ES2355882A1 - Combinación de adenovirus oncolítico y un bloqueador de canal de calcio y su uso para el tratamiento del cáncer. - Google Patents
Combinación de adenovirus oncolítico y un bloqueador de canal de calcio y su uso para el tratamiento del cáncer. Download PDFInfo
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- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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Abstract
Combinación de un adenovirus oncolítico y un bloqueador de canal de calcio y su uso para el tratamiento del cáncer.Combinación que comprende dos componentes: (a) el primer componente es una composición farmacéutica que comprende un bloqueador de canal de calcio junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables; y (b) el segundo componente es una composición farmacéutica que comprende un adenovirus oncolítico junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, así como su uso para administración separada o secuencial para el tratamiento del cáncer.También comprende el uso del bloqueador de canal de calcio en la combinación como potenciador de la actividad oncolítica del adenovirus.
Description
Combinación de un adenovirus oncolítico y un
bloqueador de canal de calcio y su uso para el tratamiento del
cáncer.
La presente invención está relacionada con la
biología del cáncer. En particular, la presente invención se refiere
a una combinación de un adenovirus oncolítico y un bloqueador de
canal de calcio, la cual es efectiva en el tratamiento del
cáncer.
Los adenovirus oncolíticos representan una
alternativa prometedora para el tratamiento del cáncer. Cuando se
administra un adenovirus oncolítico, éste se replica de manera
selectiva en las células tumorales. La posterior lisis de las
células infectadas provoca la liberación de la progenie viral al
medio extracelular y la progenie viral liberada se disemina
lateralmente hacia células vecinas tumorales no infectadas. Como
consecuencia de este mecanismo, se produce un efecto amplificador
(multiplicativo) de la dosis viral inicial.
Sin embargo se han detectado ciertas
limitaciones que repercuten negativamente en la diseminación del
adenovirus lo cual, a su vez, afecta de manera negativa a la
eficacia oncolítica de estos adenovirus.
En particular, cuando el adenovirus se
administra por vía sistémica, el adenovirus se elimina rápidamente
del torrente sanguíneo, lo que reduce la cantidad de virus
disponible para la infección del tumor. Además, una vez han
difundido al interior de la masa tumoral, los adenovirus oncolíticos
deben hacer frente a las barreras físicas impuestas por el estroma
tumoral (zona del tumor carente de células tumorales) y a la
activación del sistema inmune (que provoca la destrucción de
partículas víricas).
Adicionalmente, la diseminación intratumoral del
adenovirus está seriamente limitada por la velocidad de liberación
del virus al medio extracelular. La liberación del virus al medio
extracelular no se inicia hasta las etapas más tardías del ciclo
viral, cuando la expresión de la proteína ADP (en inglés
"adenovirus death proten") se acumula en una cantidad
suficiente como para promover la liberación de la progenie del
interior de la célula hospedadora. A pesar de que el mecanismo de
lisis celular y liberación de partículas víricas no se conoce con
exactitud, distintas hipótesis sugieren que la proteína ADP funciona
modificando los depósitos intracelulares de calcio (cfr. Tollefson
A. E. et al., "The
E3-11,6-kDa adenovirus death protein
(ADP) is required for efficient cell death: characterization of
cells infected with adp mutants", Virology. 1996; vol.
220(1), pp. 152-62; Doronin K. et al.,
"Overexpression of the ADP (E3-11,6K) protein
increases cell lysis and spread of adenovirus", Virology
2003; vol. 305(2), pp. 378-87). Cada vez se
dispone de más evidencias que sugieren que muchos virus inducen la
muerte de la célula infectada y la liberación de su progenie
mediante la alteración de la concentración intracelular de calcio
(Ruiz M. C. et al., "Role of Ca^{2+} in the replication
and pathogenesis of rotavirus and other viral infections",
Cell calcium, 2000, vol. 28(3), pp.
137-49).
Con el fin de mejorar la diseminación de los
adenovirus oncolíticos se han diseñado distintas estrategias. En
este sentido, se ha propuesto la expresión de transgenes tales como
proteasas (cfr. Ganesh S. et al., "Intratumoral
coadministration of hyaluronidase enzyme and oncolytic adenoviruses
enhances virus potency in metastatic tumor models", Clin.
Cancer Res., 2008, vol. 14(12), pp.
3933-3941), que provocan la disrupción del tejido
conectivo, o proteínas fusogénicas. Sin embargo, la inserción de
transgenes en el marco del genoma adenoviral está limitada por el
tamaño (tanto del genoma adenoviral como del transgén), y requiere
la compatibilidad de la expresión de dicho transgén en el ciclo
replicativo del adenovirus. Como alternativa se ha descrito la
inclusión de mutaciones puntuales específicas o deleciones parciales
en el gen E1B/19K (7), la sobre-expresión de la
proteína ADP a través de deleciones parciales o completas de la
unidad transcripcional E3 del adenovirus (cfr. Toth K. et
al., "An oncolytic adenovirus vector combining enhanced
cell-to-cell spreading, mediated by
the ADP cytolytic protein, with selective replication in cancer
cells with deregulated wnt signaling", Cancer research,
2004, vol. 64(10), pp. 3638-3644), o la
mutación truncante de la región C-terminal de la
proteína viral i-leader.
Si bien las estrategias indicadas más arriba
incrementan la diseminación célula-célula in
vitro, y mejoran el potencial terapéutico de los adenovirus
oncolíticos in vivo, requieren la manipulación del genoma
adenovírico. Además algunas de las modificaciones conllevan efectos
potencialmente indeseables en la actividad oncolítica del adenovirus
como, por ejemplo, la reducción de la producción viral (observada en
los mutantes E1B/19K en algunos tipos celulares) o la pérdida de una
o más funciones inmunomoduladoras (en los mutantes de la región
E3).
Otro de los problemas asociados con las terapias
actuales para el tratamiento del cáncer es la aparición de
resistencia de las células tumorales a la quimio- y radioterapia. En
este sentido, la solicitud PCT WO2007/103825 indica que la
combinación de la quimio- y radioterapia con la terapia basada en el
uso de adenovirus oncolíticos puede mejorar la eficacia del
tratamiento. Así, en este documento se propone un método para el
tratamiento del cáncer en base a la combinación de un primer agente
que modula el ciclo celular y un segundo agente que es un agente
anticancerígeno.
A pesar de los esfuerzos realizados hasta la
fecha, existe todavía la necesidad de encontrar nuevas
aproximaciones terapéuticas con una eficacia mejorada en el
tratamiento del cáncer.
Los investigadores de la presente invención han
descubierto que los bloqueadores de canales de calcio (también
conocidos como "antagonistas del calcio"), mejoran la
diseminación intratumoral de los adenovirus oncolíticos. Los
resultados obtenidos demuestran que estos compuestos (y, en
particular el verapamilo) incrementan la citotoxicidad del
adenovirus oncolítico in vitro e incrementa la actividad
antitumoral del mismo en dos modelos xenógrafos distintos de tumores
humanos in vivo. Ventajosamente, estas mejoras en la
citotoxicidad (análisis in vitro) y actividad tumoral
(análisis in vivo) no afectan negativamente a la selectividad
del adenovirus por la célula tumoral ni a la síntesis de proteínas
de fase temprana y tardía.
