ES2354677A1 - Envase inteligente para la detección de microorganismos. - Google Patents
Envase inteligente para la detección de microorganismos. Download PDFInfo
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Abstract
Envase inteligente.La presente invención se refiere a un nuevo envase inteligente, diseñado a partir de un nuevo material que comprende un soporte sólido adsorbente parcialmente polar impregnado en una disolución de vainillina, que permite la detección visual del crecimiento de microorganismos en productos de diferente naturaleza sin necesidad de estar en contacto directo con el microorganismo ni con el medio que lo contiene.
Description
Envase inteligente para la detección de
microorganismos.
La presente invención se enmarca dentro del
sector alimentario, químico-farmacéutico y de la
cosmética. Concretamente, se refiere a un nuevo material formado por
un soporte sólido adsorbente parcialmente polar impregnado con una
disolución de vainillina y a su uso como sensor colorimétrico para
la detección de la presencia de microorganismos en alimentos, en
productos cosméticos o farmacéuticos.
Todos los años existen en el mundo innumerables
casos de ingresos hospitalarios como consecuencia de
toxi-infecciones alimentarias, derivadas de la
presencia de microorganismos.
Por su parte, el consumidor del siglo XXI
demanda alimentos de gran calidad sensorial y alto valor nutritivo,
es decir mínimamente procesados, en detrimento de los productos
convencionales. Es obvio que la aplicación de unas condiciones de
procesado menos drásticas comporta un incremento del riesgo
microbiológico y por lo tanto, la variabilidad del comportamiento
microbiano adquiere una importancia crítica, ya que debe conocerse
la posibilidad real de supervivencia y desarrollo de la microbiota
residual en cualquier producto, para determinar con precisión su
vida útil o los riesgos microbiológicos que el productor está
dispuesto a asumir.
El estudio de la incidencia y prevalencia de
patógenos en alimentos es de hecho uno de los objetivos prioritarios
de la Unión Europea en materia de seguridad alimentaria. Su
finalidad es poder valorar qué riesgo entrañan en realidad los
alimentos, así como la adopción de criterios microbiológicos y
objetivos de seguridad alimentaria para algunos tipos de
alimentos.
Actualmente no existe en el mercado ningún
material con compuestos naturales que sea capaz de detectar de forma
visual la presencia de un amplio rango de microorganismos en los
productos envasados. Por ello, ni el consumidor ni el vendedor o
distribuidor pueden conocer si los productos envasados están
contaminados o no por microorganismos. En el caso de microorganismos
patógenos esta situación supone un grave riesgo para la salud. Para
su control es necesario recurrir a exámenes microscópicos y análisis
microbiológicos o siembras en medios de cultivo selectivos, lo que
implica un gran consumo de recursos de personal y material. Además
estos métodos son destructivos, lo que implica que el producto
analizado ya no está disponible en la cadena comercial, y requieren
un gran consumo de tiempo, puesto que desde que se realiza la
siembra, hasta que se realiza el recuento de microorganismos, pasan
entre 2 y 7 días, sin tener en cuenta el tiempo necesario para el
pre-enriquecimiento. Dichos análisis implican además
un coste de laboratorio importante. En cualquier caso estos análisis
se realizan de forma aleatoria para un número representativo de
muestras, pero en ningún caso pueden realizarse para todas las
unidades de todas las partidas de alimentos, con lo que siempre
existe un riesgo potencial de que haya contaminación microbiana en
un producto y no sea detectado por el productor o el consumidor
final. En productos farmacéuticos el riesgo es mucho mayor, ya que
sólo se detecta que ha habido un problema de esta naturaleza cuando
ya ha causado el daño, con frecuencia irreparable.
En los últimos años, los sistemas de envasado
para alimentos han ido evolucionando como respuesta a las exigencias
de los consumidores en cuanto a la caducidad, conservación de sus
propiedades, frescura, apariencia, etc. Por una parte, los métodos
modernos de marketing necesitan un envasado atractivo que comunique
algo al consumidor para que de esta forma éste adquiera el producto.
En segundo lugar los envases han ido evolucionando a lo largo de los
años como respuesta a los profundos cambios en la forma de vida, y
la industria del envasado ha tenido que responder a estos
cambios.
Los envases han de cumplir, entre otras, las
siguientes funciones:
- 100
- contener el alimento,
- 100
- proteger el alimento de las acciones físicas, químicas y microbiológicas,
- 100
- conservar la calidad y salubridad del alimento,
- 100
- evitar fraudes,
- 100
- acondicionar el producto para la manipulación comercial,
- 100
- presentar e identificar el producto,
- 100
- informar al consumidor de las características del alimento,
- 100
- alargar la vida útil, etc.
