ES2355839T3

ES2355839T3 - Procedimiento de preparación de partículas de polímero revestidas que contienen cristales superparamagnéticos.

Info

Publication number: ES2355839T3
Application number: ES06700598T
Authority: ES
Inventors: Geir Fonnum; Lars Kilaas; Arvid Trygve Berge; Tom-Nils Nilsen; Ruth Schmid
Original assignee: Invitrogen Dynal AS
Current assignee: Life Technologies AS
Priority date: 2005-01-17
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2011-03-31
Anticipated expiration: 2026-01-17
Also published as: CN101107525B; ATE488768T1; CN101107525A; EP1839060A1; DE602006018256D1; WO2006075185A8; JP5088822B2; WO2006075185A1; JP2008527132A; EP1839060B1; GB0500888D0

Abstract

Un procedimiento para la preparación de partículas de polímero revestidas que contienen cristales superparamagnéticos, procedimiento que comprende hacer reaccionar partículas de polímero con la superficie funcionalizada, de un diámetro inferior a 0,5 m, que contienen cristales superparamagnéticos, con al menos un poliisocianato y al menos un diol, diol que se selecciona entre el grupo que consiste en polietilenglicoles y dioles de fórmula HO((CH2)mO)nH (siendo n un número entero de 1 a 15 y m un número entero de 2 a 6).

Description

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de partículas de polímero magnéticas revestidas.

Las partículas de polímero magnéticas son de utilidad general en diversos campos médicos y biológicos, por ejemplo, como vehículos de transporte para el suministro de productos farmacéuticos, para fines diagnósticos, para 5 fines de separación y de síntesis. Tales partículas se basan en sus propiedades magnéticas para realizar estas funciones. En aplicaciones de ensayos diagnósticos, por ejemplo, la aplicación de un campo magnético a una muestra que contiene un analito unido a partículas de polímero magnéticas, permite el aislamiento del analito sin usar la centrifugación o la filtración y, en aplicaciones terapéuticas, la aplicación de un campo magnético al paciente puede servir para seleccionar la diana para las partículas de polímero magnéticas con el fin de dirigirlas al sitio corporal 10 deseado.

Por magnético se entiende aquí que las partículas de polímero contienen cristales superparamagnéticos. Así, las partículas de polímero magnéticas son magnéticamente desplazables pero no son permanentemente magnetizables. Se conocen muchos procedimientos para preparar partículas de polímero magnéticas, de los que un gran número implica preparar partículas de polímero que contienen maghemita o magnetita a partir de óxidos de hierro magnéticos 15 preformados, por ejemplo, magnetita. En el documento US-A-4.654.267 (Ugelstad), cuyo contenido se incorpora aquí por referencia, se describen algunos de los procedimientos implicados.

Con el desarrollo de dispositivos que pueden medir cargas muy pequeñas de magnetismo así como el crecimiento de la nanotecnología se ha previsto que los usuarios de partículas magnéticas desearán partículas más pequeñas con las que realizar en el futuro ensayos, etc. Además, las partículas magnéticas necesitarán ser 20 manipuladas para tener grupos reactivos que puedan acoplarse fácilmente con marcadores para que resulte una fase sólida ideal para procedimientos bioquímicos.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que se pueden producir partículas magnéticas con características superficiales particularmente útiles haciendo reaccionar partículas de polímero magnéticas funcionalizadas en la superficie con una combinación de monómeros poliisocianato/diol para producir una partícula de 25 polímero magnética “revestida”. Tales partículas se acoplan fácilmente además con marcadores resultando un soporte de fase sólida útil en una variedad de campos.

Visto un primer aspecto de la invención, la invención proporciona por tanto un procedimiento para la preparación de partículas de polímero revestidas que contienen cristales superparamagnéticos, procedimiento que comprende hacer reaccionar partículas de polímero de un diámetro inferior a 0,5 m que contienen cristales 30 superparamagnéticos, funcionalizadas en la superficie, con al menos un poliisocianato, por ejemplo diisocianato, y al menos un diol, preferiblemente al menos dos dioles.