Así, en un primer aspecto la presente invención
se refiere a una combinación que comprende dos componentes: (a) el
primer componente comprende un bloqueador de canal de calcio junto
con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables; y (b) el
segundo componente comprende un adenovirus oncolítico junto con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones de la presente invención se
pueden administrar en forma de composiciones inyectables, ya sea
como soluciones líquidas o, en el caso de los bloqueadores de canal
de calcio, suspensiones. También se pueden administrar formas
sólidas del bloqueador de canal de calcio para solución o
suspensión, en líquido antes de la inyección. Estas preparaciones
también se pueden emulsionar. Una composición típica para este
propósito comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen
soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales,
conservantes, tampones y similares. Ejemplos de disolventes son el
propilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales
como el etiloleato. Portadores acuosos incluyen el agua, soluciones
acuosas/alcohólicas, soluciones salinas, vehículos parenterales
tales como el cloruro de sodio o dextrosa de Ringer. Vehículos
intravenosos incluyen reconstituyentes ("replenishers")
de fluidos y nutrientes. Los conservantes incluyen agentes
antimicrobianos, antioxidantes, quelantes o gases inertes. El pH y
la concentración exacta de los diversos componentes de la
composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con parámetros bien
conocidos para el experto en la materia.
La combinación de la presente invención se
proporciona en forma de dos componentes, en la cual el componente
(a) (que incluye el bloqueador de canal de calcio) y el componente
(b) (que incluye el adenovirus oncolítico) se envasan separadamente.
Por ejemplo, una primera forma de dosis unitaria (p.e. un primer
sobre) puede contener el adenovirus oncolítico (en forma líquida) y
una segunda forma de dosis unitaria, (p.e., un segundo sobre) puede
contener el bloqueador de canal de calcio (ya sea en forma líquida,
en suspensión, emulsión o en forma sólida).
En una realización del primer aspecto de la
invención, el componente (a) se administra una vez al día.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, el componente (a) se administra posteriormente a la
administración del componente (b).
En todavía otra realización del primer aspecto
de la invención, se administra en primer lugar una única dosis del
componente (b) y posteriormente se administra una o varias dosis del
componente (a) con el fin de prolongar la actividad potenciada del
adenovirus oncolítico hasta conseguir el efecto terapéutico deseado
(la erradicación del tumor).
En todavía aún otra realización preferida del
primer aspecto de la invención, tanto el componente (a) como el
componente (b) se administran por vía sistémica.
En aún otra realización preferida del primer
aspecto de la invención, el componente (a) se administra por vía
oral y el componente (b) se administra por vía intratumoral.
Los bloqueadores de canales del calcio son una
clase de compuestos empleados para tratar la hipertensión arterial,
la angina de pecho y las arritmias cardiacas. La característica
farmacológica común para todos estos compuestos es la inhibición de
la entrada de calcio a través de los canales pasivos "lentos"
(passive "slow" channels). Existen
principalmente tres subgrupos: (a) derivados de las
dihidropiridinas: azelnidipina, amlodipina, felodipina, isradipina,
lacidipina, lercanidipina, nicardipina, nifedipina, nilvadipina,
nimodipina, nisoldipina, nitrendipina, manidipina, mebudipina,
pranidipina, clevidipina; (b) derivados de la papaverina o
fenilalquilamina: verapamilo; y (c) derivados de las
benzodiazepinas: diltiazem. Preferiblemente, el bloqueador de canal
de calcio se selecciona del grupo formado por verapamilo, amlodipino
y diltiazem. Más preferiblemente, el bloqueador de canal de calcio
es verapamilo.
El adenovirus oncolítico que se puede usar de
acuerdo con el primer aspecto de la invención puede ser cualquiera
de los conocidos en el estado de la técnica. Ejemplos ilustrativos
no limitativos incluyen el adenovirus humano de tipo 5 (de aquí en
adelante también referido como "Ad5") y los adenovirus
descritos en las solicitudes de patente PCT WO2003080083 y
WO2007088229.
En una realización preferida del primer aspecto
de la invención, el adenovirus contiene una secuencia de DNA humano
aislando a un promotor que confiere expresión selectiva a un gen
adenoviral. La producción del mismo se describe en la solicitud
WO2007088229.
Los resultados mostrados más abajo demuestran
que la combinación de un adenovirus oncolítico con un bloqueador de
canal de calcio como el verapamilo incrementa de forma sustancial la
liberación del adenovirus de la célula infectada, sin afectar
negativamente a la producción total de virus. Este bloqueador de
canales de calcio es capaz de mejorar la cinética de liberación en
diversos tipos celulares, incluyendo melanoma, adenocarcinomas de
pulmón y páncreas, y fibroblastos asociados a tumor llevando, en
todos los casos, a una diseminación célula-célula y
a una citotoxicidad incrementadas. El tipo de cáncer a ser tratado
determina el diseño específico del adenovirus oncolítico a ser
usado. Como es bien conocido en el estado de la técnica, se puede
conseguir que un adenovirus oncolítico se dirija de manera
específica a un tipo de cáncer concreto realizando modificaciones en
su genoma.
Los investigadores de la presente invención han
descubierto que los bloqueadores de canales de calcio desencadenan
en la célula hospedadora un mecanismo que es independiente tanto de
la inducción de apoptosis como de la expresión de la proteína ADP
(tal y como se ilustra en la Fig. 2B el verapamilo no induce
apoptosis (en base al marcador PARP)). Adicionalmente, se ha
descubierto que la liberación de partículas víricas se inicia mucho
antes administrando un bloqueador de canal de calcio.
Consecuentemente estos bloqueadores de canales de calcio
desencadenan un mecanismo aún desconocido, mediante el cual se
promueve la liberación del adenovirus de las células infectadas en
una fase más temprana.
Pese a que el mecanismo exacto a través del cual
los bloqueadores de canales de calcio promueven la liberación
celular del adenovirus oncolítico es todavía desconocido, parece que
la inhibición del flujo de entrada de calcio es necesaria para
inducir el fenotipo observado. Tal y como se ilustra más abajo, en
la Fig. 3B, miembros de cada tipo de bloqueadores de canales de
calcio (fenilalquilaminas, dihidropiridinas y benzotiazepinas)
tienen todos un efecto similar en la liberación del adenovirus, lo
que sugiere que la actividad responsable de la
liberación/diseminación de las partículas víricas es la actividad
bloqueadora de canales de calcio, común a los tres tipos. El efecto
observado por la deprivación de calcio en los adenovirus
oncolíticos, de acuerdo con la presente invención, es contrario al
efecto que se ha observado con la depleción de calcio en, por
ejemplo, coxsackievirus, en donde se produce una disminución de la
liberación de la progenie viral y una inhibición de la producción de
virus total en las células infectadas con citomegalovirus, el virus
del sarampión y el de la viruela (cfr. Ruiz M. C. et al.,
citado más arriba).
Por otro lado, la solicitud PCT WO2007/10382
describe un método para el tratamiento del cáncer en base a la
combinación de un primer agente que modula el ciclo celular y un
segundo agente que es un agente anticancerígeno . En la sección de
"Ejemplos" se ilustran varias combinaciones de adenovirus
oncolíticos con un segundo agente anticancerígeno. En particular se
ejemplifican las combinaciones adenovirus
Delta-24+CPT-11, adenovirus
ICOVIR5+temozolamida y adenovirus ICOVIR5+RAD001. Tanto
CPT-11, como la temozolamida y RAD001 son productos
ampliamente usados como agentes quimioterapéuticos.
