ES2355642T3 - Conjugados que comprenden una porcion de gm-csf y un polimero. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende: (i)un producto conjugado que comprende un GM-CSF humano unido covalentemente, directamente o a través de un radical espaciador compuesto de uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, que tiene la siguiente estructura: **(Ver fórmula)** donde cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 3 a 4.000, y que tiene un peso molecular medio ponderal de más de 5.000 Daltons; y (ii)un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde al menos aproximadamente 85% de los productos conjugados en la composición tienen de uno a dos polímeros anclado al GM-CSF humano.
Description
Conjugados que comprenden una porción de
GM-CSF y un polímero.
La presente invención se refiere generalmente a
productos conjugados que comprenden una porción de
GM-CSF (es decir, una porción que tiene actividad
GM-CSF) y un polímero. Además, la invención se
refiere a composiciones que comprenden los productos
conjugados.
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Una función importante del sistema
hematopoyético humano es la reposición de una diversidad de glóbulos
blancos (incluyendo macrófagos, neutrófilos, y
basófilos/mastocitos), glóbulos rojos (es decir, eritrocitos) y
células formadoras de coágulos (p. ej., megacariocitos/plaquetas).
Cada una de estas células especializadas se forma a partir de
células precursoras hematopoyéticas localizadas en la médula ósea.
Glicoproteínas de tipo hormona específicas denominadas "factores
estimuladores de colonias" controlan la diferenciación y la
maduración de las células precursoras hematopoyéticas en cada una
de las varias células sanguíneas especializadas.
Uno de tales factores estimuladores de colonias
es el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos o
"GM-CSF". Como su nombre implica, este factor
estimulador de colonias promueve la proliferación y la
diferenciación de glóbulos blancos tales como granulocitos y
macrófagos, si bien GM-CSF puede promover también la
formación de otros tipos celulares. El GM-CSF es
producido por varios tipos celulares diferentes (incluyendo células
T activadas, células B, macrófagos, mastocitos, células endoteliales
y fibroblastos) en respuesta a citoquinas, estímulos inmunitarios e
inflamatorios. El GM-CSF nativo es una glicoproteína
de 127 aminoácidos y puede tener una diversidad de pesos
moleculares dependiendo del grado de glicosilación.
Farmacológicamente, el GM-CSF ha
sido administrado a pacientes con cáncer con el fin de acelerar la
reposición de glóbulos blancos que son destruidos durante los
tratamientos de quimioterapia. Con el propósito similar de acelerar
la reposición de glóbulos blancos, este factor estimulador de
colonias ha sido administrado a pacientes con leucemia que
experimentan terapia de reposición de médula ósea. Se han propuesto
aplicaciones adicionales, tales como la curación acelerada de
heridas. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm.
6.689.351.
Una desventaja asociada con las formas actuales
de terapia con GM-CSF es la frecuencia de
dosificación. Puesto que la terapia con GM-CSF
requiere por lo general inyecciones diarias, los pacientes tienen
aversión por la inconveniencia y la incomodidad asociadas con este
régimen. Asociado con el hecho de que los pacientes requieren
análisis de sangre frecuentes para determinar los recuentos de
glóbulos blancos (que requieren visitas a un profesional de la
salud), muchos pacientes preferirían una alternativa que fuera menos
incómoda y/o implicara una reducción del número de inyecciones.
Una solución propuesta a estos problemas ha sido
proporcionar una forma de liberación prolongada de
GM-CSF. Por ejemplo, la Patente de los Estados
Unidos Núm. 5.942.253 describe microesferas de poli(ácido
láctico-co-ácido glicólico) u otros polímeros
biodegradables de GM-CSF. La formación de
microesferas, no obstante, puede ser un proceso complejo, que
requiere varias etapas sintéticas. De este modo, este enfoque de
liberación prolongada adolece de complejidades que se evitan
idealmente.
La PEGilación, o el anclaje de un derivado de
poli(etilenglicol) a una proteína, se ha descrito como un
medio para prolongar la vida media in vivo de una proteína,
dando como resultado la prolongación de la actividad farmacológica.
Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.880.255
describe un producto conjugado de GM-CSF y
poli(etilenglicol) formado a partir de una reacción con
monometoxipoli(etilenglicol) lineal derivatizado con
2,2,2-trifluoroetanosulfonato que tiene un peso
molecular de 5.000 Daltons.
Saifer et al "Polymer Preprints",
vol 38, 1997 págs. 576-577, describen productos
conjugados de PEG-GH-CSF donde las
cadenas de PEG son lineales.
No obstante, a pesar de este producto conjugado
descrito, persiste la necesidad de otros productos conjugados de
GM-CSF que posean, por ejemplo, un polímero que
tenga un peso molecular mayor de 5.000 Daltons, un polímero que
tenga una estructura diferente (p. ej., una estructura ramificada
y/o en tenedor), diferentes sitios de anclaje, sitios de anclaje de
sitio específico o de sitio selectivo, etcétera.
De este modo, persiste la necesidad en la
técnica de proporcionar productos conjugados de porciones de
GM-CSF-polímero adicionales. Entre
otras cosas, una o más realizaciones de la presente invención están
dirigidas por lo tanto a tales productos conjugados así como a
composiciones que comprenden los productos conjugados y métodos
relacionados descritos en la presente memoria, que se cree que son
nuevos y no han sido propuestos en absoluto por la técnica.
Una composición farmacéutica que comprende:
- 1. (i)
- un producto conjugado que comprende un GM-CSF humano unido covalentemente, directamente o a través de un radical espaciador compuesto de uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, que tiene la siguiente estructura:
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\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- donde cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 3 a 4.000, y que tiene un peso molecular medio ponderal de más de 5.000 Daltons; y
- 2. (ii)
- un excipiente farmacéuticamente aceptable,
donde al menos aproximadamente 85% de los
productos conjugados en la composición tienen de uno a dos polímeros
anclados a GM-CSF humano.
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La Fig. 1 es el cromatograma que sigue al
análisis SEC-HPLC de una solución de producto
conjugado como se describe en el Ejemplo 1.
La Fig. 2 es el cromatograma que sigue a la
purificación de intercambio aniónico de una composición descrita en
el Ejemplo 1.
La Fig. 3 muestra los resultados de la
SDS-PAGE de las fracciones de producto conjugado
como se describe en el Ejemplo 1.
La Fig. 4 es el cromatograma que sigue al
análisis SEC-HPLC de una solución de producto
conjugado como se describe en el Ejemplo 2.
La Fig. 5 es el cromatograma que sigue a la
purificación de intercambio aniónico de una composición como se
describe en el Ejemplo 3.
La Fig. 6 es el cromatograma que sigue al
análisis SEC-HPLC de una solución de producto
conjugado como se describe en el Ejemplo 4.
La Fig. 7 es el cromatograma que sigue al
análisis SEC-HPLC de una solución de producto
conjugado como se describe en el Ejemplo 5.
La Fig. 8 es el cromatograma que sigue al
análisis SEC-HPLC de una solución de producto
conjugado como se describe en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La porción de GM-CSF se puede
obtener a partir de métodos no recombinantes o a partir de métodos
recombinantes.
La porción de GM-CSF se puede
obtener no recombinantemente. Por ejemplo, el GM-CSF
se puede obtener de fuentes derivadas de sangre. En particular, el
GM-CSF se puede aislar de plasma o tejidos humanos
utilizando técnicas (p. ej., técnicas de precipitación, técnicas de
centrifugación, técnicas cromatográficas) conocidas por los
expertos normales en la técnica.
La porción de GM-CSF se puede
obtener a partir de métodos recombinantes. Por ejemplo, se ha
aislado, caracterizado, y clonado en vectores de expresión el ADNc
que codifica el GM-CSF humano. Véanse, p. ej., las
Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.078.996 y 5.891.429, y Wong
et al. (1985) "Human GM-CSF: Molecular
Cloning of the Complementary DNA y Purification of the Natural and
Recombinant Proteins", Science 218:819, y Cantrell et al.
(1985) "Cloning, Sequence, and Expression of a Human
Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating
Factor," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 82: 6250. Se pueden
utilizar las porciones de GM-CSF expresadas en
sistemas de expresión bacterianos (Escherichia coli), de
mamíferos (p. ej., células ováricas de hámster Chino), y de
levaduras (p. ej., Saccharomyces cerevisiae).
Una vez expresado, el GM-CSF
humano endógeno es una glicoproteína monomérica con un peso
molecular de aproximadamente 22.000 Daltons. La secuencia de
aminoácidos expresada se proporciona como SEQ ID NO: 1. Son
preferidos para su uso como una porción de GM-CSF
en la presente memoria cualquiera de varias secuencias de
aminoácidos de GM-CSF humano. Se han producido al
menos tres proteínas GM-CSF humanas diferentes en
varios sistemas de expresión: sargramostim; molgramostim;
regramostim; y ecogramostim. Sargramostim se expresa en
Saccharomyces cerevisiae, tiene una sustitución del aminoácido leucina en la posición 23 (SEQ ID NO: 2) en comparación en el GM-CSF humano endógeno y está O-glicosilado. Molgramostim se expresa en Escherichia coli y no está glicosilado. Regramostim se produce en células ováricas de hámster (CHO) y está completamente glicosilado. También se contemplan las versiones con metionilo de estas proteínas donde un residuo metiona precede a la secuencia de aminoácidos completa. A no ser que se indique específicamente, todas las asignaciones de una localización numérica de un residuo aminoácido según se proporciona en la presente memoria están basadas en el SEQ ID
NO: 1.
