intercambio de iones, o como derivados poco solubles, por ejemplo en
forma de sal poco soluble.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
comprender soportes o excipientes sólidos o en forma de gel
adecuados. Los ejemplos de estos soportes o excipientes incluyen,
sin limitarse a ellos, carbonato de calcio, fosfato de calcio,
diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y
polímeros tales como polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su
uso de la presente invención incluyen aquellas que contienen el
principio activo en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir,
en una cantidad efectiva para lograr el objetivo previsto.
Evidentemente, la cantidad eficaz real para una administración en
particular dependerá, entre otras cosas, de la situación a tratar.
Por ejemplo, cuando se administren para inducir la apoptosis en
tumores neuroectodérmicos, estas composiciones contendrán una
cantidad de principio activo suficiente para lograr este resultado.
Cuando se administren para inhibir el desarrollo de células
tumorales carentes de p53, dichas composiciones contendrán una
cantidad de principio activo eficaz para lograr este resultado.
Cuando se administren a pacientes de tumores neuroectodérmicos,
dichas composiciones contendrán una cantidad de principio activo
eficaz, entre otras cosas, para prevenir el desarrollo del tumor, o
para aliviar los síntomas existentes o para prolongar la vida del
paciente tratado. Para utilizarlas en el tratamiento de cánceres
resistentes a otros fármacos, una cantidad terapéuticamente eficaz
incluye, además, la cantidad de compuesto o composición que detenga
o haga retroceder el desarrollo del tumor. Los expertos en la
técnica tienen capacidad suficiente para determinar la cantidad
eficaz, especialmente a la luz de la descripción detallada
proporcionada en este documento.
Para cualquier compuesto aquí descrito, la
cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar inicialmente a
partir de series de cultivos celulares. Las concentraciones de
plasma objetivo serán aquellas concentraciones de compuesto o
compuestos activos que sean capaces de inducir como mínimo un 25% de
apoptosis aproximadamente y/o como mínimo un 25% de inhibición de la
proliferación celular en ensayos de cultivos celulares,
evidentemente dependiendo de la aplicación particular deseada. Son
preferentes las concentraciones de plasma objetivo del compuesto o
los compuestos activos que sean capaces de inducir aproximadamente
al menos un 50%, un 75% o incluso un 90% o más de apoptosis o
inhibición de la proliferación celular en ensayos de cultivos
celulares. Se puede controlar el porcentaje de inducción de
apoptosis o inhibición de proliferación celular en el paciente para
evaluar la idoneidad de la concentración en plasma de fármaco
obtenida.
Las cantidades terapéuticamente eficaces para uso
en humanos también se pueden determinar a partir de modelos
animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis para humanos de
modo que se obtenga una concentración circulante que se ha
comprobado es eficaz en animales. Los modelos animales útiles para
enfermedades caracterizadas por una proliferación celular anormal
son conocidos en la técnica. En particular, las siguientes
referencias proporcionan modelos animales adecuados para
xenoinjertos de cáncer (Corbett y col., 1996, J. Exp.
Ther. Oncol. 1: 95-108; Dykes y col.,
1992, Contrib. Oncol. Basel. Karger 42:
1-22), restenosis (Carter y col., 1994,
J. Am. Coll. Cardiol. 24(5):
1398-1405), aterosclerosis (Zhu y col.,
1994, Cardiology 85(6): 370-377) y
neovascularización (Epstein y col., 1987, Cornea
6(4):250-257). La dosificación en humanos se
puede ajustar controlando el tamaño de los tumores.
Una dosis terapéuticamente eficaz también se
puede determinar a partir de datos obtenidos en humanos referentes a
compuestos conocidos que presentan actividades farmacológicas
similares, como la doxorrubicina (véase, por ejemplo, Brugnara y
col., 1995, JPET 273: 266-272;
Benzaquen y col., 1995, Nature Medicine 1:
534-540; Brugnara y col., 1996 J. Clin.
Invest. 97(5): 1227-1234). La dosis
administrada se puede ajustar en base a la biodisponibilidad
relativa y a la potencia del compuesto administrado en comparación
con la doxorrubicina.
Los técnicos con una experiencia media tienen
capacidad suficiente para ajustar la dosis con el fin de lograr una
eficacia máxima en humanos en base a los métodos arriba descritos y
a otros métodos.
Evidentemente, en caso de administración local,
la concentración circulante sistémica del compuesto administrado no
será de ninguna importancia en particular. En tales casos, el
compuesto se administra de modo que se obtenga una concentración
eficaz para lograr el resultado perseguido en el área local.
Para la profilaxis y/o el tratamiento de tumores
neuroectodérmicos se considera eficaz una concentración circulante
del compuesto administrado de aproximadamente 0,001 \muM a 20
\muM, preferentemente de aproximadamente 0,1 \muM a 5
\muM.
Las dosis por paciente para la administración
oral de los compuestos aquí descritos, que es el modo de
administración preferente para el tratamiento de tumores
neuroectodérmicos, suelen oscilar entre aproximadamente 80 mg/día y
16.000 mg/día, más especialmente entre aproximadamente 800 mg/día y
8.000 mg/día, y de forma totalmente específica entre aproximadamente
800 mg/día y 4.000 mg/día. Expresado en términos de peso corporal
del paciente, las dosis típicas oscilan entre 1 y 200 mg/kg/día
aproximadamente, normalmente entre aproximadamente 10 y 100
mg/kg/día y especialmente entre aproximadamente 10 a 50 mg/kg/día.
Expresado en términos de superficie corporal del paciente, las dosis
típicas oscilan entre aproximadamente 40 y 8.000 mg/m^{2}/día,
normalmente entre aproximadamente 400 y 4.000 mg/m^{2}/día, y
especialmente entre 400 y 2.000 mg/m^{2}/día aproximadamente.
Para el tratamiento de tumores caracterizados por
ser resistentes a otros agentes quimioterapéuticos, incluyendo
tumores carentes de proteínas p53 "tipo salvaje" o con defectos
en el sistema CD95, se considera efectiva una concentración
circulante del compuesto administrado de aproximadamente 0,001
\muM a 20 \muM, siendo preferente que sea de alrededor de 0,1
\muM a 5 \muM.
Las dosis por paciente para la administración
oral de los compuestos aquí descritos para el tratamiento o la
prevención de cánceres oscilan típicamente entre 80 mg/día y 16.000
mg/día aproximadamente, normalmente entre 800 mg/día y 8.000 mg/día
aprox., y especialmente alrededor de 800 mg/día y 4.000 mg/día.
Expresado en términos de peso corporal del paciente, las dosis
típicas oscilan entre aproximadamente 1 y 200 mg/kg/día, normalmente
entre 10 y 100 mg/kg/día y preferentemente entre 10 a 50 mg/kg/día
aproximadamente. Expresado en términos de áreas superficiales
corporales del paciente, las dosis típicas oscilan entre
aproximadamente 40 y 8.000 mg/m^{2}/día, normalmente entre 400 y
4.000 mg/m^{2}/día, y de forma totalmente preferente entre 400 y
2.000 mg/m^{2}/día aproximadamente.
Para otros modos de administración, la cantidad y
el intervalo de las dosis se pueden ajustar individualmente para
proporcionar niveles plasmáticos del compuesto administrado eficaces
para la indicación clínica tratada en particular. Para aplicarlos
al tratamiento de cánceres tumorigénicos, los compuestos se pueden
administrar antes, durante o después de la extirpación quirúrgica
del tumor. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar al
tumor a través de una inyección dentro de la masa tumoral en una o
varias dosis antes de la cirugía. El tumor, o la mayor cantidad
posible del mismo, puede extirparse después por cirugía. Tras la
extirpación se pueden administrar dosis adicionales del fármaco en
el lugar donde se encontraba el tumor. Como alternativa, la
extirpación quirúrgica de la mayor cantidad posible del tumor puede
preceder a la administración de los compuestos en la zona donde se
encontraba éste.
En combinación con los conocimientos aquí
proporcionados, eligiendo entre los diversos compuestos activos y
sopesando factores tales como potencia, biodisponibilidad relativa,
peso corporal del paciente, gravedad de los efectos secundarios
negativos y modo de administración preferente, se puede planificar
un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaces que no
produzcan una toxicidad sustancial y, no obstante, sean
completamente efectivos para tratar los síntomas clínicos que
muestra el paciente. Evidentemente, existen muchos factores
importantes para determinar un régimen terapéutico adecuado para una
indicación o para un paciente en particular. Las indicaciones graves
justifican la administración de dosis mayores en comparación con las
indicaciones menos graves.
La relación entre la toxicidad y el efecto
terapéutico de un compuesto particular es su índice terapéutico y se
puede expresar como el cociente entre LD_{50} (la cantidad de
compuesto letal en el 50% de la población) y ED_{50} (la cantidad
de compuesto eficaz para el 50% de la población). Son preferibles
los compuestos que presentan índices terapéuticos altos. Los datos
sobre índices terapéuticos obtenidos en ensayos de cultivos
celulares y/o estudios en animales se pueden utilizar para formular
un rango de dosificaciones para su uso en humanos. La dosificación
de estos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un rango
de concentraciones en plasma que incluyen un ED_{50} con poca o
ninguna toxicidad. Las dosis pueden variar dentro de este rango
dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de
administración utilizada. Cualquier médico puede elegir la
formulación exacta, la vía de administración y la dosificación a la
vista del estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Gingl y
col., 1975, en: The Pharmacological Basis of
Therapeutics, cap. 1, p. 1).
Si así se desea, las composiciones se pueden
presentar en un envase o en un dispositivo dispensador que contiene
una o más formas de dosificación unitaria con el principio activo.
El envase puede consistir, por ejemplo, en una lámina metálica o de
plástico, tal como un envase "blister". El envase o dispositivo
dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración.
Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención
formulado en un soporte farmacéuticamente compatible también se
pueden preparar, disponer en un recipiente adecuado y etiquetar para
el tratamiento de una situación determinada. Las indicaciones
adecuadas mostradas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de
tumores neuroectodérmicos, meduloblastoma, neuroblastoma, sarcoma de
Ewing y similares.
Los siguientes ejemplos de fabricación y uso de
los sistemas de selección de la invención han de permitir a los
expertos en la técnica comprender más claramente y poner en práctica
la presente invención. Algunos materiales de los siguientes ejemplos
han sido publicados en Fulda y col., 1997, Cancer
Res. 57: 4956-4964 y Fulda y col., 1998,
Cancer Res. 58: 4453-4460, publicaciones
incorporadas aquí como referencias.
Se trata 1 equivalentede betulina con exceso de
anhídrido acético disuelto en piridina a temperatura ambiente,
durante 12 horas, obteniéndose 3,28-diacetil
betulina. A continuación, 1 equivalente de
3,28-diacetil betulina se trata con 1 equivalente de
NaOH en etanol para obtener 28-acetil betulina con
un rendimiento de un 61%. La 28-acetil betulina se
obtuvo de acuerdo con el procedimiento de S. Ohara y col.,
Mokuzai Gakkaishi 40(4): 4444-51
(1994). Específicamente, 1 equivalente de 28-acetil
betulina se trata con 3 equivalentes de bromuro de
2,3,4,6-tetraacetil-\beta-D-glucopiranosilo
en presencia de Hg(CN)_{2} en exceso, y en
nitrometano, para obtener un producto de reacción neto que se
purifica mediante cromatografía de columna para obtener
28-acetil-3-\beta-D-(2,3,4,6-tetraacetil)glucosil
betulina con un rendimiento de un 62%. Después, 1 equivalente de la
28-acetil-3-\beta-D-(2,3,4,6-tetraacetil)glucosil
betulina así obtenida se trata con un exceso de una mezcla 4:2:1
de MeOH:H_{2}O:Et_{3}N a 40-50ºC, durante 1 h,
para obtener el compuesto indicado en el título con un rendimiento
de un 62%.
La
28-acetil-3-\beta-D-galactosil-betulina
se prepara de acuerdo con el procedimiento anterior del Ejemplo 1,
excepto que se utiliza bromuro de
2,3,4,6-tetraacetil-\beta-D-galactopiranosilo
en lugar de bromuro de
2,3,4,6-tetraacetil-\beta-D-glucopiranosilo
y que la
28-acetil-3-\beta-D-galactosil
betulina no se purifica de su mezcla de reacción.
Un equivalente de betulina se trata con un exceso
de anhídrido acético en piridina a 0ºC, durante 0,5 a 1 h, o hasta
que la cromatografía de capa fina indique que la reacción se ha
completado, con ello se obtiene 3-acetil
betulina.
Un equivalente de
\beta-D-glucosa se trata con
cloruro de tricloroacetilo en exceso, en presencia de piridina para
obtener una mezcla de
pertricloroacetil-\beta-D-glucosa
y
pertricloroacetil-\beta-D-glucosa.
Un equivalente de la mezcla así obtenida se trata con HBr en ácido
acético para obtener bromuro de
2,3,4,6-tetratricloroacetil-\beta-D-glucopiranosilo.
Un equivalente de 3-acetil
betulina se trata con exceso de bromuro de
2,3,4,6-tetratricloroacetil-\beta-D-glucopiranosilo
en presencia de Hg(CN)_{2} en exceso y en
nitrometano, así se obtiene un producto de reacción neto que se
purifica mediante cromatografía de columna para obtener
3-acetil-28-\beta-D-(2,3,4,6-tetratricloroacetil)glucosil
betulina. A continuación, 1 equivalente de
3-acetil-28-\beta-D-(2,3,4,6-tetratricloroacetil)glucosil
betulina se trata con NH_{3}/EtOH en cloroformo (V. Schwarz,
Coll, Czech. Commun. 27: 2567 (1962)) para obtener
el compuesto indicado en el título.
