BRPI0720967A2 - Metionina sintases com inibição reduzida de produto. - Google Patents

Description

‘ Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "METIONINA SINTASES COM INIBIÇÃO REDUZIDA DE PRODUTO".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a seqüências nucleotídicas codifi- 5 cando cobalamina-metionina sintase enzimaticamente ativa e fragmentos funcionais da mesma sendo modificada em comparação com a enzima de tipo selvagem respectiva de modo que referidas enzimas mostram uma inibi- ção reduzida de produto por metionina. A presente invenção também refere- se a polipeptídeos sendo codificados por tais seqüências nucleotídicas e 10 células hospedeiras compreendendo estas seqüências nucleotídicas. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para produzir metionina em organismos hospedeiros ao fazer uso de tais seqüências nucleotídicas e de aminoácidos.

Antecedentes Tecnológicos Atualmente, em todo o mundo, a produção anual de metionina é

de cerca de 500.000 toneladas. Metionina é o primeiro aminoácido Iimitativo em animais de criação de ração de aves domésticas e, devido a este fato, principalmente aplicado como um suplemento alimentício. Em contraste com outros aminoácidos industriais, metionina é quase que exclusivamente apli- 20 cada como um racemato produzido por síntese química. Porque animais po- dem metabolizar ambos os estereoisômeros de metionina, a alimentação direta da mistura racêmica quimicamente produzida é possível (D1MeIIo e Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animais: Amino Acids, Rechgigl (Ed.), CRC HandbookSeries in Nutrition and Food, 441-490, 1978).

No entanto, ainda existe um grande interesse na substituição da

produção química existente por um processo biotecnológico. isto é, devido ao fato de que menores níveis de L-metionina de suplementação é uma fon- te melhor de aminoácidos de enxofre do que L-metionina (Katz et al., (1975) Poult. Sci., 545: 1667-74). Além disso, o processo químico usa produtos 30 químicos bastante perigosos e produz correntes substanciais de refugos. Todas estas desvantagens da produção química podem ser evitadas por um processo biotecnológico eficiente. Para outros aminoácidos como glutamato, os métodos de produ- ção com fermentação são conhecidos. Para estes fins, alguns micro- organismos como Escherichia coli (E. coli) e Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) demonstraram ser particularmente apropriados. A produção de aminoácidos por fermentação também tem a vantagem particular de que apenas L-aminoácidos são produzidos. Além disso, produtos químicos am- bientalmente problemáticos, como solventes, etc, que são usados na síntese química, são evitados. No entanto, a produção fermentativa de metionina por micro-organismos irá somente ser uma alternativa à síntese química se ela permitir a produção de metionina em uma escala comercial em um preço comparável ao da produção química.

Assim, a produção de L-metionina através de cultura em larga escala de bactérias desenvolvidas para produzir e secretar quantidades grandes desta molécula é um objetivo desejável. As melhoras no processo podem estar relacionadas com os parâmetros de fermentação, como agita- ção e suprimento de oxigênio, ou a composição dos meios nutrientes, como a concentração de açúcar durante a fermentação, ou o trabalho do produto por, por exemplo, cromatografia de troca tônica, ou as propriedades de pro- dução intrínsecas do próprio micro-organismo.

Os métodos de mutagênese e seleção de mutantes são também usados para melhorar as propriedades de produção destes micro- organismos produzindo metionina. Cepas de elevada produção que são re- sistentes a antimetabólitos ou que são auxotróficas para metabólitos de im- portância regulatória são obtidas deste modo.

A tecnologia de DNA recombinante também tem sido empregada durante alguns anos para melhorar as cepas de micro-organismos que pro- duzem L-aminoácidos por amplificação de genes de biossíntese de aminoá- cidos individuais e investigação do efeito sobre a produção de aminoácidos.

Ruckert et al. (Journal of Biotechnoiogy (2003), 104: 213-228) fornecem uma análsie da via biossintética de L-metionina em Corynebacteri- um glutamicum. As funções conhecidas de MetZ (também conhecido como MetY) e MetB poderiam ser confirmadas e MetC (também conhecido como < AecD) demonstrou ser uma cistationina-3-liase. Além disso, MetE e MetH, que catalisam a conversão de L-homocisteína em L-metionina, foram identi- ficados neste estudo.

WO 02/097096 descreve seqüências nucleotídicas a partir de 5 bactérias corineformes que codificam para o gene repressor McbR (também conhecido como MetD) e processos para a preparação de aminoácidos u- sando bactérias em que este gene repressor McbR é atenuado. De acordo com WO 02/097096, a atenuação do McbR regulador transcripcional melho- ra a produção de L-metionina em bactérias corineformes. É ainda também 10 descrito em WO 02/097096 que, além da atenuação do gene repressor Mc- bR, a melhora ou a superexpressão do gene MetB que codifica para cistatio- nina-y-sintase é preferida para a preparação de L-metionina.

A seleção de cepas melhoradas para a produção de uma molé- cula particular é um processo consumidor de tempo e difícil. Assim, ainda existe uma grande necessidade para micro-organismos que produzam, efici- entemente, L-metionina e/ou tenham teores significantemente aumentados de L-metionina, que podem ser utilizados para obter metionina.

Sumário da invenção

É um objeto da presente invenção prover seqüências nucleotídi- 20 cas que codificam metionina sintase dependente de cobalamina enzimati- camente ativa ou fragmentos funcionais das mesmas tendo a propriedade de inibição reduzida de produto por metionina. Estas seqüências nucleotídicas codificam preferivelmente metionina sintase dependente de cobalamina en- zimaticamente ativa ou fragmentos funcionais das mesmas que carregam 25 pelo menos uma mutação em sua seqüência de aminoácido comparada com uma seqüência de tipo selvagem respectiva de aminoácido de modo que estas enzimas mostram inibição reduzida de produto por metionina, isto é, a atividade enzimática é inibida por metionina em uma extensão menor do que para as enzimas e polipeptídeos de tipo selvagem. Estas seqüências nucleo- 30 tídicas podem ser, por exemplo, seqüências de DNA e/ou RNA com as se- qüências de DNA sendo preferidas.

É além disso é um objeto da presente invenção prover polipeptí- deos e preferivelmente proteínas que são codificados por tais seqüências nucleotídicas.

Ainda outro objeto da presente invenção é prover vetores que compreendem estas seqüências nucleotídicas e podem ser usados para ex- pressão destas seqüências nucleotídicas e polipeptídeos em células hospe- deiras.

Outro objeto da presente invenção refere-se a células hospedei- ras que expressam as seqüências nucleotídicas e polipeptídicas acima men- cionadas.

Ainda outro objeto da presente invenção refere-se ao uso de tais

seqüências nucleotídicas e polipeptídicas para produzir metionina e/ou au- mentar a eficiência de produção de metionina em organismos hospedeiros.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir metionina por expressão de referidas seqüências nucleotídicas e polipeptídi- cas em organismos hospedeiros.

De acordo com uma modalidade da invenção, seqüências nu- cleotídicas e preferivelmente de DNA são providas que codificam uma meti- onina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou fragmen- tos funcionais das mesmas tendo a propriedade de inibição reduzida de pro- 20 duto por metionina. Em uma modalidade estas seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA codificam metionina sintases dependentes de coba- lamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas que carregam pelo menos uma mutação em sua seqüência de aminoácido com- parada com uma respectiva seqüência de aminoácidos de tipo selvagem, de 25 modo que a atividade enzimática de referidas metionina sintases dependen- tes de cobalamina enzimaticamente ativas ou de referidos fragmentos fun- cionais mostram uma inibição reduzida de produto como uma conseqüência de pelo menos uma mutação. Isto significa que a atividade enzimática das enzimas mudadas ou fragmentos funcionais das mesmas é inibida por meti- 30 onina em uma menor extensão comparada com as seqüências de tipo sel- vagem respectivas.

Estas seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA tam- ‘ bém podem permitir a construção de organismos hospedeiros que produzem e secretam preferivelmente quantidades grandes da molécula desejada, isto é, L-metionina.

Em uma outra modalidade da presente invenção, estas sequên- 5 cias nucleotídicas e preferivelmente de DNA codificam metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcio- nais das mesmas que carregam pelo menos uma mutação em SEQ ID NO. 1 de modo que os polipeptídeos codificados mostram inibição reduzida de produto por metionina comparada com os polipeptídeos respectivos de tipo 10 selvagem.

Ainda outra modalidade da presente invenção refere-se a se- qüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA que codificam metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas que carregam pelo menos uma mutação em seu 15 domínio de ligação de homocisteína de modo que estes polipeptídeos mos- tram inibição reduzida de produto por metionina. Um domínio de ligação típi- co de homocisteína é o de MetH de C. glutamicum. A seqüência de DNA correspondente é SEQ ID No. 24 enquanto uma seqüência de aminoácido é SEQ ID No. 2.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, seqüências

nucleotídicas e preferivelmente de DNA codificam metionina sintases de- pendentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas que carregam pelo menos uma mutação em SEQ ID Nos. 3 a 18 de modo que estes polipeptídeos mostram inibição reduzida de produto 25 por metionina.

Uma modalidade da presente invenção refere-se a seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA que codificam metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcio- nais das mesmas que carregam pelo menos uma mutação em uma posição 30 correspondendo a M33, F86 ou S134 da metionina sintase dependente de cobalamina MetH de C. glutamicum. A seqüência de DNA de MetH de C. glutamicum é a de SEQ ID No. 23. A seqüência de aminoácido de MetH de C. glutamicum é a de SEQ ID No. 1.

A presente invenção em uma modalidade também refere-se a seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA que codificam polipeptí- deos que são pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo 5 menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticos aos polipeptídeos sendo codificados pelas seqüências nucleotídicas acima mencionadas que carregam pelo menos uma mutação nestas seqüências comparadas às seqüências de tipo selvagem de modo que as metionina sin- 10 tases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas resultantes ou fragmentos funcionais das mesmas mostrem inibição reduzida de produto por metionina.

Assim, a presente invenção em uma modalidade refere-se a se- qüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA que codificam polipeptí- 15 deos que são pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticos aos polipeptídeos sendo codificados por qualquer uma de SEQ ID Nos.1 a 18 com a condição que estes polipeptídeos carregam pelo menos uma mu- 20 tação nestas seqüências de modo que as metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas resultantes ou fragmentos funcionais das mesmas mostrem inibição reduzida de produto por metionina.

Ainda outra modalidade da presente invenção refere-se a se- qüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA que são pelo menos 30%, 25 pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas às seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA acima mencionadas.

Assim, em uma modalidade a presente invenção refere-se a se- quências nucleotídicas e preferivelmente de DNA que são pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas a, por exemplo, SEQ ID No. 23 ou SEQ ID No. 24 com a condição que as seqüências nucleotídicas carregam adicionalmente pelo menos uma muta- ção de modo que as metionina sintases dependentes de cobalamina enzi- 5 maticamente ativas resultantes ou fragmentos funcionais das mesmas mos- tram inibição reduzida de produto por metionina.

Em modalidades preferidas estas seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA são isoladas ou seqüências nucleotídicas recombi- nantes e preferivelmente de DNA.

Outra modalidade da presente invenção refere-se a seqüências

nucleotídicas e preferivelmente de DNA que hibridizam sob condições estri- gentes para as seqüências nucleotídicas acima mencionadas.

Outras modalidades da presente invenção referem-se a seqüên- cias nucleotídicas e preferivelmente de DNA codificando metionina sintases 15 dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcio- nais das mesmas que carregam pelo menos uma mutação com relação às seqüências de tipo selvagem correspondentes, cuja atividade enzimática é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% e preferivelmente pelo menos um fator de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 20 ou 1000 menos inibida na presença de 20 mM metionina comparado com a metionina sintases dependentes de cobalamina de tipo selvagem respecti- vas ou fragmentos funcionais das mesmas.

A presente invenção também refere-se a vetores que compreen- dem as seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA acima mencio- nadas em ligação operativa ao promotor e seqüências de terminação de modo que estas seqüências nucleotídicas possam ser expressadas em or- ganismos hospedeiros.

Outras modalidades da presente invenção referem-se a polipep- tídeos que são codificados por seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA acima mencionadas.

Ainda outra modalidade da presente invenção refere-se a células hospedeiras que compreendem as seqüências nucleotídicas e preferivel- mente de DNA acima mencionadas.

Em uma modalidade da presente invenção, estas células hospe- deiras expressam seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA acima mencionadas, preferivelmente a partir de um dos vetores acima menciona- dos.

De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, estas células hospedeiras são selecionadas dentre micro-organismos e le- veduras. Em uma modalidade, o micro-organismo é selecionado dentre o grupo consistindo em por exemplo, bactérias corineformes, microbactérias, 10 streptomycetaceae, salmonella, Escherichia coli, Shigella, Bacillus, Serratia, Pseudomonas, S. coei ou Thermotoga marítima.

Apesar de qualquer célula hospedeira ou organismo hospedeiro de acordo com a presente invenção poder compreender as seqüências nu- cleotídicas acima mencionadas e preferivelmente de DNA que codificam pa- 15 ra metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas tendo inibição reduzida de produto por metionina, uma modalidade da presente invenção refere-se a células hospedeiras em que adicionalmente o(s) gene(s) endógeno(s) para metioni- na sintase dependente de cobalamina(s) é/são deletado (s) ou funcional- 20 mente rompido(s).