Saccharomyces cerevisiae, tiene una sustitución del aminoácido leucina en la posición 23 (SEQ ID NO: 2) en comparación en el GM-CSF humano endógeno y está O-glicosilado. Molgramostim se expresa en Escherichia coli y no está glicosilado. Regramostim se produce en células ováricas de hámster (CHO) y está completamente glicosilado. También se contemplan las versiones con metionilo de estas proteínas donde un residuo metiona precede a la secuencia de aminoácidos completa. A no ser que se indique específicamente, todas las asignaciones de una localización numérica de un residuo aminoácido según se proporciona en la presente memoria están basadas en el SEQ ID
NO: 1.
Los métodos recombinantes ilustrativos
utilizados para preparar una porción de GM-CSF (ya
sea un GM-CSF humano o una proteína diferente que
tiene actividad GM-CSF) se pueden describir
brevemente. Tales métodos implican la construcción del ácido
nucleico que codifica el polipéptido o fragmento deseado, la
clonación del ácido nucleico en un vector de expresión, la
transformación de una célula anfitriona (p. ej., célula vegetal,
bacteriana tal como Escherichia coli, de levadura tal como
Saccharomyces cerevisiae, o de mamífero tal como una célula
ovárica de hámster Chino o una célula de riñón de cría de hámster),
y la expresión del ácido nucleico para producir el polipéptido o
fragmento deseado. La expresión puede producirse a través de la
expresión exógena (cuando la célula anfitriona contiene
naturalmente la codificación genética deseada) o a través de la
expresión endógena. Los métodos para producir y expresar
polipéptidos recombinantes en vitro y en células
anfitrionas procarióticas y eucarióticas son conocidos por los
expertos normales en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de
los Estados Unidos Núm.
4.868.122.
4.868.122.
Para facilitar la identificación y purificación
del polipéptido recombinante, se pueden insertar o añadir en marco
a la secuencia codificante secuencias de ácido nucleico que
codifican una etiqueta epitópica u otra secuencia de unión de
afinidad, produciéndose de ese modo una proteína de fusión compuesta
del polipéptido deseado y un polipéptido adecuado para la unión.
Las proteínas de fusión se pueden identificar y purificar haciendo
correr en primer lugar una mezcla que contiene la proteína de fusión
a través de una columna de afinidad que porta radicales de unión
(p. ej., anticuerpos) dirigidos a la etiqueta epitópica u otra
secuencia de unión en las proteínas de fusión, uniéndose de ese
modo la proteína de fusión en el interior de la columna. Después de
eso, la proteína de fusión se puede recuperar mediante lavado de la
columna con la solución apropiada (p. ej., ácido) para liberar la
proteína de fusión unida. El polipéptido recombinante también se
puede identificar y purificar lisando las células anfitrionas,
separando el polipéptido, p. ej., mediante cromatografía de
exclusión por tamaños, y recogiendo el polipéptido. Estos y otros
métodos para identificar y purificar polipéptidos recombinantes son
conocidos por los expertos normales en la técnica. En una o más
realizaciones de la presente invención, no obstante, se prefiere
que la porción de GM-CSF no esté en forma de una
proteína de fusión.
Dependiendo del sistema utilizado para expresar
proteínas que tienen actividad GM-CSF, la porción de
GM-CSF puede estar no glicosilada o glicosilada y
se puede utilizar cualquiera. Esto es, la porción de
GM-CSF puede estar no glicosilada o la porción de
GM-CSF puede estar glicosilada. En una o más
realizaciones de la invención, se prefiere que la porción de
GM-CSF esté glicosilada. Los ejemplos de la
glicosilación incluyen O-glicosilación y
N-glicosilación. Se cree que los sitios de
glicosilación del GM-CSF endógeno humano son la
serina 9 (O-glicosilación), la treonina 10
(O-glicosilación), la asparagina 27
(N-glicosilación) y la asparagina 37
(N-glicosilación). Los ordenamientos de
glicosilación preferidos de cualquier porción de
GM-CSF ocurrirán en los mismos sitios (o los sitios
correspondientes a estas localizaciones en la porción dada de
GM-CSF). Así, la porción de GM-CSF
puede tener un grado de glicosilación seleccionado del grupo que
consiste en: no glicosilación, glicosilación en un solo sitio;
glicosilación en dos sitios; glicosilación en tres sitios; y
glicosilación en cuatro sitios. Un ordenamiento de glicosilación
particularmente preferido es O-glicosilación sólo en
la serina 9 y la treonina 10 y sin
N-glicosila-
ción.
ción.
La porción que tiene actividad
GM-CSF se puede modificar ventajosamente para
incluir uno o más residuos de aminoácidos tales como, por ejemplo,
lisina, cisteína y/o arginina, con el fin de proporcionar un fácil
anclaje de un polímero a un átomo dentro de un aminoácido. Por
ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.608.183 describe
secuencias de GM-CSF con "cisteína añadida" que
se pueden utilizar como una porción de GM-CSF y
métodos para preparar tales secuencias con "cisteína añadida".
Además, la porción de GM-CSF se puede modificar para
incluir un residuo de aminoácido de origen no natural. Las técnicas
para añadir residuos de aminoácidos y residuos de aminoácidos de
origen no natural son bien conocidas por los expertos normales en la
técnica. Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm.
5.393.870 y J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions
Mechanisms and Structure, 4^{a} Ed. (New York:
Wiley-Interscience, 1992).
Por añadidura, la porción de
GM-CSF se puede modificar ventajosamente para
incluir el anclaje de un grupo funcional (diferente de la adición
de un residuo de aminoácido que contiene un grupo funcional). Por
ejemplo, la porción de GM-CSF se puede modificar
para incluir un grupo tiol. Además, la porción de
GM-CSF se puede modificar para incluir de un
carbono alfa N-terminal. Además, la porción de
GM-CSF se puede modificar para incluir uno o más
radicales carbohidrato. También se pueden utilizar porciones de
GM-CSF modificadas para contener aminoxi, aldehído
u otro grupo. Además, se pueden utilizar variantes oxidadas de
GM-CSF como una porción de GM-CSF.
Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.358.707.
Los derivados de GM-CSF también están incluidos
como porciones de GM-CSF. Véase la Patente de los
Estados Unidos Núm. 5.298.603.
Para cualquier porción dada, es posible
determinar si esa porción tiene actividad GM-CSF.
Por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos
Núm. 5.393.870, se puede recoger, poner en solución y centrifugar
médula ósea humana de la cresta ilíaca de donantes sanos
recogiéndose las células y diluyéndolas para su posterior cultivo.
Después del cultivo, se puede identificar cada colonia de células y
se puede añadir la porción propuesta de GM-CSF a la
colonia apropiada y someter a ensayo la proliferación acelerada con
respecto a un control. También se pueden utilizar otros métodos
conocidos por los expertos normales en la técnica para determinar
si una porción dada tiene actividad GM-CSF. Tales
métodos son útiles para determinar la actividad
GM-CSF de la propia porción (y por lo tanto se
puede utilizar como una "porción de GM-CSF")
así como del producto conjugado de polímero-
porción.
porción.
Los ejemplos de las porciones de
GM-CSF incluyen los siguientes: un
GM-CSF humano identificado en cualquiera de los SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; sus versiones truncadas;
variantes híbridas, y miméticos peptídicos que tienen actividad
GM-CSF. Los fragmentos biológicamente activos, las
variantes por deleción, las variantes por sustitución o las
variantes adición de cualquiera de los anteriores que mantengan al
menos algún grado de actividad GM-CSF pueden servir
también como una porción de GM-CSF.
Dependiendo del sistema utilizado para expresar
proteínas que tienen actividad GM-CSF, la porción de
GM-CSF puede estar no glicosilada o glicosilada y
se puede utilizar cualquiera. Esto es, la porción de
GM-CSF puede estar no glicosilada o la porción de
GM-CSF puede estar glicosilada.
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Como se ha tratado previamente, cada producto
conjugado comprende un GM-CSF anclado, directamente
o a través de un radical espaciador compuesto de uno o más átomos,
a un polímero soluble en agua de acuerdo con las
reivindicaciones.
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Como se ha descrito antes, un producto conjugado
de la invención comprende un polímero soluble en agua unido
covalentemente (directamente o a través de un radical espaciador) a
una porción de GM-CSF. Típicamente, para cualquier
producto conjugado dado, existirán de uno a cuatro polímeros
solubles en agua unidos covalentemente a una porción de
GM-CSF (donde para cada polímero soluble en agua, el
polímero soluble en agua se puede anclar directamente a la porción
de GM-CSF o a través de una fracción espaciadora).
