ES2354608T3 - ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DEL proBNP(1-108) Y SU UTILIZACIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA INSUFICIENCIA CARDIACA. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti proBNP(1- 108) caracterizado porque, por una parte, reconoce un epítope que comprende la secuencia RAPR76S77P (SEQ ID Nº 5) del proBNP(1-108) y no reconoce sustancialmente los péptidos BNP (1-76) ni el BNP (77-108), y, por otra parte, tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1- 108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas.

Description

La invención se refiere al campo del diagnóstico in vitro de la insuficiencia cardiaca ventricular. La insuficiencia cardiaca (Congestive heart failure) es un síndrome clínico frecuente, en particular en las personas mayores. Se presenta habitualmente en forma de disparo insidioso de síntomas no específicos tales como tos al esfuerzo, fatiga, aparición de edemas periféricos. El diagnóstico reposa clásicamente en el estudio de diversos 5 parámetros tales como signos clínicos (clasificados en 4 estadios, estadios I a IV de la NYHA, es decir, de la Asociación de Cardiología de Nueva York), ecocardiografía, escintigrafía, prueba de esfuerzo, etc.

Debido a la gravedad de a enfermedad cardiaca, y también de los costes elevados de su tratamiento, un diagnóstico precoz de este síndrome es, evidentemente, muy deseable: contribuiría a evitar la progresión rápida del síndrome hacia la insuficiencia cardiaca severa. Identificar a las personas con riesgo de insuficiencia cardiaca es 10 por lo tanto una necesidad. Esto permitiría también adaptar un seguimiento terapéutico más rápido, más fácil y menos costoso. Desgraciadamente, no existe un procedimiento diagnóstico de la insuficiencia cardiaca totalmente satisfactorio y totalmente informativo.

Se han buscado desde hace mucho marcadores presintomáticos predictivos de la insuficiencia cardiaca. Con este fin, se ha puesto de manifiesto el hecho de que los cardiomiocitos fabrican y secretan péptidos con actividad 15 natriurética: un péptido de origen auricular, el ANP (Atrial Natriurectic Peptide) descubierto en la rata por de Bold et al. Life Science 1981, vol. 28(1) : 89-94, y un péptido natriurético de origen auriculo-ventricular denominado BNP (Brain Natriuretic Peptide) descubierto por Sudoh et al., Nature 1988, vol. 332 : 78-81 en el cerdo, y a continuación en el hombre.

El precursor del BNP es el preproBNP (1-134), forma de almacenamiento de la molécula en el interior de los 20 cardiomiocitos. Este se cliva para liberar un péptido señal y el proBNP (1-108). El proBNP (1-108) consiste en un polipéptido de 108 aminoácidos, de secuencia:

H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGV WKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR78S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSG LGCKVLRRH108 (SEQ ID Nº 1).

Se cliva, antes y/o durante su secreción, entre los aminoácidos Arg78 y Ser77 en, por una parte, el BNP, también 25 designado BNP (77-108) o BNP-32, incluso BNP (1-32), y la parte N-terminal de la prohormona, el BNP (1-76), también designado fragmento N-terminal de proBNP o NT-proBNP.

El BNP o BNP (77-108), forma vasoréactiva de la molécula, consiste en un péptido de 32 aminoácidos, de secuencia: S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108 (SEQ ID Nº 2). 30

El NT-proBNP o BNP(1-76) consiste en los 76 aminoácidos N-terminales del proBNP(1-108) que constituyen la siguiente secuencia:

H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGV WKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76 (SEQ ID Nº 3).

La tasa plasmática de BNP hormonal, el BNP (77-108), es elevada en los pacientes que presentan una 35 distrofia ventricular. Se han descrito asimismo determinaciones plasmáticas del BNP(77-108) utilizánbdolo como marcador predictivo de la insuficiencia cardiaca ventricular. Sin embargo, es bien sabido que la hormona BNP(77-108) es poco estable. De ello resulta que su determinación necesita precauciones particulares (Davidson, N. C. et al. Circulation 1995; 91:1276) (Gobinet-Georges et al. Clin. Chem. Lab. Med. 2000; ademá la semivida del BNP muy corta y su concentración plasmática es poco elevada. De ello se resulta que se observa un cierto número de 40 respuestas falsamente negativas en sujetos con riesgo de insuficiencia cardiaca. De este modo la determinación del BNP (77-108) no permite discriminar correctamente los pacientes en estadio I de la clasificación NYHA, de los individuos sanos (Clerico A. et al. J. Endocrinol. Invest. 1998 ; 21:170-9) (Del Ry S. et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000; 60:81-90).

Para solventar esta dificultar, la solicitud de patente WO 93/24531 describe un procedimiento de 45 diagnóstico in vitro de la insuficiencia cardiaca que descansa sobre la detección del BNP (1-76) (fragmento N-terminal del proBNP), un compuesto abundante y que tiene una larga semivida en comparación con la de la hormona BNP (77-108). Sin embargo, el procedimiento descrito en la solicitud WO 93/24531 no parece simple de aplicar al BNP (1-76) en muestras sanguíneas. En efecto, los únicos ejemplos mostrados se realizan, no en sueros reales, sino en gamas patrón obtenidas con la ayuda de un péptido sintético, el péptido BNP (47-64), (38:519-23) 50 del BNP (1-76). Para paliar este inconveniente, un sistema automatizado muy sofisticado se ha revelado, desde

entonces, necesario.

El artículo Hunt et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 214(3), 1995, pp. 1175-1183 describe una determinación RIA de tipo competitivo del BNP(1-76) sobre plasmas de pacientes que padecen insuficiencia cardiaca, haciendo intervenir un antisuero dirigido contra el fragmento N-terminal del proBNP(1-13). El artículo muestra precisamente que, en pacientes con insuficiencia cardiaca, la tasa de BNP(1-76), muy bien 5 correlacionada con la del BNP(77-108), es considerablemente elevada respecto de la tasa observada en los individuos testigo. Sin embargo, el protocolo descrito para extraer específicamente el único BNP (1-76) plasmático es complejo, ya que necesita una extracción del plasma sobre cartucho Sep-pak C18 TM (Millipore-Waters), seguida de una cromatografía HPLC. Por otra parte, este artículo subraya que, en la determinación RIA así aplicada, el proBNP (1-108) no parece reconocido. Sugiere más bien que el proBNP(1-108) podría ser secretado en 10 la circulación a partir del tejido cardiaco pero sería a continuación rápidamente degradado en un péptido más pequeño, por clivado de los ácidos N-terminales. O también, según el artículo, el proBNP(1-108) se presentaría de tal manera que el antisuero anti-proBNP(1-108) sería incapaz de ligarse al mismo. Finalmente, los autores sugieren que el BNP (1-76) (fragmento N-terminal del proBNP) podría incluso ser un marcador más específico de la disfunción cardiaca que el BNP (77-108) o que el fragmento N-terminal del proANP 15

El artículo Karl et al. (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1999; 59(supl 230): 177-181) describe un procedimiento de detección del BNP(1-76) similar al de la solicitud de patente W093/24531, pero no proporciona ningún resultadp obtenido en las muestras de pacientes.

El artículo Schulz et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 2001, vol. 61, pp. 33-42, describe igualmente una determinación radioinmunológica específica del BNP (1-76) (fragmento N-terminal del proBNP), sin extracción, con 20 la ayuda de un antisuero dirigido contra los aminoácidos 1-21 de este fragmento. Los autores confirman el interés de la determinación del BNP (1-76) en el diagnóstico de la insuficiencia cardiaca ventricular así como su buena correlación con la determinación del BNP(77-108). Durante un estudio de las diferentes formas circulantes del proBNP(1-108), avanzan la hipótesis que el proBNP(1-108) circularía en la sangre, a la vez en forma de prohormona intacta y de productos de clivado, BNP (1-76) (fragmento N-terminal del proBNP) y BNP (77-108). Sin 25 embargo, no se dice nada ni se sugiere nada en el artículo relativo a una eventual actividad fisiológica del proBNP (1-108) o un interés diagnóstico cualquiera del proBNP(1-108) como marcador predictivo o diagnóstico de la insuficiencia cardiaca ventricular.

El artículo Shimizu et al. Clinica Chimica Acta, 2002, vol. 316, pp. 129-135, presenta un estudio sobre la degradación del BNP humano en la sangre y las formas moleculares circulantes de BNP inmunorreactivo en el 30 plasma de individuos con insuficiencia cardiaca. Observa en el plasma de estos últimos la presencia de dos formas de BNP inmunorreactivo: un BNP de gran peso molecular (de 36 KD, que podría corresponder a un trimero del proBNP(1- 108)) y un BNP de bajo peso molecular. Este último corresponde a la presencia simultánea de una forma de producto de degradación del BNP-32 que ha perdido la serina y la prolina N-terminales (des-SerPro-BNP (BNP3-32)) de la forma hormonal del BNP-32 (denominada aquí BNP(1-32)). El proBNP(1-108) y el BNP hormonal (BNP-35 32, BNP (1-32) también BNP(77-108)) son por lo tanto secretados por el corazón en la sangre. Sin embargo, los autores parecen sugerir que el proBNP (1-108) bajo su forma oligomerizada (trimero) está presente en una concentración próxima a la del BNP(77-108) circulante, pero no la miden. Por consiguiente, la correlación de la concentración del proBNP (1-108) con el estado clínico de los pacientes no se estudia. De ahí que el interés diagnóstico o pronóstico del proBNP(1-108) sérico no está demostrado. Tampoco se sugiere que sea posible 40 dosificar este último por rutina.

Por otra parte, se conoce un cierto número de epítopes presentes en el proBNP (1-108). De este modo, en el marco de la detección del BNP (77-108), el epítope de la secuencia S77PKMVQGSGC88 (SEQ ID nº 105) que corresponde a los 10 aminoácidos N-terminales (AA 1-10) del BNP(77-108) se describe en la solicitud WO 97/32900. Igualmente, en el marco de la detección del BNP(1-76) (fragmento N-terminal del proBNP), el epítope de 45 secuencia R65KMVLYTLRAPR76 (SEQ ID Nº 106) que corresponde a los 12 aminoácidos C-terminales del BNP (1-76) (fragmento N-terminal del proBNP) se describe en la solicitud WO 00/35951, y la secuencia vecina H64RKMVLYTLRAPR78 (SEQ ID Nº 107) se describe en la solicitud WO 00/35951, y la secuencia adyacente H64RKMVLYTLRAPR78 (SEQ ID Nº 107) se describe en la solicitud WO 00/45176. Sin embargo, ninguna de estas solicitudes describe o sugiere la existencia de un epítope intermedio o híbrido entre estas secuencias 50

Existe por lo tanto siempre una necesidad, en el marco del diagnóstico precoz de la insuficiencia cardiaca, de disponer de un procedimiento que evite los inconvenientes de la técnica anterior. En particular, existe una necesidad de disponer de un procedimiento simple, utilizable por rutina y fiable, que evite los inconvenientes de la detección del BNP(77-108), molécula poco abundante y poco estable, a la par que se evitan las extracciones

complejas, ocasionadas por la determinación de otras formas moleculares de BNP, y que pueden ir hasta requerir una automatización sofisticada.

Los autores de la presente invención han pretendido desarrollar un procedimiento alternativo para resolver el problema planteado. En el seno de la presente invención se encuentra el descubrimiento inesperado, llevado a cabo por los inventores, de un epítope con propiedades únicas situado en el ámbito de la secuencia bisagra 5 Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID Nº 4) o de la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 (SEQ ID Nº 108) del proBNP(1-108) y que comprende al menos la secuencia RAPR76S77P (SEQ ID Nº 5).

En efecto, durante una inmunización practicada en el conejo con un péptido de región bisagra del proBNP (1-108), de secuencia CY70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID Nº 16), o también con el péptido de secuencia CY70TLRAPR78S77PKMVQGS84 (SEQ ID Nº 109), han descubierto de manera sorprendente que el antisuero 10 obtenido no solamente contenía anticuerpos que reconocían de manera específica dicho péptido de la región bisagra sin reconocer sustancialmente las formas del BNP (1-76) y del BNP(77-108), sino que tenía, además, la capacidad de reconocer el proBNP(1-108) circulante.

Los autores de la presente invención han, además, mostrado por primera vez que el proBNP (1-108) circulante era efectivamente un marcador predictivo de la insuficiencia cardiaca y que estaba presente en 15 concentración significativamente más elevada en los individuos con insuficiencia cardiaca que en los individuos testigo sanos.

Los autores han descubierto igualmente que otra manera de obtener este tipo de anticuerpos es inmunizar animales con la ayuda de la molécula completa de proBNP (1-108). En efecto, los autores han encontrado que la inmunización con la molécula completa del proBNP (1-108) permitía inducir la aparición de anticuerpos que 20 reconocen de manera específica una secuencia de región bisagra.

Además, los autores de la presente invención han demostrado que el epítope mínimo reconocido por los anticuerpos según la invención tenía la siguiente secuencia: RAPR76S77P. Han mostrado, además, que una buena manera de obtener los anticuerpos objeto de la presente invención es inmunizar animales con un péptido de fórmula general: 25

a1-X1-RAPRSP-X2-a2 (I)

en la que

a1 puede ser H o representar una función o un grupo químico elegido entre una función tiol, alcohol, aminoxi, amina primaria o secundaria, un grupo aminocarboxilo, un grupo biotinilo y un grupo acetilo,

X1 representa una secuencia peptídica de 0 a 3 aminoácidos, procedente de la secuencia natural del 30 proBNP(1-108) o no,

X2 representa una secuencia peptídica de 0 a 8 aminoácidos, de preferencia procedente de la secuencia natural del proBNP(1-108) o no,

a2 puede representar una función OH, NH2 o un grupo alcoxilo.

Asimismo, los autores de la presente invención han mostrado que era posible obtener los mismos 35 anticuerpos específicos por inmunización de un animal con un péptido que comprende la secuencia RAPR76S77P o con un péptido de fórmula:

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II)

en la que X puede ser H o representar bien un grupo acetilo, bien 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP (1-108), y donde Z puede representar una función OH, o 1 a 3 aminoácidos no 40 pertenecientes a la secuencia del proBNP(1-108).

Además, los autores de la presente invención han mostrado que era posible obtener los mismos anticuerpos específicos por inmunización de un animal con un péptido de fórmula:

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III)

en la que X puede ser H o representar bien un grupo acetilo, bien 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la 45

secuencia del proBNP (1-108), y donde Z puede representar una función OH, o 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP(1-108).

Los autores de la presente invención han desarrollado, además, un procedimiento simple y fiable de diagnóstico precoz de la insuficiencia cardiaca que reposa sobre la detección del proBNP (1-108) circulante en la sangre y un kit que permite la aplicación de esta detección del proBNP(1-108) circulante. 5

La presente invención es definida por las reivindicaciones 1 a 24.

