ES2355942T3

ES2355942T3 - Uso de disulfuro de dimetilo para la producción de metionina en microorganismos.

Info

Publication number: ES2355942T3
Application number: ES06800107T
Authority: ES
Inventors: Oskar Zelder; Stefan Haefner; Andrea Herold; Corinna Klopprogge; Hartwig Schroder; R. Rogers Yocum; Mark K. Williams
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2011-04-01
Anticipated expiration: 2026-07-18
Also published as: CN101223280B; ZA200801496B; CN101223280A

Abstract

Un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, de manera que se produce metionina, en el que a)el compuesto de sulfuro rematado con metilo se selecciona del grupo que consiste en disulfuro de dimetilo (DMDS), trisulfuro de dimetilo, tetrasulfuro de dimetilo, b)el microorganismo productor de metionina se selecciona del grupo que consiste en bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas, levaduras y Archaea, c)el microorganismo productor de metionina tiene al menos una enzima biosintética de metionina desregulada, seleccionada del grupo que consiste en c1)una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa u O-succinil-homoserina sulfhidrilasa desregulada c2)una homoseriana acetiltransferasa u homoserina succiniltransferasa desregulada y una homoserina deshidrogenasa desregulada c3)una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y una homoserina acetiltransferasa desregulada o una O-succinil-homoserina sulfihídrilasa desregulada y una homoserina succiniltransferasa desregulada.

Description

Uso de disulfuro de dimetilo para la producción de metionina en microorganismos.

Antecedentes de la invención

Metionina se produce actualmente en forma de una mezcla racémica de DL-metionina por un proceso químico bien establecido que implica materiales o compuestos intermedios tóxicos, peligrosos, inflamables, inestables y nocivos. Los materiales de partida para la producción química de metionina son acroleína, metilmercaptano y cianuro de hidrógeno. La síntesis química de metionina implica la reacción de metilmercaptano y acroleína, para producir el compuesto intermedio 3-metilmercaptopropionaldehído (MMP). El tratamiento ulterior implica hacer reaccionar MMP con cianuro de hidrógeno para formar 5-(2-metiltoetil)hidantoina, que luego se hidroliza utilizando productos cáusticos tales como NaOH, junto con Na_{2}CO_{3}, NH_{3} y CO_{2}. Subsiguientemente, DL-metionina sódica se neutraliza con ácido sulfúrico y Na_{2}CO_{3} para proporcionar DL-metionina, Na_{2}SO_{4} y CO_{2}. Este proceso proporciona un gran exceso de compuestos no utilizados en comparación con la cantidad de metionina producida, que plantea un reto económico y ecológico.

Procesos fermentativos para la producción de metionina se basan típicamente en el cultivo de microorganismos con nutrientes que incluyen fuentes de hidratos de carbono, p. ej. azúcares tales como glucosa, fructosa o sacarosa, fuentes de nitrógeno, p. ej. amoníaco y fuentes de azufre, p. ej. sulfato o tiosulfato junto con otros componentes del medio necesarios. Este proceso proporciona L-metionina y biomasa como un subproducto sin materiales de partida tóxicos, peligrosos, inflamables, inestables y/o nocivos.

Sin embargo, con el fin de que un organismo (p. ej. un microorganismo) produzca metionina a partir de sulfato en calidad de fuente de azufre, el átomo de azufre debe de ser reducido primeramente en sulfuro. Este proceso consume energía, de modo que la alimentación de una fuente de azufre al microorganismo, que es más reducida que el sulfato, mejoraría el proceso. Una fuente de azufre reducida de este tipo es tiosulfato, en el que uno de los dos átomos de azufre ya está reducido. Otra fuente de azufre reducido es metano-tiol, que contiene un átomo de azufre totalmente reducido.

J. Mampel et al. describen en Appl. Microbiol. Biotechnol. (2005) 68: 228-236, publicado en línea el 25 de enero del 2005, que la inactivación de NCgI2640 daba como resultado una producción significativamente incrementada de metionina. Utilizando fusiones lacZ promotoras de genes implicados en el metabolismo del azufre, demostraron el alivio de la represión de L-metionina en el mutante NCgI2640 para la cisteína sintasa, o-acetilhomoserina sulfhidrilasa (metY) y sulfito reductasa. La complementación de la cepa mutante con NCgI2640 portador de plásmidos restauraba el fenotipo de tipo salvaje para metY y sulfito reductasa.

El uso de metano-tiol para la producción de metionina ofrece dos ventajas. La primera, como se ha mencionado antes, el átomo de azufre ya está reducido. La segunda, se suministra un grupo metilo que podría eludir potencialmente la necesidad de dos de las enzimas que normalmente se requieren para la biosíntesis de metionina, metiltetrahidrofolato reductasa (MetF) y metionina sintasa (MetE y/o MetH). Existen informes en la bibliografía que describen que algunos microorganismos, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, pueden incorporar enzimáticamente metano-tiol directamente en metionina, haciéndola reaccionar con O-acetil homoserina (Yamagata, S. 1971, J. Biochem. (Tokyo) 70:1035). Métodos para el uso de metano-tiol en la producción de metionina se describen también en los documentos WO 93/17112 y WO 2004/076659.

Sin embargo, el uso de metano-tiol para la producción de metionina tiene también inconvenientes. Es un gas explosivo y tóxico que se oxida fácilmente en el aire, y es nocivo. El proceso químico para producir metionina también utiliza metano-tiol como uno de los sustratos, de manera que los ingenieros han aprendido a manipular el compuesto a escala industrial. No obstante, serían de gran beneficio procedimientos mejorados para la producción de metionina que no utilicen metano-tiol.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para la producción de metionina. Los autores de la presente invención han descubierto una fuente de grupos azufre y/o metilo distinta de metano-tiol que puede utilizarse para la producción de metionina. En particular, los autores de la presente invención han descubierto que disulfuro de dimetilo (DMDS - siglas en inglés), al que también se alude como disulfuro de metilo o CH_{3}-S-S-CH_{3}, se puede añadir a medios de cultivo y utilizar por parte de un microorganismo como una fuente tanto de un grupo sulfuro como de un grupo metilo, eludiendo la necesidad de una actividad MetH/MetE y MetF y la necesidad de reducir el sulfato para la síntesis de metionina.

Además, la presente invención demuestra que un microorganismo que tiene una vía de biosíntesis de metionina desregulada, p. ej. una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y/o una homoserina acetiltransferasa desregulada y/o una homoserina deshidrogenasa desregulada, puede utilizar un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), para la síntesis de metionina. Además, los autores de la invención han descubierto que la producción de metionina mediante cepas prototróficas tratadas mediante ingeniería genética que acumulan O-acetil-homoserina, es mejorada mediante la adición de
DMDS.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención ofrece un método para la producción de metionina, que comprende cultivar un microorganismo en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), de manera que se produce metionina. En una realización, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en el cultivo a una concentración de 0,02% o superior. En otra realización, el compuesto de sulfuro rematado por metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en el cultivo a una concentración de 0,06% o mayor. En otras realizaciones, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. la fuente de azufre y/o metilo, se selecciona del grupo que consiste en trisulfuro de dimetilo (DMTS - siglas en inglés) o CH_{3}-S-S-S-CH_{3}, tetrasulfuro de dimetilo (DMTTS - siglas en inglés) o CH_{3}-S-S-S-SCH_{3}.

Otro aspecto de la invención ofrece un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. un sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS), de manera que se produce metionina. En una realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de azufre y/o metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es Amberlite^{TM} XAD4. En una realización, el sistema de suministro de liberación lenta libera DMDS a una concentración que totaliza 0,1% o mayor en el medio de cultivo. Todavía en otra realización, el sistema de suministro de liberación lenta libera DMDS a una concentración que totaliza 0,3% o mayor en el medio de cultivo. En una realización, el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende un líquido que es inmiscible con agua, pero que disuelve DMDS. En una realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. un sistema de suministro de DMDS de liberación lenta, comprende un líquido seleccionado del grupo que consiste en aceites animales, aceites minerales, aceites químicos, aceites vegetales, aceites sintéticos, un disolvente orgánico, clorocarburos, fluorocarburos, cloro-fluoro-carburos, o combinaciones de los mismos. En otra realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. el sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. un sistema de suministro de DMDS de liberación lenta, comprende un líquido que es inmiscible con agua, pero que disuelve el compuesto disulfuro rematado con metilo, p. ej. la fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS. Todavía en otra realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado por metilo de liberación lenta, p. ej. el sistema de suministro de un grupo de azufre y/o metilo, p. ej. un sistema de suministro de liberación lenta de DMDS, es una alimentación lenta controlada de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. una alimentación de DMDS lenta controlada. En otra realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. el sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta, es una membrana que es permeable a un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS. En otra realización, el sistema de liberación lenta de DMDS está suministrando DMDS en un estado gaseoso, por ejemplo al evaporar o calentar hasta ebullición DMDS líquido o, por ejemplo, burbujeando aire u oxígeno a través de DMDS líquido en su recorrido al recipiente de fermentación. En una realización, el microorganismo productor de metionina pertenece al género Corynebacterium. En otra realización, el microorganismo productor de metionina es Corynebacterium glutamicum. Todavía en otra realización, el microorganismo productor de metionina se selecciona del grupo que consiste en bacterias Gram-negativas (p. ej. Escherichia coli o enterobacterias relacionadas), bacterias Gram-positivas (p. ej. Bacillus subtilis o bacilos relacionados), levaduras (p. ej. Saccharomyces cerevisiae o cepas de levaduras relacionadas), y
Archaea.

La invención está dirigida a un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, de manera que se produce metionina, en el que

a): el compuesto de sulfuro rematado con metilo se selecciona del grupo que consiste en disulfuro de dimetilo (DMDS), trisulfuro de dimetilo, tetrasulfuro de dimetilo,

b): el microorganismo productor de metionina se selecciona del grupo que consiste en bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas, levaduras y Archaea,

c): el microorganismo productor de metionina tiene al menos una enzima biosintética de metionina desregulada, seleccionada del grupo que consiste en

c1): una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa u O-succinil-homoserina sulfihidrilasa desregulada

c2): una homoseriana acetiltransferasa u homoserina succiniltransferasa desregulada y una homoserina deshidrogenasa desregulada

c3): una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y una homoserina acetiltransferasa desregulada o una O-succinil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y una homoserina succiniltransferasa desregulada.

Otro aspecto de la invención ofrece un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo que tiene una vía biosintética de metionina desregulada, en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), de modo que se produce metionina. En una realización, el microorganismo pertenece al género Corynebacterium. En otra realización, el microorganismo es Corynebacterium glutamicum. Todavía en otra realización, el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias Gran-negativas (p. ej. Escherichia coli o enterobacterias relacionadas), bacterias Gram-positivas (p. ej. Bacillus subtilis o bacilos relacionados), levaduras (p. ej. Saccharomyces cerevisiae o cepas de levaduras relacionadas), y Archaea.

Otro aspecto de la descripción ofrece un microorganismo recombinante para la producción de metionina en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), teniendo dicho microorganismo una vía biosintética de metionina desregulada. En un aspecto, el microorganismo pertenece al género Corynebacterium. En otro aspecto, el microorganismo es Corynebacterium glutamicum. Todavía en otro aspecto, el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias Gran-negativas (p. ej. Escherichia coli o enterobacterias relacionadas), bacterias Gram-positivas (p. ej. Bacillus subtilis o bacilos relacionados), levaduras (p. ej. Saccharomyces cerevisiae o cepas de levaduras relacionadas), y
Archaea.

Todavía otro aspecto de la descripción ofrece un método para identificar enzimas O-acetilhomoserina sulfhidrilasa y/u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa resistentes a la retroalimentación por metionina, y/o genes (p. ej. genes o alelos mutantes) que codifican dichas enzimas resistentes a la retroalimentación de metionina. En un aspecto, la descripción ofrece un método para identificar un alelo mutante que codifica una O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa que es resistente a la inhibición de la retroalimentación por parte de metionina, que comprende: a) poner en contacto un microorganismo que depende de DMDS y O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa codificada por un plásmido, para el crecimiento en un medio exento de metionina con un análogo de metionina que inhibe el crecimiento de dicho microorganismo, b) seleccionar variantes mutantes de dicho microorganismo que son resistentes a dicho análogo, c) aislar dichas variantes mutantes, en donde el fenotipo resistente es codificado por dicho plásmido y d) determinar la secuencia de ADN de la porción relevante de dicho plásmido para identificar plásmidos mutantes que tienen una secuencia alterada en la región codificadora de dicha O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa. La descripción también ofrece nuevas enzimas O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa mutantes, aisladas por este método, genes que codifican a dichas enzimas mutantes, así como organismos que contienen a dichas enzimas
mutantes.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de la vía biosintética de metionina. Las enzimas biosintéticas de metionina se representan en negrilla y sus genes correspondientes se indican en cursivas.

La Figura 2 es una vista esquemática del vector pH273.

La Figura 3 es una vista esquemática del vector pH373.

La Figura 4 es una vista esquemática del vector pH304.

La Figura 5 es una vista esquemática del vector pH399.

La Figura 6 es una vista esquemática del vector pH484.

La Figura 7 es una vista esquemática del vector pH491.

Las Figuras 8A-8B son representaciones esquemáticas de la estructura del cromosoma de C. glutamicum en la región de metY antes (8A) y después (8B) de la deleción de una parte de metY utilizando el plásmido H215.

La Figura 9 es una vista esquemática del vector pOM86, un plásmido diseñado para interrumpir el gen metF de C. glutamicum con una casete de resistencia a espectinomicina.

La Figura 10 es una vista esquemática del vector pH469.

La Figura 11 es una vista esquemática del vector pH300.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de métodos mejorados para la producción de metionina. Según se describe en esta memoria, la producción de metionina por métodos químicos utiliza actualmente productos químicos nocivos y peligrosos tales como metano-tiol, como una fuente de azufre. Se ha descubierto que para la producción biosintética de metionina se puede utilizar una fuente de azufre menos peligrosa y nociva. En particular, los autores de la presente invención han descubierto que un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), al que también se alude como disulfuro de metilo, se puede añadir a un medio de cultivo y utilizar por parte de un microorganismo. Según se describe en los ejemplos adjuntos, una cepa \DeltametF o una cepa \DeltametE \DeltametH de C. glutamicum puede utilizar un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), en calidad de una fuente tanto de un grupo sulfuro como de un grupo metilo, evitando la necesidad de la actividad de MetH/Met E y MetF y la necesidad de reducir el sulfato para la síntesis de
metionina.

El uso de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de metilo, para la producción de metionina, ofrece la mayoría de las ventajas del metano-tiol, pero no la mayoría de los inconvenientes. DMDS es el dímero disulfuro oxidado de metano-tiol, que es un subproducto relativamente económico de la industria de la destilación del petróleo. Es líquido a la temperatura ambiente, con un punto de ebullición de aproximadamente 109ºC. DMDS es apenas soluble en agua; si se añade a un medio de crecimiento, a una concentración de 0,1% o mayor, en particular a una concentración de 0,3% o mayor, gran cantidad del DMDS permanece en forma de un aceite en el fondo o en los lados del recipiente.

Además, la presente invención demuestra que MetY (a la que también se alude como MetZ; O-acetil-homoserina sulfhidrilasa) es una enzima que incorpora un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo sulfuro y/o metilo, p. ej. DMDS, directa o indirectamente en metionina, dado que una cepa \DeltametF \DeltametB de C. glutamicum puede utilizar un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, en calidad de una fuente tanto de un grupo sulfuro como de un grupo metilo. Además, la producción de metionina mediante cepas prototróficas tratadas mediante ingeniería genética que acumulan O-acetil-homoserina se mejoró mediante la adición de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS.

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para la producción de metionina.

Con el fin de entender más fácilmente la presente invención, se definen primeramente en esta memoria determinados términos y expresiones.