En algunos casos, no obstante, el producto conjugado puede tener 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más polímeros solubles en agua anclados
individualmente a una porción de GM-CSF (de nuevo,
con respecto a cada polímero soluble en agua, anclado directamente o
a través de una fracción espaciadora). Además, el producto
conjugado puede incluir no más de 8 polímeros solubles en agua
anclados individualmente a una porción de GM-CSF, no
más de 7 polímeros solubles en agua anclados individualmente a una
porción de GM-CSF, no más de 6 polímeros solubles en
agua anclados individualmente a una porción de
GM-CSF, no más de 5 polímeros solubles en agua
anclados individualmente a una porción de GM-CSF,
no más de 4 polímeros solubles en agua anclados individualmente a
una porción de GM-CSF, no más de 3 polímeros
solubles en agua anclados individualmente a una porción de
GM-CSF, no más de 2 polímeros solubles en agua
anclados individualmente a una porción de GM-CSF, y
no más de 1 polímero soluble en agua anclado a una porción de
GM-CSF.
El enlace concreto entre la porción de
GM-CSF y el polímero soluble en agua (o la fracción
espaciadora que se ancla al polímero soluble en agua) depende de
numerosos factores. Tales factores incluyen, por ejemplo, la
química del enlace concreto empleado, la porción concreta de
GM-CSF, los grupos funcionales disponibles en la
porción de GM-CSF (para el anclaje a un polímero o
la conversión en un sitio de anclaje adecuado), la posible
presencia de grupos funcionales reactivos adicionales en la porción
de GM-CSF.
En una o más realizaciones de la invención, el
enlace entre la porción de GM-CSF y el polímero (o
la fracción espaciadora que está anclada al polímero) es un enlace
hidrolíticamente estable, tal como amida, uretano (también conocido
como carbamato), amina, tioéter (también conocido como sulfuro), o
urea (también conocido como carbamida). En una o más realizaciones,
el enlace no resulta de la reacción del reactivo polimérico que
porta un grupo funcional con la porción de GM-CSF,
donde el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un
grupo funcional triazina, hidrazina, hidrazida, aldehído,
semicarbazida, maleimida, vinilsulfona, fenilglioxal, isocianato,
isotiocianato, amina y tresilo con la porción de
GM-CSF.
En una o más realizaciones de la invención, el
enlace entre la porción de GM-CSF y el polímero
soluble en agua (o la fracción espaciadora que está anclada al
polímero soluble en agua) es un enlace degradable. De este modo, el
enlace que conecta la porción de GM-CSF es
"degradable". Esto es, el polímero soluble en agua (y la
fracción espaciadora, cuando está presente) se escinde (a través de
hidrólisis, procedimientos enzimáticos, o de otro modo), dando como
resultado la porción de GM-CSF nativa o conjugada.
Preferiblemente, los enlaces degradables dan como resultado en el
polímero soluble en agua (y cualquier fracción espaciadora) la
separación de la porción de GM-CSF in
vivo sin dejar ningún fragmento del polímero soluble en agua
(y cualquier fracción espaciadora). Los enlaces degradables
ilustrativos incluyen carbonato, éster carboxilato, éster fosfato,
tioléster, anhídridos, acetales, cetales, éter aciloxialquílico,
iminas, y ortoésteres. Tales enlaces se pueden preparar fácilmente
mediante una modificación apropiada de la porción de
GM-CSF (p. ej., el grupo carboxilo del extremo C de
la proteína o un grupo hidroxilo de la cadena lateral de un
aminoácido tal como serina o treonina contenido en la proteína) y/o
el reactivo polimérico utilizando métodos de acoplamiento empleados
comúnmente en la técnica. Muy preferidos, no obstante, son los
enlaces hidrolizables que se forman fácilmente mediante reacción de
un polímero adecuadamente sustituido con un grupo funcional no
modificado contenido en la porción de GM-CSF.
Con respecto a los enlaces, en una realización
más de la invención, se proporciona un producto conjugado, que
comprende una porción de GM-CSF unida covalentemente
a un residuo de aminoácido, directamente o a través de un radical
espaciador compuesto de uno o más átomos, a un polímero soluble en
agua.
Los productos conjugados (en oposición a una
porción de GM-CSF no conjugada) pueden poseer o no
un grado medible de actividad GM-CSF. Es decir, un
producto conjugado de acuerdo con la invención poseerá en todas
partes de aproximadamente 0% a aproximadamente 100% o más de la
bioactividad de la porción parental de GM-CSF no
modificada. Preferiblemente, los compuestos que poseen una pequeña
o ninguna actividad GM-CSF contienen típicamente un
enlace degradable que conecta el polímero a la porción, de manera
que con independencia de la carencia de actividad en el producto
conjugado, la molécula parental activa (o uno de sus derivados que
tiene actividad GM-CSF) se libera mediante
degradación del enlace (p. ej., hidrólisis después de la escisión
inducida por agua del enlace). Tal actividad se puede determinar
utilizando un modelo in vivo o in vitro
adecuado, dependiendo de la actividad conocida de la porción
concreta que tiene actividad GM-CSF empleada.
Óptimamente, la degradación de un enlace
degradable es facilitada por el uso de enlaces escindibles
hidrolíticamente y/o degradables enzimáticamente tales como enlaces
que contienen uretano, amida, carbonato o éster. De este modo, el
aclaramiento del producto conjugado [vía escisión del polímero o
polímeros solubles en agua individuales] se puede modular
seleccionando el tamaño molecular y el tipo de grupo funcional del
polímero que podría proporcionar las propiedades de aclaramiento
deseadas. Un experto normal en la técnica puede determinar el tamaño
molecular apropiado del polímero así como el grupo funcional
escindible. Por ejemplo, un experto normal en la técnica,
utilizando experimentación rutinaria, puede determinar un tamaño
molecular apropiado y el grupo funcional escindible preparando
primero una variedad de productos conjugados de
polímero-(GM-CSF) con diferentes pesos moleculares
medios ponderales y grupos funcionales degradables, y obteniendo
después el perfil de aclaramiento para cada producto conjugado
administrando el producto conjugado a un paciente y tomando muestras
periódicas de sangre y/o de orina. Una vez que se han obtenido una
serie de perfiles de aclaramiento para cada producto conjugado
sometido a ensayo, se puede determinar un producto conjugado que
tiene el perfil de aclaramiento deseado.
Para los productos conjugados que poseen un
enlace hidrolíticamente estable que acopla la porción de
GM-CSF al polímero soluble en agua, el producto
conjugado poseerá típicamente un grado medible de actividad
GM-CSF. Por ejemplo, tales productos conjugados
están caracterizados típicamente por tener una bioactividad que
satisface uno o más de los siguientes porcentajes con respecto al
de la porción de GM-CSF no conjugada: al menos
aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 5%, al menos
aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos
aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos
aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos
aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 80%, al menos
aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos
aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97%, al menos
aproximadamente 100%, y más de 105% (cuando se midieron en un
modelo adecuado, tales como los presentados aquí y/o bien conocidos
en la técnica). Preferiblemente, los productos conjugados que
tienen un enlace hidrolíticamente estable (p. ej., un enlace amida)
poseerán al menos algún grado de la bioactividad de la porción de
GM-CSF parental no modificada.
Ahora se describirán los productos conjugados
ilustrativos. Se espera que la porción de GM-CSF
comparta (al menos en parte) una secuencia de aminoácidos similar a
o relacionada con un GM-CSF humano. De este modo,
como se ha indicado previamente, si bien se hará referencia a
localizaciones o átomos específicos dentro de un
GM-CSF humano, tal referencia es únicamente por
conveniencia y un experto normal en la técnica será capaz de
determinar fácilmente la localización o el átomo correspondiente en
otras porciones que tienen actividad GM-CSF. En
particular, la descripción proporcionada en la presente memoria para
un GM-CSF humano con frecuencia es aplicable no
solo a un GM-CSF humano, si no a fragmentos,
variantes por deleción, variantes sustracción y variantes por
adición de cualquiera de los anteriores.
Los grupos amino en las porciones de
GM-CSF proporcionan un punto de anclaje entre la
porción de GM-CSF y el polímero soluble en agua.
Cada una de las porciones de GM-CSF humano
proporcionadas en el SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3,
comprenden 14 residuos de lisina, conteniendo cada residuo de lisina
un grupo \varepsilon-amino que puede estar
disponible para su conjugación, así como un extremo amino. Véanse el
SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 3. De este modo, los
puntos de anclaje ilustrativos incluyen el anclaje a un aminoácido
(a través de la cadena lateral que contiene amina de un residuo de
lisina) en una o más cualesquiera de las posiciones 25, 26, 28, 49,
55, 59, 61, 66, 64, 73, 77, 110, 114 y 115. Adicionalmente, otra
porción de GM-CSF contiene 15 residuos de lisina que
contienen amina (véase el SEQ ID NO: 3). Así, los puntos de anclaje
preferidos de este GM-CSF incluyen el anclaje en el
residuo de amina asociado con una lisina en una cualquiera de las
posiciones 23, 25, 26, 28, 49, 55, 59, 61, 66, 64, 73, 77, 110, 114
y 115.