Outras modalidades da invenção referem-se a células hospedei- ras e organismos hospedeiros em que pelo menos uma das seqüências nu- cleotídicas e preferivelmente de DNA de acordo com a presente invenção é expressada em que a quantidade e/ou atividade de pelo menos um polipep- 25 tídeo sendo codificado pelas seguintes seqüências nucleotídicas é aumenta- da em comparação com o organismo hospedeiro inicial correspondente:

• seqüência nucleotídica codificando para aspartato quinase IysC,

• seqüência nucleotídica codificando para glicerina aldeído-3-fosfato desidrogenase gap,

· seqüência nucleotídica codificando para 3-fosfatoglicerato quinase

pgk>

• seqüência nucleotídica codificando para piruvatocarboxilase pyc, • seqüência nucleotídica codificando para triosefosfato isomerase tpi,

• seqüência nucleotídica codificando para homosserina-O- acetiltransferase metA,

· seqüência nucleotídica codificando para cistationa-gama-sintase

metB,

• seqüência nucleotídica codificando para cistationa-gama-liase metC,

• seqüência nucleotídica codificando para serina-hidroximetil trans-

ferase glyA,

• seqüência nucleotídica codificando para O-acetil-homosserina- sulfidrilase metY,

• seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina amino- transferase serC,

· seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina-fosfatase

serB,

• seqüência nucleotídica codificando para serina acetiltransferase cysE,

• seqüência nucleotídica codificando para homosserina- desidrogenase hom,

• seqüência nucleotídica codificando para metionina sintase metE,

• seqüência nucleotídica codificando para fosfatoadenosina- fosfatossulfato-redutase cysH,

• seqüência nucleotídica codificando para sulfato adenilil transfera- se-subunidade I,

• seqüência nucleotídica codificando para CysN-sulfato adenilil transferase-subunidade 2,

• seqüência nucleotídica codificando para ferredoxinae-NADP- redutase,

· seqüência nucleotídica codificando para ferredoxinae,

• seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato- desidrogenase, e/ou • seqüência nucleotídica codificando para frutose-1-6-bisfosfatase.

Outra modalidade da presente invenção refere-se a células hos- pedeiras e organismos hospedeiros em que uma das seqüências nucleotídi- cas e preferivelmente de DNA de acordo com a presente invenção é expres- 5 sada e em que adicionalmente a quantidade e/ou atividade de pelo menos um polipeptídeo sendo codificados pelas seguintes seqüências nucleotídicas é diminuída com relação ao organismo inicial correspondente:

• seqüência nucleotídica codificando para homosserina quinase thrB,

· seqüência nucleotídica codificando para treonina desidratase

ilvA,

• seqüência nucleotídica codificando para treonina sintase thrC,

• seqüência nucleotídica codificando para meso-diaminopimelato- D-desidrogenase ddh,

· seqüência nucleotídica codificando para fosfoenolpiruvato car-

bóxi quinase pck,

• seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato-6- isomerase pgi,

• seqüência nucleotídica codificando para piruvato-oxidase poxB,

· seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato sin-

tase dapA,

• seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato re- dutase dapB,

• seqüência nucleotídica codificando para diaminopicolinato- descarboxilase IysA,

• seqüência nucleotídica codificando para glicosil transferase e/ou

• seqüência nucleotídica codificando para Iactato hidrogenase.

Outro aspecto da invenção refere-se a células hospedeiras e

organismos em que a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de produ- ção de metionina é aumentada por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% e preferivelmente pelo menos por um fator de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100 ou 1000 em comparação com a célula hospedeira * ou organismo hospedeiro em que a seqüência nucleotídica de acordo com a invenção é expressada.

Outras modalidades da presente invenção referem-se a métodos para produzir metionina em uma célula hospedeira ou organismo em que 5 uma seqüência de nucleotídeo e preferivelmente de DNA ou polipeptídeo de acordo com a invenção é expressada na célula hospedeira. Outras modali- dades da presente invenção referem-se a métodos para produzir metionina em que se usa uma das células hospedeiras acima mencionadas.

Um aspecto da presente invenção refere-se a um método para 10 produzir metionina em que uma das células hospedeiras acima mencionadas é cultivada e metionina é subsequentemente isolada. A presente invenção também refere-se ao uso das células hospedeiras acima mencionadas para produzir metionina e ao uso de seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA de acordo com a presente invenção para produzir metionina e célu- 15 Ias hospedeiras que são utilizáveis na produção de metionina.

Descrição dos desenhos

Figura 1 é um modelo da via para biossíntese de L-metionina em micro-organismos como C. glutamicum. Enzimas envolvidas são MetA (ho- mosserina transacetilase), MetB (cistationa-gama-sintase), MetZ (O-acetil- 20 homosserina sulfhidrolase), MetC (cistationa-beta-liase), metionina sintase dependente de cob(l)alamina I (MetH) e metionina sintase independente de cob(l)alamina- Il (MetE).

Figura 2 mostra um alinhamento de seqüência da metionina sin- tases dependentes de cob(l)alamina de C. glutamicum, S. coei, E. coli e 25 Thermotoga maritima.

Figura 3 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID No. 1, a)) e seqüência de DNA (SEQ ID No. 23), b)) de metionina sintase dependente de cob(l)alamina MetH de C. glutamicum.

Figura 4 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID No. 2, b)) e 30 seqüência de DNA (SEQ ID No. 24, b)) do domínio de ligação de homociste- ína de metionina sintase dependente de cob(l)alamina MetH de C. glutamicum compreendendo aminoácidos 1 a 244. Figura 5 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID Nos. 3 a 18) de regiões conservadas dentro do domínio de ligação de homocisteína de metionina sintases dependentes de cob(l)alamina de C. glutamicum, S. coei, E. coli e Thermotoga maritima.

Figura 6 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID No. 19, a))

e seqüência de DNA (SEQ ID No. 25, b)) da metionina sintase dependente de cob(l)alamina MetH de C. glutamicum carregando uma mutação M33A.

Figura 7 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID No. 20, a)) e seqüência de DNA (SEQ ID No. 26, b)) da metionina sintase dependente de cob(l)alamina MetH de C. glutamicum carregando uma mutação M33L.

Figura 8 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID No. 21, a)) e seqüência de DNA (SEQ ID No. 27, b)) da metionina sintase dependente de cob(l)alamina MetH de C. glutamicum carregando uma mutação F86L.

Figura 9 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID No. 22, a)) e seqüência de DNA (SEQ ID No. 28, b)) da metionina sintase dependente de cob(l)alamina MetH de C. glutamicum carregando uma mutação S134N. Descrição detalhada de modalidades exemplares

Antes de descrever em detalhes as modalidades exemplares da presente invenção, as seguintes definições são dadas.

Os termos “seqüências nucleotídicas de acordo com a presente

invenção" e “seqüências de DNA de acordo com a presente invenção” refe- rem-se às seqüências correspondentes como acima mencionado que codifi- cam polipeptídeos sendo metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas que mostram 25 uma inibição reduzida de produto por metionina. O termo “inibição reduzida de produto por metionina” será também definido abaixo. O termo “polipeptí- deo” significa englobar proteínas e tipicamente refere-se a polipeptídeos com mais do que 20 aminoácidos.

O termo "eficiência de síntese de metionina" descreve o rendi- mento de carbono de metionina. Esta eficácia é calculada como a porcenta- gem da entrada de energia que entra no sistema na forma de um substrato de carbono. Em toda esta invenção, este valor é dado em valores percentu- ais ((mois de metionina) (mois de substrato de carbono)'1 ■ 100), salvo espe- cificado em contrário. As fontes preferidas de carbono de acordo com a pre- sente invenção são açúcares, como mono-, di-, ou polissacarídeos. Por e- xemplo, açúcares selecionados dentre o grupo consistindo em glicose, fruto- se, manose, galactose, libose, sorbose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose podem servir como fontes de carbono particularmente preferidas.

O termo "eficiência aumentada de síntese de metionina" refere- se a comparação entre um organismo sendo uma célula hospedeira que foi geneticamente modificada para expressar seqüências nucleotídicas e prefe- rivelmente de DNA de acordo com a presente invenção e que tem uma mai- or eficiência de síntese de metionina comparada com um organismo inicial que não expressa as seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA de acordo com a presente invenção.

O organismo inicial que não expressa seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA de acordo com a presente invenção pode ser um organismo de tipo selvagem. Alternativamente, ele pode ser um organismo que já tinha sido otimizado para a produção de metionina e assim super- expressa alguns genes da síntese de via metionina. Alternativamente, um organismo inicial que já tinha sido otimizado para a produção de metionina pode mostrar uma expressão reduzida para algumas enzimas da via metio- nina.

Os termos "via metionina" e "via de biossíntese de metionina" são reconhecidos na técnica e descrevem uma série de reações que ocor- rem em um organismo de tipo selvagem e levam à biossíntese de L- metionina. Estas vias podem variar de organismo a organismo. Os detalhes de uma via específica de organismo podem ser adquiridos de livros de texto e da literatura científica no website da internet http://www.genome.jp/kegg/metabolism.html. Em particular, uma via metioni- na dentro do significado da presente invenção é mostrada em figura 1.

O termo "rendimento de metionina" descreve o rendimento de metionina que é calculado como uma quantidade de metionina obtida por peso de massa celular.

Os termos "organismo", "organismo hospedeiro", "célula hospe- deira" ou "micro-organismo" para os fins da presente invenção referem-se a qualquer organismo que é comumente usado para a produção de aminoáci- 5 dos como metionina. Em particular, estes termos referem-se a procariotes, eucariotes inferiores e fungos. Um grupo preferido dos organismos acima mencionados compreende actino bactérias, ciano bactérias, proteo bacté- rias, Chloroflexus aurantiacus, Pirellula sp. 1, halo bactérias e/ou metanoco- cos, preferivelmente bactérias corineformes, mico bactérias, estreptomices, 10 salmonella, Escherichia coli, Shigella, Pseudomonas, S. coei ou Thermotoga marítima.

Os micro-organismos particularmente preferidos são seleciona- dos dentre

Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, micro-organismos do gênero Bacillus, particularmente Bacillus subtilis, micro-organismos do gênero Strep- tomyces, ou do gênero Thermotoga, particularmente Thermotoga marítima.

Os organismos da presente invenção podem, no entanto, tam- bém compreender leveduras como Schizosaccharomyces pombe ou S. ce- revisiae e Pichia pastoris.

Os termos "organismo superproduzindo L-metionina", "organis-

mo superproduzindo metionina" ou "organismo produzindo metionina" para os fins da presente invenção referem-se a qualquer "organismo", "organismo hospedeiro" ou "micro-organismo" em que, comparado com um organismo inicial que não expressa seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA 25 de acordo com a presente invenção, a eficiência e/ou rendimento e/ou quan- tidade de produção de metionina, é aumentado pelo menos por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou pelo menos por um fator de 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 500 e 1000 ou mais.

O termo "metabólito" refere-se a compostos químicos que são usados nas vias metabólicas de organismos como precursores, intermediá- rios e/ou produtos finais. Estes metabólitos podem não somente servir como unidades de construção química, mas também podem exercer uma atividade regulatória sobre as enzimas e sua atividade catalítica. Sabe-se a partir da literatura que estes metabólitos podem inibir e estimular a atividade de enzi- mas (Stryer, Biochemistry, (1995) W.H. Freeman & Company, New York, New York).

5 Para os fins da presente invenção, o termo "metabólito externo"

compreende substratos como glicose, sulfato, tiossulfato, sulfito, sulfeto, amônia, oxigênio etc.

Se, no contexto da presente invenção, referência é feita ao teor de uma seqüência nucleotídica ou o teor de um polipeptídeo codificado por 10 uma seqüência nucleotídica, esta refere-se à quantidade de ácido nucleico e polipeptídeo sendo codificados por tais seqüências nucléicas como elas po- dem ser determinadas para o organismo hospedeiro respectivo compreen- dendo estas seqüências nucleotídicas ou polipeptídeos.

Se referência é feita à atividade de uma seqüência nucleotídica, esta tipicamente, para os fins da presente invenção, significa englobar a ati- vidade do polipeptídeo ou proteína que é codificado por tal seqüência nucle- otídica.

Se, no contexto da presente invenção, afirma-se que a quanti- dade de seqüência nucleotídica é aumentada com relação a um tipo selva- gem ou organismo inicial, isto significa que a quantidade desta seqüência nucleotídica e a quantidade de polipeptídeo que é codificado pelo ácido nu- cleico são aumentadas em comparação com um organismo que não é gene- ticamente manipulado com relação a esta seqüência nucleotídica ou de poli- peptídeo específica. Isto pode ser obtido por introdução de uma seqüência nucleotídica exógena correspondente em um organismo hospedeiro e com- paração então se referindo ao organismo hospedeiro expressando a se- qüência nucleotídica e o organismo inicial em que a seqüência nucleotídica não foi introduzida. Alternativamente, a quantidade de seqüência nucleotídi- ca pode ser aumentada por manipulação de outras seqüências regulatórias ou as seqüências endógenas dentro de um organismo.

Assim, aumentando a quantidade de uma seqüência nucleotídi- ca pode ser obtido por introdução de seqüências exógenas ou manipulação de seqüências endógenas que são responsáveis para o nível de expressão das respectivas seqüências nucleotídicas.

Se, no contexto da presente invenção, afirmar-se que a atividade de uma seqüência nucleotídica é aumentada com relação a um organismo inicial, faz-se referência a uma situação onde tipicamente a atividade do po- lipeptídeo que é codificado por esta seqüência nucleotídica é aumentada em comparação com o organismo inicial. O aumento da atividade pode ser obti- do por aumento de uma quantidade de uma seqüência nucleotídica, e/ou por introdução de mutações em seqüências nucleotídicas codificando polipeptí- deos com aumentada atividade.

Assim, aumentar a atividade de uma seqüência nucleotídica e de polipeptídeo sendo codificada assim pode ser obtido ou por introdução de seqüências nucleotídicas exógenas e/ou introdução de mutações nas se- qüências regulatórias e de codificação de seqüências endógenas, que são responsáveis pela expressão de uma seqüência de interesse.

Se no contexto da presente invenção, afirma-se que o teor (quantidade) e/ou atividade de uma seqüência nucleotídica, e consequente- mente do polipeptídeo sendo codificada assim, é diminuído em comparação com um organismo inicial, as definições acima devem ser aplicadas mutatis mutandis.