Últimamente, y debido a las nuevas exigencias en
la demanda de los consumidores, han surgido dos nuevos conceptos de
envase. El envase activo y el envase inteligente. Los envases
activos e inteligentes pueden ser vistos como la próxima generación
en el envasado de alimentos.
Los materiales y objetos activos en contacto con
alimentos se definen, de acuerdo con la Directiva Europea 1935/2004.
como aquellos destinados a ampliar el tiempo de conservación, o a
mantener o mejorar el estado de los alimentos envasados, y que están
diseñados para incorporar deliberadamente componentes que transmitan
sustancias a los alimentos envasados o al entorno de éstos o que
absorban sustancias de los alimentos envasados o del entorno de
éstos. En los últimos años se ha producido un desarrollo importante
en el campo del envase activo, con un gran número de publicaciones
haciendo referencia a este tema (Rodríguez, A., Battle, R.,
Nerín, C (2007) "The use of natural esential oils as antimicrobial
solutions in paper packaging. Part II". Progress in Organic
Coatings 60(1): 33-38); Rodríguez, A, Nerín,
C., y Battle, R (2008). "New cinnamon-based active
paper packaging against Rhizopusstolonifer food spoilage".
Journal of Agricultural and Food Chemistry 56 (15)); López, P.;
Sánchez, C.; Batlle, R, and Nerín, C. (2007b). "Development of
flexible antimicrobial films using essential oils as active
agents". Journal of Agricultural and Food Chemistry
55(21): 8814-8824); Gutiérrez, L; Sánchez,
C.: Batlle, R.: Nerín. C. (2009). "New antimicrobial active
package for bakery products". Trends in Food Science &
Technology 20(2); 92-99.
En cuanto al envase inteligente, las finalidades
son diferentes, y ello justifica su separación con una designación
especial. Su acción posibilita un sueño en las pretensiones del
consumidor del mundo moderno, siendo el envase mismo el que habla de
la calidad del producto que contiene o de los sucesos que han
marcado su procesado, actuando como chivato de posible mal estado o
degradación, así como de un mantenimiento, transporte o distribución
inadecuada. Según la Directiva 1935/2004, los envases inteligentes
se definen como aquellos materiales que controlan el estado de los
alimentos envasados o el entorno de éstos.
Como "envases inteligentes" se
clasificarían aquellos que utilizan, bien propiedades, bien
componentes del alimento o de algún material del envase como
indicadores del historial y calidad del producto; hasta el momento
se trata fundamentalmente de indicadores de
tiempo-temperatura, indicadores de calidad
microbiológica, indicadores de oxígeno o dióxido de carbono.
El envase inteligente se define por tanto como
aquel que monitoriza las condiciones del alimento envasado dando
información sobre la calidad del alimento envasado durante el
transporte y el almacenamiento, entendiendo por condición del
alimento:
- 100
- procesos fisiológicos (respiración de frutas y verduras frescas)
- 100
- procesos químicos (oxidación de lípidos)
- 100
- procesos físicos (endurecimiento de pan, deshidratación)
- 100
- aspectos microbiológicos (dañado por microorganismos), e
- 100
- infección (por insectos).
Estos envases despiertan un gran interés en la
industria alimentaria y la prueba de ello radica en que se está
realizando actualmente un gran esfuerzo en el desarrollo e
investigación de este tipo de envases.
Dentro de este grupo se encuentran los envases
que portan etiquetas, tintes o esmaltes, que se utilizan como
indicadores de la calidad, seguridad o tratamiento del producto
envasado. Se fundamentan en reacciones
físico-químicas, enzimáticas u otras, que dan lugar
generalmente, al cambio de color del dispositivo, señalando de esa
forma el daño o cambio que tuvo lugar en el alimento.
Así se puede comenzar a explotar la posibilidad
de usar la interacción entre el alimento y el envase como algo
positivo, es decir, bloqueando o inhibiendo las causas de la
descomposición de los alimentos.
Muchos de los indicadores inteligentes
existentes son de gran utilidad para la industria del envasado de
los alimentos, tales como indicadores de
tiempo-temperatura, integridad del envase,
crecimiento microbiano, autenticidad del envase, etc. Existen varios
de estos sistemas patentados pero sólo unos pocos son comerciales,
entre los que destacan los indicadores de
tiempo-temperatura.