Existen varios ejemplos de reactivos poliméricos
solubles en agua útiles para formar enlaces covalentes con las
aminas disponibles de una porción de GM-CSF. Los
ejemplos específicos, junto con los productos conjugados
correspondientes, se proporcionan en la Tabla 1, más abajo. En la
tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas
repetitivas y "(GM-CSF)" representa la porción
de GM-CSF que sigue a la conjugación con el
polímero soluble en agua.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La conjugación de un reactivo polimérico a un
grupo amina de una porción de GM-CSF se puede lograr
mediante una variedad de técnicas. En un enfoque, una porción de
GM-CSF se puede conjugar a un reactivo polimérico
funcionalizado con un derivado de succinimidilo (u otro grupo éster
activado, donde se pueden utilizar enfoques similares a los
descritos para un derivado de succinimidilo para otros reactivo
poliméricos que contienen un grupo éster activado). En este
enfoque, el reactivo polimérico que porta un grupo succinimidilo se
puede anclar a la porción de GM-CSF en medios
acuosos a un pH de 7,0 a 9,0, aunque diferentes condiciones de
reacción (p. ej., un pH más abajo tal como 6 a 7, o temperaturas
diferentes y/o menos de 15ºC) pueden dar como resultado el anclaje
de un polímero a una localización diferente en la porción de
GM-CSF.
Es típico de otro enfoque útil para conjugar una
porción de GM-CSF a un reactivo polimérico el uso de
una reacción de aminación reductiva para conjugar una amina
primaria de una porción de GM-CSF con un reactivo
polimérico funcionalizado con una cetona, aldehído o una de sus
formas hidratadas (p. ej., hidrato de cetona e hidrato de
aldehído). En este enfoque, la amina primaria de la porción de
GM-CSF reacciona con el grupo carbonilo del
aldehído o la cetona (o el grupo que contiene hidroxi
correspondiente de un aldehído o cetona hidratados), formando de
ese modo una base de Schiff. La base de Schiff, a su vez, se puede
convertir después reductivamente en un producto conjugado estable a
través del uso de un agente reductor tal como borohidruro de sodio.
Son posibles reacciones selectivas (p. ej., son posibles en el
extremo N), particularmente con un polímero funcionalizado con una
cetona o aldehído ramificado en el metilo alfa y/o en condiciones de
reacción específicas (p. ej., pH reducido).
Los productos conjugados ilustrativos que se
pueden preparar usando, por ejemplo, los reactivos poliméricos que
contienen un aldehído (o hidrato de aldehído) o una cetona o
(hidrato de cetona) comprende la siguiente estructura:
donde:
- cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 3 a 4000;
- X^{2} es una fracción espaciadora compuesta de uno o más átomos
- (b) es de 2 a 6;
- (c) es de 2 a 6;
- R^{2}, en cada aparición, es independientemente H o alquilo inferior; y
- GM-CSF es una porción de GM-CSF.
Los grupos carboxilo representan otro grupo
funcional que puede servir como punto de anclaje sobre la porción
de GM-CSF.
Como se ha comentado antes, el enlace específico
dependerá del tipo de grupo funcional utilizado. Si el polímero es
funcionalizado en el extremo o "activado" con un grupo
hidroxilo, el enlace resultante será un éster de ácido carboxílico
y X será O. Si la cadena principal del polímero es funcionalizada
con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será
S. Cuando se emplean ciertos polímeros multi-brazo,
ramificados o en tenedor, el radical C(O)X, y en
particular el radical
\hbox{X, puede ser relativamente más
complejo y puede incluir una estructura de enlace más
larga.}
Los reactivos poliméricos que contienen un
radical hidrazida también son útiles para su conjugación a un
carbonilo. En la medida que la porción de GM-CSF no
contiene un radical carbonilo, se puede introducir un radical
carbonilo reduciendo cualquier ácido carboxílico (p. ej., el ácido
carboxílico C-terminal) y/o proporcionando una
versión glicosilada (donde el azúcar añadido tiene un radical
carbonilo) de la porción de GM-CSF. Además,
cualquier reactivo polimérico que comprende un éster activado (p.
ej., un grupo succinimidilo) se puede convertir para que contenga
un radical hidrazida haciendo reaccionar el reactivo polimérico que
comprende el éster activado con hidrazina
(NH_{2}-NH_{2}) o carbazato de
terc-butilo
[NH_{2}NHCO_{2}C(CH_{3})_{3}]. En la tabla,
la variable (n) representa el número de unidades monoméricas
repetitivas y "=C-(GM-CSF)" representa una
porción de GM-CSF siguiente a la conjugación con el
reactivo polimérico. Opcionalmente, el enlace hidrazona se puede
reducir utilizando un agente reductor adecuado.
Los grupos tiol contenidos en la porción de
GM-CSF pueden servir como sitios de anclaje eficaces
para el polímero soluble en agua. Los grupos tiol de los residuos
de cisteína de la porción de GM-CSF se pueden hacer
reaccionar con un PEG activado que sea específico para la reacción
con grupos tiol, p. ej., un polímero con
N-maleimidilo u otro derivado, como se ha descrito,
por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.739.208, en
la Publicación de Patente Internacional Núm. WO 01/62827, y en la
Tabla 3 de más abajo.
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Con respecto al SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y
SEQ ID NO: 3, existen cuatro residuos de cisteína que contienen
tiol. Se cree que todos los residuos de cisteína en estas secuencias
están implicados en enlaces disulfuro. Como consecuencia, la
conjugación con un residuo de cisteína que participa en el enlace
disulfuro puede desorganizar la estructura terciaria de una porción
de GM-CSF y reducir potencialmente de manera
significativa su actividad total. De este modo, en la medida que
cualquier porción concreta de GM-CSF carezca de un
grupo tiol o se pueda evitar la rotura de los enlaces disulfuro, es
posible añadir un residuo de cisteína a la porción de
GM-CSF utilizando técnicas sintéticas
convencionales. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos
Núm. 6.608.183 y el procedimiento descrito la Publicación de
Patente Internacional Núm. WO 90/12874, donde tal procedimiento se
puede adaptar a una porción de GM-CSF. Además,
también se pueden utilizar procedimientos de ingeniería genética
convencionales utilizados para introducir un residuo de cisteína en
la porción de GM-CSF.
Con respecto a los productos conjugados formados
a partir de polímeros solubles en agua que portan uno o más grupos
funcionales maleimida (con independencia de si la maleimida
reacciona con un grupo amina o tiol en la porción de
GM-CSF), la forma o formas de ácido maleámico
correspondientes del polímero soluble en agua también pueden
reaccionar con la porción de GM-CSF. En ciertas
condiciones (p. ej., un pH de aproximadamente 7-9 y
en presencia de agua), el anillo de maleimida será "abierto"
para formar el ácido maleámico correspondiente. El ácido maleámico,
a su vez, puede reaccionar con un grupo amina o tiol de una porción
de GM-CSF. Las reacciones basadas en ácido
maleámico ilustrativas se muestran esquemáticamente más abajo. POLY
representa el polímero soluble en agua, y GM-CSF
representa la porción de GM-CSF.
Con respecto a los reactivos poliméricos, los
descritos aquí y en cualquier parte se pueden adquirir de fuentes
comerciales (p. ej., Nektar Therapeutics, Huntsville AL). Por
añadidura, los métodos para preparar los reactivos poliméricos se
describen en las publicaciones especializadas.
El anclaje entre la porción de
GM-CSF y el polímero soluble en agua puede ser
directo, donde los átomos no interpuestos están localizados entre
la porción de GM-CSF y el polímero, o indirecto,
donde uno o más átomos están localizados entre la porción de
GM-CSF y el polímero. Con respecto al anclaje
indirecto, una "fracción espaciadora" sirve como conexión
entre la porción de GM-CSF y el polímero soluble en
agua. Los uno o más átomos que constituyen la fracción espaciadora
pueden incluir uno o más de átomos de carbono, átomos de nitrógeno,
átomos de azufre, átomos de oxígeno, y sus combinaciones. La
fracción espaciadora puede comprender un grupo amida, amina
secundaria, carbamato, tioéter, y/o disulfuro. Los ejemplos de los
radicales espaciadores específicos (incluyendo "X", X^{1} y
X^{2}) incluyen los seleccionados del grupo que consiste en -O-,
-S-, -S-S-, -C(O)-,
-C(O)-NH-,
-NH-C(O)-NH-,
-O-C(O)-NH-, -C(S)-,
-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-, -CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-C(O)-NH-CH_{2}-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-,
-C(O)-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-,
-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-NH-C(O)-CH_{2}-,
-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-,
-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-,
-C(O)-NH-CH_{2}-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-C(O)-NH-CH_{2}-,
-O-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-[CH_{2}]_{h}-(OCH_{2}CH_{2})_{j}-, un grupo cicloalquilo divalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N(R^{6})-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde R^{6} es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis, y (j) es de cero a 20. Otros radicales espaciadores específicos tienen las siguientes estructuras: -C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, y -O-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, donde los valores de los subíndices que siguen a cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, p. ej., (CH_{2})_{1-6} significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de los radicales espaciadores anteriores puede incluir adicionalmente una cadena oligomérica de óxido de etileno que comprende de 1 a 20 unidades monoméricas de óxido de etileno [es decir, -(CH_{2}CH_{2}O)_{1-20}]. Esto es, la cadena oligomérica de óxido de etileno puede aparecer antes o después de la fracción espaciadora, y opcionalmente entre dos átomos cualesquiera de una fracción espaciadora compuesta de dos o más átomos. Asimismo, la cadena oligomérica podría no considerarse parte de la fracción espaciadora si el oligómero es adyacente a un segmento polimérico y simplemente representa una extensión del segmento polimérico. La fracción espaciadora no incluye azúcares o carbohidratos (esto es, una fracción espaciadora no incluye específicamente el azúcar de un residuo de glicosilato). El polímero soluble en agua se puede anclar a través de un residuo de glicosilato (p. ej., un azúcar o carbohidrato). En esos casos en los que se desea tal ordenamiento, la presente solicitud hará referencia a tal ordenamiento como "una porción de GM-CSF unida covalentemente a un polímero soluble en agua a través de un residuo glicosilato".