Los agentes quimioterapéuticos tienen la
capacidad de destruir las células cancerosas. Habitualmente, los
fármacos para el cáncer actúan dañando el ARN o ADN que indica a la
célula cómo realizar una copia de sí misma en la división. Si las
células cancerosas no pueden dividirse, mueren. Cuanto más rápido se
dividan las células cancerosas, habrá más probabilidades de que la
quimioterapia destruya las células y el tumor reduzca su tamaño.
Adicionalmente, estos fármacos inducen al suicidio celular (muerte
celular programada o apoptosis).
El mecanismo de acción de los agentes
quimioterapéuticos es, por lo tanto, totalmente diferente al que
ejerce un bloqueador de canal de calcio sobre la diseminación del
adenovirus ya que, tal y como se ha indicado más arriba, la acción
de los bloqueadores de canal de calcio es independiente de la
apoptosis celular.
Los investigadores de la presente invención han
llevado a cabo un estudio con el fin de comparar la velocidad de
diseminación provocada por el verapamilo (como bloqueador
ejemplificativo de los bloqueadores de canal de calcio) así como la
provocada por otros agentes quimioterapéuticos conocidos como son la
temozolamida y RAD001. Para ello, se infectaron células A549 con Ad5
y, a continuación, se administró cada uno de los productos. Como se
puede observar en la Fig. 6, la administración de verapamilo
consigue aumentar notablemente la diseminación del adenovirus con
respecto a los resultados que se obtienen usando temozolamida o
RAD001. Es destacable, además, el hecho de que el tamaño de las
calvas obtenidas tras la administración de la temozolamida o RAD001
es prácticamente idéntico al tamaño de las calvas sin la adición de
ningún compuesto. Por lo tanto, el verapamilo (y por extensión
cualquier bloqueador de canal de calcio) incrementa notablemente la
diseminación del adenovirus a las células vecinas, lo cual conlleva
a un incremento en la actividad antitumoral del adenovirus y, en
consecuencia, a una mayor eficacia (ya que la progenie viral infecta
más rápidamente a las células tumorales vecinas).
Adicionalmente, el hecho de que se incremente de
forma tan notable la diseminación posibilita que usando una misma
cantidad de adenovirus el efecto terapéutico (i.e. efecto
oncolítico) sea muy superior.
Otro aspecto ventajoso del uso de bloqueadores
de canal de calcio es que estos no afectan negativamente a la
viabilidad celular cuando se usan a dosis elevadas, lo cual supone
un gran avance en el tratamiento del cáncer.
El uso de bloqueadores de canal de calcio como
potenciadores del efecto antitumoral de los adenovirus oncolíticos
puede beneficiarse de medidas de salvaguarda adicionales que no son
posibles con los métodos genéticos descritos anteriormente. Así, por
ejemplo, la aparición de toxicidades inesperadas puede ser
fácilmente revertida suprimiendo el uso del bloqueador.
Por todo lo comentado más arriba, junto con los
resultados mostrados más abajo, se puede concluir que los
bloqueadores de canal de calcio constituyen una forma nueva, segura
y versátil de incrementar la potencia antitumoral de los adenovirus
oncolíticos en el marco de su uso clínico.
Adicionalmente, mientras que con los métodos
genéticos usados para el incremento de la liberación se puede
comprometer alguna de la funciones inmunomoduladoras de la región
E3, o incluso reducir la producción viral total (al inducir una
muerte celular más temprana), el bloqueador de canal de calcio es
capaz de incrementar la diseminación y la citoxicidad viral sin que
se vea modificada la producción viral ni la expresión de proteínas
adenovirales.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a la combinación de acuerdo con el primer aspecto de la
invención para uso separado o secuencial en el tratamiento del
cáncer.
En un tercer aspecto, la presente invención se
refiere a un kit que comprende la combinación definida según el
primer aspecto de la invención e instrucciones para su uso.
En un cuarto aspecto, la presente invención se
refiere a un bloqueador de canal de calcio para uso como agente
potenciador de la actividad antitumoral de un adenovirus
oncolítico.
El efecto potenciador que ejercen los
bloqueadores de canales de calcio sobre los adenovirus se puede
determinar mediante cualquiera de los métodos rutinarios bien
conocidos por el experto en la materia, comparando la actividad
antitumoral en presencia y ausencia del bloqueador de canal de
calcio.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1 muestra que el verapamilo incrementa la
liberación, diseminación y citoxicidad del Ad5 in vitro. (A)
Producción viral y cinética de liberación de Ad5 o de Ad5 combinado
con verapamilo 40 \muM en células A549. El contenido viral de la
fracción total (CE) y del sobrenadante (SN) se analizaron en los
tiempos indicados. *, significativo (p= 8,1x10^{-5} y p=0,03 a las
40 h y las 48 h post-infección respectivamente)
respecto al SN de Ad5 mediante test de la t-Student a dos
colas para muestras desapareadas. (-\medcirc- = sobrenadante del
cultivo infectado con Ad5; -\medbullet- = sobrenadante del cultivo
infectado con Ad5 y adición de verapamilo; -\boxempty- = extracto
celular del cultivo infectado con Ad5; -\blacksquare- = extracto
celular del cultivo infectado con Ad5 y adición de verapamilo). (B)
Liberación viral al medio de Ad5 solo o en combinación con
verapamilo en las células CAF1, SKMeI-28 y
NP-9. Se muestra el punto en el cual se observó una
diferencia mayor en la liberación viral. *, significativo (p= 0,015
para CAF1, y p= 0,04 para NP-9 respecto al SN de Ad5
mediante test de la t-Student a dos colas para muestras
desapareadas, (barra rayada= sobrenadante del cultivo infectado con
Ad5; barra negra lisa= sobrenadante del cultivo infectado con Ad5 y
adición de verapamilo). (C) Tamaño de calva de Ad5 solo o en
presencia de verapamilo 40 \muM en las células A549 a día 7
post-infección. (D) Citotoxicidad comparativa de Ad5
\pm verapamilo en las líneas celulares tumorales
SKMeI-28, A549 y NP-9. Se muestran
los valores de IC_{50} (TU/célula de Ad5 necesarias para causar
una reducción de la viabilidad celular del 50%).(-\medcirc- =
supervivencia del cultivo infectado con Ad5; -\medbullet- =
supervivencia del cultivo infectado con Ad5 + verapamilo).
Fig. 2 muestra el efecto del verapamilo en la
expresión de proteínas virales, la apoptosis, y dependencia de ADP.
(A) La adición de verapamilo no modifica el patrón de expresión de
las proteínas tempranas y el de las tardías. Se infectaron células
A549 con Ad5 en presencia o ausencia de verapamilo en el medio
extracelular y se analizó por Western-blot la
expresión de E1A, E3/19K, L4-100K y fibra (gen
marcador de la expresión de proteínas tardías) a las 16, 24, 40 y 48
horas post-infección. (B) Niveles de activación de
la apoptosis en células A549 infectadas con Ad5 y tratadas o no con
verapamilo. Se detectó el truncamiento de PARP por
Western-blot de los extractos celulares proteicos a
las 40 h post-infección. Como control positivo de
inducción de apoptosis se incubaron las mismas células con
estaurosporina (SSP) a 0,2 \muM. (C) Cinética de liberación viral
de Ad5 y AdADP^{-} (adenovirus que no expresa ADP) en células A549
en presencia o ausencia de verapamilo en el medio extracelular. A
los tiempos indicados se cuantificó el contenido en virus de los
sobrenadantes y extractos celulares correspondientes. *,
significativo (p= 0,005 y p= 0,01 a las 40 y 48 horas
post-infección respectivamente) con respecto a la
liberación de Ad5, y #, significativo (p= 0,03, p= 0,003 y p= 0,02 a
las 48, 64 y 72 horas post-infección
respectivamente) con respecto a la liberación de AdADP^{-} por el
test t-Student a dos colas para muestras desapareadas.