No se encuentran muchas referencias en cuanto al
desarrollo de envases inteligentes que sean capaces de detectar de
forma rápida y eficaz la presencia de microorganismos en el alimento
en el momento de adquisición o ingesta. Dado que la ingesta de
alimentos en mal estado desde el punto de vista microbiológico es
una de las mayores causas de afecciones a la salud (Intoxicaciones
alimentarias), es importante poder detectar a tiempo, es decir,
antes de la ingesta, los productos envasados que estén infectados.
De esta forma, el vendedor los puede retirar a tiempo y el
consumidor puede evitar su ingesta sin riesgo para la salud.
Los desarrollos descritos en relación con este
tipo de envases inteligentes, necesitan contacto directo entre el
microorganismo y el sensor, que actúa como envase inteligente, como
en las patentes EP1326653; WO03093784, WO2008026119,
(Kimberly-Clark Wordlwide, INC), en la que se emplea
un detector cromogénico;, o WO0013009, (Johnson Matthey Public
Limited Company), en la que se utilizan complejos metálicos como
soportes de la reacción. En el documento Desbordes, J: Coniver,
L. Prevot, A. Annales Pharmaceutiques Francaises 1972,
30(7-8), 507-518 se
utiliza la reacción coloreada de la vainillina en medio sulfúrico y
fosfórico para identificar la presencia de lípidos en estudios
bacterianos y finalmente identifica los ácidos grasos por
cromatografía de capa fina y por cromatografía de gases. De nuevo en
este desarrollo es necesario el contacto directo entre la bacteria y
el reactivo para que se produzca la reacción. Además el sistema de
fabricación de este tipo de sensores es de gran complejidad, lo que
dificulta la posibilidad de fabricación a nivel industrial. Por otra
parte el mecanismo de actuación es complejo y requiere inicialmente
la generación de un compuesto coloreado, que desaparecerá ante el
contacto con microorganismos. Además, los compuestos empleados como
cromógenos, son compuestos químicos que en algunos casos necesitan
condiciones especiales como acidificación, o complejos compuestos
químicos para que tenga lugar la reacción, varios de los cuales no
pueden emplearse hoy en día en contacto con alimentos o bien tienen
una limitación importante en su concentración. En ningún caso se
usan compuestos naturales como principales compuestos cromógenos, ni
mucho menos compuestos aceptados como aditivos alimentarios, con las
ventajas tecnológicas y de salubridad que esto implica.
En vista de las deficiencias de los envases
hasta ahora descritos, los autores de la presente invención, tras un
importante trabajo de investigación, han desarrollado un nuevo
material que comprende un soporte sólido adsorbente parcialmente
polar impregnado en una disolución de vainillina que puede ser
empleado como sensor colorimétrico para la detección de
microorganismos en productos envasados de diferente naturaleza.
De forma ventajosa, la vainillina
(3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído),
autorizada como aditivo alimentario, permite detectar el crecimiento
de microorganismos mediante una reacción cromogénica sencilla y
fácilmente identificable. Actúa además en el sensor sin necesidad de
estar en contacto directo con el alimento o el producto envasado, si
bien para que tenga lugar necesita que exista una pequeña
concentración de humedad en la fase vapor.
La vainillina es un compuesto natural que se
encuentra en muchos vegetales, sobre todo en la vaina de la
vainilla. Industrialmente se obtiene a partir del eugenol, el
constituyente principal de la esencia de clavo. También se obtiene
por oxidación de la lignina, un polímero complejo que se encuentra
en el tejido leñoso de las plantas.
La vainillina se utiliza mucho como agente
aromatizante en alimentación, sobre todo en pastelería. También se
emplea en la industria farmacéutica como estimulante gástrico, y en
perfumería.
Existen algunas referencias en el estado de la
técnica que también citan el empleo de vainillina como precursor de
otros reactivos, pero necesita un largo proceso de síntesis y la
mezcla con disolventes como etanol y con reactivos como ácido
clorhídrico concentrado, piperidina, yoduro de metilo u otros. Por
ejemplo, en el documento WO2008026119, la vainillina no es el
componente principal de la invención, sino que es necesaria la
presencia de otro compuesto en la reacción para que el cambio de
color tenga lugar.