Los dioles son polietilenglicoles o son de la fórmula HO((CH2)mO)nH (siendo n un número entero de 1 a 15, por ejemplo, de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 4, y m un número entero de 2 a 6, preferiblemente de 2 a 3, muy preferiblemente 2). Cuando sólo se emplea un diol, preferiblemente éste es un polietilenglicol, por ejemplo 35 polietilenglicol 300, 400, 500 o 600.

Las partículas de polímero usadas en el procedimiento de la invención pueden ser cualesquiera partículas de polímero de un tamaño adecuado, opcionalmente porosas, que tienen una superficie funcionalizada, por ejemplo, partículas de Ugelstad descritas en general en el documento US-A-4.654.267. También son asequibles partículas adecuadas de Ademtech, por ejemplo, partículas Carboxyl-Ademtech 0212 que comprenden un revestimiento superficial 40 de ácido carboxílico.

La funcionalidad de la superficie de la partícula de polímero preferiblemente es un grupo capaz, opcionalmente con activación, de reaccionar con un poliisocianato para unir covalentemente el poliisocianato a la superficie. Muy preferiblemente, la superficie tiene la funcionalidad amina o carboxilo.

Preferiblemente, la partícula de polímero se hace de combinaciones de polímeros vinílicos, por ejemplo 45 estirenos, acrilatos y/o metacrilatos. Opcionalmente el material polímero se puede reticular, por ejemplo, por incorporación de agentes reticuladores, por ejemplo, como comonómeros, por ejemplo, divinilbenceno (DVB) o dimetacrilato de etilenglicol. Se prefieren partículas que comprenden DVB.

Los expertos en la técnica conocerán las cantidades apropiadas de agentes reticuladores (por ejemplo comonómeros) requeridas. Preferiblemente, el polímero es un polímero estirénico reticulado (por ejemplo un polímero 50 de estireno-divinilbenceno que puede estar funcionalizado en la superficie usando un comonómero que contiene un grupo nitro, por ejemplo nitro-estireno y posterior reducción), o un polímero (met)acrílico reticulado con superficie funcionalizada usando un comonómero que contiene un grupo epoxi (por ejemplo metacrilato de glicidilo) y posterior aminación (por ejemplo, por reacción con etilendiamina).

Los cristales superparamagnéticos de las partículas de polímero usados en el procedimiento de la invención 55 pueden ser de cualquier material capaz de ser de ser depositado en forma cristalina superparamagnética sobre las

partículas de polímero o en sus poros si la partícula es porosa. Se prefieren óxidos de hierro magnéticos, por ejemplo, magnetita o maghemita; sin embargo, si se desea, los cristales pueden ser de óxidos metálicos mezclados u otro material magnético. La cantidad total presente de material magnético cristalino generalmente es de más de 20%, preferiblemente de más de 25%, deseablemente de más de o igual a 30% (en peso, por ejemplo, hasta de 85% en peso o de como mínimo 50% en peso, por ejemplo de 30 a 80% en peso). El porcentaje se calcula sobre la base de Fe (o 5 metal equivalente en el caso de materiales magnéticos que no son óxidos de hierro) en relación al peso total en seco de las partículas de polímero.

Se requieren concentraciones más altas de cristales magnéticos en las partículas de polímero para las partículas pequeñas reivindicadas aquí, para que puedan ser atraídas con éxito por un imán durante cualquier proceso de aislamiento. Otra manera de aumentar la facilidad con la que las perlas son arrastradas hacia un imán es hacer que 10 una parte de las mismas sean remanentes.