(-\medbullet- = sobrenadante del cultivo infectado con adenovirus
5; -\blacksquare- = sobrenadante del cultivo infectado con
AdADP^{-}; -\medcirc- = sobrenadante del cultivo infectado con
Ad5 y adición de verapamilo; -\boxempty- = sobrenadante del
cultivo infectado con AdADP^{-} y adición de verapamilo;
\cdot\cdot\cdot\medbullet\cdot\cdot\cdot = extracto
celular del cultivo infectado con adenovirus 5;
\cdot\cdot\cdot\blacksquare\cdot\cdot\cdot = extracto
celular del cultivo infectado con AdADP^{-};
\cdot\cdot\cdot\medcirc\cdot\cdot\cdot = extracto
celular del cultivo infectado con Ad5 y adición de verapamilo;
-\boxempty- = extracto celular infectado con AdADP^{-} y adición
de verapamilo) (D) Comparación del tamaño de las calvas de
rec700 y dl732 (adenovirus que sobreexpresa la
proteína ADP) en presencia o ausencia de verapamilo en células A549
a día 6
post-infección.
post-infección.
\newpage
Fig. 3 muestra la dependencia del fenotipo de
liberación de partículas víricas en base a la actividad bloqueadora
de calcio del verapamilo. (A) Tamaño de las calvas generadas en A549
por Ad5 solo, o en presencia de distintos bloqueantes de canales de
calcio: verapamilo (v), amlodipino (a) y diltiazem (d). Se muestran
fotografías representativas tomadas a día 7
post-infección. (B) Liberación al medio de Ad5 a las
40 horas post-infección en presencia o ausencia de
distintos bloqueantes de canales de calcio. *, significativo con
respecto a la liberación de Ad5 por el test t-Student a dos
colas para muestras desapareadas (p= 0,025, p= 0,023 y p= 0,003 para
verapamilo, amlodipino y diltiazem, respectivamente). (C) Producción
viral total y cinética de liberación al medio de Ad5 en presencia o
ausencia del ión calcio en el medio extracelular. (-\medcirc- =
sobrenadante del cultivo sin calcio infectado con Ad5;
-\medbullet- = sobrenadante del cultivo con calcio infectado con
Ad5; \cdot\cdot\cdot\medcirc\cdot\cdot\cdot = extracto
celular del cultivo sin calcio infectado con Ad5;
\cdot\cdot\cdot\medbullet\cdot\cdot\cdot = extracto
celular del cultivo con calcio).
Fig. 4. El verapamilo mantiene la selectividad
de ICOVIR-5 en un modelo inmunocompetente in
vivo, (a) Expresión hepática de E1A analizada por
inmunohistoquímica de secciones representativas de hígados de
ratones tratados durante 5 días con PBS (a) ó con 5x10^{10}
partículas virales (vp) de AdwtRGD (en este caso el tratamiento fue
de 3 días) (b), de ICOVIR-5 (c) ó de la combinación
ICOVIR-5 + administración diaria de 20 mg/kg de
verapamilo. En las fotografías se puede apreciar el mareaje
específico de E1A como una tinción clara sobre el fondo negro. Tal y
como se puede observar este mareaje sólo es visible después de la
administración de AdwtRGD y no así cuando se administra
ICOVIR-5 o ICOVIR-5+verapamilo. (B).
Valores medios de AST (aspartato aminotransferas) y de ALT (alanina
aminotransferasa) en plasma después de la administración de los
virus indicados. Barra blanca= PBS; barra negra= AdwtRGD; barra
punteada= ICOVIR5; barra rayada= ICOVIR5+verapamilo y (C)
concentraciones linfocitarias y plaquetarias en sangre periférica a
día 5 post-inyección (día 3
post-inyección para el grupo tratado con AdwtRGD) a
las dosis indicadas. Se representan los valores de medias obtenidas
para 5 animales por grupo \pm SD. *, significativo (P<0,05) con
respecto al grupo PBS y #, significativo con respecto al grupo
tratado con AdwtRGD por el test t-Student a dos colas para
muestras desapareadas, (barra blanca= PBS; barra negra= AdwtRGD;
barra punteada= ICOVIR5; barra rayada= ICOVIR5 + verapamilo).
Fig. 5 muestra que el verapamilo incrementa la
actividad antitumoral de ICOVIR-5 in vivo.
(A) Se trataron ratones nude con tumores xenógrafos de A549
con PBS, PBS combinado con administración diaria de verapamilo (V) a
20 mg/kg por vía intraperitoneal (i.p.), o con una única dosis de
5x10^{10} vp de ICOVIR-5 solo o en combinación con
verapamilo. *, significativo (P<0,05) con respecto al grupo PBS;
\NAK, significativo con respecto al grupo PBS + V, y #,
significativo (P<0,05) con respecto al grupo tratado con
ICOVIR-5 solo, por el test t-Student a dos
colas para muestras desapareadas. (-\medbullet- = PBS;
-\blacksquare-= PBS+verapamilo; -\medcirc- = ICOVIR5;
-\boxempty- ICOVIR5+verapamilo). (B) Inmunotinción
anti-adenovirus de secciones congeladas de tumores
A549 tratados con PBS (a), PBS + verapamilo a 20 mg/kg diario (b),
5x10^{10} vp de ICOVIR-5 (c), y 5x10^{10} vp de
ICOVIR-5 + verapamilo a 20 mg/kg diario (d). Se
presentan fotografías representativas de muestras obtenidas a día 13
después de la administración de los virus indicados. En las
fotografías se puede apreciar el mareaje específico de proteínas
adenovirales estructurales (indicativas de replicación viral) como
una tinción clara sobre el fondo negro. Tal y como se puede observar
este mareaje es visible después de la administración de
ICOVIR-5 y se incrementa su extensión después del
tratamiento con ICOVIR-5+verapamilo. (C) Se trataron
ratones nude con tumores xenógrafos de
SKMeI-28 con PBS, PBS combinado con administración
diaria de verapamilo (V) a 20 mg/kg i.p., o con una única dosis de
5x10^{10} vp de ICOVIR-5 solo o en combinación con
verapamilo. *, significativo (P<0,05) con respecto al grupo PBS;
\NAK, significativo con respecto al grupo PBS + V, y #,
significativo (P<0,05) con respecto al grupo tratado con
ICOVIR-5 solo, por el test t-Student a dos
colas para muestras desapareadas. (-\medbullet- = PBS;
-\blacksquare-= PBS+verapamilo; -\medcirc- = ICOVIR5;
-\boxempty- ICOVIR5+verapamilo). (D) comparación del tamaño de los
tumores xenógrafos humanos SKMeI-28 tratados con PBS
(a), PBS combinado con administración diaria de verapamilo a 20
mg/kg i.p. (b), con una única dosis de 5x10^{10} vp de
ICOVIR-5 solo (c) o en combinación con verapamilo
(d) obtenidos a día 52 post-administración del
virus.
