ES2355503T3 - Métodos para regular el cáncer. - Google Patents

Abstract

El uso de una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, en el que el cáncer comprende una o más células que expresan EphB4.

Description

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a métodos para regular el cáncer. En particular, la invención se refiere a métodos para inhibir el crecimiento canceroso de una célula. La invención proporciona también métodos para prevenir o tratar el cáncer. La invención se refiere también a métodos para identificar 5 agentes que pueden inhibir el crecimiento canceroso de una célula.

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Antecedentes de la invención

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El cáncer describe varias enfermedades, que son el resultado del crecimiento desregulado de células del cuerpo. Se pueden desarrollar cánceres malignos a partir de este crecimiento desregulado y subsecuentemente extenderse por el cuerpo vía el torrente sanguíneo o el sistema linfático, un 10 procedimiento conocido como metástasis. Los tumores malignos de los tejidos epiteliales son la forma más común de cáncer y son responsables de la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer en los países occidentales industrializados. Según el Australian Institute of Health and Welfare (AIHW), en promedio uno de cada tres hombres y una de cada cuatro mujeres desarrollarán cáncer antes de la edad de 75 años (1). En los hombres los cánceres más comunes son de próstata, intestino y pulmón y en las 15 mujeres, pecho, intestino y melanoma. La identificación de los genes expresados específicamente en los tejidos tumorales y no en los tejidos normales, y el análisis de sus funciones son útiles para identificar nuevas dianas para la terapia del cáncer.

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Varios genes han sido implicados en varios cánceres. Por ejemplo, se conocen oncogenes que codifican receptores del factor de crecimiento celular tal como el factor de crecimiento epidérmico. El gen 20 ras es un oncogén que se cree que es responsable de hasta el 90% de todos los cánceres pancreáticos humanos, 50% de los cánceres de colon humano, 40% de los cánceres de pulmón, y 30% de las leucemias. Los oncogenes mutados se pueden convertir en genes que provocan cáncer. Tales oncogenes mutados codifican proteínas tales como proteína quinasas y enzimas que fosforilan proteínas que desencadenan el crecimiento celular incontrolado. La EphB4 es un miembro recientemente identificado de 25 la mayor familia conocida de proteínas tirosina quinasas receptoras. Se ha identificado que los miembros de la familia de receptores Eph están implicados en muchos procesos celulares que incluyen el desarrollo neuronal, angiogénesis y desarrollo de la red vascular (2-5). Como resultado de interacciones con sus ligandos, las efrinas, median en las interacciones celulares dependientes del contacto, que regulan funciones celulares como la inhibición de contacto, la organización citoesquelética y la migración celular 30 (6,7)

Aunque se han desarrollado varios agentes anticáncer que incluyen moléculas inhibidoras del crecimiento tales como compuestos citotóxicos en un intento de tratar el cáncer, aún hay una necesidad de proporcionar métodos efectivos para regular el cáncer.

Sumario de la invención 35

La presente invención está basada en el sorprendente hallazgo de que un anticuerpo que puede unirse a una región particular de la proteína EphB4 puede inhibir ventajosamente el crecimiento canceroso en una célula cancerosa provocando la muerte celular de la célula cancerosa.

Por lo tanto, en un primer aspecto de la invención, proporciona como método in vitro para inhibir el crecimiento canceroso de una célula que expresa EphB4, comprendiendo el método poner en contacto 40 la célula con por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO: 1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID. NO:1). 45

Según un aspecto de la invención, se proporciona el uso según la reivindicación 1.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona el uso según la reivindicación 2.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la localización inmunohistoquímica de la expresión de EphB4 en tres cánceres de colon diferentes y mucosa normal comparada usando el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 50 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO: 1). La mancha oscura del anticuerpo secundario biotinilado indica la proteína EphB4. Los núcleos se tiñen con hematoxilina Harris. Se muestran imágenes de gran aumento (x100) de tres adenocarcinomas diferentes (bien diferenciado, moderadamente bien diferenciado y poco diferenciado) y sus mucosas normales comparables. La fuerte tinción de tejido tumoral y la tinción muy 55

débil, difusa del tejido normal era evidente en cada conjunto de muestras. No había reactividad cruzada con el anticuerpo secundario solo (no se muestra el resultado).

La Figura 2 muestra la RT-PCR relativa que compara la expresión de EphB4 (1187 bp) y ARNr 18S interno (489 bp) en cinco pares tumor (T)/normal (N). LM - metástasis de hígado y NL - hígado normal de pacientes 5, CL - línea celular de cáncer de colon LIM2405, C2 - línea celular de cáncer de colon 5 SW480, RT - control negativo de RT, P - control negativo de PCR, M - marcador pUC19/HpaII.

La Figura 3 muestra una monocapa confluente de células en 2 ml de DMEM tratada con un dilución 1/500 del anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) (concentración final 0,4 ng/µl). La incubación de células con el anticuerpo provoca una respuesta visual entre 24 y 48 h. Las 10 células se despegan del fondo del recipiente de cultivo en forma de lámina frágil que se rompe fácilmente con agitación suave. El cambio de color del medio es debido a un cambio de 0,5 unidades de pH atribuido a la fuga de contenidos celulares de las células muertas.

La Figura 4 muestra un gráfico que muestra el efecto de las dosis incrementadas de un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos 15 amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) sobre el crecimiento de células MCF-7 in vitro después de 48 horas.

La Figura 5 muestra un ensayo de exclusión de azul de tripano para determinar la dependencia de la dosis de un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El número de células 20 viables (x100000) (eje Y) disminuye después de una exposición de 48 h a tres diluciones diferentes del anticuerpo EphB4 (eje X). No quedaban células viables después de 72 h con la adición de 1 µg/ml y después de 48 h con la adición de 2 µg/ml.

La Figura 6 muestra un ensayo de Caspasa-3. La cantidad relativa de actividad de caspasa-3 por 100.000 células (eje Y) se incrementa con el tiempo para todas las diluciones de un anticuerpo policlonal 25 EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino de dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) (eje X). Debido a que no había células viables contadas para la dilución 1/200 (1µg/ml) después de 72 horas y para la dilución 1/100 (2 µg/ml) después de 48 h, no se midió actividad de la caspasa-3.