Os termos “expressar” “expressando,” “expressado” e “expres- são” referem-se à expressão de um produto de gene (por exemplo, enzima biossintética de um gene de uma via ou reação definida e descrita neste pe- dido) ou uma seqüência nucleotídica. A expressão pode ser feita por altera- ção genética de por exemplo, micro-organismo que é usado como um orga- nismo de partida inicial. Em algumas modalidades, um micro-organismo po- de ser geneticamente alterado (por exemplo, geneticamente engenheirado) para expressar um produto de gene como um polipeptídeo em um nível au- mentado com relação ao produzido pelo micro-organismo inicial ou em um micro-organismo comparável que não foi alterado. A alteração genética é, mas não é limitada, uma alteração ou modificação de seqüências regulató- rias ou sítios associados com a expressão de um gene particular (por exem- 1 pio, por adição de promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou por remoção de seqüências regulatórias, de modo que expres- são é constitutiva), modificando o local cromossômico de um gene particular, alterando as seqüências de ácido nucleico adjacentes a um gene particular 5 como um sítio de ligação de ribossomas ou terminador de transcrição, au- mentando o número de cópias de um gene particular, modificando proteínas (por exemplo, proteínas regulatórias, supressores, melhoradores, ativadores transcripcionais, e similares) envolvidos na transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto de gene particular, ou qualquer outro meio 10 convencional de desregulação da expressão de um gene particular usando técnicas de rotina (incluindo, mas não limitadas ao uso de moléculas de áci- do nucleico antissenso, por exemplo, para bloquear a expressão de proteí- nas repressoras).

Os termos "superexpressar”, "superexpressando”, "superexpres- 15 sado” e "superexpressão” referem-se à expressão de um produto de gene (por exemplo, enzima biossintética de metionina ou um gene ou uma via ou reação definida e descrita neste pedido) ou uma seqüência nucleotídica em um nível maior do que o presente antes de uma alteração genética do micro- organismo inicial. Em algumas modalidades, um micro-organismo pode ser 20 geneticamente alterado (por exemplo, geneticamente engenheirado) para expressar um produto de gene ou seqüência nucleotídicas em um nível au- mentado com relação ao produzido pelo micro-organismo inicial. A alteração genética inclui, mas não é limitada, uma alteração ou modificação de se- qüências regulatórias ou sítios associados com a expressão de um gene 25 particular (por exemplo, por adição de promotores fortes, promotores indutí- veis ou promotores múltiplos ou por remoção de seqüências regulatórias, de modo que a expressão é constitutiva), modificando o local cromossômico de um gene particular, alterando as seqüências de ácido nucleico adjacentes a um gene particular como um sítio de ligação de ribossomas ou terminador de 30 transcrição, aumentando o número de cópias de um gene particular, modifi- cando proteínas (por exemplo, proteínas regulatórias, supressores, melhora- dores, ativadores transcripcionais, e similares) envolvidos na transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto de gene particular, ou qual- quer outro meio convencional de desregulação da expressão de um gene particular usando técnicas de rotina (incluindo, mas não limitadas ao uso de moléculas de ácido nucleico antissenso, por exemplo, para bloquear a ex- 5 pressão de proteínas repressoras). Exemplos para a superexpressão de ge- nes em organismos como C. glutamicum podem ser encontrados em Eik- manns et al (Gene. (1991) 102, 93-8).

Em algumas modalidades, um micro-organismo pode ser física ou ambientalmente alterado para expressar um produto de gene ou sequên- cia nucleotídica em um nível aumentado ou menor com relação ao nível de expressão do produto de gene ou seqüência nucleotídica pelo micro- organismo inicial. Por exemplo, um micro-organismo pode ser tratado ou cultivado na presença de um agente conhecido ou que se suspeita aumente transcrição de uma seqüência nucleotídica particular e/ou a tradução de uma seqüência nucleotídica particular de modo que a transcrição e/ou tradução são melhoradas ou aumentadas. Alternativamente, um micro-organismo po- de ser cultivado a uma temperatura selecionada para aumentar a transcrição de uma seqüência nucleotídica particular ou gene e/ou tradução de uma se- qüência nucleotídica particular ou produto de gene de modo que a transcri- ção e/ou tradução são melhoradas ou aumentadas.

Os termos “romper”, “rompido”, “ruptura", “desregular,” “desregu- lado” e “desregulação” referem-se à alteração ou modificação de pelo menos um gene ou seqüência nucleotídica em por exemplo, um micro-organismo, em que a alteração ou modificação resulta em crescente eficiência ou ren- 25 dimento de produção de metionina no micro-organismo relativo à produção de metionina na ausência da alteração ou modificação. Em algumas modali- dades, um gene ou seqüência nucleotídica que é alterado ou modificado co- difica uma enzima em uma via biossintética, de modo que o nível ou a ativi- dade da enzima biossintética no micro-organismo é alterado ou modificado. 30 Em algumas modalidades, pelo menos um gene que codifica uma enzima em uma via biossintética é alterado ou modificado de modo que o nível ou a atividade da enzima é melhorada ou aumentada relativa ao nível na presen- * ça do gene não-alterado ou de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a via biossintética é a via biossintética de metionina. A desregulação também inclui alterar a região de codificação de um ou mais genes para dar, por e- xemplo, uma enzima que é resistente à realimentação ou que tem uma ativi- 5 dade específica maior ou menor. Também, a desregulação ainda engloba a alteração genética de genes codificando fatores transcripcionais (por exem- plo, ativatores, repressores) que regulam a expressão de genes na via bios- sintética de metionina e/ou cisteína.

A frase “via desregulada ou reação” refere-se a uma via biossin- 10 tética ou reação em que pelo menos um gene que codifica uma enzima em uma via biossintética ou reação é alterado ou modificado de modo que o ní- vel ou atividade de pelo menos uma enzima biossintética é alterada ou modi- ficada. A frase “via desregulada” inclui uma via biossintética em que mais do que um gene foi alterado ou modificado, assim alterando o nível e/ou ativi- 15 dade dos correspondentes produtos de gene/enzimas. Em alguns casos, a capacidade para "desregular” a via (por exemplo, para desregular simulta- neamente mais do que um gene em uma dada via biossintética) em um mi- cro-organismo surge do fenômeno particular de micro-organismos em que mais do que uma enzima (por exemplo, duas ou três enzimas biossintéticas) 20 são codificadas por genes ocorrendo adjacentes um ao outro ou em um pe- daço contínuo de material genético chamado um “operon.” Em outros casos, a fim de desregular a via, um número de genes deve ser desregulado em uma série de etapas de engenharia seqüenciais.

O termo “operon” refere-se a uma unidade coordenada de mate- 25 rial genético que contém um promotor e possivelmente um elemento regula- tório associado com um ou mais, preferivelmente pelo menos dois genes estruturais (por exemplo, genes codificando enzimas, por exemplo, enzimas biossintéticas). Expressão dos genes estruturas pode ser regulada de modo coordenado, por exemplo, por proteínas regulatórias como ligando para o 30 elemento regulatório ou por antiterminação de transcrição. Os genes estrutu- rais podem ser transcritos para dar um único mRNA que codifica todas den- tre as proteínas estruturadas. Devido à regulação coordenada de genes in- cluídos em um operon, alteração ou modificação do promotor único e/ou e- Iemento regulatório pode resultar em uma alteração ou modificação de cada produto de gene codificado pelo operon. Alteração ou modificação de um elemento regulatório inclui, mas não é limitada à remoção de promotor en- 5 dógeno e/ou elemento(s) regulatório(s), adicionando promotores fortes, pro- motores indutíveis ou promotores múltiplos ou removendo as seqüências regulatórias de modo que a expressão de produtos de gene é modificada, modificando o local cromossômico do operon, alterando as seqüências de ácido nucleico adjacentes ao operon ou dentro do operon como um sítio de 10 ligação de ribossoma, uso de códon, aumentando o número de cópias do operon, modificando proteínas (por exemplo, proteínas regulatórias, supres- sores, melhoradores, ativadores transcripcionais e outros) envolvidas na transcrição do operon e/ou tradução dos produtos de gene do operon, ou quaisquer outros meios convencionais de desregulação da expressão de 15 genes de rotina da técnica (incluindo, mas não limitados ao uso de molécu- las antissenso de ácido nucleico, por exemplo, para bloquear a expressão de proteínas repressoras).

Em algumas modalidades, micro-organismos recombinantes descritos aqui foram geneticamente engenheirados para superexpressar um 20 gene derivado de bactérias ou produto de gene. Os termos "derivado de modo bacteriano" e “derivado de bactérias” referem-se a um gene que é na- turalmente encontrado em bactérias ou um produto de gene que é codificado por um gene bacteriano.

Os aminoácidos compreendem as unidades estruturais básicas 25 de todas as proteínas, e como tal são essenciais para o funcionamento celu- lar normal em organismos. O termo "aminoácido" é bem conhecido na técni- ca. Os aminoácidos proteinogênicos, dos quais se tem 20 espécies, servem como unidades estruturais para as proteínas, em que eles são ligados por ligações de peptídeo, enquanto os aminoácidos não-proteinogênicos não 30 são normalmente encontrados em proteínas (ver Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, VoI. A2, pags 57-97, VCH, Weinheim (1985)). Aminoá- cidos podem estar na conformação óptica D- ou L, apesar dos L- ‘ aminoácidos serem geralmente o único tipo encontrado em proteínas de o- corrência natura. As vias biossintéticas e degradativas de cada um dos 20 aminoácidos proteinogênicos foram bem caracterizadas tanto em células procarióticas como eucarióticas (ver, por exemplo, Stryer, L. Biochemistry, 3a. edição, págs. 578-590 (1988)).

Os aminoácidos essenciais, isto é, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina, que são geral- mente uma exigência nutricional devido à complexidade de sua biossíntese, são prontamente convertidos por simples vias biossintéticas nos restantes 10 11 aminoácidos não essenciais, isto é, alanina, arginina, asparagina, aspar- tato, cisteína, glutamato, Glutamina, glicina, prolina, serina e tirosina.

Os animais superiores retêm a capacidade de sintetizar alguns destes aminoácidos, mas os aminoácidos essenciais devem ser supridos da dieta a fim de que a síntese normal de proteínas ocorra. Além de sua função 15 na biossíntese de proteínas, estes aminoácidos são produtos químicos inte- ressantes sozinhos, e podem ser verificados como tendo várias aplicações nas indústrias de rações, alimentos, químicos, cosméticos, agrícola e farma- cêutica.

Lisina é um aminoácido importante na nutrição não apenas de

■ 20 humanos mas também de animais monográstricos, como as aves de criação e suínos. Glutamato é o mais comumente usado como um aditivo aromati- zante e é amplamente usado em toda a indústria de alimentos, como o são aspartato, fenilalanina, glicina e cisteína. Glicina, L-metionina e triptofano são todos usados na indústria farmacêutica. Glutamina, valina, leucina, iso- 25 leucina, histidina, arginina, prolina, serina e alanina são de uso tanto nas indústrias farmacêutica como de cosméticos. Treonina, triptofano e D/L- metionina são aditivos comuns para rações (Leuchtenberger, W. (1996), A- mino acids - technical production and use, p.466-502 em Rehm et al. (edito- res) Biotechnology, Vol. 6, Cap. 14a, VCH: Weinheim). Adicionalmente, es- 30 tes aminoácidos foram verificados como sendo utilizáveis como precursores para a síntese de aminoácidos e proteínas sintéticos como N-acetil cisteína, S-carboximetil-L-cisteína, (S)-5-hidroxitriptofano e outros descritos em Ull- mann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p.57-97, VCH: Wei- nheim, 1985.

A biossíntese destes aminoácidos naturais em organismos ca- pazes de produzir os mesmos, como bactérias, foi caracterizada (para uma 5 revisão de biossíntese de aminoácido bacteriano e regulação para o mesmo (ver Umbarger H.E. (1978), Ann. Rev. Biochem. 47:533-606). Glutamato é sintetizado por aminação redutiva de α-cetoglutarato, um intermediário no ciclo de ácido cítrico. Glutamina, prolina e arginina são cada subsequente- mente produzidas a partir de glutamato. A biossíntese de serina é um pro- 10 cesso em três etapas começando com 3-fosfatoglicerato (um intermediário em glicólise), e resultando neste aminoácido após as etapas de oxidação, transaminação, e hidrólise. Tanto a cisteína como a glicina são produzidas a partir de serina; a primeira pela condensação de homocisteína com serina, e a última por transferência do átomo de carbono β de cadeia lateral em tetra- 15 hidrofolato, em uma reação catalisada por serina transhidroximetilase. Feni- lalanina e tirosina são sintetizadas a partir da via glicolítica e pentose fosfato via precursores eritrose-4-fosfato e fosfoenolpiruvato em uma via biossintéti- ca de nove etapas que diferem somente nas duas etapas finais após a sín- tese de prefenato. Triptofano é também produzido a partir destas duas molé- 20 cuias iniciais, mas sua síntese é uma via de onze etapas. Tirosina também pode ser sintetizada a partir de fenilalanina em uma reação catalisada por fenilalanina hidroxilase. Alanina, valina e leucina são, todas, produtos bios- sintéticos de piruvato, o produto final de glicólise. Aspartato é formado a par- tir de oxaloacetato, um intermediário do ciclo de ácido cítrico. Asparagina, 25 metionina, treonina e lisina são cada produzidas pela conversão de asparta- to. Isoleucina pode ser formada partir de treonina. Uma via de nove etapas complexa resulta na produção de histidina a partir de 5-fosfatoribosil-1- pirofosfato, um açúcar ativado.

Os aminoácidos em excesso das necessidades de síntese de proteína da célula não podem ser armazenados e são ao contrário degrada- dos para prover intermediários para as vias metabólicas principais da célula (para revisão, ver Stryer, L., Biochemistry, 3a. ed., capítulo 21 "Amino acid degradation and the urea cycle", p. 495-516 (1988)). Apesar de a célula ser capaz de converter aminoácidos indesejado dentro de intermediários meta- bólicos úteis, a produção de aminoácidos é onerosa em termos de energia, moléculas precursoras e as enzimas necessárias para a síntese dos mes- mos.

A biossíntese de aminoácidos por ser regulada por inibição de realimentação em que a presença de um aminoácido particular serve para retardar ou completamente parar sua própria produção (para uma revisão de mecanismos de realimentação em vias biossintéticas de aminoácidos, ver 10 Stryer1 L., Biochemistry, 3a. ed. Capítulo 24: "Biosynthesis of amino acids and heme", p.575-600 (1988)). Se esta inibição de realimentação for media- da por um aminoácido formando o produto da reação ou via regulada, fala- se tipicamente de "inibição de produto”. Assim, a produção de qualquer ami- noácido particular é limitada por uma quantidade deste aminoácido presente 15 na célula.