A partir de 1 equivalente de ácido betulínico
disuelto en una mezcla de etanol y acetato de etilo al 50% se
obtiene etil éster de ácido betulínico. Después se añade bajo
agitación un exceso de una solución de diazotano en éter dietílico,
preparada a partir de
N-nitroso-N-etilurea.
La agitación se continúa durante 30 minutos y la solución se trata
con ácido acético en exceso. La solución se evapora hasta sequedad.
Se precipita etil éster de ácido betulínico y se recristaliza a
partir de etanol. De acuerdo con el procedimiento de glicosilación
descrito más arriba en el Ejemplo 1, el etil éster de ácido
betulínico (1 equivalente) se somete a reacción con 3 equivalentes
de bromuro de
2,3,4,6-tetraacetil-\alpha-D-galactosilo
para obtener etil éster de ácido
2,3,4,6-tetraacetil-3-\beta-D-galactosil-betulínico,
con un rendimiento de un 58% después de cromatografía de columna.
La disociación de los grupos protectores acetilo de este compuesto
se logra utilizando KOH al 5% en una mezcla agua/etanol 1/1 durante
12 h, a temperatura ambiente, obteniéndose el compuesto indicado en
el título, con un rendimiento de un 79% y después de cromatografía
de columna.
Este compuesto se prepara tal como se describe
más arriba. Sin embargo, en lugar de etil éster de ácido betulínico
se utiliza betulina.
\newpage
Este ejemplo muestra que el ácido betulínico
induce apoptosis en tumores neuroectodérmicos, tales como
neuroblastoma, meduloblastoma y sarcoma de Ewing, que son los
tumores sólidos más comunes en la infancia. Este ejemplo también
muestra que el ácido betulínico activa una ruta de apoptosis
diferente de la identificada para fármacos quimioterapéuticos
estándar. La apoptosis inducida por ácido betulínico es
independiente de la interacción de ligando CD95/receptor y de la
acumulación de proteína p53 de "tipo salvaje", pero depende
críticamente de la activación de caspasas (enzima convertidora de
interleuquina 1\alpha/proteasas tipo Ced-3). Se
activan FLICE/MACH (caspasa-8), que se considera
como una proteasa "corriente arriba" en la cascada de caspasas,
y la caspasa "corriente abajo" CPP32/YAMA/Apopaína
(caspasa-3), lo que conduce a la disociación del
sustrato prototipo de caspasas PARP. El péptido
benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona
inhibidor de amplio espectro, que bloquea la disociación de FLICE y
PARP, también anula por completo la apoptosis activada por ácido
betulínico. La disociación de caspasas viene precedida de por una
perturbación del potencial de membrana mitocondrial y por la
formación de especies reactivas al oxígeno. La sobreexpresión de
Bcl-2 y Bcl-x_{L} confiere
resistencia al ácido betulínico a nivel de disfunción mitocondrial,
activación de proteasas y fragmentación nuclear. Esto sugiere que
las alteraciones mitocondriales están implicadas en la activación de
caspasas inducida por ácido betulínico.
Además, la Bax y la Bcl-x_{m},
dos proteínas promotoras de muerte de la familia de las
Bcl-2, se regulan después del tratamiento con ácido
betulínico. Aun más importante: células de neuroblastoma resistentes
a la apoptosis mediada por CD95 y doxorrubicina son sensibles al
tratamiento con ácido betulínico, lo que sugiere que el ácido
betulínico puede evitar algunas formas de resistencia a fármacos. El
ácido betulínico también induce apoptosis en células
neuroectodérmicas derivadas de pacientes ex vivo, lo que
indica que el ácido betulínico debería de ser activo in
vivo.
El ácido betulínico (Aldrich; Steinheim,
Alemania) y la doxorrubicina (Farmitalia, Milán, Italia) se obtienen
como sustancias puras y se disuelven en DMSO (4 mg por ml de ácido
betulínico) o agua esterilizada (1 mg por ml de doxorrubicina) antes
de cada experimento.
Células de neuroblastoma (SH-EP,
IMR-32, Kelly, y LAN-5,
proporcionadas amablemente por el Profesor M. Schwab, German Cancer
Research Center, Heidelberg, Alemania), células de meduloblastoma
(Daoy, proporcionadas amablemente por el Dr. T. Pietsch, Department
of Neuropathology, University of Bonn Medical Center, Bonn,
Alemania), células de sarcoma de Ewing (A17/95, proporcionadas
amablemente por el Dr. U. Anderer, Institute of Pathology, Humboldt
University, Berlín, Alemania) y células de melanoma
A-378), carcinoma de mama (MCF-71),
carcinoma de color (HT-29), carcinoma de pulmón de
células pequeñas (H-126), carcinoma celular renal
(KTCTL-26, proporcionadas amablemente por H. Lörke,
German Cancer Research Center, Heidelberg, Alemania) y leucemia de
células T (CEM) se cultivaron en RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.
Eggenstein, Alemania) suplementado con un 10% suero bovino fetal
(FCS) inactivado por calor de Conco (Wiesbaden, Alemania), 10 mM
HEPES pH 7,3 (Biochrom, Berlín, Alemania), 100 unidades/ml
penicilina (Life Technologies, Inc.), 100 \mug/ml de
estreptomicina (Life Technologies, Inc.) y 2 mM de
L-glutamina (Biochrom, Berlín, Alemania). Las
células de neuroblastoma SH-EP transfectadas de
forma estable con bcl-2, bcl-X_{L}
o control de vector se cultivaron en un medio mínimo Eagle de
Dulbecco (Life Technologies, Inc.) que contiene 500 \mug/ml de
G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) tal como se describe en
Dole y col. 1994, Cancer Res. 54:
3253-3259 y Dole y col., 1995, Cancer
Res. 55: 2576-2582. Se generaron células
SH-EP^{CD95R} y SH-EP^{DoxoR},
que son variedades de células de neuroblastoma
SH-EP resistentes a anti-CD95 y
doxorrubicina respectivamente, mediante cultivo continuo en
presencia del anticuerpo agonista
anti-APO-1
(anti-CD95) (1 \mug/ml; Trauth y col.,
1989, Science (Washington DC) 245: 301-305) o
doxorrubicina (0,1 \mug/ml) durante más de 6 meses. Para los
experimentos, las células resistentes se lavaron y cultivaron en
un medio sin anti-APO-1
(anti-CD95) durante 24 h o sin doxorrubicina durante
2 semanas.
La cuantificación de fragmentación de ADN se
llevó a cabo mediante análisis FACS de núcleos teñidos con yoduro de
propidio, tal como se describe en Nicoletti y col., 1991,
J. Immunol. Methods. 139: 271-279. Las
células se analizaron en cuanto al contenido de ADN mediante
citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg,
Alemania) utilizando software CELLQuest. Los cambios de apoptosis
precoces se identificaron mediante tinción con anexina V biotinilada
(Bender Med Systems, Viena, Austria) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La anexina V se une a la fosfatidilserina expuesta en
la superficie de las células apoptósicas (Koopman y col.,
1994, Blood. 84:1415-1420). Las células se
analizaron mediante citometría de flujo
(FAC-Scan.Becton Dickinson) utilizando software
CELLQuest.
\newpage
Se obtuvieron muestras de tumor fresco de
resecciones quirúrgicas de dos pacientes con neuroblastoma en
estadio IV5 y IV respectivamente, antes de la quimioterapia y se
analizaron de inmediato. Se prepararon suspensiones de células
individuales utilizando Dnasa (0,154 mg/ml), colagenasa (0,416
mg/ml) e hialuronidasa (0,33 mg/ml; Boheringer Mannheim). Se llevó a
cabo una fluorescencia bi-color utilizando
anticuerpo GD2 antihumano de ratón conjugado con FITC (IgG2a. 0,2
mg/ml, proporcionado amablemente por R. Handgretinger, University of
Tuebingen, Tuebingen, Alemania) y anexina V biotinilada (Bender Med
Systems) seguida de estreptavidina-ficoeritrina para
detectar células de neuroblastoma apoptósicas (Wu y col.,
1986, Cancer Res. 46: 440-443).
El tripéptido inhibidor de caspasas de amplio
espectro _{2}VAD-tmk (Enzyme Systems Products,
Dublin, CA) se utilizó en una concentración de 60 \mum. La
preparación de fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2}
anti-APO-1
(anti-CD95) y el anticuerpo isotipo F1123 (IgG3)
correspondiente se llevó a cabo tal como se describe en Dhein y
col., 1995, Nature (Lond.) 375: 81-83.
Las células se incubaron con 10 \mug/ml de fragmentos de
anticuerpo F(ab')_{2}
anti-APO-1 o 10 \mug/ml de
fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2}F1123 durante 1 h, a
37ºC, antes de la adición de ácido betulínico.
La actividad caspasa se midió mediante análisis
FACS tal como se describe en Los y col., 1995, Nature
(Lond.) 375: 81-83. En pocas palabras: se
cargaron células en medio hipotónico con el sustrato fluorogénico
Val-Ala-Asp-[2-(4-metoxinaftilamida)]
en una concentración final de 50 \mum (Enzyme Systems Products).
La fluorescencia se midió mediante citómetro de flujo (FACVantage,
Becton Dickinson) utilizando una longitud de onda de excitación de
365 nm y una longitud de onda de emisión de 425 nm.
Para medir el \Delta\Psi_{m} se utilizó el
fluorocromo lipofílico catiónico DiOC_{6}(3) (460 ng/ml,
Molecular Probes, Eugene, OR). Para determinar la generación de ROS
se utilizó HE (126 ng/ml. Molecular Probes) y para determinar la
peroxidación de lípidos se empleó NAO (94 ng/ml, Molecular Probes)
(Kroemer y col., 1997, Immunol. Today 18:
44-51). Las células se incubaron durante 12 minutos
a 37ºC en presencia de los fluorocromos, se lavaron en PBS/1%FCS y
se analizaron inmediatamente después mediante citometría de flujo
(FACScan, Becton Dickinson). Las fluorescencias de
DiOC_{6}(3) y NAO se registraron en fluorescencia 1; la
fluorescencia de He se evaluó en fluorescencia 3. El porcentaje de
células con bajo potencial mitocondrial o con un aumento de la
producción de ROS se calculó en comparación con células control no
tratadas.
Se preparó ARN completo utilizando el kit Qiagen
Total RNA (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN se convirtió en ADNc
mediante transcripción inversa y se amplificó durante 38 ciclos
mediante PCR en un termociclador (Stratagene, Heidelberg, Alemania)
utilizando el kit Gene Amplification RNA-PCR
(Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para
amplificación del fragmento de CD95-L son de acuerdo
con la secuencia de CD95-L humana (Suda y
col., 1995, Cell 75: 1169-1178; Herr y
col., 1996, Cell Death Diff., 5: 299-305). La
expresión de \alpha-actina
(MWG-Biotech, Ebersberg, Alemania) se utilizó como
estándard interno para la integridad del ARN y para la igual carga
de gel. A los productos PCR se les pasaron 60 V durante 2 h en un
gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio y se
visualizaron mediante iluminación UV.
Las células se sometieron a lisis durante 30
minutos, a 4ºC, en PBS con Triton X 0,5% (Serva, Heidelberg,
Alemania) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (Sigma,
Deisenhofen, Alemania), seguida de centrifugación a alta velocidad.
Las proteínas de membrana se eluyeron en un tampón que contenía
glicina 0,1 M, pH 3,0 y Tris 1,5 M, pH 8,8. La concentración
proteínica se ensayó utilizando ácido bicinconínico (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL). Cuarenta \mug de proteína por pista se
separaron mediante SDS-PAGE 12% y se sometieron a
electrotransferencia sobre nitrocelulosa (Amersham, Braunschweig,
Alemania). Mediante tinción roja de Ponceau de membrana se controló
una carga proteínica igual. Después de bloqueo durante 1 h en PBS
suplementado con BSA2% (Sigma) y Tween 20 0,1% (Sigma), se llevó a
cabo inmunodetección de FLICE, CPP32, PARP, Bax,
Bcl-x, Bcl-2 y proteína p53
utilizando anticuerpo C15 monoclonal anti-FLICE de
ratón (dilución 1:5 de sobrenadante de hibridoma), anticuerpo
monoclonal anti-CPP32 de ratón (1:1.000,
Transduction Laboratories, Lexington, KY), anticuerpo policlonal
anti-PARP de conejo (1:10.000, Enzyme Systems
Products), anticuerpo policlonal anti-Bax de conejo
(1:500, Calbiochem, Bad Soden, Alemania), anticuerpo policlonal
anti-Bcl-x de conejo (1:1.000, Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anticuerpo monoclonal
anti-p53 de ratón (1:10.000, Transduction
Laboratories) y 1gG anti-ratón de cabra o IgG
anti-conejo de cabra (1:5.000, Santa Cruz
Biotechnology), para la detección se utilizó ECL (Amersham).