Otros métodos, que utilizan la vainillina como
detector de la presencia de microorganismos necesitan acidificar
fuertemente el medio con HCl, con los inconvenientes que esto
implica, y además solamente son capaces de detectar la presencia de
aquellos microorganismos que son capaces de producir Indol. Así, en
el documento Ferlin, H.J. y Karabinos, (J.V. Euclides 1954, 14,
345-353) se describe un medio que contiene
triptófano como fuente para aislar E. coli y P.
vulgaris de mezclas según las diferencias en la producción de
indol a partir de triptófano. Con ello, desarrollaron también un
reactivo para realizar el test de indol. En estas condiciones
emplearon la adición de una disolución de vainillina al 0,25% en
ácido clorhídrico concentrado para producir un color violeta con el
indol, por contacto directo y en fase líquida. Es decir, los
microorganismos productores de indol debían encontrarse en dicha
disolución, produciendo el indol que da lugar a la reacción
cromogénica.
A la luz de estos inconvenientes, una de las
principales ventajas de la presente invención es precisamente la
utilización de un compuesto natural, no nocivo, aditivo alimentario,
como es la vainillina, y la capacidad de detectar la presencia de
microorganismo sin necesidad de que exista contacto directo entre el
microorganismo y el material de envase.
Su aplicación está dirigida a resolver un
problema que supone un gran riesgo para la sociedad, como es la
presencia de microorganismos patógenos en los alimentos, en
productos de cosmética y farmacia, o en otros productos
envasados.
El material de la invención se incorpora en el
material de envase de los alimentos, o de cualquier otro productos
susceptible de sufrir contaminación por microorganismos, de forma
que mediante un cambio de color fácilmente reconocible, (de incoloro
a violeta), el consumidor es capaz de rechazar el producto y evitar
la ingesta de alimentos o el uso de productos infectados y
contaminados con microorganismos peligrosos para la salud.
Por otro lado, es un sistema que contribuye
sobremanera al control de calidad del producto envasado pudiéndose
retirar a tiempo partidas contaminadas, evitando de ese modo que
lleguen al consumidor final así como todos los problemas y costes
generados de posibles devoluciones. Los sectores involucrados para
la elaboración y aplicación de este nuevo dispositivo, serían por
una parte el sector de los envases, quién sería el encargado de
fabricar y poner en el mercado el material incorporado ya en el
envase. Y por otra parte la industria alimentaria, cosmética o
farmacéutica. Este sector ha de encargarse de la optimización de
ubicación del material dentro del envase, teniendo en cuenta el
proceso industrial de envasado, con objeto de lograr una ubicación
fácilmente visible para el consumidor final y que no interfiera con
el producto envasado ni dificulte el proceso industrial de
envasado.
La principal ventaja que posee la utilización de
un sensor como el que se presenta como invención es la posibilidad
que le ofrece al consumidor de saber que el alimento que va a
ingerir o el producto que va a utilizar está libre de
microorganismos, en el momento de la adquisición e ingesta del mismo
y de esta forma puede abstenerse de consumirlo y rechazar el
producto.
Figura 1. Aplicación del material sensor en un
film de polipropileno. Cultivo de E. coli.
Figura 2. Aplicación del material sensor en
filtros de papel en ausencia de microorganismos (blanco), con medio
de cultivo (columna izquierda) y sin medio de cultivo (columna
derecha).
Figura 3. Aplicación del material sensor en una
etiqueta de papel autoadhesiva. Cultivo de E. Coli.
Figura 4. Aplicación del material sensor en
filtros de papel en presencia de microorganismos (E. coli) o
ausencia de microorganismos (blanco). El medio de cultivo es
Müller-Hinton.
Figura 5. Gráfico de días necesarios para lograr
coloración en diferentes medios (Müller-Hinton;
T.S.A.;. M.E.A.) para diferentes microorganismos.
Figura 6. Aplicación del material sensor a un
filtro de papel a diferentes pHs en un cultivo sin microorganismos:
medio Müller-Hinton.
Figura 7. Gráfico de la evolución de la
concentración de vainillina en el tiempo con a) ausencia de
microorganismos (blanco); b) Candida albicans: c)
Staphylococcus aureus y d) Salmonella cholerasuis.
En primer lugar, es objeto de la invención un
material que comprende un soporte sólido adsorbente parcialmente
polar impregnado en una disolución que comprende vainillina.
Es también objeto de la invención el empleo de
dicho material como sensor colorimétrico para la detección visual
del crecimiento de microorganismos, donde dicho sensor no necesita
contacto directo con los microorganismos ni con el medio que los
contiene para producir el cambio de color.
Finalmente, es también objeto de la invención,
el empleo de la vainillina como reactivo colorimétrico para la
detección visual del crecimiento de microorganismos.