El grado de remanencia puede medirse con un magnetómetro de muestra vibrante realizando curvas de histéresis, Las curvas se producen midiendo la magnetización de las partículas en diferentes potencias de campo, desde, por ejemplo, -1,5 teslas a +1,5 teslas y retroceso. Si la magnetización máxima se designa Ms y el valor de cruce del eje Y (potencia de campo cero) se designa Mr, la relación Mr/Ms indicará lo remanentes que son las partículas. 15

Las partículas con una relación Mr/Ms inferior a 0,15 se pueden considerar superparamagnéticas para la mayoría de aplicaciones. El intervalo de tiempo para ir de –1,5 a +1,5 teslas debe ser de 10 min. Las partículas con valores de remanencia bajos a menudo tienen un arrastre acrecentado hacia un imán a causa de la agregación, pero las fuerzas entre ellas con tan pequeñas que esto no influye sobre el lavado de la muestra.

Las partículas porosas de polímero pueden tener partículas magnéticas depositadas en sus poros por técnicas 20 estándar. Como otra posibilidad, se pueden preparar partículas de polímero porosas a partir de nitroestireno y DVB e introducción de material magnético. Se prefiere el uso de aminoestireno, en especial 4-aminoestireno, como monómero o comonómero en la preparación de material polímero que presenta grupos amino. El uso de este monómero o comonómero obvia la necesidad de posteriores reacciones de nitración después de polimerización y reducción. Además, la naturaleza más predecible (homogeneidad) del revestimiento obtenido por este procedimiento permite que 25 se aplique un revestimiento más fiable.

Las partículas de polímero se pueden formar por funcionalización de la superficie o, alternativamente, la funcionalización del material polímero se puede realizar después de la polimerización mediante, por ejemplo, nitración y posterior reducción de los grupos así formados en grupos amina salientes, o por aminación directa, por ejemplo, por tratamiento con aminoetanol. 30

Las partículas de polímero de acuerdo con la invención tendrán tamaños (esto es, diámetros) inferiores a 500 nm, por ejemplo, generalmente en el intervalo de 100 nm a 400 nm, por ejemplo de 150 nm a 250 nm.

Típicamente, las partículas usadas tendrán una superficie de como mínimo 15 m2/g (medida por el procedimiento BET de absorción de nitrógeno) y, más preferiblemente, de como mínimo 30 m2/g, por ejemplo de hasta 700 m2/g cuando se corrige a un diámetro medio de partícula de 2,7 m (esto es, multiplicando la superficie por 2,7/DM, 35 siendo DM el diámetro medio en micrómetros). Preferiblemente, a escala similar, el volumen de poro de partícula preferiblemente es de como mínimo 0,1 ml/g.

Típicamente, las partículas de polímero son esféricas y están sustancialmente monodispersas antes de ser revestidas y permanecen de manera especialmente preferible esféricas y sustancialmente monodispersas una vez que han sido revestidas. 40

Por sustancialmente monodispersas se entiende que, para una pluralidad de partículas (por ejemplo, como mínimo 100, más preferiblemente como mínimo 1000, por ejemplo todas), las partículas tienen un coeficiente de variación (CV) de menos de 20%, por ejemplo de menos de 15%, preferiblemente de menos de 12%, más preferiblemente de menos de 11%, aún más preferiblemente de menos de 10% y, muy preferiblemente, de no más de aproximadamente 8%, por ejemplo de 2 a 5%. CV se determina en porcentaje como: 45

100 x desviación estándar

CV = 

medio

siendo medio el diámetro medio de partícula y la desviación estándar la desviación estándar del tamaño de partícula. Preferiblemente CV se calcula al modo principal, esto es, ajustando una curva de distribución monomodal a la 50 distribución detectada del tamaño de partículas. Así, se pueden descontar algunas partículas por debajo o por encima del tamaño del modo en el cálculo que puede estar basado en, por ejemplo, aproximadamente el 90% del número total de partículas (esto es, de partículas detectables). Esta determinación del CV preferiblemente se hace con un analizador del tamaño de partículas Coulter LS 130.