La presente invención divulga un anticuerpo anti proBNP(1- 108) caracterizado porque, por una parte, reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG88 del proBNP(1-108) y no reconoce sustancialmente el BNP (1-76) ni el BNP (77-108), y, por otra parte, tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas. 10

La presente invención divulga, además, un anticuerpo anti proBNP (1-108) caracterizado porque , por una parte, reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77P KMVQGS84 del proBNP (1-108) y no reconoce sustancialmente el BNP (1-76) ni el BNP (77-108), y, por otra parte, tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas.

La presente invención divulga más particularmente un anticuerpo anti proBNP (1-108) caracterizado 15 porque, por una parte, reconoce de manera específica la secuencia RAPR76S77 del proBNP (1-108) y no reconoce sustancialmente el BNP (1-76) ni el BNP (77-108), y, por otra parte, tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas.

La presente invención divulga, además, un procedimiento de obtención de anticuerpos anti proBNP (1-108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la secuencia 20 Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o

la secuencia RAPR76S77P del proBNP(1- 108) con la exclusión del BNP (1-76) y del BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, caracterizado porque se inmuniza un animal con la molécula entera de proBNP(1-108),y a continuación porque se agota, con la ayuda del péptido BNP(77-108) y/o del péptido BNP(1-76), el antisuero obtenido. 25

Por “agotamiento de un antisuero” obtenido contra un antígeno específico dado (el antígeno inmunizante), se entiende la eliminación de anticuerpos no específicos, potencialmente presentes en este antisuero, por la puesta en contacto y la incubación de dicho antisuero con “antígenos no específicos”, es decir, antígenos diferentes del antígeno inmunizante, y a continuación la separación y eliminación inmunológicas de los anticuerpos que han reaccionado con dichos “antígenos no específicos” y la recuperación del antisuero así agotado (es decir, 30 empobrecido en anticuerpos no específicos). El agotamiento sirve clásicamente a convertir en específico un antisuero dirigido contra un antígeno dado.

En el presente caso, un antisuero que reconoce la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 y/o la secuencia Y70TLRAPR76S77P KMVQGS84 o la secuencia RAPR76S77P del proBNP(1-108) puede estar agotado, es decir, convertido específico, por puesta en contacto con el BNP (77-108) y/o el BNP (1-76) anteriormente 35 mencionados, pudiendo estos últimos, por ejemplo, ser inmovilizados en fase sólida y servir de soporte a una cromatografía por inmunoadsorción según técnicas convencionales, conocidas por el experto en la técnica. El anticuerpo presente finalmente en el antisuero agotado es aquí un anticuerpo policlonal monoespecífico.

La presente invención divulga también un péptido de fórmula:

a1-X1-RAPRSP-X2-a2 (I) 40

en la que

a1 puede ser H o representar una función o un grupo químico elegido entre una función tiol, alcohol, aminoxi, amina primaria o secundaria, un grupo aminocarboxilo, un grupo biotinilo y un grupo acetilo,

X1 representa una secuencia peptídica de 0 a 3 aminoácidos, procedente de la secuencia natural del proBNP(1-108) o no, 45

X2 representa una secuencia peptídica de 0 a 8 aminoácidos, de preferencia 7 aminoácidos procedente de la secuencia natural del proBNP(1-108) o no,

a2 puede representar una función OH, NH2 o un grupo alcoxilo.

La presente invención divulga también un péptido de fórmula:

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)

en la que X puede ser H o representar bien un grupo acetilo, bien 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP(1-108), y donde Z puede representar una función OH, o 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes 5 a la secuencia del proBNP(1-108).

La presente invención divulga, además, un péptido de fórmula:

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III)

en la que X puede ser H o representar bien un grupo acetilo, bien 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP(1-108), y donde Z puede representar una función OH, o 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes 10 a la secuencia del proBNP(1-108).

Obsérvese que en las fórmulas (II) y (III) anteriores, el número de los aminoácidos (Y70, R, S76, S84 o G85) se ha mantenido simplemente para ayudar a la comprensión de la invención y a la localización de esta secuencia respecto de la secuencia proBNP(1-108). Lo mismo ocurre para las otras secuencias presentadas con números en esta solicitud. 15

La invención se refiere asimismo a cualquier péptido que contenga la secuencia X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) o la secuencia X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III), o una de las secuencias (II) o (III) anteriormente mencionada en forma sustituida, de manera conservadora o no, en uno cualquiera de los aminoácidos de la posición 70 a la posición 85 o 84 respectivamente, a condición de que mantenga intacta (en particular no sustituida) la porción RAPR76S77P. 20

Se trata por lo tanto de un péptido que comprende una secuencia derivada de la secuencia X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) o la secuencia X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III) por sustitución de uno o más aminoácidos entre los aminoácidos Y70, T71, L72, K79, M80, V81, Q82, G83, S84 y G85, con X pudiendo estar ausente o representar bien una función NH2, bien 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP (1-108), y en la que Z puede estar ausente o representar bien una función OH, bien 1 a 3 aminoácidos no 25 pertenecientes a la secuencia del proBNP(1-108).

La invención se refiere finalmente al péptido de secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 y el péptido de secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84.

La invención divulga también un procedimiento de obtención de anticuerpos anti proBNP (1-108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la 30 secuencia RAPR76S77P del proBNP(1- 108) con la exclusión del BNP (1-76) y del BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, caracterizado porque se inmuniza un animal con un péptido de fórmula

a1-X1-RAPRSP-X2-a2 (I)

donde 35

a1 X1, X2, y a2 tienen la misma significación que anteriormente,

y eventualmente, porque se agota, con la ayuda del péptido BNP(77- 108) y/o el péptido BNP(1-76), el antisuero obtenido. El anticuerpo así obtenido es un anticuerpo monoespecífico.

La invención divulga también un procedimiento de obtención de anticuerpos anti proBNP (1-108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la 40 secuencia RAPR76S77P del proBNP(1- 108) con la exclusión del BNP (1-76) y del BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, caracterizado porque se inmuniza un animal con un péptido de fórmula La presente invención divulga también un péptido de fórmula:

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II) 45

o con un péptido de fórmula X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III),

donde X y Z son tales como se han definido anteriormente, y eventualmente, porque se agota, con la ayuda del péptido BNP(77-108) y/o del péptido BNP(1-76), el antisuero obtenido

La invención divulga también un procedimiento de obtención de hibridoma secretor de anticuerpos anti proBNP (1-108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, 5 Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la secuencia RAPR76S77P del proBNP(1- 108) con la exclusión del BNP (1-76) y del BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, caracterizado porque se inmuniza un animal con un péptido de fórmula

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSB85-Z (II)

o con un péptido de fórmula X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III), 10

en forma sustituida . de manera conservadora o no, a condición de que mantenga intacta (en particular no sustituida) la porción RAPR76S77P donde X y Z son tales como se han definido anteriormente, y eventualmente, porque se agota, con la ayuda del péptido BNP(77-108) y/o del péptido BNP(1-76), el antisuero obtenido

La invención divulga también un procedimiento de obtención de anticuerpos anti proBNP (1-108) que 15 reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la secuencia RAPR76S77P del proBNP(1-108) con la exclusión de los péptidos BNP (1-76) y BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP(1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, caracterizado porque se inmuniza un animal con el péptido de secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, o el péptido de secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y eventualmente, porque se agota, con la ayuda del péptido 20 BNP(77-108) y/o del péptido BNP(1-76), el antisuero obtenido.

La invención divulga también un procedimiento de obtención de hibridoma secretor de anticuerpos anti proBNP (1-108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o

la secuencia RAPR76S77P del proBNP(1- 108) con la exclusión sustancial del BNP (1-76) y del BNP (77-108), y que 25 tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, caracterizado porque

- se inmuniza un animal con un péptido elegido entre los péptidos de las siguientes fórmulas:

a1-X1-RAPRSP-X2-a2 (I)

en la que a1 X1, X2, y a2 tienen la misma significación que anteriormente, 30

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II)

en la que X y Z tienen la misma significación que anteriormente

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III)

en la que X y Z tienen la misma significación que anteriormente

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) 35

en forma sustituida de manera conservadora o no, siempre que mantenga intacta (en particular no sustituida) la porción RAPR76S77P, donde X y Z tienen la misma significación que anteriormente,

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III)

en forma sustituida de manera conservadora o no, siempre que mantenga intacta (en particular no sustituida) la porción RAPR76S77P, 40

donde X y Z tienen la misma significación que anteriormente,

Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, y

Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84

- se toman linfocitos secretores de inmunoglobulinas de este animal, y porque

- se procede a una fusión de los linfocitos con células de mieloma para obtener al menos un hibridoma secretor de inmunoglobulinas.

Esto corresponde a la técnica clásica de obtención de los hibridomas cuyo principio se describe en Köhler 5 y Milstein, (1975) Nature (London), 256 :495-497.

La invención divulga tal hibridoma y el anticuerpo anti proBNP(1-108) monoclonal secretado por dicho hibridoma. Más particularmente, la invención tiene por objeto el hibridoma 3D4 registrado en la CNCM bajo el nº CNCM I-3073 y el anticuerpo secretado por este hibridoma.

La presente invención divulga, además, un procedimiento de diagnóstico in vitro de la insuficiencia 10 cardiaca en un ser humano que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica, preferiblemente de sangre, plasma o suero, con un anticuerpo anti proBNP(1-108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la secuencia RAPR76S77P del proBNP(1-108) con la exclusión sustancial del BNP(1-76) y del BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, y la 15 detección del proBNP (1-108) en la muestra.

La invención proporciona de manera general un procedimiento de diagnóstico in vitro de la insuficiencia cardiaca en un ser humano que comprende:

a) la puesta en contacto de una muestra biológica, preferiblemente sangre, plasma o suero, con un anticuerpo anti proBNP (1-108) de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la secuencia 20 Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la secuencia RAPR76S77P del proBNP (1-108) con la exclusión sustancial del BNP (1-76) del BNP(77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP(1- 108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas,.

b) la incubación de la mezcla en condiciones que permiten la formación de complejos antígenos-anticuerpos; y c) el revelado de los complejos antígenos-anticuerpos formados, eventualmente con la ayuda de un anticuerpo de 25 detección marcado, capaz de ligarse específicamente al proBNP (1-108) presente en el primer complejo, o con la ayuda de un antígeno de detección, marcado, capaz de ligarse al anticuerpo dirigido contra dicho proBNP(1-108) presente en el primer complejo.

En particular, la invención proporciona un procedimiento de diagnostico de la insuficiencia cardiaca que comprende, además de las etapas a, b y c anteriormente mencionadas, una etapa d) de correlación de la cantidad 30 de los complejos antígenos-anticuerpos revelados en el estado clínico del individuo.

La presente invención divulga, además, un kit de detección del proBNP (1-108) en una muestra biológica, especialmente en una muestra de sangre, plasma o suero, que contiene al menos un anticuerpo anti proBNP(1- 108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84, y/o la secuencia RAPR76S77P del proBNP(1-108) con la exclusión sustancial del BNP 35 (1-76) del BNP(77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP(1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas.

La invención apunta finalmente a un kit de detección del proBNP (1-108) en una muestra biológica, especialmente en una muestra de sangre, plasma o suero, que contiene, como patrón, un compuesto que contiene al menos un péptido elegido en el grupo de péptidos de las siguientes fórmulas: 40

a1–X1-RAPRSP-X2- a2 (I)

donde a1, X1, X2, y a2 tiene la misma significación que anteriormente,

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II)

donde X y Z tiene la misma significación que anteriormente,

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II) 45

en forma sustituida, de manera conservadora o no, siempre que mantenga intacta (en particular no sustituida) la porción RAPR76S77P,

donde X y Z tienen la misma significación que anteriormente

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III)

donde X y Z tiene la misma significación que anteriormente, 5

X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III)

en forma sustituida, de manera conservadora o no, siempre que mantenga intacta (en particular no sustituida) la porción RAPR76S77P,

donde X y Z tienen la misma significación que anteriormente

Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-, 10

Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-,

Definiciones

En el contexto de la invención, una “muestra biológica” o también una “muestra de fluido biológico” está preferiblemente constituida por un líquido biológico, tal como sangre, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, etc... 15

Por “insuficiencia cardiaca” , se entiende el estado patológico en el cual una anomalía de la función cardiaca es responsable de la incapacidad del corazón para bombear la sangre de manera suficiente para responder a las necesidades metabólicas del organismo y/o en el cual el corazón responde a las necesidades pero con presiones de llenado anormalmente elevadas. Puede especialmente tratarse de una insuficiencia ventricular derecha y/o izquierda. 20

El término “anticuerpo” se refiere a cualquier anticuerpo entero o fragmento funcional de un anticuerpo (obtenido por ingeniería genética o no), que comprende, o consiste en, al menos un sitio de combinación antigénica, que permite a dicho anticuerpo ligarse a al menos un determinante antigénico de un compuesto antigénico. A título de ejemplo de fragmento de anticuerpos se pueden mencionar los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 así como los fragmentos variables de cadena simple (cadenas scFv). 25

Los anticuerpos anti proBNP (1-108) según la invención pueden ser de tipo policlonal o monoclonal. Un anticuerpo policlonal anti proBNP(1-108) según la invención puede entre otros, obtenerse por inmunización de un animal tal como un c conejo, un ratón, etc.. con la ayuda del proBNP(1-108) entero, toma de muestra y a continuación agotamiento del antisuero obtenido en, por ejemplo, un inmunoadsorbente que contiene BNP(77-108) y/o BNP(1-76) según procedimientos en sí conocidas por el experto en a técnica. Un anticuerpo monoclonal anti 30 proBNP(1-108) según la invención puede , entre otros, obtenerse por el procedimiento clásico de Köler y Milstein (Nature (London), 256 : 495 497 (1975)).

La producción de anticuerpos monoclonales o de sueros policlonales monoespecíficos, o anticuerpos obtenidos por cribado de bancos genómicos, útiles en el marco de la invención procedente de técnicas convencionales que se detallan más adelante. 35

Por “anticuerpo de captura”, se entiende un anticuerpo o una parte de anticuerpo, preferiblemente fijado en una fase sólida, que es capaz de retener el antígeno proBNP (1-108) presente en una muestra biológica, por unión afín.

La presencia del antígeno en la muestra biológica es revelada por “medios de detección”. Tratándose de la detección del antígeno, la invención prevé especialmente una detección con la ayuda de al menos un “anticuerpo 40 de detección”. Tal anticuerpo de detección, marcado, es capaz de ligarse al antígeno capturado, por unión afín, reconociendo un sitio epitópico diferente del reconocido por el anticuerpo de captura.

El término “marcado” se refiere tanto a un marcaje directo (mediante enzimas, radioisótopos, fluorocromos, compuestos luminiscentes, etc) que a un marcaje indirecto (por ejemplo, mediante anticuerpos, ellos mismos marcados de manera directa o con la ayuda de reactivos de un “par de afinidad”, marcado, tal como, pero no 45

exclusivamente, el par avidina marcada-biotina, etc...).