La Figura 1A muestra la inducción de apoptosis
por ácido betulínico en diversas líneas celulares tumorales. Las
células se trataron con 10 \mug/ml de ácido betulínico durante 72
h. La apoptosis se evaluó mediante análisis FACS de núcleos teñidos
con yoduro de propidio. El porcentaje de la apoptosis específica se
calculó de la siguiente manera: apoptosis experimental (%) -
apoptosis espontánea en medio (%)/[100% - apoptosis espontánea en
medio (%)] x 100%.
Las líneas celulares ensayadas fueron
neuroblastoma (SH-EP), meduloblastoma (Daoy),
sarcoma de Ewing (A171
95), melanoma (A.378), carcinoma de mama (MCF-7), carcinoma de colon (HT-29), carcinoma de pulmón de células pequeñas (H-146), carcinoma celular renal (KTCTL-26) y leucemia de células T (CEM). Cada columna corresponde al promedio de tres valores. Las desviaciones estándar (Sds) fueron inferiores a un 10%. Resultados similares se obtuvieron en tres experimentos independientes.
95), melanoma (A.378), carcinoma de mama (MCF-7), carcinoma de colon (HT-29), carcinoma de pulmón de células pequeñas (H-146), carcinoma celular renal (KTCTL-26) y leucemia de células T (CEM). Cada columna corresponde al promedio de tres valores. Las desviaciones estándar (Sds) fueron inferiores a un 10%. Resultados similares se obtuvieron en tres experimentos independientes.
La Figura 1B muestra la respuesta de apoptosis
inducida por ácido botulínico en función de la dosis. Se trataron
células de neuroblastoma SH-EP (\vardiamondsuit),
LAN-5 (\Delta), IMR-32 (x) y Kelly
(\blacksquare) con ácido betulínico durante 72 h en las
concentraciones indicadas. La apoptosis se evaluó mediante análisis
FACS de núcleos teñidos con yoduro de propidio. El porcentaje de
apoptosis específica se calculó tal como se ha descrito en relación
con la Figura 1A. Cada punto de datos es un promedio de tres
valores. Las Sds fueron inferiores a un 10%. En tres experimentos
independientes se obtuvieron resultados similares.
La Figura 1C muestra la respuesta de la apoptosis
inducida por ácido betulínico en función de la dosis en células de
neuroblastoma ex vivo. Se prepararon suspensiones de células
individuales a partir de muestras de tumor obtenidas mediante
resección quirúrgica previa a quimioterapia y se incubaron con las
concentraciones indicadas de ácido betulínico durante 18 h. Se llevó
a cabo una fluorescencia bi-color utilizando
anticuerpo GD2 antihumano de ratón conjugado con FITC y anexina V
biotinilada seguida de estreptavidinaficoeritrina en un citómetro de
flujo. La apoptosis específica se calculó tal como se ha descrito en
relación con la Figura 1A. Se muestran datos representativos de uno
de dos pacientes. Los experimentos se realizaron por triplicado. Las
Sds fueron inferiores a un 10%.
Se comprobó que células de neuroblastoma,
meduloblastoma y sarcoma de Ewing eran altamente sensibles al ácido
betulínico, además de las células de melanoma que, como se ha
mencionado anteriormente, responden al ácido betulínico. En cambio,
los tumores epiteliales tales como carcinoma de mama, carcinoma de
colon, carcinoma de pulmón de células pequeñas y carcinoma celular
renal, así como las células de leucemia de células T eran casi
completamente refractarias al tratamiento con ácido betulínico
(Figura 1A).
Las células de neuroblastoma tratadas con ácido
betulínico mostraban características morfológicas típicas de las
células apoptósicas, con contracción, formación de ampollas en la
membrana y fragmentación nuclear. La respuesta en función de la
dosis de la apoptosis inducida por ácido bongkrékico se evaluó
mediante citometría de flujo, tiñendo ADN con yoduro de propidio
(Figura 1B). La fragmentación de ADN de las células de neuroblastoma
tratadas con ácido betulínico también se detectó mediante
electroforesis en gel de agarosa (datos no mostrados). Además del
análisis de ADN, la apoptosis también se evaluó mediante tinción con
anexina V, obteniéndose resultados similares (datos no mostrados).
Para investigar si el ácido betulínico era activo o no contra
células de neuroblastoma ex vivo, se analizaron preparados
celulares obtenidos de especímenes tumorales mediante análisis FACS
utilizando fluorescencia bi-color para identificar
la apoptosis en células tumorales mediante tinción con
anti-GD2 (Wu y col., 1986, Cancer Res.
46: 440-443). Las células de neuroblastoma derivadas
de pacientes experimentaron rápidamente apoptosis incluso a bajas
concentraciones (0,5 \mug/ml) de ácido betulínico (Figura 1C).
Estos resultados sugieren que el ácido betulínico podría ejercer
una potente actividad antitumoral in vivo.
Se controló la activación del receptor proximal
de caspasa CD95 FLICE y la caspasa "corriente abajo" CPP32 para
evaluar los diferentes componentes de la cascada de caspasa.
La Figura 2A muestra la actividad de caspasa
afectada por el ácido betulínico. Se incubaron células de
neuroblastoma SH-EP con 1 (x), 5 (\bullet), 10
(\vardiamondsuit) y 50 (\blacksquare) \mug/ml de ácido
betulínico durante los tiempos indicados. Las células se
permeabilizaron mediante shock hipotónico, se incubaron con 50
\muM del sustrato fluorogénico
Val-Ala-Asp-[2-(4-metoxinaftilaroide)]
y se analizaron con un citómetro de flujo. Cada punto de datos es
un promedio de tres experimentos independientes realizados por
triplicado. Las Sds fueron inferiores a un 10%.
La Figura 2B y la Figura 2C muestran la
disociación de FLICE, CPP32 y PARP. Las células de neuroblastoma
SH-EP se trataron con 10 \mug/ml de ácido
betulínico durante los tiempos indicados o con 0,5 \mug/ml de
doxorrubicina durante 24 h. Cuarenta \mug de proteína por pista,
aislada de lisis celulares, se separaron mediante
SDS-PAGE 12%. La inmunodetección de proteínas FLICE
(Figura 2B), CPP32 (Figura 2C), y PARP (C) se llevó a cabo mediante
anticuerpo monoclonal anti-FLICE de ratón,
anticuerpo monoclonal anti-CPP32 de ratón o
anticuerpo policlonal anti-PARP de conejo y ECL. El
procesamiento de FLICE, que se detectó como una banda doble
correspondiente a dos isoformas FLICE (caspasa 8/a y 8/b), condujo a
la p43 y p4 (productos intermedios de disociación derivados de
caspasa 8/a y 8/b, respectivamente) y a la subunidad activa p18.
La Figura 2E muestra la inhibición de la
apoptosis inducida por ácido betulínico mediante
zVAD-fmk. Las células de neuroblastoma
SH-EP se trataron con 10 \mug/ml de ácido
betulínico durante 72 h en ausencia (\blacksquare) o presencia
(\Box) de 60 \muM zVAD-fmk. La apoptosis
específica se determinó y calculó tal como se describe en la
leyenda de la Figura 1A. Cada columna corresponde al promedio de
tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las Sds
fueron inferiores a un 10%.
La Figura 2E muestra la inhibición de la
disociación inducida por ácido betulínico de FLICE y PARP mediante
zVAD-fmk. Las células de neuroblastoma
SH-EP se trataron con 10 \mug/ml de ácido
betulínico durante 24 h con o sin 60 \muM
zVAD-fmk. Se llevó a cabo un análisis Western blot
para la disociación de FLICE y PARP tal como se describe para la
Figura 2B.
El ácido betulínico provocó un fuerte aumento de
la actividad caspasa, que presentó un valor máximo 18 h después de
la adición de ácido betulínico (Figura 2A). La FLICE se disoció en
subunidades activas p18 con el tratamiento con ácido betulínico
(Figura 2B). Además se procesó proteolíticamente CPP32, y también
PARP, uno de los sustratos conocidos para CPP32, y se disoció PARP,
uno de los sustratos conocidos para CPP32(35), en su
fragmento característico M 85.000 (Figura 2C). La incubación con
zVAD-fmk anuló prácticamente por completo la
apoptosis después del tratamiento con ácido betulínico (Figura 2D) e
inhibió la disociación de FLICE y PARP (Figura 2E), lo que indicaba
que las caspasas estaban implicadas de forma crucial en la apoptosis
inducida por ácido betulínico. Para investigar si el ácido
betulínico podía disociar o no directamente FLICE se realizó un
ensayo de disociación in vitro. Después de incubar FLICE
marcada ^{35}S traducida in vitro con ácido betulínico
durante 24 h, a 4 ó 37ºC, no se detectó ningún producto de
segmentación, lo que demostraba que el ácido betulínico no disociaba
dilinealmente FLICE (datos no mostrados), mientras que la CD95 DISC
disoció FLICE al utilizarla en un ensayo FLICE in vitro
(Medema y col., 1997, EMBO J., 16:
2794-2804).
La Figura 3A muestra el análisis de expresión de
ARNm de CD95-L mediante RT-PCR. Las
células de neuroblastoma SH-PE se incubaron con 5 y
10 \mug/ml de ácido betulínico durante los tiempos indicados o con
0,5 \mug/ml de doxorrubicina durante 24 h. La expresión de ARNm
de CD95-L se determinó mediante
RT-PCR. La expresión de
\alpha-actina se utilizó para controlar la
integridad de ARN y para la igual carga de gel.
La Figura 3B muestra la falta de inhibición de
apoptosis inducida por ácido betulínico mediante F(ab')_{2}
anti-APO-1
(anti-CD95). Las células de neuroblastoma
SH-EP se trataron con 10 \mug/ml de ácido
betulínico, 50 \mug/ml de VP-16, 10 \mug/ml de
cisplatino (DDP) o 0,5 \mug/ml de doxorrubicina durante 72 h
después de preincubación durante 1 h con medio (\blacksquare), 10
\mug/ml de F(ab')_{2} FII23 (anticuerpo de control IgG3:
\Box) o 10 \mug/ml de F(ab')_{2}
anti-APO-1 (anticuerpo de bloqueo
anti-CD95:
\sqsqsq). La apoptosis específica se determinó y calculó tal como se describe en la leyenda de la Figura 1A. Cada columna corresponde al promedio de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las Sds fueron inferiores a un 10%.
El ácido betulínico no indujo ARNm de
CD95-L según se evaluó mediante
RT-PCR, mientras que la doxorrubicina reguló
fuertemente el ARNm de CD95-L y también estimuló la
disociación de FLICE (Figuras 3A y 2B). Además, después de la
incubación con ácido betulínico no se pudo detectar ninguna
regulación de la proteína CD95 (datos no mostrados), mientras que
existen informes de una regulación de CD95 en respuesta a fármacos
citotóxicos, Véase, por ejemplo, Debatin y col., 1997, J.
Natl. Cancer Inst. 89: 750-751; Micheau,
1997 J. Natl. Cancer Inst. 89: 783-789. El
bloqueo de CD95 mediante fragmentos de anticuerpo
P(ab')_{2} anti-APO-1
demostró previamente inhibir la muerte autocrina/paracrina en
células T y la apoptosis activada por fármacos no inhibió la muerte
celular inducida por ácido bongkrékico, mientras que la apoptosis
después de tratamiento con doxorrubicina, cisplatino y
VP-16 se redujo notablemente (Figura 3B). En
conjunto, estos hallazgos indican que la apoptosis mediada por ácido
bongkrékico es independiente de la interacción
CD95-L/receptor.
La Figura 4A muestra una reducción del potencial
de membrana mitocondrial e hiperproducción de ROS. Las células de
neuroblastoma SH-EP se trataron con 10 \mug/ml de
ácido betulínico durante los tiempos indicados. Las células se
tiñeron con el fluorocromo DiOC_{6}(3) para determinar
\Delta\Psi_{m} y con HE para determinar la generación de ROS y
se analizó mediante citometría de flujo. Se observó un aumento
proporcional en células con \Delta\Psi_{m} bajo
[DiOC_{6}
(3)^{bajo}] o con producción de ROS incrementada (HE+).
(3)^{bajo}] o con producción de ROS incrementada (HE+).
La Figura 4B muestra la peroxidación de lípidos.
Las células de neuroblastoma de SH-EP tratadas con
10 \mug/ml de ácido bongkrékico durante 24 h (línea
gruesa), o las células de control (línea delgada) se
tiñeron con NAO para evaluar la cardiolipina oxidada y se
analizaron mediante citometría de flujo.
El tratamiento de células SH-EP
con ácido betulínico provocó una ruptura del \Delta\Psi_{m}
seguido por hiperproducción de ROS (Figura 4A). La pérdida precoz
de potencial mitocondrial puede reflejar un efecto directo del ácido
betulínico en la función mitocondrial. El colapso del
\Delta\Psi_{m} y la generación de ROS precedieron a la
disociación de caspasas, lo que sugiere que hay eventos
mitocondriales que pueden estar relacionados con la activación de
caspasas. Para determinar si el ROS generado en mitocondrias tenía
un efecto local directo en membranas mitocondriales, se evaluó la
cantidad de cardiolipina intacta, una molécula restringida a la
membrana mitocondrial interna, mediante el fluorocromo NAO. Tal como
muestra la Figura 4B, la generación de ROS mitocondrial fue
acompañada por una tinción reducida con NAO, lo que sugiere que la
producción de ROS provocaba un deterioro inmediato de la membrana
mitocondrial interna. Por consiguiente, la apoptosis inducida por
ácido bongkrékico parecía estar asociada con la disfunción
mitocondrial.