La Figura 7 muestra un gráfico que muestra el porcentaje de viabilidad de células de cáncer de 30 pecho después de tratamiento de 65 h con cinco anticuerpos EphB4 diferentes: (1) un anticuerpo policlonal EphB4 (Suizo) dirigido a residuos de aminoácido 825 a 991 del terminal carboxi de EphB4 de ratón (regalo del Dr. Andrew Ziemiecki, Universidad de Berna), (2) un anticuerpo EphB4 N-terminal policlonal (N-19 Santa Cruz Biotechnology) dirigido a los primeros 19 aminoácidos de N-terminal de la secuencia de aminoácidos de EphB4 que es posible que sean los residuos de aminoácido 16 a 34 del 35 EphB4 maduro (SEQ ID NO:1), (3) un anticuerpo EphB4 policlonal de C terminal (C-16 Santa Cruz Biotechnology) dirigido al carboxi terminal correspondiente al dominio de tirosina quinasa que consiste en residuos de aminoácido 615 a 874 de EphB4 (SEQ ID NO:1), (4) un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) y (5) un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 (antiguo) Santa Cruz 40 Biotechnology Lot número B141 lote) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Las células se trataron con dilución 1/100 de anticuerpo patrón (200 µg/ml), a continuación se tiñeron con azul de tripano (tiñe las células muertas). Se calcularon las relaciones de sin teñir (viables) a teñidas (inviables) para cuatro diferentes alícuotas de cada tratamiento. Control – no se añadió anticuerpo. CLM – medio limitado de complemento. FCS – suero fetal 45 vacuno al 10% añadido al medio. El complemento no juega un papel en el efecto de la muerte celular del anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Esto se demuestra por la comparación del porcentaje de viabilidad después de la adición de anticuerpo a células cultivadas en medio con actividad proteínica normal (experimento de FCS) con células cultivadas en medio en el que 50 las proteínas de complemento se inactivaron calentando a 55ºC durante 30 minutos (experimento de CLM).

La Figura 8 muestra un análisis western de tejidos humanos normales como se indica y un tumor de colon representativo (Tumor). (A) la proteína EphB4 se identificó usando un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio 55 extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1). La proteína natural prevista es de 120 kDa y está indicada por la flecha. (B) gel duplicado teñido de azul de Coomassie. Los tamaños de peso molecular del marcador son como se indica.

La Figura 9 muestra un diagrama esquemático que compara los dominios del receptor EphB4 natural con la estructura prevista de las variantes de empalme EphB4v1 y EphB4v2. Las regiones eliminadas están indicadas por *.

La Figura 10 muestra una expresión del gen EphB4 y PBGD (control endógeno) en líneas celulares de cáncer de pecho MDA-MB-231 (231), MDA-MB-468 (468), Hs578t, MCF7 y T47D tratadas 5 con dilución 1/100 del anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) durante 65 h (Tratado) o sin tratamiento (control). RT-ve son los reactivos de transcripción inversa solo control. Marcador 1 - Spp1/EcoR1 y Marcador 2 - pUC19/Hpa11.

La Figura 11 muestra las secuencias de los seis péptidos que se solapan [mostrados como SEQ 10 ID NO:2 (Péptido 1) a SEQ ID NO:7 (Péptido 6)] diseñadas para abarcar los primeros 125 aminoácidos de la secuencia diana de EphB4 (mostrada en negrita). Los números se refieren a la posición de los aminoácidos en la proteína EphB4 madura (SEQ ID NO:1 mostrada en la Figura 18).

La Figura 12 muestra un ensayo de exclusión de azul de tripano que compara la viabilidad en células de control (sin tratar), células con el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz 15 Biotechnology) específicamente dirigido a los restos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) solo (Ab solo) o tratadas tanto con anticuerpo como un cóctel de péptidos (Ab + todos los péptidos). Los ensayos se realizaron por duplicado.

La Figura 13 muestra un ensayo que compara los niveles relativos de actividad de caspasa-3 en células de control (sin tratar), células con el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz 20 Biotechnology) específicamente dirigido a los restos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) solo, (Ab solo) o tratadas tanto con anticuerpo como con un cóctel de péptidos (Ab + todos los péptidos). Los ensayos se realizaron por duplicado

La Figura 14 muestra resultados del ensayo de exclusión de azul de tripano realizado 48 h después del tratamiento sobre monocapas de SW480 confluentes con una dilución 1/500 del anticuerpo 25 policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) con o sin 5 µl de péptidos como se indica. Los péptidos 1 y 2 parecían rescatar 50% de las células de la muerte celular mediada por Ab.

La Figura 15 muestra que un incremento de la concentración de péptido 1 (SEQ ID NO:2) o péptido 2 (SEQ ID NO:3) (hasta 10 µl) fue capaz de rescatar totalmente células de la muerte celular 30 mediada por el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) especialmente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) y era igual en efecto a una combinación de los péptidos 1 y 2 (5 µl de cada uno).

La Figura 16 muestra las secuencias de los dos péptidos que se solapan [mostradas como SEQ ID NO:2 (péptido 1) y SEQ ID NO:3 (péptido 2)] que fueron capaces de bloquear la función del anticuerpo 35 monoclonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular de EphB4 (SEQ ID NO:1) en células en cultivo y secuencias de tres péptidos [mostradas como SEQ ID NO:8 (péptido 7) a SEQ ID NO:10 (péptido 9) diseñadas alrededor de la secuencia central GSCVV para un estrechamiento adicional de la secuencia reactiva. Los números se refieren a la posición en la proteína EphB4 madura (secuencia mostrada en negrita). 40

La Figura 17 muestra que el péptido 7 (SEQ ID NO:8) fue capaz de rescatar totalmente células de la muerte celular mediada por Ab y era igual en efecto al péptido 2 (SEQ ID NO:3). Un microlitro del anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) (0,2 µg/ml) y 10 µl de un patrón de 10 mg/ml de péptido se pre-incubaron conjuntamente en hielo durante 2 h antes de la adición a una monocapa 45 confluente de células en una placa de microtitulación de 24 pocillos con 500 µl de DMEM.

La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos del receptor 4 (EphB4) de tipo B de efrina de homo sapiens.

La Figura 19 muestra un modelo del receptor EphB4 con dominios a los que se han dirigido los diferentes anticuerpos policlonales (N-19, H-200 y C-16) indicadas por corchetes negros. El dominio 50 globular (dominio de unión del ligando receptor de efrina) corresponde a los residuos 29 a 197 de EphB4 (SEQ ID NO:1). La región rica en cisteína (proteína de superficie específica de la variante de Giardia) corresponde a los residuos 255 a 313 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El dominio 1 de tipo III de fibronectina corresponde a los residuos 324 a 414 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El dominio de tipo III de fibronectina corresponde a los residuos 437 a 517 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El dominio transmembrana corresponde 55 a los residuos 540 a 560 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El dominio de tirosina quinasa corresponde a los residuos 615 a 874 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El dominio SAM (motivo alfa estéril) corresponde a los

residuos 904 a 971 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El dominio PDZ corresponde a los residuos 985 a 987 de EphB4 (SEQ ID NO:1).