La expresión "vía biosintética de metionina" incluye la vía biosintética que implica enzimas biosintéticas de metionina (p. ej. polipéptidos codificados por genes que codifican enzimas biosintéticas), compuestos (p. ej. precursores, sustratos, compuestos intermedios o productos), co-factores y similares utilizados en la formación o la síntesis de metionina. La "vía biosintética de metionina" incluye la vía biosintética que conduce a la síntesis de metionina en un microorganismo (p. ej. in vivo), así como la vía biosintética que conduce a la síntesis de metionina in vitro.

La expresión "enzima biosintética de metionina" incluye cualquier enzima utilizada en la formación de un compuesto (p. ej. un compuesto intermedio o producto) de la vía biosintética de metionina. "Enzima biosintética de metionina" incluye enzimas implicadas, p. ej. en la "vía de transulfuración" y en la "vía de sulfhidrilación directa", vías alternativas para síntesis de metionina. Por ejemplo. E. coli utiliza una vía de transulfuración, mientras que otros microorganismos tales como Saccharomices cerevisiae, C. glutamicum y B subtillis y parientes de estos microorganismos han desarrollado una vía de sulfhidrilación directa. A pesar de que muchos microorganismos utilizan la vía de transulfuración o la vía de sulfhidrilación directa, pero no ambas, algunos microorganismos tales como, por ejemplo, C. glutamicum, utilizan ambas vías para la síntesis de metionina.

"Enzimas biosintéticas de metionina" comprenden todas las enzimas que normalmente se encuentran en microorganismos que contribuyen a la producción de metionina. La Tabla 1 lista diversas enzimas en la vía biosintética de metionina y los correspondientes genes que las codifican, y la Figura 1 muestra una representación esquemática de la vía biosintética de metionina. Ha de entenderse que en algunos microorganismos los nombres de los genes que codifican las correspondientes enzimas pueden variar de los nombres listados en esta memoria.

TABLA 1 Enzimas en la vía biosintética de metionina y los genes que las codifican

1

De acuerdo con la Figura 1, la síntesis de metionina a partir de oxaloacetato (OAA) discurre a través de los compuestos intermedios aspartato, aspartato fosfato y aspartato semialdehído. El aspartato semialdehído se convierte en homoserina mediante homoserina deshidrogenasa (el producto del gen hom, también conocido como thrA, metL, hdh, entre otros nombres en otros organismos). Las subsiguientes etapas en la síntesis de metionina pueden transcurrir a través de la vía de transulfuración y/o la vía de sulfhidrilación directa.

En la vía de transulfuración, la homoserina se convierte en O-acetilhomoserina mediante homoserina acetiltransferasa (el producto del gen metX, a veces también denominado metA) y la adición de acetil CoA, o en O-succinilhomoserina mediante la adición de succinil CoA mediante el producto de un gen metA (homoserina succiniltransferasa). La donación de un grupo azufre procedente de cisteína a O-acetilhomoserina u O-succinilhomoserina por parte de cistationina \gamma-sintasa, el producto de un gen metB, produce cistationina. Después, cistationina se convierte en homocisteína mediante cistationina \beta-liasa, el producto de un gen metC (al que también se alude como el gen aecD en algunos organismos).

En la vía de sulfhidrilación directa, O-acetilhomoserina sulfihidrilasa, el producto de un gen metY (al que a veces se alude como el gen metZ) cataliza la adición directa de sulfuro a O-acetilhomoserina para formar homocisteína. La homocisteína también se puede formar en la vía de sulfhidrilación directa mediante la adición directa de un grupo sulfuro a O-succinilhomoserina por parte de O-succinilhomoserina sulfhidrilasa, el producto de un gen metZ.

Independientemente de la vía que se utilice, la vía de transulfuración o la vía de sulfhidrilación directa, la metionina se produce subsiguientemente a partir de homocisteína mediante la adición de un grupo metilo mediante metionina sintasa dependiente de vitamina B_{12} (el producto del gen metH) o metionina sintasa independiente de vitamina B_{12} (el producto del gen metE). El grupo metilo de metionina es donado por tetrahidrofolato de metilo (metil-THF) que, a su vez, se produce mediante la reducción de metileno-THF en una reacción catalizada por el producto génico metF.

I. Métodos para cultivar microorganismos en presencia de disulfuro de dimetilo (DMDS) de modo que se produce metionina y microorganismos recombinantes para uso en los métodos de la invención

En un aspecto, la presente invención ofrece métodos para producir metionina, que comprenden cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un compuesto sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, preferiblemente disulfuro de dimetilo (DMDS), de modo que se produce L-metionina o una sal de L-metionina. Un "microorganismo productor de metionina" es cualquier microorganismo capaz de producir metionina, p. ej. bacterias, levaduras, hongos, Archaea, etc. En una realización, el microorganismo productor de metionina pertenece al género Corynebacterium. En otra realización, el microorganismo productor de metionina es Corynebacterium glutamicum. Todavía en otra realización, el microorganismo productor de metionina se selecciona del grupo que consiste en: bacterias Gram-negativas (p. ej. Escherichia coli o enterobacterias relacionadas), bacterias Gram-positivas (p. ej. Bacillus subtilis o bacilos relacionados), levaduras (p. ej. Saccharomyces cerevisiae o cepas de levaduras relacionadas) y Archaea, p. ej. un microorganismo adecuado para uso en los métodos de la invención. En un aspecto, el microorganismo que pertenece al grupo enterobacterias es Escherichia coli. En otra realización, el microorganismo que pertenece al género Bacillus es Bacillus subtilis. Todavía en otra realización, el microorganismo de levadura es Saccharomyces cerevisiae o un pariente del mismo.

En más de una realización de la invención, un microorganismo se cultiva en un medio que comprende un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, preferiblemente disulfuro de dimetilo (DMDS). En una realización, un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,02% o mayor. En otra realización, un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,04% o mayor. Todavía en otra realización un compuesto de azufre rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS está presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,06% o mayor.

En más de una realización de la invención, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. la fuente de un grupo azufre y/o metilo, es trisulfuro de dimetilo o tetrasulfuro de dimetilo, cuyos extremos están rematados con grupos metilo.

En una realización, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. la fuente de un grupo azufre y/o metilo, preferiblemente DMDS, se proporciona al cultivo utilizando un sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS) de liberación lenta. Tal como se utiliza en esta memoria, las frases "sistemas de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta", "sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo de liberación lenta" y "sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS) de liberación lenta" incluyen cualquier sustancia inerte que se puede añadir a o interrelacionar de otro modo con medios de cultivo, de modo que compuestos orgánicos hidrófobos pequeños tales como un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, se pueden liberar en la fase acuosa, de manera que la concentración en estado estacionario de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, se mantiene a una concentración sub-letal para el organismo que se esté utilizando. Un "sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta", p. ej. "un sistema de suministro de un grupo de azufre y/o metilo de liberación lenta", p. ej. "un sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS) de liberación lenta", permite también la liberación prolongada y sostenida de estos compuestos en disolución a lo largo del tiempo a una concentración que no es tóxica para el microorganismo y que no afecta adversamente al desarrollo del propio microorganismo. En una realización, el sistema de suministro de liberación lenta de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS es un líquido que es inmiscible con agua, pero que disuelve un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS. En una realización preferida, el sistema de suministro de liberación lenta de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, es una resina de poliestireno macroporosa en forma de perlas, p. ej. Amberlite^{TM} XAD4. Amberlite^{TM} XAD4 consiste en perlas insolubles suministradas en forma de un producto humedecido con agua embebido con cloruro de sodio y carbonato de sodio. Antes de la absorción de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, la .Amberlite^{TM} XAD4 se lava con etanol y agua según se recomienda por el fabricante, proporcionando una suspensión en agua. Después de la absorción de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, a .Amberlite^{TM} XAD4, y de la adición de esta mezcla a medios de cultivo, un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, se libera de las perlas a una velocidad suficiente para sustentar el desarrollo de un auxótrofo metF o metE, metH. En una realización, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en una concentración de 0,1% o mayor en los medios de cultivo que contienen.Amberlite^{TM} XAD4. En otra realización, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en una concentración de 0,2% o mayor en los medios de cultivo que contienen .Amberlite^{TM} XAD4. Todavía en otra realización, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en una concentración de 0,3% o mayor en los medios de cultivo que contienen Amberlite^{TM} XAD4.

En otra realización preferida, el sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. el sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo de liberación lenta, p. ej. el sistema de suministro de liberación lenta de DMDS, es una alimentación de compuesto de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. una alimentación de una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. una alimentación de DMDS. Tal como se utilizan en esta memoria, las frases "alimentación de compuesto de sulfuro rematado con metilo controlada lenta", "una alimentación de una fuente de un grupo de azufre y/o metilo controlada lenta" y "una alimentación de DMDS controlada lenta" es una alimentación controlada lenta que suministra, p. ej. de manera incrementada o continua, un compuesto de sulfuro rematado, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS al cultivo en cantidades suficientes de modo que se obtiene el producto deseado, p. ej. metionina, pero de manera que se eviten concentraciones tóxicas para el microorganismo de producción. Todavía en otra realización preferida, el sistema de suministro de liberación lenta es una membrana que es permeable a un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, y el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS se deja que difunda y fluya a través de la membrana hacia el medio de crecimiento. Ejemplos no limitantes de membranas incluyen cualquier membrana que pueda conservar su integridad estructural y funcional en presencia de disolventes orgánicos (es decir, DMDS) y un medio de cultivo acuoso. Membranas de este tipo se describen en el Catálogo de Millipore Corporation y la guía de referencias técnicas titulada "1994-1995 Millipore Direct", Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU. Membranas adecuadas incluyen las constituidas por PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)), PTFE (politetrafluoroetileno), polipropileno, poli(cloruro de vinilo), poliéter-sulfona, nilón y policarbonato, ya sea con o sin revestimientos hidrófilos. Ejemplos adicionales, no limitantes, de sustancias que se pueden utilizar como un sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS) de liberación lenta incluyen otras resinas hidrófobas en forma de perlas, aceites animales, aceites minerales, aceites químicos, aceites vegetales, aceites sintéticos, un disolvente orgánico,

\hbox{clorocarburos, fluorocarburos,
cloro-fluoro-carburos o
combinaciones de los mismos.}

Según se describe en esta memoria, microorganismos en los que la vía biosintética de metionina ha sido genéticamente alterada, p. ej. para supra-producir O-acetilhomoserina, da como resultado la producción mejorada de metionina en medios que contienen un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo tal como, p. ej., DMDS. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos para producir metionina, que comprenden cultivar un microorganismo que tiene una vía biosintética de metionina desregulada en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, preferiblemente disulfuro de dimetilo (DMDS), de modo que se produce metionina.

Las metodologías de la presente invención ofrecen microorganismos, p. ej. microorganismos recombinantes, preferiblemente que incluyen vectores o genes (p. ej. genes del tipo salvaje y/o mutados) según se describen en esta memoria y/o se cultivan de una manera que resulten en la obtención de un producto deseado (p. ej. metionina). La expresión microorganismo "recombinante" incluye un microorganismo (p. ej. bacteria, célula de levaduras, célula de hongos, etc.) que ha sido genéticamente alterado, modificado o tratado mediante ingeniería (p. ej. tratado mediante ingeniería genética), de modo que exhibe un genotipo y/o fenotipo alterado, modificado o diferente (p. ej. cuando la modificación genética afecta a las secuencias de ácidos nucleicos codificadores del microorganismo) en comparación con el microorganismo que se produce en la naturaleza del cual se derivó.

Un microorganismo recombinante utilizado se diseña o trata mediante ingeniería de modo que se expresa o sobre-expresa al menos una enzima biosintética de metionina no nativa. La expresión "se sobre-expresa" o el término "sobre-expresión" incluyen la expresión de un producto génico (p. ej. una enzima biosintética) en un medio de crecimiento apropiado a una concentración mayor que la expresada antes de la manipulación del microorganismo o en un microorganismo equiparable que no ha sido manipulado. El microorganismo utilizado se puede diseñar o tratar mediante ingeniería genética para que sobre-exprese una concentración de un producto génico mayor que la expresada en un microorganismo equiparable que no ha sido tratado mediante ingeniería. Preferiblemente, el gen que codifica un enzima biosintética está incluido dentro de un vector recombinante y/o una enzima biosintética expresada a partir de un vector recombinante. El experto ordinario en la técnica apreciará que un microorganismo que expresa o sobre-expresa un producto génico produce o sobre-produce el producto génico como resultado de la expresión o sobre-expresión de secuencias de ácidos nucleicos y/o genes que codifican el producto génico.

La expresión "microorganismo manipulado" incluye un microorganismo que ha sido tratado mediante ingeniería (p. ej. tratado mediante ingeniería genética) o modificado de modo que el microorganismo tiene al menos una enzima de la vía biosintética de metionina modificada en una cantidad o estructura tal que aumenta la producción de metionina. La modificación o el tratamiento mediante ingeniería de microorganismos de este tipo puede realizarse de acuerdo con cualquier metodología descrita en esta memoria, que incluye, pero no se limita a la desregulación de una vía biosintética y/o la sobre-expresión de al menos una enzima biosintética. Una enzima "manipulada" (p. ej. una enzima biosintética "manipulada") incluye una enzima, cuya expresión, producción o actividad ha sido alterada o modificada de manera que al menos un precursor, sustrato o producto de la enzima situado aguas arriba o situado aguas abajo es alterado o modificado (p. ej. una concentración, relación, etc. alterada o modificada de un precursor, sustrato y/o producto), por ejemplo en comparación con una correspondiente enzima de tipo salvaje o que se produce en la naturaleza. Una enzima "manipulada" incluye también una en la que se ha reforzado la resistencia a la inhibición, p. ej. la inhibición de retroalimentación por parte de uno o más productos o compuestos intermedios. Por ejemplo, una enzima que es capaz de funcionar enzimáticamente de manera eficaz en presencia, p. ej. de metionina.

La expresión "se sobre-expresa" o el término "sobre-expresión" incluyen la expresión de un producto génico (p. ej. una enzima biosintética de metionina) a una concentración mayor que la expresada antes de la manipulación del microorganismo o en un microorganismo equiparable que no ha sido manipulado. En una realización, el microorganismo puede ser manipulado genéticamente (p. ej. tratado mediante ingeniería genética) para que sobre-exprese una concentración de un producto génico mayor que la expresada antes de la manipulación del microorganismo o en un microorganismo equiparable que no ha sido manipulado. La manipulación genética puede incluir, pero no se limita a alterar o modificar secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión de un gen particular (p. ej. añadiendo promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples, o separando secuencias reguladoras de manera que la expresión sea constitutiva), modificando la localización en el cromosoma de un gen particular, alterando la secuencia de ácidos nucleicos adyacente a un gen particular tal como un sitio de unión a ribosoma o un terminador de la transcripción, aumentando el número de copias de un gen particular, modificando proteínas (p. ej. proteínas reguladoras, supresores, reforzadores, activadores de la transcripción y similares) implicados en la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular, o cualesquiera otros medios convencionales para desregular la expresión de un gen particular, rutinarios en la técnica (incluidos, pero no limitados al uso de moléculas de ácido nucleico antisentido, por ejemplo para bloquear la expresión de proteínas represoras y/o el uso de alelos mutadores, p. ej. alelos bacterianos que refuerzan la variabilidad genética y aceleran, por ejemplo, la evolución adaptativa).

En otra realización, el microorganismo utilizado puede manipularse de un modo físico o medioambiental para sobre-expresar una concentración de un producto génico mayor que la expresada antes de la manipulación del microorganismo o en un microorganismo equiparable que no ha sido manipulado. Por ejemplo, un microorganismo se puede tratar con o cultivar en presencia de un agente del que se sabe o sospecha que aumenta la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular, de manera que se refuerzan o incrementan la transcripción y/o traducción. Alternativamente, un microorganismo se puede cultivar a una temperatura seleccionada para aumentar la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular de modo que se refuerza o incrementa la transcripción y/o traducción.