La presente invención contempla un nuevo envase
inteligente, diseñado a partir de un nuevo material, que permite la
detección visual del crecimiento de microorganismos en productos de
diferente naturaleza sin necesidad de estar en contacto directo con
el microorganismo ni con el medio que lo contiene.
Así, en un aspecto principal de la invención, se
contempla dicho material, que comprende un soporte sólido adsorbente
parcialmente polar impregnado en una disolución que comprende
vainillina.
La presencia de la vainillina en la composición
del material permite detectar el crecimiento de microorganismos
mediante una reacción cromogénica sencilla y fácilmente
identificable. El cambio de color (de incoloro a violeta) en las
condiciones del ensayo se relaciona inequívocamente con la presencia
de microorganismos, tanto en cultivos puros, realizados en placa
Petri, como en alimentos, como por ejemplo la mahonesa casera, que
no lleva conservantes, en fármacos o en cosméticos.
La vainillina es un compuesto natural que
reacciona ante la presencia de microorganismos. En ausencia de
vainillina la reacción coloreada no tiene lugar. La reacción es de
carácter irreversible y el color generado aumenta en intensidad
mientras se siga produciendo crecimiento microbiano.
En una realización particular, la disolución de
vainillina comprende etanol. La concentración mínima de vainillina
necesaria para hacer la reacción coloreada visible es de 10% en
etanol, preferiblemente de un 10 a un 50%.
La reacción necesita medio acuoso o al menos
humedad para que sea visible, duradera e irreversible y que por
tanto sirva como detector colorimétrico. Por ello, el soporte sólido
debe ser de un material adsorbente parcialmente polar, capaz de
retener la humedad desprendida por el propio alimento en fase de
vapor, preferiblemente se utiliza papel o cartón.
En el caso de que la vainillina se incorporara a
un soporte hidrofóbico, la reacción no sería permanente, ya que la
humedad se condensaría sobre el soporte hidrofóbico y, aunque se
colorearía igualmente, no permanecería porque la gota de
condensación caería por gravedad. Por tanto, no constituiría un
soporte irreversible y estable.
Como se ha comentado anteriormente, las
características descritas del material de la invención lo hacen
adecuado para la detección visual del crecimiento de
microorganismos, por lo que en otro aspecto principal de la
invención se contempla el uso de este nuevo material como sensor
colorimétrico para la detección visual de la presencia de
microorganismos.
La reacción en el sensor tiene lugar en fase
vapor, por lo que la vainillina no necesita estar en contacto
directo con el microorganismo ni con el medio que lo contiene. De
esta manera, el sensor y los microorganismos pueden estar alejados
uno de otro, siendo únicamente el contacto entre ellos a través de
una fase vapor.
El hecho de que el sensor no necesite contacto
directo con el microorganismo es muy ventajoso y una diferencia
importante respecto a los sensores descritos en el estado de la
técnica, ya que de esta forma los compuestos exhalados por los
microorganismos en su metabolismo, alcanzan la fase vapor y a través
de esta llegan al sensor donde se realiza la reacción cromogénica.
Esto posibilita que el sensor se coloque en la tapa o adherido al
envase o formando parte de él, pero a distancia. Tiene la ventaja
además de que en estas condiciones, es decir, actuando en fase
vapor, es capaz de responder a la presencia de los microorganismos
en cualquier punto del producto donde puedan encontrarse, no estando
limitado a una fracción o parte del mismo, como sucede cuando se
requiere contacto directo.
Además, el hecho de producirse el cambio de
color provocado por la transferencia o difusión de los compuestos
procedentes de los microorganismos en fase vapor permite alcanzar
alta sensibilidad, lo que significa que el sensor responde a la
aparición de las primeras colonias de microorganismos en el
medio.
En presencia de una concentración de
microorganismos igual o superior a 10 unidades formadoras de
colonias por ml o por mg (UFC/ml, UFC/mg)) de alimento conteniendo
el microorganismo, el sensor cambia de color de manera irreversible,
de incoloro (o blanco, debido al papel o soporte sólido) a
rosa-violeta. La intensidad del color depende de la
concentración de microorganismos.
El sensor permite la detección visual del
crecimiento de un amplio espectro de microorganismos tales como
mohos, levaduras y/o bacterias.
Todos los microorganismos que generan en su
metabolismo indol dan reacción con la vainillina. Pero además, otros
microorganismos que no producen indol en su metabolismo, como
Salmonella y Pseudomonas spp., dan también positiva la reacción de
identificación con la vainillina, por lo que la reacción no sería
específica "indol-vainillina", sino que se
definiría como una reacción más genérica, "compuestos
nitrogenados-vainillina".