-O-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-[CH_{2}]_{h}-(OCH_{2}CH_{2})_{j}-, un grupo cicloalquilo divalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N(R^{6})-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde R^{6} es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis, y (j) es de cero a 20. Otros radicales espaciadores específicos tienen las siguientes estructuras: -C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, y -O-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, donde los valores de los subíndices que siguen a cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, p. ej., (CH_{2})_{1-6} significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de los radicales espaciadores anteriores puede incluir adicionalmente una cadena oligomérica de óxido de etileno que comprende de 1 a 20 unidades monoméricas de óxido de etileno [es decir, -(CH_{2}CH_{2}O)_{1-20}]. Esto es, la cadena oligomérica de óxido de etileno puede aparecer antes o después de la fracción espaciadora, y opcionalmente entre dos átomos cualesquiera de una fracción espaciadora compuesta de dos o más átomos. Asimismo, la cadena oligomérica podría no considerarse parte de la fracción espaciadora si el oligómero es adyacente a un segmento polimérico y simplemente representa una extensión del segmento polimérico. La fracción espaciadora no incluye azúcares o carbohidratos (esto es, una fracción espaciadora no incluye específicamente el azúcar de un residuo de glicosilato). El polímero soluble en agua se puede anclar a través de un residuo de glicosilato (p. ej., un azúcar o carbohidrato). En esos casos en los que se desea tal ordenamiento, la presente solicitud hará referencia a tal ordenamiento como "una porción de GM-CSF unida covalentemente a un polímero soluble en agua a través de un residuo glicosilato".
Los productos conjugados son típicamente parte
de una composición. Generalmente, la composición comprende una
pluralidad de productos conjugados, teniendo cada uno
preferiblemente aunque no necesariamente, uno, dos, tres o cuatro
polímeros solubles en agua separadamente unidos covalentemente
(directamente o a través de un radical espaciador) a una porción de
GM-CSF. Las composiciones, no obstante, pueden
comprender también otros productos conjugados que tienen cuatro,
cinco, seis, siete, ocho o más polímeros anclados a cualquier
porción dada de
GM-CSF.
GM-CSF.
En una o más realizaciones, se prefiere que la
composición que contiene el producto conjugado esté libre o
sustancialmente libre de albúmina. También se prefiere que la
composición esté libre o sustancialmente libre de proteínas que no
tienen actividad GM-CSF.
Si se desea, se pueden aislar productos
conjugados que tienen diferentes pesos moleculares utilizando
cromatografía de filtración en gel y/o cromatografía de intercambio
iónico. Es decir, la cromatografía de filtración en gel se utiliza
para fraccionar de otra manera proporciones de
polímero-a-porción de
(GM-CSF) numeradas [p. ej., monómero, dímero,
trímero, etcétera, donde "monómero" indica 1 polímero anclado a
una porción de GM-CSF (o monoPEGilado cuando el
polímero es PEG), "dímero" indica dos polímeros anclados a una
porción de GM-CSF (o diPEGilado cuando el polímero
es PEG), etcétera] sobre la base de sus diferentes pesos moleculares
(donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular
medio de la porción polimérica soluble en agua). Por ejemplo, en
una reacción ilustrativa en la que una proteína de 20.000 Daltons se
conjuga al azar con un reactivo PEG que tiene un peso molecular de
aproximadamente 20.000 Daltons, la mezcla de reacción resultante
puede contener la proteína no modificada que tiene un peso molecular
de aproximadamente 20.000 Daltons, la proteína monoPEGilada (o
"monómero") que tiene un peso molecular de aproximadamente
40.000 Daltons, la proteína diPEGilada (o "dímero") que tiene
un peso molecular de aproximadamente 60.000 Daltons.
Si bien este enfoque se puede utilizar para
separar productos conjugados de PEG que tienen diferente pesos
moleculares, este enfoque es generalmente ineficaz para separar
isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de anclaje al
polímero en la porción de GM-CSF. Por ejemplo, la
cromatografía de filtración en gel se puede utilizar para separar
entre sí otras mezclas de monómeros, dímeros, trímeros, etcétera,
aunque cada una de las composiciones de PEG-mero
recuperadas puede contener PEG anclados a diferentes grupos amino
reactivos (p. ej., residuos de lisina) dentro de una porción de
GM-CSF.
Las columnas de filtración en gel adecuadas para
llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex® y
Sephadex® asequibles de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). La
selección de una columna concreta dependerá del intervalo de
fraccionamiento deseado. La elución se lleva a cabo generalmente
utilizando un tampón adecuado, tal como fosfato, acetato, o
similares. Las fracciones recogidas se pueden analizar mediante
algunos métodos diferentes, por ejemplo, (i) absorbancia a 280 nm
para el contenido de proteína, (ii) análisis de proteína basado en
colorantes utilizando albúmina de suero bovino como patrón, (iii)
ensayo con yodo para el contenido de PEG (Sims et al. (1980)
Anal. Biochem, 107:60-63), (iv) electroforesis en
gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS PAGE), seguido
de tinción con yoduro de bario, y cromatografía líquida de alta
resolución.
La separación de los isómeros posicionales se
puede llevar a cabo mediante cromatografía de fase inversa
utilizando métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento de
fase inversa (RP-HPLC) utilizando, por ejemplo, una
columna C18 o una columna C3 (Amersham Biosciences o Vydac) o
mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna
de intercambio iónico, p. ej., una columna de intercambio iónico
Sepharose® asequible de Amersham Biosciences. Se puede utilizar
cualquier enfoque para separar los isómeros de
polímero-agente activo que tiene en mismo peso
molecular (isómeros posicionales).
Las composiciones están preferiblemente
sustancialmente libres de proteínas que no tienen actividad
GM-CSF. Además, las composiciones preferiblemente
están sustancialmente libres de todos los demás polímeros solubles
en agua no unidos covalentemente. En algunas circunstancias, no
obstante, la composición puede contener una mezcla de productos
conjugados de polímero soluble en agua-porción de
(GM-CSF) y GM-CSF no conjugado.
Opcionalmente, la composición de la invención
comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Si se desea, el excipiente farmacéuticamente aceptable se puede
añadir a un producto conjugado para formar una composición.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables
ilustrativos incluyen, los seleccionados del grupo que consiste en
carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos,
antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases, y sus
combinaciones.
Un carbohidrato tal como un azúcar, un azúcar
derivatizado tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar
esterificado, y/o un polímero de azúcar puede estar presente como
excipiente. Los excipientes carbohidratados específicos incluyen,
por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa,
glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares;
disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y
similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa,
maltodextrinas, dextranos, almidonas, y alditoles, tales como
manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol),
piranosil- sorbitol, mioinositol.
El excipiente puede incluir también una sal
inorgánica o tampón tal como ácido cítrico, cloruro de sodio,
cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato de
sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, y sus
combinaciones.
La composición puede incluir también un agente
antimicrobiano para prevenir o reprimir el crecimiento microbiano.
Los ejemplos de los agentes antimicrobianos adecuados para la
presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de
benzetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio,
clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico,
timerosal, y sus combinaciones.
También puede estar presente en la composición
un antioxidante. Los antioxidantes se utilizan para evitar la
oxidación, previniendo de ese modo el deterioro del producto
conjugado o de otros componentes de la preparación. Los
antioxidantes adecuados para su uso en la presente invención
incluyen, por ejemplo, ascorbilo palmitato, hidroxianisol butilado,
hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol,
galato de propilo, bisulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato de
sodio, metabisulfito de sodio, y sus combinaciones.
Como excipiente puede estar presente un
tensioactivo. Los tensioactivos ilustrativos incluyen: polisorbatos,
tales como "Tween 20" y "Tween 80," y pluronics tales
como F68 y F88 (ambos los cuales son asequibles de BASF, Mount
Olive, New Jersey); ésteres de sorbitan; lípidos, tales como
fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas,
fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma
liposómica), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides, tales como
colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, cinc y otros de
tales cationes adecuados.
Los ácidos o bases pueden estar presentes como
excipientes en la composición. Los ejemplos no limitantes de los
ácidos que se pueden utilizar incluyen los ácidos seleccionados del
grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido
fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido
fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico,
ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, y sus
combinaciones. Los ejemplos de las bases adecuadas incluyen, bases
seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido de sodio, acetato
de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de
amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio,
citrato de sodio, formiato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de
potasio, fumarato de potasio, y sus combinaciones.