Un microorganismo "recombinante" preferido utilizado es un microorganismo que tiene una vía o enzima biosintética de metionina desregulada. El término "desregulada" o "desregulación" incluye la alteración o modificación de al menos un gen en un microorganismo que codifica una enzima en una vía biosintética, de modo que se altera o modifica la concentración o actividad de la enzima biosintética en el microorganismo. Preferiblemente, se altera o modifica al menos un gen que codifica una enzima en una vía biosintética, de manera que el producto génico se refuerza o aumenta. La frase "vía desregulada" también puede incluir una vía biosintética en la que se altera o modifica más de un gen que codifica una enzima en una vía biosintética, de manera que se altera o modifica la concentración o actividad de más de una enzima biosintética. La capacidad de "desregular" una vía (p. ej. para desregular simultáneamente más de un gen, p. ej. 2, 3, 4, 5, 6, 7 en una vía biosintética dada) en un microorganismo surge del fenómeno particular de los microorganismos en los que más de una enzima (p. ej. 2, 3, 4, 5, 6, 7, etc. enzimas biosintéticas) son codificadas por genes que se producen uno junto a otro en un trozo contiguo de un material genético denominado "operón".

El término "operón" incluye al menos dos genes adyacentes u ORFs (marcos de lectura abierta) que se solapan opcionalmente en secuencias en el extremo 5' ó 3' de al menos un gen u ORF. El término "operón" incluye una unidad coordinada de expresión génica que contiene un promotor y, posiblemente, un elemento regulador asociado con uno o más, preferiblemente al menos dos genes estructurales (p. ej. genes que codifican enzimas, por ejemplo enzimas biosintéticas). La expresión de los genes estructurales se puede regular de forma coordinada, por ejemplo mediante proteínas reguladoras que se unen al elemento regulador o mediante anti-terminación de la transcripción. Los genes estructurales se pueden transcribir para dar un ARNm sencillo que codifica la totalidad de las proteínas estructurales. Debido a la regulación coordinada de genes incluidos en un operón, la alteración o modificación del promotor sencillo y/o del elemento regulador puede dar como resultado una alteración o modificación de cada uno de los productos génicos codificados por el operón. La alteración o modificación del elemento regulador puede incluir, pero no se limita a separar el promotor endógeno y/o el o los elementos reguladores, añadir promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples, o separar secuencias reguladoras, de manera que se modifique la expresión de los productos génicos, modificando la localización en el cromosoma del operón, alterando las secuencias de ácidos nucleicos adyacentes al operón o dentro del operón tal como un sitio de unión a ribosoma, aumentando el número de copias del operón, modificando proteínas (p. ej. proteínas reguladoras, supresores, reforzadores, activadores de la transcripción y similares) implicados en la transcripción del operón y/o la traducción de los productos génicos del operón, o cualesquiera otros medios convencionales de desregular la expresión de genes, rutinarios en la técnica (que incluyen, pero no se limitan al uso de moléculas de ácidos nucleicos antisentido, por ejemplo para bloquear la expresión de proteínas represoras). La desregulación también puede implicar la alteración de la región codificadora de uno o más genes para proporcionar, por ejemplo, una enzima que es resistente a la retroalimentación, o resistente a la inhibición por parte de un producto o compuesto intermedio, o que tiene una actividad específica mayor o menor.

Un microorganismo "recombinante" utilizado, particularmente preferido, ha sido tratado mediante ingeniería genética para sobre-expresar un gen o producto génico derivado de bacterias. La expresión "derivado de bacterias" o "derivado de", por ejemplo, bacterias incluye un gen que se encuentra de forma natural en bacterias o un producto génico (p. ej. homoserina acetiltransferasa, homoserina deshidrogenasa y O-acetilhomoserina sulfhidrilasa) que es codificado por un gen bacteriano (p. ej. codificado por metX, hom (también conocido como hsd, etc.) y metY, respectivamente).

En una realización, el microorganismo productor de metionina tiene al menos una enzima biosintética de metionina desregulada. En una realización preferida, la enzima biosintética de metionina desregulada es O-acetilhomoserina sulfhidrilasa. En otra realización, el microorganismo productor de metionina tiene al menos dos enzimas biosintéticas de metionina desreguladas. En una realización preferida, las enzimas biosintéticas de metionina desreguladas son homoserina acetiltransferasa y homoserina deshidrogenasa. En otra realización preferida, las enzimas biosintéticas de metionina desreguladas son O-acetil-homoserina sulfhidrilasa y homoserina acetiltransferasa.

En un aspecto, la presente descripción ofrece modificaciones de diversas enzimas biosintéticas de la vía biosintética de metionina. En particular, la descripción ofrece modificar diversas actividades enzimáticas asociadas con dichas vías al modificar o alterar los genes que codifican dichas enzimas biosintéticas.

El término "gen", tal como se utiliza en esta memoria, incluye una molécula de ácido nucleico (p. ej. una molécula de ADN o un segmento de la misma) que es un organismo que se puede separar de otro gen u otros genes, mediante ADN intergénico (es decir, ADN intermedio o espaciador que flanquea de forma natural al gen y/o a los genes separadores en el ADN cromosómico del organismo). Alternativamente, un gen puede solapar ligeramente a otro gen (p. ej. el extremo 3' de un primer gen que solapa al extremo 5' de un segundo gen), estando los genes solapantes separados de los otros genes mediante ADN intergénico. Un gen puede dirigir la síntesis de una enzima o de otra molécula proteínica (p. ej. puede comprender secuencias codificadoras, por ejemplo un marco de lectura abierta (ORF) contiguo que codifica una proteína) o puede ser por sí mismo funcional en el organismo. Un gen en un organismo puede estar formando racimo en un operón, según se define en esta memoria, estando dicho operón separado de otros genes y/u operónes por parte del ADN intergénico. Un "gen aislado", tal como se utiliza en esta memoria, incluye un gen que está esencialmente exento de secuencias que flanquean de forma natural al gen en el ADN cromosómico del organismo del que se deriva el gen (es decir, está exento de secuencias codificadoras adyacentes que codifican una segunda o distinta proteína, secuencias estructurales adyacentes o similares) y que incluye, opcionalmente, secuencias reguladoras 5' y 3', por ejemplo secuencias de promotores y/o secuencias de terminadores. En una realización, un gen aislado incluye predominantemente secuencias codificadoras de una proteína (p. ej. secuencias que codifican proteínas de Corynebacterium). En otra realización, un gen aislado incluye secuencias codificadoras de una proteína (p. ej. una proteína de Corynebacterium), secuencias reguladoras 5' y/ó 3' adyacentes procedentes del ADN cromosómico del organismo del que se deriva el gen (p. ej. secuencias reguladoras de Corynebacterium 5' y/ó 3' adyacentes). Preferiblemente, un gen aislado contiene menos de aproximadamente 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,2 kb, 0,1 kb, 50 pb, 25 pb ó 10 pb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural al gen en el ADN cromosómico del organismo del que se deriva el gen.

Un "gen que tiene una mutación" o "gen mutante", tal como se utiliza en esta memoria, incluye un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que incluye al menos una alteración (p. ej. sustitución, inserción, deleción), de modo que el polipéptido o la proteína codificado por dicho mutante exhibe una actividad que difiere del polipéptido o proteína codificado por la molécula de ácido nucleico o gen de tipo salvaje. En una realización, un gen que tiene una mutación o un gen mutante que codifica un polipéptido o proteína que tiene una actividad incrementada en comparación con el polipéptido o la proteína codificado por el gen de tipo salvaje, por ejemplo cuando se ensaya en condiciones similares (p. ej. ensayado en microorganismos cultivados a la misma temperatura). Tal como se utiliza en esta memoria, una "actividad incrementada" o "actividad enzimática incrementada" es una que es al menos 5% mayor que la del polipéptido o proteína codificado por la molécula de ácido nucleico o gen de tipo salvaje, preferiblemente al menos 5-10% mayor, más preferiblemente al menos 10-25% mayor e, incluso más preferiblemente, al menos 25-50%, 50-75% ó 75-100% mayor que el del polipéptido o proteína codificado por la molécula de ácido nucleico o gen de tipo salvaje. También se pretende que queden comprendidos por la presente invención intervalos intermedios a los valores antes reseñados, p. ej. 75-85%, 85-90%, 90-95%. Tal como se utiliza en esta memoria, una "actividad incrementada" o "actividad enzimática incrementada" también puede incluir una actividad que es al menos 1,25 mayor que la actividad del polipéptido o proteína codificado por el gen de tipo salvaje, preferiblemente al menos 1,5 veces mayor, más preferiblemente al menos 2 veces mayor, incluso más preferiblemente, al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces mayor que la actividad del polipéptido o proteína codificado por el gen de tipo salvaje.

En otra realización, un gen que tiene una mutación o un gen mutante que codifica un polipéptido o proteína tiene una actividad reducida en comparación con el polipéptido o proteína codificado por el gen de tipo salvaje, por ejemplo cuando se ensaya en condiciones similares (por ejemplo ensayado en microorganismos cultivados a la misma temperatura). Un gen mutante también puede no codificar polipéptido alguno o tener un nivel reducido de producción del polipéptido de tipo salvaje. Tal como se utiliza en esta memoria, una "actividad reducida" o "actividad enzimática reducida" es una que es al menos 5% menor que la del polipéptido o proteína codificado por la molécula de ácido nucleico o gen de tipo salvaje, preferiblemente al menos 5-10% menor, al menos más preferiblemente 10-25% menor, e incluso más preferiblemente, al menos 25-50%, 50-75% ó 75-100% menor que la del polipéptido o proteína codificado por la molécula de ácido nucleico o gen de tipo salvaje. También pretenden estar comprendidos por la presente invención intervalos intermedios a los valores antes reseñados, p. ej. 75-85%, 85-90%, 90-95%. Tal como se utiliza en esta memoria, una "actividad reducida" o "actividad enzimática reducida" también puede incluir una actividad que ha sido suprimida o "inactivada" (p. ej. aproximadamente una actividad 100% menor que la del poliipéptido o proteína codificado por la molécula de ácido nucleico o gen de tipo salvaje).

En más de una realización, los microorganismos utilizados que tienen una combinación de genes desregulados producen metionina, por ejemplo a una concentración que es al menos 1-2% mayor, o al menos 3-5% mayor, o al menos 5-10% mayor, o al menos 10-20% mayor, o al menos 20-30%, o al menos 30-40%, o al menos 40-50% mayor, o al menos 50-60% mayor, o al menos 60-70% mayor, o al menos 70-80% mayor, o al menos 80-90% mayor o al menos 90-95% mayor que la suma de concentraciones de metionina producidas en presencia de cada gen desregulado individual.

En algunas realizaciones, la concentración de metionina producida por microorganismos, que incluye una combinación de genes desregulados, es al menos 2 veces, o al menos 2,5 veces, o al menos, 3 veces, o al menos 3,5 veces, o al menos 4 veces, o al menos 4,5 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 15 veces, o al menos 20 veces, o al menos 25 veces, o al menos 30 veces, o al menos 35 veces, o al menos 40 veces, o al menos 45 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces mayor que la suma de concentraciones de metionina producida en presencia de cada uno de los genes individuales desregulados.

Todavía en otras realizaciones, la cantidad de metionina producida por un microorganismo bajo condiciones de fermentación adecuadas, que incluyen una combinación de genes alterados, es al menos 5 g, o al menos 7 g, o al menos 8 g, o al menos 9 g, o al menos 10 g, o al menos 11 g, o al menos 12 g, o al menos 13 g, o al menos 14 g, o al menos 15 g, o al menos 16 g, o al menos 17 g, o al menos 18 g, o al menos 19 g, o al menos 20 g, o al menos 25 g, o al menos 30 g, o al menos 40 g, o al menos 50 g mayor por litro con relación a la suma de cantidades producidas por un microorganismo en presencia de cada uno de

\hbox{los genes
individuales alterados  o en presencia de ninguna alteración de
genes.}

La concentración de metionina producida por microorganismos descritos en esta memoria se puede medir fácilmente utilizando uno o más ensayos descritos en esta memoria.

La actividad se puede determinar de acuerdo con cualquier ensayo bien aceptado para medir la actividad de una proteína particular de interés. La actividad se puede medir o ensayar directamente, por ejemplo midiendo una actividad de una proteína aislada o purificada a partir de una célula o microorganismo. Alternativamente, una actividad también se puede medir o ensayar dentro de una célula o microorganismo o en un medio extracelular. Por ejemplo, el ensayo de un gen mutante (es decir, dicho mutante que codifica una actividad enzimática reducida) se puede conseguir expresando el gen mutado en un microorganismo, por ejemplo un microorganismo mutante en el que la enzima es una sensible a la temperatura, y ensayando el gen mutante en cuanto a la capacidad de complementar a un mutante sensible a la temperatura (Ts - siglas en inglés) en cuanto a la actividad enzimática. Un gen mutante que codifica una "actividad enzimática incrementada" puede ser uno que complementa al mutante Ts de manera más eficaz que, por ejemplo, un gen de tipo salvaje correspondiente. Un gen mutante que codifica una "actividad enzimática reducida" es uno que complementa al mutante Ts de manera menos eficaz que, por ejemplo, un gen de tipo salvaje correspondiente.

Se apreciará por parte del experto que incluso una única sustitución en una secuencia de ácidos nucleicos o genes (p. ej. una sustitución de una base que codifica un cambio de aminoácido en la correspondiente secuencia de aminoácidos) puede afectar drásticamente a la actividad de un polipéptido o proteína codificado en comparación con el polipéptido o proteína de tipo salvaje correspondiente. Un gen mutante (p. ej. que codifica un polipéptido o proteína mutante) según se define en esta memoria, es fácilmente discernible de un ácido nucleico o gen que codifica una proteína homóloga, debido a que un gen mutante codifica una proteína o polipéptido que tiene una actividad alterada, opcionalmente observable como un fenotipo diferente o distinto en un microorganismo que expresa dicho gen mutante o produce dicha proteína o polipéptido mutante (es decir, un microorganismo mutante) en comparación con un correspondiente microorganismo que expresa el gen de tipo salvaje. En contraposición, un homólogo de proteína puede tener una actividad idéntica o esencialmente similar, opcionalmente indiscernible por el fenotipo, cuando se produce en un microorganismo en comparación con un correspondiente microorganismo que expresa el gen de tipo salvaje. Por consiguiente, no es, por ejemplo, el grado de la identidad de secuencias entre moléculas de ácidos nucleicos, genes, proteínas o polipéptidos el que sirve para distinguir entre homólogos y mutantes, más bien es la actividad de la proteína o polipéptido codificado la que distingue entre homólogos y mutantes: homólogos que tienen, por ejemplo, una baja identidad de la secuencia (p. ej. una identidad de la secuencia de 30-50%), pero que tienen actividades funcionales esencialmente equivalentes, y mutantes, por ejemplo que comparten una identidad de la secuencia de un 99%, pero que tienen actividades funcionales drásticamente diferentes o alteradas.

En una realización, un microorganismo recombinante utilizado es un organismo Gram-positivo (p. ej. un microorganismo que retiene un colorante básico, por ejemplo cristal violeta, debido a la presencia de una pared Gram-positiva que rodea al microorganismo). En una realización preferida, el microorganismo recombinante utilizado el del género Corynebacterium, En una realización, el microorganismo recombinante utilizado es del género Bacillus. En otra realización preferida, el microorganismo recombinante se selecciona del grupo que consiste en Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis y Bacillus pumilus.