Las colocaciones de estos dominios con relación a la secuencia de aminoácidos de EphB4 está basada en información tomada de la publicación más reciente del NCBI número de acceso NP_004435. El anticuerpo N-19 se asocia a los primeros 19 aminoácidos N-terminales de la secuencia que es probable 5 que sean los residuos de aminoácidos 16 a 34 de EphB4 madura (SEQ ID NO:1). El anticuerpo C-16 se dirige al dominio de tirosina quinasa. El anticuerpo H-200 se dirige específicamente a los residuos 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) en el dominio extracelular que abarca la región rica en cisteína y el domino de fibronectina.

La Figura 20 muestra una secuencia de un péptido 11 (SEQ ID NO:12) diseñado para incluir la 10 propuesta secuencia de epítopo y un péptido 10 (SEQ ID NO:11) en el que aminoácido Aspartato (D) que lleva una carga en esta secuencia natural está substituido por un aminoácido sin carga con una estructura de cadena lateral similar Asparagina (N). Los números y la secuencia en negrita se refieren a la posición de los aminoácidos en la proteína EphB4 madura.

Descripción detallada de la invención 15

En un primer aspecto la presente invención proporciona un método in vitro para inhibir el crecimiento canceroso de una célula que expresa EphB4, comprendiendo el método poner en contacto la célula por lo menos con un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado en los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1) o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo 20 menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Lo más preferentemente, el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia que consiste en residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución 25 del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Lo más preferentemente, el anticuerpo o su porción que se une a antígeno es un anticuerpo monoclonal o policlonal. El método preferentemente da como resultado la muerte de la célula.

El anticuerpo o su porción que se une a antígeno preferente y específicamente se une a un polipéptido que tiene una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a la 30 secuencia seleccionada del grupo que consiste en los residuos:

220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Un polipéptido que tiene una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a los residuos.

220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), que preferentemente incluye variantes de polipéptido que tienen por lo menos una substitución, eliminación o adición de aminoácido(s) particular(es). Tales 35 variantes de polipéptido son también apropiadas para los presentes métodos, particularmente si retienen propiedades antigénicas. Por ejemplo, las variantes de polipéptido se pueden diseñar para retener propiedades antigénicas y para mejorar la producción de polipéptido y/o la solubilidad.

Por ejemplo, los programas de predicción antigénica sugieren que el aminoácido cargado Asp (D) puede ser también importante para la función del epítopo ya que es el único residuo cargado en la 40 secuencia. El péptido 11 que consiste en los residuos de aminoácido 220 a 244 de la proteína EphB4 (SEQ ID NO:1) se diseñó como se indica en la Figura 20. El péptido 10 con una substitución de Asn (N) en el residuo 226 de la proteína EphB4 (SEQ ID NO:1) se diseñó también como se indica en la Figura 20. La secuencia de aminoácidos del Péptido 10 y Péptido 11 es como sigue:

Péptido 10 SEQ ID NO:11: AGSCVVNAVPAPGPSPSLYCREDGQ 45

Péptido 11 SEQ ID NO:12: AGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQ

La cadenas laterales de Asp y Asn son muy similares – el grupo hidroxilo de Asp es una amina en Asn y lo cambia de ser un aminoácido negativamente cargado a uno neutro.

El cáncer se selecciona preferentemente del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de intestino, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, 50 melanoma, linfoma y leucemia.

En la presente memoria descriptiva el término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo. El término “epítopo” se refiere a una

región epítope de un polipéptido que es reconocida por un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno.

Los anticuerpos se refieren a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR o VH) y una región 5 constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de la cadena ligera (LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones que determinan la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están 10 más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el amino terminal al carboxi terminal en el siguiente orden: FR, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresión “porción que se une a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo”), tal como se usa aquí se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la 15 capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de la unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo entero. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en la expresión “porción que se une a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente 20 disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento (8) dAB que consiste en un dominio VH, o un dominio (9) VL; y (vi) una región aislada que determina la complementariedad (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por medio de un conector sintético 25 que permite que se haga con los dos una única cadena proteínica en la que las regiones VL y VH se juntan para formar moléculas monovalentes (conocida como cadena única Fv (scFv) (10), (11)). Tales anticuerpos de cadena única se pretende también que estén incluidos dentro de la expresión “porción que se une a antígeno” de un anticuerpo. También están incluidas otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como dianticuerpos o trianticuerpos. Los dianticuerpos son anticuerpos bivalentes, 30 biespecíficos en los que los dominios VH y VL están expresados en una única cadena de polipéptido, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el pareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando por ello a los dominios a parearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión de antígeno (12, 13). Preferentemente, el anticuerpo es anticuerpo IgG policlonal de conejo EphB4 (H-200), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , California. 35

Lo más preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos, y particularmente, se selecciona de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos que se une a un epítopo dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idénticos a ella. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1). 40

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo 45 convencional (policlonal) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre el antígeno. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe considerar que requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar 50 según la presente invención se pueden fabricar por métodos de ADN recombinante. Tales técnicas incluyen, pero no están restringidas a, la técnica (14) de hibridoma, la técnica del trioma, la técnica (15) del hibridoma de célula B humana, y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos (16) monoclonales humanos. Además, los anticuerpos monoclonales humanizados se pueden generar según métodos descritos en la patente de EE.UU. 6.090.382 de la que se incorpora aquí toda la descripción y 55 las referencias citadas en ella. El documento proporciona células hospedantes apropiadas para expresar anticuerpos humanos recombinantes y métodos de sintetizar los anticuerpos humanos recombinantes. Además, se pueden producir anticuerpos humanos recombinantes apropiados usando animales transgénicos usando por ejemplo, técnicas descritas en Oncology 29 (Supp 4) 47-50 (2002). Los anticuerpos de la presente invención se pueden obtener también de fuentes comerciales. 60

Se pueden usar también varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales que se pueden unir a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los

residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Para la producción de los anticuerpos, se pueden humanizar varios animales hospedantes por inyección con una proteína EphB4 o un fragmento de polipéptido de EphB4 unido a un vehículo apropiado. Los vehículos apropiados pueden incluir, pero no están limitados a, BSA (seroalbúmina bovina), KLH (hemocianina de lapa californiana), OVA (ovoalbúmina), THY (Tiroglobulina) y 5 RSA (Seroalbúmina de conejo). El animal hospedante está preferentemente inmunizado con un polipéptido de EphB4 que comprende los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, los animales hospedantes se pueden inmunizar por inyección con una proteína EphB4 o un polipéptido que comprende los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente 10 por lo menos 90% idéntica a ella.

Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1).

Los animales hospedantes apropiados incluyen, pero no están limitados a, conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden usar varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo 15 de las especies hospedantes, e incluyen, pero no están limitados a Freud’s (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como Bacillus Calmette-Guerin (BCG) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden producir en grandes cantidades por técnicas estándar 20 (por ejemplo, en cultivo tisular o suero libre usando un fermentador) y purificar usando columnas de afinidad tales como proteína A (por ejemplo, para Mabs murinos), Proteína G (por ejemplo, para Mabs de rata) o MEP HYPERGEL (por ejemplo, para Mabs de IgM e IgG).

Los anticuerpos apropiados pueden incluir fragmentos de anticuerpo que incluyen una porción que se une a antígeno que se puede unir a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los 25 residuos de 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. La porción que se une a antígeno de un anticuerpo preferentemente incluye idiotipos de residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella.

Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el 30 residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1).

Tales fragmentos de anticuerpo se pueden generar por técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no están limitados a, el fragmento F(ab’)2 que se puede producir por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab’ que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab’)2, los fragmentos Fab que se pueden generar 35 tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor, y los fragmentos Fv. En una técnica adicional, los anticuerpos recombinantes específicos de un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella, se pueden manipular y expresar ectópicamente en una amplia variedad de tipos de célula. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido 40 Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1).

Los anticuerpos usados en los presentes métodos pueden incluir formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas o sus fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’).sub.2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígeno) que contienen mínimos residuos de aminoácido derivados de una inmunoglobulina no 45 humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de receptor) en las que los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor están reemplazados por residuos de un CDR de una especie (anticuerpo de donante) no humana tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región (FR) de estructura de Fv de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los 50 correspondientes residuos de FR no humanos. Además, un anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR o secuencias de estructura importadas. Estas modificaciones se pueden realizar para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo.

La expresión “proteína EphB4” tal como se usa aquí se entiende que incluye la proteína EphB4 55 completa o un fragmento de polipéptido que comprende los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, la proteína EphB4 incluye un fragmento de polipéptido que comprende los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, la proteína EphB4 incluye un fragmento de polipéptido que comprende los residuos 220 60

a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Lo más preferentemente, la proteína EphB4 comprende los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1). 5

Una proteína EphB4 variante puede estar modificada al nivel de aminoácido y puede incluir adiciones o eliminaciones o remplazos de aminoácidos que no afectan a la funcionalidad de la proteína, tales como substituciones de aminoácido conservativas. Una proteína EphB4 puede incluir también una proteína EphB4 truncada. Una proteína EphB4 puede ser natural o recombinante. La proteína EphB4 puede ser de cualquier especie animal, preferentemente la proteína EphB4 es humana. 10

Un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno que es apropiada para los métodos de la presente invención, preferentemente puede inhibir el crecimiento canceroso de una célula inhibiendo la actividad de una proteína EphB4. En la memoria descriptiva la expresión “crecimiento canceroso” se entiende que se refiere a la división y crecimiento celular anormal e incontrolable. Típicamente tal célula se identifica como célula cancerosa que puede ser capaz de invadir y afectar a otros tejidos y tiene el 15 potencial de extenderse a otras áreas del cuerpo. El crecimiento canceroso de una célula puede conducir a la formación de un tumor que puede ser benigno o maligno.

En la memoria descriptiva el término “célula(s)” se entiende que incluye cualquier célula. Preferentemente, las células se derivan de especies de mamífero, tales como, pero no limitadas a, seres humanos, ratones, animal bovino, ovejas o animales domésticos. Se prefiere que las células se 20 seleccionen del grupo que incluye, pero no está limitado a, células de próstata, células de pecho, células de colon, fibroblastos, células epidérmicas, células de placenta, hígado, riñón, páncreas, corazón, neuronas o musculares, o células cancerosas o tumorales. Las células pueden ser células normales, células enfermas, células adultas o células embrionarias. Las células pueden ser células aisladas, células cultivadas o parte de un tejido. Las células pueden ser células recombinantes genéticamente modificadas, 25 tales como una célula transgénica. Preferentemente, las células expresan EphB4. Las células pueden ser parte de un animal entero. Las células pueden también ser derivadas de una línea celular. Preferentemente, las células son de una línea celular derivada de, pero no limitada a, una línea celular de próstata, pecho, colon u ovario. La línea celular se selecciona preferentemente del grupo que consiste en SW480 de colon, SW620 de colon, LIM1215 de colon, MCF7 de pecho, T47-D de pecho, MDA-MB-231 de 30 pecho, MDA-MB-453 de pecho, J82 de vejiga, T24 de vejiga, RT119 de vejiga y 5637 de vejiga. Lo más preferentemente, la línea celular se selecciona del grupo que consiste en la línea celular de cáncer de pecho MCF-7 y la línea celular de cáncer de colon SW480.

El anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno de la presente invención preferentemente puede inhibir el crecimiento canceroso de una o más células cancerosas seleccionadas 35 del grupo que consiste en células cancerosas de pecho, células cancerosas de próstata, células cancerosas de intestino, células cancerosas de vejiga, células cancerosas de colon, células cancerosas de ovario, células cancerosas de pulmón, células de melanoma, células de linfoma y células de leucemia.

El anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno preferente y específicamente se une a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID 40 NO:1),o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. En una realización preferida de la invención, por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno específicamente se une a un epítopo contenido dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella.

La expresión “se une específicamente” en esta memoria descriptiva, se debe entender que se 45 refiere a las características de unión de un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno que se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1),o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. El anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno es preferentemente un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia que 50 comprende residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1),o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1).

La frase “que inhibe el crecimiento canceroso de una célula” tal como se usa aquí se entiende 55 que significa que el crecimiento canceroso de la célula se reduce o previene sustancialmente. En la presente invención una célula se pone en contacto por lo menos con un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno que se une a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1),o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella, para dar como resultado la inhibición del crecimiento canceroso de la célula 60

comparado con una célula sin tratar. El método preferentemente da como resultado la muerte de la célula. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1).