A bactéria de solo Gram-positiva Corynebacterium glutamicum é amplamente usada para a produção industrial de diferentes aminoácidos. Apesar da biossíntese de lisina e glutamato, os produtos industriais princi- pais, ter sido estudada por muitos anos, o conhecimento sobre a regulação da via biossintética de metionina é limitada.

No entanto, pelo menos as enzimas chaves da via são conheci- das (ver figura 1). C. glutamicum ativa homosserina por acetilação com ho- mosserina-O-acetiltransferase (MetA) (EC 2.3.1.31). Sabe-se, além disso, que tanto a transsulfuração e sulfidrilação direta são usadas para produzir 25 homocisteína (Hwang et al. (2002), J. Bacteriol., 1845: 1277-86). Transsulfu- ração é catalisada por cistationina-y-sintase (MetB) (EC 2.5.1.48) (Hwang et al. (1999) Mol Cells, 93: 300-8). Nesta reação, cisteína e O-acetil- homosserina são combinadas em cistationina, que é hidrolisada por cistatio- nina-p-liase (MetC que é também conhecida como AecD) (EC 4.4.1.8) (Kim 30 et al. (2001), Mol. Cell, 112:220-5, Ruckert et al. (2003), vide supra) converte O-acetil-homosserina e sulfeto dentro homocisteína e acetato. Finalmente, C. glutamicum tem duas enzimas diferentes para a S-metilação de homocis- teína dando metionina (Lee et al. (2003), Appl. Microbiol. Biotechnoi 625-6, 459,67; Ruckert et al. (2003), vide supra), isto é, uma metionina sintase I dependente de cob(l)alamina (MetH) (EC 2.1.1.13) e a metionina sintase Il independente de cob(l)alamina (MetE) (EC 2.1.1.14). A primeira utiliza 5- 5 metiltetra-hidrofolato e a última 5-metiltetra-hidropteroiltri-L-glutamato como o doador de metila.

Recentemente, uma proteína reguladora transcripcional putativa da família TetR foi encontrada (Rey et al. (2003), Journal of Bioteehnology, 103: 51-65). Este regulador foi demonstrado para reprimir a transcrição de 10 vários genes pertencendo ao metabolismo de metionina e enxofre. O nocau- te do gene da proteína reguladora levou a uma expressão aumentada de hom codificando homosserina desidrogenase, metZ codificando O-acetil- homosserina sulfhidrolase, metK codificando S-adenosilmetionina (SAM) sintase (EC 2.5.1.6), cysK codificando cisteína sintase (EC 2.5.1.47), cysl 15 codificando uma sulfito redutase dependente de NADPH putativa, e final- mente ssuD codificando uma alcanossulfonato monooxigenase putativa. Rey et al. (Molecular Microbiology 2005, 56, 871-887) também verificou que o gene metB é significantemente induzido em uma cepa menos mcbR.

Com relação a metionina sintases dependentes de cob(l)alamina que, para os fins da presente invenção, são também designadas como meti- onina sintases dependentes de cobalamina ou MetH, foi demonstrado que a atividade desta enzima é inibida por seu produto, isto é, metionina (Banerjee et al. (1990), Biochemistry, 29:11101-1109).

Esta assim chamada "inibição de produto" de metionina prova- 25 velmente completa a elevada necessidade de produção de metionina que foi calculada como requerendo uma entrada de energia de 7 mois de ATP e 8 mois de NADPH por molécula de metionina (Neidhardt et al. (1990) Physio- Iogy of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sunderland, Massachu- setts, USA, Sinauer Associates, Inc.). assim, metionina é o único aminoácido 30 com relação ao qual uma célula forneceu mais energia.

Como uma conseqüência deste fato, os organismos produzindo metionina têm evolvido vias metabólicas que estão sob o controle estrito com relação à taxa e quantidade de síntese de metionina (Neidhardt (1996) E. coli e S. typhimurium, ASM Press Washington). Estes mecanismos de regulação incluem, por exemplo, mecanismos de controle de realimentação como a inibição de produto acima mencionada da atividade da metionina 5 sintase dependente de cobalamina.

A inibição de produto da metionina sintase dependente de coba- lamina cria um gargalo particular quando produzindo metionina superprodu- zindo micro-organismos, como esta enzima catalisa a última etapa na via de biossíntese de metionina. Assim, micro-organismos que foram otimizados 10 com relação à expressão de outras enzimas envolvidas na via de biossínte- se de metionina podem, por fim, demonstrar não serem utilizáveis para a produção eficiente de metionina, porque, mesmo que, por exemplo, quanti- dades elevadas de homocisteína terem se acumulado nestes micro- organismos, homocisteína não pode ser eficientemente metilada em metio- 15 nina, como as células irão parar esta etapa enzimática uma vez que suficien- te metionina foi produzida.

Como pode ser visto da figura 1, a metilação de homocisteína para metionina é catalisada por dois tipos de enzimas. A metionina sintase independente de cobalamina, que é também designada como MetE tendo 20 em vista seus números de turnover tem uma capacidade catalítica bastante limitada (Gonzales et al. (1992) Journal of Biology 31:6045-6056). A sintase dependente de cobalamina, no entanto, parece ser um candidato muito bom para esta abordagem dado o seu número de turnover de cerca de 1500 min'1 (Gonzales et al. (1992) vide supra).

Um dos objetivos da presente invenção é resolver as limitações

para a produção não-química de metionina em organismos. Estes e outros objetivos que se tornarão evidentes da descrição seguinte são resolvidos pelas reivindicações independentes. As modalidades preferidas são descri- tas nas reivindicações dependentes.

O núcleo da presente invenção repousa na descoberta surpre-

endente de que é possível produzir mutantes de metionina sintases depen- dentes de cobalamina em que a inibição da atividade enzimática pelo produ- to metionina é significantemente reduzida.

Estes mutantes, que mostram inibição reduzida de produto, as- sim continuam a catalisar eficientemente a metilação de homocisteína em metionina em um modo dependente de cobalamina, mesmo quando os ní- 5 veis de metionina são alcançados para que um micro-organismo passe ge- ralmente a regular de modo negativo a atividade enzimática desta última e- tapa. Como estes mutantes desacoplam a atividade enzimática de metionina sintase dependente de cobalamina a partir do mecanismo de controle de realimentação de inibição de produto, eles permitem a construção de orga- 10 nismos hospedeiros que produzem metionina de modo contínuo e eficiente.

Apesar destes mutantes de metionina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa terem sido especificamente isolados para a enzima MetH de C. glutamicum, justifica-se considerar que mutantes cor- respondentes existam para as metionina sintases dependentes de cobalami- 15 na em outros organismos como E.coli, S. coei e T. marítima, isto é, apoiado pelo fato de que as metionina sintases dependentes de cobalamina de E.coli, S. coei, C. glutamicum, Thermotoga marítima mostrem um grau ele- vado de similaridade de seqüência particularmente no domínio de ligação de homocisteína que é a região que foi identificada pela presente invenção co- 20 mo sendo a mais apropriada para a introdução de mutações que reduzem a inibição de produto de metionina sintases dependentes de cobalamina em C. glutamicum.

Antes dos mutantes de metionina sintase dependente de coba- lamina específicos e preferidos serem descritos em maiores detalhes, uma visão é dada para as propriedades das metionina sintases dependentes de cobalamina em geral.

Metionina sintase dependente de cobalamina catalisa a transfe- rência de um grupo metila a partir de metiltetra-hidrofolato em homocisteína gerando tetra-hidrofolato e metionina (Banerjee (1990) vide supra). O gene 30 MetH de E.coli assim como de outros organismos incluindo T. marítima, S. coei e C. glutamicum foram clonados e, em alguns casos, caracterizados (Banerjee (1990) vide supra; Ludwig et al. (1997) Annu. Rev. Biochem., 66:269-313; Yamada et al. (1999) Journal of Biological Chemistry, 274:33571-33576; Evans et al. (2004) Proc. NatL Acad. Sei. USA, 101:3729- 3736).

A enzima contém um grupo protético de cobalamina não cova- 5 Ientemente ligado que funciona como um intermediário na reação de metil- transferase. Durante a catálise os shuttles de enzima, entre os estados de E- metil cobalamina e E-cob(l)alamina, são alternadamente desmetilados por homocisteína e remetilados por metiltetra-hidrofolato.

Um teste para medir a atividade de metionina sintase é descrito na literatura (Drummond et al. (1995) Analytieal Bioehemistry, 228:323-329). Esta última referência é especificamente incorporada por referência, na me- dida em que descreve testes para a caracterização de metionina sintases dependentes de cobalamina. Assim as passagens começando na página 324, coluna à direita ("Materials and Methds”) até a página 326, coluna à esquerda (“Results”) a referência de Drummond et al. formam parte da des- crição deste pedido na medida em que estão relacionados aos testes não- radioativos para a caracterização de metionina sintases dependentes de co- balamina. O teste descrito por Drummond et al. pode ser usado para a de- terminação da influência do produto metionina sobre a atividade enzimática de metionina sintases dependentes de cobalamina junto com as mesmas linhas como descrito pela referência acima mencionada de Banerjee et al. (1990) vide supra para testes radioativos em pág. 11102, coluna à esquerda ("Experimental proeedures") até a página 11103, coluna à esquerda ("Re- sults") e página 11103, coluna à direita ("Inhibition of produet data") até a página 11104, coluna à esquerda ("Pre-steady-state kinetie analysis of ea- talysis") e Tabela Il da referência de Banerjee et al.. Como pode ser retirado da última referência metionina sintases dependentes de cobalamina são ini- bidas por metionina em um modo não competitivo.

A metionina sintase dependente de cobalamina de E.coli que é representativa para outras metionina sintases dependentes de cobalamina a partir de organismos como C. glutamicum, etc. é uma proteína modular con- sistindo em vários domínios. Os primeiros 352 resíduos da enzima de E. coli compreendem uma região de ligação de homocisteína. Os resíduos 353 a 649 estão envol- vidos na ligação de metiltetra-hidrofolato, enquanto os resíduos 650 a 896 ligam o cofator de cobalamina. Os resíduos de carbóxi terminal 897 a 1227 5 são requeridos para ativação de cob(ll)alamina oxidada e ligam adenosilsil- metila. Um fragmento de 71 kDa, que compreende resíduos 2 a 649, contém os domínios de ligação de homocisteína e metiltetra-hidrofolato e catalisa a transferência de metila para e proveniente da cobalamina exógena. O frag- mento de 98 kDa compreende tanto as regiões de ligação de substrato aci- 10 ma mencionadas como o domínio de ligação de cobalamina e é capaz de um turnover enzimático usando cofator de cobalamina endógena.

A presente invenção em seu núcleo refere-se a metionina sinta- se dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou fragmentos funcio- nais da mesma com inibição reduzida de produto por metionina.

Como especificado acima, a presente invenção em uma modali-

dade refere-se a metionina sintases dependentes de cobalamina enzimati- camente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas que carregam pelo menos uma mutação em comparação com a respectiva seqüência de tipo selvagem com a mutação tendo a conseqüência de que as metionina sinta- 20 ses dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas mudadas ou frag- mentos da mesma mostram inibição reduzida de produto por metionina.

O termo "fragmento funcional" refere-se a fragmentos de ver- sões de comprimento completo de tipo selvagem de metionina sintases de- pendentes de cobalamina enzimaticamente ativas que são capazes de cata- 25 Iisar a metilação de homocisteína em metionina em um modo dependente de cobalamina e que adicionalmente carregam pelo menos uma mutação em sua seqüência de aminoácido que efetua a inibição reduzida de produto por metionina.

Metionina sintases dependentes de cobalamina ou fragmentos funcionais das mesmas de acordo com a invenção são assim preferivelmen- te consideradas para mostrar inibição reduzida afetada de produto se a inibi- ção não competitiva da metilação de homocisteína com metiltetra-hidrofolato 1 pela enzima for influenciada em uma menor extensão por metionina do que para as metionina sintases dependentes de cobalamina de tipo selvagem respectivas ou fragmentos funcionais das mesmas.

De acordo com a presente invenção, metionina sintases depen- 5 dentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas são particularmente considerados para mostrar inibição reduzida de produto por metionina se, como uma conseqüência da mutação em uma se- qüência de aminoácido, a inibição da atividade por metionina, e preferivel- mente por aproximadamente 20 mM metionina for reduzida por pelo menos 10 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% e preferivelmente por pelo menos um fator de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais comparada com a atividade enzimática da enzima respectiva de tipo selvagem ou fragmento funcional da mesma.

Se a atividade enzimática de uma metionina sintase dependente 15 de cobalamina de tipo selvagem ou um fragmento funcional da mesma for definida como 100%, metionina sintases dependentes de cobalamina ou fragmentos funcionais das mesmas com inibição reduzida de produto por metionina de acordo com a invenção mostram uma atividade aumentada na presença de metionina, e preferivelmente de aproximadamente 20 mM meti- 20 onina de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% e preferivelmente por pelo menos um fator de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais comparada com a atividade enzimática da enzima respectiva de tipo selvagem ou fragmento funcional da mesma.

A influência de metionina, e preferivelmente de aproximadamen- 25 te 20 mM metionina sobre a atividade de ou metionina sintases dependentes de cobalamina de tipo selvagem enzimaticamente ativas ou fragmentos fun- cionais das mesmas e metionina sintases dependentes de cobalamina enzi- maticamente ativas de acordo com a presente invenção que têm inibição reduzida de produto, pode ser determinada pelo teste como descrito por 30 Drummond et al. (vide supra).

A título de exemplo, a metionina sintase dependente de cobala- mina pode ser MetH de C. glutamicum e ter uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 1. Se uma versão de MetH de SEQ ID NO. 1 que adicional- mente carrega pelo menos uma mutação mostrar uma influência reduzida de metionina, e preferivelmente de aproximadamente 20 mM metionina sobre a atividade desta enzima sob as condições de teste acima, será considerada 5 como uma metionina sintase dependente de cobalamina com inibição redu- zida de produto de acordo com a presente invenção. O mesmo deve se apli- car para um fragmento funcional de MetH.