En otra realización, el microorganismo recombinante utilizado es un organismo Gram-negativo (excluye el colorante básico). En otra realización, el microorganismo recombinante utilizado de la presente invención es un microorganismo que pertenece al grupo enterobacterias. En una realización preferida, el microorganismo recombinante utilizado es un microorganismo que pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia y Proteus. En una realización más preferida, el microorganismo recombinante utilizado es del género Escherichia, En una realización incluso más preferida, el microorganismo recombinante utilizado es Escherichai coli. En otra realización, el microorganismo recombinante es una levadura del género Saccharomyces (p. ej. S. cerevisiae) y una Archaea.

Un aspecto importante de la presente invención implica cultivar los microorganismos de la presente invención de modo que se produzca metionina.

El término "cultivar" incluye mantener y/o hacer crecer un microorganismo vivo de la presente invención (p. ej. mantener y/o hacer crecer un cultivo o cepa). En una realización, un microorganismo de la invención se cultiva en medios líquidos. En otra realización, un microorganismo de la invención se cultiva en medios sólidos o medios semi-sólidos. En una realización preferida, un microorganismo de la invención se cultiva en medios (p. ej. un medio líquido estéril) que comprende nutrientes esenciales o beneficiosos para el mantenimiento y/o crecimiento del microorganismo (p. ej. fuentes de carbono o sustrato de carbono, por ejemplo hidratos de carbono, hidrocarburos, aceites, grasas, ácidos grasos, ácidos orgánicos y alcoholes; fuentes nitrogenadas, por ejemplo peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo ácido fosfórico, sales sódica y potásica de los mismos; elementos traza, por ejemplo magnesio, hierro, manganeso, calcio, cobre, zinc, boro, níquel, molibdeno y/o sales de cobalto, así como factores de crecimiento tales como aminoácidos, vitaminas, promotores del crecimiento y similares).

Los microorganismos de acuerdo con la invención se pueden cultivar de forma continua o discontinua o en un proceso por lotes alimentados o por lotes alimentados repetidos para producir metionina. Una perspectiva general de métodos de cultivo conocidos se puede encontrar en el libro de texto de Chmiel (Bioprozelitechnik I. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Preferiblemente, los microorganismos se cultivan bajo un pH controlado. La expresión "pH controlado" incluye cualquier pH que resulta en la obtención del producto deseado (p. ej. metionina). En una realización, los microorganismos se cultivan a un pH de aproximadamente 7. En otra realización, los microorganismos se cultivan a un pH entre 6,0 y 8,5. El pH deseado se puede mantener mediante cualquier número de métodos conocidos por los expertos en la técnica.

También de manera preferida, en la presente invención se cultivan microorganismos bajo aireación controlada. La expresión "aireación controlada" incluye una aireación suficiente (p. ej. oxígeno) que da como resultado la obtención del producto deseado (p. ej. metionina). En una realización, la aireación se controla regulando los niveles de oxígeno en el cultivo, por ejemplo regulando la cantidad de oxígeno disuelto en los medios de cultivo. Preferiblemente, la aireación del cultivo se controla agitando el cultivo. La agitación se puede proporcionar mediante un propulsor o equipo de agitación mecánico similar, haciendo girar o sacudiendo el recipiente de cultivo (p. ej. tubo o matraz) o por un equipo de bombeo diverso. La aireación se puede controlar, adicionalmente, mediante el paso de aire estéril u oxígeno a través del medio (p. ej. a través de la mezcla de fermentación). También de manera preferida, en la presente invención los microorganismos se cultivan sin una excesiva formación de espuma (p. ej. a través de la adición de agentes anti-espumantes).

Además, en la presente invención, los microorganismos se pueden cultivar bajo temperaturas controladas. La expresión "temperatura controlada" incluye cualquier temperatura que resulta en la obtención del producto deseado (p. ej. metionina). En una realización, temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15ºC y 95ºC. En otra realización, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15ºC y 70ºC. Temperaturas preferidas se encuentran entre 20ºC y 55ºC, más preferiblemente entre 30ºC y 50ºC.

Los microorganismos se pueden cultivar (p. ej. mantener y/o hacer crecer) en medios líquidos y, preferiblemente, se cultivan, de forma continua o intermitente, mediante métodos de cultivo convencionales tales como cultivo en reposo, cultivo en tubo de ensayo, cultivo con agitación (p. ej. cultivo con agitación rotatoria, cultivo en matraz con agitación, etc.), cultivo en rotación con aireación, o fermentación. En una realización preferida, los microorganismos se cultivan en matraces con agitación. En una realización más preferida, los microorganismos se cultivan en un fermentador (p. ej. un proceso de fermentación). Procesos de fermentación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a procesos por lotes, por lotes alimentados y continuos o métodos de fermentación. La frase "proceso por lotes" o "fermentación por lotes" se refiere a un sistema en el que la composición de los medios, nutrientes, aditivos suplementarios y similares se establece al comienzo de la fermentación y no se somete a alteración durante la misma, sin embargo se han realizado intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno para prevenir una acidificación de los medios en exceso y/o la muerte de los microorganismos. La frase "proceso por lotes alimentados" o fermentación "por lotes alimentados" se refiere a una fermentación por lotes, con la excepción de que a medida que progresa la fermentación se añaden más sustratos o suplementos (p. ej. añadidos en incrementos o de forma continua). La frase "proceso continuo" o "fermentación continua" se refiere a un sistema en el que un medio de fermentación definido se añade de forma continua a un fermentador y se separa simultáneamente una cantidad igual de medio usado o "acondicionado", preferiblemente para la recuperación del producto deseado (p. ej. metionina). Se han desarrollado y son bien conocidas en la técnica variedades de procesos de este tipo.

El medio de cultivo a utilizar debe cumplir los requisitos de las cepas particulares de una manera adecuada. Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., EE.UU., 1981).

Fuentes de carbono que son apropiadas para uso en el medio de cultivo son, por ejemplo, azúcares e hidratos carbono tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como, p. ej., aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como, p. ej., ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, p. ej., glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como, p. ej., ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o en forma de una mezcla.

Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos con contenido en nitrógeno, orgánicos tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, líquido de maceración de maíz, harina de haba de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o en forma de una mezcla.

Como fuente de fósforo se puede utilizar ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio o las correspondientes sales con contenido en sodio.

Además de DMDS, trisulfuro de dimetilo, tetrasulfuro de dimetilo, cuyos extremos están rematados con grupos metilo, como fuentes adicionales de azufre se pueden utilizar compuestos con contenido en azufre, orgánicos e inorgánicos tales como, por ejemplo, sulfuros, sulfitos, sulfatos y tiosulfatos.

El medio de cultivo puede comprender, además, sales de metales tales como, p. ej., sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, además de las sustancias antes mencionadas se pueden emplear sustancias para el crecimiento esenciales y no esenciales tales como aminoácidos y vitaminas. Además de ello, al medio de cultivo se pueden añadir precursores adecuados. Las sustancias de partida mencionadas pueden añadirse al cultivo en forma de un único lote, o pueden ser alimentadas de una manera adecuada durante el cultivo.

Compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, se pueden emplear de una manera adecuada para controlar el pH. Para controlar el desarrollo de espuma se pueden emplear agentes anti-espumantes tales como, p. ej., ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Sustancias adecuadas que tengan una acción selectiva tales como, p. ej., antibióticos, se pueden añadir al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Con el fin de mantener las condiciones aerobias, se introducen en el cultivo mezclas de oxígeno o de gas con contenido en oxígeno tales como, p. ej., aire. La temperatura del cultivo es habitualmente de 20ºC a 45ºC y, preferiblemente, de 25ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se haya formado un máximo del producto deseado. Este objetivo se alcanza habitualmente en el espacio de 10 horas a 160 horas.

La frase "cultivo bajo condiciones tales que se produce un compuesto deseado" incluye mantener y/o hacer crecer microorganismos en condiciones (p. ej. temperatura, presión, pH, duración, etc.) apropiadas o suficientes para obtener la producción del compuesto deseado o para obtener rendimientos deseados del compuesto particular que se esté produciendo. Por ejemplo, el cultivo se continúa durante un tiempo suficiente para producir la cantidad deseada de un compuesto (p. ej. metionina). Preferiblemente, el cultivo se continua durante un tiempo suficiente para alcanzar esencialmente una producción adecuada del compuesto (p. ej. un tiempo suficiente para alcanzar una concentración adecuada de metionina). En una realización, el cultivo se continúa durante aproximadamente 12 a 24 horas. En otra realización, el cultivo se continúa durante aproximadamente 24 a 36 horas, 36 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 96 a 120 horas, 120 a 144 horas, o más de 144 horas. En otra realización, el cultivo se continúa durante un tiempo suficiente para alcanzar rendimientos de producción deseables de metionina, por ejemplo los microorganismos se cultivan de manera que se produzca al menos aproximadamente de 7 a 10 g/L, o al menos 10 a 15 g/L, o al menos aproximadamente 15 a 20 g/L, o al menos aproximadamente 20 a 25 g/L, o al menos aproximadamente 25 a 30 g/L, o al menos aproximadamente 30 a 35 g/L, o al menos aproximadamente 35 a 40 g/L, o al menos aproximadamente 40 a 50 g/L de metionina. Todavía en otras realizaciones, los microorganismos se cultivan en condiciones tales que un rendimiento preferido de metionina, por ejemplo un rendimiento dentro de un intervalo recogido anteriormente, se produce en aproximadamente 24 horas, en aproximadamente 36 horas, en aproximadamente 48 horas, en aproximadamente 72 horas o en aproximadamente 96 horas.

La metodología de la presente invención puede incluir, además, una etapa de recuperar el compuesto deseado (metionina). El término "recuperar" un compuesto deseado, incluye concentrar, extraer, recolectar, aislar o purificar el compuesto a partir de medios de cultivo. La recuperación del compuesto se puede efectuar de acuerdo con cualquier metodología de aislamiento o purificación convencional conocida en la técnica que incluye, pero no se limita a tratamiento con una resina convencional (p. ej. resina de intercambio de aniones o cationes, resina de adsorción no iónica, etc.), tratamiento con un adsorbente convencional (p. ej. carbón vegetal activado, ácido silícico, sílice, celulosa, alúmina, etc.), alteración del pH, extracción con disolvente (p. ej. con un disolvente convencional tal como un alcohol, acetato de etilo, hexano y similares), diálisis, filtración, concentración, cristalización, recristalización, ajuste del pH, liofilización, secado, evaporación y similares. Por ejemplo, la metionina se puede recuperar del medio de cultivo re-separando primeramente los microorganismos del cultivo.

Preferiblemente, metionina de la presente invención se "extrae", "aísla" o "purifica" de modo que la preparación resultante está esencialmente exenta de otros componentes del medio (p. ej. exenta de componentes del medio y/o subproductos de la fermentación). El lenguaje "esencialmente exenta de otros componentes del medio" incluye preparaciones del compuesto deseado en las que el compuesto se separa de componentes del medio o subproductos de la fermentación del cultivo del cual se produce. En una realización, la preparación tiene más de aproximadamente 80% (en peso seco) del compuesto deseado (p. ej. menos de aproximadamente 20% de otros componentes del medio o subproductos de la fermentación), más preferiblemente más de aproximadamente 90% del compuesto deseado (p. ej. menos de aproximadamente 10% de otros componentes del medio o subproductos de la fermentación), todavía más preferiblemente más de aproximadamente 95% del compuesto deseado (p. ej. menos de aproximadamente 5% de otros componentes del medio o subproductos de la fermentación) y, lo más preferiblemente, más de aproximadamente 98-99% del compuesto deseado (p. ej. menos de aproximadamente 1-2% de otros componentes del medio o subproductos de la fermentación).

La descripción comprende, además, procesos de biotransformación que ofrecen diversos microorganismos recombinantes descritos en esta memoria. La expresión "proceso de biotransformación", al que también se alude en esta memoria como "procesos de bioconversión", incluye procesos biológicos que resultan en la producción (p. ej. transformación o conversión) de sustratos y/o compuestos intermedios apropiados para formar un producto deseado (metionina).

Microorganismo o microorganismos y/o enzimas utilizados en reacciones de biotransformación se encuentran en una forma que les permite realizar su función pretendida (p. ej. producir con compuesto deseado). Microorganismos de este tipo pueden ser células enteras, o pueden ser solamente aquellas partes de una célula (por ejemplo genes y/o enzimas) necesarias para obtener el resultado final deseado. Estos microorganismos se pueden suspender (p. ej. en una disolución apropiada tal como disoluciones o medios tamponados), aclarar (p. ej. liberar por aclarado de medios del cultivo del microorganismo), secar con acetona, inmovilizar (p. ej. con gel de poliacrilamida o k-carragenano u otros soportes sintéticos, por ejemplo perlas, matrices y similares), fijar, reticular o permeabilizar (p. ej. tener membranas y/o paredes permeabilizadas, de modo que los compuestos, por ejemplo sustratos, compuestos intermedios o productos, puedan pasar más fácilmente a través de dicha membrana o pared).

En una realización alternativa, el compuesto deseado no se purifica a partir del microorganismo, por ejemplo cuando el microorganismo no es biológicamente peligroso (p. ej. es seguro). Por ejemplo, el cultivo completo (o el sobrenadante del cultivo) se puede utilizar como una fuente del producto (p. ej. producto bruto). En una realización, el cultivo (o sobrenadante del cultivo) se utiliza sin modificación. En otra realización, el cultivo (o sobrenadante del cultivo) se concentra. Todavía en otra realización, el cultivo (o sobrenadante del cultivo) se seca o liofiliza. El producto obtenido por la presente invención puede incluir, además de metionina, otros componentes del caldo de fermentación, p. ej. fosfatos, carbonatos, hidratos de carbono remanentes, biomasa, componentes del medio complejo, etc.

II. Moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, vectores y polipéptidos

La presente descripción ofrece, además, moléculas de ácidos nucleicos recombinantes (p. ej. moléculas de ADN recombinante) que incluyen genes descritos en esta memoria (p. ej. genes aislados), preferiblemente genes de Corynebacterium, más preferiblemente genes de Corynebacterium glutamicum, incluso más preferiblemente genes biosintéticos de metionina de Corynebacterium glutamicum. La expresión "molécula de ácido nucleico recombinante" incluye una molécula de ácido nucleico (p. ej. una molécula de ADN) que ha sido alterada, modificada o tratada mediante ingeniería, de manera que difiere en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico nativa o natural de la cual se derivó la molécula de ácido nucleico recombinante (p. ej. mediante adición, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos). Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico recombinante (p. ej. una molécula de ADN recombinante) incluye un gen aislado de la presente invención, enlazado operativamente a secuencias reguladoras. La frase "enlazada operativamente a secuencia o secuencias reguladoras" significa que la secuencia de nucleótidos del gen de interés está enlazada a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permita la expresión (p. ej. expresión reforzada, incrementada, constitutiva, basal, atenuada, disminuida o reprimida) del gen, preferiblemente la expresión de un producto génico codificado por el gen (p. ej. cuando la molécula de ácido nucleico recombinante está incluida en un vector recombinante, según se define en esta memoria, y se introduce en un microorganismo).

La expresión "ácido nucleico heterólogo" se utiliza en esta memoria para aludir a secuencias de ácidos nucleicos que no están típicamente presentes en un organismo diana. También pueden comprender secuencias de ácidos nucleicos presentes en un organismo diana, pero no se encuentran normalmente en una región genética de un organismo diana de interés. De manera similar, la expresión "gen heterólogo" se refiere a un gen que no está presente en un material aislado de tipo salvaje del organismo hospedador. Ácidos nucleicos heterólogos y genes heterólogos comprenden generalmente moléculas de ácido nucleico recombinante. El ácido nucleico heterólogo o el gen heterólogo puede no comprender modificaciones (p. ej. por adición, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos).