La muerte celular de una célula cancerosa se puede verificar por varios ensayos. Por ejemplo, se considera que la activación de la caspasa-3 juega un papel clave en la iniciación de los eventos celulares 5 durante la muerte celular. Están comercialmente disponibles muchos kits diferentes para la cuantificación de la actividad de la caspasa-3. La despolarización de la membrana mitocondrial está a menudo asociada con las primeras etapas de la muerte celular. Se supone que los cambios en el potencial de la membrana son debidos a la apertura de los poros de transición de la permeabilidad mitocondrial, que puede jugar un papel fundamental en la apóptosis. La despolarización se puede detectar por varios ensayos diferentes 10 que incluyen el uso de Rhodamina 123, un colorante catiónico verde fluorescente que se acumula en la mitocondria activa, que tiene altos potenciales de membrana que permite la rápida y fácil detección de la ruptura celular. La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima citoplasmática estable presente en todas las células. Se desprende rápidamente en el sobrenadante del cultivo celular cuando se daña la membrana plasmática. La actividad de la LDH se puede medir fácilmente en el sobrenadante del cultivo 15 por medio de un ensayo de un solo punto usando un lector de placa espectrométrico usando kits comercialmente disponibles. La LDH elevada en un medio de cultivo es una indicación de necrosis (muerte) celular.

La morfología de una célula se puede examinar también para evaluar la muerte celular. Por ejemplo, la apóptosis es la muerte celular programada que está caracterizada por una serie de eventos 20 morfológicos típicos, tales como la contracción de la célula y la fragmentación en cuerpos (17) apoptóticos unidos por una membrana. Estos se pueden ver usando un microscopio óptico. Además, se puede examinar una célula para ver la expresión de genes relacionados con la muerte celular. Además, el análisis RT-PCR que compara células tratadas y sin tratar con el anticuerpo EphB4 de cuatro diferentes líneas celulares de cáncer de pecho ha mostrado que la expresión del gen EphB4 disminuye en las 25 células tratadas.

El cáncer se selecciona preferentemente del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de intestino, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma y leucemia.

El sujeto tratado se puede seleccionar, pero no está limitado al, grupo que consiste en seres 30 humanos, ovejas, ganado vacuno, caballos, bóvidos, cerdos, aves, perros y gatos.

La expresión “cantidad efectiva” quiere decir una dosis suficiente para proporcionar tratamiento o prevención para el cáncer que se está tratando o previniendo. Esta variará dependiendo del sujeto y del tipo de cáncer del que está afectado. Las cantidades efectivas de por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno usadas en los métodos de la presente invención pueden variar 35 dependiendo de la manera de administración, del estado del animal que se va a tratar, y finalmente se decidirán por el científico, médico o veterinario que lo trata. La cantidad de anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno usada para tratar o prevenir a un sujeto variará también dependiendo de la naturaleza e identidad del particular anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno.

Un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se administra preferentemente a un 40 sujeto por cualquier medio apropiado conocido por los expertos en la técnica. Preferentemente, el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se puede poner en contacto con una célula de varios modos, que incluyen, por ejemplo, intravenosamente.

Preferentemente, el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno de la presente invención se combina con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable apropiado para formar 45 una composición farmacéutica que puede ser apropiada para la administración a un sujeto humano o animal. Los vehículos o diluyentes apropiados incluyen disoluciones salinas isotónicas, por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato. La composición farmacéutica que incluye por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se puede formular para administración parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular, oral o transdérmica. El anticuerpo se 50 puede administrar con una dosis apropiada dependiente del peso corporal del sujeto. Se debe entender, sin embargo, que las rutas de administración y las dosis mencionadas se pretende que sirvan solo como guía dado que una persona experta en la técnica sería capaz fácilmente de determinar la ruta óptima de administración y la dosis para cualquier sujeto y cáncer en particular.

El anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se puede combinar con excipientes 55 apropiados, tales como emulsionantes, tensioactivos, estabilizantes, colorantes, mejoradores de penetración, antioxidantes, agua, disoluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, estearato de magnesio y ácido silícico. El anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se formula preferentemente en forma de una disolución acuosa estéril. El anticuerpo o una de sus porciones

que se une a antígeno se puede combinar con los componentes adjuntos que son compatibles con la actividad del anticuerpo. Un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno usado en los métodos de la presente invención se puede usar preferentemente para complementar los tratamientos existentes para el cáncer. Por ejemplo, el método de la presente invención se puede usar también en combinación con los tratamientos convencionales del cáncer tales como radioterapia, quimioterapia (por 5 ejemplo, usando antraciclinas, 5FU, inhibidores de topoisomerasa, Cisplatino o Carboplatino), o terapia hormonal o terapias que utilizan modificadores hormonales (por ejemplo, Catamoxifen).

Se puede usar un método para identificar un agente que inhibe el crecimiento canceroso de una célula. Comprendiendo el método evaluar la capacidad del agente para unirse a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los 10 residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más preferentemente los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. El agente se puede unir a un epítopo contenido dentro de los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más 15 preferentemente los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente el agente se une a una proteína EphB4 que tiene una secuencia que comprende los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más preferentemente los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o 20 una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella.

En la presente memoria descriptiva el término “agente” se entiende que incluye cualquier molécula, compuesto o proteína que se puede unir (interactuar con) los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más preferentemente los residuos 220 a 230 de EphB4 25 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Los agentes apropiados pueden incluir preferentemente un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno que se une a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más preferentemente los residuos 220 30 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Lo más preferentemente, el agente es un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno que es un anticuerpo monoclonal o policlonal. Se puede evaluar la capacidad del agente para inducir la muerte celular. El agente es preferentemente un ligando de EphB4, tal como un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, que es preferentemente específico para la proteína EphB4 y 35 se puede desarrollar u obtener comercialmente para examinar in vitro o in vivo sistemas para verificar su capacidad para inhibir el crecimiento canceroso de una célula.

Por ejemplo, los anticuerpos o una de sus porciones que se unen a antígeno dirigidas a epítopos específicos de residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más 40 preferentemente los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella, se pueden examinar para ver su capacidad de inhibir el crecimiento canceroso de una célula y preferentemente inducir la muerte celular. Se pueden realizar las curvas de respuesta a la dosis para evaluar el IC50 de los anticuerpos para examinar la eficacia de cada anticuerpo examinado. Además, se pueden realizar estudios de unión anticuerpo/receptor-ligando para 45 evaluar la capacidad del anticuerpo para prevenir la unión del ligando. La fosforilación de tirosina del receptor EphB4 después de la unión del anticuerpo se puede evaluar por inmunoprecipitación del receptor con el anticuerpo respectivo, seguido de análisis de Western con un anticuerpo anti-fosfotirosina para confirmar que el receptor EphB4 está inactivado. El anticuerpo con la mejor actividad de neutralización respecto a inhibir la fosforilación de tirosina y el crecimiento celular in vitro y prevenir la unión del ligando 50 al receptor EphB4 a la más baja concentración (IC50) inhibidora de 50% se puede seleccionar para ensayos in vivo adicionales.