La reacción de la partícula magnética de polímero con los poliisocianatos genera un revestimiento de polímero. 55 Cuando las partículas son porosas, las partículas “revestidas” resultantes tienen luego una porosidad reducida en

relación al material poroso de partida. Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que parece que los cristales superparamagnéticos catalizan la polimerización de manera que el revestimiento se forma preferentemente en su vecindad.

En otra realización preferente, el polímero de revestimiento se forma a partir de uno o varios poliisocianatos (por ejemplo, 1, 2 o 3 y uno o varios (por ejemplo, 2, 3 o 4) dioles. Preferiblemente se debería usar un poliisocianato. 5 Alternativamente, se puede emplear una mezcla de polisocianatos muy afines (por ejemplo Desmodur).

Entre los típicos polisocianatos que se pueden usar figuran diisocianato de metileno, diisocianato de hexametileno, diisocianato de 2,4-tolueno (2,4-TDI) (e isómeros o mezclas de los mismos), diisocianato de isoforona (IPDI), isocianato de 4,4’-oxibisfenilo, diisocianato de 4,4’-difenilmetano (MDI), mezclas de MDI y oligómeros basados en MDI (por ejemplo Desmodur VL), diisocianato de 2,4-difenilo, diisocianato de metilenbisciclohexilo (H12MDI), diisocianato 10 de fenileno (p-PDI), 1,4-diisocianato de transciclohexano (CHDI), 1,6-diisocianatohexano (DICH), 1,5-diisocianatonaftaleno (NDI), diisocianato de para-tetrametilxileno (p-TMXDI) o diisocianato de metatetrametilxileno (m-TMXDI).

Un isocianato especialmente preferido es MDI o los poliisocianatos basados en él (por ejemplo Desmodur). Desmodur comprende MDI y oligómeros del mismo que comprenden MDI con restos de CH2-fenilisocianato. El 15 Desmodur es por ello una mezcla de varios polisocianatos que derivan de MDI. Una muestra de estructura puede ser

4,4-metilenbis(fenilisocianato) 40-50%

4,4-metilenbis(fenilisocianato)+ bencilisocianato: 20-25%

4,4- metilenbis(fenilisocianato)+ 2 bencilisocianato: 10%

4,4- metilenbis(fenilisocianato)+ 3 bencilisocianato: 2% 20

(En una reacción como ésta, el producto contiene también algo del isómero 2). El compuesto se vende por Shell bajo el nombre comercial Caradate y bajo los nombres comerciales Hylene y Rubinate por Hunstamn.

Preferiblemente se deben emplear dos dioles. Los dioles se usan preferiblemente en una relación molar de 0,5:1 a 1:05, más preferiblemente de 0,8:1 a 1:08 cuando se usan dos dioles. Preferiblemente, ninguno de los dioles se usa en una cantidad superior a 90% en moles de la mezcla de dioles. 25

Entre los dioles preferidos figuran dietilenglicol, tetraetilenglicol y poletilenglicol, por ejemplo, PEG 300, 400 o 600. Una combinación de dioles preferida es dietilenglicol y tetraetilenglicol.

Durante la reacción de revestimiento que implica el poliisocianato, se prefiere que en una primera etapa el poliisocianato esté en exceso (por ejemplo, en relación a cualquier diol). Está dentro del alcance de la invención usar sólo poliisocianato en esta etapa del procedimiento de revestimiento. Se cree que esto minimiza la posibilidad de que 30 haya gelificación durante la reacción. Cuando se usa un gran exceso de poliisocianato en una reacción de revestimiento inicial, puede ser luego necesario hacer reaccionar en una segunda etapa las partículas revestidas con otro(s) diol(es) (por ejemplo un diol como se ha descrito antes) para que reaccionen con cualesquier grupos isocianato sin reaccionar. Cuando la reacción de revestimiento inicial usa poliisocianato solo, es esencial que la partícula resultante reaccione luego con al menos un diol. 35

En una realización así, preferiblemente tal diol es un polietilenglicol. La larga cadena del PEG diol permite la formación de un conector de tamaño variable entre la superficie de revestimiento de la partícula y, por ello, facilita la reacción con ligandos de afinidad tales como estreptavidina.