Fig. 6 muestra el efecto del verapamilo,
temozolamida y everolimus (RAD001) en la difusión del Ad5 en células
A549, en base al tamaño de las calvas generadas. El verapamilo es el
que induce una mayor diseminación del
virus.
virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron de la American Type Culture
Collection (ATCC, Manassas, VA) las células embrionarias de riñón
humano HEK293 (CLR-1573), la línea de adenocarcinoma
pulmonar A549 (CCL-185), y la línea celular de
melanoma SKMeI-28 (HTB-72). La línea
celular tumoral pancreática NP-9, y la línea celular
de fibroblastos humanos asociados a carcinoma CAF1 se establecieron
siguiendo protocolos bien establecidos (cfr. Gros A et al.,
"Bioselection of a gain of function mutation that enhances
adenovirus 5 release and improves its antitumoral potency",
Cancer Research. 2008, vol. 68(21), pp.
8928-8937; Villanueva A. et al.,
"Disruption of the antiproliferative TGF-beta
signaling pathways in human pancreatic cáncer cells",
Oncogene, 1998, vol. 17(15), pp.
1969-1978.).
Las células se hicieron crecer en medio DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle's Médium) suplementado con 5% de suero
fetal bovino (FBS). La línea celular CAF1 se hizo crecer en DMEM:F12
(1:1) suplementado con 10% FBS y BD ^{TM}MITO^{+} serum extender
(Becton Dickinson, Erembodegem, Bélgica).
Todas las líneas se cultivaron a 37°C y 5%
CO_{2}. Para obtener una infección mínima del 80%, las células
A549, SKMeI-28, NP-9 y CAF1 se
infectaron respectivamente con 25, 35, 30 y 45 unidades de
transducción por célula (TU/célula).
En los experimentos en ausencia de calcio, se
utilizó un medio libre de calcio que contenía 200 mg/L MgSO_{4},
400 mg/L KCl, 6400 mg/L NaCl, 3700 mg/L NaHCO_{3}, 141 mg/L
NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O, 4500 mg/L D-glucosa
(SIGMA-ALDRICH, St Louis, MO), solución de
aminoácidos MEM (Invitrogene, Paisley, UK), solución de vitaminas
MEM (Invitrogene, Paisley, UK), solución de aminoácidos no
esenciales MEM (Invitrogene, Paisley, UK),
L-glutamina (Invitrogene, Paisley, UK) y 5% FBS.
Cuando el medio se usó como medio completo, se suplemento con 1,8 mM
de CaCl_{2}. Los fármacos verapamilo, amlodipino y diltiazem se
obtuvieron respectivamente de Abbot Laboratories (Abbot Park, IL),
Laboratorios Almirall (Barcelona, España) y Pfizer (New York,
NY).
El adenovirus tipo 5 humano (Ad5) se obtuvo de
ATCC (número UVR-1516).
El mutante dl732 que
sobre-expresa ADP (Scaria A. et al.,
"Fine-mapping of sequences that suppress splicing
in the E3 complex transcription unit of adenovirus",
Virology, 1994, vol. 205(2), pp.
406-416) y su correspondiente forma salvaje rec700
(Wold W. S. et al., "Evidence that AGUAUAUGA and CCAAGAUGA
initiate translation in the same mRNA región E3 of adenovirus",
Virology, 1986, vol. 148(1), pp.
168-180) fueron cedidas por el Dr. William S. M.
Wold (St. Louis University, USA).
El adenovirus mutante defectivo en la expresión
de ADP (AdADP^{-}) se construyó insertando una timina en la
posición 7 de la secuencia codificante para ADP del plásmido pAd5CAU
(Gros A. et al., "Bioselection of a gain of function
mutation that enhances adenovirus 5 release and improves its
antitumoral potency", Cancer Research, 2008, pp.
68(21), pp. 8928-8937). Dicha inserción
elimina la expresión de ADP al generar un codón de STOP en la
posición 3 de la secuencia aminoacídica de la proteína. La posterior
digestión del plásmido resultante de la inserción (pAdADP^{-}) con
PacI (New England Biolab, Beverly, MA (USA)) se usó
posteriormente para transfectar células 293.
El adenovirus de replicación condicional
ICOVIR-5
(Ad-DM-E2F-K-\Delta24-RGD)
y el control de virus nativo con igual modificación de tropismo
(AdwtRGD) han sido descritos previamente (Cascalló M. et al.,
"Systemic toxicity-efficacy profile of
ICOVIR-5, a potent and selective oncolytic
adenovirus based on the pRB pathway", Mol. Ther., 2007,
vol. 15(9), pp. 1607-1615).
Todos los virus se propagaron en células A549 y
el número de unidades de transducción (TU) de cada extracto se
cuantificó mediante un método basado en tinción
anti-hexon usando células 293 (Majem M. et
al., "Control of E1A under an E2F-1 promoter
insulated with the myotonic dystrophy locus insulator reduces the
toxicity of oncolytic adenovirus Ad-Delta24RGD",
Cancer Gene Therapy, 2006, vol. 13(7), pp.
696-705).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron experimentos preliminares
destinados a evaluar el efecto de dosis crecientes de verapamilo en
la liberación de Ad5 y su viabilidad celular. Para llevar a cabo los
experimentos de producción viral y liberación de adenovirus, en cada
tipo celular, se escogió la concentración de verapamilo que resultó
en la menor toxicidad y el mayor incremento en la liberación viral
(40 \muM de verapamilo para A549, NP-9 y CAF1, y
25 \muM para las células SKMeI-28).
Los cultivos de A549, SKMeI-28,
NP-9 y CAF1 se infectaron para conseguir un mínimo
de 80% de infección (véase sección anterior). Dos horas
post-infección los cultivos se lavaron dos veces
con tampón fosfato salino (PBS) y se incubaron con medio fresco o
medio que contenía verapamilo. Se recogieron, por triplicado,
sobrenadantes y suspensiones células-medio a
diferentes tiempos post-infección (a las 16, 24, 40,
48, 64 y 96 horas post-infección) y se cuantificó
la cantidad de virus en cada muestra por el método basado en tinción
anti-hexon usando células 293 (Majem M. et
al., citado más arriba).
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron con diluciones seriadas de Ad5,
rec700 o dl732 monocapas de células A549. Cuatro horas
post-infección se aspiró el medio, y los cultivos se
lavaron con PBS dos veces. Posteriormente se añadió una solución 1:1
de DMEM+10%FBS: 1% agarosa y, una vez solidificada ésta, se adicionó
medio fresco o suplementado con verapamilo 35 \muM. El ensayo se
tiñó el día 6-7 por incubación con 0,5 mg/ml de
bromuro de tiazol Azul tetrazolio (MTT) por un período de 3 horas a
37°C y 5% CO_{2}. Se tomaron fotografías representativas de las
calvas.