También se describen homólogos de los diversos genes y proteínas descritos en esta memoria. Un "homólogo", en referencia a un gen, se refiere a una secuencia de nucleótidos que es esencialmente idéntica a lo largo de al menos parte del gen o de su cadena complementaria o a una parte de la misma, con la condición de que la secuencia de nucleótidos codifique una proteína que tiene esencialmente la misma actividad/función que la proteína codificada por el gen del que es un homólogo. Homólogos de los genes descritos en esta memoria se pueden identificar mediante porcentaje de identidad entre la secuencia de aminoácidos o nucleótidos para los supuestos homológos y las secuencias para los genes o proteínas codificados por ellos (p. ej. secuencias de nucleótidos para genes ask, hom, metX, metY, metB, metH, metE, metF, metC y metK de Corynebacterium glutamicum o sus cadenas complementarias). El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, mediante inspección visual o utilizando diversos programas de ordenador conocidos en la técnica o según se describen en esta memoria. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleótidos se puede determinar comparando la información de las secuencias utilizando el programa de ordenador GAP descrito por Devereux et al. (1984) Nucl. Acids. Res., 12:387 y disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El porcentaje de identidad también se puede determinar alineando dos secuencias de nucleótidos utilizando el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST.RTM), según se describe por Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174:247. Por ejemplo, para los alineamientos de secuencias de nucleótidos utilizando el programa BLAST^{TM}, las configuraciones por defecto son como siguen: recompensa para el apareamiento es 2, penalización para el desapareamiento es -2, penalizaciones para el hueco abierto y el hueco de extensión son 5 y 2, respectivamente, gap.times.dropoff es 50, esperado es 10, si el tamaño de la palabra es 11 y el filtro está DESCONECTADO.

Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "homología" y "homólogo" no están limitados a designar proteínas que tengan un teórico ancestro genético común, sino que incluyen proteínas que pueden no estar genéticamente relacionadas las cuales, no obstante, han evolucionado para realizar funciones similares y/o tener estructuras similares. La homología funcional con las diversas proteínas descritas en esta memoria comprende también proteínas que tienen una actividad de la correspondiente proteína de la que es homóloga. Para que las proteínas tengan una homología funcional no se requiere que tengan una identidad significativa en sus secuencias de aminoácidos, sino más bien que las proteínas que tengan una homología funcional se definan de manera que tengan actividades similares o idénticas, p. ej. actividades enzimáticas. De manera similar, proteínas con una homología estructural se definen como que tienen una estructura terciaria (o cuaternaria) análoga y no requieren necesariamente una homología de aminoácidos o una homología de ácidos nucleicos para los genes que las codifican. En determinadas circunstancias, homólogos estructurales pueden incluir proteínas que conservan la homología estructural solamente en el sitio activo o sitio de unión de la proteína.

Adicionalmente a la homología estructural y funcional, la presente descripción comprende, además, proteínas que tienen al menos una identidad parcial de aminoácidos con las diversas proteínas y enzimas descritas en esta memoria. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (p. ej. se pueden introducir huecos en la secuencia de aminoácidos de una proteína para un alineamiento óptimo con la secuencia de aminoácidos de otra proteína). Luego se comparan los residuos de aminoácidos en las correspondientes posiciones de los aminoácidos. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoácido que la posición correspondiente en la otra, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = nº de posiciones idénticas/nº total de posiciones, multiplicado por 100).

En algunos aspectos, las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de moléculas descritas en esta memoria comprenden una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos que se hibrida a o que tiene al menos una identidad de aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos descrita en esta memoria.

La presente descripción también comprende técnicas bien conocidas en la técnica, útiles para el tratamiento mediante ingeniería genética de las proteínas descritas en esta memoria para producir enzimas con características mejoradas o modificadas. Por ejemplo, se encuentra dentro de las enseñanzas disponibles en la técnica modificar una proteína de manera que la proteína tenga una afinidad de unión al sustrato incrementada o disminuida. También puede ser ventajoso, y se encuentra dentro de las enseñanzas de la técnica, diseñar una proteína que tenga tasas enzimáticas incrementadas o disminuidas. En particular, para enzimas multifuncionales, puede ser útil sintonizar con una precisión diferencial las diversas actividades de una proteína para que se comporte óptimamente bajo circunstancias especificadas. Además, la capacidad de modular la sensibilidad de una enzima a la inhibición de la retroalimentación (p. ej. por parte de metionina) se puede conseguir a través del cambio selectivo de aminoácidos implicados en la unión o coordinación de metionina o de otros cofactores que pueden estar implicados en la retroalimentación negativa o positiva. Además, la ingeniería genética comprende eventos asociados con la regulación de la expresión a los niveles tanto de transcripción como de traducción. Por ejemplo, cuando se utiliza un operón completo o parcial para la clonación y la expresión, se pueden modificar secuencias reguladoras, p. ej. secuencias del promotor o reforzador del gen, de manera que proporcione niveles deseados de transcripción.

Un "homólogo" de cualquiera de los genes descritos en esta memoria también se puede identificar mediante una actividad de la proteína codificada por el homólogo. Por ejemplo, un homólogo de este tipo puede complementar una mutación en el gen del que es homólogo.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "secuencia reguladora" incluye secuencias de ácidos nucleicos que afectan (p. ej. modulan o regulan) la expresión de otras secuencias de ácidos nucleicos (es decir, genes). En un aspecto, una secuencia reguladora está incluida en una molécula de ácido nucleico recombinante en una posición y/u orientación similar o idéntica con relación a un gen particular de interés según se observa para la secuencia reguladora y el gen de interés, según se manifiesta en la naturaleza, p. ej. en una posición y/u orientación nativa. Por ejemplo, un gen de interés puede incluirse en una molécula de ácido nucleico recombinante operativamente enlazada a una secuencia reguladora que acompaña o es adyacente al gen de interés en el organismo natural (p. ej. está enlazada operativamente a secuencias reguladoras "nativas", p. ej. al promotor "nativo"). Alternativamente, un gen de interés puede incluirse en una molécula de ácido nucleico recombinante enlazada operativamente a una secuencia reguladora que acompaña o es adyacente a otro gen (p. ej. diferente) en el organismo natural. Alternativamente, un gen de interés puede incluirse en una molécula de ácido nucleico recombinante operativamente enlazada a una secuencia reguladora de otro organismo. Por ejemplo, secuencias reguladoras de otros microbios (p. ej. otras secuencias reguladoras bacterianas, secuencias reguladoras de bacteriófagos y similares) pueden estar operativamente enlazadas a un gen de interés particular.

En un aspecto, una secuencia reguladora es una secuencia no nativa o que no aparece de forma natural (p. ej. una secuencia que ha sido modificada, mutada, sustituida, derivatizada, suprimida, incluidas secuencias que se sintetizan químicamente). Secuencias reguladoras preferidas incluyen promotores, reforzadores, señales de terminación, señales anti-terminación y otros elementos de control de la expresión (p. ej. secuencias a las que se unen represores o inductores y/o sitios de unión para las proteínas reguladoras de la transcripción y/o traducción, por ejemplo en el ARNm transcrito). Secuencias reguladoras de este tipo se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y en Patek, M. et al, (2003) Journal of Biotechnology 104: 311-323. Secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (p. ej. promotores constitutivos y promotores constitutivos fuertes), aquellas que dirigen una expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (p. ej. promotores inducibles, por ejemplo promotores inducibles de xilosa) y aquellas que atenúan o reprimen la expresión de una secuencia de nucleótidos en un microorganismo (p. ej. señales de atenuación o secuencias de represor). También se describe regular la expresión de un gen de interés separando o eliminando secuencias reguladoras. Por ejemplo, secuencias implicadas en la regulación negativa de la transcripción se pueden separar de modo que se refuerce la expresión de un gen de interés.

En un aspecto, una molécula de ácido nucleico recombinante de la descripción incluye una secuencia de ácidos nucleicos o gen que codifica al menos un producto génico bacteriano (p. ej. una enzima biosintética de metionina) enlazado operativamente a un promotor o secuencia de promotor. Promotores preferidos incluyen promotores de Corynebacterium y/o promotores de bacteriófagos (p. ej. bacteriófagos que infestan Corynebacterium). En una realización, un promotor es un promotor de Corynebacterium, preferiblemente un promotor fuerte de Corynebacterium (p. ej. un promotor asociado con un gen de control interno bioquímico en Corynebacterium). En otra realización, un promotor es un promotor de bacteriófago. Promotores preferidos adicionales, por ejemplo para uso en microorganismos Gram-positivos, incluyen, pero no se limitan a promotores de superóxido dismutasa, groEL, factor de elongación Tu, amy y SPO1. Promotores preferidos adicionales, por ejemplo para uso en microorganismos Gram-negativos, incluyen, pero no se limitan a cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIQ, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, \lambda-PR o
\lambda-PL.

En otro aspecto, una molécula de ácido nucleico recombinante de la descripción incluye una secuencia de terminador o secuencias de terminador (p. ej. secuencias de terminador de la transcripción). La expresión "secuencias de terminador" incluye secuencias reguladoras que sirven para terminar la transcripción de ARNm. Secuencias de terminador (o terminadores de la transcripción en tándem) pueden servir adicionalmente para estabilizar ARNm (p. ej. añadiendo estructura al ARNm) por ejemplo frente a nucleasas.

Todavía en otro aspecto, una molécula de ácido nucleico recombinante de la descripción incluye secuencias que permiten la detección del vector que contiene dichas secuencias (es decir, marcadores detectables y/o seleccionables), por ejemplo genes que codifican secuencias de resistencia a antibióticos o que superan mutaciones auxotróficas, por ejemplo trpC, marcadores de fármacos, marcadores fluorescentes y/o marcadores colorimétricos (p. ej. lacZ/\beta-galactosidasa). Todavía en otro aspecto, una molécula de ácido nucleico recombinante de la descripción incluye un sitio de unión a ribosoma (RBS - siglas en inglés) artificial o una secuencia que es transcrita en un RBS artificial. La expresión "sitio de unión al ribosoma RBS artificial)" incluye un sitio dentro de una molécula de ARNm (p. ej. codificada dentro de ADN) a la que se une un ribosoma (p. ej. para iniciar la traducción), que difiere de un RBS nativo (p. ej. un RBS encontrado en un gen que se produce en la naturaleza) en al menos un nucleótido. RBSs artificiales preferidos incluyen aproximadamente 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16, 17-18, 19-20, 21-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30 o más nucleótidos, de los cuales aproximadamente 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-15 o más difieren del RBS nativo (p. ej. RBS nativo de un gen de interés).

La presente descripción ofrece, además, vectores (p. ej. vectores recombinantes) que incluyen moléculas de ácidos nucleicos (p. ej. genes o moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que comprenden dichos genes) según se describe en esta memoria. La expresión "vector recombinante" incluye un vector (p. ej. plásmido, fago, fagémido, virus, cósmido u otro vector de ácido nucleico purificado) que ha sido alterado, modificado o tratado mediante ingeniería de manera que contiene un número de secuencias de ácidos nucleicos mayor, menor o diferente que las incluidas en la molécula de ácido nucleico nativa o natural de la que se derivó el vector recombinante. Preferiblemente, el vector recombinante incluye un gen codificador de una enzima biosintética o una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye dicho gen, operativamente enlazada a secuencias reguladoras, por ejemplo secuencias de promotor, secuencias de terminador y/o sitios de unión al ribosoma (RBS) artificial, según se define en esta memoria. En otro aspecto, un vector recombinante de la descripción incluye secuencias que refuerzan la replicación en bacterias (p. ej. secuencias reforzadoras de la replicación). En un aspecto, las secuencias reforzadoras de la replicación funcionan en E. coli o C. glutamicum. En otro aspecto, secuencias reforzadoras de la replicación se derivan de pBR322.

Todavía en otro aspecto, un vector recombinante de la descripción incluye secuencias de resistencia a antibióticos. La expresión "secuencias de resistencia a antibióticos" incluye secuencias que fomentan o confieren resistencia a antibióticos en el organismo hospedador (p. ej. Corynebacterium). En un aspecto, las secuencias de resistencia a antibióticos se seleccionan del grupo que consiste en secuencias cat (de resistencia a cloranfenicol), secuencias tet (de resistencia a tetraciclina), secuencias erm (de resistencia a eritromicina), secuencias neo (de resistencia a neomicina), secuencias kan (de resistencia a canamicina) y secuencias spec (de resistencia a espectinomicina). Vectores recombinantes de la descripción pueden incluir, además, secuencias de recombinación homólogas (p. ej. secuencias diseñadas para permitir la recombinación del gen de interés en el cromosoma del organismo hospedador). Además, por parte un experto en la técnica se apreciará que el diseño de un vector se puede adaptar dependiendo de factores tales como la elección del microorganismo a ser tratado mediante ingeniería genética, el nivel de expresión del producto génico deseado y similar.

Se apreciará, además, por parte de un experto en la técnica que el diseño de un vector se puede adaptar en función de factores tales como la elección del microorganismo a ser tratado mediante ingeniería genética, el nivel de expresión del producto génico deseado y similares.

"Campbell in" (recombinación tipo Campbell por integración) tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un transformante de una célula hospedadora original en el que se ha integrado una molécula de ADN de doble hebra, circular, completa (por ejemplo un plásmido) en un cromosoma mediante un único evento de recombinación homóloga (un evento de cruzamiento integrado) y que resulta eficazmente en la inserción de una versión linearizada de dicha molécula de ADN circular en una primera secuencia de ADN del cromosoma que es homóloga a una primera secuencia de ADN de dicha molécula de ADN circular. "Campbelled in" (integrado según Campbell) se refiere a la secuencia de ADN linearizada que ha sido integrada en el cromosoma de un transformante "Campbell in". Un "Campbell in" contiene una duplicación de la primera secuencia de ADN homóloga, cada una de cuyas copias incluye y rodea a una copia del punto de entrecruzamiento de la recombinación homóloga. El nombre procede del profesor Alan Campbell, quién propuso por primera vez este tipo de recombinación.

"Campbell out" (recombinación tipo Campbell por deleción), tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una célula que desciende de un transformante "Campbell in", en el que ha ocurrido un segundo evento de recombinación homóloga (un evento de cruzamiento por deleción) entre una segunda secuencia de ADN que está contenida en el ADN insertado linearizado del ADN "Campbelled in" y una segunda secuencia de ADN de origen cromosómico que es homóloga a la segunda secuencia de ADN de dicho inserto linearizado, resultando el segundo evento de recombinación en la deleción (desprendimiento) de una porción de la secuencia de ADN integrada pero, de manera importante, resultando también en una porción (ésta puede ser tan pequeña como una sola base) del ADN "Campbelled in" integrado que permanece en el cromosoma, de manera que, comparada con la célula hospedadora original, la célula "Campbell out" contiene uno o más cambios intencionados en el cromosoma (por ejemplo una sustitución de una sola base, sustituciones de múltiples bases, inserción de un gen heterólogo o secuencia de ADN, inserción de una copia o copias adicionales de un gen homólogo o un gen homólogo modificado, o inserción de una secuencia de ADN que comprende más de uno de estos ejemplos antes mencionados, arriba listados).

Una célula o cepa "Campbell out" se obtiene habitualmente, pero no necesariamente, mediante una contra-selección frente a un gen que está contenido en una porción (la porción de la que se desea desprenderse) de la secuencia de ADN "Campbell in", por ejemplo el gen sacB de Bacillus subtilis, que es letal cuando se expresa en una célula que crece en presencia de sacarosa a aproximadamente el 5% al 10%. Ya sea con o sin una contra-selección, una célula "Campbell out" deseada se puede obtener o identificar mediante el rastreo de la célula deseada, utilizando cualquier fenotipo rastreable tal como, pero no limitado a la morfología de la colonia, al color de la colonia, a la presencia o ausencia de resistencia a antibióticos, la presencia o ausencia de una secuencia de ADN dada mediante reacción en cadena de la polimerasa, la presencia o ausencia de una auxotrofía, la presencia o ausencia de una enzima, hibridación de ácido nucleico de la colonia, rastreo de anticuerpos, etc. Las expresiones "Campbell in" y "Campbell out" también se pueden utilizar como verbos en diversos tiempos para referirse al método o proceso descrito anteriormente.