Assim, metionina sintases dependentes de cobalamina de outros organismos como E.coli, T. marítima, B. subtilis, S, coei que mostram uma 10 homologia significante para a enzima MetH de tipo selvagem de C. glutamicum e que adicionalmente carregam mutações que reduzem a inibição de produto destas enzimas em comparação com suas enzimas res- pectivas de tipo selvagem sob as condições de teste acima, serão também consideradas como metionina sintases dependentes de cobalamina com a 15 inibição reduzida de produto de acordo com a presente invenção.

De acordo com a presente invenção, uma homologia de seqüên- cia significante entre duas moléculas de ácido nucleico ou dois polipeptídeos é geralmente entendida como indicando que as seqüências nucleotídicas ou a seqüência de aminoácidos, respectivamente, de, por exemplo, moléculas 20 de DNA ou proteínas são pelo menos 30%, pelo menos 40%, preferivelmen- te pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, também preferivel- mente pelo menos 80%, particularmente preferivelmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e, o mais preferivelmente, pelo menos 99% idênticas. Adicionalmente, o termo 25 “homologia de seqüência significante" pode requerer que, por exemplo, 90% das seqüências nucleotídicas idênticas codifiquem polipeptídeos com a mesma função, por exemplo, a metionina sintase dependente de cobalamina ou fragmento funcional da mesma.

A identidade de duas seqüências nucleotídicas ou polipeptídeos é entendida como sendo a identidade dos nucleotídeos ou aminoácidos so- bre o comprimento completo respectivo das seqüências nucleotídicas ou de polipeptídeos respectivamente. Identidade e Homologia podem ser calcula- das usando o software laser gene de DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA) aplicando o método CLUSTAL (Higgens et al. (1989), Comput. Appl. Bioch., 5(2): 151). Homologias e identidades para as seqüências de aminoá- cido e de ácido nucleico também podem ser calculadas usando algoritmos 5 que são baseados em algoritmos por Niedelmann e Wunsch ou Smith e Wa- terman. Software que pode ser usado para estes fins são os programas Pil Aupa (J. Mol. Evolution (1987), 25, 351-360; Higgins et al. (1989) Cabgos, 5:151) ou os programas Gap e Bestfit (Niedelmann e Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48, 443-453 e Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math., 2, 482-489). 10 Para os fins de determinação da identidade das duas seqüências, os parâ- metros de default dos programas de software acima são usados.

Um exemplo de determinação de uma homologia de seqüência significante entre metionina sintases dependentes de cobalamina de diferen- tes organismos é provido por um alinhamento de seqüência de figura 2.

Em uma modalidade da presente invenção, as mutações que

levam à inibição reduzida de produto das metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcionais das mesmas estão localizadas na região de ligação de homocisteína das proteínas. Para a metionina sintase dependente de cobalamina de E.coli, esta região foi ma- peada em aminoácidos 1 a 251.

Está bem de acordo com o conhecimento geral do versado na técnica identificar domínios correspondentes em proteína que são relaciona- das com a enzima de E.coli. Na figura 2, um alinhamento de seqüência é mostrado para as metionina sintases dependentes de cobalamina com se- 25 quências de tipo selvagem para C. glutamicum, E.coli, S. coei e T. marítima. A partir de uma comparação, pode-se notar que os aminoácidos 1 a 251 da enzima de E.coli correspondem a aminoácidos 1 a 244 da enzima de C. glutamicum, aminoácidos 1 a 212 da enzima de T. marítima e aminoáci- dos 1 a 243 da enzima de S. coei 30 Assim, uma modalidade da presente invenção refere-se a metio-

nina sintases dependentes de cobalamina que carregam mutações em uma seqüência que é significantemente homóloga a SEQ ID NO. 1 e que propor- ciona uma inibição reduzida de produto. Em outras modalidades da presente invenção, as metionina sintases dependentes de cobalamina com inibição reduzida de produto de acordo com a presente invenção tem pelo menos uma mutação em pelo menos uma das seguintes seqüências:

SEQ ID No 3:

X1X2X3X4X5X6X7LX8X9X10 em que

Xi = S, V, R; X2= S, E1 R; X3 = Ε, A, Q; X4 = F, L, V; X5 = L, R, S; X6 = D, E1 A, K; X7 = A, Q, L; X8 = A, N, S; X9 = Ν, Τ, E; X10 = H1R SEQ ID No 4:

X-ι X2X3X4DGXsXeGTX7X8X9Xi 0X11 em que

Xi = V, I; X2 = V, L; X3 = I, V, L ;X4 = g, A, L; X5 = A, G; X6 = Μ, Y; X7 = Q, M, E; X8= L, I, F; X9= Q, M; Xi0= G1 A1 S1 K; X11 = F1 Q1 Y SEQ ID No 5:

X1 X2X3X4X5X6X7X8X9Xi OX1 Xi 2X-i 3Χι 4Χ·ι 5 em que

X1 = L1 P1 Y; X2= D1 T1 N; X3 = V1 L1 D1 E; X4= E1 D1 A1 L; X5= K1 D1 P; X6= F exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coeiX7 = R exceto em T. marina, 20 C. glutamicum, S. coei.: X8= G exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coei.: X9 = E exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coei.: X1O = R exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coei.: Xn = F exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coei.: X12 = A exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coei.: X13 = D exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coei.: X14 = D1 W exceto em T. marina: X15 = 25 F1 P exceto em T. marina SEQ ID No 6:

LX1X2X3X4PX5X6X7X8X9X1 OHX11X12YXi3 em que

X1 = N1 V; X2 = D1 L, I; X3 = T1 S1 K; X4 = R, K1 A; X5 = D1 E; X6 = V1 I; X7 = L1 V1 I; X8 = R1 A1 L; X9 = Q1 S1 A1 K; X10 = I1 V; X11 = R1 E1 N; X12 = A1 E1 S; X13 = F1 I;

SEQ ID No 7: < Xix2GX3DX4X5X6TNTFX7X8X9

em que

Xi = Ε, A; X2 = A, S; X3 = A1 V, S; X4 = L, C, I, V; X5 = V, I; X6 = E, L; X7 = G1 N; X8= C1 A, S; X9=N, T;

5 SEQ ID No 8:

Xl X2X3X4X5X5X6X7XgXg em que

Xi = L, Η, T, R; X2 = P, S, I, M; X3 = Ν, A, K; X4 = L. M; X5 = A, G, R; X6 = D, Ε, K; X7 = Y, H; X8 = D, Q, G; X9 = I, M, L;

10 SEQ ID No 9:

X1X2X3X4X5X6X7X8XgXlOX11X12X13X14ARXi5Xl6AX17EXl8 em que

X1 = A, Ρ, E; X2 = D, E, S; X3 = R1 L1 K; X4 = C1 V1 S1 L; X5 = R1 H1 A, D; X6 = Ε, P; X7 = L, I; X8 = A, S, Ν, V; X9 = Y, E, f, R; X10 = Κ, A, N; X11 = G, A; X12 = 15 Τ, A, V; X13 = A, R, K; X14 = V, L, I; X15 = Ε, A, R; X16 = V, C, A; X17 = D, E; X18 = F, M, W, K SEQ ID No 10:

X1X2X3X4X5X6RX7 em que

20 X1 = G exceto em T. marina, A, R exceto em T. marina; X2 = R, T exceto em T. marína\ X3 = N, D, P exceto em T. marina-, X4 = G, G, E exceto em T. ma- rina; X5 = M, R, K exceto em T. marina; X6 = R, Q, P exceto em T. marina-, X7 = F, W, Y exceto em T. marina-,

SEQ ID No 11:

VX1GX2X3GPX4X5X6X7X8Xg em que

X1 = V, L, A, F; X2 = S1 V1 D; X3 = L1 M1 I; X4 = G1 T; X5 = T1 N1 G; X6 = K1 R1 E; X7 = L1 T; X8 = P1 A; X9 = S1 T1 Y;

SEQ ID NO 12:

30 X1 X2X3X4X5X6X7X8XgX10X-1 ί X12Xi 3X14X-i 5X16X17X1 8GX-i 9 em que

X1 = F1 Y; X2 = >, T1 D1 E; X3 = D1 V1 G1 E; X4 = L, F; X5 = R, V1 Y; X6 = G, D1 A1 E; X7 = Η, Α, Ν; X8 = Υ, Ε; X9 = Κ, Q, R; Xi0 = Ε, R; X11 = Α, Ν, S1 Τ; X12 = Α, Τ, V; X13 = L1 Ε, Κ; X14 = G, Α, I; X15 = I, L1 Μ; X16= I. V; X17= Ε, A1 Ε; X18 = G1 Ε; X19=G, Α, V SEQ ID No 13:

DX1X2X3X4ET em que

X1 = A1 L1 G; X2 = F1 L1 I; X3 = L, I; X4 = I, V, F SEQ ID NO 14:

X1DX2LX3X4KAX5VX6X7X8X9 em que

X1 = Q, F, S; X2 = L1 T1 I; X3 = Q1 N1 E; X4 = V1 T, A1 L; X5 = A1 S; X6 = H1 L1 F; X7=G1A; X8=V1 A; X9=Q1 R1K SEQ ID No 15:

X1 X2X3X4XsX6X7X8X9X10X11T em que

X1 = L, V; X2 = D1 G1 S; X3 = T1 L1 V1 R; X4 = F1 D1 E; X5 = L1 V; X6 = P1 F; X7 =

I1 L; X8 = I1 M; X9 = C1 V1 I, A; X10 = H, S; X11 = V, G, M SEQ ID No 16:

X1 X2X3X4X5XeX7X8LX9GX10X-11 em que

X1 = V, I, F; X2 = Ε, T, D; X3 = T, D, E; X4 = Τ, A, K; X5 = G1 S; X6 = G exceto em T. marina, C. glutamicum, S. coel/, X7 = T1 R; X8 = M1 T1 S; X9 = M1 L1 S1 T; X10 = S1Q1T; X11 = E1T1 D SEQ ID No 17:

X1X2X3X4X5X6X7 em que

X1 = G1 E1 A; X2 = A, N; X3 = A, F; X4 = L, Y, A; X5 = Τ, N, I; X6 = A, S, T; X7 = L1F

SEQ ID No 18:

X1 X2X3X4X5XeX7GX8NCX9X10G PX1, E em que

X1 = Ρ, Η, E; X2 = L, A; X3 = G, E, D; X4 = I1 A; X5 = D1 L; X6 = Μ, Τ, A; X7 = I1 ‘ F, L; X8 = L, I; X9 = A1 S; X10 = T, L; X11 = D, A, E

No contexto da presente invenção o termo "mutação" com rela- ção a uma seqüência de aminoácido refere-se a uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido na seqüência de tipo selvagem de metionina sin- 5 tases dependentes de cobalamina ou fragmentos funcionais das mesmas com a exigência de que a mutação mude uma atividade enzimática de modo que o polipeptídeo resultante ainda é capaz de catalisar a transferência de um grupo metila a partir de metiltetra-hidrofolato para homocisteína em um modo dependente de cobalamina, com a enzima mudada ou fragmento fun- 10 cional da mesma tendo inibição reduzida de produto por metionina como definido acima.

O versado na técnica será capaz de introduzir mutações por e- xemplo, na seqüência de aminoácidos SEQ ID Nos. 1 a 18 acima menciona- do e, por exemplo, se basear no este descrito acima, será capaz de determi- 15 nar ser os polipeptídeos resultantes são enzimaticamente ativos e mostram inibição reduzida de produto na presença por metionina.

Para tais mutações, o versado na técnica irá considerar em par- ticular substituições de aminoácido não-conservativas, significando que o aminoácido de tipo selvagem aminoácido é substituído com um aminoácido

■ 20 de propriedades fisico-químicas diferentes. Por exemplo, se a seqüência de tipo selvagem compreende um aminoácido carregado como aspartato, uma substituição não conservativa irá incluir a substituição do aspartato para um aminoácido positivamente carregado como lisina. Alternativamente, um ami- noácido negativamente carregado como ácido aspártico ou ácido glutâmico 25 pode ser substituído por um aminoácido neutro como Glutamina, arginina ou metionina. O versado na técnica irá, como evidente, também considerar substituições conservativas de aminoácido, isto é, substituição por aminoá- cidos com propriedades fisico-químicas comparáveis. Um exemplo é a subs- tituição de Valina por Leucina.

30 Uma metionina sintase dependente de cobalamina enzimatica-

mente ativa ou fragmento funcional da mesma que carrega a mutação em comparação com as seqüências de tipo selvagem respectivas não é consi- derada como sendo um polipeptídeo de acordo com a invenção porque ele não demonstra uma inibição reduzida de produto por metionina como pode ser determinado pelo teste acima mencionado. Os polipeptídeos mudados também não são considerados como formando parte da invenção se eles não forem enzimaticamente ativos. Isto também se aplica para uma seqüên- cia nucleotídica codificando estes polipeptídeos.

A nomenclatura usada em todo este relatório para os aminoáci- dos é o código de uma letra comum.

Com relação à SEQ ID NOS. 3 a 18, "mutação" no caso de substituição de aminoácido significa que o aminoácido de uma posição es- pecificada pode ser substituído com qualquer aminoácido que não é especi- ficado para esta posição particular. Por exemplo, para SEQ ID NO. 3, X1 é especificado como sendo S, V ou R. Uma mutação pode assim compreender qualquer substituição de aminoácido que não é S, V, R. Similarmente, resí- duo X4 de SEQ ID NO. 4, que é G, A, L, pode ser substituído por qualquer aminoácido que não é G, A, L.

O versado na técnica sabe bem que para qualquer tipo de subs- tituição, deleção ou inserção de aminoácido, será necessário determinar se

o polipeptídeo resultante é (i) enzimaticamente ativo e (ii) mostra a inibição reduzida de produto da atividade enzimática na presença de metionina.

As explicações acima do termo "mutação" como dadas para a seqüência de aminoácidos correspondentemente se aplicam para as se- qüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA codificando estes polipep- tídeos.

As formas específicas de realização da presente invenção no caso da metionina sintase dependente de cobalamina MetH de C. glutamicum incluem mutações em posições 33, 86 e 134, em que a se- qüência de resíduos de tipo selvagem são metionina, fenilalanina e serina, respectivamente.