Por “fragmento antigénico”, se entiende cualquier parte del proBNP(1-108) capaz de inducir la síntesis de anticuerpos sustancialmente específica del único proBNP (1-108) en un animal inmunizado.

Según la presente invención, un “fragmento antigénico” contiene al menos el “sitio epitópico” o epítope RAPR76S77P. Un “sitio epitópico” o “epítope” es una secuencia de aminoácidos que es reconocida por al menos un 5 anticuerpo y permite la conexión específica del mismo.

El término “anticuerpo policlonal monoespecífico” se aplica a cualquier anticuerpo policlonal que presenta una especificidad para un solo epítope. Esto significa que el anticuerpo es capaz de unir una secuencia de aminoácidos de la secuencia del proBNP (1-108) que contiene los amino ácidos que comprenden el epítope, pero es incapaz de unir una secuencia de aminoácidos de la secuencia del proBNP(1-108) que no contiene los 10 aminoácidos que comprenden el epítope.

El término “específicamente”, cuando se refiere a un reconocimiento o una unión específica de un anticuerpo para un antígeno, significa que el anticuerpo interactúa con el antígeno sin interacción sustancial con otros antígenos, o si se habla de reconocimiento “específico” con un epítope, por reconocimiento casi-exclusivo de este epítope. S on preferibles constantes de asociación superiores a 108 l.mol-1. 15

Por “sustitución conservadora”, se entiende especialmente la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de la misma clase, sustitución que no modifica significativamente la inmunorreactividad del péptido obtenido respecto de la del péptido original. Entre las diferentes clases de aminoácidos se distinguen generalmente los aminoácidos de cadena lateral polar (tal como asparagina, glutamina serina, treonina y tirosina), los aminoácidos de cadena lateral no polar (tal como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, 20 metionina, triptofano y cisteína), lo aminoácidos de cadena lateral básica (tal como lisina, arginina e histidina), y los aminoácidos de cadena lateral ácida (tal como el ácido aspártico y el ácido glutámico).

Por “substitución no conservadora”, se entiende cualquier otro tipo de sustitución, que no modifica significativamente la inmunorreactividad del péptido obtenido respecto de la del péptido original

Por la expresión “no reconoce sustancialmente el BNP (1-76) ni el BNP (77-108) “ se entiende que el 25 anticuerpo apuntado por la invención presenta una reacción cruzada con el BNP (1-76) o el BNP (77-108) inferior al 20%, particularmente inferior al 10%, de manera preferida inferior al 5%. La determinación del porcentaje de la reacción cruzada se hace según procedimientos conocidos en si por el experto en la técnica, por ejemplo, el ilustrado en el ejemplo 5.

El no-reconocimiento “sustancial” de los péptidos BNP (1-76) y BNP (77-108) corresponde preferiblemente 30 a una ausencia o casi-ausencia de reacción de los anticuerpos de la invención con estos péptidos.

Por la expresión “con la exclusión sustancial del BNP (1-76) y del BNP (77-108), se entiende que el anticuerpo “no reconoce sustancialmente el BNP (1-76) ni el BNP (77-108)2 en el sentido anteriormente mencionado.

Producción de anticuerpos específicos 35

Los anticuerpos utilizados en la presente invención son anticuerpos específicos del antígeno, y por esta razón, son anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales monoespecíficos, es decir, que no reconocen específicamente más que un epítope.

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener según el procedimiento clásico de fusión limfocitaria y cultivo de hibridomas descrito por Kôhler y Milstein, Nature, 1975, 256: 495-497. Otros procedimientos de 40 preparación de anticuerpos monoclonales son igualmente conocidos (Harlow et al, ed., 1988 Antibodies : a laboratory manual ). Los anticuerpos monoclonales se puede preparar inmunizando un mamífero (por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, incluso un ser humano, etc...) y utilizando la técnica de fusión linfocitaria que conduce a hibridomas (Kôhler y Milstein, 1975).

Existen técnica alternativas a esta técnica usual. Se pueden, por ejemplo, producir anticuerpos 45 monoclonales por expresión de un ácido nucleico clonado a partir de un hibridoma. Se pueden producir igualmente anticuerpos por la técnica de expresión sobre fago (“phage display”), introduciendo ADNc de anticuerpos en vectores, que son típicamente fagos filamentosos que presentan bancos de genes V en la superficie del fago (por

ejemplo fUSE5 para E.coli, Scott, J. K. y Smith, G.P, Science, 1990,249 : 386-390). Se describen protocolos de construcción de estos bancos de anticuerpos en Marks et al, 1991, J. Mol. Biol, 222 :581-597).

Los anticuerpos policlonales se pueden obtener a partir del suero de un animal inmunizado contra un antígeno de naturaleza peptídica según los modos operatorios usuales. Los anticuerpos policlonales así obtenidos podrán, si se necesita, y por agotamiento con el BNP (77-108) y del BNP1-76, según técnicas conocidas en sí por el 5 experto en la técnica como por ejemplo la inmunoadsorción sobre columna, volverse monoespecíficos de la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, de la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o de un péptido que comprende la secuencia RAPR76S77P, que garantiza de este modo la especificidad del proBNP (1-108), la exclusión sustancial del BNP(1-76) y del BNP(77-108).

Anticuerpos de captura y/o de detección 10

En la técnica de sándwich, el anticuerpo de captura se elige de manera a que reconozca específicamente un epítope, sobre el antígeno natural del paciente, mientras que el anticuerpo de detección se elige, preferiblemente, pero no obligatoriamente de manera a que reconozca específicamente otro epítope, sobre el antígeno natural del paciente.

La muestra biológica se puede eventualmente tratar en una etapa previa, o puesta directamente en 15 presencia de al menos un anticuerpo de captura en condiciones que favorecen la exposición del epítope a detectar.

El procedimiento de diagnóstico según la invención se puede realizar según diversos formatos bien conocidos por el experto en la técnica: en fase sólida o en fase homogénea; en un tiempo o en dos tiempos; en procedimiento sándwich o en procedimiento competitivo, a título de ejemplos no limitativos.

Según una realización preferida, el anticuerpo de captura se inmoviliza en una fase sólida. Se pueden 20 utilizar a título de ejemplos no limitativos de fase sólida microplacas, en particular microplacas de poliestireno, tales como las comercializadas por la sociedad Nunc, Dinamarca. Se pueden usar también partículas o bolas sólidas, bolas paramagnéticas, tales como las proporcionadas por Dynal o Merck-Eurolab (Francia) (bajo la marca EstaporTM), o también tubos de ensayo de poliestireno o polipropileno, etc...

Un formato de inmunoensayo de tipo sándwich entre dos anticuerpos (de captura y de detección) es 25 particularmente ventajoso para la detección de los antígenos presentes en la muestra biológica.

Un formato de inmunoensayo de detección de los antígenos por competición es igualmente posible. Otras modalidades de inmunoensayo se pueden considerar y son bien conocidas por el experto en la técnica.

Se puede aplicar determinaciones ELISA, radioinmunoensayos o cualquier otra técnica de detección para revelar la presencia de los complejos antígenos-anticuerpos formados. 30

Kits

Los kits y reactivos útiles para la detección del proBNP (1-108) en una muestra de fluido biológico, según el procedimiento de la invención, pueden ser proporcionados para una aplicación práctica de la invención fácil y aplicable a numerosas muestras biológicas.

Kits de detección del proBNP (1-108) en una muestra biológica pueden contener al menos un anticuerpo 35 tal como se ha definido anteriormente. Otros kits, que contienen como patrón y/o testigo, al menos un péptido de fórmula (I) (II)) o un péptido sustituido tal como se han definido anteriormente, también pueden ser útiles para la aplicación de la invención.

La invención se refiere a un kit de detección del proBNP (1-108) en una muestra de fluido biológico, que comprende 40

- al menos un anticuerpo anti proBNP (1-108) que rconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85, la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la secuencia RAPR76S77P del proBNP (1-108) con la exclusión sustancial del BNP (1-76) y del BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP(1- 108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, y que es preferiblemente un anticuerpo de captura de dicho proBNP(1-108) presente en la 45 muestra biológica, y

- un conjugado marcado capaz de unirse específicamente a los complejos antígenos-anticuerpos formados.

Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo de captura se puede presentar de manera ventajosa bajo una forma inmovilizada sobre una fase sólida, tal como una microplaca, por ejemplo, pero no exclusivamente.

Un kit preferido comprende al menos:

- un anticuerpo de captura anti proBNP (1-108) que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 y la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 y/o la secuencia RAPR76S77P 5 del proBNP(1-108) con la exclusión sustancial del BNP(1-76) y del BNP (77-108), y que tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP(1- 108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas, estando dicho anticuerpo de captura inmovilizado en una fase sólida; y

- un anticuerpo de detección, marcado, dirigido contra otro epítope, intacto, del proBNP (1-108), eventualmente, 10

- un antígeno de detección, marcado, que es un péptido del proBNP(1- 108) o el propio proBNP(1-108)

Según una realización particular, un kit de detección del proBNP(1-108) en una muestra biológica, puede contener:

- en un recipiente, a menos un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente;

- en otro recipiente al menos un péptido tal como se ha definido anteriormente, útil especialmente como 15 patrón y/o testigo.

Las siguientes figuras y ejemplos ilustran la invención sin limitar el alcance.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS:

- La figura 1 representa la reactividad de los anticuerpos policlonales del conejo #046 805 purificados sobre proteína A-sefarosa con el proBNP (1-108), el fragmento BNP(1-76), el BNP (77-108), y la GST 20 (Glutathion-S-transférase, utilizada como proteína testigo) adsorbidos sobre microplaca de 0,25 µg/ml.

- La figura 2 representa la reactividad de los anticuerpos policlonales del filtrado de conejo #046 805 obtenidos después del agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa. Los anticuerpos policlonales se preparan en forma de gamas de diluciones de 2 a 20 µg/ml, y a continuación se ensayan en cúpulas revestidas de polipéptidos proBNP (1-108), BNP(1- 76) o BNP(77-108) adsorbido a 0,25 µg/ml. 25

- La figura 3 representa la reactividad de los anticuerpos policlonales del filtrado de conejo #046 832 obtenidos después del agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa. Los anticuerpos policlonales se preparan en forma de gamas de diluciones de 5 a 20 µg/ml, y a continuación se ensayan en cúpulas revestidas de polipéptidos proBNP (1-108), BNP(1- 76) o BNP(77-108) adsorbido a 0,25 µg/ml.

- La figura 4 representa la reactividad del eluado del suero policlonal del conejo #046 805 obtenido después 30 del agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa. Los anticuerpos policlonales se preparan en forma de gamas de diluciones de 2 a 20 µg/ml, y a continuación se ensayan sobre cúpulas revestidas de polipéptido proBNP (1-108), BNP(1-76) o BNP (77-108) a 0,25 µg/ml.

- La figura 5 representa la reactividad del eluado del suero policlonal del conejo #046 8325 obtenido después del agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa. Los anticuerpos policlonales se preparan en 35 forma de gamas de diluciones de 5 a 20 µg/ml, y a continuación se ensayan sobre cúpulas revestidas de polipéptido proBNP (1-108), BNP(1-76) o BNP (77-108) a 0,25 µg/ml.

- La figura 6 representa un análisis epitópico con la ayuda de la técnica sport del suero policlonal del conejo #046 805 antes de agotamiento. (Para este ejemplo, el ruido de fondo es de 30,4  5,93 unidades de intensidad relativas.) 40

- La figura 7 representa un análisis epitópico con la ayuda de la técnica sport del suero policlonal del conejo #046 805 antes de agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa. (Para este ejemplo, el ruido de fondo es de 31,3  6,31 unidades de intensidad relativas.)

- La figura 8 representa la reactividad del sobrenadante de cultivo del hibridoma 3D4 diluido en ½, ensayado sobre cúpulas revestidas bien de proBNP(1-108), bien de BNP (1-76), bien de –BNP(77-108), bien del 45

péptido YTLRAPRSPKMVQGSG (C13P30), adsorbido a 1 µg/ml. La figura 9 muestra una fotografía del gel de acrilamida al 16% en el cual se hace migrar cada proteína (1 µg de proteína por pista): Pista 1: marcador de peso molecular; pista 2 proBNP(1-108); pista 3: GST (proteína testigo negativo); pista 4: BNP(1-76)-GSTT, pista 5: BNP(77-108).

- La figura 10 muestra los resultados del test western-blot del anticuerpo producido por el hibridoma 3D4 5 sobre el proBNP(1-108)-GST (pista 2), la GST (proteína testigo negativo) (pista 3), el BNP(1-76)-GST (pista 4), y el BNP(77-108) (pista 5) depositados sobre gel (1 µg de proteína por gel), y a continuación se transfieren sobre membrana de nitrocelulosa.

- La figura 11 representa una curva de calibración de la determinación IRMA del proBNP(1-108).

- La figura 12 muestra los resultados en cpm (golpes por minuto de radiactividad) de la determinación IRMA 10 del proBNP (1-108)de las tomas de muestras de 14 individuos sanos y de 15 pacientes con insuficiencia cardiaca.

- La figura 13 representa la correlación entre las concentraciones de proBNP(1-108) en pg/ml) determinadas con la ayuda de la determinación radioinmunométrica según la invención y las concentraciones de BNP(1-76) (pg/ml) determinadas con la ayuda de la determinación sobre el autómata Elecsys® (marca de la 15 sociedad Hoffman La Roche), de las tomas de muestras de 14 pacientes con insuficiencia cardiaca.

- La figura 14 representa una curva de calibración de la determinación ELISA del proBNP(1-108) según la invención.

- La figura 15 representa una evaluación de la reacción cruzada respecto del BNP(1-76) y del BNP (77-108), del anticuerpo policlonal del conejo # 0406 805 no agotado acoplado a la biotina, utilizado en sándwich en 20 la determinación ELISA proBNP(1-108) junto con el anticuerpo policlonal anti-BNP(77-108).

- La figura 16 representa la evaluación de la reacción cruzada respecto del BNP(1-76) y del BNP (77-108), del anticuerpo policlonal del conejo # 0406 805 no agotado acoplado a la biotina, utilizado en sándwich en la determinación ELISA proBNP(1-108) junto con el anticuerpo policlonal anti-NT-proBNP(1-29).