La Figura 5A muestra la inhibición de la
perturbación de la función mitocondrial inducida por ácido
betulínico mediante sobreexpresión de Bcl-2 y
Bcl-X_{L}. Las células de neuroblastoma
SH-EP transfectadas sólo con un vector de
resistencia a la neomicina, bcl-2 o
Bcl-X_{L}, se trataron con 10 \mug/ml de ácido
betulínico durante los tiempos indicados. Las células se tiñeron
con el fluorocromo DiOC_{6}(3) para determinar el
\Delta\Psi_{m} y con HE para determinar la generación de ROS y
se analizaron mediante citometría de flujo. Se observó un aumento
proporcional en células con \Delta\Psi_{m} bajo (células
DiOC_{6}(3)^{bajo}. tabla izquierda) o con
producción de ROS incrementada (células HE+, tabla
derecha).
La Figura 5B muestra la inhibición de la
disociación de FLICE y PARP inducida por ácido betulínico mediante
sobreexpresión de Bcl-2 y
Bcl-X_{L}. Las células de neuroblastoma
transfectadas sólo con un vector de resistencia a la neomicina
(Neo), bcl-2 o Bcl-X_{L} se
dejaron sin tratar (-) o se trataron con 10 \mug/ml de ácido
bongkrékico durante 24 h (+). Se llevó a cabo un análisis Western
blot de disociación de FLICE y PARP tal como se describe en la
Figura 2B.
La Figura 5C muestra la inducción de Bax y
Bcl-X_{s}. Las células de neuroblastoma
SH-EP se trataron con 10 \mug/ml de ácido
betulínico durante los tiempos indicados. Cuarenta \mug de
proteína por pista, aislados de lisis celulares, se separaron
mediante SDS-PAGE 12%. La inmunodetección de Bax,
Bcl-x y Bcl-2 se realizó mediante
anticuerpo policlonal anti-Bax de conejo, anticuerpo
policlonal anti-Bcl-x de conejo y
anticuerpo monoclonal anti-Bcl-2 de
ratón utilizando ECL. Como control positivo para expresión de
Bcl-2 se utilizaron células KM3 no tratadas.
La Figura 5D muestra la falta de acumulación de
p53 durante la apoptosis inducida por ácido betulínico. Las células
de neuroblastoma SH-EP se trataron con 10 \mug/ml
de ácido betulínico durante los tiempos indicados o con 0,5
\mug/ml de doxorrubicina durante 12 h. Cuarenta \mug de proteína
por pista, aislados de lisis celulares, se separaron mediante
SDS-PAGE 12%. La inmunodetección de p53 se llevó a
cabo mediante anticuerpo monoclonal anti-p53 de
ratón utilizando ECL.
Recientemente se ha informado de que
Bcl-2 y Bcl-X_{L} participan en el
mantenimiento de la viabilidad celular previniendo la pérdida de
potencial de membrana mitocondrial (Kroemer y col., 1997,
Immunol. Today 18: 44-51). La sobreexpresión
de Bcl-2 y Bcl-X_{L} inhibió
fuertemente la ruptura de \Delta\Psi_{m} y la hiperproducción
de ROS (Figura 5A) y bloqueó la disociación de FLICE y PARP (Figura
5B), lo que apoya adicionalmente la hipótesis de que hay
alteraciones mitocondriales que pueden estar relacionadas con la
activación de caspasas. Además, proteínas relacionadas con
Bcl-2 proapoptósicas, tales como Bax y
Bcl-X_{s}, se regularon después de incubación con
ácido betulínico, mientras que los niveles de expresión de
Bcl-2 y Bcl-X_{L} no resultaron
afectados por el tratamiento con ácido betulínico (Figura 5C). Ya
se ha demostrado previamente que la p53 participa en el proceso de
apoptosis inducida por fármacos después del deterioro de ADN y puede
actuar como un activador transcripcional directo del gen bax
(Lowe y col., 1994, Science (Washington DC), 266:
807-810; Miyashita y col., 1995, Cell 80:
293-299).
Sin embargo, ninguna acumulación de proteína p53
de tipo "salvaje" se incrementó fuertemente después del
tratamiento de células SH-EP con doxorrubicina
(Figura 5D). Estos hallazgos indican que la apoptosis mediada por
ácido betulínico y la regulación de Bax tuvo lugar
independientemente de la proteína p53 en células de
neuroblastoma.
La Figura 6A muestra la inducción de apoptosis
mediante ácido bongkrékico en células de neuroblastoma resistentes a
CD95 y a la doxorrubicina. Células de neuroblastoma
SH-EP (\blacksquare), células
SH-EP^{CD95R} resistentes a CD95
(
\sqsqsq) se trataron con 10 \mug/ml de ácido bongkrékico o 0,5 \mug/ml de doxorrubicina durante 72 h. La apoptosis específica se determinó y calculó tal como se describe en la leyenda de la Figura 1A. Cada columna corresponde al promedio de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las Sds fueron inferiores a un 10%.
La Figura 6B muestra la disociación de FLICE y
PARP en células sensibles al ácido bongkrékico; las células [células
de neuroblastoma resistentes a CD95
(SH-EP^{CD95R}), neuroblastoma resistente a la
doxorrubicina (SH-EP^{DoxoR}), meduloblastoma
(Daoy), sarcoma de Ewing (A17195), carcinoma de mama
(MCF-7), carcinoma de colon (HT-29),
carcinoma de pulmón de células pequeñas (H-146), y
carcinoma celular renal (KTCTL-26)] se dejaron sin
tratar (-) o se trataron con 10 \mug/ml de ácido bongkrékico
durante 24 h (+). Cuarenta \mug de proteína por pista, aislados
de lisis celulares, se separaron mediante SDS-PAGE
12%. Se llevó a cabo un análisis Western blot de disociación de
FLICE y PARP tal como se describe en la leyenda de la Figura 2B.
Dado que el mecanismo molecular de la muerte
inducida por ácido bongkrékico parecía ser diferente de la
activación de CD95-L/interactivación de receptor
inducida por otros agentes citotóxicos convencionales, se planteó si
el ácido betulínico podría superar o no la resistencia a los
fármacos de células tumorales. Las células SH-EP
parentales y las líneas celulares variantes resistentes a
anti-CD95 o doxorrubicina respondían al ácido
betulínico, mientras que las células resistentes a
anti-CD95 y doxorrubicina eran parcialmente
resistentes a la doxorrubicina (Figura 6A). Además, la incubación
con ácido betulínico condujo a la disociación de FLICE y PARP en
células de neuroblastoma parcialmente resistentes (Figura 6B). Estos
hallazgos muestran que el ácido betulínico medió en la apoptosis en
células SH-EP resistentes a CD95 y doxorrubicina
independientemente del sistema CD95 y via activación de
caspasas. Además, también se procesaron FLICE y PARP en otras líneas
celulares tumorales sensibles al ácido betulínico, como
meduloblastoma (Daoy) y sarcoma de Ewing (A17/95), pero no en
células tumorales resistentes al ácido betulínico
(MCF-7, HT-29, H-146
y KTTL-26; Figura 6B).
Este ejemplo muestra que el ácido betulínico es
un agente citotóxico que activa la apoptosis mediante un efecto
directo en las mitocondrias. En mitocondrias aisladas, el ácido
betulínico induce dilinealmente la pérdida de potencial
transmembrana independiente de una caspasa inhibible por
zVAD-fmk. Ésta es inhibida por ácido bongkrékico, un
agente que estabiliza el complejo de poros de transición de
permeabilidad. Las mitocondrias sometidas a ácido betulínico
indujeron la disociación de caspasa-8
(FLICE/MACH/Mch5) y caspasa-3 (CPP32/YAMA) mediada
por transición de permeabilidad en un sistema libre de células. Los
factores solubles tales como citocromo c o factor inductor de
apoptosis (AIF) liberados en las mitocondrias tratadas con ácido
betulínico son suficientes para la disociación de caspasas y la
fragmentación nuclear. La adición de citocromo c a extractos
citosólicos condujo a la disociación de caspasa-3,
pero no de caspasa-8. No obstante, sobrenadantes de
mitocondrias, que han experimentado transición de permeabilidad, y
AIF parcialmente purificado activan tanto la
caspasa-8 como la caspasa-3 en
extractos citosólicos y son suficientes para activar
caspasa-8 recombinante. Estos hallazgos muestran que
la inducción de transición de permeabilidad mitocondrial es
suficiente para activar por sí misma el programa de apoptosis
completa y que algunos fármacos citotóxicos como el ácido betulínico
pueden inducir la apoptosis a través de un efecto directo en la
mitocondria.
El ácido betulínico (Sigma, Deisenhofen,
Alemania) se obtuvo como sustancia pura y se disolvió en
dimetilsulfóxido.
La línea celular de neuroblastoma humano SHEP fue
proporcionada amablemente por M. Schwab (German Cancer Research
Center, Heidelberg, Alemania) y se mantuvo en cultivo monocapa en
matraces de cultivo tisular de 75 cm^{2} (Falcon, Heidelberg,
Alemania) en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Eggenstein,
Alemania) suplementado con FCS 10% inactivado por calor (Conco,
Wiesbaden, Alemania), 10 mM HEPES, pH 7,4 (Biochrom, Berlín,
Alemania), 100 U/ml de penicilina (Life Technologies, Inc.), 100
\mug/ml de estreptomicina (Life Technologies, Inc.) y 2 mM de
L-glutamina (Biochrom), y se incubó a 37ºC en
aire(95%)/CO_{2}(5%). Se cultivaron células de
neuroblastoma SHEP transfectadas establemente con
bcl-2, Bcl-X_{L} o control de
vector en medio mínimo Eagle de Dulbecco (Life Technologies, Inc.)
que contenía 500 \mug/ml G418 (Geneticin, Life Technologies,
Inc.). Véase Dole y col., 1994, Cancer Res. 54:
3253-3259; Dole y col., Cancer Res.
55: 2576-2582.
Se incubaron células con ácido betulínico durante
los tiempos indicados y se cosecharon por tripsinización, utilizando
tripsina 0,05% y EDTA 0,02% sin Ca^{2+} y Mg^{2+} (Life
Technologies, Inc.). La cuantificación de la fragmentación de ADN se
llevó a cabo mediante análisis FACS de núcleos teñidos con yoduro de
propidio tal como ha descrito previamente en Nicoletti y
col., 1991, J. Immunol. Methods 139:
271-279, utilizando software CELLQuest (Becton
Dickinson, Heidelberg, Alemania).
El tripéptido inhibidor de caspasas de amplio
espectro zVAD-fmk (Enzyme Systems Products, Dublin,
EEUU) se utilizó en una concentración de 60 \muM y el ácido
bongkrékico inhibidor específico mitocondrial se empleó en una
concentración de 50 \muM (proporcionado amablemente por el Dr.
Duine, University of Delft, Delft, Holanda).
Las células se sometieron a lisis durante 30
minutos, a 4ºC, en PBS con Triton X 0,5% (Serva, Heidelberg,
Alemania) y 1 mM de PMSF (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y a
continuación se centrifugaron a alta velocidad. Las proteínas de
membrana se eluyeron en un tampón que contenía glicina 0,1 M, pH 3,0
y 1,5 M Tris, pH 8,8. La concentración proteínica se ensayó
utilizando ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL). Cuarenta
\mug de proteína por pista se separaron mediante
SDS-PAGE 12% o 15% y se sometieron a
electrotransferencia sobre nitrocelulosa (Amersham, Braunschweig,
Alemania). Mediante tinción roja de Ponceau de membranas se controló
una carga proteínica igualitaria. Después de bloqueo durante 1 h en
PBS suplementado con BSA 2% (Sigma) y Tween 20 0,1% (Sigma), se
llevó a cabo inmunodetección de caspasa-3 y
caspasa-8, PARP y proteína citocromo c utilizando
C15 mAb anti-caspasa-8 de ratón
(Scaffidi y col., 1997, J. Biol. Chem. 272:
26953-26958, dilución 1:5 de sobrenadante de
hibridoma), mAb específico
anti-caspasa-3 de ratón (1:1.000,
Transduction Laboratories, Lexington, KY), anticuerpo policlonal
anti-PARP de conejo (1:10.000, Enzyme Systems
Products) o mAb anti-citocromo c de ratón (1:5.000,
PharMingen, San Diego, CA). Para la detección se utilizó IgG
anti-ratón de cabra o IgG
anti-conejo de cabra (1:5.000, Santa Cruz
Biotechnology) seguido de ECL (Amersham).