La cantidad del producto conjugado (es decir, el
producto conjugado formado entre el agente activo y el reactivo
polimérico) en la composición variará dependiendo de numerosos
factores, pero será óptimamente una cantidad terapéuticamente
eficaz cuando la composición se almacene en un contenedor de
dosificación unitaria (p. ej., un vial). Además, la preparación
farmacéutica se puede alojar en una jeringa. Una cantidad
terapéuticamente eficaz se puede determinar experimentalmente
mediante la administración repetida de cantidades crecientes del
producto conjugado con el fin de determinar qué cantidad produce un
criterio de valoración clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual
en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente
y las necesidades concretas de la composición. Típicamente, la
cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina a
través de experimentación rutinaria, es decir, preparando
composiciones que contienen cantidades variables del excipiente
(oscilando de bajas a altas), examinando la estabilidad y otros
parámetros, y determinando después el intervalo al que se logra el
funcionamiento óptimo sin efectos adversos significativos.
Generalmente, no obstante, el excipiente estará
presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1% a
aproximadamente 99% en peso, preferiblemente de aproximadamente 5% a
aproximadamente 98% en peso, más preferiblemente de aproximadamente
15 a aproximadamente 95% en peso del excipiente, prefiriéndose
concentraciones menores de 30% en peso.
Estos excipientes farmacéuticamente aceptables
anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington:
The Science & Practice of Pharmacy", 19^{a} ed., Williams
& Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference",
52^{a} ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.H.,
Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^{a} Edición, American
Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
También se proporciona un método para elaborar
un producto conjugado, comprendiendo el método poner en contacto,
en condiciones de conjugación, una porción de GM-CSF
con un reactivo polimérico. Según se proporciona en la presente
memoria, el método no implica necesariamente llevar a cabo etapas de
protección y desprotección. La sección experimental de más abajo
proporciona enfoques ilustrativos para elaborar productos
conjugados. Una vez que se prepara un producto conjugado, se puede
añadir un excipiente farmacéuticamente aceptable al producto
conjugado para proporcionar una composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas abarcan todos
los tipos de formulaciones y en particular aquellas que son
adecuadas para su inyección, p. ej., polvos o productos liofilizados
que se pueden reconstituir también en forma de líquido. Los
ejemplos de los diluyentes adecuados para reconstituir composiciones
sólidas antes de su inyección incluyen agua bacteriostática para
inyectables, dextrosa al 5% en agua, solución salina tamponada con
fosfato, solución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua
desionizada, y sus combinaciones. Con respecto a las composiciones
farmacéuticas líquidas, se consideran las soluciones y las
suspensiones.
Los tipos de formulación adecuados para su
administración parenteral incluyen soluciones listas para su
inyección, polvos secos para su combinación con un disolvente antes
de su uso, suspensiones listas para su inyección, composiciones
insolubles secas para su combinación con un vehículo antes de su
uso, y emulsiones y productos concentrados líquidos para su
dilución antes de su administración, entre otros.
Además, el producto conjugado se puede
administrar a un paciente que experimente trasplante de médula ósea
(tal como un paciente que sufre de leucemia mielógena aguda), donde
la administración se produce antes de, simultáneamente, o después
del trasplante de médula ósea (autólogo o alogénico). Además, el
producto conjugado se puede utilizar en el tratamiento de cánceres
a través de la potenciación de la actividad citotóxica de monocitos
y linfocitos periféricos, mucositis, estomatitis, diarrea, curación
de heridas, proteinosis alveolar pulmonar, e hipercolesterolemia.
Finalmente, los productos conjugados se pueden utilizar también en
forma de un coadyuvante para vacuna.
La dosis real que se va a administrar variará
dependiendo de la edad, el peso, y el estado general del sujeto así
como de la gravedad de la afección que esté siendo tratada, el
criterio del profesional de la salud, y el producto conjugado que
esté siendo administrado. Las cantidades terapéuticamente eficaces
son conocidas por los expertos en la técnica y/o se describen en
los textos y publicaciones de referencia pertinentes. Generalmente,
sobre una base en peso, una cantidad terapéuticamente efectiva
oscilará de aproximadamente 0,001 mg a 100 mg, preferiblemente en
dosis de 0,01 mg/día a 75 mg/día, y más preferiblemente en dosis de
0,10 mg/día a 50 mg/día. Sobre la base de la actividad, un experto
normal en la técnica puede calcular las dosis correspondientes
basadas en unidades internacionales de actividad.
La dosificación unitaria de cualquier producto
conjugado dado (de nuevo, proporcionado preferiblemente como parte
de una composición farmacéutica) se puede administrar en una
variedad de programas de dosificación dependiendo del criterio del
médico clínico, las necesidades del paciente, etcétera. El programa
de dosificación específico será conocido por los expertos normales
en la técnica o se puede determinar experimentalmente utilizando
métodos rutinarios. Los programas de dosificación ilustrativos
incluyen, sin limitación, la administración cinco veces al día,
cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al
día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la
semana, dos veces al mes, una vez al mes, y cualquiera de sus
combinaciones. Una vez que se han alcanzado los criterios de
valoración clínicos, se interrumpe la dosificación de la
composición.
En la práctica de la invención se emplearán, a
no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
síntesis orgánica, que se encuentran dentro del conocimiento
práctico de la técnica. Tales técnicas están explicadas
completamente en las publicaciones especializadas. Los reactivos y
los materiales son asequibles comercialmente a no ser que se
establezca específicamente lo contrario. Véase, por ejemplo, J.
March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and
Structure, 4^{a} Ed. (New York:
Wiley-Interscience, 1992), supra.
En los siguientes ejemplos, se han realizado
esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números
utilizados (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.) pero se deben
tener en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A no
ser que se indique lo contrario, la temperatura es en grados C y la
presión es o casi la presión atmosférica a nivel del mar.
Aunque se hará referencia a otras abreviaturas
conocidas por un experto normal en la técnica, se utilizarán otros
reactivos y materiales, y se utilizarán otros métodos conocidos por
un experto normal en la técnica, se proporcionan por conveniencia
la siguiente lista y la descripción de los métodos.
\newpage
\global\parskip0.980000\baselineskip
- NaCNBH_{3}
- cianoborohidruro de sodio
- HCl
- ácido clorhídrico
- HEPES
- ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico
- K o kDa
- kiloDaltons
- SEC
- Cromatografía de exclusión por tamaños
- HPLC
- Cromatografía líquida de alta resolución
- SDS-PAGE
- electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio.
Se analizaron las muestras indicadas mediante
electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE) utilizando un sistema
Bio-Rad (Mini-PROTEAN ID Precast Gel
Electrophoresis System). Las muestras se mezclaron con tampón de
muestra. A continuación, las muestras preparadas se cargaron en un
gel y se hicieron circular durante aproximadamente treinta
minutos.
El análisis de cromatografía de exclusión por
tamaños (SEC-HPLC) se realizó en un sistema HPLC
Agilent 1100 (Agilent). Las muestras se analizaron utilizando una
columna Shodex de proteína KW-804 (300 x 8 mm,
Phenomenex), a pH 7,4. La velocidad de flujo para la columna fue de
0,5 mL/minuto. La proteína eluida y los productos conjugados de
PEG-proteína se detectaron utilizando UV a 280
nm.
Se utilizó una columna de intercambio aniónico
HiTrap Q Sepharose HP (Amersham Biosciences) con el sistema
AKTAprime (Amersham Biosciences) para purificar los productos
conjugados de GM-CSF PEGilados preparados en el
Ejemplo 1 al 6. Para cada solución de producto conjugado preparada,
la solución de producto conjugado se cargó en una columna que fue
pre-equilibrada en tampón Tris 20 mM, pH 7,5 (tampón
A) y después se lavó con diez volúmenes de la columna de tampón A
para eliminar cualquier reactivo PEG que no hubiera reaccionado.
Con posterioridad, se aumentó un gradiente de tampón A con tampón B
de 0-100% (tampón Tris 20 mM con NaCl 0,5 M, pH
7,5). El eluyente se controló con un detector UV a 280 nm.
Cualquiera de los meros superiores (p. ej., trímeros, tetrámeros,
etcétera) eluyó en primer lugar, seguido a continuación de los
dímeros, y después los monómeros, y finalmente el
GM-CSF no conjugado. Las fracciones se reunieron de
acuerdo con el cromatograma, y la pureza del producto conjugado
individual se determinó mediante SEC-HPLC o
SDS-PAGE.
El GM-CSF humano
(hGM-CSF) recombinante correspondiente a la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 se utilizó en los
Ejemplos 1-6 y se obtuvo de una fuente comercial. Se
preparó una solución de partida de hGM-CSF
asegurándose de que el GM-CSF humano recombinante
existiera en un tampón sin aminas, utilizando (si fuera necesario)
una técnica de intercambio de tampón conocida por los expertos
normales en la técnica.
Ejemplo
1
Se calentó mPEG2-NHS, 40 kDa,
almacenado a -20ºC en argón, a temperatura ambiente. Se disolvió un
exceso de cinco veces (con respecto a la cantidad de
hGM-CSF en una alícuota medida de la solución de
hGM-CSF de partida) del mPEG2-NHS
calentado en HCl 2 mM para formar una solución de reactivo al 10%.