Ha de entenderse que los eventos de recombinación homóloga que conducen a una "Campbell in" o "Campbell out" pueden producirse a lo largo de un intervalo de bases de ADN dentro de la secuencia de ADN homóloga y, dado que las secuencias homólogas serán idénticas entre sí, para al menos parte de este intervalo, no es habitualmente posible especificar con exactitud donde se produjo el evento de entrecruzamiento. En otras palabras, no es posible especificar con precisión qué secuencia procedía originalmente del ADN insertado y cual era originalmente del ADN cromosómico. Además de ello, la primera secuencia de ADN homóloga y la segunda secuencia de ADN homóloga están habitualmente separadas por una región de una no homología parcial, y es esta región de no homología la que queda depositada en un cromosoma de la célula "Campbell out".

Por motivos prácticos, en C. glutamicum, primera y segunda secuencias de ADN homólogas típicas tienen una longitud de al menos aproximadamente 200 pares de bases y pueden ser de una longitud de hasta varios miles de pares de bases, pero puede hacerse que el proceso trabaje con secuencias más cortas o más largas. Por ejemplo, una longitud para la primera y segunda secuencias homólogas puede oscilar entre aproximadamente 500 y 2000 bases, y la obtención de una "Campbell out" a partir de una "Campbell in" viene facilitada al disponer la primera y segunda secuencias homólogas de modo que sean aproximadamente de la misma longitud, preferiblemente, con una diferencia menor que 200 pares de bases y, lo más preferiblemente, constituyendo la más corta de las dos al menos el 70% de la longitud de la más larga en pares de bases.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deberían considerarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Generación de la cepa M2014

La cepa ATCC 13032 de C. glutamicum fue transformada con ADN A (al que se alude también como pH273) (SEQ ID Nº:1) y fue "Campbelled in" para proporcionar una cepa "Campbell in". La Figura 2 muestra una vista esquemática del plásmido pH273. La cepa "Campbell in" fue entonces "Campbelled out" para proporcionar una cepa "Campbell out", M440, que contiene un gen que codifica una enzima homoserina dehidrogenasa resistente a la retroalimentación (hom^{fbr}). La proteína homoserina deshidrogenasa resultante incluía un cambio en los aminoácidos, en que S393 fue cambiado a F393 (al que se alude como Hsdh S393F).

Subsiguientemente, la cepa M440 fue transformada con ADN B (al que también se alude como pH373) (SEQ ID Nº:2) para proporcionar una cepa "Campbell in". La Figura 3 representa una vista esquemática del plásmido pH373. La cepa "Campbell in" fue entonces "Campbelled out" para proporcionar una cepa "Campbell out", M603, que contiene un gen que codifica una enzima aspartato quinasa resistente a la retroalimentación (Ask^{fbr}) (codificada por lysC). En la proteína aspartato quinasa resultante, T311 fue cambiado a I311 (al que se alude como LysC T311I).

Se encontró que la cepa M603 producía lisina aproximadamente 17,4 mM, mientras que la cepa ATCC13032 no producía cantidad medible alguna de lisina. Adicionalmente, la cepa M603 producía homoserina aproximadamente 0,5 mM en comparación con la cantidad no

\hbox{medible producida por la cepa ATCC 13032
según se resume en la Tabla 2.}

TABLA 2 Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas ATCC13032 y M603

2

La cepa M603 fue transformada con ADN C (al que también se alude como pH304, del que en la Figura 4 se representa una vista esquemática) (SEQ ID Nº:3) para proporcionar una cepa "Campbell in", que luego fue "Campbelled out" para proporcionar una cepa "Campbell out", M690. La cepa M690 contenía un promotor PgroES aguas arriba del gen MetH (al que se alude como P_{497} metH) (la secuencia de ácidos nucleicos de P_{497} se recoge en SEQ ID Nº:12). La cepa M690 producía lisina aproximadamente 77,2 mM y homoserina aproximadamente 41,6 mM, según se muestra a continuación en la Tabla 3.

TABLA 3 Cantidades de homoserina, O-acetil homoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M603 y M690

3

La cepa M690 se sometió subsiguientemente a mutagénesis como sigue: un cultivo de una noche de M603, hecho crecer en medio BHI (BECTON DICKINSON), se lavó en tampón citrato 50 mM pH 5,5, se trató durante 20 min a 30ºC con N-metil-N-nitrosoguanidina (10 mg/ml en citrato 50 mM pH 5,5). Después del tratamiento, las células se lavaron de nuevo en tampón citrato 50 mM pH 5,5 y se extendieron en placas en un medio que contenía los siguientes ingredientes: (todas las cantidades mencionadas se calculan para 500 ml de medio) 10 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 0,5 g de KH_{2}PO_{4}; 0,5 g de K_{2}HPO_{4}; 0,125 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 21 g de MOPS; 50 mg de CaCl_{2}; 15 mg de ácido protocatecuico; 0,5 mg de biotina; 1 mg de tiamina; y 5 g/l de D,L-metionina (SIGMA CHEMICALS, Nº DE CATÁLOGO E5139), ajustada a pH 7,0 con KOH. Además, el medio contenía 0,5 ml de una disolución de metales traza compuesta por: 10 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O; 1 g/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,1 g/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de CuSO_{4}; y 0,002 g/l de NiCl_{2}\cdot6H_{2}O, todos ellos disueltos en HCl 0,1 M. El medio final se esterilizó mediante filtración y al medio se añadieron 40 ml de disolución estéril de glucosa al 50% (40 ml) y agar estéril hasta una concentración final de 1,5%. El medio que contenía el aguar final se vertió en placas de agar y se marcó como medio de etiniona mínimo. Las cepas sometidas a mutagénesis se esparcieron sobre las placas (etinionina mínimo) y se incubaron durante 3-7 días a 30ºC. Se aislaron los clones que crecieron en el medio y se volvieron a inocular por estrías en el mismo medio de etionina mínimo. Se seleccionaron varios clones para el análisis de la producción de metionina.

La producción de metionina se analizó como sigue: las cepas se hicieron crecer en medio de agar CM durante dos días a 30ºC, que contenía: 10 g/l de D-glucosa; 2,5 g/l de NaCl; 2 g/l de urea; 10 g/l de Bacto Peptone (DIFCO); 5 g/l de extracto de levadura (DIFCO); 5 g/l de extracto de carne (DIFCO); 22 g/l de agar (DIFCO); y que se sometió a autoclave durante 20 min a aproximadamente 121ºC.

Después de crecer las cepas, las células se separaron mediante raspado y se resuspendieron en NaCl 0,15 M. Para el cultivo principal, se añadió una suspensión de células raspadas a una DO de partida de 600 nm a aproximadamente 1,5 a 10 ml de medio II (véase más abajo), junto con 0,5 g de CaCO_{3} sólido y sometido en autoclave (RIEDEL DE HAEN) y las células se incubaron en un matraz con agitación de 100 ml sin hendiduras internas durante 72 h en una plataforma de agitación horizontal a aproximadamente 200 rpm y a 30ºC. El medio II contenía: 40 g/l de sacarosa; 60 g/l de azúcares totales procedentes de melazas (calculados para el contenido en azúcares); 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 0,4 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 0,6 g/de KH_{2}PO_{4}; 0,3 mg/l de tiamina. HCl; 1 mg/l de biotina; 2 mg/l de FeSO_{4}.; y 2 mg/l de MnSO_{4}. El medio se ajustó a pH 7,8 con NH_{4}OH y se sometió en autoclave a aproximadamente 121ºC durante aproximadamente 20 min. Después de someter en autoclave y de enfriar, se añadió vitamina B_{12} (cianocobalamina) (SIGMA CHEMICALS) procedente de una disolución de partida estéril del filtro (200 \mug/ml) hasta una concentración final de 100 \mug/l.

Las muestras se tomaron del medio y se ensayaron en cuanto al contenido en aminoácidos. Los aminoácidos producidos, incluida metionina, se determinaron utilizando el método de aminoácidos de Agilent en un sistema Agilent 1100 Series LC System HPLC. (AGILENT). Una derivatización de la muestra en la pre-columna con orto-ftalaldehído permitió la cuantificación de los aminoácidos producidos después de la separación en una columna Hypersil AA (AGILENT).

Se aislaron los clones que mostraban un título de metionina que era al menos el doble que en M690. Un clon de este tipo, utilizado en experimentos ulteriores, se denominó M1179 y se depositó el 18 de mayo de 2005 en la colección de cepas de DSMZ como cepa número DSM 17322. La producción de aminoácidos por parte de esta cepa se comparó con la de la cepa M690, según se resume a continuación en la Tabla 4.

TABLA 4 Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M690 y M1197

4

La cepa M1179 se transformó con ADN F (al que también se alude como pH399, del que en la Figura 5 se representa una vista esquemática) (SEQ ID Nº:4) para proporcionar una cepa "Campbell in", la cual fue subsiguientemente "Campbelled out" para proporcionar la cepa M1494. Esta cepa contiene una mutación en el gen para la homoserina quinasa, que resulta en un cambio de aminoácidos en la enzima homoserina quinasa resultante de T190 a A190 (a la que se alude como HskT190A). La producción de aminoácidos por parte de la cepa M1494 se comparó con la producción por parte de la cepa M1197, según se resume a continuación en la Tabla 5.

TABLA 5 Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas LU11197 y M1494

5

La cepa M1494 se transformó con ADN D (al que también se alude como pH484, del que en la Figura 6 se representa una vista esquemática) (SEQ ID Nº:5) para proporcionar una cepa "Campbell in", la cual fue subsiguientemente "Campbelled out" para proporcionar la cepa M1990. La cepa M 1990 sobre-expresa un alelo metY utilizando tanto un promotor groES como un promotor EFTU (factor de elongación Tu) al que se alude como P_{497} P_{1284} metY) (la secuencia de P_{497} P_{1284} se muestra en SEQ ID Nº:6). La producción de aminoácidos por parte de la cepa M1494 se comparó con la producción por parte de la cepa M1990, según se resume a continuación en la Tabla 6.

TABLA 6 Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M1494 y M1990

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La cepa M1990 se transformó con ADN E (al que también se alude como pH491, del que en la Figura 7 se representa una vista esquemática) (SEQ ID Nº:7) para proporcionar una cepa "Campbell in", la cual fue subsiguientemente "Campbelled out" para proporcionar una cepa M2014 "Campbell out". La cepa M 2014 sobre-expresa un alelo metA utilizando tanto un promotor de superóxido dismutasa (al que se alude como P_{3119} metA). La producción de aminoácidos por parte de la cepa M2014 se comparó con la producción por parte de la cepa M2014, según se resume a continuación en la Tabla 7.

TABLA 7 Cantidades de homoserina, O-acetilhomoserina, metionina y lisina producidas por las cepas M1990 y M1494

7

Ejemplo 2

Auxótrofos de metionina de C. glutamicum incorporan disulfuro de dimetilo en metionina

Con el fin de determinar si C. glutamicum tiene la capacidad de incorporar DMDS en metionina, se construyó una deleción de metF en la cepa M2014 (descrita en el Ejemplo 1). M2014 se transformó con el plásmido pOM86 (Figura 9) (SEQ ID Nº:8) para proporcionar una cepa "Campbell in". La cepa "Campbell in" fue luego "Campbelled out" para proporcionar una cepa "Campbell out" denominada OM63. Con el fin de determinar si este auxótrofo de metionina, OM63, podía utilizar DMDS para sintetizar metionina, cultivos en tubos de ensayo de OM63 y de M2014 parental se sometieron a ensayo en cuanto al crecimiento midiendo la DO a 600 nm. Los cultivos se hicieron crecer en medio exento de metionina (en cuanto a la receta, véase más abajo), medio exento de metionina suplementado con metionina o medio exento de metionina suplementado con diversas cantidades diferentes de DMDS (Aldrich, nº de Catálogo 32.041-2). Este experimento se diseñó para determinar si DMDS puede atravesar la membrana de la bacteria, reducirse en metano-tiol una vez que se encuentra dentro del citoplasma y utilizarse subsiguientemente por parte de MetY o Met B u otra enzima, por ejemplo MetC, como un sustrato en unión con O-acetil-homoserina para formar L-metionina directamente. Este experimento también se diseñó para determinar la toxicidad de DMDS, si es que existiera, sobre el crecimiento de las células.

Tal como se muestra en la Tabla 8, los auxótrofos metF de C. glutamicum pueden utilizar DMDS como sustrato para el crecimiento y, por lo tanto, para la producción de metionina. Además, las densidades ópticas eran similares para todas las cepas en los tubos de ensayo que contenían 5 ml de medio exento de metionina suplementado con DMDS al 0,02%, 0,04% ó 0,06%. Los tubos de ensayo que contenían 5 ml de medio exento de metionina suplementado con DMDS al 0,08% o al 0,1% mostraban un pequeño crecimiento o ninguno, presumiblemente debido a la toxicidad de DMDS a estas concentraciones. Finalmente, según lo esperado, medio exento de metionina sin DMDS sustentaba el crecimiento de M2014, pero no de OM63.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 Densidades ópticas a 600 nm de cultivos en tubos de ensayo^{1} de C. glutamicum desarrollados en medio exento de metionina con o sin metionina suplementada o disulfuro de dimetilo (DMDS) durante 36 horas a 30ºC

8

Los resultados de este experimento demuestran que DMDS puede recogerse y escindirse de forma reductiva en metano-tiol por parte de C. glutamicum y entrar en la vía de la metionina para sustentar el crecimiento de un auxótrofo de metionina. Alternativamente, DMDS es un sustrato directo para O-acetil-homoserina sulfhidrilasa u O-O-succinil-homoserina sulfhidrilasa u otra enzima. En otras palabras, es posible que una sola enzima pueda catalizar la escisión reductiva y la incorporación de DMDS en metionina.

Medio exento de metionina - 1 litro

: 100 ml de medio de ensayo de metionina Difco^{TM} (105 g/l)

: 100 ml de sales 10x de Spizizen*

: 6 ml de glucosa (al 50%)

: 4 ml de disolución "4B"**

: 100 mg de treonina

: 40 mg de cisteína

: 785 ml de dH_{2}O

: 5 ml de CaCl_{2} al 2%.

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** Disolución 4B

: tiamina (B_{1}) - 0,25 mg/ml

: cianocolbalamina (B_{12}) - 50 \mug/ml

: biotina - 28 \mug/ml en KPO_{4} 50 mM pH = 7,0

: piridoxina HCl - 1,25 mg/ml.

\newpage

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Sales 10x de Spizizen*

: 20 g/l de sulfato de amonio

: 174 g/l de fosfato potásico dibásico (trihidrato)

: 60 g/l de fosfato potásico monobásico (anhidro)

: 10 g/l de citrato de sodio

: 2 g/l de sulfato de magnesio (heptahidrato).

\vskip1.000000\baselineskip

: Después de someter en autoclave, añadir 3,5 ml de FeCl_{3}\cdot6 H_{2}O al 0,4% y 1 ml de disolución de micronutrientes^{1}

\vskip1.000000\baselineskip

^{1}Disolución de micronutrientes

: 0,15 g de Na_{2}MoO_{4}\cdot2 H_{2}O

: 2,5 g de H_{3}BO_{3}

: 0,7 g de CuSO_{4}\cdot5 H_{2}O

: 1,6 g de MnCl_{2}\cdot4 H_{2}O

: 0,3 g de ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O.

Una versión sólida de este medio se puede preparar incluyendo aproximadamente 15 a 20 g/L de agar. Esto se consigue mediante procesos convencionales tal como añadiendo 20 g de agar a aproximadamente 750 ml de agua, sometiéndolo en autoclave y, mientras sigue estando fundido, añadiendo los ingredientes arriba listados en forma de disoluciones de partida estériles.