Para el aislamiento de mitocondrias, las células
(3\cdot10^{5} por muestra) se lavaron dos veces con PBS helado
y se resuspendieron con cinco volúmenes de tampón A (50 mM Tris, 1
mM EGTA, 5 mM 2-mercaptoetanol, 0,2% BSA, 10 mM
KH_{2}PO_{4}, pH 7,6, 0,4 M sacarosa) y se dejaron hinchar sobre
hielo durante 20 minutos. Las células se homogeneizaron con 30
pasadas de un homogeneizador Teflon y se centrifugaron a 10.000 g
durante 10 minutos a 4ºC. Las pellas resultantes se resuspendieron
en el tampón B (10 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,2, 0,3 mM manitol, 0,1%
BSA). Las mitocondrias se separaron mediante un gradiente de
sacarosa (capa inferior: 1,6 M sacarosa, 10 mM KH_{2}PO_{4}, pH
7,5, 0,1% BSA; capa superior: 1,2 M sacarosa, 10 mM
KH_{2}PO_{4}, pH 7,5, 0,1% BSA). Las interfases que contenían
las mitocondrias se lavaron con tampón B a 18.000 g durante 10
minutos a 4ºC y las pellas mitocondriales resultantes se
resuspendieron en tampón B. Para la preparación de extractos
citosólicos, las células (1\cdot10^{8} por muestra) se lavaron
dos veces con PBS helado, se resuspendieron con un volumen de tampón
A y se dejaron hinchar sobre hielo durante 20 minutos. Las células
se homogeneizaron con 30 pasadas de un homogeneizador Dounce y se
centrifugaron a 15.000 g durante 15 minutos a 4ºC. La concentración
proteínica de las mitocondrias o de los extractos citosólicos se
determinó mediante el método de Bradford (Bio-Rad).
Para el aislamiento de los núcleos, las células se lavaron dos veces
en PBS helado, se resuspendieron en 10 volúmenes de tampón C (10
mM PIPES, pH 7,4, 10 mM KC1, 2 mM MgCl_{2}, 1 mM DDT, 1 mM PMSF,
10 \muM citocalasina B), se dejaron hinchar sobre hielo durante 20
minutos y se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Teflon. Los
productos homogéneos se dispusieron en capas sobre sacarosa 30% en
tampón C y se centrifugaron a 800 g durante 10 minutos. Las pellas
nucleares resultantes se resuspendieron en tampón C y se lavaron
tres veces. Los núcleos se almacenaron a -80ºC en alícuotas de
10^{8} núcleos/ml hasta su utilización. Se preparó sobrenadante
mitocondrial con contenido de AIF de acuerdo con la descripción de
Susin y col., 1997, J. Exp. Med. 186:
5-37 y Susin y col., 1996, J. Exp.
Med. 184: 1331-41.
Para determinar la fragmentación nuclear, se
incubaron núcleos (10^{3}/\mul) con mitocondrias (1
\mug/\mul) en tampón D (10 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl, 2 mM
MgCl_{2}, 5 mM EGTA, 1 mM DDT, 2 mM ATP, 10 mM fosfocreatina, 50
\mug/ml creatinaquinasa, 10 \muM citocalasina B) durante 2 h, a
37ºC. Los núcleos se tiñeron con yoduro de propidio (10
\mug/\mul) y se analizaron mediante citometría de flujo. Para
determinar la activación de caspasas se incubaron extractos
citosólicos (2 \mug/\mul) con mitocondrias (1 \mug/\mul),
citocromo c (0,1-100 \muM) o sobrenadante
mitocondrial con contenido de AIF (0,5 \mug/\mul) en tampón D
durante 2 h, a 37ºC. Se preparó AIF parcialmente purificado (libre
de citocromo c) tal como se ha descrito anteriormente (0,5 mg/ml,
Susin y col., 1997, J. Exp. Med. 186:
5-37; Susin y col., 1996, J. Exp.
Med. 184: 1331-41). Las proteínas se separaron
mediante SDS-PAGE 15% y se llevó a cabo un
análisis Western blot tal como se ha descrito más arriba. Para
confirmar la igual carga de proteína mitocondrial, todos los
Western blot también se desarrollaron con un anticuerpo dirigido
contra un antígeno mitocondrial de 60 kDa (datos no mostrados).
Se trataron mitocondrias (5\cdot10^{5}/ml)
con 10 \mug/ml de ácido betulínico durante 30 minutos, se
incubaron con yoduro de 3,3'-dihexiloxacarbocianuro
(DiOC_{6}(3), 40 nM, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)
durante 15 minutos, a 37ºC y se analizaron en un citómetro de flujo
(FACS Vantage, Becton Dickinson). Como control, las células se
trataron con el agente de desacoplamiento carbonilcianuro de
m-clorofenilhidrazona (mCICCP, 200 \muM,
Sigma).
Se llevó a cabo el ensayo de traducción in
vitro y disociación in vitro de
caspasa-8 tal como se ha descrito previamente en
Medema y col., 1997, EMBO J. 16,
2794-2804.
Se incubaron mitocondrias aisladas con ácido
betulínico y se tiñeron con el colorante DiOC_{6}(3) para
evaluar el potencial de membrana mitocondrial (Figura 7). Las
mitocondrias aisladas de células SHEP transfectadas con
Bcl-2 o Bcl-X_{L}, o sólo con un
vector resistente a la neomicina, se dejaron sin tratar (control) o
se trataron con 10 \mug/ml de ácido betulínico durante 30 minutos,
en presencia o ausencia de 50 \muM de ácido bongkrékico o 60 pM
zVAD-fmk. Como control positivo se utilizaron 5 mM
de atractilósido, un activador mitocondrial directo. El
\Delta\Psi_{m} se determinó tiñendo mitocondrias con el
fluorocromo DiOC_{6}(3). La línea discontinua del
Histograma 1 indica el perfil de tinción obtenido en presencia del
agente de disipación de \Delta\Psi_{m} mCICCP.
Tal como muestra la Figura 7, mitocondrias
aisladas de células SHEP de tipo "salvaje" o de células
transfectadas sólo con un vector sufrieron una pérdida del
\Delta\Psi_{m} con 30 mm de tratamiento con ácido betulínico.
La disipación de \Delta\Psi_{m} inducida por ácido betulínico se
inhibió mediante ácido bongkrékico, un ligando del translocador de
nucleótido adenina (ANT), que inhibe la transición de permeabilidad
(PT), y el ácido betulínico no tuvo ningún efecto en mitocondrias
aisladas de células que habían sido transfectadas con
Bcl-2 o Bcl-X_{L}L (Figura 7),
dos inhibidores endógenos de PT. Sin embargo, el inhibidor de
caspasa zVAD-fmk no interfirió en la pérdida de
\Delta\Psi_{m} inducida por ácido betulínico (Figura 7). Por
consiguiente, el ácido betulínico puede activar dilinealmente la
transición de permeabilidad mitocondrial sin implicar una caspasa
inhibible por zVAD-fmk.
La Figura 8 muestra la fragmentación nuclear
después de coincubación de núcleos aislados con mitocondrias
aisladas en presencia de ácido betulínico. Las mitocondrias aisladas
de células SHEP, transfectadas con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o con sólo un vector resistente a la
neomicina, se incubaron durante 6 h con núcleos y
0,1-10 \mug/ml de ácido betulínico (Figura 8A) o 5
mM de atactilósido (Figura 8B) en presencia o ausencia de 50 \muM
de ácido bongkrékico o 60 \muM zVAD-fmk. Como
control se utilizaron núcleos incubados bien con mitocondrias de
células de vector sólo o bien con ácido betulínico. La apoptosis
nuclear se determinó mediante análisis FACS del contenido de ADN
teñido con yoduro de propidio.
Las células SHEP transfectadas con
Bcl-2 o Bcl-X_{L} o sólo con un
vector resistente a la neomicina se trataron con 10 \mug/ml de
ácido betulínico o 5 mM de atractilósido durante
6-24 h (Figura 8C). Se aislaron mitocondrias y se
incubaron con núcleos en presencia o ausencia de 50 \muM de ácido
bongkrékico o 60 \muM zVAD-fmk. Como control se
utilizaron núcleos incubados bien con mitocondrias de células de
vector sólo o bien con ácido betulínico. La apoptosis nuclear se
determinó mediante análisis FACS del contenido de ADN teñido con
yoduro de propidio.
En este procedimiento experimental, la
combinación de mitocondrias de células de control Neo con núcleos y
ácido betulínico condujo a una fragmentación del ADN nuclear (Figura
8A). La eliminación de las mitocondrias de esta mezcla anuló el
efecto del ácido betulínico, indicando que se requerían mitocondrias
para la apoptosis nuclear inducida por ácido betulínico en este
sistema libre de células. Las mitocondrias sin adición de ácido
betulínico no tuvieron ningún efecto en los núcleos. No se observó
ninguna fragmentación de ADN al utilizar una combinación de
mitocondrias y núcleos a los que se habían añadido dosis
apoptogénicas de fármacos citotóxicos estándar, tales como
doxorrubicina, cisplatino o etopósido (datos no mostrados). En
cambio, el atractilósido (Atra), que activa específicamente la PT
mitocondrial mediante enlace con el translocador del nucleótido
adenina en la membrana mitocondrial interna (Kromer y col.,
1997, Immunol. Today, 18: 44-51) tuvo el
mismo efecto que el ácido betulínico (Figura 8B). La fragmentación
de núcleos inducida por ácido betulínico se inhibió mediante
zVAD-fmk, mediante ácido bongkrékico o cuando las
mitocondrias se habían obtenido a partir de células, mediante
sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} (Figura 8A). La fragmentación nuclear
también se pudo inducir mediante mitocondrias aisladas de células
pretratadas con ácido betulínico (Figura 8C). Este efecto se bloqueó
de nuevo mediante zVAD-fmk, mediante ácido
bongkrékico o mediante sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} (Figura 8C). Estos hallazgos indican
que el ácido betulínico tiene un efecto directo y específico en las
mitocondrias que conduce a la fragmentación de los núcleos y a la
degradación apoptósica del ADN.
La Figura 9A muestra que las caspasas son
disociadas por mitocondrias que experimentan PT. Las células SHEP
transfectadas con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o sólo un vector resistente a la
neomicina se trataron con 10 \mug/ml de ácido betulínico durante
16 h. Se aislaron las mitocondrias y se incubaron con extractos
citosólicos durante 6 h en presencia o ausencia de
zVAD-fmk 60 \muM (tabla izquierda, células). Como
alternativa, mitocondrias aisladas de células no tratadas se
incubaron con 10 \mug/ml de ácido betulínico o 5 mM de
atractilósido junto con extractos citosólicos, durante 6 h, en
presencia o ausencia de zVAD-fmk 60 \muM (tabla
derecha, mitos, Atra). Como control se utilizaron extractos
citosólicos incubados con mitocondrias aisladas de células no
tratadas o con mitocondrias no tratadas. 40 \mug de proteína por
pista aislados de lisis celulares se separaron mediante
SDS-PAGE 15%. La inmunodetección de
caspasa-3, caspasa-8 y proteína PARP
se llevó a cabo mediante mAb
anti-caspasa-3 de ratón, mAb
anti-caspasa-8 de ratón, anticuerpo
policlonal anti-PARP de conejo y ECL.
La Figura 9B muestra la cinética de la
disociación de caspasas inducida por ácido betulínico en un sistema
libre de células. Las células SHEP se trataron con 10 \mug/ml de
ácido betulínico durante los tiempos indicados. Las mitocondrias se
aislaron e incubaron con extractos citosólicos durante 6 h. Se
llevó a cabo un análisis Western blot tal como se describe más
arriba.
La incubación de extractos citoplásmicos con
mitocondrias aisladas de células tratadas con ácido betulínico
condujo al procasiemto de caspasa-6,
caspasa-3 y sustrato prototipo PARP (Figura 9A,
mitocondria). La disociación de caspasas se bloqueó en presencia de
zVAD-fmk o cuando se utilizaron mitocondrias de
células de sobreexpresión Bcl-2 o
Bcl-X_{L} (Figura 9A). Similarmente, cuando se
utilizaron mitocondrias tratadas con ácido betulínico se observó
disociación de caspasas (Figura 9A, mitos). El tratamiento de
mitocondrias aisladas con Atra también condujo a la activación de
caspasas (Figura 9A). Además, mitocondrias aisladas de células
tratadas con ácido betulínico indujeron la disociación de
caspasa-8, caspasa-3 y PARP
dependiendo del tiempo, que se pudo detectar por primera vez después
de 12 h del tratamiento con ácido betulínico (Figura 9B). Se llevó a
cabo un ensayo de disociación in vitro para ver si el ácido
betulínico podía inducir dilinealmente la disociación de caspasas.
Después de incubar con ácido betulínico la caspasa-8
o caspasa-3 radiomarcada y traducida in vitro
no se detectó ningún producto de disociación (datos no mostrados),
lo que indicaba que el ácido betulínico no disocia dilinealmente
caspasa-8 o caspasa-3. Estos
hallazgos sugieren que la activación de caspasa inducida por ácido
betulínico está mediada por PT mitocondrial.
La Figura 10A muestra que uno o más factores
solubles liberados de las mitocondrias que experimentan PT inducen
la disociación de caspasas. Mitocondrias aisladas de células SHEP
transfectadas con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o sólo con un vector resistente a la
neomicina se trataron con 10 \mug/ml de ácido betulínico o 5 mM
de atractilósido durante 0,5 h en presencia o ausencia de 50 \muM
de ácido bongkrékico o 60 \muM de zVAD-fmk. Los
sobrenadantes mitocondriales obtenidos mediante centrifugación a
alta velocidad se incubaron con extractos citosólicos durante 6 h a
37ºC. Como control se utilizaron extractos citosólicos incubados con
sobrenadantes de mitocondrias no tratadas. Se llevó a cabo un
análisis Western blot tal como se describe para la Figura 9A.