Así, está dentro del alcance de la invención hacer reaccionar las partículas con poliisocioanato y seguidamente con diol, esto es, un procedimiento por etapas, para efectuar el revestimiento. 40

Típicamente, por tanto, la reacción de revestimiento se puede realizar impregnando la partícula porosa magnética de polímero con el poliisocianato y el(los) diol(es) usando, por ejemplo, una solución de los mismos (por ejemplo en un disolvente orgánico tal como metanol o diglima), o mezclando una dispersión de las partículas en un disolvente orgánico con una mezcla líquida de diol/poliisocianato. Se puede usar sonicación para mejorar la impregnación y se puede acelerar la reacción aumentando la temperatura, por ejemplo a 50-100ºC. Se puede extraer 45 cualquier disolvente usado aplicando una presión inferior a la ambiente.

Generalmente, los usos a los que se aplican las partículas magnéticas de polímero, por ejemplo, su uso como herramientas diagnósticas, requieren un grado de electrofilia adecuado con el fin de que puedan participar adecuadamente en el acoplamiento y otras reacciones en sistemas acuosos prevalentes en medios biológicos.

Si bien es deseable que la polaridad general de los revestimientos sea electrófila, se pueden incorporar ciertos 50 revestimientos que contienen restos hidrófobos para ajustar el grado de electrofilia al que se desee. De esta manera, la invención permite proveer herramientas diagnósticas útiles y otras que tienen una amplia gama de polaridades.

Si se desea, las superficies de las partículas magnéticas de polímero revestida pueden funcionalizarse adicionalmente mediante, por ejemplo, acoplamiento de una molécula de fármaco, un marcador informador (por ejemplo, un cromóforo, fluoróforo, una enzima o un radiomarcador), o un ligando (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un agente complejante de iones metálicos, un par partícipe de unión específica (por ejemplo biotina o estreptavidina), un oligopéptido, un oligonucleótido o un oligosacárido). 5

Tal acoplamiento puede ser directo o indirecto (y así puede implicar o no implicar el uso de un agente acoplador para formar una unión entre la partícula y la sustancia que se está acoplando a ella) y puede ser biodegradable o no biodegradable: Se pueden desear acoplamientos biodegradables si las partículas magnéticas de polímero se han de usar para la liberación de la diana seleccionada de un compuesto activo. Consecuentemente, después de haberse realizado el revestimiento, los grupos salientes del revestimiento pueden ser manipulados para 10 tener una funcionalidad apropiada (por ejemplo, las funcionalidades epoxi, hidroxi, amino, etc) para unión de tales sustancias.

La partícula magnética revestida funcionalizada se puede unir a un ligando de afinidad cuya naturaleza se seleccionará sobre la base de su afinidad a favor de un analito particular cuya presencia o ausencia en una muestra se debe determinar. La molécula de afinidad puede comprender por tanto cualquier molécula capaz de ser unida a una 15 muestra magnética que es capaz también de reconocer específicamente un analito particular. Por tanto, entre los ligandos de afinidad figuran anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, proteínas, oligopéptidos, polisacáridos, azúcares, péptidos, una molécula de ácido nucleico que codifican para un péptido, antígenos, fármacos y otros ligandos. Hay ejemplos de agentes de afinidad adecuados en la bibliografía publicada y son bien conocidos. El uso de otros partícipes de unión adecuados, ligandos de afinidad 20 secundarios y grupos de unión, que es una cuestión rutinaria en la técnica, no se discutirá más aquí, aunque se apreciará que es posible el uso de tales especies con las partículas de la invención si se desea.