No caso de posição 33, a metionina podem ser mudada para glicina ou alanina. No caso da fenilalanina de posição 86, fenilalanina podem ser mudada em leucina. No caso de resíduo serina em posição 134, o resí- duo pode ser mudado em asparagina. As seqüências de aminoácidos cor- respondentes são mostradas em SEQ ID Nos. 19 a 22 respectivamente, en- quanto as seqüências de DNA correspondentes são mostradas em SEQ ID Nos. 25 a 28.

O versado na técnica irá realizar que as mutações correspon-

dentes podem ser introduzidas em por exemplo, o resíduo 34 de metionina da enzima de S. coei, o resíduo 22 de metionina da enzima de E.coli e o re- síduo de tirosina em posição 22 da enzima de Thermotoga. Com relação a posição 86 de fenilalanina da enzima de C. glutamicum, mutações corres- 10 pondentes no sistema de E.coli podem estar localizadas no resíduo 91 de fenilalanina, na enzima de S. coei no resíduo 86 de fenilalanina e a enzima de Thermotoga maritimum no resíduo 76 de fenilalanina.

Com relação a serina 134 resíduo na enzima de C. glutamicum, mutações correspondentes na enzima de S. coei devem estar localizadas em serina 134, na enzima de E.coli no resíduo 131 de valina e na enzima de Thermotoga no resíduo 124 de aspartato.

Nestes casos, os resíduos correspondentes podem ser mudados dentro glicina e alanina para os resíduos de metionina/tirosina, em leucina para o resíduo de fenilalanina e em asparagina para o resíduo de serina, valina ou aspartato.

Correspondentemente, em vez de substituição de aminoácido, metionina sintases dependentes de cobalamina com inibição reduzida de produto de acordo com a presente invenção podem ter deleções nas posi- ções acima mencionadas, ou inserções adicionais.

Outras modalidades da presente invenção são seqüências nu-

cleotídicas e particularmente seqüências de DNA que codificam os polipeptí- deos e proteínas acima mencionados. Algumas modalidades da presente invenção referem-se a tais seqüências de DNA em uma forma isolada.

Outras modalidades da presente invenção referem-se a vetores que compreendem em direção 5'-3':

a) uma seqüência de promotor sendo funcional para expressão de seqüências nucleotídicas em uma célula hospedeira b) operativamente ligada aos mesmos uma seqüência de nu- cleotideo e preferivelmente de DNA de acordo com a presente invenção, e

c) operativamente ligada aos mesmos uma seqüência de termi- nação.

De acordo com a presente invenção, ligação operativa de um promotor, uma seqüência nucleotídica de acordo com a presente invenção e uma seqüência de terminação significam que as seqüências nucleotídicas de acordo com a presente invenção podem ser expressadas em uma célula hospedeira de modo que a célula hospedeira expressa um metionina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou um fragmento funcio- nal da mesma que mostra a inibição reduzida de produto por metionina co- mo definido acima.

Em uma modalidade preferida, estes vetores compreendem al- guns promotores e opcionalmente elementos melhoradores para permitir a superexpressão de, por exemplo, seqüências de DNA codificando os poli- peptídeos e proteínas acima mencionados. As modalidades específicas para expressão e superexpressão de seqüências de DNA são explicadas abaixo.

Assim, outra modalidade da presente invenção refere-se a célu- las hospedeiras que compreendem seqüências nucleotídicas e preferivel- mente de DNA ou vetores, como foi descrito acima.

Por geneticamente emendando organismos de acordo com a presente invenção, a eficiência e/ou rendimento e/ou quantidade de síntese de metionina podem ser aumentada de modo que estes organismos super- produzindo metionina são caracterizados em que metionina é produzida com uma eficiência aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou quantidade au- mentada de preferivelmente pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% comparado com um organismo inicial que não expres- sa as seqüências nucleotídicas de acordo com a presente invenção.

Comparado com este organismo hospedeiro inicial, a eficiência e/ou o rendimento e/ou a quantidade de produção de metionina no organis- 1 mo hospedeiro produzindo metionina de acordo com a presente invenção pode aumentar preferivelmente pelo menos por um fator de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 30, 50, 70, 100, 200, 500 ou pelo menos por um fator de 1000.

O organismo hospedeiro de acordo com a presente invenção 5 pode ser selecionado dentre o grupo consistindo em bactérias corineformes, micobactérias, streptomycetes, Salmonella1 Escherichia coli, Shigelia, Bacil- lus, Serratia, Pseudomonas, S. coei ou T. marítima.

Os organismos da presente invenção podem preferivelmente compreender um micro-organismo do gênero Corynebacterium, particular- mente Corynebacterium acetoacidophilum, C. acetoglutamicum, C. acetophi- ium, C. ammoniumgenes, C. glutamicum, C. lilium, C. nitrílophilus ou C. spec.

Os organismos de acordo com a presente invenção também compreendem membros do gênero Brevibacterium, como Brevibaeterium harmoniagenes, Brevibaeterium botanieum, B. divaratieum, B. fiavam, B. he- alil, B. ketoglutamieum, B. ketosoreduetum, B. laetofermentum, B. linens, B. paraphinolytieum e B. spec.

Os organismos de acordo com a presente invenção também compreendem S. coei.

Os organismos de acordo com a presente invenção também compreendem membros do gênero Thermotoga, como T. maritime.

Em particular, micro-organismos Corynebacterium podem ser selecionados dentre o grupo consistindo em Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032), Corynebacterium acetoglutamicum (ATCC 15806), Coryne- bacterium acetoacidophilum (ATCC 13870), Corynebacterium thermoamino- 25 genes (FERM BP-1539), Corynebacterium melassecola (ATCC 17965), Corynebacterium glutamicum (KFCC10065), Corynebacterium glutamicum (DSM 17322), Corynebacterium efficiens (YS-314) e Corynebaeterium glu- tamicum (ATCC21608).

Particularmente preferida é a cepa de Corynebacterium glutami- 30 cum ATCC13032 e todos os seus derivados. As cepas ATCC 13286, ATCC 13287, ATCC 21086, ATCC 21127, ATCC 21128, ATCC 21129, ATCC 21253, ATCC 21299, ATCC 21300, ATCC 21474, ATCC 21475, ATCC 21488, ATCC 21492, ATCC 21513, ATCC 21514, ATCC 21515, ATCC 21516, ATCC 21517, ATCC 21518, ATCC 21528, ATCC 21543, ATCC 21544, ATCC 21649, ATCC 21650, ATCC 21792, ATCC 21793, ATCC 21798, ATCC 21799, ATCC 21800, ATCC 21801, ATCC 700239, ATCC 5 21529, ATCC 21527, ATCC 31269 e ATCC 21526 que são conhecidas como produzindo lisina também podem ser preferivelmente usadas. As outras ce- pas acima mencionadas também podem ser usadas.

A abreviatura KFCC significa Korean Federation of Culture Col- lection, enquanto a abreviatura ATCC significa American Type Strain Culture Collection. A abreviatura DSM significa German Resource Centre for Biologi- cal Material.

Micro-organismos do gênero Escherichia podem ser seleciona- dos dentre o grupo compreendendo Escherichia coli. Micro-organismos do gênero Salmonella podem ser selecionados dentre o grupo compreendendo Salmonella typhimurium.

Estes organismos hospedeiros podem ser engenheirados por introdução de seqüências nucleotídicas exógenas de acordo com a presente invenção, por exemplo, na forma de vetores.

Além disso, ou alternativamente, mutações como as descritas acima que efetuam uma inibição reduzida de produto podem ser introduzidas nas seqüências de codificação endógenas para metionina sintases depen- dentes de cobalamina.

Além disso, a modalidade da presente invenção refere-se a célu- las hospedeiras em que seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA 25 de acordo com a presente invenção que codificam para metionina sintases dependentes de cobalamina enzimaticamente ativas ou fragmentos funcio- nais das mesmas tendo uma inibição reduzida de produto na presença de metionina são expressadas e em que adicionalmente o(s) gene(s) endóge- no(s) para metionina sintase(s) dependente(s) de cobalamina é/são deletado 30 (s) ou funcionalmente rompido(s).

O termo "deletado" ou "ruptura funcional" é, para os fins da pre- sente invenção, equivalente à descrição de que o teor e/ou a atividade das 1 metionina sintases dependentes de cobalamina como elas são codificadas pelos genes endógenos do organismo hospedeiro são reduzidos.

Como uma redução do teor e/ou da atividade e corresponden- temente a deleção e/ou a ruptura funcional destes genes endógenos para 5 metionina sintases dependentes de cobalamina pode ser obtida é descrita abaixo.

Outras modalidades da presente invenção referem-se a células hospedeiras em que seqüências de DNA de acordo com a presente inven- ção, isto é, codificando metionina sintases dependentes de cobalamina ou 10 fragmentos das mesmas com uma inibição reduzida de produto na presença de metionina são expressadas e em que o teor e/ou a atividade de pelo me- nos uma das seguintes seqüências nucleotídicas do grupo I é aumentada em comparação com o organismo inicial respectivo:

• seqüência nucleotídica codificando para aspartato quinase IysC (EP 1 108 790 A2;

DNA (SEQ ID No. 281),

• seqüência nucleotídica codificando para aspartato semialdeído desi- drogenase asd (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ ID No. 282),

• seqüência nucleotídica codificando para glicerina aldeído-3-fosfato desidrogenase gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology, 174: 6076-

6086),

• seqüência nucleotídica codificando para 3-fosfatoglicerato quinase pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology, 174: 6076-6086),

• seqüência nucleotídica codificando para piruvato carboxilase pyc (Eikmanns (1992), Journal of Baeteriology, 174: 6076-6086),

• seqüência nucleotídica codificando para triosefosfato isomerase tpi (Eikmanns (1992), Journal of Baeteriology, 174: 6076-6086),

• seqüência nucleotídica codificando para homosserina-O-acetil transfe- rase metA (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 725),

· seqüência nucleotídica codificando para cistahionina gama sintase metB (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 3491),

• seqüência nucleotídica codificando para cistahionina gama Iiase metC (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 3061),

• seqüência nucleotídica codificando para serina hidroximetil transfera- se glyA (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 1110),

• seqüência nucleotídica codificando para O-acetil-homosserina sulfidri- Iase metY (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 726),

• seqüência nucleotídica codificando para metilenotetra-hidrofolato re- dutase metF (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 2379),

• seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina amino transfe- rase serC (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 928),

· seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina fosfatase serB (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 334, DNA SEQ ID No. 467, DNA SEQ ID No. 2767),

• seqüência nucleotídica codificando para serina acetil transferase cysE (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 2818),

· seqüência nucleotídica codificando para homosserina desidrogenase hom (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 1306),

• seqüência nucleotídica codificando para metionina sintase metE (nú- mero de acesso do banco de genes NCgM 094),

• seqüência nucleotídica codificando para cisteína sintase (número de acesso do banco de genes NP_601760, NP_601337, NCgl2473, NCgl2055),

• seqüência nucleotídica codificando para sulfito redutase (número de acesso do banco de genes NP_602008, NCgl2718)

• seqüência nucleotídica codificando para fosfato adenosina fosfatos- sulfato redutase (número de acesso do banco de genes NP_602007, NC-

gl2717),

• seqüência nucleotídica codificando para sulfato adenilil transferase subunidade 1 (número de acesso do banco de genes NP_602005, NC- gl2715),

• seqüência nucleotídica codificando para CysN-sulfato adenilil transfe- rase subunidade 2 (número de acesso do banco de genes NP_602006, NC-

gl2716),

• seqüência nucleotídica codificando para ferredoxina NADP redutase * (número de acesso do banco de genes NP_602009, NCgl2719),

• seqüência nucleotídica codificando para ferredoxina (número de a- cesso do banco de genes NP_602010, NCgl2720),

• seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato desidroge- 5 nase (número de acesso do banco de genes NP_600790, NCgM 514), e/ou

• seqüência nucleotídica codificando para frutose-1-6-bisfosfatase (nú- mero de acesso do banco de genes NP_601294, NCgl2014).

Como evidente, estes organismos hospedeiros podem mostrar um teor e/ou atividade aumentados de seqüências nucleotídicas que mos- 10 tram uma homologia significante como definido acima para qualquer uma das seqüências nucleotídicas acima mencionadas. Novamente, o termo “homologia de seqüência significante” requer que estas seqüências nucleotí- dicas codifiquem polipeptídeos que têm a atividade enzimática respectiva.

Em outras modalidades da presente invenção, o organismo hos- 15 pedeiro pode compreender seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA de acordo com a invenção que codificam metionina sintases dependen- tes de cobalamina ou ativas ou fragmentos das mesmas com inibição redu- zida de produto na presença de metionina e adicionalmente proveem um teor e/ou uma atividade reduzida de pelo menos uma das seguintes sequên-

■ 20 cias nucleotídicas de grupo II:

• seqüência nucleotídica codificando para homosserina quinase thrB (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 3453),

• seqüência nucleotídica codificando para treonina desidratase ilvA (EP

1 108 790; DNA SEQ ID No. 2328),

25 · seqüência nucleotídica codificando para treonina sintase thrC (EP 108 790; DNA SEQ ID No. 3486),

• seqüência nucleotídica codificando para meso diaminopimelat-D- desidrogenase ddh (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 3494),

• seqüência nucleotídica codificando para fosfatoenol piruvato carboxi- 30 quinase pck (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 3157),

• seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato-6-isomerase pgi (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 950), • seqüência nucleotídica codificando para piruvato oxidase poxB (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 2873),

• seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato sintase dapA (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 3476),

5 · seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato redutase dapB (EP 1 108 790; DNA SEQ ID No. 3477),

• seqüência nucleotídica codificando para diaminopicolinato- descarboxilase IysA (EP 1 108 790 A2; DNA SEQ ID No. 3451),

• seqüência nucleotídica codificando para glicosil transferase (número de acesso do banco de genes NP_600345 e NCgM 072) e/ou

• seqüência nucleotídica codificando para Iactato desidrogenase (nú- mero de acesso do banco de genes NP_602107, NCgl2817).

O aumento e/ou a diminuição no teor e/ou na atividade das se- qüências nucleotídicas acima mencionadas de grupos I e Il em comparação 15 com o organismo de tipo selvagem ou inicial respectivo pode chegar a pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100%. Comparado com estes organismos hospedeiros iniciais, o aumento e/ou a diminuição no 20 teor e/ou na atividade das seqüências nucleotídicas de grupos I e Il acima mencionadas de acordo com a presente invenção podem chegar também preferivelmente a pelo menos um fator de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 30, 50, 70, 100, 200, 500 ou pelo menos um fator de 1000.