EJEMPLOS 25

Ejemplo 1: síntesis de péptidos para inmunización Los péptidos sintéticos se producen por las técnicas estándar bien conocidas por el experto en la técnica. Se pueden mencionar, como ejemplo la síntesis de tipo Merrifield que es ventajosa debido a su facilitada de aplicación (Merrifield, (1963) ; R. C.Sheppard (1971) ; Atherton et al. (1989)) Como sintetizador automático, se puede menciona el sintetizador "9050 Plus Pep Synthesizer" de Millipore, el "Pioneer" de Perspective, o el sintetizador 30 "433A" de ABI. Los péptidos se pueden obtener igualmente por síntesis en fase homogénea. Las siguientes síntesis se han realizado en un sintetizador Pioneer, utilizando la química “Fmoc” (9-fluorenilmetiloxi carbonilo) : a cada etapa los reactivos (es decir, el aminoácido protegido y los activadores de acoplamiento (TBTU(2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborata)/HOBt (N-hidroxibenzotriazol)) se añaden en exceso (en una relación “moles de reactivos /moles de grupos sustituibles en la 35 resina = 5). Al final de la síntesis, el péptido se separa de la resina por una solución a base de ácido trifluoroacético (reactivo K). El péptido a continuación se precipita en una solución de éter enfriada, y a continuación se purifica por HPLC. Los inventores han procedido a la síntesis de los péptidos que contienen la secuencia de los siguientes aminoácidos de la región bisagra R76S77: 40

SEQ ID Nº 6: C-G-R-A-P-R-S-P

SEQ ID Nº 7: Acetil -C-G-R-A-P-R-S-P

SEQ ID Nº 8: C-G-R-A-P-R-S-P-K

SEQ ID Nº 9: Acetil -C-G-R-A-P-R-S-P-K

SEQ ID Nº 10 C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V 45

SEQ ID Nº 11: C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G

SEQ ID Nº 12: R-A-P-R-S-P-G-C

SEQ ID Nº 13: Acetil -R-A-P-R-S-P-G-C

SEQ ID Nº 14: Acetil -C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K

SEQ ID Nº 15: C-H-R-K-M-V-L-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K 5

SEQ ID Nº 16:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (péptido C13P30)

SEQ ID Nº 17: C-F-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G

SEQ ID Nº 18: C-F-S-1-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G

SEQ I D N 19:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-pA

SEQ ID Nº 20: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-A 10

SEQ ID Nº 21: C-F-S-1-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-A

SEQ ID Nº 22: C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-A-L-A-S-G-T-A

así como

SEQ ID Nº 109: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (péptido CN32)

SEQ ID Nº 110: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K 15

SEQ ID Nº 111: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V

SEQ ID Nº 112: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q

SEQ ID Nº 113: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G

SEQ ID Nº 114: Acetil -C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q

SEQ ID Nº 115: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G 20

SEQ ID Nº 116: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S

SEQ ID Nº 117: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S-G

SEQ ID Nº 118: C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V

SEQ ID Nº 119: C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q

SEQ ID Nº 120: L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-S 25

SEQ ID Nº 121 C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S

SEQ ID Nº 122 C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S-G

NB: pA significa beta-alanina

La invención tiene por lo tanto también por objeto un péptido cualquiera elegido en el grupo constituido por las anteriores secuencias. 30

Ejemplo 2: Acoplamiento de un péptido a una proteína portadora para inmunización

Se acopla el péptido a una proteína portadora la KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin), la tiroglobulina, BSA (Bovine Serum Albumin, via diferentes funciones (tiol, amina, aldehído...) para que el péptido sea más inmunógeno. El agente de acoplamiento utilizado para ligar el péptido a la proteína puede ser hetero- o homo-bifuncional. Los reactivos más corrientemente utilizados son BS 3, sSMCC, SPDP, glutaraldéhido... Una de las técnicas de 35

acoplamiento utilizadas es la que utiliza como agente químico de acoplamiento el glutaraldéhido y como proteína portadora la KLH. El acoplamiento de la KLH sobre el péptido se realiza a partir de las funciones aminas del péptido (grupo N-terminal y grupo amina llevado por la lisina principalmente).

Una solución del péptido C13P30 de secuencia YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 (SEQ ID Nº 16) o del péptido CN32 de secuencia YTLRAPRSPKMVQGS-NH2 (SEQ ID Nº 109) à 5mg/ml se prepara en tampón PBS Dulbecco 5 NaCI 0,15M de pH 7,4. Un frasco de 20mg de KLH liofilizada en tampón PBS (Pierce #77600) se recupera con 2ml de agua PPI (agua para preparación inyectable), para obtener una solución de KLH a 10mg/ml en tampón PBS.

1 ml de la solución de péptido (es decir, 5mg) se mezcla con 1,25ml de la solución de KLH (es decir, 12,5mg). Bajo campana aspirante, 2,25ml de una solución de glutaraldéhido al 2% preparada extemporáneamente (a partir de glutaladéhido al 25%, Sigma #G-5882) se añaden a la mezcla. Con el fin de evitar la formación de 10 complejo de KLH, la solución de glutaraldéhido al 2% ese añade gota a gota y con agitación de la mezcla. La reacción de conjugación se realiza durante 2 horas 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. La reacción de acoplamiento se para por adición de una solución de borohidruro de sodio a 100 mg/ml de manera a alcanzar una concentración final de 10mg/ml. La mezcla se incuba durante una noche a 4ºC. Finalmente la solución se dializa durante una noche a 4ºC contra tampón PBS Dulbecco de pH 7,4. La solución se alicuota y se conserva a –15 80ºC.

Ejemplo 3: Inmunizaciones con péptidos

Para la producción de anticuerpos policlonales, los conejos (hembras de cepa New Zealand) se han inmunizado con la ayuda del péptido CysYTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 acoplado a la KLH según el ejemplo 2. A la primera inyección, una emulsión de 1,5 ml de péptido acoplado a la KLH con 1,5 ml de adyuvante de Freund 20 complet (Sigma # F-5881) se realiza, y 1 ml de esta última emulsión (es decir, 200 µg de péptido) se inyecta por vía intradérmica a cada uno de los conejos. Se realizan dos recuerdos con 20 días de intervalo inyectando por vía intradérmica 1 ml de una emulsión de péptido acoplado a la KLH (es decir, 200µg de péptido) con el adyuvante de Freund incompleto (Sigma #F-5506). Veinte días después del segundo recuerdo, se efectúa un tercer recuerdo, y después de la evaluación del valor en anticuerpo conocido, se sangran los conejos. Más particularmente los 25 anticuerpos de los conejos identificados por los números #046 805 y 046 832 obtenidos por inmunización con el péptido C-YTLRAPRSPKMVQGSS-NH2 (SEQ ID N 16) acoplado a la KLH, y del conejo identificado L01235, obtenidos por inmunización con el péptido C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2 (SEQ ID Nº 109) acoplado a la KLH se han utilizado para la continuación de los trabajos.

Ejemplo 4 : Obtención y purificación de los anticuerpos 30

Antes de la purificación, los sueros de conejo se centifugan durante 30 minutos a 4.500 vueltas/minuto à 4ºC. Después de la decantación, el suero se diluye a la mita en tampón glicina 1,5M, de pH 8,0 que contiene NaCl 1M.

Ejemplo 4.a : Purificación de IgG sobre proteína A-sefarosa

La purificación de los anticuerpos policlonales se realiza por cromatografía de afinidad sobre un gel de 35 proteína A-sefarosa (Amersham Biosciences #17.1279.02). La proteína A extraída de Staphylococcus aureus se combina específicamente con el fragmento Fc de las moléculas de IgG. A continuación las IgG, de todas las clases, se eluyen a pH 3,0.

Todos los tampones utilizados se desgasifican durante 15 minutos en un baño de ultrasonidos antes de su paso por la columna, para prevenir la formación de burbujas. 40

Una columna de cromatografía se prepara mediante 12 ml de p proteína A-sefarosa. La columna de gel se desequilibra durante 40 minutos con agua destilada y desgasificada, y a continuación durante 40 minutos con tampón PBS Dulbecco de pH 7,4 que contiene NaCI 0,5 M, y finalmente con tampón glicina 1,5 M de pH 8,0 que contiene NaCI 1 M, así hasta la obtención de una línea de base correcta.

A continuación, 10ml de suero de conejo diluido a la mitad en tampón glicina 1,5 M de pH 8,0 que contiene 45 NaCI 1 M, se pasan a la columna a un caudal de 0,5ml/mn. Después de la aparición del pico de albumina, las IgG del suero se eluyen con la ayuda de una solución de ácido cítrico 0,1M llevada a pH 3,0 con tampón tris sodio de citrato 0,1M. El pico de elusión de las IgG se recupera y se pone rápidamente en diálisis en tampón PBS Dulbecco de pH 7,4 durante una noche 4ºC. La concentración de las IgG se determina después de la diálisis por lectura de la densidad óptica a 280 nm contra tampón PBS. 50

Después de la purificación sobre proteína A, la reactividad de los anticuerpos policlonales se ensaya en ELISA sobre cúpulas revestidas bien por proBNP (1-108), BNP(1-76), y BNP (77-108) adsorbido a 0,25 µg/ml. Los resultados obtenidos para los anticuerpos policlonales del conejo #046 805 se presentan en la figura 1. Los anticuerpos policlonales del conejo #046 832 han dado resultados idénticos. Los anticuerpos policlonales de los conejos · 046 805 y · 046 832 son relativamente específicos del proBNP (1-108). Sin embargo, se ha podido anotar 5 la presencia de una bajo reactividad anti-BNP(77-108) a concentraciones elevadas, reactividad que se ha podido suprimir haciendo que los anticuerpos policlonales de estos conejos sean monoespecíficos por agotamiento sobre resina BNP-K3-NHSsefarosa, según el procedimiento descrito en el ejemplo 4.b.

Ejemplo 4.b : Agotamiento de las IgG sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa

El objetivo de esta operación es eliminar la reactividad cruzada observada respecto del BNP(77-108). 10

Al ser la reactividad cruzada del anticuerpo policlonal obtenida en posición N-terminal de la molécula de BNP(77-108), era importante presentar bien esta región del BNP (77-108) a las inmunoglobulinas a eliminar. Con este fin, el BNP(77-108) se ha sintetizado con una extensión de 3 residuos de lisina en posición C-terminal (BNP-K3) con el fin de favorecer su acoplamiento a la resina NHS-sefarosa por su extremo C-terminal.

El BNP-K3: S-P-K-M-V-Q-G-S-G-C-F-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G- C-K-V-L-R-R-H-K-K-K (SEQ ID nº 15 104) se ha sintetizado en un sintetizador Pioneer, utilizando la química Fmoc (9-fluorenilmetiloxi carbonilo) mencionada anteriormente en el ejemplo 1.

5 mg de BNP-K3 se disuelven con la ayuda del tampón NaHC03 100mM, de pH 8,3 con la adición de NaCI 0,5M a una concentración de 10mg/ml. 2ml de resina NHS-sefarosa (NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, Amerscham Biosciences #17.0906.01) se centrifugan durante 30 segundos a 1000 vueltas/mn a 4ºC. La resina se 20 lava con 15ml de una solución de HCI 1mM frío. Después de la centrifugación y la eliminación de la solución de 'HCI, la resina se mezcla con el ligando BNP-K3 a 10mg/ml. La mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación lenta. Después de la centrifugación y la eliminación de la solución de ligando, los grupos no reactivos de la resina se bloquean con la ayuda de 5ml de tampón glicina 0,1 M, de pH 8,0. La mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación lenta. Después centrifugación y eliminación del tampón de 25 bloqueo, la resina se recupera con 5 ml de tampón NaHC03 100mM, de pH 8,3 con adición de NaCl 0,5M. Se realizan 4 lavados con la ayuda de este tampón. en el último lavado, la mezcla se deposita en una columna de cromatografía.

Después de la preparación de la columna de cromatografía, 10mg de IgG del conejo #046 805 o del conejo #046 832 se depositan en la columna. Una bomba peristáltica conectada a la columna permite hacer circular las 30 IgG del suero de conejo durante toda una noche a 4ºC. El día siguiente, la solución de IgG se recupera (=filtrado). La fracción de IgG ligada en el BNP-K3 se eluye (=eluado) con la ayuda del tampón Tris 20mM, de pH 8,0 que contiene urea 5M. Se ensaya a continuación el eluado y el filtrado con el fin de asegurarse de la eficacia del agotamiento. Las figuras 2 y 3 muestran los resultados de los ensayos realizados en ELISA con el filtrado de los sueros policlonales de los conejos #046 805 y ·046 832, respectivamente. Las figuras 4 y 5 muestran los resultados 35 de los ensayos realizados en ELISA con el eluado de los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832, respectivamente.

Como se esperaba, el filtrado de los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832, es específica del proBNP(1-108): no se ha observado ninguna reactividad en el BNP (1-76) ni en el BNP(77-108). el eluado conserva una reactividad respecto del proBNP (1-108) pero también una reactividad respecto del BNP(77-108). 40 Estos resultados confirman la eficacia del agotamiento del suero de policlonal del conejo en la resina BNP-K3NHS-sefarosa.

El BNP(77-108) proviene de Sigma (# B-5900), mientras que el proBNP(1- 108) y el BNP (1-76) se han producido en forma de proteínas recombinadas expresadas después de la clonación en el vector pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech) y la transfección en E coli, por las técnicas clásicas bien conocidas por el experto en la técnica. El vector original ha sido proporcionado por la sociedad Berlex Biosciences (Richmond, CA, EE.UU) y su preparación es descrita por Yan et al. (PNAS, 2000, vol. 97, pp. 8525-8529). La concentración del proBNP(1- 108) y la del BNP (1-76) se han determinado mediante el procedimiento Bradford de determinación colorimétrica de las proteínas (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54).

Ejemplo 5: Determinación del porcentaje de reacción cruzada de los anticuerpos anti proBNP(1-108) de los conejos ·046 805 y · L01235 respecto del BNP(1-76) y del BNP(77-108)

Materiales:

1) Fase sólida: microplaca Maxisorp de fondo plano, Nunc (Dinamarca).

2) El BNP(77-108) procede de Sigma (#B-5900), mientras que el proBNP(1-108) y el BNP(1-76) se han 5 producido en forma de proteínas recombinadas. La concentración de estas soluciones de proteínas se ha determinado por el procedimiento de determinación colorimétrica (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54).

3) El conjugado utilizado es un anticuerpo policlonal anti-IgG de conejo acoplado a la peroxidasa (Sigma #A-9169) 10

4) Tampón de saturación: Tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de albúmina bovina sérica (BSA, Sigma #A-7888)

5) Tampón de dilución: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de BSA y el 0,1% de Tween 20.

6) Solución de lavado: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de Tween 20. 15

7) Solución de revelado: la solución de revelado se compone de:

o 7ª) un tampón sustrato: solución de ácido cítrico 0,01 M, y citrato trisódico 0,04M que contiene H2O2 a 0,33%, de pH final 5,6, y

o 7b) un cromógeno: comprimido de OPD (ortofenilenodiamina). 1 comprimido de OPD a disolver en 1ml de tampón sustrato. 20

8) Solución de parada: H2SO4 4N

Protocolo:

El Ensayo consiste en evaluar la inmunorreactividad de los anticuerpos policlonales directamente sobre las diferentes proteínas inmovilizadas en las cúpulas de una placa de microvaloración.