La detección de microorganismos por medio del
sensor o sistema inteligente de la invención, se puede llevar a cabo
en un producto envasado. El producto envasado puede ser de diferente
naturaleza, de forma preferida es un alimento, un producto
farmacéutico o un producto cosmético.
Así, en realizaciones particulares, el sistema
inteligente formado por el material como sensor puede usarse como
material de envase propiamente dicho ó bien aplicarse en forma de
etiqueta base papel, preferiblemente en formato autoadhesivo,
colocada en la cara interna del envase, que puede ser de plástico o
de cualquier otro material, de forma que esté expuesto a la
atmósfera generada en el interior del envase. El envase deberá ser
en esa zona de material transparente e incoloro, para permitir
visualizar el cambio de color que se producirá en presencia
de
microorganismos.
microorganismos.
Finalmente, en otro aspecto principal de la
invención se contempla el empleo de la vainillina como reactivo
colorimétrico para la detección visual del crecimiento de
microorganismos en fase de vapor, es decir, sin contacto directo
entre la vainillina y el microorganismo.
Se estudió la actividad del sensor en base a
diferentes materiales del soporte y condiciones experimentales. Ello
permitió visualizar de forma clara el funcionamiento del sensor a
nivel macroscópico.
En la figura 1 se aplicó un film de
polipropileno (PP) impregnado en una disolución de vainillina en un
cultivo de E. coli. A pesar de que la formulación utilizada
fuera la correcta diseñada para este sensor, no se observó cambio de
color. La razón de la ausencia de respuesta (cambio de color) se
debe a que el material no absorbió la humedad ni los compuestos, o
lo que es lo mismo, la reacción con la formulación que contiene la
vainillina no quedó retenida en el soporte, al encontrarse ésta en
un medio no polar, embebida en el polipropileno (PP). De hecho se
observó un halo coloreado recubriendo el PP pero que finalmente
condensó y se desprendió del film de PP, dando por no válido este
soporte no polar ni adsorbente para ser empleado como soporte para
el sensor.
En la figura 2 se llevaron a cabo ensayos blanco
(ausencia de microorganismos), empleando varios filtros de soporte
papel impregnados en la disolución de vainillina, en presencia de
medios de cultivo (columna izquierda) y en ausencia de cultivo
(columna derecha). Se demostró que, en ausencia de microorganismos,
la presencia del medio de cultivo no es suficiente para que la
reacción tenga lugar.
En la figura 3 se aplicó el material sensor de
la invención a una etiqueta autoadhesiva para detectar la presencia
de microorganismos en un cultivo de E. Coli, pudiéndose
observar el cambio de color del sensor.
En la figura 4 se aplicó el material sensor a
varios filtros de papel en diferentes cultivos de E. coli y
en un cultivo blanco, es decir sin microorganismo. El medio de
cultivo fue Müller-Hinton. Se pudo observar que la
coloración se produjo en todos los cultivos de E. coli,
mientras que en el único cultivo blanco no apareció color.
Para ampliar el estudio se evaluó el
comportamiento del material de la invención frente a una amplia
serie de microorganismos para determinar la concentración mínima
necesaria de para que el sensor funcionara adecuadamente.
Se llevaron a cabo ensayos para estudiar la
eficacia del sensor en los siguientes microorganismos:
Mohos
- \bullet
- Aspergillus flavus (Colección Española de Cultivos Tipo, CECT, 2687)
- \bullet
- Penicillium roqueforti (Culture Collection of Fungi, IBT, 21319)
- \bullet
- Eurotium repens (IBT 1800)
- \bullet
- Penicillium islandicum (CECT 2762NT)
- \bullet
- Penicillium commune (IBT 21314)
- \bullet
- Penicillium expansum
- \bullet
- Penicillium nalgiovensis
\vskip1.000000\baselineskip
Levaduras
- \bullet
- Candida albicans (American Type Culture Collection, ATCC. 64550)
- \bullet
- Debaryomyces hansenii (CECT 10353)
- \bullet
- Zygosaccharomyces rouxii (CECT 11928)
- \bullet
- Botrytis cinerea
\vskip1.000000\baselineskip
Bacterias
- \bullet
- Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
- \bullet
- Listeria monocytogenes (ATCC 7644)
- \bullet
- Bacillus cereus (CECT 495)
- \bullet
- Staphylococcus aureus (ATCC 29213)
- \bullet
- Salmonella choleraesuis (CECT 4000)
- \bullet
- Yersinia enterocolitica (CECT 4315)
- \bullet
- Escherichia coli (ATCC 29252)
- \bullet
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
Se observaron reacciones positivas tanto entre
las bacterias, como en los mohos y las levaduras. De los
microorganismos ensayados que dieron reacción positiva en la
siguiente tabla (tabla 1) se muestran aquellos en los que el valor
de la concentración de microorganismos puede expresarse de forma
clara, en función de la concentración de microorganismo inoculado y
del tiempo necesario para el cambio de color en el sensor.