La Figura 10B muestra que uno o más factores
solubles liberados de mitocondrias que experimentan PT inducen la
fragmentación nuclear. Mitocondrias aisladas de células SHEP
transfectadas con Bcl-2, Bcl-X_{L}
o un sólo vector resistente a la neomicina se trataron con 10
\mug/ml de ácido betulínico o 5 mM de atractilósido durante 0,5 h
en presencia o ausencia de 50 \muM de ácido bongkrékico o 60
\muM de zVAD-fmk. Los sobrenadantes mitocondriales
obtenidos mediante centrifugación a alta velocidad se incubaron con
núcleos durante 2 h a 37ºC.
Como control se utilizaron núcleos incubados con
sobrenadantes de mitocondrias no tratadas. La apoptosis nuclear se
determinó mediante análisis FACS del contenido de ADN teñido con
yoduro de propidio.
La Figura 10C muestra la liberación del citocromo
c inducida por ácido betulínico. Las mitocondrias aisladas de
células SHEP transfectadas con Bcl-2,
Bcl-X_{L} o sólo con un vector resistente a la
neomicina (Neo) se trataron con 10 \mug/ml de ácido betulínico. 5
\mug de proteína por pista se separaron mediante
SDS-PAGE 15%. La inmunodetección de citocromo c se
realizó mediante mAb anti-citocromo c de
ratón y BCL.
Al añadir sobrenadantes de mitocondrias tratadas
con ácido betulínico a los extractos citosólicos se disociaron
caspasa-8, caspasa-3 y PARP (Figura
10A). El procesado de caspasas se inhibió mediante ácido
bongkrékico, zVAD-fmk o en mitocondrias procedentes
de células de sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} (Figura 10A). Además, los sobrenadantes
de mitocondrias tratadas con ácido betulínico indujeron la
fragmentación del ADN y este efecto también se bloqueó en presencia
de ácido bongkrékico, zVAD-fmk o mediante
sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} (Figura 10B). Similarmente, cuando se
empleó Atra en lugar de ácido betulínico se observó activación de
caspasa y fragmentación nuclear (Figura 10A,10B). Esto indica que el
ácido betulínico activa la liberación mitocondrial de uno o más
factores apoptogénicos solubles. En consecuencia, el ácido
betulínico indujo dilinealmente la liberación de citocromo c en
mitocondrias aisladas (Figura 10C). Esta liberación de citocromo c
activada por ácido betulínico se bloqueó mediante ácido bongkrékico
o en mitocondrias de células de sobreexpresión de
Bcl-2 o Bcl-X_{L} (Figura
10C).
La Figura 11A muestra que el citocromo c
induce la disociación de caspasa-3. Se incubaron
extractos citosólicos de células SHEP con citocromo c
0,1-100 \muM. La inmunodetección de
caspasa-3, caspasa-8 y PARP se
llevó a cabo tal como se describe en la Figura 9A.
La Figura 11B muestra que el AIF induce la
disociación tanto de caspasa-8 como de
caspasa-3. Los extractos citosólicos de células SHEP
transfectadas con un único vector resistente a la neomicina (Neo) o
Bcl-2 se incubaron con AIF parcialmente purificado.
La inmunodetección de caspasa-3,
caspasa-8 y PARP se llevó a cabo tal como se
describe para la Figura 9A.
La Figura 11C muestra que el AIF disocia
caspasa-8 recombinante. La
caspasa-8, marcada con ^{35}S y traducida in
vitro, se incubó con AIF parcialmente purificado durante 16 h,
a 4ºC, en presencia o ausencia de 60 \muM
zVAD-fmk. Los productos de reacción se separaron
mediante SDS-PAGE 15% y se visualizaron por
autorradiografía. La posición de migración de una
caspasa-8 truncada N-terminal está
marcada con una flecha abierta.
Como muestra la Figura 11A, el citocromo c activó
el procesado proteolítico de caspasa-3 en sus
subunidades activas y provocó la disociación de PARP mediada por
caspasa (Figura 11A). Sin embargo, la adición de citocromo c
a extractos citosólicos no indujo disociación de
caspasa-8 (Figura 11A). En cambio, cuando se
utilizaron sobrenadantes mitocondriales o AIF parcialmente
purificado (libre de citocromo c) en lugar de citocromo c,
tanto la caspasa-3 como la caspasa-8
se disociaron en extractos citosólicos (Figura 11B). Además, el AIF
parcialmente purificado indujo la disociación de
caspasa-8 radiomarcada y traducida in vitro
en las subunidades p18 activas (Figura 11C). Estos hallazgos
demuestran que las distintas proteínas mitocondriales liberadas por
ácido betulínico difieren en su capacidad para activar las
diferentes caspasas. La disociación de caspasa-8
"corriente abajo" de mitocondrias parece requerir la actividad
de AIF.
La apoptosis mediada por fármacos anticancerosos
puede implicar la activación de sistemas ligando/receptor inductores
de muerte tales como CD95 (APO-1/Fas), la
disociación de caspasas y la perturbación de las funciones
mitocondriales. En este ejemplo se investigó la secuencia de estos
sucesos en células de neuroblastoma SHEP transfectadas con
Bcl-2 o Bcl-X_{L} utilizando dos
fármacos diferentes, a saber: doxorrubicina (doxorrubicina), que
activa el sistema CD95/CD95-L, y ácido betulínico,
que no incrementa la expresión de CD95 o su ligando y que, como se
muestra aquí, se dirige directamente a las mitocondrias.
La apoptosis inducida por los dos fármacos se
inhibió mediante sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o mediante ácido bongkrékico, un agente
que estabiliza la función barrera de la membrana mitocondrial, lo
que sugiere que las mitocondrias desempeñan un papel crítico.
Después del tratamiento con doxorrubicina, el incremento de la
expresión de CD95/CD95-L y la activación de
caspasa-8 no se bloqueó con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} y se detectó en células que todavía
presentaban un potencial transmembrana mitocondrial normal (células
\Delta\Psi_{m}^{alto}). En marcado contraste, después del
tratamiento con ácido betulínico, la activación de
caspasa-8 tuvo lugar de forma inhibible por
Bcl-2 o Bcl-X_{L} y quedó
limitada a las células que habían perdido su potencial
transmembrana mitocondrial (células \Delta\Psi_{m}^{bajo}).
Las mitocondrias de células tratadas con doxorrubicina o ácido
betulínico indujeron la disociación tanto de
caspasa-8 como de caspasa-3 en
extractos citosólicos. Por consiguiente, la activación de
caspasa-8 puede tener lugar "corriente arriba"
o "corriente abajo" de las mitocondrias, dependiendo del
estímulo iniciador de la apoptosis. A diferencia de la
caspasa-8, la disociación de
caspasa-3 o PARP siempre estaba restringida a
células con \Delta\Psi_{m}^{bajo}, "corriente abajo" del
punto de verificación de apoptosis controlado por
Bcl-2 o Bcl-X_{L}. El citocromo c,
liberado de las mitocondrias que experimentan transición de
permeabilidad (PT), activó la caspasa-3 pero no la
caspasa-8 en un sistema libre de células. Sin
embargo, el factor inductor de apoptosis (AIF) activó las dos
caspasas, lo que indicaba que el mecanismo de activación de la
caspasa-8 era diferente del mecanismo de activación
de la caspasa-3.
La doxorrubicina (Farmitalia, Milán, Italia) y el
ácido betulínico (Sigma, Deisenhofen, Alemania) se obtuvieron como
sustancias puras y se disolvieron en agua esterilizada
(doxorrubicina) o en dimetilsulfóxido (ácido betulínico).
La línea celular de neuroblastoma humano SHEP fue
proporcionada amablemente por el Profesor M. Schwab (German Cancer
Research Center, Heidelberg, Alemania). Las células se mantuvieron
en cultivo monocapa en matraces de cultivo tisular de 75 cm^{2}
(Falcon, Heidelberg, Alemania) en medio RPMI 1640 (Life
Technologies, Inc., Eggenstein, Alemania) suplementado con FCS 10%
inactivado por calor (Conco, Wiesbaden, Alemania), 10 mM HEPES, pH
7,4 (Biochrom, Berlín, Alemania), 100 U/ml de penicilina (Life
Technologies, Inc.), 100 \mug/ml de estreptomicina (Life
Technologies, Inc.) y 2 mM de L-glutamina
(Biochrom), y se incubaron a 37ºC en
aire(95%)/CO_{2}(5%). Se cultivaron células de
neuroblastoma SHEP transfectadas establemente con
Bcl-2, Bcl-X_{L} o control de
vector en medio mínimo Eagle de Dulbecco (Life Technologies, Inc.)
que contenía 500 \mug/ml de G418 (Geneticin, Life Technologies,
Inc.: Dole y col., 1994, Cancer Res. 54:
3253-3259; Dole y col., Cancer Res.
55: 2576-2582).
Se incubaron células durante los tiempos
indicados con doxorrubicina, ácido betulínico o
anti-APO-1 y se cosecharon por
tripsinización utilizando tripsina 0,05% y EDTA 0,02% sin Ca^{2+}
ni Mg^{2+} (Life Technologies, Inc.). La cuantificación de la
fragmentación del ADN se llevó a cabo mediante análisis FACS de
núcleos teñidos con yoduro de propidio tal como se ha descrito
previamente en Nicoletti y col., J. Immunol. Methods
139: 271-279, utilizando software CELLQuest (Becton
Dickinson, Heidelberg, Alemania).
El tripéptido inhibidor de amplio espectro de
caspasas zVAD-fmk (Enzyme Systems Products, Dublin,
EEUU) se utilizó en una concentración de 60 \muM y el ácido
bongkrékico inhibidor específico de mitocondrias se empleó en una
concentración de 50 \muM (proporcionado amablemente por el Dr.
Duine, University of Delf, Delf, Holanda).
Las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal
IgGI anti-APO-1 (CD95) (moab) (1
\mug/ml; Trauth y col., 1989, Science 245:
301-305) durante 45 minutos, a 4ºC, seguido de
IgG-FITC anti-ratón de cabra
(Immunotech., Hamburgo, Alemania) durante 30 minutos, a 4ºC. El
anticuerpo IgGI FII23 se utilizó como un anticuerpo isotipo de no
unión correspondiente para controlar la unión no específica.
Se preparó ARN completo utilizando el kit Qiagen
Total RNA (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN se convirtió en ADNc
mediante transcripción inversa y se amplificó durante 38 ciclos
mediante PCR en un termociclador (Stratagene, Heidelberg, Alemania)
utilizando el kit Gene Amplification RNA-PCR (Perkin
Elmer, Branchburg, NJ) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Un fragmento de CD95-L de 500 pares de
bases se amplificó utilizando cebador 5' ATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGA
3' (SEC ID Nº 1) y 5' CCAGAGAGAGCTCAGATACGTTGAC 3' (SEC ID Nº 2) y
un fragmento de CD95 de 311 pares de bases se amplificó utilizando
el cebador 5' TCAAGGAATGCACACTCACCAGC (SEC ID Nº 3) y 5'
GGCTTCATTGACACCATTCTTTCG 3' (SEC ID Nº 4). La expresión de
\alpha-actina (MWG-Biotech,
Ebersberg, Alemania) se utilizó como un patrón de la integridad del
ARN y de igualdad de carga de gel. Los productos de reacción de PCR
se sometieron a 60 V durante 2 h en un gel de agarosa 1,5% teñido
con bromuro de etidio y se visualizaron mediante iluminación UV.
Las células se sometieron a lisis durante 30
minutos, a 4ºC, en PBS con Triton X 0,5% (Serva, Heidelberg,
Alemania) y PMSF 1mM (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y a continuación
se centrifugaron a alta velocidad. Las proteínas de membrana se
eluyeron en un tampón que contenía 0,1 M glicina, pH 3,0 y 1,5 M
Tris, pH 8,8. La concentración proteínica se ensayó utilizando ácido
bicinconínico (Pierce, Rockford, IL). 40 \mug de proteína por
pista se separaron mediante SDS-PAGE 12% o 15% y se
sometieron a electrotransferencia sobre nitrocelulosa (Amersham,
Braunschweig, Alemania). Mediante tinción roja de Ponceau de
membranas se controló la igualdad de la carga proteínica. Después
de bloqueo durante 1 h en PBS suplementado con BSA 2% (Sigma) y
Tween 20 0,1% (Sigma), se llevó a cabo la inmunodetección de
caspasa-3 y caspasa-8, PARP,
CD95-L, CD95 y proteína citocromo c utilizando C15
moab anti-caspasa-8 de ratón
(Scaffidi y col., 1997, J. Biol. Chem. 272:
26953-26958, dilución 1:5 de sobrenadante de
hibridoma), moab anti-caspasa-3
específico de ratón (1:1.000, Transduction Laboratories, Lexington,
KY), anticuerpo policlonal anti-PARP de conejo
(1:10.000, Enzyme Systems Products), moab
anti-CD95-L de ratón (1:5.000,
Transduction Laboratories), moab anti-CD95 de ratón
(1:1.000, Transduction Laboratories), o moab
anti-citocromo c de ratón (1:5.000, PharMingen, San
Diego, CA). Para la detección se utilizó IgG
anti-ratón de cabra o IgG
anti-conejo de cabra (1:5.000, Santa Cruz
Biotechnology) seguido de ECL (Amersham).