En el ensayo llevado a cabo para determinar el
efecto del verapamilo, temozolamida y everolimus (estos dos últimos
usados en la solicitud PCT WO 2007/103825) en la velocidad de
diseminación de Ad5, se usó el mismo protocolo pero a las siguientes
concentraciones: verapamilo 30 \muM, everolimus 10 nM,
temozolamida 10 \muM, dichas concentraciones siendo las necesarias
para ajustar el valor de IC10 (de manera que el cultivo retiene el
90% de viabilidad a lo largo del ensayo).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron 20.000 (SKMeI-28),
30.000 (A549) ó 10.000 (NP-9) células en medio
DMEM+5%FBS en ausencia o presencia de verapamilo a 20 \muM
(SKMeI-28) o 35 \muM (A549 y
NP-9), y se infectaron con diluciones 1/5 seriadas a
partir de 150 (SkMeI-28), 85 (A549) y 260
(NP-9) TU/célula, respectivamente. Al día 6
post-infección, las monocapas se lavaron con PBS, se
tiñeron usando el ensayo del ácido bicinconínico (Pierce
Biotechnology, Rockford, IL) y se determinó la absorbancia a 540 nm
con el fin de determinar la cantidad de proteína total. Se calculó
el valor IC_{50}, definido como el número de TU/célula necesario
para inducir una inhibición del 50% en el crecimiento versus el
control, a partir de las curvas dosis-respuesta por
regresión estándar no lineal usando una ecuación de Hill adaptada
(GraFit; Erithacus Software, Horley UK).
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron monocapas de células A549
(1,5x10^{6} células) en las condiciones indicadas en el punto (2)
anterior, de manera que se provocara un 80% de infección. Dos horas
post-infección, los cultivos se lavaron dos veces
con PBS y se incubaron con medio fresco DMEM + 5% FBS o suplementado
con verapamilo a 40 \muM. En los tiempos de 16, 24, 40 y 48 horas
después de la infección, las células control o infectadas con Ad5 se
tripsinizaron y, a continuación, se lavaron con PBS obteniéndose,
finalmente, lisados celulares usando el tampón
Iso-Hi-pH (0,14 M NaCl, 1 mM
MgCl_{2}, 10 mM Tris-HCl [pH 8.5] y 0,5% Nonidet
P-40). Se separaron electroforéticamente muestras
proteicas (20 \mug/carril) en geles SDS-PAGE al
10%, y las proteínas se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa (Schleicher and Schuell, Dassel, Germany). Después de
su bloqueo con leche no grasa al 5% en 0,05% Tween 20, 0,9% NaCl y
50 mM Tris (pH 7,5), la membrana se incubó con anticuerpo primario
anti-Ad2 E1A (clon 13S-5, Santa Cruz
Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), anti-E3/19K
(Tw1.3 (Cox J. H. et al., "Retention of adenovirus E19
glycoprotein in the endoplasmic reticulum is essential to its
ability to block antigen presentation", The Journal of
experimental medicine, 1991, vol. 174(6), pp.
1629-1637) cedido gentilmente por el Dr. Yewdell,
(NIAID/NIH, USA), anti-L4/100K (clon 7/199 cedido
gentilmente por el Dr. W.C. Russel, St. Andrews University, St.
Andrews, UK), anti-Adenovirus Fiber
A-4 mAb (clone 4D2 Fitzgerald Industries
International Inc, Concord, MA) o con anticuerpo
anti-human PARP (Poly-(ADP ribose) Polymerase) (clon
#551024, Becton Dickinson).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los estudios en animales de
experimentación se realizaron en las instalaciones del Institut
d'Investigació Biomédica de Bellvitge, IDIBELL, en Barcelona (unidad
AAALAC 1155) y los protocolos se aprobaron por el Comité de
Experimentación Animal del IDIBELL.
A ratones inmunocompetentes BalbC machos
(Charles River) de 6 semanas de edad se les inyectó
intravenosamente, por la vena de la cola, PBS, 5x10^{10} vp
(partículas físicas) de AdwtRGD (n= 5 animales/grupo), 5x10^{10}
vp ó 1x10^{11 } vp de ICOVIR-5 (n= 10
animales/grupo) en un volumen final de 200 \mul. A partir del día
1 post-inyección, un subgrupo de los animales
tratados con 5x10^{10} vp ó 1x10^{11} vp de
ICOVIR-5 (n= 5 animales/grupo) recibieron una dosis
diaria de verapamilo 20 mg/mL por vía intraperitoneal. Se monitorizó
el peso corporal de los ratones y los animales fueron observados
diariamente controlando la presencia de signos de morbididad. El día
5 post-administración (día 3 para el grupo tratado
con AdwtRGD) los animales se sacrificaron y se obtuvo sangre por
punción intracardíaca. Se realizó un estudio bioquímico completo de
las muestras sanguíneas en el Servicio de Bioquímica Clínica de la
Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona
(UAB). Los hígados murinos también se recogieron y fijaron en formol
(para su inclusión en parafina y posterior tinción por
eosina/hematoxilina) o se congelaron inmiscuidos en un medio
específico para congelación de tejidos OCT (Sakura Finetek) para
realizar tinciones por inmunofluorescencia anti-E1A
sobre hígado congelado tal y como ha sido descrito por Majem y
colaboradores (Majem et al., "Control of E1A under an
E2F-1 promoter insulated with the myotonic dystrophy
locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenovirus
Ad-Delta24RGD", Cancer Gene Therapy, 2006,
vol. 13(7), pp. 696-705).
\vskip1.000000\baselineskip
Se establecieron tumores xenógrafos subcutáneos
de células A549 ó SKMeI-28 por inoculación de
1x10^{7} células en los flancos de ratones Balb/C nu/nu (Harían)
de 6 semanas. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 100
mm^{3}, se randomizaron los animales y se trataron con PBS o con
5x10^{10} vp de ICOVIR-5 (n= 24 animales/grupo) en
un volumen final de 0,2 mL. A partir del día 1
post-inyección, un subgrupo de los animales tratados
con PBS o de los tratados con 5x10^{10} vp de
ICOVIR-5 (n= 12 animales/grupo) recibieron una dosis
diaria de verapamilo 20 mg/ml vía intraperitoneal hasta el día final
del experimento (día 52 para tumores SkMeI-28 y día
37 para tumores A549). El tamaño tumoral y el peso corporal de los
ratones se monitorizó en intervalos de 3-4 días.
Para el cálculo del volumen de los tumores y el porcentaje de
crecimiento se usó la metodología descrita por Cascalló y
colaboradores (Cascalló M. et al., "Systemic
toxicity-efficacy profile of
ICOVIR-5, a potent and selective oncolytic
adenovirus based on the pRB pathway", Mol. Ther., 2007,
vol. 15(9), pp. 1607-1615). Muestras
tumorales de cada grupo (2 tumores/grupo) se fijaron en formol y se
congelaron en OCT para su posterior análisis de replicación viral
mediante inmunotinción anti-adenovirus a día 13 o
día 18 post-administración para los tumores A549 y
SKMeI-28 respectivamente, tal y como ha sido
descrito previamente por Gros y colaboradores (Gros A. et
al., "Bioselection of a gain of function mutation that
enhances adenovirus 5 release and improves its antitumoral
potency", Cancer Research, 2008, vol. 68(21), pp.
8928-8937.).
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de los experimentos in vitro se
testaron por significancia estadística mediante el test
t-Student. Este mismo test se utilizó para la
comparación de la progresión tumoral en ratón entre los distintos
grupos de tratamiento. Los valores p corresponden a análisis con 2
colas.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objetivo de evaluar si el agente
bloqueador de canales de calcio verapamilo era capaz de incrementar
la liberación de Ad5, se determinó el efecto del verapamilo en la
liberación y producción de Ad5 en la línea celular de adenocarcinoma
de pulmón humana A549. Tal y como muestra la Fig. 1A, pese a que el
rendimiento viral total fue el mismo (es decir, se produjo la misma
cantidad de partículas víricas), tanto en ausencia como en presencia
de verapamilo 40 \muM, se produjo un incremento de 30 veces en la
liberación de virus al medio extracelular a las 40 h
post-infección cuando se combinó con verapamilo.