- Se preparan en primer lugar varias soluciones de sensibilización en tampón PBS Dulbecco pH 7,4: una 25 primera que contiene BNP(77-108) a 0,25µg/ml, una segunda que contiene BNP(1-108) a 0,25µg/ml, una tercera que contiene BNP(1-76) a 0,25µg/ml y una cuarta que contiene GST (proteína testigo de ruido de fondo) a 0,25µg/ml

- 100 µl de cada una de estas soluciones se depositan por separado en los pocillos de una microplaca.

- La microplaca se incuba durante una noche a 4ºC. 30

- Después de la eliminación de la solución de sensibilización, la microplaca se lava con la ayuda de 300 µl de un tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de Tween 20, y a continuación se satura por adición de 250 µl del tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 1% de BSA.

- La microplaca se incuba entonces durante 1 hora a 37ºC

- La microplaca se lava a continuación (3 veces) con la ayuda de la solución de lavado. 35

- En cada cúpula, se depositan 100 µl de solución de anticuerpo policlonal, previamente diluido a 2 y 1 µg/ml para el suero policlonal del conejo #046 805 y a 1/2.500 y 1/5.000 para el suero policlonal del conejo # L01235.

- El medio de reacción se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente

- La microplaca se lava a continuación 3 veces con 300 µl de la solución de lavado. 40

- Se añaden 100 µl del conjugado de anticuerpo policlonal anti-IgG de conejo acoplado a la peroxidasa, diluido a 1/8.000 en tampón de dilución, en cada pocillos de la microplaca.

- El medio de reacción se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.

- A continuación las placas se lavan (5 lavados) con 300 µl de la solución de lavado. En cada cúpula, se distribuyen 100 µl de la solución de revelado. Se deja que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 5 20 minutos a temperatura ambiente (18-24ºC).

- A continuación se distribuyen 50 µl de la solución de parada en cada cúpula.

- Después de la parada de la reacción, la lectura de la densidad óptica se efectúan en el espectrómetro a 490/620 nm.

Tabla I: Resultados de la determinación del porcentaje de reacción cruzada de los anticuerpos 10 policlonales de los conejos …#046 805 y #L01235 respecto del BNP(-176) y del BNP(77-108)

Para un anticuerpo anti proBNP(1-108) dado, ensayado en el BNP(77-108) adsorbido a 0,25 µg/ml, en el BNP(1-108) adsorbido a 0,25 µg/ml y en la GST adsorbida a 0,25 µg/ml, se calcula el porcentaje de la reacción cruzada del anticuerpo con el BNP(77-108) con la ayuda de la siguiente fórmula Para un anticuerpo anti proBNP(1-108) dado, ensayado en el BNP(1-76) adsorbido a 0,26 µg/ml, en el BNP(1-108) adsorbido a 0,25 µg/ml y en la GST adsorbida a 0,25 µg/ml, se calcula el porcentaje de la reacción cruzada del anticuerpo con el BNP(1-76) con la ayuda de la siguiente fórmula

% de reacción cruzada

Suero policlonal #046 805 a 1 µg/ml Suero policlonal #046 805 a 2 µg/ml Suero policlonal #L01235 1/5000 Suero policlonal #L01235 1/2500

BNP(77-108) a 0,25µg/ml

1,44% 2,13% 3,55% 4,3%

BNP(1-76) a 0,25µg/ml

1,00% 1,29% 0,21% 0,00%

Conclusión: La reacción cruzada de los anticuerpos policlonales de estos sueros es inferior al 2% sobre el BNP(1-76) e inferior al 5% sobre el BNP(77-108). La reactividad cruzada respecto del BNP(77-108) se puede eliminar por el procedimiento de agotamiento descrito en el ejemplo 4-b. Sin embargo, como se describe en los 15 ejemplos 19 y 20, en las condiciones de una determinación inmunoenzimométrica del proBNP(1-108), y a las concentraciones de BNP877-108) y de BNP(1-76) habitualmente encontrados en los pacientes, estos anticuerpos policlonales se pueden utilizar en su versión no agotado sin conllevar la aparición de reacción cruzada.

Ejemplo 6: Identificación del epítope reconocido por los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832 antes y después del agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa 20

Los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832 antes y después del agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa se han ensayado por el procedimiento spot con el fin de identificar el 'epítope reconocido por estos sueros policlonales. Este procedimiento descrito por Frank (Tetrahedron 1992; 48:9217-32), permite la

síntesis rápida sobre membrana de nitrocelulosa de un gran número de péptidos de secuencias predefinidas. Los protocolos usados son los descritos por Molina et al. (Pept Res 1996; 9:151-5). En una hoja de papel se crean zonas circulares (spots) de aproximadamente 5 mm de diámetro, que comprenden una función aminada, que sirven como punto de anclaje al ácido aminado C-terminal del péptido sintético. El alargamiento de la cadena peptídica se efectúa por adiciones sucesivas de Fmoc-aminoácidos activados. Las cadenas laterales de los aminoácidos se 5 bloquean mediante grupos químicos adecuados. Todos los péptidos se sintetizan con su residuo N-terminal N-acetilado. Tras la síntesis , las cadenas laterales se desprotegen mediante la acción del ácido trifluoroacético. Este tratamiento no afecta a la unión entre el péptido y el soporte celulósico, y la reactividad de los péptidos se puede evaluar mediante un ensayo colorimétrico.

La serie de péptidos sintetizados sobre membrana está constituida por 32 pentadecapéptidos decalados 10 de 3 residuos de aminoácidos que representan la totalidad de la secuencia del proBNP(1-108).

Tabla II Membrana spot constituida por 32 pentadecapéptidos decalados de 3 en 3 residuos de aminoácidos que representan la totalidad de la secuencia del proBNP(1-108).

Secuencia

Nº spot Secuencia Nº spot

HPLGSPGSASDLETS (SEQ ID nº 23)

1 GVWKSREVATEGIRG (SEQ ID nº 39) 17

GSPGSASDLETSGLQ (SEQ ID nº 24)

2 KSREVATEGIRGHRK (SEQ ID nº 40) 18

GSASDLETSGLQEQR (SEQ ID nº 25)

3 EVATEGI1RGHRKMV L (SEQ ID nº 41) 19

SDLETSGLQEQRNHL (SEQ ID nº 26)

4 TEGIRGHRKMVLYTL (SEQ ID nº 42) 20

ETSGLQEQRNHLQGK (SEQ ID nº 27)

5 IRGHRKMVLYTLRAP (SEQ ID nº 43) 21

GLQEQRNHLQGKLSE (SEQ ID nº 28)

6 HRKMVLYTLRAPRSP (SEQ ID nº 44) 22

EQRNHLQGKLSELQV (SEQ ID nº 29)

7 MVLYTLRAPRSPKMV (SEQ ID nº 45) 23

NHLQGKLSELQVEQT (SEQ ID nº 30)

8 YTLRAPRSPKMVQGS (SEQ ID nº 46) 24

QGKLSELQVEQTSLE (SEQ ID nº 31)

9 RAPRSPKMVQGSGCF (SEQ ID nº 47) 25

LSELQVEQTSLEPLQ (SEQ ID nº 32)

10 RSPKMVQGSGCFGRK (SEQ ID nº 48) 26

LQVEQTSLEPLQESP (SEQ ID nº 33)

11 KMVQGSGCFGRKMDR (SEQ ID nº 49) 27

EQTSLEPLQESPRPT

12 QGSGCFGRKMDRISS 28

(SEQ ID nº 34)

(SEQ ID nº 50)

SLEPLQESPRPTGVW (SEQ ID nº 35)

13 GCFGRKMDRISSSSG (SEQ ID nº 51) 29

PLQESPRPTGVWKSR (SEQ ID nº 36)

14 GRKMDRISSSSGLGC (SEQ ID nº 52) 30

ESPRPTGVWKSREVA (SEQ ID nº 37)

15 MDRISSSSGLGCKVL (SEQ ID nº 53) 31

RPTGVWKSREVATEG (SEQ ID nº 38)

16 ISSSSGLGCKVLRRH (SEQ ID nº 54) 32

Después de la saturación de la membrana con la ayuda de 30 ml del tampón TBS de pH 7,0 con la adición de Tween 20 al 0,1 %, de tampón de bloqueo al 5% (Euromedex #SU-07- 250), et de sacarosa al 5%, la reactividad de 20ml del suero policlonal de conejo diluido al 10 µg/ml se ensaya (en una incubación de 1 hora 30 minutos à 37ºC con agitación). Después del lavado con el tampón TBS de pH 7,0 con la adición de Tween 20 al 0,1%, el 5 conjugado anti-IgG de conejo acoplado a lafosfatasa alcalina (Sigma #A-8025) se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Finalmente, después de una última serie de lavados con 30 ml de solución de lavado, el revelado de los spots se realiza por adición de 30 ml de solución de sustrato (solución de 30 ml de tampón CBS (Citrate Buffer Saline) pH 7,0 que contiene 120 µl de BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) 0,15M, 150 µl de MgCl2 1M et 180 µl de MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) 0,1M. Después del escaneado de la 10 membrana, la intensidad de los spots de la membrana se evalúa (en unidades de intensidad relativas) con la ayuda de un programa informático de tratamiento de imagen. El ruido de fondo se calcula a partir de los spots no detectados por el antisuero. Los resultados del análisis epitópico del suero policlonal del conejo #046 805 antes de agotamiento se representan en la figura 6. cinco péptidos (sport (spots 22 à 26) son detectados por el suero policlonal, y la secuencia común a estos cincos péptidos es R76S77P. Sin embargo, la reactividad aumenta 15 netamente cuando se añade el motivo RAP en posición N-terminal del motivo R76S77P. Los resultados del análisis epitópico del suero policlonal del conejo #046 805 después de agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa se presentan en la figura 7. cuatro péptidos (spots 22 à 25) son detectados por el suero policlonal, y la secuencia común a estos 4 péptidos es RAPR76S77P. Contrariamente a lo que se observa para el suero policlonal antes de agotamiento, ninguna resina sobre el motivo R76S77P solo es observada (spot 26). Esto explica que después de 20 agotamiento sobre resina BNP-K3-NHSsefarosa, el suero policlonal ya no detecta más el BNP(77-108) [para recuerdo, el motivo S77P corresponde a los dos primeros aminoácidos de la secuencia del BNP(77-108)]. En conclusión el epítope reconocido por el suero policlonal del conejo #046 805 convertido en monoespecífico es RAPR76S77P.

Se han obtenido resultados totalmente idénticos con la ayuda del suero policlonal del conejo #046 832: el 25 epítope reconocido por el suero policlonal de este conejo convertido en monoespecífico es igualmente RAPR76S77P.

Ejemplo 7: Identificación del epítope mínimo de los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832 antes y después de agotamiento, por el procedimiento de Ala-scan.

Los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832, antes y después de agotamiento sobre resina 30 BNP-K3-NHS-sefarosa, se ha ensayado por el procedimiento spot (descrito en el ejemplo 6) con el fin de identificar el epítope mínimo, en el péptido bisagra, que permite el reconocimiento específico del único proBNP (1-108) por los sueros policlonales. Se ha sintetizado una membrana constituida por 16 pentadecapéptidos que retoman la secuencia del péptido bisagra YTLRAPRSPKMVQGS y portadores de una sustitución progresiva de un aminoácido por un residuo alanina ((Alanine-scanning o Ala-scan ) o glicina, sustitución cada vez decalada hacia la derecha de 35 un residuo de aminoácido (tabla III). Los resultados del análisis Ala-scan de los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832 antes y después de agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa se presentan en la tabla IlI.

Tabla IlI: membrana spot en 16 pentadecapéptidos YTLRAPRSPKMVQGS portadores de una substitución progresiva de cada aminoácido por un residuo alanina o glicina. Reactividad de los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832 antes y después de agotamiento sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa.

SEQ ID

Secuencia Nº spot Reactividad (en unidades de intensidad relativas) suero policlonal conejo #046 805 no agotado Reactividad (en unidades de intensidad relativas) suero policlonal conejo #046 805 agotado Reactividad (en unidades de intensidad relativas) suero policlonal conejo #046 832 no agotado Reactividad (en unidades de intensidad relativas) suero policlonal conejo #046 832 agotado

SEQ ID nº46

YTLRAPRSPKMV QGS 716 84 69 151 132

SEQ ID nº55

ATLRAPRSPKMVQGS 717 90 68 148 130

SEQ ID nº56

YALRAPRSPKMVQGS 718 101 71 154 130

SEQ D nº57

YTARAPRSPKMVQGS 719 108 77 152 133

SEQ D nº58

YTLAAPRSPKMVQGS 720 101 39 148 106

SEQ D nº59

YTLRGPRSPKMVQGS 721 93 39 156 132

SEQ D nº60

YTLRAARSPKMVQGS 722 103 96 137 48

SEQ D nº61

YTLRAPASPKMVQGS 723 50 23 150 116

SEQ D nº62

YTLRAPRAPKMVQGS 724 58 44 148 113

SEQ D nº63

YTLRAPRSAKMVQGS 725 74 41 85 67

SEQ D nº64

YTLRAPRSPAMVQGS 726 138 118 157 148

SEQ D nº65

YTLRAPRSPKAVQGS 727 98 77 150 130

SEQ D nº66

YTLRAPRSPKMAQGS 728 100 68 138 130

SEQ D nº67

YTLRAPRSPKMVAGS 729 95 71 142 133

SEQ D nº68

YTLRAPRSPKMVQAS 730 107 78 143 134

SEQ D nº69

YTLRAPRSPKMVQGA 731 112 68 153 132

NB: Se subrayan los residuos alanina o glicina que sustituyen losr aminoácidos iniciales (A y G)

Los aminoácidos críticos en el reconocimiento del epítope reconocido por el suero policlonal del conejo #046 805 antes de agotamiento son R76S77P, mientras que después de agotamiento del suero policlonal del conejo #046 805 sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa, además del motivo R76S77P, el motivo RA se vuelve contribuidor. Para el suero policlonal del conejo #046 832 antes de agotamiento solo la prolina P78 es contribuidora, mientras que 5 después de agotamiento del suero policlonal del conejo #046 832 sobre resina BNP-K3-NHS-sefarosa,, el motivo contribuidor es R-PR76S77P. Estos resultados muestran por lo tanto que el epítope mínimo obligatorio en el reconocimiento específico del proBNP (1-108) par los sueros policlonales de los conejos #046 805 y #046 832 es RAPR76S77P.

Ejemplo 8: Identificación del epítope mínimo del suero policlonal del conejo #L01235, por el procedimiento 10 de Ala-scan

El suero policlonal del conejo #L01235, específico de entrada del proBNP(1-108) (agotamiento inútil), se ha ensayado por el procedimiento spot (descrito en el ejemplo 6) con el fin de identificar el epítope mínimo, en un péptido bisagra que permite el reconocimiento específico del único proBNP(1-108) por el suelo policlonal. La membrana usada es la descrita en el ejemplo 7. Los resultados del análisis Ala-scan del suero policlonal del conejo 15 # L0 1235 se presentan en la Tabla IV.