Assim, todas as células hospedeiras e organismos de acordo 25 com a presente invenção são caracterizados em que eles compreendem e preferivelmente superexpressam pelo menos uma seqüência nucleotídica e preferivelmente de DNA de acordo com a presente invenção que codifica uma proteína ou polipeptídeo que é uma metionina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou fragmento funcional da mesma mos- 30 trando uma inibição reduzida de produto na presença de metionina como definido acima. Estes polipeptídeos ou proteínas irão geralmente carregar pelo menos uma mutação em sua seqüência de aminoácido em comparação * com a seqüência de aminoácido de tipo selvagem respectiva que é respon- sável pela inibição reduzida de produto por metionina. Além disso, estas cé- lulas hospedeiras podem mostrar um aumento e/ou uma diminuição no teor e/ou na atividade de qualquer uma das seqüências nucleotídicas como es- pecificado acima para grupo I e grupo II.

Alternativamente, ou além disso, estas células hospedeiras po- dem mostrar uma deleção ou ruptura funcional dos genes endógenos codifi- cando para metionina sintases dependentes de cobalamina de tipo selva- gem. Estas células hospedeiras podem ser selecionadas dentre os organis- 10 mos especificados acima e produzidos de acordo com os métodos descritos abaixo.

Outras modalidades da presente invenção referem-se a métodos para produzir metionina em uma célula hospedeira, em que pelo menos uma seqüência nucleotídica e preferivelmente de DNA de acordo com a presente 15 invenção, isto é, a seqüência que codifica um polipeptídeo ou proteína que é uma metionina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou fragmento funcional da mesma com inibição reduzida de produto na presen- ça de metionina como uma conseqüência de uma mutação em uma seqüên- cia de aminoácido, é expressada em um organismo hospedeiro. Estas célu- 20 Ias hospedeiras podem ser cultivadas sob condições apropriadas e a metio- nina produzida ser recuperada. Estes métodos também proveem uma efici- ência e/ou um rendimento aumentados de metionina em comparação com o organismo de partida respectivo.

Outras modalidades da presente invenção referem-se ao uso de 25 seqüências nucleotídicas e preferivelmente de DNA de acordo com a pre- sente invenção e células hospedeiras de acordo com a presente invenção para produzir metionina e/ou aumentar a eficiência e/ou o rendimento de produção de metionina.

Com relação ao aumento ou à diminuição da quantidade e/ou atividade de seqüências nucleotídicas e de polipeptídeos sendo codificados assim, todos os métodos que são conhecidos na técnica para aumentar ou diminuir a quantidade e/ou a atividade de seqüência nucleotídica e/ou um polipeptídeo em um hospedeiro como os organismos acima mencionados podem ser usados. Estes métodos são descritos também em detalhes abai- xo. Estes métodos também podem ser usados para expressar a seqüência de DNA de acordo com a presente invenção, isto é, a seqüência de DNA codificando a metionina sintase dependente de cobalamina com inibição re- duzida de produto na presença de metionina como uma conseqüência da mutação em uma seqüência de aminoácido.

Aumentando ou introduzindo uma quantidade e/ou atividade de seqüências nucleotídicas e/ou polipeptídeos de acordo com a invenção e do grupo I

Com relação ao aumento da quantidade, dois cenários básicos podem ser diferenciados. No primeiro cenário, a quantidade do polipeptídeo é aumentada por expressão de uma versão exógena da seqüência nucleotí- dica respectiva. No outro cenário, a expressão do polipeptídeo endógeno é aumentada por influência da atividade de elementos promotores e/ou melho- radores e/ou outras atividades regulatórias como fosfatorilação, sumoilação, ubiquitilação, etc. que regulam as atividades dos polipeptídeos respectivos ou em um nível transcripcional, translacional ou pós-translacional.

Além de simplesmente aumentar a quantidade de, por exemplo, seqüências nucleotídicas acima mencionadas, a atividade dos polipeptídeos de, por exemplo, grupo I pode ser aumentada usando enzimas carregando mutações específicas que permitem uma atividade aumentada da enzima. Estas mutações podem, por exemplo, inativar as regiões de uma enzima que são responsáveis para a inibição de realimentação. Ao mudar estas por, por exemplo, introdução de mutações não-conservativas, a enzima não poderia prover uma regulação de realimentação mais e, assim, a atividade da enzi- ma não poderia ser regulada de modo negativo se mais produto fosse pro- duzido. Estas mutações podem ser ou introduzidas dentro da cópia endóge- na da enzima, ou podem ser providas por superexpressão de uma forma de mutante correspondente da enzima exógena. Estas mutações podem com- preender mutações por pontos, deleções ou inserções. As mutações por pontos podem ser conservativas ou não-conservativas. Além disso, deleções podem compreender somente dois ou três aminoácidos até os domínios completos da proteína respectiva. Como evidente, polipeptídeos de acordo com a invenção, isto é, metionina sintases dependentes de cobalamina ou fragmentos funcionais das mesmas com inibição reduzida de produto, po- dem ser expressados por expressão de seqüências nucleotídicas exógenas correspondentes ou por introdução da(s) mutação(s) que leva à inibição re- duzida de produto nos genes endógenos.

Assim, o aumento da atividade e da quantidade de um polipeptí- deo pode ser obtido por vias diferentes, por exemplo, por desligamento dos mecanismos regulatóríos inibitórios no nível de transcrição, translação de proteínas ou por aumento de expressão de gene de um ácido nucleico codi- ficando para estas proteínas em comparação com o organismo de partida, por exemplo, por manipulação do gene endógeno ou por introdução dos áci- dos nucleicos codificando para o polipeptídeo.

Em uma modalidade, o aumento da atividade e da quantidade de um polipeptídeo, respectivamente, em comparação com o organismo ini- cial é alcançado por um aumento na expressão de um ácido nucleico codifi- cando estes polipeptídeos. Seqüências podem ser obtidas a partir da base de dados respectiva, por exemplo, em NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EMBL (http://www.embl.org), ou Expasy (http://www.expasy.org/).

Em ainda outra modalidade, o aumento de uma quantidade e/ou de uma atividade dos polipeptídeos acima mencionados é obtido por intro- dução dos ácidos nucleicos correspondentes dentro do organismo, preferi- velmente C. glutamicum, E. coli, S. coei ou T. marítima.

Em princípio, cada proteína de organismos diferentes com uma atividade enzimática dos polipeptídeos acima mencionados pode ser usada. Com seqüências genômicas de ácido nucleico destas enzimas a partir de fontes eucarióticas contendo íntrons, as seqüências de ácido nucleico já pro- cessadas, do tipo dos cDNAs correspondentes, devem ser usadas no caso em que o organismo hospedeiro não é capaz ou não pode ser tornado capaz de emendar os mRNAs correspondentes. Todos os ácidos nucleicos men- cionados na descrição podem ser, por exemplo, uma seqüência de RNA, DNA ou cDNA.

Em um método de acordo com a presente invenção para produ- zir metionina, a seqüência de ácido nucleico codificando para uma das meti- onina sintases dependentes de cobalamina acima mencionadas ou fragmen- 5 tos funcionais das mesmas com inibição reduzida de produto por metionina é transferida para um micro-organismo como C. glutamicum, E. coli, S. coei ou T. marítima, respectivamente. Esta transferência leva a um aumento na ex- pressão da enzima mudada, e correspondentemente a síntese de metionina aumentada.

De acordo com a presente invenção, o aumento e/ou a introdu-

ção de uma quantidade e/ou a atividade do polipeptídeo tipicamente com- preende as seguintes etapas:

a) produção de um vetor compreendendo as seguintes seqüên- cias de ácido nucleico, preferivelmente seqüências de DNA, em orientação

5’-3':

uma seqüência de promotor funcional nos organismos da invenção uma seqüência de DNA operativamente ligada ao mesmo de acor- do com a invenção

uma seqüência de terminação funcional nos organismos da inven-

ção

b) transferência do vetor da etapa a) para os organismos da in- venção como C. glutamicum, E. coli, S. coei ou T. marítima e, opcionalmen- te, integração dentro dos genomas respectivos.

O uso destes vetores compreendendo seqüências regulatórias,

como são as seqüências de promotor e de terminação, é conhecido do ver- sado. Além disso, o versado na técnica sabe como o vetor da etapa a) pode ser transferido para organismos como C. glutamicum, E. coli, S. coei ou T. marítima e quais propriedades um vetor deve ter para ser capaz de ser inte- grado dentro de seus genomas.

Se o teor de enzima em um organismo como C. glutamicum for

aumentado por transferência de um ácido nucleico codificando para um poli- peptídeo de outro organismo, como por exemplo, E. coli, é aconselhável ‘ transferir uma seqüência de aminoácido codificado pela seqüência de ácido

nucleico por exemplo, de E. coli por retrotradução da seqüência de polipep- tídeo de acordo com o código genético dentro da seqüência de ácido nuclei- co compreendendo principalmente estes códons, que são usados com maior 5 frequência devido ao uso de códons específico do organismo. O uso de có- dons pode ser determinado por meio de avaliações computadorizadas de outros genes conhecidos dos organismos relevantes.

De acordo com a presente invenção, um aumento da expressão do gene e da atividade, respectivamente, de uma seqüência nucleotídica de acordo com a presente invenção é também entendido como sendo a mani- pulação da expressão das enzimas endógenas respectivas de um organis- mo, em particular de C. glutamicum, E. coli, S. coei ou T. martima. Isto pode ser obtido, por exemplo, por alteração da seqüência promotora de DNA para genes codificando, por exemplo, metionina sintases dependentes de coba- lamina com inibição reduzida de produto. Esta alteração, que causa uma taxa de expressão alterada, preferivelmente aumentada, destas enzimas mudadas pode ser obtida por deleção ou inserção de seqüências de DNA. Como evidente, isto requer que as mutações que são responsáveis pela ini- bição reduzida de produto tenham sido introduzidas dentro dos genes endó- - 20 genos.

Uma alteração da seqüência de promotor de tais genes endóge- nos mudados geralmente causa uma alteração da quantidade expressada do gene e assim também uma alteração da atividade detectável na célula ou no organismo.

25 Além disso, uma expressão alterada e aumentada, respectiva-

mente, de um gene endógeno pode ser obtida por uma proteína regulatória, que não ocorre no organismo transformado, e que interage com o promotor destes genes. Este regulador pode ser uma proteína quimérica consistindo em um domínio de ligação de DNA e um domínio de ativador de transcrição, 30 como por exemplo, descrito em WO 96/06166.

Uma outra possibilidade para aumentar a atividade e o teor de genes endógenos é regular de modo positivo os fatores de transcrição en- volvidos na transcrição dos genes endógenos, por exemplo, por meio de su- perexpressão. As medidas para a superexpressão de fatores de transcrição são conhecidas do versado.

Além disso, uma alteração da atividade de genes endógenos 5 pode ser obtida por mutagênese marcada das cópias do gene endógeno.

Uma alteração de genes endógenos codificando para as enzi- mas de, por exemplo, grupo I também pode ser obtida por influência das modificações pós-translacionais das enzimas. Isto pode acontecer, por e- xemplo, por regulação da atividade de enzimas de tipo quinases ou fosfata- 10 ses envolvidas na modificação pós-translacional de enzimas por meio de medidas correspondentes como a superexpressão ou silenciamento dos ge- nes.

Em outra modalidade, polipeptídeos de, por exemplo, grupo I podem ser melhorados em sua eficiência, ou sua região de controle alo- 15 estereoquímica destruída de modo que a inibição de realimentação de pro- dução do composto seja evitada. Similarmente, uma enzima degradativa pode ser deletada ou modificada por substituição, deleção, ou adição de modo que sua atividade degradativa seja diminuída para os polipeptídeos desejados ou os polipeptídeos sendo codificados por seqüências nucleotídi- 20 cas da presente invenção sem afetar a viabilidade da célula. Em cada caso, o rendimento global ou a taxa de produção de metionina pode ser aumenta- da.

Também é possível que tais alterações nos polipeptídeos e mo- léculas de nucleotídeos possam melhorar a produção dos produtos químicos 25 finos, como outros compostos contendo enxofre, do tipo cisteína ou glutatio- na, outros aminoácidos, vitaminas, cofatores, nutracêuticos, nucleotídeos, nucleosídeos, e trehalose. Metabolismo de qualquer composto pode ser en- trelaçado com outras vias biossintéticas e degradativas dentro da célula, e os cofatores necessários, , intermediários, ou substratos em uma via são 30 provavelmente supridos ou limitados por outra de tal via. Assim, por modula- ção da atividade de polipeptídeos da presente invenção e/ou os de, por e- xemplo, grupo I, a produção e/ou eficiência de outra via biossintética ou de- ‘ gradativa para produto químico fino além das levando à metionina podem ser impactadas.

A expressão e a função de enzima também podem ser regula- das com base nos níveis celulares de um composto a partir de um processo metabólico diferente, e os níveis celulares de moléculas necessários para o crescimento básico, como aminoácidos e nucleotídeos, podem afetar criti- camente a viabilidade do micro-organismo em uma cultura em larga escala. Assim, modulação de uma enzima de biossíntese de aminoácido de, por e- xemplo, as vias biossintéticas de lisina de modo que elas não sejam mais respondentes à inibição de realimentação ou de modo que elas sejam me- lhoradas em eficiência ou turnover, pode resultar em uma melhor produção de metionina. As estratégias acima mencionadas para aumentar ou introdu- zir uma quantidade e/ou atividade da polipeptídeo e seqüências nucleotídi- cas não significam ser limitativas; variações nestas estratégias serão pron- tamente evidentes para um versado na técnica.

Reduzindo a quantidade e/ou atividade de seqüências nucleotí- dicas e/ou polipeptídeos codificando metionina sintases dependentes de co- balamina endógenas e de grupo Il

Para reduzir a quantidade e/ou atividade de seqüência nucleotí- 20 dica e polipeptídeos sendo assim codificados, várias estratégias também se encontram disponíveis.