Este fenotipo se confirmó en una variedad de tipos celulares. Así,
la adición de verapamilo resultó también en una liberación más
rápida de Ad5 en fibroblastos humanos asociados a carcinoma (CAF1),
en la línea celular de melanoma SKMeI-28 y en la
línea tumoral pancreática NP-9 (Fig. 1B).
La liberación temprana en estas condiciones
mejoró la diseminación célula-célula, tal y como se
demuestra por el tamaño de las calvas en un ensayo de formación de
calvas en A549. En presencia de verapamilo, las calvas generadas por
Ad5 aparecieron antes y fueron mayores que las calvas control (Fig.
1C). Adicionalmente, la adición de verapamilo confirió una mayor
citotoxicidad al Ad5, de forma que la cantidad de Ad5 necesaria para
reducir la viabilidad celular en un 50% (valor IC_{50}) resultó
ser 4 veces, 3 veces y hasta 100 veces menor en las células
SKMeI-28, NP-9 y A549
respectivamente (Fig. 1D). Los resultados de IC5o obtenidos para
cada una de las líneas tumorales ensayadas se resumen en la
siguiente tabla (Tabla 1):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En conclusión, con los resultados obtenidos se
confirma que la adición de un bloqueante de canales de calcio
provoca la liberación temprana de partículas adenovíricas, dichas
partículas, además, siendo liberadas más rápidamente. Esto provoca
que la diseminación célula-célula sea mayor. La
consecuencia es que con la misma cantidad de virus se consigue un
mayor efecto terapéutico. Todo esto provoca un aumento de la
citotoxicidad del adenovirus, siendo necesaria una menor cantidad
del mismo para conseguir el efecto terapéutico (i.e., actividad
oncolítica) deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objetivo de estudiar los efectos del
verapamilo en el patrón de expresión proteico del Ad5, se analizó la
expresión de proteínas tempranas (early) y tardías
(late) en presencia y ausencia de verapamilo. Tal y como
ilustra la Fig. 2A, no se aprecian diferencias en el patrón de
expresión de las proteínas E1 A, E3/19K ni en las proteínas tardías
L4-100K y fibra cuando se combinó la infección con
la incubación con verapamilo, lo que demuestra que el verapamilo no
tiene ningún efecto en la expresión de proteínas del adenovirus.
La importancia otorgada al calcio intracelular
en la regulación de la apoptosis, junto con el hecho de que la
activación de la apoptosis sea capaz de conferir fenotipo de calva
grande al Ad5 de forma análoga a la observación hecha en presencia
de verapamilo, llevó a los investigadores de la presente invención a
estudiar el estado de activación de la apoptosis en presencia de
este bloqueante de calcio. Tal y como demuestra la Fig. 2B, el nivel
de truncación de PARP (considerado un indicador de activación de
apoptosis: si existe apoptosis se detecta la forma PARP truncada) a
lo largo de la infección de las células A549 con Ad5 solo o en
combinación con verapamilo 40 \muM fue muy similar. Esto demuestra
que el verapamilo no induce apoptosis y consecuentemente el fenotipo
de calva grande de Ad5 en presencia de verapamilo no está mediado
portal mecanismo.
\vskip1.000000\baselineskip
A pesar que el mecanismo exacto que desencadena
la liberación del adenovirus es desconocido, la proteína viral ADP
desarrolla un papel relevante en este proceso, ya que los virus
mutantes en ADP muestran un defecto en la liberación viral, sin que
ello afecte a la producción viral total. Además, también se ha
descrito que la sobre-expresión de ADP es capaz de
mejorar la diseminación del adenovirus y conferirle mayor
citotoxicidad.
Para evaluar la dependencia de ADP, en presencia
de verapamilo, del fenotipo del Ad5, los investigadores de la
presente invención analizaron la liberación viral de AdADP^{-},
virus defectivo en la expresión de ADP, solo o en combinación con
verapamilo 40 \muM, en células A549. Tal y como muestra la Fig.
2C, AdADP^{-} presentó una liberación disminuida en comparación
con Ad5, tal y como ya había sido descrito (Tollefson A. E. et
al., "The E3-11.6-kDa
adenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death:
characterization of cells infected with adp mutants",
Virology, 1996, vol. 220(1), pp.
152-162). Cabe destacar que la incubación de las
células A549 infectadas con AdADP^{-} con verapamilo 40 \muM
resultó en un incremento de la liberación del mutante defectivo.
Así, pese a que el incremento de la liberación de AdADP^{-} estaba
retrasado en comparación con el observado con Ad5 + verapamilo (64
h. post-infección para AdADP^{-}, frente a 40 h
post-infección para Ad5), la presencia del
bloqueador de calcio incrementó la liberación de los dos virus en el
mismo grado (aproximadamente 30 veces) (Fig. 2C). Este hecho
demuestra no sólo que el fenotipo inducido por verapamilo no
requiere de la proteína ADP, sino que el verapamilo induce una nueva
ruta que redunda en una mayor liberación del adenovirus. Puesto que
el efecto del verapamilo en la liberación viral es independiente de
ADP, combinamos la incubación de verapamilo con el virus
dl732, otro mutante adenoviral que presenta liberación
incrementada por sobre-expresión de ADP, con la
finalidad de evaluar si se podía incrementar todavía más su fenotipo
de liberación mejorada. La adición de verapamilo al ensayo de
formación de calvas de dl32 en células A549 resultó en la
generación de calvas de dimensiones todavía mayores a las del virus
solo (Fig. 2D), lo que demuestra que los efectos de la
sobre-expresión de ADP y verapamilo en la liberación
del adenovirus son independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objetivo de estudiar si la actividad
bloqueadora de canales de calcio del verapamilo es la causante de la
liberación temprana de virus en las células infectadas, se ensayó la
liberación del Ad5 en presencia de un miembro de la familia de las
dihidropiridinas (amlodipino) y de un miembro de la familia de las
benzotiazepinas (diltiazem). De forma análoga a lo observado con
verapamilo, el Ad5 presentó una tamaño de calva mayor que el
control, y una liberación al sobrenadante incrementada a las 40
horas post-infección cuando se combinó tanto con
amlodipino como con diltiazem en las células A549 (Fig. 3A y 3B).
Este resultado sugiere que es la actividad bloqueadora de calcio,
común en los tres fármacos, la responsable de la inducción de
liberación temprana en el Ad5. Los experimentos de análisis de la
liberación y producción total realizados en un medio en ausencia de
calcio aportaron evidencias adicionales de la dependencia de la
actividad bloqueadora de calcio en este fenotipo. La deprivación
extracelular de calcio también mejoró la liberación del Ad5 sin
afectación de la producción total de virus (Fig. 3C), sugiriendo
nuevamente que es la función sobre los canales de calcio la
responsable del incremento en la liberación del adenovirus.
\vskip1.000000\baselineskip
Los investigadores de la presente invención
habían descrito previamente que el adenovirus oncolítico
ICOVIR-5
(As-DM-E2F-K-\Delta24RGD)
presentaba un perfil de toxicidad seguro (después de la
administración por vía sistémica) debido al control de la expresión
del gen E1A-\Delta24 por parte del promotor E2F
(Cascalló M. et al., "Systemic
toxicity-efficacy profile of
ICOVIR-5, a potent and selective oncolytic
adenovirus based on the pRB pathway", Mol. Ther., 2007,
vol. 15(9), pp. 1607-1615). La combinación de
ICOVIR-5 y verapamilo incrementó su citotoxicidad en
las líneas A549 y NP-9 in vitro. El valor
IC_{50} (TU/células necesarias para causar una pérdida del 50% de
la viabilidad del cultivo) de ICOVIR-5 en A549 y
NP-9 es de 0,69 y 4,96 respectivamente, mientras que
la presencia de verapamilo los redujo a 0,067 y 3,2.