Para el aislamiento de mitocondrias, las células
(3\cdot10^{8} por muestra) se lavaron dos veces con PBS helado y
se resuspendieron con cinco volúmenes del tampón A (50 mM tampón
Tris, 1 mM EGTA, 5 mM 2-mercaptoetanol, BSA 0,2%, 10
mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,6, sacarosa 0,4 M) y se dejaron hinchar
sobre hielo durante 20 minutos. Las células se homogeneizaron con
30 pasadas de un homogeneizador Teflon y se centrifugaron a 4.000 g
durante 1 minuto, a 4ºC. Los sobrenadantes se centrifugaron
adicionalmente a 10.000 g durante 10 minutos, a 4ºC y las pellas
resultantes se resuspendieron en el tampón B (10 mM
KH_{2}PO_{4}, pH 7,2, 0,3 mM manitol, BSA 0,1%). Las
mitocondrias se separaron mediante gradiente de sacarosa (capa
inferior: sacarosa 1,6 M, 10 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,5, BSA 0,1%;
capa superior: sacarosa 1,2 M, 10 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,5, BSA
0,1%). Las interfases que contenían mitocondrias se lavaron con el
tampón B a 18.000 g durante 10 minutos, a 4ºC y las pellas
mitocondriales resultantes se resuspendieron en tampón B. Para la
preparación de extractos citosólicos, las células (1\cdot10^{8}
por muestra) se lavaron dos veces con PBS helado, se resuspendieron
con un volumen del tampón A y se dejaron hinchar sobre hielo durante
20 minutos. Las células se homogeneizaron con 30 pasadas de un
homogeneizador Dounce y se centrifugaron a 15.000 g durante 15
minutos a 4ºC. La concentración proteínica de las mitocondrias o de
los extractos citosólicos se determinó mediante el método Bradford.
Para el aislamiento de núcleos, las células se lavaron dos veces en
PBS helado, se resuspendieron en 10 volúmenes de tampón C (10 mM
Pipes, pH 7,4, 10 mM KCl, 2 mM MgCl_{2}, 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 10
\muM citocalasina B), se dejaron hinchar sobre hielo durante 20
minutos y se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Teflon. Los
productos homogéneos se dispusieron en capas sobre sacarosa 30% en
tampón C y se centrifugaron a 800 g durante 10 minutos. Las pellas
nucleares resultantes se resuspendieron en tampón C y se lavaron
tres veces. Los núcleos se almacenaron a -80ºC en alícuotas de
10^{8} núcleos/ml hasta su utilización. Se preparó sobrenadante
mitocondrial con contenido de AIF de acuerdo con la descripción
previa de Kroemer y col., 1997, Immunol. Today. 18:
44-51.
Para determinar la fragmentación nuclear se
incubaron núcleos (10^{3}/\mul) con mitocondrias (1
\mug/\mul) en tampón D (10 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl, 2 mM
MgCl_{2}, 5 mM EGTA, 1 mM DDT, 2 mM ATP, 10 mM fosfocreatina, 50
\mug/ml de creatina-quinasa, 10 \muM
citocalasina B) durante 2 h, a 37ºC. Los núcleos se tiñeron con
yoduro de propidio (10 \mug/\mul) y se analizaron mediante
citometría de flujo (Susin y col., 1997, Exp. Cell
Res. 236:397-403). Para determinar la
activación de caspasa se incubaron extractos citosólicos (2
\mug/\mul) con mitocondrias (1 \mug/\mul), citocromo
c (10 \muM) o sobrenadante mitocondrial con contenido de
AIF (0,5 \mug/\mul) en tampón D durante 2 h, a 37ºC. Las
proteínas se separaron mediante SDS-PAGE 15% y se
llevó a cabo un análisis Western blot tal como se ha descrito más
arriba.
\newpage
Para determinar el potencial de membrana
mitocondrial se incubaron células (5\cdot10^{5}/ml) con yoduro
de 3,3'-dihexiloxacarbocianuro
(DiOC_{6}(3), 40 nM, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)
durante 15 minutos, a 37ºC y se analizaron en un citómetro de flujo
(FACScan) (Zamzami y col., 1996, J. Exp. Med.
183:1533-44). Para la clasificación celular, las
células se tiñeron con DiOC_{6}(3) y se clasificaron en
células DiOC_{6}(3)^{alto} y células
DiOC_{6}(3)^{bajo} en un citofluorómetro (FACS
Vantage, Becton Dickinson). Como control, las células se trataron
con el agente de desacoplamiento carbonilcianuro de
m-clorofenilhidrazona (mCICCP, 200 \muM,
Sigma).
La figura 12 muestra la apoptosis inducida por
fármacos y la PT mitocondrial. Las Figuras A-C
muestran que la apoptosis inducida por doxorrubicina y ácido
betulínico depende de la PT mitocondrial y de la activación de
caspasas. Las células SHEP transfectadas con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o con sólo un vector resistente a la
neomicina (Neo) se trataron con 0,5 \mug/ml de doxorrubicina o 10
\mug/ml de ácido betulínico durante 48 h (A) o 24 h (B y C). Las
células transfectadas sólo con un vector resistente a la neomicina
(Neo) se trataron en presencia o ausencia de 50 \mum BA o 60
\mum zVAD-fmk. La apoptosis nuclear se determinó
mediante análisis FACS o analizando el contenido de ADN teñido con
yoduro de propidio en células intactas (A) o en un CFS incubando
núcleos aislados con mitocondrias de células tratadas cono
doxorrubicina o ácido betulínico (C). El \Delta\Psi_{m} se
determinó tiñendo células con el fluorocromo DiOC_{6}(3)
sensible al potencial (B).
La Figura 12D muestra que el ácido betulínico
induce directamente PT mitocondrial. Las mitocondrias aisladas de
células SHEP transfectadas con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o sólo un vector de resistencia a la
neomicina (Neo) se trataron con 10 \mug/ml de ácido betulínico
durante 0,5 h. Las células transfectadas sólo con un vector
resistente a la neomicina (Neo) se trataron en presencia o ausencia
de 50 \mum de ácido betulínico o 60 \mum
zVAD-fmk. El \Delta\Psi_{m} se determinó tiñendo
mitocondrias con el fluorocromo DiOC_{6}(3). La línea
discontinua del primer Histograma indica el perfil de teñido
obtenido en presencia del agente de disipación de
\Delta\Psi_{m} el carbonil cianuro
m-clorofenilhidrazona.
La apoptosis inducida por doxorrubicina y ácido
betulínico se analizó determinando la fragmentación nuclear y la
ruptura del \Delta\Psi_{m}. La doxorrubicina y el ácido
betulínico indujeron pérdida de \Delta\Psi_{m} y fragmentación
nuclear (Figuras 12A y B). Tanto las manifestaciones mitocondriales
como nucleares de la apoptosis se bloquearon mediante sobreexpresión
de Bcl-2 y Bcl-X_{L} (Figuras 12A
y B). Para determinar si la apoptosis estaba relacionada con la
apertura del poro de PT mitocondrial se ensayó el efecto del ácido
bongkrékico, un inhibidor específico de este poro. La adición de
ácido bongkrékico inhibió la fragmentación nuclear activada por
fármacos y la pérdida de \Delta\Psi_{m}, indicando que había
alteraciones mitocondriales relacionadas con la apertura de poros de
PT (Figuras 12A y B). En células tratadas con doxorrubicina, la
fragmentación nuclear y la pérdida de \Delta\Psi_{m} se
inhibieron mediante el inhibidor de caspasa de amplio espectro
zVAD-fmk (Figuras 12A y B). En cambio, el
zVAD-fmk sólo afectó a la fragmentación nuclear
inducida por ácido betulínico, pero no tuvo ningún efecto en la
disipación de \Delta\Psi_{m} inducida por ácido betulínico
(Figuras 12A y B). Para analizar si las alteraciones
mitocondriales inducidas por fármacos eran suficientes para
provocar la fragmentación nuclear, mitocondrias aisladas de células
tratadas con fármacos se incubaron con núcleos en un sistema libre
de células y se midió la pérdida de ADN nuclear mediante citometría
de flujo. Las mitocondrias de células tratadas con doxorrubicina o
ácido betulínico indujeron la fragmentación del ADN nuclear (Figura
12C). Este efecto se bloqueó mediante sobreexpresión de
Bcl-2 o Bcl-X_{L}, así como
mediante tratamiento de las células con zVAD-fmk o
ácido bongkrékico (Figura 12C). Tomados en conjunto, estos
experimentos sugieren que la apoptosis nuclear inducida por
doxorrubicina o ácido betulínico depende indistinguiblemente de la
PT mitocondrial y de la activación de caspasa. Sin embargo, el
mecanismo que conduce a la pérdida de \Delta\Psi_{m} depende de
qué agente anticanceroso se utilice. En el caso de la
doxorrubicina, requiere la activación de caspasas inhibibles por
zVAD-fmk. Por el contrario, el ácido betulínico
activa la disipación de \Delta\Psi_{m} independientemente de la
caspasa.
El ácido betulínico provocó una pérdida de
\Delta\Psi_{m} en mitocondrias aisladas (Figura 12D). Esta
pérdida de \Delta\Psi_{m} se inhibió mediante sobreexpresión de
Bcl-2 o Bcl-X_{L} o por ácido
bongkrékico (Figura 12D), indicando que la pérdida de
\Delta\Psi_{m} implicaba PT. Sin embargo, la disminución de
\Delta\Psi_{m} no se bloqueó mediante zVAD-fmk
(Figura 12D), lo que sugería que el ácido betulínico puede activar
PT a través de un efecto directo en las mitocondrias.
La Figura 13A muestra la inducción de
CD95-L. Las células SHEP transfectadas con
Bcl-2 o Bcl-X_{L} o con sólo un
vector resistente a la neomicina (Neo) se trataron (Pistas +) con
0,5 \mug/ml de doxorrubicina o 10 \mug/ml de ácido betulínico
durante 24 h. La expresión del ARNm de CD95-L se
determinó mediante RT-PCR. La expresión de
\alpha-actina se utilizó para controlar la
integridad del ARN y la igualdad de la carga de gel. Para el
análisis Western blot, 40 \mug de proteína procedentes de lisis
celulares por pista se separaron mediante SDS-PAGE
12%. La proteína CD95-L se detectó en una banda
M_{r} 37.000 mediante moab
anti-CD95-L de ratón y
quimioluminiscencia aumentada.
Las Figuras 14 B y C muestran la inducción de
CD95. Las células SHEP transfectadas con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} o con sólo un vector resistente a la
neomicina (Neo) se trataron (Pistas +) con 0,5 \mug/ml de
doxorrubicina o 10 \mug/ml de ácido betulínico durante 24 h. La
expresión de ARNm de CD95 se determinó mediante
RT-PCR. La expresión de
\alpha-actina se utilizó para controlar la
integridad de ARN y la igual carga de gel. Para el análisis Western
blot (B), 40 \mug de proteína procedentes de lisis celulares por
pista se separaron mediante SDS-PAGE 12%. La
inmunodetección de proteína CD95 se llevó a cabo mediante moab
anti-CD95 de ratón y quimioluminiscencia aumentada.
Para el análisis FACS de expresión de proteína CD95 (C), las células
se tiñeron con moab anti-APO-1 de
ratón seguido de anticuerpo IgG anti-ratón conjugado
con FITC y se analizaron mediante citometría de flujo. En tres
experimentos individuales se obtuvieron resultados similares.
Tanto la CD95-L como la CD95 se
indujeron a nivel de ARNm y de proteína en células de control
transfectadas con Neo y células de sobreexpresión de
Bcl-2 o Bcl-X_{L} (Figuras
13A-C). No se observaron diferencias significativas
con respecto a la cinética de la inducción de CD95-L
y CD95. También se observó un aumento similar en la expresión de
CD95 y CD95-L después del tratamiento con cisplatino
o VP-16, independientemente de la expresión de
Bcl-2 o Bcl-X_{L}. Estos hallazgos
sugieren que la regulación de CD95-L y CD95 después
del tratamiento con doxorrubicina se produce independientemente y
"corriente arriba" de las mitocondrias. En cambio, después del
tratamiento con ácido betulínico no se detectó en ningún momento
ninguna regulación de CD95-L o CD95 (Figuras 13A y
13B), lo que indicaba que el ácido betulínico activa la apoptosis
independientemente del sistema CD95-L/receptor.
La Figura 14A muestra que Bcl-2 y
Bcl-X_{L} bloquean la activación de caspasas
"corriente abajo". Las células SHEP transfectadas con
Bcl-2 o Bcl-X_{L} o con sólo un
vector resistente a la neomicina (Neo) se trataron (Pistas +) con
0,5 \mug/ml de doxorrubicina o 10 \mug/ml de ácido betulínico
durante 24 h. Se muestra el porcentaje de células tratadas o no
tratadas con su \Delta\Psi_{m}. 40 \mug de proteína por pista
aisladas de lisis celulares se separaron mediante
SDS-PAGE 15%. La inmunodetección de
caspasa-3, caspasa-8 y proteína PARP
se llevó a cabo mediante moab
anti-caspasa-3 de ratón, moab
anti-caspasa-8 de ratón, anticuerpo
policlonal anti-PARP de conejo y quimioluminiscencia
aumentada.
La Figura 14B muestra la relación temporal entre
la ruptura de \Delta\Psi_{m} y la disociación de caspasa. Las
células SHEP se trataron con 0,5 \mug/ml de doxorrubicina, 10
\mug/ml de ácido betulínico o 1 \mug/ml de
anti-APO-1 durante 18 h, se tiñeron
con DiOC_{6}(3) y se separaron en un citofluorómetro en
células que todavía tenían un \Delta\Psi_{m} normal
(\Delta\Psi_{m}^{alto}) y células que tenían un
\Delta\Psi_{m} modificado (\Delta\Psi_{m}^{bajo}). La
clasificación celular se realizó de acuerdo con las zonas de
células de \Delta\Psi_{m}^{alto} o células de
\Delta\Psi_{m}^{bajo} tal como se indica en los histogramas.