Visto otro aspecto de la invención, ésta proporciona el uso de partículas de la invención en síntesis, extracciones o ensayos, en particular en la detección de ácido nucleico.

La introducción de grupos vinílicos polimerizables con, por ejemplo, un ácido acrílico puede también lograrse 25 haciendo reaccionar la superficie de revestimiento con un compuesto tal como anhídrido metacrílico. Por ejemplo, una partícula revestida que se ha hecho reaccionar con un diol puede presentar funcionalidades hidroxilo que reaccionarían fácilmente con anhídrido metilacrílico para introducir grupos vinilo en la superficie del polímero

Como se ha mencionado antes, la naturaleza de la sustancia externa introducida en las partículas se puede seleccionar sobre la base de su capacidad de unirse a un material diana particular. Generalmente, la detección de ácido 30 nucleico implica sondar una muestra que se piensa que contiene ácidos nucleicos diana usando una sonda de ácido nucleico que contiene secuencias de un ácido nucleico que reconoce explícitamente, por ejemplo, que se hibrida con la secuencia de los ácidos nucleicos diana, de manera que el ligando de afinidad del ácido nucleico y los ácidos nucleicos diana en combinación creen una capa de hibridación. Las partículas adecuadamente funcionalizadas de la invención, que, por ejemplo, presentan estreptavidina, son idealmente adecuadas para la detección de ácido nucleico. 35

Para aislar ADN de secuencia específica se pueden usar sondas de oligonucleótido de cadena simple unidos a partículas de estreptavidina. Las sondas biotiniladas se unen a las partículas mezclando la cantidad apropiada de partículas con un exceso de sonda biotinilada. Luego se incuban las partículas/sonda con la muestra de ADN en un tampón de hibridación, por ejemplo SSPE o SSC, en condiciones apropiadas para la longitud y secuencia de la sonda y el ADN. El ADN en exceso e innecesario se elimina por lavado utilizando las propiedades magnéticas de las partículas. 40 El ADN capturado se puede detectar/cuantificar por RCP, etc.

Para aislar la secuencia de ADN específica para proteínas de unión se pueden usar fragmentos de ADN de cadena doble unidas a partículas de estreptavidina. El ADN biotinilado se une a las partículas mezclando la cantidad apropiada de partículas con un exceso de sonda biotinilada. Luego se incuban las partículas/ADN con la muestra de proteína en un tampón de hibridación en condiciones apropiadas para la proteína que se investiga. El ADN 45 en exceso e innecesario se elimina por lavado utilizando las propiedades magnéticas de las partículas. La proteína capturada se puede eluir de la sonda (por alto contenido de sal, abjo contenido de sal, calor, pH bajo, etc.) para aplicaciones corriente abajo y detección.

Opcionalmente, el material diana puede ser un material de origen biológico o sintético, por ejemplo, puede ser una molécula o un grupo de moléculas, incluidos, por ejemplo, anticuerpos, aminoácidos, proteínas, péptidos, 50 polipéptidos, enzimas, sustratos de enzimas, hormonas, linfocinas, metabolitos, antígenos, haptenos, lecitinas, avidina, estreptavidina, toxinas, venenos, contaminantes ambientales, carbohidratos, oligosacáridos, poilisacáridos, glucoproteínas, glucolípidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos y ácidos nucleicos derivatizados, ADN y ARN, fármacos naturales o sintéticos, receptores, partículas de virus, partículas bacterianas, componentes de virus, células, componentes celulares, vesículas lipídicas naturales o sintéticas, membranas de polímero, servicios y partículas 55 de polímero y superficies de vidrio y plástico.