Ejemplo 3

Desarrollo de un sistema de suministro de DMDS a C. glutamicum para la incorporación en metionina

Como se ha comentado anteriormente, DMDS es tóxico si se añade directamente a cultivos líquidos en cantidades mayores que aproximadamente 0,06%. Con el fin de superar este problema, se buscó un sistema de suministro que permitiera la liberación lenta de DMDS en disolución a lo largo del tiempo. Amberlite^{TM} XAD4, una resina de poliestireno macroporosa en forma de perlas, a la que se alude en lo que sigue como "XAD4", se eligió como sistema de suministro debido a que es inerte, capaz de absorber pequeños compuestos orgánicos hidrófobos, es capaz de ser humedecida por el agua y tiene una superficie específica elevada y un tamaño de poros pequeño.

Se llevó a cabo un experimento en tubos de ensayo con el fin de determinar la cantidad máxima de DMDS que puede ser adsorbida por XAD4 y que todavía permita el crecimiento. Para este fin, se llevaron a cabo experimentos en tubo de ensayo utilizando 5 ml de medio sobre OM63 y M2014. Cada uno de los tubos de ensayo contenía 100 \mul de una suspensión al 50% (v/v) de XAD4 y medio exento de metionina, medio exento de metionina suplementado con metionina o medio exento de metionina suplementado con diversas cantidades de DMDS.

Se prepararon ensayos en tubo de ensayo añadiendo 5 ml de medio exento de metionina a tubos de ensayo estériles de 20 mm x 20 mm x 150 mm, cubiertos con tapones de metal no ajustados. A cada uno de los tubos de ensayo se añadieron 100 \mul de una suspensión estéril de XAD4 en agua (al 50% v/v). Los tubos de ensayo se inocularon con células que se hicieron crecer durante una noche en tubos de ensayo que contenían medio BHI (Bacto^{TM} Brain Heart Infusion (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) y luego se hicieron rotar y se aclararon dos veces con medio exento de metionina. Las células se resuspendieron en el 50% del volumen de partida en medio exento de metionina. La suspensión de células (5 \mul) se utilizó como inóculo para cada uno de los tubos de ensayo. Después de la inoculación de las células, se añadió DMDS a cada uno de los tubos de ensayo a la concentración indicada (v/v). Los tubos de ensayo se incubaron a 30ºC a 200 rpm en un agitador con plataforma durante 24-48 horas. El crecimiento de las células se midió mediante densidad óptica a 600 nm empleando un espectrofotómetro Genesys^{TM} 2.

Tal como se muestra en la Tabla 9, las densidades ópticas eran bastante

similares para todas las cepas en los tubos de ensayo que contenían medio exento de metionina suplementado con DMDS al 0,1%, 0,2%, 0,3% ó 0,4%. Los tubos de ensayo suplementados con DMDS al 0,5% mostraron un efecto negativo sobre el crecimiento en OM63, pero esta concentración de DMDS parecía ser tolerada por M2014. En conclusión, la adsorción de DMDS sobre perlas de XAD4 permite añadir más DMDS a cultivos en tubos de ensayo líquidos de C. glutamicum. Se libera suficiente DMDS a partir de las perlas para permitir el crecimiento completo de un auxótrofo de metionina.

TABLA 9 Densidades ópticas a 600 nm de OM63 y M2014 desarrollados en medio exento de metionina^{1} con o sin las cantidades indicadas de DMDS en presencia de XAD4^{2} durante 42 horas a 30ºC

9

Además, XAD4 solo no tiene efecto adverso aparente alguno sobre el crecimiento de las células. Según lo esperado, los tubos de ensayo que contenían medio exento de metionina sin DMDS sustentaron el crecimiento de M2014, pero no de OM63. Tubos de ensayo que contenían medio exento de metionina suplementado con 40 mg/l de metionina, pero sin DMDS, dieron como resultado una densidad óptica final similar para M2014, pero una densidad óptica algo menor que la esperada para OM63. Esto puede ser debido a que XAD4 adsorbe algo de la metionina suplementada, limitando así el crecimiento de células OM63.

Ejemplo 4

DMDS en estado gaseoso puede sustentar la síntesis de metionina y el crecimiento de OM101 (\DeltametB, \DeltametF)

Se ha demostrado previamente que un análogo de DMDS, diselenuro de dimetilo (DMDSe) es tóxico para los microorganismos en un estado gaseoso pero que podía utilizarse para seleccionar mutantes que carecen de O-acetilhomo-
serina sulfhidrilasa (Brzywczy, J., y Paszewski, A. (1994) Yeast 9: 1335-1342 y Treichler, H. J., et al. (1978) en el Simposium de FEMS nº 5, págs. 177-199, R. Hutter et al., comp., Academic Press, Nueva York). El DMDSe se introdujo en forma de una gota en la cara inferior de la cubierta de una placa de Petri para dar una concentración final de aproximadamente 5 \muM, si el suministro completo de DMDSe se difundía y disolvía en el agar. Sin embargo, no se mencionó el compuesto DMDS y no era obvio si la difusión a través de un estado gaseoso podía aportar concentraciones suficientes de DMDS para el crecimiento (en oposición a la inhibición de análogos). Para fines comparativos, en los experimentos de crecimiento en líquidos de los Ejemplos 1-3 anteriores, la concentración de DMDS era aproximadamente 10 mM (por ejemplo en el caso de 0,1%) o aproximadamente 2000 veces superior a la de DMDSe en las referencias arriba citadas. Sin embargo, el suministro de DMDS en el estado gaseoso podría evadir la toxicidad que se observó con DMDS líquido.

Para testar esta posibilidad, céspedes que contenían aproximadamente 10^{8} células de OM101 (\DeltametB, \DeltametF) se aclararon hasta quedar relativamente exentos de metionina y se extendieron en placas de agar exentas de metionina que contenían aproximadamente 25 ml de medio agar. DMDS se suministró salpicando 50 \mul en el centro de la placa o cortando un pocillo en el agar en el centro de la placa y colocando 50 \mul de DMDS en el pocillo. Si el DMDS se difundía a través de la placa, la concentración final sería de aproximadamente 25 mM. Placas control recibieron el césped de células, pero nada de DMDS. Las placas se colocaron juntas en una caja de plástico de polipropileno cerrada herméticamente que era ligeramente mayor que la pila de placas, y se incubaron a 30ºC durante 48-60 horas. Las placas salpicadas con DMDS directamente sobre el césped tenían una zona de exterminio de aproximadamente 30 mm desde la cual se salpicó el DMDS líquido, pero el resto de la placa estaba cubierto uniformemente con un césped de crecimiento. Placas que contenían DMDS líquido colocadas en un pocillo no tenían zona de exterminio, sino un césped de crecimiento que cubría uniformemente a toda la placa, incluida la periferia de la placa y justo hasta el pocillo del centro. Normalmente, cuando un nutriente requerido se coloca en el centro de un césped que es auxotrófico para el nutriente, se observa un gradiente de crecimiento, produciéndose el crecimiento más rápido en la zona más próxima al nutriente. Finalmente, placas control sin DMDS añadido, pero colocadas en la misma caja de plástico cerrada herméticamente con placas que recibieron DMDS, dieron céspedes completos de crecimiento de OM101. Estas observaciones sugirieron que el crecimiento de los auxótrofos de C. glutamicum podía ser sustentado por la difusión de DMDS en el estado gaseoso.

Con el fin de demostrar la transferencia gaseosa, se llevó a cabo un experimento en el que cavidades circulares (25 x 25 x 5 mm) se cortaron desde el centro del agar de placas exentas de metionina, previamente rociadas con un césped de OM101. En estas cavidades se colocaron tubos cónicos con tapones roscados de polipropileno rojo estériles ((20 x 20 x 5 mm) de Sarstedt® (Nº 62.554.002)), que servían como copas para 50 \mul de DMDS líquido. Este método aseguraba que el DMDS líquido no entrara en contacto directo con las células y que sólo pudiera alcanzar a las células por difusión a través de un estado gaseoso, ya que DMDS no se difunde rápidamente a través del polipropileno. Las placas se incubaron a 30ºC encerradas en una caja de plástico estanca al aire. Las placas de control para este experimento eran placas exentas de metionina rociadas con un césped de OM101 y se incubaron a 30ºC en ausencia de DMDS en una caja de plástico cerrada separada. Al cabo de dos días se observó que un césped bacteriano completo cubría las placas que tenían la tapa estéril que contenía DMDS líquido y que las placas control, que carecían de DMDS, en un recipiente separado, no mostraron crecimiento alguno. Estos experimentos, tomados juntos, indican que el contacto directo de DMDS líquido es necesario para la toxicidad de OM101 y que, en contraposición, DMDS en estado gaseoso no es tóxico, sino que puede seguir utilizándose por parte de OM101 para el crecimiento y, por lo tanto, la síntesis de metionina. Así, en un tanque de fermentación, DMDS podía ser suministrado a las células en un estado gaseoso con el fin de evitar la toxicidad de DMDS a las células en el estado líquido. Esto se pudo conseguir evaporando o calentando a ebullición DMDS y bombeando el vapor de DMDS en el recipiente de fermentación, o burbujeando aire u oxígeno a través de DMDS líquido en su recorrido al recipiente de fermentación.

Ejemplo 5

Construcción de una cepa \DeltametE, \DeltametH

Se construyó una cepa de C. glutamicum que está desprovista tanto de metE como de metH. M2014 se transformó con el plásmido pH469 (Figura 10) (SEQ ID Nº:9) para proporcionar una cepa "Campbell in". Después, la cepa "Campbell in" fue "Campbelled out" para proporcionar una cepa "Campbell out", OM228C-2, que contiene la deleción met E. Después, OM228C-2 se transformó con el plásmido pH300 (Figura 11) (SEQ ID Nº:10) para proporcionar una cepa "Campbell in". La cepa "Campbell in" fue luego "Campbelled out" para proporcionar una cepa "Campbell out", OM246C, que contiene tanto \DeltametE como \DeltametH. Como era de esperar, dos aislados de la cepa de doble deleción, OM246C-1 y OM246C-2, son auxótrofos de metionina y no producen metionina en los cultivos en tubos de ensayo en medio de melazas.

Ejemplo 6

MetY es el responsable de la mayor parte de la actividad enzimática que cataliza la reacción entre metano-tiol con O-acetil-homoserina para la producción de metionina

Dado que informes de la bibliografía sugieren que MetB (Flavin, M. y S. Slaughter 1967. Biochim. Biophys. Acta, 132:400-405; Kanzaki, H. et al. 1987. Eur. J. Biochem. 163: 105-112; Kiene, R. P. et al. 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65: 4549-4558) o MetZ (Yamagata, S. 1971. J. Biochem. (Tokyo) 70: 1035) podría estar implicado en la incorporación de metano-tiol, se llevó a cabo un experimento con un derivado de OM63 que contenía un alelo \DeltametB para identificar la enzima implicada en la incorporación de metano-tiol en C. glutamicum. Como se demostró anteriormente, C. glutamicum puede incorporar disulfuro de dimetilo (DMDS), a través de metano-tiol, directamente en metionina. En el Ejemplo 3, se determinó que DMDS es tolerado por las células si se añade directamente a cultivos líquidos en cantidades menores que aproximadamente 0,06%, pero si se añade en presencia de un sistema de suministro tal como el adsorbente Amberlite^{TM} XAD4, las cantidades de DMDS añadido a cultivos líquidos pueden incrementarse 5 veces antes de que se observe una toxicidad.

El auxótrofo de metionina OM63 (\DeltametF) se utilizó para experimentos de "prueba de concepto" que demuestran que C. glutamicum puede utilizar DMDS para sustentar el crecimiento de un auxótrofo de metionina \DeltametF. Con el fin de definir adicionalmente cual o cuales enzimas están implicadas en la incorporación de metano-tiol en metionina en C. glutamicum, cepas que contenían una deleción en metB se sometieron a ensayo en cuanto a su capacidad para crecer en presencia de DMDS.

OM101C (\DeltametF, \DeltametB), derivado de OM63 transformado con H216, que contiene el mismo alelo de deleción metB que pSH315 (Hwang BJ, et al. J. Bacteriol. 2002, Mar; 184 (5): 1277-86) para suprimir metB, OM246c (\DeltametH, \DeltametE) descrito en el Ejemplo 4, OM63 (\DeltametF) y M2014 se hicieron crecer en tubos de ensayo que contenían 100 \mul de una suspensión al 50% de Amberlite XAD4 y medio exento de metionina o medio exento de metionina suplementado con diversas cantidades de DMDS. Tal como se muestra en la Tabla, 10, las densidades ópticas eran similares para todas las cepas en los tubos de ensayo que contenían medio exento de metionina suplementado con DMDS al 0,1 ó 0,2%. Todas las cepas eran capaces de crecer en medio exento de metionina suplementado con DMDS al 0,4%, con la excepción de OM101C, que mostró una inhibición del crecimiento en DMDS al 0,3%. Únicamente la cepa OM246C era capaz de crecer en presencia de DMDS al 0,5%. Tomados juntos, estos resultados demuestran que MetB, MetH/MetE y MetF no son necesarios para la incorporación de metano-tiol en metionina. Por lo tanto, MetY es suficiente para la actividad enzimática que permite la incorporación de DMDS en metionina.

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10

Ejemplo 7

Identificación de MetY como la enzima con actividad de O-acetilhomoserina metanol-tiol sulfhidrilasa

Aquí los autores de la invención demuestran directamente que MetY, pero no MetB, es la enzima necesaria y suficiente para la actividad de O-acetilhomoserina metano-tiol sulfhidrilasa. Se llevó a cabo un experimento en tubos de ensayo con derivados de M2014 que contenían diferentes combinaciones de deleciones de metY, metB y metF. Las cepas se hicieron crecer en medio exento de metionina con perlas de Amberlite^{TM} XAD4 y con o sin DMDS a 200 mg/l o metionina a 100 mg/l. El inóculo era aproximadamente de 5 x 10^{3} células por tubo. Las células se hicieron crecer a 30ºC en un agitador de plataforma durante 60 horas y las densidades de células se midieron a
DO_{600}.

Tal como se muestra en la Tabla 11, DMDS puede sustentar el crecimiento de los auxótrofos de metionina OM63 (\DeltametF) y OM101 (\DeltametF, \DeltametB), pero DMDS no puede sustentar el crecimiento de cualquier auxótrofo de metiona que contenga una deleción metY tal como OM158 u OM174. OM158 se construyó transformando OM63 con el plásmido pH215 (SEQ ID Nº: 11) para proporcionar una cepa "Campbell in". La secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID Nº:11 es la región en pH215 del gen metY suprimido, que se extiende desde el codón de inicio de metY, residuos 1-3, al codón de detención de metA, residuos 912-914. Las dos bases que rodean a la deleción se encuentran en los residuos 609-610. Después, la cepa "Campbell in" fue "Campbell out" para proporcionar una cepa "Campbell out", OM158, que contiene \DeltametF, \DeltametY. OM174 se construyó transformando OM101 con el plásmido pH215 para proporcionar una cepa "Campbell in". La cepa "Campbell in" fue luego "Campbell out" para proporcionar una cepa "Campbell out", OM174, que contiene \DeltametF, \DeltametB, \DeltametY. La Figura 8 muestra la estructura del cromosoma de C. glutamicum en la región de metY antes (8A) y después (8B) de la deleción de una porción de metY utilizando el plásmido pH215.

Estos datos demuestran que MetY es la única enzima responsable de la actividad de O-acetil homoserina metano-tiol sulfhidrilasa y que ni MetB ni MetC contienen un nivel suficiente de esta actividad enzimática para el crecimiento bajo estas condiciones.