Se completaron los ensayos estudiando el efecto
de diferentes medios de cultivo en el cambio del color del soporte
adsorbente que contiene el sensor. Debido al elevado consumo de
recursos, se eligieron 2 microorganismos como representantes de cada
grupo y tres medios de cultivo, genéricos que permitieran el
crecimiento de todos los microorganismos, pero con diferente
contenido en fuente de proteínas, como característica
diferenciadora. Los medios seleccionados fueron
Müller-Hinton (M. H), Malt Extrac Agar (M.E.A) y
T.S.A (Triptona Soja Agar). Se prolongó el tiempo del estudio hasta
un año. En las tablas siguientes (2 y 3) se resumen los
microorganismos y los medios de cultivo seleccionados. Las
diferencias en la composición de los medios de cultivo representa
diferente concentración de nutrientes y por tanto, simula la
situación de los alimentos, en los que los nutrientes para los
microorganismos van a ser diferentes unos de otros.
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Los gráficos de la figura 5 muestran los días
que fueron necesarios para que el filtro adquiriera la tonalidad
prácticamente negra final (morado o violeta muy intenso) para los
diferentes microorganismos en los diferentes medios estudiados. Se
observa la intensificación del color en función de la concentración
de microorganismos.
A raíz de este ensayo se pudo concluir que el
medio de cultivo en el que tiene lugar el crecimiento del
microorganismo afecta de forma notable al cambio de color. Este
cambio fue más rápido en Müller-Hinton, medio con
mayor contenido en compuestos nitrogenados, seguido de T.S.A y en
M.E.A, el cambio fue bastante más lento.
La principal diferencia entre estos medios es el
contenido en compuestos nitrogenados. En el caso del
Müller-Hinton, la carne de res y la caseína,
suministran compuestos nitrogenados, vitaminas, carbono, azufre y
amino ácidos. Para el T.S.A la digestión enzimática de la soja
aporta nitrógeno, vitaminas y minerales. Mientras que el M.E.A.,
tiene un alto contenido en polisacáridos y cómo única fuente de
nitrógeno tiene peptona y en cantidades menores a las presentes en
los otros dos medios. Esto afecta a la intensidad de la reacción que
tiene lugar con la vainillina y por tanto al cambio de color, ya que
en aquellos casos en los que los microorganismos crecen rápidamente
porque encuentran gran cantidad de nutrientes, la reacción se
produce antes, dando lugar a un cambio de color en el sensor antes
en el tiempo y más intenso para el mismo tiempo que en otros
casos.
Se investigó el mecanismo de reacción que tuvo
lugar, comprobando que microorganismos que generaban en su
metabolismo indol daban la reacción positiva, sugiriendo que se
trataba de un compuesto coloreado debido a la reacción química
producida entre indol y vainillina. Sin embargo, microorganismos que
no generan indol, como Salmonella y Pseudomonas spp,
dieron también reacción positiva con la vainillina.
Se hicieron ensayos adicionales para demostrar
la efectividad de la vainillina en la detección de microorganismos y
descartar que el cambio de coloración se debiera a un cambio de pH o
debido a la presencia de CO_{2}, procedente del metabolismo de los
microorganismos. En estas pruebas se seleccionó como medio de
cultivo Müller-Hinton. puesto que era el que
generaba una reacción más rápida de cambio de color para todos los
casos.
Los microorganismos en su crecimiento y
respiración liberan CO_{2}. Debido a la abundancia y volatilidad
de este compuesto se estudió el efecto que ejercía sobre el color
desarrollado por las etiquetas impregnadas con vainillina.
Para ello se realizó la preparación de placas
con medio de cultivo y etiquetas impregnada con la disolución de
vainillina a estudiar, pero sin presencia de microorganismos. La
incubación se realizó en jarras de anaerobiosis y en condiciones de
anaerobiosis y microaerofilia, mediante la utilización de sobres
generadores de estas atmósferas. Las placas no se sellaron en el
interior de la jarra, para que pudiera penetrar el CO_{2}.