Cuando las partículas de la invención se han de emplear en inmunoensayos, se ha encontrado sorprendentemente que la tosilación de las partículas después de revestimiento da por resultado partículas que

presentan un comportamiento mejorado en inmunoensayos. Así, en una realización preferente se pueden tosilar partículas que tienen revestimiento, por ejemplo, haciendo reaccionar las partículas con cloruro de tosilo en presencia de una base. Las partículas revestidas tosiladas son nuevas y constituyen otro aspecto de la invención. Por tosilo se entiende un grupo tolueno-4-sulfonilo.

Además, tales especies tosiladas pueden reaccionar fácilmente con ligandos de afinidad, por ejemplo 5 estreptavidina, para formar otras nuevas partículas.

Así, contemplada la invención en otro aspecto, la invención proporciona partículas polímeras revestidas que tienen cristales superparamagnéticos y que tienen un revestimiento formado por al menos un poliisocianato y al menos un diol, que posteriormente se tosilan, por ejemplo, por reacción con cloruro de tosilo y, opcionalmente, se hace reaccionar luego con un ligando de afinidad, por ejemplo estreptavidina. 10

Además, se ha encontrado sorprendentemente que las partículas de los diámetros reivindicados en este documento tienen una capacidad de unión muy acrecentada en comparación con partículas de mayor tamaño, por ejemplo partículas de 3 m. Se prevé que la capacidad de unión de las partículas reivindicadas es más de 200% mayor que la de partículas mayores, lo que permite el uso de cantidades más bajas de partículas en un proceso de ensayo.

Las partículas de la invención, por tanto, son útiles en procesos de adsorción/desorción análogamente a los 15 mecanismos en cromatografía en fase inversa o cromatografía de interacción hidrófoba. La cromatografía en fase inversa es una técnica de separación que utiliza una interacción de adsorción hidrófoba entre una molécula de soluto (por ejemplo una proteína) y un ligando hidrófobo inmovilizado (por ejemplo, la superficie de las moléculas). Usualmente la interacción es tan fuerte que puede presentarse en soluciones de baja resistencia iónica y se interrumpe usando disolventes orgánicos (por ejemplo acetonitrilo). La cromatografía en fase inversa se puede usar para fraccionar 20 muestras de proteínas complejas y para desalar muestras de proteína. Usualmente, la RCP se realiza usando una fase sólida como relleno en una columna. Las partículas de la invención permiten realizar la técnica sin columna, sin dilución de la muestra y automatizarla con un rendimiento alto.

La cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) es una técnica de separación que utiliza una interacción de adsorción hidrófoba entre una molécula de soluto (por ejemplo una proteína) y un ligando hidrófobo inmovilizado (por 25 ejemplo la superficie de las partículas). Esta interacción es más débil que las interacciones utilizadas durante la RCP y requiere ser promovida por concentraciones salinas altas. Consecuentemente, se pueden usar concentraciones salinas decrecientes para romper estas interacciones de adsorción. La CIH se puede usar para fraccionar muestras complejas de proteína y para desalar muestras de proteína. Usualmente, la CIH se realiza usando una fase sólida como relleno en una columna. Las partículas de la invención permiten realizar la técnica sin columna, sin dilución de la muestra y 30 automatizarla con una gran producción.

La invención se describirá ahora haciendo referencia al ejemplo siguiente.

Ejemplo 1 Revestimiento con poliuretano de partículas magnéticas de ácido carboxílico de 0,3 m

Se añadieron a un recipiente de reacción 6,5 gramos de una dispersión de partículas magnéticas (0212x de 35 Ademtech) con un contenido seco de 3,1% en peso y el recipiente se puso sobre un imán. Se eliminó la fase acuosa de las partículas y se lavaron las partículas tres veces con 5 ml de hidróxido sódico 0,01M, dos veces con 5 ml de ácido clorhídrico 0,01 M, nuevamente con hidróxido sódico 0,01 M y luego con agua pura. Además se lavaron luego con metanol y se pasaron a dietilenglicol dimetil éter. La concentración de partículas en dietilenglicol dimetil éter se ajustó al valor original de 3,1% en peso. 40

Se añadieron 0,5 g de diisocianato de difenilmetano (Desmodur v1, Bayer) y el recipiente de reacción se puso en un vórtex con un bloque de calentamiento. La temperatura se fijó en 80ºC durante 20 horas. La espectroscopía de infrarrojos reveló que las partículas habían fijado grupos uretano y grupos isocianato (número de onda 1707 cm-1 para tramo C=O y 2278 cm-1 para el tramo N=C=O).