Se llevó a cabo un análisis Western blot de productos de lisis
celulares tal como se describe en la Figura 14A.
Al ser tratada con doxorrubicina, la
caspasa-8 se disoció en los productos intermedios
p43 y p41 y la subunidad p18 activa, independientemente de la
sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} (Figura 14A). En cambio, el procado
proteolítico de caspasa-3 y PARP se inhibió en
células transfectadas con Bcl-2 y
Bcl-X_{L} (Figura 14A). Utilizando cisplatino o
VP-16 como agentes quimioterapéuticos se obtuvieron
resultados similares. En cambio, cuando la apoptosis se activó
mediante ácido betulínico, el procesado tanto de
caspasa-8 como de caspasa-3 se
inhibió mediante Bcl-2 o
Bcl-X_{L}. Estos datos indican que la
caspasa-8 se disocia "corriente arriba" de un
punto de verificación controlado por
Bcl-2/Bcl-X_{L} después del
tratamiento con doxorrubicina, pero "corriente abajo" de dicho
punto de verificación después de la incubación con ácido betulínico.
No obstante, en los dos casos el procado de
caspasa-3 y PARP se impidió mediante
Bcl-2 o Bcl-X_{L}.
Para seguir esbozando la relación entre la PT
mitocondrial (que representa un evento controlado por
Bcl-2/Bcl-X_{L}), la inducción de
CD95-L y la activación de caspasa, las células
tratadas con doxorrubicina o ácido betulínico se clasificaron en
células que todavía tenían un \Delta\Psi_{m} normal
(DiOC_{6}^{alto}) y células que tenían un \Delta\Psi_{m}
modificado (DiOC_{6}^{bajo}). Después de la incubación con
doxorrubicina se detectó inducción de CD95-L y
disociación de caspasa-8 tanto en células
\Delta\Psi_{m}^{alto} y células \Delta\Psi_{m}^{bajo}
(Figura 14B). Sin embargo, sólo las células
\Delta\Psi_{m}^{bajo} presentaban caspasa-3
disociada y PARP (Figura 14B). Al estimular células mediante
entrecruzamiento de CD95 se obtuvo un patrón de disociación de
caspasa similar (Figura 14B). Esto indica que la iniciación del
programa de apoptosis mediante regulación de
CD95/CD95-L y activación de caspasa provocada por
CD95 tiene lugar "corriente arriba" de las mitocondrias. En
cambio, en el caso de la incubación con ácido betulínico sólo las
células \Delta\Psi_{m}^{bajo} presentaban
caspasa-3 y caspasa-8 disociadas,
además de PARP procesado (Fig. 14B). Por consiguiente, la activación
de caspasa-8 se produjo "corriente abajo" de la
disipación de \Delta\Psi_{m} en apoptosis inducida por ácido
betulínico, mientras que la disociación de caspasa-8
y la inducción de CD95-L tuvieron lugar "corriente
arriba" del colapso de \Delta\Psi_{m} en apoptosis inducida
por doxorrubicina.
La Figura 15A muestra que la
caspasa-8 es disociada en mitocondrias que
experimentan PT. Las células SHEP transfectadas con
Bcl-2 o Bcl-X_{L} o con sólo un
vector resistente a la neomicina (Neo) se trataron (Pistas +) con
0,5 \mug/ml de doxorrubicina o 10 \mug/ml de ácido betulínico
durante 16 h. Se aislaron las mitocondrias y se incubaron con
extractos citosólicos durante 6 h, en presencia o ausencia de 60
\mum zVAD-fmk. Se llevó a cabo un análisis
Western blot tal como se describe en la Figura 14A.
La Figura 15B muestra que Bcl-2 y
Bcl-X_{L} inhiben la disociación de caspasas a
nivel mitocondrial. Las mitocondrias (mito) de células de control de
vector tratadas con doxorrubicina o ácido betulínico y células SHEP
de sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} se incubaron con extractos citosólicos
de células de sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} y células de control de vector,
respectivamente, y se sometieron a inmunodetección de
caspasa-3 y caspasa-8, tal como se
describe en la Figura 14A.
Las mitocondrias de células de control de vector
tratadas con doxorrubicina o ácido betulínico indujeron la
disociación de caspasa-3, caspasa- 8 y PARP en
extractos citosólicos (Figura 15A). Este efecto se bloqueó mediante
el inhibidor de caspasa de amplio espectro zVAD-fmk,
lo que indicaba que se requería actividad proteasa para la
activación de caspasa-3 y caspasa-8
(Figura 15A). Para confirmar que la disociación de caspasas dependía
de mitocondrias que experimentaban PT se realizaron experimentos
similares utilizando células transfectadas con Bcl-2
o Bcl-X_{L}, en las que las mitocondrias no
experimentaron PT después del tratamiento con doxorrubicina o ácido
betulínico (Figura 12). Las mitocondrias de células de
sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} tratadas con doxorrubicina o ácido
betulínico no indujeron la disociación de caspasa en extractos
citosólicos (Figura 15A).
Al utilizar mitocondrias de células de control de
vector se detectó disociación de caspasas en extractos citosólicos
de células transfectadas con Bcl-2 o
Bcl-X_{L} (Figura 15B). Sin embargo, el procesado
de caspasas se inhibió al utilizar mitocondrias de células de
sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} en combinación con extractos
citosólicos de células de control de vector (Figura 15B). Esto
indica que una disociación deficiente de caspasas en células de
sobreexpresión de Bcl-2 o
Bcl-X_{L} influye directamente en el bloqueo de la
función mitocondrial más que tener efectos directos o indirectos,
incluyendo el secuestro de caspasas del citosol.
La Figura 16A muestra la liberación de citocromo
c de mitocondrias inducida por fármacos. Las células SHEP
transfectadas con Bcl-2 o con sólo un vector
resistente a la neomicina (Neo) se trataron con 0,5 \mug/ml de
doxorrubicina o 10 \mug/ml de ácido betulínico durante los
tiempos indicados. Se prepararon mitocondrias y extractos
citosólicos (fracción S100) tal como se describe en "Materiales y
Métodos". Cinco \mug de proteína por pista se separaron
mediante SDS-PAGE 15%. La inmunodetección de
citocromo c se llevó a cabo mediante moab
anti-citocromo c de ratón y quimioluminiscencia
aumentada.
La Figura 16B muestra que la disociación de
pro-caspasa-8 se activa mediante
AIF, pero no mediante citocromo c. Se prepararon extractos
citosólicos de células SHEP transfectadas sólo con un vector
resistente a la neomicina (Neo) o Bcl-2 y se
incubaron con 10 \mum de citocromo c o sobrenadante mitocondrial
con contenido de AIF. La inmunodetección de
caspasa-3, caspasa-8 y PARP se llevó
a cabo tal como se describe en la Figura 14A.
Después de la estimulación con doxorrubicina o
ácido betulínico, los niveles de citocromo c mitocondrial
disminuyeron, mientras que la concentración de citocromo c
citosólico ectópico aumentó (figura 16A). La expresión forzada de
Bcl-2 o Bcl-X_{L} bloqueó la
liberación mitocondrial de citocromo c (Figura 16A). La adición de
citocromo c purificado a extractos citosólicos condujo al
procesado de caspasa-3 y PARP tanto en células de
control de vector como en células de sobreexpresión de
Bcl-2 (Figura 16B), indicando, de nuevo, que la
actividad apoptogénica estaba preservada en el citosol de células de
sobreexpresión de Bcl-2. Sin embargo, la adición de
citocromo c a extractos citosólicos no indujo la activación
de caspasa-8 (Figura 16B).
La incubación de extractos citosólicos con
sobrenadantes mitocondriales con contenido de AIF condujo a la
disociación de caspasa-3, caspasa-8
y PARP (Figura 16B). Por consiguiente, diferentes proteínas
mitocondriales liberadas durante PT activan diferentes caspasas
implicadas en el mecanismo de apoptosis.
El siguiente experimento demuestra que los
derivados de ácido betulínico de los ejemplos inducen apoptosis en
diversas células neuroectodérmicas. Más específicamente, el ácido
betulínico,
28-acetil-3-\beta-D-glucosil
betulina ("B10"),
3-\beta-28-hidroxilup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
("B11"),
3-\beta-3-hidroxilup-20(29)-en-28-il-\beta-D-glucopiranósido
("B12") y etil éster de ácido
3-(\beta-D-glucopiranosiloxi)lup-20(29)-en-28-oico
("B13") se han analizado en cuanto a la inducción de apoptosis
específica utilizando los ensayos mostrados en el Ejemplo 2 (véase
más arriba). Tal como se muestra en la Figura 17A, en las células
SHEP, todos los derivados ensayados demostraron una actividad
apoptósica incluso superior a la del ácido betulínico. En células
IMR-5, B10, B12 y B13 demostraron una actividad
apoptósica aumentada en comparación con el ácido betulínico,
mientras que B11 mostró aproximadamente la misma actividad que el
ácido betulínico (figura 17B). Por último, en células Kelly, todos
los derivados ensayados, B10, B11, B12 y B13, demostraron una
actividad apoptósica como mínimo tan alta como la del ácido
betulínico (Figura 17C).
Algunos derivados de azúcares, en particular
derivados de glucosa, tienen la ventaja adicional de poder pasar la
barrera hematoencefálica de forma activa, a través de receptores y
canales de sacáridos, en particular canales de glucosa. Por
consiguiente, los derivados mostrados tienen ventajas adicionales
para el tratamiento de tumores localizados en el cerebro.
Las células abajo indicadas se han tratado con
diferentes concentraciones (1-50 \mug/ml) de ácido
betulínico (BetA) o sus derivados (B10-B15). Los
compuestos B10, B11, B12 y B13 son los mismos compuestos indicados
en el Ejemplo 5, mientras que B14 consiste en
3-\beta-D-galactosil
betulina y B15 es etil éster de ácido
3-\beta-D-galactosil-betulínico.
La apoptosis se determinó mediante análisis FACS del contenido de
ADN teñido con yoduro de propidio utilizando software CELLQuest. El
porcentaje de apoptosis específica se calculó de la siguiente
manera: 100 x (apoptosis experimental (%) - apoptosis espontánea (%)
/ 100% apoptosis espontánea (%)). La apoptosis espontánea fue
inferior a un 12%. Los datos consisten en el promedio de tres
valores. Se indican las concentraciones necesarias para la inducción
de apoptosis específica en un 50% de la población celular (ED50
(\mug/ml)).
| Línea celular | BetA | B10 | B11 | B12 | B13 | B14 | B15 |
| Melanoma | |||||||
| Colo38 | 23 | 0,5 | >50 | >50 | 2 | >50 | 2 |
| IGR | 8 | 0,5 | >50 | 7 | 2 | >50 | 2 |
| MRIH221 | 9 | 0,5 | 25 | 30 | 3 | >50 | 4 |
| HS69ST | 9 | 0,5 | 42 | >50 | 3 | >50 | 4 |
| MEWO | 9 | 0,5 | >50 | 38 | 3 | >50 | 3 |
| MML1 | 35 | 0,5 | >50 | 50 | 30 | >50 | 9 |
| Sarcoma de Ewing | |||||||
| GG62 | 8 | 0,5 | 3 | 12 | 3 | 25 | 1 |
| CADO | 9 | 0,5 | 20 | 50 | 2 | >50 | 2 |
| NT68 | 9 | 0,5 | 20 | 10 | 0,5 | 5 | 0,5 |
| VH64 | 0,5 | 0,5 | 5 | 8 | 0,5 | 5 | 0,5 |
| Tumor cerebral | |||||||
| Daoy | 5 | 0,5 | >50 | 14 | 3 | >50 | 1 |
| A172 | 6 | 0,5 | 6 | 35 | 2 | >50 | 6 |
Claims (8)
1. Compuesto que tiene la estructura
3-\beta-28-(acetiloxi)lup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido
(28-acetil-3-\beta-D-glucosil
betulina), su enantiómero D, su enantiómero L o racémico de éste, o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Compuesto que tiene la estructura de
3-\beta-28-hidroxilup-20(29)-en-3-il-\beta-D-glucopiranósido,
su enantiómero D, su enantiómero L o racémico de éste, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Compuesto que tiene la estructura de
3-\beta-3-hidroxilup-20(29)-en-28-il-\beta-D-glucopiranósido,
su enantiómero D, su enantiómero L o racémico de éste, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. Compuesto que tiene la estructura de etil
éster de ácido
3-(\beta-D-glucopiranosiloxi)lup-20(29)-en-28-oico,
su enantiómero D, su enantiómero L o racémico de éste, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. Compuesto que tiene la estructura de etil
éster de ácido
3-\beta-D-galactosil-betulínico,
su enantiómero D, su enantiómero L o racémico de éste, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. Composición farmacéutica que comprende el
compuesto de la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, y un soporte
farmacéuticamente aceptable.
7. Utilización de un compuesto de la
reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5 para preparar una composición
farmacéutica para tratar un tumor neuroectodérmico.
8. Utilización según la reivindicación 7, en la
que el tumor neuroectodérmico es un neuroblastoma, un
meduloblastoma o un sarcoma de Ewing.
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