Una vez confirmado el efecto del incremento de
citotoxicidad del verapamilo sobre ICOVIR-5, se
pasaron a establecer los efectos que tiene el verapamilo en la
selectividad de ICOVIR-5. Para ello se usó un modelo
de ratón inmunocompetente (según sección (6) anterior) in
vivo después de la administración endovenosa del virus y la
inyección intraperitoneal del fármaco. Se evaluó la toxicidad
después de una dosis única intravenosa de 5x10^{10} vp ó de
1x10^{11} vp de ICOVIR-5 solo o en combinación con
dosis diarias de verapamilo a 20 mg/kg en un ratón Balb/C
inmunocompetente en comparación con la toxicidad obtenida después de
una inyección sistémica única de 5x10^{10} vp de AdwtRGD (como
control de virus no selectivo). Los parámetros que se monitorizaron
incluyeron la pérdida de peso corporal de los animales, los niveles
de enzimas hepáticos (AST, aspartato aminotransferasa; ALT, alanina
aminotransferasa), así como el perfil hematológico a día 5 después
de la administración del virus (día 3 después de la administración
para el grupo inyectado con AdwtRGD). Los ratones tratados con
5x10^{10} vp ó de 1x10^{11} vp de ICOVIR-5 en
combinación con verapamilo diario mostraron una variación de peso
corporal similar a la obtenida con los grupos tratados con
ICOVIR-5 solo tal y como se ilustra en la Tabla
2:
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunotinción anti-E1A de la
secciones de hígado congeladas correspondientes a ratones tratados
con 5x10^{10} vp de ICOVIR-5 solo o en combinación
con verapamilo mostró en ambos casos una restricción efectiva en la
expresión de E1A a día 5 post-inyección (Fig. 4A).
Además, los niveles de AST y ALT de los animales inyectados con
ICOVIR-5 no se vieron afectados por el tratamiento
concomitante diario con verapamilo (Fig. 4B). La administración
combinada de verapamilo con 5x10^{10} vp ó 1x10^{11} vp de
ICOVIR-5 tampoco modificó el recuento de plaquetas y
linfocitos cuando se comparó con el obtenido con
ICOVIR-5 solo. Esto contrasta con las reducciones
obtenidas en el grupo de animales tratados con AdwtRGD (Fig.
4C).
En conjunto, los resultados obtenidos indican
que la administración diaria de verapamilo no incrementa la
toxicidad de ICOVIR-5 con independencia de la dosis
de virus administrada. Adicionalmente, se puede concluir que el
verapamilo mantiene la selectividad asociada con la presencia del
promotor E2F para el gen E1A en ICOVIR-5.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez demostrado que la combinación de
verapamilo y ICOVIR-5 incrementa la citotoxicidad
in vitro, y mantiene la seguridad después de la
administración sistémica del virus, el siguiente paso fue determinar
si la combinación también ofrece una ventaja en términos de eficacia
antitumoral en comparación con la administración de
ICOVIR-5 solo. Para este objetivo se administró una
inyección única de 5x10^{10} vp de ICOVIR-5 por
vía sistémica en ratones nude (Harlan) con tumores xenógrafos
subcutáneos de adenocarcinoma de pulmón A549 y de melanoma
SKMeI-28. A partir del día 1
post-inyección, la mitad de los ratones de los
grupos tratados con PBS y ICOVIR-5 fueron pautados
para inyección intraperitoneal diaria de verapamilo a 20 mg/kg (n=12
tumores/grupo), y se controló el crecimiento tumoral y el peso
corporal de los animales de forma periódica para evaluar la
actividad antitumoral. Tal y como se muestra en la Fig. 5A, la
combinación de ICOVIR-5 con verapamilo fue más
eficiente en el control del crecimiento de los tumores A549
subcutáneos in vivo. Esta mejora del efecto antitumoral
correlaciona con una presencia más difusa del virus en la masa
tumoral, tal y como se aprecia en la inmunotinción
anti-adenovirus de secciones tumorales obtenidas a
día 13 post-inyección (Fig. 5B), lo que sugiere que
la diseminación intratumoral de ICOVIR-5 mejora en
presencia del bloqueador de canales de calcio. Igualmente, frente al
discreto efecto sobre el crecimiento antitumoral obtenido al tratar
los tumores xenógrafos subcutáneos de SKMeI-28 con
ICOVIR-5, la combinación de ICOVIR-5
y verapamilo mostró un marcado control del crecimiento tumoral en
este modelo (reducción de 6 veces en el crecimiento con respecto al
grupo PBS) (Fig. 5C y 5D). El efecto antitumoral mejorado de la
combinación de ICOVIR-5 y verapamilo en dos modelos
tumorales xenógrafos distintos confirma los beneficios del uso de
este fármaco para incrementar el potencial terapéutico de los
adenovirus oncolíticos.
Claims (12)
1. Combinación que comprende dos
componentes:
(a) el primer componente comprende un bloqueador
de canal de calcio junto con excipientes o portadores
farmacéuticamente aceptables; y
(b) el segundo componente comprende un
adenovirus oncolítico junto con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Combinación según la reivindicación 1, en
donde el componente (a) se administra una vez al día.
3. Combinación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, en donde el componente (a) se
administra posteriormente a la administración del componente
(b).
4. Combinación según la reivindicación 3, en
donde se administra en primer lugar una única dosis del componente
(b) y posteriormente se administra una o varias dosis del componente
(a).
5. Combinación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en donde tanto el componente
(a) como el componente (b) se administran por vía sistémica.
6. Combinación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en donde el componente (a) se
administra por vía oral y el componente (b) se administra por vía
intratumoral.
7. Combinación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde el bloqueador de canal
de calcio se selecciona del grupo formado por verapamilo, amlodipino
y diltiazem.
8. Combinación según la reivindicación 7, donde
el bloqueador del canal de calcio es el verapamilo.
9. Combinación según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en donde el adenovirus contiene una
secuencia de DNA humano aislando a un promotor que confiere
expresión selectiva a un gen adenoviral.
10. Kit que comprende la combinación definida en
cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y
instrucciones para su uso.
11. Combinación según se define en cualquiera de
las reivindicaciones 1-9 para uso separado o
secuencial en el tratamiento del cáncer.
12. Bloqueador de canal de calcio para uso como
agente potenciador de la actividad antitumoral de un adenovirus
oncolítico.
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| ES200900866A ES2355882B1 (es) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | Combinación de adenovirus oncolítico y un bloqueador de canal de calcio y su uso para el tratamiento del cáncer. |
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| ES200900866A ES2355882B1 (es) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | Combinación de adenovirus oncolítico y un bloqueador de canal de calcio y su uso para el tratamiento del cáncer. |
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| ES2355882B1 ES2355882B1 (es) | 2012-02-13 |
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| ES200900866A Withdrawn - After Issue ES2355882B1 (es) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | Combinación de adenovirus oncolítico y un bloqueador de canal de calcio y su uso para el tratamiento del cáncer. |
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