El ensayo se repitió por triplicado y se observó
que pasados 50 días, a 37ºC, en las placas con
Müller-Hinton y el filtro conteniendo la vainillina
no se produjo cambio de coloración en el disco.
Por lo que se concluyó que el cambio de color no
es producido por la presencia de CO_{2}.
Se modificó el pH del medio superficialmente. Se
añadió en tres placas ácido acético y en otras tres NaOH, y se
observó el efecto que estos compuestos ácidos o bases podían ejercer
sobre el sensor, en ausencia de microorganismos. Se observó que,
pasados tres meses, no había ningún cambio de color. No existió
contacto directo entre los filtros y los agentes acidificantes o
basificantes.
En el siguiente ensayo, se añadió directamente
el ácido y la base sobre el filtro, al que previamente se le había
añadido vainillina. El resto de preparación de la placa fue para
todos los casos idénticos, sin siembra de microorganismo. No se
observó tampoco cambio de coloración.
Complementario a estos ensayos se añadió
directamente el ácido y la base a la mezcla de
etanol-vainillina, y con esta mezcla se impregnó el
filtro que se colocó en las placas como en todos los ensayos
realizados anteriormente.
Se observó que no existía ningún cambio de
coloración en ninguno de los filtros pasado un mes. Por lo tanto se
concluyó que el cambio de color del sensor no es producido por un
cambio de pH. Tres meses después sigue sin producirse ningún cambio
de color.
Sin embargo, cuando se modificó el pH del medio
de cultivo intrínsecamente, pasados 5 días, se observó que se
produjo un cambio de coloración en las muestras que estaban en fase
vapor con el medio de pH 12 y pH 10 (figura 6).
El crecimiento de los microorganismos generó
también una modificación en el pH final del medio, siendo pH básico
con un valor alrededor de 10.
Se analizaron mediante técnicas cromatográficas
la evolución de la vainillina y los nuevos compuestos aparecidos
tras la reacción.
Para ver la evolución de la vainillina, se
realizó un análisis por SPME (microextracción en fase sólida) y
GC-MS (Cromatografía de
gases-espectrometría de masas)
Como se puede observar (figura 7) tuvo lugar una
disminución de la concentración de vainillina en todos los casos.
Ésta disminución fue mayor para el caso de S. aureus y S.
cholerasuis, que son además los microorganismos que provocan un
cambio de color más rápido e intenso. Con esta técnica no se pudo
detectar la presencia de nuevos compuestos responsables del cambio
de coloración, ya que probablemente el compuesto coloreado generado
no es volátil. Sin embargo disminuyó la concentración de vainillina,
lo cual indica que tuvo lugar una reacción de ésta con un compuesto
generado por el crecimiento de los microorganismos, provocando la
aparición del nuevo compuesto coloreado.
Claims (14)
1. Material que comprende un soporte sólido
adsorbente parcialmente polar impregnado en una disolución que
comprende vainillina.
2. Material según la reivindicación 1
caracterizado porque la disolución comprende etanol.
3. Material, según la reivindicación 2
caracterizado porque la vainillina está en una concentración
de al menos el 10%.
4. Material, según la reivindicación 3
caracterizado porque la vainillina está en un rango de
concentración del 10 al 50%.
5. Material, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el soporte
es papel.
6. Empleo de un material, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, como sensor colorimétrico para la
detección visual del crecimiento de microorganismos.
7. Empleo de un material, según la
reivindicación anterior, caracterizado porque la detección se
lleva a cabo en fase de vapor sin contacto directo entre el material
y los microorganismos.
8. Empleo de un material, según las
reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque el cambio de
color es visualmente perceptible cuando la concentración de
microorganismos es igual o superior a 10 ufc por ml o mg de
alimento.
9. Empleo de un material según cualquiera de las
reivindicaciones 6-8, caracterizado porque
los microorganismos detectados son mohos, levaduras y/o
bacterias.
10. Empleo de un material, según cualquiera de
las reivindicaciones 6-9, caracterizado
porque la detección de microorganismos se lleva a cabo en un
producto envasado.
11. Empleo de un material, según la
reivindicación anterior, caracterizado porque el producto
envasado es un alimento, un producto farmacéutico o un producto
cosmético.
12. Empleo de un material, según las
reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el envase está
formado por dicho material.
13. Empleo de un material, según las
reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque dicho material
se adhiere a la cara interna del envase del producto mediante un
adhesivo.
14. Empleo de la vainillina en la fabricación de
un material, según cualquiera de las reivindicaciones
1-5, como reactivo colorimétrico para la detección
visual del crecimiento de microorganismos en fase de vapor.
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