Por ejemplo, se puede usar un modelo in vivo de metástasis y crecimiento celular usando ratones inmunodeficientes NOD-SCID (inmunodeficiencia combinada diabética no obesa) para examinar la capacidad de los agentes putativos que se pueden unir a un polipéptido que tiene una secuencia que 55 comprende los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más preferentemente los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella, para ver su eficacia como agente anticáncer. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 60 226 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Además, un conjunto diverso de líneas celulares tumorales que están disponibles, la mayor parte de las cuales se pueden cultivar como xenoinjertos, y estas incluyen la línea celular de cáncer de pecho humano MCF-7 y la línea celular de cáncer de colon HT29, se pueden usar

para ensayos in vitro. Los tumores de xenoinjerto se pueden hacer crecer en el modelo de ratón después de inyección subcutánea, donde crecerán como una masa, o después de una inyección en la vena de la cola permitiendo la imitación de la extensión hematógena de la metástasis que da como resultado depósitos secundarios en otros órganos. Una vez que se han establecido los periodos de injerto y las dosis de inoculación para cada línea celular, el modelo se puede usar para examinar varios agentes que 5 se unen a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 200 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 201 a 245 de EphB4 (SEQ ID NO:1), preferentemente los residuos 220 a 244 de EphB4 (SEQ ID NO:1), más preferentemente los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO:1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Las células se pueden tratar también con dosis subletales de un anticuerpo EphB4 escogido comparando 10 con el IC50 e IC75 para evaluar el prendimiento de las células tratadas comparadas con las células no tratadas. Esto evaluará los efectos de la expresión funcional reducida de EphB4 en el establecimiento y metástasis de las líneas celulares tumorales.

Los modelos in vivo se pueden usar también para la evaluación preclínica de nuevas terapias potenciales para el tratamiento de líneas celulares tumorales positivas a EphB4. El uso de inyección 15 subcutánea permitirá el examen de tumores que se ha permitido que se establezcan durante diferentes periodos de tiempo. Esto se puede usar para determinar la capacidad de un agente, tal como un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, para quitar nuevos y bien establecidos tumores comparado con el vehículo de control. El uso de inyecciones en la vena de la cola se puede usar para determinar si el tratamiento con un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno reducirá el 20 número de metástasis formadas como resultado de la extensión hematógena. Los agentes identificados por los métodos de la presente invención se pueden usar para el tratamiento o prevención del cáncer. La presente invención proporciona también un agente identificado por el método descrito anteriormente.

En toda esta memoria descriptiva la palabra “comprenden”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un citado elemento, número 25 entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

La invención se describirá de aquí en adelante por medio de los siguientes Ejemplos y Figuras no limitantes.

Ejemplo 1 – Localización inmunohistoquímica de EphB4 30

Se usó un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) para analizar la localización de la proteína EphB4 en tejido normal y tumoral. El tejido de colon y pecho mostró un notable incremento de los niveles de esta proteína en las células epiteliales del tumor cuando se compara con el tejido normal equivalente (como se muestra en la Figura 1). La demostración de la alta expresión de 35 EphB4 en las células epiteliales tumorales en dos de los cánceres que ocurren más comúnmente sugiere que la EphB4 es crítica para la progresión de estos tumores.

Ejemplo 2 – Expresión por RT-PCR de EphB4

Se usó la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para comparar la expresión de EphB4 (1187 bp) y ARNr 18S (489 bp) en cinco pares tumor (T)/normal(N) 40 (resultados mostrados en la Figura 2). El análisis de 63 cánceres de colon de 60 pacientes indicó que el EphB4 esta sobre-expresado en el tejido tumoral de 80% de los pacientes, lo que implica una amplia aplicación como diana terapéutica (Figura 2). La diferencia de expresión entre células tumorales y tejido normal sugiere que la terapia tumoral anti-EphB4 puede tener un efecto preferencial en tumores de colon (y otros). 45

Una comparación del perfil de expresión de EphB4 con el de otras proteínas tirosina quinasas receptoras que ya están siendo dianas en ensayos clínicos (HER2, EGFR y VEGFR) sugiere que el EphB4 se expresa en menor grado en tejidos normales. La información de las bases de datos EST sugiere que puede estar presente bajo nivel de expresión de EphB4 en riñón, ovario y placenta, y muy bajo nivel de expresión en corazón, pulmón, nervios periféricos y tejido vascular. Por consiguiente se 50 puede esperar que las terapias que apuntan a EphB4 produzcan menos efectos secundarios que aquellas que apuntan a otras tirosina quinasas receptoras.

Ejemplo 3 – Estudios de anticuerpo específico EphB4

Se demostró un efecto tumoricida directo de un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de 55 EphB4 (SEQ ID NO:1) in vitro. La incubación de una monocapa totalmente confluente de líneas celulares de cáncer de colon SW480 y SW620 con una dilución 1/500 de anticuerpo EphB4 H-200 (Santa Cruz Biotechnology – números de lote B141 y F182) provocó que las células se despegaran del fondo del

recipiente de cultivo y muriesen (Figura 3). Esta fue una respuesta común observada cuando se tratan líneas celulares de cáncer que incluyen SW480, SW620, LIM1215, líneas celulares de cáncer de pecho MCF-7, T47-D, MDA-MB-453, MDA-MB-231, y Hs578t, líneas celulares de cáncer de vejiga J82, RT119, 5637 y T24.

La incubación de la línea celular de cáncer de pecho MCF-7 y la línea celular de cáncer de colon 5 SW480 con tres diferentes concentraciones de anticuerpo (2 µg/ml, 1 µg/ml y 0,2 µg/ml) dio como resultado la muerte celular de una manera dependiente de la dosis (véase la Figura 4 y la Figura 5). Este efecto no se observó después de la exposición de la línea celular endotelial HUVEC-C al anticuerpo EphB4. El análisis de la actividad de la caspasa-3 sugirió que la muerte celular no fue vía apóptosis (Figura 6). Estos resultados sugieren que por reticulación o unión a receptores de membrana, los 10 anticuerpos pueden imitar o modular la actividad del receptor y que estas señales transmembrana generadas por los anticuerpos pueden provocar apóptosis o inhibición del crecimiento (18). Los posibles mecanismos alternativos para la inducción de la muerte celular incluyen la muerte celular no apoptótica mediada por ras o la restauración de la comunicación intercelular por canales de unión (GJIC), un camino directo de comunicación célula-célula que se sabe que es prevenido por la señalización (19) del receptor 15 Eph.