A la dispersión de partículas anterior se añadieron 0,6 g de polietilenglicol 300 y se calentó a 80ºC durante 1 45 hora. Las partículas se lavaron dos veces con 20 ml de dietilenglicol dimetil éter y luego seis veces con 20 ml de metanol y luego se pasaron a agua (3 x 20 ml). La espectroscopia de infrarrojos demostró que estaba unido por covalencia polietilenglicol a las partículas por una reducción en el tramo N=C=O a 2278 cm-1 y un aumento en los grupos éter (a 1112 cm-1 y 1071 cm-1).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la preparación de partículas de polímero revestidas que contienen cristales superparamagnéticos, procedimiento que comprende hacer reaccionar partículas de polímero con la superficie funcionalizada, de un diámetro inferior a 0,5 m, que contienen cristales superparamagnéticos, con al menos un poliisocianato y al menos un diol, diol que se selecciona entre el grupo que consiste en polietilenglicoles y dioles de 5 fórmula HO((CH2)mO)nH (siendo n un número entero de 1 a 15 y m un número entero de 2 a 6).
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que se emplean al menos dos dioles.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que m es 2.
4. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que los mencionados dioles son dietilenglicol y tetraetilenglicol. 10
5. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que uno de los mencionados dioles es polietilenglicol.
6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el mencionado poliisocianato es 4,4-metilenbis(fenilisocianato) o un poliisocianato que comprende 4,4-metilenbis-(fenilisocianato) con restos de CH2-fenilisocianato.
7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el mencionado poliisocianato es un 15 diisocianato.
8. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las mencionadas partículas se hacen reaccionar, en una primera etapa, con una mezcla de poliisocianato y al menos un diol, en el que el poliisocianato está en un exceso molar en relación al (los) diol(es) y, en una segunda etapa, se hace reaccionar seguidamente con al menos un diol.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que se usan dos dioles en la primera etapa de la reacción y 20 uno o dos dioles en la segunda etapa.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que se usan dietilenglicol y tetraetilenglicol en ambas etapas de la reacción.
11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las partículas se hacen reaccionar, en una primera etapa, con poliisocianato en ausencia de diol y, en una segunda etapa, se hacen reaccionar con al 25 menos un diol.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que se emplea un diol y el mencionado diol es un polietilenglicol.
13. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que las partículas tienen funcionalidad amina. 30
14. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que las mencionadas partículas de polímero funcionalizadas en la superficie son partículas de polímero de estireno-divinilbenceno nitradas y reducidas.
15. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el diámetro de las partículas de polímero está entre 150 y 250 nm.
16. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que la mencionada partícula revestida se 35 tosila posteriormente.
17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que, tras la reacción de revestimiento, las mencionadas partículas se acoplan a una molécula de fármaco, un resto informador o un ligando.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que el mencionado ligando es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo, un ácido nucleico, un oligonucleótido, una proteína, un oligopéptido, 40 un polisacárido, un azúcar, un péptido, una molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido, un antígeno o un fármaco.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que el mencionado ligando es estreptavidina.
20. Una partícula obtenible por el procedimiento de cualquier reivindicación precedente.
21. Uso de una partícula según la reivindicación 20 en un ensayo. 45
22. Uso según la reivindicación 21, en el que el mencionado ensayo es para la detección de ácido nucleico o es un inmunoensayo.
23. Uso de una partícula según la reivindicación 21 en cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de fase inversa.