La solución de reactivo al 10% se añadió rápidamente a la alícuota
de la solución de hGM-CSF de partida (1 mg/mL en
tampón de fosfato de sodio, pH 7,0) y se mezcló bien. Después de la
adición del reactivo de PEG, el pH de la mezcla de reacción se
determinó y se ajustó a 7,0 utilizando técnicas convencionales. Para
permitir el acoplamiento del mPEG2-NHS a
hGM-CSF a través de un enlace amida, la solución de
reacción se colocó en un Slow Speed Lab Rotator durante la noche
para facilitar la conjugación a temperatura ambiente. La reacción se
sofocó con tampón Tris. La solución de producto conjugado fue
caracterizada según se estipula más abajo.
La Figura 1 muestra el cromatograma que sigue al
análisis SEC-HPLC de la solución de producto
conjugado. La reacción de PEGilación produjo especies con 57% de
monómero (producto mono-conjugado o un PEG anclado a
hGM-CSF) y 13% de dímero (producto
di-conjugado o dos PEG anclados a
hGM-CSF).
Se utilizó cromatografía de intercambio aniónico
para purificar los productos conjugados. La Figura 2 muestra el
cromatograma que sigue a la purificación de intercambio aniónico.
Las fracciones de producto conjugado se recogieron y analizaron
mediante SDS-PAGE (Figura 3). Los productos
conjugados purificados fueron hasta 100% puros.
Utilizando este mismo enfoque, se pueden
preparar otros productos conjugados utilizando
mPEG2-NHS que tienen otros pesos moleculares medios
ponderales.
Ejemplo de Referencia
2
Se calentó mPEG-SMB, 30 kDa,
almacenado a -20ºC en argón, a temperatura ambiente. Se disolvió un
exceso de diez veces (con respecto a la cantidad de
hGM-CSF en una alícuota medida de la solución de
hGM-CSF de partida) del mPEG-SMB
calentado en 2 mM HCl para formar una solución de reactivo al 10%.
La solución de reactivo al 10% se añadió rápidamente a la alícuota
de la solución de hGM-CSF de partida (1 mg/mL en
tampón de fosfato de sodio, pH 7,0) y se mezcló bien. Después de la
adición del mPEG-SMB, el pH de la mezcla de reacción
se determinó y se ajustó a 7,0 utilizando técnicas convencionales.
Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB a
hGM-CSF vía un enlace amida, la solución de reacción
se colocó en un Slow Speed Lab Rotator durante la noche para
facilitar la conjugación a temperatura ambiente. La reacción se
sofocó con tampón Tris. La solución de producto conjugado fue
caracterizada según se estipula más abajo.
La Figura 4 muestra el cromatograma
SEC-HPLC de la solución de producto conjugado. El
análisis SEC-HPLC revela que la reacción de
PEGilación produjo especies con 58% de monómero (producto
mono-conjugado o un PEG anclado a
hGM-CSF) y 14% de dímero (producto
di-conjugado o dos PEG anclados a
hGM-CSF). También se utilizó un método de
cromatografía de intercambio aniónico utilizando Q Sepharose High
Performance y tampón Tris para purificar los productos conjugados.
El perfil de separación de las especies de producto conjugado fue
similar al mostrado en la Figura 2.
Utilizando este mismo enfoque, se pueden
preparar otros productos conjugados utilizando
mPEG-SMB que tienen otros pesos moleculares medios
ponderales.
Ejemplo de Referencia
3
Se obtiene mPEG-Piperidona
(mPEG-PIP) que tiene un peso molecular de 20.000
Daltons de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL). La estructura
básica del reactivo polimérico se proporciona más abajo:
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
El mPEG-PIP, 20 kDa, almacenado
a -20ºC en argón, se calentó a temperatura ambiente. Se disolvió un
exceso de cincuenta a cien veces (con respecto a la cantidad de
hGM-CSF en una alícuota medida del
hGM-CSF de partida) del mPEG-PIP
calentado en fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0) para formar una
solución de reactivo al 10%. La solución de reactivo al 10% se
añadió rápidamente a la alícuota de la solución de
hGM-CSF de partida (1 mg/mL en tampón de fosfato de
sodio, pH 7,0) y se mezcló bien. Después de la adición del
mPEG-PIP, el pH de la mezcla de reacción se
determinó y se ajustó a 7,0 utilizando técnicas convencionales,
mezclando a continuación durante treinta minutos. Después se añadió
un agente reductor, cianoborohidruro de sodio, para elaborar
NaCNBH_{3} 13 mM. La solución de reacción se colocó en un Slow
Speed Lab Rotator durante la noche para facilitar la conjugación a
temperatura ambiente. La reacción se sofocó con tampón Tris. La
solución de producto conjugado fue caracterizada según se estipula
más abajo.
La reacción de PEGilación produjo más de 30% de
monómero (producto mono-conjugado o un PEG anclado a
hGM-CSF). Debido a la alta selectividad de la
estructura anular del PEG, se produjo poco dímero.
También se utilizó un método de cromatografía de
intercambio aniónico para purificar los productos conjugados. La
Figura 5 representa el perfil de purificación de intercambio
aniónico.
Ejemplo de Referencia
4
El mPEG-ButirALD, 20 kDa,
almacenado a -20ºC en argón, se calentó a temperatura ambiente. Se
disolvió un exceso de treinta veces (con respecto a la cantidad de
hGM-CSF en una alícuota medida del
hGM-CSF de partida) del
mPEG-ButirALD calentado en H_{2}O
Milli-Q para formar una solución de reactivo al 10%.
La solución de reactivo al 10% se añadió rápidamente a la alícuota
de la solución de hGM-CSF de partida (1 mg/mL en
tampón de fosfato de sodio, pH 7,0) y se mezcló bien. Después de la
adición de the mPEG-ButirALD, el pH de la mezcla de
reacción se determinó y se ajustó a 6,0 utilizando técnicas
convencionales, mezclando a continuación durante treinta minutos.
Después se añadió un agente reductor, cianoborohidruro de sodio para
elaborar NaCNBH_{3} 9 mM. La solución de reacción se colocó en un
Slow Speed Lab Rotator durante la noche para facilitar la
conjugación a temperatura ambiente. La reacción se sofocó con
tampón Tris. La
\hbox{solución de producto conjugado fue
caracterizada según se estipula más abajo.}
El grupo aldehído de
mPEG-ButirALD puede reaccionar con las aminas
primarias asociadas con hGM-CSF y unirse
covalentemente a ellas a través de una amina secundaria después de
la reducción con un reactivo reductor tal como cianoborohidruro de
sodio. Puesto que la reacción de PEGilación se llevó a cabo a pH
6,0, el anclaje del derivado de PEG a hGM-CSF fue
más selectivo hacia el extremo N. La Figura 6 muestra el
cromatograma SEC-HPLC de la solución de producto
conjugado. La reacción de PEGilación produjo especies con 75% de
monómero (un PEG anclado a hGM-CSF o monoPEGilado)
y 4% de dímero (producto di-conjugado o dos PEG
anclados a hGM-CSF). También se utilizó un método
de cromatografía de intercambio aniónico utilizando Q Sepharose High
Performance y también se utilizó tampón Tris para purificar los
productos conjugados. El perfil de separación de las especies de
producto conjugado fue similar al mostrado en la Figura 5.
Utilizando este mismo enfoque, se pueden
preparar otros productos conjugados utilizando
mPEG-ButirALD que tienen otros pesos moleculares
medios ponderales.
Ejemplo de Referencia
5
El mPEG-ButirALD, 30 kDa,
almacenado a -20ºC en argón, se calentó a temperatura ambiente. Se
disolvió un exceso de treinta veces (con respecto a la cantidad de
hGM-CSF en una alícuota medida del
hGM-CSF de partida) del
mPEG-ButirALD de partida en H_{2}O
Milli-Q para formar una solución de reactivo al 10%.
La solución de reactivo al 10% se añadió rápidamente a la alícuota
de la solución de hGM-CSF de partida (1 mg/mL en
tampón de fosfato de sodio, pH 7,0) y se mezcló bien. Después de la
adición del mPEG-ButirALD, el pH de la mezcla de
reacción se determinó y se ajustó a 6,0 utilizando técnicas
convencionales, mezclando a continuación durante treinta minutos.
Después se añadió un agente reductor, cianoborohidruro de sodio para
elaborar NaCNBH_{3} 9 mM_{.} La solución de reacción se colocó
en un Slow Speed Lab Rotator durante la noche para facilitar la
conjugación a temperatura ambiente. La reacción se sofocó con
tampón Tris. La solución de producto conjugado fue caracterizada
según se estipula más abajo.
El grupo aldehído de
mPEG-ButirALD puede reaccionar con las amina
primarias asociadas con hGM-CSF y unirse
covalentamente a ellas a través de una amina secundaria después de
la reducción con un reactivo reductor tal como cianoborohidruro de
sodio. Puesto que la reacción de PEGilación se llevó a cabo a pH
6,0, el anclaje del derivado de PEG a hGM-CSF fue
más selectivo hacia el extremo N. La Figura 7 muestra el
cromatograma SEC-HPLC de la solución de producto
conjugado. La reacción de PEGilación produjo especies con 63% de
monómero (un PEG anclado a hGM-CSF o monoPEGilado)
y 20% de dímero (producto di-conjugado o dos PEG
anclados a hGM-CSF). También se utilizó un método
de cromatografía de intercambio aniónico utilizando Q Sepharose High
Performance y tampón Tris para purificar los productos conjugados.