Se han desarrollado anticuerpos policlonales específicos para EphB4 y están disponibles comercialmente, para el examen de estos anticuerpos en sistemas in vitro e in vivo. La Figura 7 muestra resultados del porcentaje de viabilidad de células de cáncer de pecho después del tratamiento con cinco anticuerpos EphB4 como se detalla a continuación: 20

(1) un anticuerpo policlonal EphB4 (Suizo) dirigido a los residuos de aminoácido 825 a 991 del carboxi terminal de EphB4 de ratón;

(2) un anticuerpo policlonal EphB4 de N-terminal (N-19 Santa Cruz Biotechnology) dirigido a los primeros 19 aminoácidos N-terminales de la secuencia de aminoácidos de EphB4 que es probable que sean los residuos de aminoácido 16 a 34 del EphB4 maduro (SEQ ID NO:1); 25

(3) un anticuerpo policlonal EphB4 de C-terminal (C-16 Santa Cruz Biotechnology) dirigido al carboxi terminal que corresponde al dominio de tirosina quinasa que consiste en los residuos de aminoácido 651 a 874 de EphB4 (SEQ ID NO:1);

(4) un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotecnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1); 30

(5) un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 (antiguo) Santa Cruz Biotechnology – Lot number B141 batch) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1).

El efecto de la muerte celular se observó en el tratamiento con el anticuerpo H-200 específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID 35 NO:1). Una comparación de las células cultivadas en un medio con o sin proteínas de complemento activas muestra que el complemento no juega ningún papel en la muerte celular mediada por Ab (véase la Figura 7).

El mecanismo de la muerte celular se puede ver adicionalmente analizando cambios en la expresión génica inducidos en células cancerosas in vitro después de la incubación con dosis subletales 40 del anticuerpo EphB4 H-200 usando técnicas de microsecuenciación.

Ejemplo 4 – Expresión de EphB4 en tejido humano

La información de las bases de datos EST y el análisis Northern de tejidos humanos normales (20) sugiere que puede estar presente bajo nivel de expresión de EphB4 en riñón, ovario y placenta y muy bajo nivel de expresión en corazón, pulmón, nervios periféricos y tejido vascular, y ninguna expresión en 45 el cerebro. Para determinar si la expresión génica se correlaciona con el nivel de proteína traducida en realidad, se realizó un análisis Westhern usando estos tejidos con un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Por comparación con una única muestra de tumor de colon se mostró que el nivel de expresión génica no corresponde a la cantidad de proteína EphB4 producida en estos tejidos 50 (Figura 8). La diferencia de expresión entre las células tumorales y el tejido normal sugiere que la terapia tumoral anti-EphB4 puede tener un efecto preferente en los tumores de cáncer.

Se obtuvieron varias bandas de hibridación con el análisis de Western blot (datos no mostrados). Sin embargo, la identidad de estas bandas de proteínas que son específicas de la(s) muestra(s) de tumor, y comunes a todas las muestras de tumor examinadas, está por determinar pero puede corresponder a la 55 variante de empalme. Se identificaron dos variantes de empalme de EphB4 (denominadas EphB4v1 y

EphB4v2). La determinación de la estructura del gen EphB4 ha mostrado que EphB4v1 es el resultado de la ausencia de los 53 aminoácidos codificados por todo el exón 16 (Figura 9). Si se traduce EphB4v1 la proteína resultante carecería de una porción de los dominios tanto de la quinasa como de SAM, dos dominios proteínicos que se sabe que juegan papeles para transmitir señales a las dianas intracelulares. La EphB4v2 está provocada por la eliminación en el marco de todo el exón 6 que da como resultado la 5 ausencia de 111 aminoácidos. La EphB4v2 codificaría una proteína que carece de la primera repetición del tipo III de fibronectina. El papel de las repeticiones del tipo III de fibronectina no es conocido y el efecto de retirar una de estas repeticiones es desconocido en este momento.

Ejemplo 5 – Análisis por RT-PCR de EphB4

Debido al posible papel de EphB4 en la angiogénesis, se realizó la expresión de EphB4 en 10 células endoteliales usando RT-PCR. Se observó bajo nivel de expresión de EphB4. Sin embargo, cuando se cultivaron estas células en presencia del anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotecnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) no había cambio aparente del crecimiento celular o morfología, incluso con la más alta concentración de anticuerpo. Se examinó también el efecto del anticuerpo EphB4 sobre el crecimiento y 15 morfología de células NIH3T3. No había respuesta morfológica o de crecimiento (datos no mostrados). Se examinó también la línea celular de pecho no tumorigénica MCF10A, establecida a partir de tejido mamario de una paciente caucásica de 36 años de edad con mastopatía fibroquística (21), y se observó que expresaba EphB4 en bajos niveles pero no respondía al anticuerpo anti-EphB4 (datos no mostrados). Estos resultados, cuando se consideran junto con los resultados obtenidos del análisis western de tejidos 20 humanos normales (Ejemplo 5), sugieren que los tejidos que muestran un alto nivel de expresión de EphB4 serán negativamente afectados por un anticuerpo EphB4.

Los resultados indicaron que después del tratamiento con el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) se reduce la expresión del gen EphB4 (Figura 10). Esto está de acuerdo 25 con el hallazgo de que la mayor parte de los anticuerpos incrementan la reducción de RTK y la internalización del receptor después del bloqueo de la interacción ligando-receptor y la inhibición de la señal de RTK inducida por el ligando. Esto es dado que ciertos anticuerpos pueden influir en el crecimiento tumoral alterando el patrón de señalización intracelular dentro de la célula tumoral diana. El análisis de los cambios globales en la expresión génica en células tratadas con Ab comparadas con las 30 células sin tratar puede identificar genes implicados en la señalización relacionada con EphB4.