Tabla IV: Membrana spot de 16 pentadecapéptidos YTLRAPRSPKMVQGS portadores de una substitución progresiva de cada aminoácido por un residuo alanina o glicina. Reactividad del suero policlonal del conejo #L01235.

SEQ ID

Secuencia Reactividad en unidades de intensidad relativas) suero policlonal del conejo #L01235

SEQ D nº46

YTLRAPRSPKMVQGS 94

SEQ ID nº55

ATLRAPRSPKMVQGS 91

SEQ ID nº56

YALRAPRSPKMVQGS 84

SEQ D nº57

YTARAPRSPKMVQGS 92

SEQ D nº58

YTLAAPRSPKMVQGS 66

SEQ D nº59

YTLRGPRSPKMVOGS 71

SEQ D nº60

YTLRAARSPKMVQGS 67

SEQ D nº61

YTLRAPASPKMVQGS 71

SEQ D nº62

YTLRAPRAPKMVQGS 47

SEQ D nº63

YTLRAPRSAKMVQGS 53

SEQ D nº64

YTLRAPRSPAMVQGS 102

SEQ D nº65

YTLRAPRSPKAVQGS 73

SEQ D nº66

YTLRAPRSPKMAQGS 70

SEQ D nº67

YTLRAPRSPKMVAGS 70

SEQ D nº68

YTLRAPRSPKMVQAS 83

SEQ D nº69

YTLRAPRSPKMVQGA 80

NB: Se subrayan los residuos alanina o glicina sustituidos por aminoácidos iniciales (A y G)

Como para los sueros policlonales de los conejo #046 805 y #046 832 (ejemplo 7), estos resultados muestran que el epítope mínimo obligatorio en el reconocimiento específico del proBNP(1-108) por los anticuerpos policlonales del conejo # L01235 es RAPR76S77P.

Ejemplo 9: Inmunización de ratones con la proteína recombinada proBNP(1-108) 5

Se han inmunizado ratones de cepa BALB/c (hembras de 6 semanas) con la ayuda del proBNP(1-108) recombino descrito en el ejemplo 4.b, por las técnicas clásicas bien conocidas por el experto en la técnica. A la primera inyección, se realiza una emulsión de 1 ml de proBNP con 1 ml de adyuvante de Freund completo (Sigma # F-5881), y se inyectan 300 l de esta emulsión (es decir, 100µg de proteína) por vía subcutánea a cada uno de los ratones. Se realizan dos recuerdos con un intervalo de 15 días por inyección por vía intraperitoneal de 300µl de una 10 emulsión de proBNP (1-108) (es decir, 100 µg de péptido) con el adyuvante de Freund incompleto (Sigma # F-5506). Quince días después del segundo recuerdo, se efectúa un tercer recuerdo de la misma manera que los anteriores recuerdos pero en inyección subcutánea. Finalmente, 15 días después de este último recuerdo, se realizan extracciones sanguíneas sobre los ratones para analizar la respuesta inmunitaria por la técnica spot. La respuesta inmunitaria del ratón 12 se ha revelado particularmente interesante para la continuación de los trabajos. 15

Ejemplo 10: Identificación de los epítopes reconocidos por los anticuerpos policlonales del ratón 12 en la secuencia del proBNP(1-108)

El procedimiento spot utilizado para identificar los epítopes reconocidos por los anticuerpos policlonales del ratón 12 en la secuencia del proBNP(1-108) se describe en el ejemplo 6.

La serie de péptidos sintetizados en membrana está constituido por 94 pentadecapéptidos, decalados de 20 un residuo de aminoácido que representa la totalidad de la secuencia del proBNP(1-108). La reactividad del suero policlonal del ratón 12 diluido a 1/500 se ensaya sobre esta membrana como se ha descrito en el ejemplo 6. Después del escando de la membrana, se evalúa la intensidad de los spots de la membrana(en unidades de intensidad relativas) con la ayuda de un programa informático de tratamiento de imagen. El ruido de fondo, calculado a partir de los spots no detectados por antisuero , era de 30 unidades de intensidad relativas. 25

.Tres regiones situadas en posición N-terminal de la secuencia proBNP(1-108) son de este modo particularmente bien detectadas por los anticuerpos del antisuero del ratón 12: HPLGSPGSASDLETS (SEQ ID nº 23) (spots 1 a 12), , L17LQEQRNHLQGK27L(SEQ ID nº123) (17 a 27), y secuencia L38EPLQESPRPTG49 (SEQ ID nº 124) (spots 38 a 49). .

De manera sorprendente, el antisuero del ratón 12 contiene igualmente anticuerpos capaces de reconocer 30 spots cuya secuencia peptídica comprende el motivo RAPR76S77P: spots 64 a 68. Las secuencias peptídicas de los spots se describen en la tabla V

Tabla V: Epítopes de la región bisagra reconocidos, con la ayuda de la técnica spot, por el antisuero del ratón 12.

Nº spot

Secuencia peptídica del spot detectado Reactividad en unidades relativas de intensidad Nº de spot Secuencia peptídica del spot detectado Reactividad en unidades relativas de intensidad

1

HPLGSPGSASDLETS (SEQ ID nº 23) 177,0 38 LEPLQESPRPTGVWK (SEQ ID nº 88) 177,0

2

PLGSPGSASDLETSG (SEQ ID nº 70) 170,0 39 EPLQESPRPTGVWKS (SEQ ID nº 89) 188,0

3

LGSPGSASDLETSGL (SEQ ID nº 71) 145,7 40 PLQESPRPTGVWKSR (SEQ ID nº 90) 109,0

4

GSPGSASDLETSGLQ (SEQ ID nº 24) 166,3 41 LQESPRPTGVWKSRE (SEQ ID nº 91) 166,0

5

SPGSASDLETSGLQE (SEQ ID nº 72 185,0 42 QESPRPTGVWKSREV (SEQ ID nº 92) 164,0

6

PGSASDLETSGLQEQ (SEQ ID nº 73) 169,3 43 ESPRPTGVWKSREVA (SEQ ID nº 93) 147,0

7

GSASDLETSGLQEQR (SEQ ID nº 25) 155,2 44 ESPRPTGVWKSREVA (SEQ ID nº 93) 149,0

8

SASDLETSGLQEQRN (SEQ ID nº 74) 176,5 45 SPRPTGVWKSREVAT (SEQ ID nº 94) 175,0

9

ASDLETSGLQEQRNH (SEQ ID nº 75) 108,0 46 PRPTGVWKSREVATE (SEQ ID nº 95) 186,0

10

SDLETSGLQEQRNHL (SEQ ID nº 76) 118,3 47 RPTGVWKSREVATEG (SEQ ID nº 16) 171,0

11

DLETSGLQEQRNHLQ (SEQ ID nº 77) 121,0 48 PTGVWKSREVATEGI (SEQ ID nº 96) 148,0

12

LETSGLQEQRNHLQG SEQ ID nº 78) 101,0 49 TGVWKSREVATEGIR (SEQ ID nº 97) 72,0

17

L17LQEQRNHLQGKLSEL(SEQ ID nº79) 99,0 61 IRGHRKMVLYTLRAP (SEQ ID nº 98) 105,8

18

QEQRNHLQGKLSELQ (SEQ ID nº 80) 179,8 62 RGHRKMVLYTLRAPR (SEQ ID nº 99) 97,7

19

EQRNHLQGKLSELQV (SEQ ID nº 29) 189,6 63 GHRKMVLYTLRAPRS (SEQ ID nº 100) 95,9

20

QRNHLQGKLSELQVE (SEQ ID nº 81) 211,8 64 HRKMVLYTLRAPRSP (SEQ ID nº 53) 92,8

21

RNHLQGKLSELQVEQ (SEQ ID nº 82) 219,0 65 RKMVLYTLRAPRSPK (SEQ ID nº 101) 48,0

22

NHLQGKLSELQVEQT (SEQ ID nº 30) 213,3 66 KMVLYTLRAPRSPKM (SEQ ID nº 102) 48,0

23

HLQGKLSELQVEQTS (SEQ ID nº 83 202,6 67 MVLYTLRAPRSPKMV (SEQ ID nº 45) 42,1

24

LQGKLSELQVEQTSL (SEQ ID nº 84) 189,5 68 VLYTLRAPRSPKMVQ (SEQ ID nº 103) 38,4

25

QGKLSELQVEQTSLE (SEQ ID nº 85) 187,3

26

GKLSELQVEQTSLEP (SEQ ID nº 86) 36,6

27

KLSELQVEQTSLEPL (SEQ ID nº 87) 69,9

Ejemplo 11: Obtención de anticuerpos monoclonales que reconocen de manera específica el proBNP(1-108), con la exclusión sustancial del BNP(1- 76) y del BNP(77-108)

El ratón (hembra BALB/c de 5 semanas) seleccionado para la producción de anticuerpos monoclonales se inmunizó con el péptido SEQ ID nº 16 C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 (C13P30) acoplado a la KLH (Keyhole LimpetHemocyanin) según el siguiente protocolo: 100 µg del péptido acoplado a la KLH diluida volumen a volumen 5 con el adyuvante completo de Freund se inyectaron por vía subcutánea. Se efectuaron cuatro recuerdos a un intervalo de 3 semanas con 100 µg del péptido acoplado a la KLH diluido volumen a volumen con el adyuvante incompleto de Freund, inyectados por vía subcutánea.

Tres días antes de la realización de la fusión linfocitaria, el ratón experimentó una hiperinmunización según el siguiente protocolo: se fracciona la dosis total de inmunógeno, aquí 100 µg de péptido C-10 YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2 acoplado a la KLH en tampón PSB estéril, en 4 inyecciones. La primera y la segunda inyecciones corresponden cada una a una décima de la dosis total. Estas inyecciones se realizan por vía subcutánea en diferentes lugares y a 45 minutos de intervalo. La tercera inyección, que corresponde a 2 décimas de la dosis total, se realiza 45 minutos después de la segunda inyección, por vía subcutánea. Treinta minutos después de la tercera inyección, se realiza una inyección por vía intraperitoneal de 100 µl de una solución de 15 prometazina a 1mg/ml en PBS estéril (Phenergan al 2,5%, Laboratoires Medeva Parma) con el fin de prevenir cualquier choque anafiláctico. Finalmente 15 minutos después, se efectúa la última inyección que corresponde a 6 décimas de la dosis total por vía intraperitoneal.

La hibridación linfocitaria se realiza según el procedimiento descrito por Köhler y Milstein (Nature, 1975 ; 256 :495-97). Se realiza a partir de las células linfocitarias extraídas del bazo del ratón y de las células 20 mielomatosas (P3-X63-Ag8. 653) previamente cultivadas en medio RPMI 1640 (Bio-Whittaker #BE12-167F), complementado con una mezcla de L-glutamina, penicilina y estreptomicina (Sigma #G-6784), con la adición del 10% de suero de feto de ternera previamente descomplementado (Bio-Whittaker #BE02701 E) y de 8-azaguanina (Sigma #A-8526). Las células linfocitarias y las células mielomatosas, previamente colocadas en medio RPMI 1640 (Bio-Whittaker #BE12-167F) complementado con una mezcla de L-glutamina, penicilina y estreptomicina (Sigma 25 #G-6784) sin adición de suero de feto de ternera, se mezclan a razón de 5 células linfocitarias linfocitarias para 1 célula mielomatosa. Después de la centrifugación de la mezcla durante 7 minutos à 900 r/mn a temperatura ambiente, y resuspensión del residuo celular, se añade 1 ml de polietilenglicol Hybri-Max® (Sigma #P-7777). Después de 1 minuto de incubación al baño María a 37ºC, las células se centrifugan durante 1 minuto y treinta segundos a 1000 r/mn a temperatura ambiente. Finalmente después de incubación durante 2 minutos al baño María 30 a 37ºC, el residuo se resuspende y se añaden 6 ml de medio RPMI 1640 (Bio-Whittaker #BE12-167F) complementado con una mezcla de L-glutamina, penicilina y estreptomicina (Sigma #G-6784) previamente puesto a 37ºC, a razón de 100 µl cada 5 segundos, y 9 ml de este mismo medio se añaden de una sola vez. Después de la centrifugación durante 10 minutos a 900 r/mn a TA, y eliminación del sobrenadante, se recupera el residuo por el medio RPMI 1640 (Bio-Whittaker#BE12- 167F), complementado con una mezcla de L-glutamina, penicilina y 35 estreptomicina (Sigma #G-6784), con la adición del 15% de suero de feto de ternera, previamente descomplementado (Bio-Whittaker #BE02701E) y de HAT (Hipoxantina, aminopterina, timidina Sigma #H-0262), para distribuir, bajo 100 µl, 120.000 células por pocillo. La solución se deposita bajo 100 µl en los pocillos de las placas de cultivo de 96 pocillos previamente cultivados de macrófagos murinos. Las placas se colocan a continuación en una incubadora de CO2. Quince días después de la hibridación linfocitaria, el número de clones 40 presentes en las placas de fusión es estimado y expresado en porcentaje de desarrollo de los hibridomas.

La selección de hibridomas se efectúa en ELISA sobre proBNP(1-108) y un péptido portador de la secuencia RAPR76S77P. Solo se retienen los hibridoma que secretan anticuerpos capaces de detectar el proBNP(1-108) y el péptido C13P30 portador de la secuencia RAPR76S77P y que no reconocen sustancialmente el BNP(1-76) ni el BNP(77-108). Los hibridomas seleccionados se mantienen en cultivo y se clonan en dilución límite. Los 45 hibridomas así clonados se pueden usar a continuación para la producción del anticuerpo monoclonal en líquido de ascitis.

De este modo, los inventores han producido un hibridoma murino, el clon 3D4, que secreta una inmunoglobulina de isotipo IgG1 que presenta las características de los anticuerpos según la invención. Este hibridoma se ha registrado el 31 de julio de 2003 en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de 50 Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, Cedex 15, Francia) con el número de registro CNCM I-3070.

La invención tiene por lo tanto también por objeto el hibridoma 3D4 registrado en la CNCM con el número de registro CNCM I-3070 y el anticuerpo monoclonal que secreta.

Ejemplo 12: Validación en ELISA de la especificidad del anticuerpo producido por el hibridoma 3D4

Materiales

1) Fase sólida: microplaca Maxisorp de fondo plano, Nunc (Dinamarca).