El perfil de separación de las especies de producto conjugado fue
similar al mostrado en la Figura 2.
Utilizando este mismo enfoque, se pueden
preparar otros productos conjugados utilizando
mPEG-ButirALD que tienen otros pesos moleculares
medios ponderales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El mPEG2-ButirALD, 40 kDa,
almacenado a -20ºC en argón, se calentó a temperatura ambiente. Se
disolvió un exceso de treinta veces (con respecto a la cantidad de
hGM-CSF en una alícuota medida del
hGM-CSF de partida) del
mPEG2-ButirALD calentado en H_{2}O
Milli-Q para formar una solución de reactivo al 10%.
La solución de reactivo al 10% se añadió rápidamente a la alícuota
de la solución de hGM-CSF de partida (1 mg/mL en
tampón de fosfato de sodio, pH 7,0) y se mezcló bien. Después de la
adición de the mPEG2-ButirALD, el pH de la mezcla de
reacción se determinó y se ajustó a 6,0 utilizando técnicas
convencionales, mezclando a continuación durante treinta minutos.
Después se añadió un agente reductor, cianoborohidruro de sodio para
elaborar NaCNBH_{3} 9 mM. La solución de reacción se colocó en un
Slow Speed Lab Rotator durante la noche para facilitar la
conjugación a temperatura ambiente. La reacción se sofocó con
tampón Tris. La solución de producto conjugado fue caracterizada
según se estipula más abajo.
El grupo aldehído de
mPEG2-ButirALD puede reaccionar con las amina
primarias asociadas con hGM-CSF y unirse
covalentamente a ellas a través de una amina secundaria después de
la reducción con un reactivo reductor tal como cianoborohidruro de
sodio. Puesto que la reacción de PEGilación se llevó a cabo a pH
6,0, el anclaje del derivado de PEG a hGM-CSF fue
más selectivo hacia el extremo N. La Figura 8 muestra el
cromatograma SEC-HPLC de la solución de producto
conjugado. La reacción de PEGilación produjo especies con 65% de
monómero (un PEG anclado a hGM-CSF o monoPEGilado)
y 10% de dímero (producto di-conjugado o dos PEG
anclado a hGM-CSF). También se utilizó un método de
cromatografía de intercambio aniónico utilizando Q Sepharose High
Performance y tampón Tris para purificar los productos conjugados.
El perfil de separación de las especies de producto conjugado fue
similar al mostrado en la Figura 2.
Utilizando este mismo enfoque, se pueden
preparar otros productos conjugados utilizando
mPEG2-ButirALD que tienen otros pesos moleculares
medios ponderales.
\newpage
Ejemplo de Referencia
7
El mPEG-Butanoato de
succinimidilo que tiene un peso molecular de 20.000 Daltons se
obtiene de Nektar Therapeutics, (Huntsville, AL). La estructura
básica del reactivo polimérico se proporciona más abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El GM-CSF se disuelve en agua
desionizada, a la que se añade trietilamina para aumentar el pH a
7,2-9. A esta solución se le añade después un
exceso molar de 1,5 a 10 veces de mPEG-SBA. La
mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias
horas.
La mezcla de reacción se analiza mediante
SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación de
la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
8
Al GM-CSF se le insertan uno o
más residuos de cisteína de acuerdo con el procedimiento descrito en
el documento WO 90/12874.
El mPEG-MAL, 20 K, almacenado a
-20ºC en argón, se calienta a temperatura ambiente. Se disuelve en
agua desionizada un exceso de cinco a veinte veces del
mPEG-MAL, 20K, calentado para elaborar una solución
de mPEG MAL al 10%. La solución de mPEG MAL se añade rápidamente a
una alícuota de solución de GM-CSF de partida (1
mg/mL en HEPES 50 mM, pH 7,0) y se mezcla bien. Después de una hora
de reacción a temperatura ambiente, el vial de reacción se
transfiere a la sala fría y se deja que prosiga la reacción durante
la noche a 4ºC en un Rotomix (baja velocidad, Thermoline).
La mezcla de producto conjugado se purifica
utilizando cromatografía de filtración en gel. Se desarrolla un
método de cromatografía de exclusión por tamaños para analizar las
mezclas de reacción, y los productos finales. También se utiliza
análisis SDS-PAGE para la caracterización de las
muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
9
Al GM-CSF se le insertan uno o
más residuos de cisteína de acuerdo con el procedimiento descrito en
el documento WO 90/12874.
El mPEG-MAL, 30 K, almacenado a
-20ºC en argón, se calienta a temperatura ambiente. Se disuelve un
exceso de de cinco a veinte veces del mPEG-MAL, 30
K, calentado en agua desionizada para elaborar una solución de
mPEG-MAL al 10%. La solución de
mPEG-MAL se añade rápidamente a una alícuota de
solución de GM-CSF de partida (1 mg/mL en HEPES 50
mM, pH 7,0) y se mezcla bien. Al cabo de una hora de reacción a
temperatura ambiente, el vial de reacción se transfiere a la sala
fría y se deja que prosiga la reacción durante la noche a 4ºC en un
Rotomix (baja velocidad, Thermoline).
La mezcla de producto conjugado se purifica
utilizando cromatografía de filtración en gel. Se desarrolla un
método de cromatografía de exclusión por tamaños para analizar las
mezclas de reacción, y los productos finales. También se utiliza
análisis SDS-PAGE para la caracterización de las
muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se determinan las actividades in vitro de
los productos conjugados descritos en los Ejemplos
1-6. Todos los productos conjugados sometidos a
ensayo son bioactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
11-19
Se repite cada uno de los Ejemplos
1-9 excepto que la porción de GM-CSF
del SEQ ID NO: 2 se remplaza por el GM-CSF del SEQ
ID NO: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se determinan las actividades
in-vitro de los productos conjugados
descritos en los Ejemplos 11-19. Todos los
productos conjugados sometidos a ensayo son bioactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Una composición farmacéutica que
comprende:
- (i)
- un producto conjugado que comprende un GM-CSF humano unido covalentemente, directamente o a través de un radical espaciador compuesto de uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, que tiene la siguiente estructura:
- \quad
- donde cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 3 a 4.000, y que tiene un peso molecular medio ponderal de más de 5.000 Daltons; y
- (ii)
- un excipiente farmacéuticamente aceptable,
donde al menos aproximadamente 85% de los
productos conjugados en la composición tienen de uno a dos polímeros
anclado al GM-CSF humano.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La composición de la reivindicación 1, donde
el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio ponderal
total en el intervalo de más de 5.000 Daltons a aproximadamente
150.000 Daltons.
3. La composición de la reivindicación 2, donde
el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio ponderal
total en el intervalo de aproximadamente 6.000 Daltons a
aproximadamente 100.000 Daltons.
4. La composición de la reivindicación 3, donde
el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio ponderal
total en el intervalo de aproximadamente 15.000 Daltons a
aproximadamente 85.000 Daltons.
5. La composición de la reivindicación 4, donde
el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio ponderal
total en el intervalo de aproximadamente 20.000 Daltons a
aproximadamente 85.000 Daltons.
6. La composición de la reivindicación 5, donde
el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio ponderal
total en el intervalo de aproximadamente 20.000 Daltons a
aproximadamente 60.000 Daltons.
7. La composición de la reivindicación 1, con la
condición de que el polímero soluble en agua ramificado carece de
un residuo de lisina utilizado para efectuar la ramificación.
8. La composición de la reivindicación 1, donde
el GM-CSF humano comprende una secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
9. La composición de la reivindicación 6, donde
el GM-CSF humano comprende una secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 2.
10. La composición de la reivindicación 6, donde
el GM-CSF humano es obtenido recombinantemente.
11. La composición de la reivindicación 9, donde
el GM-CSF humano no está glicosilado.
12. La composición de la reivindicación 9, donde
el GM-CSF humano está glicosilado.
13. La composición de la reivindicación 1, donde
la composición está sustancialmente libre de albúmina.
14. La composición de la reivindicación 1, donde
la composición está sustancialmente libre de proteínas que no
tienen actividad GM-CSF.
15. La composición de la reivindicación 1, donde
la composición está sustancialmente libre de polímeros solubles en
agua unidos no covalentemente.
16. La composición de la reivindicación 1, en
forma liofilizada.
17. La composición de la reivindicación 1, en
forma líquida.
18. La composición de la reivindicación 1, donde
al menos aproximadamente 90% de los productos conjugados en la
composición tienen de uno a dos polímeros anclados al
GM-CSF humano.
19. La composición de la reivindicación 18,
donde al menos aproximadamente 95% de los productos conjugados en
la composición tienen de uno a dos polímeros anclados al
GM-CSF humano.
20. La composición farmacéutica de
reivindicación 1, para su uso en terapia.
21. La composición de la reivindicación 20, en
una forma adecuada para su inyección subcutánea.
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