Ejemplo 6 – Mapeo del epítopo del anticuerpo EphB4

Se cría un anticuerpo policlonal EphB4 H-200 comercialmente disponible Ab de Santa Cruz contra una proteína recombinante correspondiente a los aminoácidos 201-400 de la SEQ ID NO:1 de receptor humano EphB4. La secuencia incluye el dominio rico en cisteína y la primera repetición de tipo III 35 de fibronectina y por consiguiente se esperaba que varias regiones antigénicas diferentes serian reconocidas. Se diseñaron seis péptidos bloqueantes de 25 aminoácidos (solapados por 5 aminoácidos, separados por 20 aminoácidos) contra residuos de aminoácido específicos de la proteína EphB4 (SEQ ID NO:1) como se indica en la Figura 11. Los péptidos bloqueantes tienen la siguiente secuencia de aminoácidos: 40

Péptido 1 SEQ ID NO : 2: TVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVV

Péptido 2 SEQ ID NO : 3: GSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQW

Péptido 3 SEQ ID NO : 4: EDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGN

Péptido 4 SEQ ID NO : 5: AAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSC

Péptido 5 SEQ ID NO : 6: GEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCR 45

Péptido 6 SEQ ID NO : 7: VCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPS

Los péptidos se examinaron para ver su capacidad para prevenir la muerte celular después de preincubación con el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotecnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1). Un cóctel de todos los péptidos se examinó inicialmente y previno con éxito la muerte celular como se determina 50 usando los ensayos de exclusión de azul de tripano (Figura 12) y de actividad de la caspasa-3 (Figura 13). Los péptidos se examinaron a continuación separadamente y se observó el rescate parcial para el Péptido 1 (SEQ ID NO:2) y el Péptido 2 (SEQ ID NO:3) (véase la Figura 14). El Péptido 1 y el Péptido 2 se solapan en cinco residuos de aminoácido (GSCVV denominada SEQ ID NO:13) que indican que esta secuencia de aminoácidos que corresponde a los residuos 221 a 225 de EphB4 (SEQ ID NO:1) es 55 posiblemente el núcleo del epítopo reactivo.

Debido a que el experimento inicial con el cóctel de péptidos efectivamente contenía dos veces la cantidad molar de la secuencia GSCVV (SEQ ID NO:13) (es decir, los residuos 221 a 225 de EphB4 (SEQ ID NO:1)) se efectuó un experimento bloqueante adicional en el que se comparó dos veces la cantidad de cada uno del Péptido 1 (SEQ ID NO:2) y del Péptido 2 (SEQ ID NO:3) con la cantidad inicial de los péptidos conjuntamente. Todos los tratamientos tuvieron éxito para prevenir la muerte de la célula tumoral 5 causada por el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 de Santa Cruz) (véase la Figura 15).

Se prepararon comercialmente tres nuevos péptidos (péptidos 7 a 9) de diferentes longitudes que abarcan la secuencia del epítopo del núcleo GSCVV (SEQ ID NO:13) basados en residuos de aminoácido específicos de proteína EphB4 (SEQ ID NO:1) como se indicó en la Figura 16. Los péptidos bloqueantes tienen la siguiente secuencia de aminoácidos: 10

Péptido 7 SEQ ID NO: 8: AGSCVVDA

Péptido 8 SEQ ID NO: 9 VAGSCVVDAV

Péptido 9 SEQ ID NO: 10 LVVPVAGSCVVDAVPA.

Sin embargo, debido al alto número de aminoácidos hidrófobos en los péptidos 8 y 9, estos péptidos no eran solubles en ninguna disolución que se pudiera aplicar a células, impidiendo de este 15 modo un ensayo posterior. Sin embargo, el Péptido 7 (SEQ ID NO:8) con una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 220 a 227 de EphB4 (SEQ ID NO:1) se usó en experimentos bloqueantes y fue capaz de rescatar células del efecto de muerte celular provocado por la adición del anticuerpo EphB4 (H-200 de Santa Cruz) solo (véase la Figura 17).

Referencias: 20

1. Australian Institute of Health and Welfare (AIHW) and Australasian Association of Cancer Registries (AACR) 2000. Cancer in Australia 1997. AIHW cat no. CAN10. Canberra: AIHW (Cancer Series no. 15).

2. Wang et al. , 1998, Cell 93: 741-753.

3. Dottori et al. , 1998, PNAS 1998 95: 13248-13253.

4. Easty et al. , 1999, Int. J. Cancer 84: 494-501. 25

5. Tickle and Altabef, 1999, Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 455-460.

6. Oates et al. , 1999, Mech. Dev. 83: 77-94.

7. O'Leary and Wilkinson, 1999, Curr. Opin. Neurobiol. 9: 65-73.

8. Ward et al, 1989, Nature 341: 544-546.

9. Van den Beuken T et al, 2001, J. Mol. Biol, 310,591. 30

10. Bird et al, 1988, Science 242: 423-426.

11. Huston et al. , 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883.

12. Holliger, P. , et al 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.

13. Poljak, R. J., et al. 1994 Structure 2: 1121-1123.

14. Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497. 35

15. Kozbor et al, . 1983, Immunology Today 4: 72.

16. Cole et al. , 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96.

17. Saraste and Pulkki, 2000, Cardiovascular Res. 45: 528-53.

18. Tickle and Altabef (1999) Epithelial cell movements and interactions in limb, neural crest and vasculature. Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 455-460 19. Mellitzer et al. , 1999, Nature 400: 77-81. 40

20. Bennett et al (1994) Cloning and characterization of HTK, a novel transmembrane tyrosine kinase of the EPH subfamily. J Biol Chem. 269: 14211-14218.

21. Keydar et al (1979) Establishment and characterization of a cell line of human breast carcinoma origin. Eur. J Cancer 15: 659-670.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> The Queen Elizabeth Hospital Stephenson, Sally-Anne

<120> Métodos para regular el cáncer

<130> P38558EP-K

<140> EP 03794710.8

<150> AU 2002951409

<151> 16-09-2002

<160> 13

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 984

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. El uso de una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o 5 prevención del cáncer en un sujeto, en el que el cáncer comprende una o más células que expresan EphB4.
3. 2. El uso de una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 85% a los residuos 220 a 230 de EphB4 10 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, en el que el cáncer comprende una o más células que expresan EphB4.
4. 3. Un uso según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 90% a los residuos 15 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1.
5. 4. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de intestino, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma y leucemia.
6. 5. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cáncer es cáncer de 20 pecho o cáncer de colon.
7. 6. Un método in vitro para inhibir el crecimiento canceroso de una célula que expresa EphB4, comprendiendo el método poner en contacto la célula por lo menos con un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 que 25 consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1.
8. 7. Un método in vitro para inhibir el crecimiento canceroso de una célula que expresa EphB4, comprendiendo el método poner en contacto la célula por lo menos con un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 85% a los 30 residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1.
9. 8. Un método según la reivindicación 7, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 90% a los residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID 35 NO:1
10. 9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la célula es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de intestino, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma y leucemia. 40
11. 10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la célula es una célula de un cáncer de pecho o cáncer de colon.