2) El BNP(77-108) procede de Sigma (#B-5900), mientras que el proBNP(1-108) y el BNP(1-76) se han producido en forma de proteína recombinadas. La concentración de estas soluciones de proteínas se ha determinado 5 mediante el procedimiento Bradford de determinación colorimétrica de las proteínas (Bradford M. Anl. Biochem. 1976; 72:248-54-). 3) El conjugado usado es un anticuerpo policlonal de burro anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa (Jackson Immunoresearch # 715-035-150)

4) Tampón de saturación_ tampón PBS Dulbecco de pH 7,4 , que contiene el 0,1% de albumina bovina sérica (BSA, 10 Sigma #A-7888)

5) Tampón de dilución: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de BSA y el 0,1% de Tween 20.

6) Solución de lavado: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de Tween 20.

7) Solución de revelado: la solución de revelado se compone de:

o 7ª) un tampón sustrato: solución de ácido cítrico 0,01 M, y citrato trisódico 0,04M que contiene 15 H2O2 al 0,33%, de pH final 5,6, y

o 7b) un cromógeno: comprimido de OPD (ortofenilenodiamina). 1 comprimido de OPD a disolver en 10ml de tampón sustrato.

8) Solución de parada: H2SO4 4N

Protocolo: 20

El ensayo consiste en evaluar la inmunorreactividad del sobrenadante de cultivo del hibridoma 3D4 directamente sobre las diferentes proteínas inmovilizadas en las cúpulas de una placa de microvaloración.

- Se preparan en primer lugar varias soluciones de sensibilización en tampón PBS Dulbecco pH 7,4: una primera que contiene BNP(77-108) a 1 µg/ml, una segunda que contiene BNP(1-108) a 1 µg/ml, y una tercera que contiene BNP(1-76) a 1 µg/ml. 25

- 100 µl de cada una de estas soluciones se depositan por separado en los pocillos de una microplaca.

- La microplaca se incuba durante una noche a 4ºC.

- Después de la eliminación de la solución de sensibilización, la microplaca se lava con la ayuda de tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de Tween 20, y a continuación se satura por adición de 250 µl del tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 1% de BSA. 30

- La microplaca se incuba entonces durante 1 hora a 37ºC

- La microplaca se lava a continuación (3 veces) con 300ml de la solución de lavado.

- En cada cúpula, se depositan 100 µl de sobrenadante del hibridoma 3D4, previamente diluido al ½ en el tampón de dilución

- El medio de reacción se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente 35

- la microplaca se lava a continuación 3 veces con 300 µl de la solución de lavado

- se añaden 100 µl de conjugado, anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón acoplado a la perosidasa diluido a 1/2000 en tampón de dilución a cada pocillo de la microplaca,

- el medio de reacción se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente

- A continuación las placas se lavan (5 lavados) con 300 µl de la solución de lavado. En cada cúpula, se distribuyen 100 µl de la solución de revelado. Se deja que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente (18-24ºC).

- A continuación se distribuyen 50 µl de la solución de parada en cada cúpula.

- Después de la parada de la reacción, la lectura de la densidad óptica se efectúan en el espectrómetro a 5 490/620 nm.

La figura 8 ilustra el resultado de este ensayo: el anticuerpo producido en el sobrenadante del hibridoma 3D4 es capaz de detectar únicamente el proBNP(1-108) y el péptido de inmunización C13P30, no se obtiene ninguna reactividad sobre el BNP(1-76) ni el BNP(77-108). Estos resultados validan la especificidad del anticuerpo producido por el hibridoma 3D4 para el proBNP(1-76) con la exclusión del BNP-(1-76) y del BNP(77-108). 10

El anticuerpo según la invención procedente del hibridoma 3D4 es por lo tanto efectivamente un anticuerpo que reconoce de manera específica el proBNP(1-108), con la exclusión sustancial del BNP-1-76) y del BNP(77-108).

Ejemplo 13: Validación en western-blot de la especificidad del anticuerpo producido por el hibridoma 3D4

Materiales: 15

1) Equipo de electroforesis SDS-PAGE clásico

2) Gel de concentración: acrilamida al 5%

3) Gel de separación: acrilamida al 16%

4) Tampón ánodo: Tris 0,2M, pH 8,9

5) Tampón cátodo: Tris-tricina 0,1M; SDS al 0,1% 20

6) Tampón de la muestra: Tris 0,5M, pH 6,8; glicerol al 25%, SDS al 2%; betamercaptoetanol 14,4mM, azul de bromofenol al 0,1%

7) Aparato de transferencia electroforético

8) Tampón de transferencia: Tris base 25 mM; glicina 190 mM; metanol al 20%; SDS al 0,05%

9) El BNP(77-108) procede de sigma (#B-5900) mientras que el proBNP(1-108)-GST, el BNP(1-76-GST y la 25 GST (utilizada como testigo negativo) se han producido en forma de proteínas recombinadas. La concentración de estas soluciones de proteínas se ha determinado por el procedimiento Bradford de determinación colorimétrica (Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54).

10) El conjugado utilizado es un anticuerpo policlonal de burro anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa (Jackson Immunoresearch # 715-035-150) 30

11) Kit ECL de detección en western-blot (Amersham Biosciences #RPB2106)

Protocolo:

La aplicación de este ensayo comprende tres grandes etapas: la migración electroforética de las diferentes proteínas en un gel de acrilamida al 16%, a continuación la transferencia de estas proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa, y finalmente el western-blot. 35

- - Se preparan diversas soluciones en tampón de muestra bajo un volumen final de 35 µl: una primera que comprende 1 µg de BNP(1-108)-GST, una segunda que comprende 1 µg de GST, una tercera que comprende 1 µg de BNP(1-76)-GST, y una cuarta que comprende 1 µg de BNP(77-108). a 1 µg/m.

- Cada solución se incuba al baño María durante 5 minutos a 100ºC, y a continuación se deposita en un pocillo del gel. La migración a través del gel de acrilamida se realiza bajo tensión constante de 120 V 40 durante 1 hora y 30 minutos. La figura 9 corresponde a una fotografía del gel de acrilamida obtenido. Las proteínas se colorean mediante el azul de coomasie.

- Después de la migración las proteínas del gel se transfieren sobre una membrana de nitrocelulosa durante 1 hora a 120 mA.

- La membrana de nitrocelulosa se lava a continuación con tampón PBS + Tween al 0,1% y se satura durante 30 minutos a temperatura ambiente en tampón PBS + Tween al 0,1% + leche desnatada al 2%.

- Después de 3 lavados con tampón PBS + Tween al 0,1%, la membrana se incuba durante 1 hora a 37ºC 5 con agitación, con 5 ml de sobrenadante del hibridoma 3D4.

- Después de 3 lavados con tampón PBS + Tween al 0,1%, la membrana se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación, con 10 ml de conjugado anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa diluido al 1/2000 en tampón PBS + Tween 0,1% + leche desnatada al 2%.

- Después de 3 lavados con tampón PBS + Tween al 0,1%, la membrana se sumerge en el reactivo de 10 revelado ECL antes de exponerse a una película fotográfica durante 4 minutos.

Como se muestra en la figura 10 que corresponde a la imagen escaneada de la fotografía obtenida, el anticuerpo producido en el sobrenadante del hibridoma 3D4 es capaz de detectar únicamente la banda correspondiente al proBNP(1-108). El BNP(1-76), el BNP(77-108), así como la GST no son detectado por el anticuerpo del hibridoma 3D4. Estos resultados validan igualmente la especificad del anticuerpo producido por el hibridoma 3D4 para el 15 proBNP(1-108).

El anticuerpo según la invención procedente del hibridoma 3D4 es por lo tanto efectivamente un anticuerpo que reconoce de manera específica el proBNP(1-108), con la exclusión sustancial del BNP(1-76) y del BNP(77-108).

Ejemplo 14: Identificación del epítope reconocido por el anticuerpo producido por el hibridoma 3D4 por el 20 procedimiento spot

El sobrenadante del hibridoma 3D4 se a ensayado mediante el procedimiento spot (descrito en el ejemplo 6) para identificar el epítope reconocido por el anticuerpo del hibridoma 3D4. Los resultados obtenidos indican que el anticuerpo 3D4 reconocía efectivamente secuencias peptídicas que comprenden el motivo RAPR76S77P.

Estos resultados concuerdan con los obtenidos en ELISA (ejemplo 12) y western-blot (ejemplo 13) que 25 validan la especificidad del anticuerpo 3D4 para el proBNP(1-108).

Ejemplo 15.- determinación radioinmunométrica del proBNP(1-108)

Materiales:

1) Fase sólida: microplaca Maxisorp de fondo plano y pocillos separables Nunc (Dinamarca).

2) El anticuerpo de captura utilizado es el anticuerpo obtenido a partir del suero del conejo #046 805 no 30 agotado.

3) El conjugado utilizado es un anticuerpo antiBNP(77-108) marcado al I125(antiBNP-I125). se trata del anticuerpo trazador del kit Shionoria comercializado por la sociedad Shionogi

4) Tampón de saturación: Tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 1% de albúmina bovina sérica (BSA, Sigma #A-7888) 35

5) Tampón de dilución: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de BSA y el 0,1% de Tween 20 (Sigma #P-1379).

6) Tampón de lavado: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de Tween 20.

Patrón proBNP(1-108): producido en forma de proteína recombinada.

Protocolo: 40

El principio del ensayo utilizado se basa en el procedimiento radioinmunológico de tipo sándwich, realizado en microplaca de fondo plano y cúpulas separables. Se trata de un ensayo en un tiempo donde la muestra (o solución patrón de proBNP(1-108)) y trazador se añaden uno tras otro sin lavado intermedio.

- Se prepara en primer lugar una solución de sensibilización con el anticuerpo policlonal del conejo #046 805 diluido en tapón PBS Dulbecco de pH7,4: a 40 µg/ml. 300 µl de esta solución se deposita en cada uno de los pocillos de la microplaca.

- La microplaca se incuba durante una noche a 4ºC.

- Después de la eliminación de la solución de sensibilización, la microplaca se lava con la ayuda de 300 µl 5 de un tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de Tween 20, y a continuación se satura por adición de 300 µl del tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 1% de BSA.

- La microplaca se incuba entonces durante 1 hora a 37ºC

- La microplaca se lava a continuación (3 veces) con la ayuda de la solución de lavado (tampón PBS Dubelco de pH 7,4, con adición de Tween 20 al 0,1%). 10

- En cada cúpula, se depositan 100 µl de solución patrón de proBNP(1-108), del suero o de plasma. El proBNP(1-108), si está presente, se liga al anticuerpo de captura retenido en la fase sólida.

- Se añaden 200 µl de la solución de trazador anti-BNP-I125 lista para su uso (extracto del kit Shionoria de Shionogi) en cada uno de los pocillos.

- El medio de reacción se incuba durante una noche (18-22 h) 4ºC 15

- Al día siguiente, la microplaca se lava a continuación 3 veces con 300 µl de la solución de lavado. En el último lavado y después de la aspiración de la solución de lavado, cada cúpula es transferida a un tubo previamente identificado.

La radiactividad presente en cada cúpula y proporcional a la cantidad de trazador fijado, por lo tanto a la cantidad de proBNP(1-108) presente en la muestra, se mide con la ayuda de un contador gamma. 20

La figura 11 presenta los resultados obtenido con la ayuda de una gama patrón de proBNP(1-108).

Ejemplo 16: Resultados de la determinación de muestras humanas

Con la ayuda de la determinación IRMA proBNP (1-108) según la invención descrita en el ejemplo 15 y de la determinación BNP(1-76) comercializada por la sociedad Roche y realizada en el autómata Elecsys®, se han ensayado 14 tomas de muestras de individuos sanos y 15 tomas de muestras de pacientes con insuficiencia 25 cardiaca. Las muestras sanguíneas se toman en un tubo que contiene EDTA. La figura 12 presenta los resultados en cpm (corte por minuto) de los ensayos de estas determinaciones de muestras con la determinación IRMA proBNP(1-108) según la invención. Los resultados obtenidos sobre las muestras de pacientes con insuficiencia cardiaca son significativamente más elevados que los obtenidos sobre muestras de individuos sanos. Estos resultados ponen de manifiesto la presencia de proBNP(1-108) circulante en las muestras de pacientes con 30 insuficiencia cardiaca y constituyen la primera demostración de que el proBNP(1-108) sérico es un marcador predictivo de la insuficiencia cardiaca. La figura 13 presenta la correlación entre las concentraciones de proBNP(1-108) (en pg/ml) determinadas con la ayuda de la determinación IRMA proBNP según la invención y las concentraciones de BNP-(1-76) (pg(ml) determinadas con la ayuda de la determinación Roche en el autómata (Elecsys®, de las muestras de 14 pacientes con insuficiencia cardiaca. La correlación observada es significativa 35 con un coeficiente R2 = 0,85.

Ejemplo 17: Acoplamiento del anticuerpo policlonal del conejo #046 805 a la biotina

El procedimiento de acoplamiento utiliza un derivado N-Hidroxi Succinimida (NHS) de la biotina que reacciona con las laminas primarias de IgG para formar un enlace amida.

Une solución de (+)-Biotina N-succinimidiloester (Fluka #14405) de 100mM se prepara por disolución de la 40 Biotina en dimetilfornamida. La biotinilación se realiza en un frasco de vidrio. Se depositan 500 µg del anticuerpo policlonal del conejo #046 805 previamente purificado pero no agotado en el frasco con 17 µl de la solución de biotina 100mM (la relación molar biotina/anticuerpo es de 500). La reacción se hace en tampón PBS Dulbecco de pH 7,4. La mezcla de reacción se incuba durante 1 hora 30 minutos a temperatura ambiente con agitación lenta. Después del acoplamiento, la biotina se inactiva por adición de un volumen de tampón glicina 2M. La mezcla se 45 incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación lenta. finalmente la mezcla se dializa durante una

noche a 4ºC contra tampón PBS Dulbecco de pH 7,4. Al día siguiente, se añade una solución de azida sódica al 0,02% en concentración final. el conjugado se conserva a 4ºC.

Ejemplo 18: Determinación inmunoenzimométrica del proBNP(1-108)

Se ha puesto a punto también una determinación inmunoenzymométrica.

Materiales 5

1) Fase sólida : microplaca Maxisorp de fondo plano, Nunc (Dinamarca).

2) El anticuerpo de captura utilizado es un anticuerpo policlonal antiBNP(77-108) comercializado por la sociedad Strategic Biosolución (#B9105RAOO- AO).

3) El conjugado utilizado es el anticuerpo policlonal del conejo #046 805 no agotado acoplado a la biotina según el procedimiento descrito en el ejemplo 17. 10

4) Conjugado estreptavidina-peroxidasa (Amersham Pharmacia Biotech #RPN1231V)

5) Tampón de saturación: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4 que contiene el 1 % de albúmina bovina sérica (BSA, Sigma #A-7888)

6) Tampón de dilución: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4 que contiene el 0.1 % de BSA y el 0,1 % de Tween 20.

7) Solución de lavado: tampón PBS Dulbecco de pH 7,4 que contiene el 0,1% de Tween 20. 15

8) Patrón proBNP(1-108) : proteína recombinada.