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(Tabla pasa a página siguiente)

11

Ejemplo 8

Eficacia de la producción de metionina en cepas auxotróficas de C. glutamicum

Una vez que se estableció que un auxótrofo de C. glutamicum, \DeltametF o \DeltametE o \DeltametH podía utilizar DMDS para la síntesis de metionina, era interesante determinar la eficacia de la producción de metionina. Se llevó a cabo un experimento en matraz agitador en el que OM246C se comparó con M2014. Cada matraz agitador contenía 20 ml de medio de melazas y 800 \mul de una suspensión al 50% de Amberlite^{TM} XAD4, con o sin DMDS al 0,4%. Tal como se muestra en la Tabla 12, OM246C sin DMDS acumulaba poca metionina. En contraposición OM246C suplementado con DMDS acumulaba aproximadamente 0,3 g/l de metionina. Así, la producción de metionina se produce de la conversión de O-acetil-homoserina directamente en metionina, eludiendo la homocisteína. Lo más importante, el incremento neto en el título de metionina en OM246C, hecha crecer en presencia de DMDS, establece firmemente que metionina puede ser producida por mutantes de C. glutamicum defectuosos en la última etapa de la síntesis de la metionina cuando está presente DMDS. La cepa control M2014 acumulaba perfiles similares de aminoácidos, ya creciera en presencia de DMDS o no. De manera interesante, DMDS estimulaba ligeramente la producción de metionina en M2014 desde aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 0,7 g/l. Esto se explica por un efecto aditivo de la incorporación de DMDS en combinación con la producción de metionina a partir de las vías biosintéticas de metionina convencionales.

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(Tabla pasa a página siguiente)

12

Ejemplo 9

Desarrollo adicional de un sistema de suministro de DMDS a C. glutamicum para la incorporación en metionina

Con el fin de explorar adicionalmente potenciales sistemas de suministro de DMDS (además de Amberlite^{TM} XAD4), se investigaron tanto aceite mineral blanco pesado (Sigma nº de cat. 400-5) como un aceite vegetal, aceite de colza. Dado que los aceites son hidrófobos, deberían ser capaces de disolver el DMDS y permitir, en potencia, la liberación lenta de DMDS en el medio acuoso. Aceite (0,5 ml) que contenía cantidades diversas de DMDS disuelto se añadió a los tubos de ensayo que contenían 5 ml de medio exento de metionina con o sin 100 mg/l de metionina. Densidades ópticas de los cultivos celulares que contenían concentraciones finales de 0, 0,2, 0,4, 0,8 y 1,2% de DMDS se midieron después de la incubación a 30ºC durante 24 horas en un agitador de plataforma. Tal como se muestra en la Tabla 13, el crecimiento de OM246C se producía en tubos de ensayo que contenían DMDS hasta al 0,4% mientras que el crecimiento de M2014 se producía en tubos de ensayos que contenían DMDS hasta al 0,8% disuelto en aceite mineral. Sin embargo, las densidades ópticas eran menos de la mitad en comparación con las de cultivos en tubos de ensayo que contenían medio exento de metionina sin aceite mineral. La cantidad máxima de DMDS en el aceite mineral comparada con Amberlite^{TM} XAD4 que permitía el crecimiento de las células era ligeramente superior para M2014 (0,8% frente a 0,4%), pero similar para OM63 (0,4% frente a 0,4%). Se observaron resultados similares cuando el aceite de colza se sometió a ensayo como un sistema de suministro; sin embargo, el aceite de colza solo no tiene un efecto tan negativo sobre el crecimiento de células como el aceite mineral (Tabla 14). El crecimiento reducido en presencia de estos aceites puede ser debido, en parte, a la carencia de una aireación suficiente en los cultivos en tubos de ensayo, una ruptura de la membrana de la célula o una combinación de ambos. No obstante, resulta obvio que los aceites se pueden utilizar como un sistema de suministro para DMDS en fermentaciones. Aceites derivados de fuentes animales, minerales, químicas o vegetales, o una combinación de las mismas, podrían utilizarse para el suministro de DMDS a las células. Otros sistemas de suministro posibles incluyen aceites sintéticos, disolventes orgánicos, clorocarburos, fluorocarburos o cloro-fluoro-carburos. Un enfoque adicional sería una alimentación de DMDS controlada lenta que proporcione una concentración en estado estacionario a las células que sea inferior al nivel tóxico. La selección de cepas de C. glutamicum resistentes a DMDS también aliviaría los aspectos de toxicidad por DMDS. Finalmente, utilizando una especie hospedadora que sea inherentemente más resistente a la toxicidad frente a DMDS también aliviaría este problema.

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(Tabla pasa a página siguiente)

13

14

Ejemplo 10

Mejora de las cepas

El gen metB de E. coli ha sido mutado o ha evolucionado para utilizar metano-tiol (documento WO 2004/076659 A2). Procesos de selección similares se pueden aplicar utilizando auxótrofos de metionina, por ejemplo que carecen de MetE y MetH o MetF, pero utilizando DMDS antes que metano-tiol en el medio selectivo. Así, se pueden seleccionar microorganismos en cuanto a los que tengan una mayor capacidad de incorporar DMDS en metionina, comenzando con un auxótrofo de metionina que, por ejemplo, pueda producir O-acetil homoserina u O-succinil homoserina, pero que no pueda utilizar homocisteína, y seleccionando para el crecimiento, o un crecimiento más rápido, en un medio mínimo que carece de metionina pero que contiene DMDS, y con o sin mutagénesis por parte de productos químicos, radiación o alelos mutadores. Este tipo de selección se puede dirigir a un gen particular, por ejemplo un gen metB, un gen metY, un gen metC, o un gen metI (Auger et al., 2002 Microbiology 148: 507-518), instalando el gen en un plásmido e introduciendo el plásmido en una cepa que carece (por deleción o mutación) de la capacidad endógena de incorporar DMDS y llevando a cabo la selección como se ha descrito antes. Descendientes de microorganismos seleccionados de este tipo o genes aislados de microorganismos seleccionados de este tipo también son útiles para construir o derivar cepas de producción de metionina.

Ejemplo 11

E. coli puede metabolizar DMDS en metionina si se suministra con O-acetil homoserina sulfhidrilasa u O-succinil homoserina sulfhidrilasa

Auxótrofos de metionina de E. coli CGSC 3592 (metF64) y RY714B, un derivado met E:Tn10, \DeltametH de MM294, también conocido como ATCC 33625 y CGSC 6315 (endA1, thi-1, supE44, hsdR17) se transformaron con pH357 (SEQ ID Nº:13; un plásmido que expresa metY y metX de C. glutamicum), pH309 (SEQ ID Nº:14, un plásmido que expresa metY de C. glutamicum) o pCLIK, que es un vector vacío relacionado con pH357 y pH309 que se replica en E. coli y C. glutamicum. (SEQ ID Nº:15). La selección fue en cuanto a la resistencia al sulfato de canamicina a 25 mg/l en medio rico (agar de caldo Luria). Los seis transformantes se extendieron en placas en medio de agar exento de metionina, se cortó un pocillo en el centro del agar, se añadieron al pocillo 50 microlitos de DMDS y las placas se incubaron según se describe en el Ejemplo 4 a 30ºC. Las dos cepas transformadas pH309 o pH357 crecieron en las placas, pero no creció cepa alguna transformada con el vector pCLIK vacío, demostrando que metY era necesario y suficiente para que E. coli utilizara DMDS para sintetizar metionina. Estos resultados sustentan el argumento de que metY tiene actividad tanto O-acetil homoserina sulfhidrilasa como O-succinil homoserina sulfhidrilasa, ya que RY714B/pH309, por ejemplo, se basa en la enzima MetA de E. coli que se sabe produce principalmente O-succinil homoserina.

Así, E. coli, si se trata mediante ingeniería según se describe en esta memoria, tiene la capacidad de importar DMDS, reducirlo e incorporarlo en metionina. Dado que E. coli y C. glutamicum, que no son organismos estrechamente relacionados, tienen ambos esta capacidad, los autores de la invención anticipan que una amplia diversidad de organismos tienen esta capacidad y que una amplia diversidad de organismos puede ser tratada mediante ingeniería para producir metionina utilizando DMDS como uno de los compuestos alimentados.

Ejemplo 12

Selección la enzima O-acetil homoserina sulfhidrilasa u O-succinil homoserina sulfhidrilasa resistente a la retroalimentación

Para producir metionina por vía biosintética, es deseable utilizar enzimas O-acetilhomoserina sulfhidrilasa y/u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa resistentes a la retroalimentación. En muchos organismos, estas enzimas son inhibidas en cuanto a la retroalimentación por parte de metionina. Por ejemplo, MetY (O-acetilhomoserina sulfhidrilasa) en Corynebacterium glutamicum es inhibida en cuanto a la retroalimentación por parte de metionina, que es contraproductiva para la síntesis de metionina. Se han descrito versiones mutadas de MetY que son supuestamente resistentes a la inhibición por parte de metionina (documento WO 2004/108894 A2), pero estas versiones pudieran no ser las mejores versiones para mejorar la biosíntesis de metionina. Así, sigue existiendo la necesidad de versiones de MetY resistentes a la retroalimentación, adecuadas. Dado que MetY ha demostrado en esta memoria ser una enzima que puede conferir crecimiento en DMDS, se desarrolló un nuevo esquema para seleccionar alelos metY útiles como sigue: una cepa de C. glutamicum que carece de MetF o MetE y MetH y, que opcionalmente, también carece de MetY, MeB y/o MetC, pero que se trata mediante ingeniería para la síntesis de O-acetil homoserina relativalemente elevada, se transforma con un plásmido que expresa MetY tal como pH357 o pH309. La cepa resultante puede crecer en medio exento de metionina que contiene DMDS en virtud del MetY producido por el plásmido pH357 o pH309. Análogos de metionina tales como \alpha-metil metionina, selenometionina, norleucina, trifluorometionina y hidroxamato de metionina, etionina, S-metil-cisteína y similares son rastreados en cuanto los que inhiben el crecimiento de la cepa. Un análogo que inhibe el crecimiento de la cepa lo hará en algunos casos mediante una inhibición de retroalimentación falsa de MetY. En otras palabras, el análogo se unirá al sitio de unión de metionina en MetY e inhibirá la actividad de la enzima. La selección (con o sin mutagénesis) de mutantes resistentes a dicho análogo dará como resultado variantes de MetY que sean resistentes a la unión del análogo y a metionina. ADN del plásmido se aísla de candidatos mutantes de este tipo y se vuelve a transformar en la cepa hospedadora activa y no mutada, y se determina si el fenotipo resistente análogo es codificado por el plásmido introducido. Plásmidos que superan esta criba contendrán una o más mutaciones, algunas de las cuales conferirán la resistencia deseada a la retroalimentación a metionina.

El esquema descrito anteriormente para crear e identificar variantes de O- acetilhomoserina sulfhidrilasa resistentes a la retroalimentación es también apropiado para aislar variantes de la enzima O-succinilhomoserina sulfhidrilasa resistentes a la retroalimentación. El método es similar, pero el organismo de partida produce O-succinilhomoserina como un producto intermedio en lugar de O-acetilhomoserina, y el plásmido codifica una enzima O-succinilhomoserina sulfhidrilasa en lugar de O-acetilhomoserina sulfhidrilasa. En otras palabras, el plásmido contiene un gen metZ en lugar de un gen metY.

La selección antes descrita para MetY o MetZ resistentes a la retroalimentación también se puede llevar a cabo en organismos distintos de C. glutamicum. Por ejemplo, tal como se muestra en el Ejemplo 11 anterior, RY714B/pH309 de E. coli o CGSC 3592/pH357 de E. coli, etc. también pueden crecer en medio exento de metionina con DMDS, de modo que tales cepas también se pueden utilizar para seleccionar variantes deseables de MetY al crecer en medio exento de metionina que contiene DMDS, y seleccionar en cuanto a la resistencia a análogos de metionina. Dado que MetA de E. coli es también sensible a la inhibición por parte de metionina y a algunos análogos tal como \alpha-metil-metionina (Usuda Y, Kurahashi O., Appl. Environ. Microbiol., 2005 Junio; 71 (6):3228-34), la selección de los alelos metY deseables se puede reforzar utilizando un mutante metA de E. coli y suministrando MetA o MetX resistentes a la retroalimentación, por ejemplo con pH357 o utilizando un alelo metA que ya ha sido seleccionado en cuanto a la resistencia al análogo. En general, este método debería funcionar en una amplia diversidad de bacterias, levaduras, hongos, Archaea y plantas.

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<110> BASF AG

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<120> USO DE DISULFURO DE DIMETILO PARA LA PRODUCCIÓN DE METIONINA EN MICROORGANISMOS

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<130> BGI-177PC

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<140>

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<141>

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<150> 60/713.907

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<151> 01-09-2005

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<150> 60/700.698

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<151> 18-07-2005

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<160> 15

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<170> PatentIn Ver. 3.3

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<210> 1

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<211> 7070

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 1

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15

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<210> 2

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<211> 7070

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<210> 3

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<211> 8766

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 7070

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 6625

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 5

27

28

29

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<210> 6

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<211> 363

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Promotor sintético

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<400> 6

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30

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<210> 7

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<211> 6350

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 7

31

33

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<210> 8

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<211> 6440

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 8

34

35

36

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<210> 9

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<211> 5106

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 9

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37

38

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<210> 10

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<211> 5512

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 10

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39

40

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<210> 11

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<211> 914

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 11

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41

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<210> 12

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<211> 184

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 12

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42

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<210> 13

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<211> 8554

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 13

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43

44

45

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<210> 14

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<211> 6583

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 14

46

47

48

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<210> 15

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<211> 5091

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<400> 15

49

50

Claims

1. Un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, de manera que se produce metionina, en el que

c1): una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa u O-succinil-homoserina sulfhidrilasa desregulada

c3): una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y una homoserina acetiltransferasa desregulada o una O-succinil-homoserina sulfihídrilasa desregulada y una homoserina succiniltransferasa desregulada.

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2. El método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo pertenece a género Corynebacterum.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo es Corynebacterum glutamicum.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo pertenece al género Escherichia.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa de aislar la metionina.

6. Uso de un microorganismo recombinante para la producción de metionina en presencia de disulfuro de dimetilo (DMDS), teniendo dicho microorganismo al menos una enzima biosintética de metionina desregulada elegida del grupo:

a): una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa u O-succinil-homoserina sulfhidrilasa desregulada

b): una homoserina acetiltransferasa u homoserina succiniltransferasa desregulada y una homoserina deshidrogenasa desregulada

c): una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y una homoserina acetiltransferasa desregulada o una O-succinil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y una homoserina succiniltransferasa desregulada.

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7. El uso de la reivindicación 6, en el que el microorganismo pertenece al género Corynebacterium.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que el microorganismo pertenece a Corynebacterium glutamicum.

9. El uso de la reivindicación 6, en el que el microorganismo pertenece al género Escherichia.

10. Un método para producir metionina de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS) de liberación lenta, de manera que se produce metionina.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es Amberlite^{TM} XAD4.

12. El método de las reivindicaciones 10 y 11, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta libera DMDS en el cultivo a una concentración de 0,1% o mayor.

13. El método de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta libera DMDS en el cultivo a una concentración de 0,3% o mayor.

14. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende un líquido que es inmiscible con agua, pero que disuelve DMDS.

15. El método de la reivindicación 14, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende un líquido seleccionado del grupo que consiste en: aceites animales, aceites minerales, aceites químicos, aceites vegetales, aceites sintéticos, un disolvente orgánico, clorocarburos, fluorocarburos, cloro-fluoro-carburos o una combinación de los mismos.

16. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es una alimentación de DMDS lenta controlada.

17. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es el flujo o la difusión de DMDS a través de una membrana que es permeable a DMDS.

18. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende alimentar DMDS en un estado gaseoso.

19. El método de la reivindicación 18, en el que el DMDS en un estado gaseoso se genera evaporando o calentando a ebullición DMDS líquido.

20. El método de la reivindicación 18, en el que el DMDS en un estado gaseoso se genera burbujeando aire u oxígeno a través de DMDS líquido.