9) Solución de revelado: la solución de revelado se compone de:

9a) un tampón substrato :Solución de ácido cítrico 0,01 M, y citrato trisódico 0,04M que contiene H202 al 0,33%, de pH final 5,6, y

9b) un cromógeno: de OPD (ortofenilenodiamina). 1 comprimido de OPD a disolver en 10ml de tampón 20 sustrato.

10) Solución de parada: H2S04 4N.

Protocolo:

El principio del ensayo utilizado se basa en el procedimiento radioinmunológico de tipo sándwich, realizado en microplaca de fondo plano. Se trata de un ensayo en dos tiempos donde la muestra (o solución patrón) se incuba 25 en primer lugar con el anticuerpo de captura, y después de la incubación y los lavados, se añade el anticuerpo de detección.

- Se prepara en primer lugar una solución de sensibilización con el anticuerpo policlonal anti-BNP(77-108) diluido en tampón PBS Dulbecco de pH7,4: a 10 µg/ml. 100 µl de esta solución se depositan en cada uno de los pocillos de la microplaca. 30

- La microplaca se incuba durante una noche a 4ºC.

- Después de la eliminación de la solución de sensibilización, la microplaca se lava con la ayuda de 300 µl de un tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 0,1% de Tween 20, y a continuación se satura por adición de 250 µl del tampón PBS Dulbecco de pH 7,4, que contiene el 1% de BSA.

- La microplaca se incuba entonces durante 1 hora a 37ºC 35

- La microplaca se lava a continuación (3 veces) con la ayuda de la solución de lavado.

- En cada cúpula, se depositan 100 µl de solución patrón de proBNP(1-108), de suero o de plasma. El proBNP(1-108), si está presente, se liga al anticuerpo de captura retenido en la fase sólida.

- El medio de reacción se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.

- La microplaca se lava a continuación (5 lavados) con 300 µl de solución de lavado.

- Se añaden 100 µl de anticuerpo policlonal del conejo #046 805 biotilinado (concentrado a 6µg/ml) en cada pocillo

- El medio de reacción se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.

- La microplaca se lava a continuación (5 lavados) con 300 µl de solución de lavado. 5

- Finalmente se añaden 100 µl de conjugado estreptavidina-POD diluido al 1/1000 en cada uno de los pocillos de la microplaca.

- El medio de reacción se incuba durante 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente.

- Las placas se lavan a continuación (5 lavados) con 300 µl de solución de lavado. En cada cúpula, se distribuyen 100 µl de la solución de revelado. Se deja que se desarrolle la reacción en la oscuridad durante 10 20 minutos a temperatura ambiente (18-24ºC)

- A continuación se distribuyen 50 µl de la solución de parada en cada cúpula.

Después de la parada de la reacción se efectúa la lectura de la densidad óptica con el espectrofotómetro a 490/620 nm.

La figura 14 presenta los resultados obtenidos con la ayuda de una gama patrón de proBNP(1-108). 15

Ejemplo 19: Evaluación de la reacción cruzada, respecto del BNP(1- 76) y del BNP (77-108), del anticuerpo policlonal del conejo #046 805 no agotado acoplado a la biotina, utilizado en sándwich en la determinación ELISA proBNP (1-108) junto con el anticuerpo policlonal anti-BNP(77-108).

Con la ayuda de la determinación ELISA proBNP(1-108) descrita en el ejemplo 18, se ha evaluado la reacción cruzada de la determinación respecto al anticuerpo antiproBNP(1-108) según la invención (conejo # 046 20 805), no agotado, biotinilizado, respecto del BNP (1-76) y del BNP(77-108). Se han realizado gamas de concentraciones de 5ng/ml a 100ng/m con proBNP(1-108), BNP(1-76) y BNP(77-108) y se han ensayado con la ayuda de la determinación ELISA ProBNP (1-108) descrita en el ejemplo 18. Los resultados de la variación de la densidad óptica a 490nm en función de la concentración se representan en la figura 15 para cada una de las proteínas. no se observa ninguna reacción cruzada respecto del BNP(1-76) o del BNP(77-108): la señal obtenida es 25 equivalente al ruido de fondo, sea cual sea la concentración ensayada. A las concentraciones de BNP(1-76) y de BNP(77-108) habitualmente encontradas en los pacientes (del orden del ng/ml para las concentraciones más elevadas), el anticuerpo policlonal del conejo # 046 805 se puede utilizar en su versión no agotada sin conllevar la aparición de reacción cruzada.

Ejemplo 20: Evaluación de la reacción cruzada, respecto del BNP(1-76) y del BNP(77-108), del anticuerpo 30 policlonal del conejo #046 805 no agotado acoplado a la biotina, utilizado en sándwich en la determinación ELISA proBNP (1-108) junto con el anticuerpo policlonal anti-BNP (1-29).

Con la ayuda de una determinación ELISA que utiliza el procedimiento y los reactivos descritos en el ejemplo 18, aparte de que el anticuerpo policlonal anti-BNP(77-108) se sustituye por un anticuerpo policlonal anti-NT-proBNP (1-29), se ha evaluado la reacción cruzada del anticuerpo policlonal del conejo #046 805 no agotado 35 biotinilado respecto del BNP(1-76) y del BNP(77-108).

El anticuerpo policlonal anti-NT-proBNP(1-29) se ha producido según el protocolo descrito en el ejemplo 3, aparte de que el péptido utilizado como inmunógeno era el péptido NT-proBNP(1-29) acoplado a la KLH. Se han realizado gamas de concentraciones de 5ng/ml a 100ng/ml con proBNP(1-108), BNP(1-76) y BNP(77-108) y se han ensayado con la ayuda de la determinación ELISA ProBNP(1-108). Los resultados de la variación de la densidad 40 óptica a 490nm en función de la concentración se representan en la figura 16 para cada una de las proteínas. No se ha observado ninguna reacción cruzada respecto del BNP (1-76) y del BNP(77- 108), la señal obtenida es equivalente a ruido de fondo, sea cual sea la concentración ensayada. A las concentraciones de BNP(1-76) y de BNP(77-108) habitualmente encontradas en los pacientes (del orden del ng/ml), el anticuerpo policlonal del conejo #046 805 se puede utilizar en su versión no agotada sin conllevar la aparición de una reacción cruzada 45

En resumen , de desprende claramente de toda la exposición que antecede que la presente invención ha permitido un nuevo epítope, RAPR76S77P, situado en la región bisagra del proBNP(108) humano, derivar péptidos

inmunogénicos que lo contienen, y obtener anticuerpos específicos del proBNP(108), que no reconocen sustancialmente el BNP(1-76) y el BNP(77-108), y por lo tanto algunos de ellos tienen la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas.

Aparece también claramente que la presente invención ha permitido la puesta a punto de una determinación del proBNP(1-108) circulante que permite de este modo un diagnóstico de la insuficiencia cardiaca 5 de manera sencilla, utilizable por rutina y fiable.

Listado de secuencias

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Anticuerpo anti proBNP(1- 108) caracterizado porque, por una parte, reconoce un epítope que comprende la secuencia RAPR76S77P (SEQ ID Nº 5) del proBNP(1-108) y no reconoce sustancialmente los péptidos BNP (1-76) ni el BNP (77-108), y, por otra parte, tiene la capacidad de reconocer específicamente el proBNP (1-108) circulante en muestras séricas o plasmáticas humanas. 5
2. 2.- Anticuerpo anti proBNP(1-108) según la reivindicación 1 que reconoce de manera específica la secuencia V70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID Nº4) del proBNP(1-108).
3. 3.- Anticuerpo anti proBNP(1-108) según la reivindicación 1 que reconoce de manera específica la secuencia Y70TLRAPR78S77PKMVQGS84 (SEQ ID Nº108) del proBNP(1-108).
4. 4.- Anticuerpo anti proBNP(1-108) según una de las reivindicaciones 1 a 3, dicho anticuerpo es monoclonal. 10
5. 5.- Anticuerpo anti proBNP(1-108) según la reivindicación 4, secretado por el hibridoma 3D4 registrado en la CNCM con el Nº CNCM I-3073.
6. 6.- Hibridoma que produce un anticuerpo tal como se ha definido en la reivindicación 5, denominado 3D4 y registrado en la CNCM con el Nº CNCM I-3073.
7. 7.- Péptido de fórmula: 15

   a1-X1-RAPRSP-X2-a2 (I)

   en la que

   a1 puede ser H o representar una función o un grupo químico elegido entre una función tiol, alcohol, aminoxi, amina primaria o secundaria, un grupo aminocarboxilo, un grupo biotinilo y un grupo acetilo,

   X1 representa una secuencia peptídica de 0 a 3 aminoácidos, procedente de la secuencia natural del 20 proBNP(1-108) o no,

   X2 representa una secuencia peptídica de 0 a 7 aminoácidos, procedente de la secuencia natural del proBNP(1-108) o no,

   a2 puede representar una función OH, NH2 o un grupo alcoxilo.
8. 8.- Péptido de fórmula: 25

   X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (II)

   en la que X puede ser H o representar bien un grupo acetilo, bien 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP (1-108), y en la que Z puede representar una función OH, o 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP(1-108).
9. 9.- Péptido según la reivindicación 8, que tiene la secuencia X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85- Z (SEQ ID 30 Nº4)
10. 10.- Péptido de fórmula

    X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84- Z (III)

    en la que X puede ser H o representar bien un grupo acetilo, bien 1 a 3 aminoácidos no pertenecientes a la secuencia del proBNP (1-108), y en la que Z puede representar una función OH, o 1 a 3 aminoácidos no 35 pertenecientes a la secuencia del proBNP(1-108).
11. 11.- Péptido según la reivindicación 10, que tiene la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 (SEQ ID Nº 108)
12. 12.- Péptido que comprende una secuencia derivada de la secuencia del péptido de fórmula (II) tal como se ha definido en la reivindicación 8 o del péptido de fórmula (III) tal como se ha definido en la reivindicación 10 por sustitución de uno o más aminoácidos entre los aminoácidos Y70, T71, L72, K79, M80, V81, Q82, G83, S84 y G85. 40
13. 13.- Péptido según la reivindicación 7, que tiene una secuencia elegida en el grupo constituido por las

    siguientes secuencias:

    SEQ ID Nº 16:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (péptido C13P30)

    SEQ ID Nº 109: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (péptido CN32)

    SEQ ID Nº 6: C-G-R-A-P-R-S-P

    SEQ ID Nº 7: Acetil -C-G-R-A-P-R-S-P 5

    SEQ ID Nº 8: C-G-R-A-P-R-S-P-K

    SEQ ID Nº 9: Acetil -C-G-R-A-P-R-S-P-K

    SEQ ID Nº 10 C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V

    SEQ ID Nº 11: C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G

    SEQ ID Nº 12: R-A-P-R-S-P-G-C 10

    SEQ ID Nº 13: Acetil -R-A-P-R-S-P-G-C

    SEQ ID Nº 110: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K

    SEQ ID Nº 111: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V

    SEQ ID Nº 112: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q

    SEQ ID Nº 113: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G 15

    SEQ I D N 19:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-BA

    SEQ ID Nº 20: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-A

    SEQ ID Nº 114: Acetil -C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q

    SEQ ID Nº 115: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G

    SEQ ID Nº 116: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S 20

    SEQ ID Nº 117: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S-G

    SEQ ID Nº 118: C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V

    SEQ ID Nº 119: C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q

    SEQ ID Nº 120: L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-C

    SEQ ID Nº 121 C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S 25

    SEQ ID Nº 122 C-L-R-A-P-R-S-P-K -M-V-Q-G-S-G
14. 14.- Kit de detección del proBNP (1-108) en una muestra biológica, que contiene al menos un anticuerpo tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 5.
15. 15.- Kit de detección del proBNP (1-108) en una muestra biológica, que contiene, como patrón y/o testigo, al menos un péptido según se ha definido en una de las reivindicaciones 7 a 13. 30
16. 16.- Kit de detección del proBNP(1-108) en una muestra biológica según la reivindicación 14 o 15, que contiene:

    (i) en un recipiente, a menos un anticuerpo tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 5,

    (ii) en otro recipiente, al menos un péptido tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 7 a 13.

17. 17.- Procedimiento de obtención de un anticuerpo anti proBNP(1-108) tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1, 2 y 3 en el que se inmuniza un animal con la molécula entera de proBNP(1-108), y a continuación se agota, con la ayuda del péptido BNP(77-108) y/o del péptido BNP(1-76), el antisuero obtenido.
18. 18.- Procedimiento de obtención de un anticuerpo anti proBNP(1-108) tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1, 2 y 3 en el que se inmuniza un animal con un péptido tal como se ha definido en una de las 5 reivindicaciones 7 a 13, y eventualmente se agota con la ayuda del péptido BNP(77-108) y/o del péptido BNP(1-76), el antisuero obtenido.
19. 19.- Procedimiento de obtención de hibridoma secretor de anticuerpos anti proBNP (1-108) tal como se ha definido en la reivindicación 4 o 5, en el cual

    - se inmuniza un animal con un péptido tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 7 a 13, 10

    - se toman linfocitos secretores de inmunoglobulinas de este animal,

    - se procede a una fusión de los linfocitos con células de mieloma para obtener al menos un hibridoma secretor de inmunoglobulinas,

    - y se selecciona un hibridoma secretor de anticuerpos monoclonales específicos.

20. 20.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 18 y 19, en el cual el péptido es un péptido de fórmula (II) 15 que tiene la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85 (SEQ ID Nº 4).
21. 21.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 18 y 19, en el cual el péptido es un péptido de fórmula (III) que tiene la secuencia Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84 (SEQ ID Nº 108).
22. 22.- Procedimiento de diagnóstico in vitro de la insuficiencia cardiaca en un humano que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica con un anticuerpo anti proBNP (1-108), tal como se ha definido en una de las 20 reivindicaciones 1 a 5, y la detección del proBNP(1- 108) en la muestra.
23. 23.- Procedimiento de diagnóstico in vitro de la insuficiencia cardiaca en un ser humano que comprende;

    a) la puesta en contacto de una muestra biológica con un anticuerpo anti proBNP (1-108) tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 5,

    b) la incubación de la mezcla en condiciones que permiten la formación de complejos antígenos-anticuerpos; 25 y

    c) el revelado de los complejos antígenos-anticuerpos formados,

    eventualmente con la ayuda de un anticuerpo de detección marcado, capaz de ligarse específicamente al proBNP (1-108) presente en el primer complejo, o con la ayuda de un antígeno de detección, marcado, capaz de ligarse al anticuerpo dirigido contra dicho proBNP(1-108) presente en el primer complejo. 30
24. 24.- Procedimiento de diagnóstico según la reivindicación 23 que comprende, además, una etapa d) de correlación de la cantidad de los complejos antígenos-anticuerpos revelados en el estado clínico del individuo.