A expressão das enzimas endógenas de, por exemplo, grupo Il pode, por exemplo, ser regulada via a expressão de aptâmeros especifica- mente ligando para as seqüências de promotor dos genes. Dependendo dos 25 aptâmeros ligando para estimular ou reprimir as regiões de promotor, a quantidade e assim, neste caso, a atividade de tais enzimas, é aumentada ou reduzida.

Aptâmeros também podem ser projetados em um modo como para especificamente ligar-se às próprias enzimas e para reduzir a atividade das enzimas por, por exemplo, ligando para p centro catalítico das respecti- vas enzimas. A expressão de aptâmeros é geralmente obtida por superex- pressão com base em vetor (ver acima) e é, também como o projeto e a seleção de aptâmeros, bem conhecidos do versado (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36).

Além disso, a diminuição da quantidade e da atividade de, por exemplo, os genes endógenos de MetH ou de enzimas endógenas de grupo 5 Il pode ser obtida por meio de várias medidas experimentais, que são bem conhecidas do versado. Estas medidas são geralmente resumidas sob o termo "silenciamento de genes”. Por exemplo, a expressão de um gene en- dógeno pode ser silenciada por transferência de um vetor acima menciona- do, que tem uma seqüência de DNA codificando para a enzima ou partes da 10 mesma em ordem antissenso, para os organismos como C. glutamicum e E. coli. isto é, baseado no fato de que a transcrição de tal vetor na célula leva a um RNA, que pode hibridizar com o mRNA transcrito pelo gene endógeno e assim evita sua tradução.

As seqüências regulatórias operativamente ligadas a um ácido nucleico clonado na orientação antissenso podem ser selecionadas que diri- gem a expressão contínua da molécula de RNA antissenso RNA em uma variedade de tipos de células, por exemplo, promotores virais e/ou melhora- dores, ou seqüências regulatórias podem ser selecionadas que dirigem a expressão constitutiva direta, específica de tecido ou específica de tipo celu- Iar de RNA antissenso. O vetor de expressão antissenso pode estar na for- ma de um plasmídeo recombinante, fagemídeo ou vírus atenuado em que os ácidos nucleicos antissenso são produzidos sob o controle de uma região regulatória de elevada eficiência, cuja atividade pode ser determinada pelo tipo de célula dentro da qual o vetor é introduzido. Para uma discussão da regulação de expressão de gene usando genes antissenso, ver Weintraub, H. etal., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Trends in Genetics, Vo1.1 (1) 1986.

Em princípio, a estratégia antissenso pode ser copulada a um método de ribozima. As ribozimas são seqüências de RNA cataliticamente ativas, que, se copuladas nas seqüências antissenso, clivam as sequências- alvo cataliticamente (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257- 75). Isto pode melhorar a eficiência de uma estratégia antissenso. * Além destes métodos, existe a introdução de mutações antis-

senso dentro do gene endógeno por meio de introdução de oligonucleotí- deos RNA/DNA dentro do organismo (Zhu et al., (2000) Λ/aí. Biotechnol. 18 (5), 555-558) ou gerando mutantes de nocaute com a ajuda de recombina- 5 ção homóloga (Hohn et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 8321- 8323.).

Para criar um micro-organismo recombinante homólogo, um ve- tor é preparado o qual contém pelo menos uma porção de gene codificando para, por exemplo, uma enzima de grupo Il ou o gene MetH endógeno den- 10 tro do qual a deleção, adição ou substituição foi introduzida para, assim, alte- rar, por exemplo, romper funcionalmente, o gene endógeno.

Preferivelmente, este gene endógeno é um gene de C. glutami- cum ou E. coli, mas ele pode ser um homólogo de uma bactéria relacionada ou mesmo de uma fonte de planta ou levedura. Em uma modalidade, o vetor 15 é projetado de modo que, quando da recombinação homóloga, o gene en- dógeno é funcionalmente rompido (isto é, não codifica mais uma proteína funcional; também referido como um vetor de "nocaute"). Alternativamente, o vetor pode ser projetado de modo que, quando da recombinação homóloga, o gene endógeno é mudado ou de outra forma alterado mas ainda codifica

■ 20 proteína funcional (por exemplo, a regulação regulatória a montante pode ser alterada para assim alterar a expressão da enzima endógena de, por exemplo, grupo 2). No vetor de recombinação homóloga, a porção alterada do gene endógeno é flanqueada em suas extremidades 5' e 3' por ácido nu- cleico adicional do gene endógeno para permitir a recombinação homóloga 25 ocorrer entre o gene exógeno carregado pelo vetor e um gene endógeno no (micro)organismo. O ácido nucleico endógeno de flanco adicional é de com- primento suficiente para uma recombinação homóloga de sucesso com o gene endógeno. Tipicamente, vários kilobases de DNA de flanco (ambos nas extremidades 5' e 3') são incluídos no vetor (ver por exemplo, Thomas, K. R., 30 e Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503 para uma descrição de vetores de re- combinação homóloga).

O vetor é introduzido dentro de um micro-organismo (por exem- pio, por eletroporação) e células em que o gene introduzido endógeno foi recombinado de modo homólogo com as enzimas endógenas são selecio- nadas, usando técnicas conhecidas.

Em outra modalidade, um gene endógeno em uma célula hos- pedeira é rompido (por exemplo, por recombinação homóloga ou outros meios genéticos bem conhecidos) de modo que expressão de seu produto de proteína não ocorra. Em outra modalidade, um gene endógeno ou intro- duzido em uma célula hospedeira foi alterado por uma ou mais mutações de pontos, deleções, ou inversões, mas ainda codifica uma enzima funcional. Em ainda outra modalidade, uma ou mais das seqüências regulatórias (por exemplo, um promotor, repressor, ou indutor) de um gene endógeno em um (micro)organismo foi alterado (por exemplo, por deleção, truncagem, inver- são ou mutação de pontos), de modo que a expressão do gene endógeno seja modulada. Um versado na técnica irá apreciar que as células hospedei- ras contendo mais do que um dos genes codificando, por exemplo, para as enzimas de grupo Il e modificações de proteína podem ser prontamente pro- duzidas usando os métodos da invenção, e são destinadas a estarem incluí- das na presente invenção.

Além disso, uma repressão de genes (mas também superex- pressão de genes) é também possível por meio de fatores de ligação de DNA específicos, por exemplo, fatores do tipo de fator de transcrição de da- do de zinco. Além disso, fatores inibindo a própria proteína-alvo podem ser introduzidos dentro de uma célula. Os fatores de ligação de proteína podem ser, por exemplo, aptâmeros acima mencionados. Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36).

Como outros fatores de ligação de proteína, cuja expressão em organismos causa uma redução da quantidade e/ou da atividade das enzi- mas de, por exemplo, grupo II, os anticorpos específicos de enzima podem ser considerados. A produção de anticorpos específicos de enzima mono- clonais, policlonais, ou recombinantes segue protocolos-padrão (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), Μ. P. Deuts- cher, ed.). A expressão de anticorpos é também conhecida da literatura (Fi- edler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard e Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).

As técnicas mencionadas são bem conhecidas do versado. As- sim, o técnico também sabe que tamanhos as construções de ácido nucleico 5 usadas para, por exemplo, métodos antissenso, devem ter e qual comple- mentaridade, homologia ou identidade, as seqüências respectivas de ácido nucleico devem ter. Os termos complementaridade, homologia, e identidade são conhecidos do versado.

O termo complementaridade descreve a capacidade de uma mo- lécula de ácido nucleico de hibridizar com outra molécula de ácido nucleico devido às ligações hidrogênio entre duas bases complementares. O versado na técnica sabe que duas moléculas de ácido nucleico não precisam ter uma complementaridade de 100% a fim de serem capazes de hibridizar entre si. A seqüência de ácido nucleico, que deve hibridizar com outra seqüência de ácido nucleico, sendo preferida pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, particularmen- te preferida pelo menos 80%, também particularmente preferida pelo menos 90%, em particular preferida pelo menos 95% e o mais preferivelmente pelo menos 98 ou 100%, respectivamente, complementar com a referida outra seqüência de ácido nucleico.

Moléculas de ácido nucleico são idênticas, se elas tiverem nu- cleotídeos idênticos em ordem 5'-3' idêntica.

A hibridização de uma seqüência antissenso com uma seqüên- cia de mRNA endógena tipicamente ocorre in vivo sob condições celulares ou in vitro. De acordo com a presente invenção, a hibridização é realizada in vivo ou in vitro sob condições que são estringentes o suficiente para assegu- rar uma hibridização específica.

As condições estrigentes de hibridização in vitro são conhecidas do versado e podem ser obtidas da literatura (ver por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press). O termo “hibridização es- pecífica" refere-se ao caso em que a molécula preferivelmente se liga a uma certa seqüência de ácido nucleico sob condições estringentes, se esta se- quência de ácido nucleico fizer parte de uma mistura complexa de, por e- xemplo, moléculas de DNA ou RNA.

O termo “condições estringentes” assim refere-se a condições, sob as quais a seqüência de ácido nucleico preferivelmente liga-se a uma sequência-alvo, mas não, ou pelo menos em uma extensão significantemen- te reduzida, a outras seqüências.

Condições estringentes são dependentes das circunstâncias. As seqüências mais longas especificamente hibridizam em maiores temperatu- ras. Em geral, as condições estringentes são selecionadas em tal modo que a temperatura de hibridização está na faixa de cerca de 5°C abaixo do ponto de fusão (Tm) da seqüência específica com uma força tônica definida e um valor de pH definido. Tm é a temperatura (com um valor de pH definido, uma força iônica definida e uma concentração de ácido nucleico definida), em que 50% das moléculas, que são complementares a uma sequência-alvo, hibridi- zam com a referida sequência-alvo. Tipicamente, as condições estringentes compreendem concentrações de sal entre 0,01 e 1,0 M de íons sódio (ou íons de outro sal) e um valor de pH entre 7,0 e 8,3. A temperatura é pelo menos 30°C para as moléculas curtas (por exemplo, para tais moléculas compreendendo entre 10 e 50 nucleotídeos). Além disso, condições estrin- gentes podem compreender a adição de agentes desestabilizantes como, por exemplo, formam amida. Os tampões de lavagem e de hibridização típi- cos são da seguinte composição.

Solução de pré-hibridização:

0,5 % de SDS 5x SSC

50 mM de NaPO4, pH 6,8 0,1% pirofosfato de Na 5x reagente de Denhardt 100 pg/esperma de salmão Solução de hibridização Solução de pré-hibridização 1x106 cpm/ml sonda (5-10 min 95°C) * 20x SSC: NaCI a 3 M

citrato de sódio a 0,3 M ad pH 7 com HCI 50x reagente de Denhardt: 5 g a Ficoll 5 5 g de polivinilpirrolidona

5 g de Albumina de soro bovino ad 500 ml A. dest.

Um procedimento típico para a hibridização é como a seguir: Opcional: lavar Blot 30 min em 1x SSC/0,1 % SDS a 65°C Pré-hibridização: pelo menos 2 h a 50-55°C Hibridização.'durante a noite a 55-60°C Lavagem: 05 min 2x SSC/0,1 % SDS Temperatura de hibridização min 2x SSC/0,1 % SDS Temperatura de hibridização min 1x SSC/0,1 % SDS Temperatura de hibridização 45 min 0,2x SSC/0,1 % SDS 65°C min 0,1x SSC temperatura ambiente ' 20 Estas condições estringentes também se aplicam quando as rei-

vindicações referem-se a seqüências de DNA que hibridizam sob condições estringentes.

Os termos “senso” e “antissenso” assim como “orientação antis- senso” são conhecidos do versado. Além disso, o versado na técnica conhe- 25 ce, qual o comprimento que as moléculas de ácido nucleico, que devem ser usadas para os métodos antissenso, deve ter e que homologia ou comple- mentaridade elas devem ter com relação às suas sequências-alvos.

Assim, o versado na técnica também sabe qual o comprimento que as moléculas de ácido nucleico, que são usadas para os métodos de 30 silenciamento de gene, devem ter. Para fins de complementaridade antis- senso, comprimentos de seqüência de 100 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 40 nucleotídeos e 20 nucleotídeos devem ser suficientes. Os comprimentos de nucleotídeos maiores com certeza também serão sufi- cientes. Uma aplicação combinada dos métodos acima mencionados tam- bém é concebível.

Se1 de acordo com a presente invenção, seqüências de DNA são usadas, que são operativamente ligadas em orientação 5-3' a um pro- motor ativo no organismo, vetores podem, geralmente, ser construídos, os quais, após transferência para as células do organismo, permitem a super- expressão da seqüência de codificação ou causam a supressão ou competi- ção e bloqueio de seqüências endógenas de ácido nucleico e as proteínas expressadas a partir das mesmas, respectivamente.

A atividade de uma enzima particular também pode ser reduzida por superexpressão de um mutante não-funcional da mesma no organismo. Assim, um mutante não-funcional não é capaz de catalisar a reação em questão, mas é capaz de ligar-se, por exemplo, o substrato ou cofator, pode, por meio da superexpressão competir com a enzima endógena e assim inibir a reação. Além disso, os métodos destinados a reduzir a quantidade e/ou a atividade de uma enzima em uma célula hospedeira são bem conhecidos do versado.

Vetores e Células hospedeiras

Outro aspecto da invenção pertence a vetores, preferivelmente vetores de expressão, contendo uma seqüência nucleotídica de acordo com a invenção (ou porções da mesma) ou combinações da mesma. Como usa- do, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado.

Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a um laço de DNA de fita dupla circular dentro dos quais os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral.

Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira dentro da qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamí- feros epissomais). Outros vetores são integrados dentro do genoma de uma * célula hospedeira quando da introdução dentro da célula hospedeira, e as- sim são replicados ao longo do genoma hospedeiro. Além disso, alguns ve- tores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais eles são opera- tivamente ligados.

5 Estes vetores são referidos aqui como "vetores de expressão".

Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão com frequência na forma de plasmídeos. No pre- sente relatório, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados de modo interper- mutável como o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem

compreender um ácido nucleico de acordo com a presente invenção e/ou codificando para as enzimas de grupo I em uma forma apropriada para ex- pressão do ácido nucleico respectivo em uma célula hospedeira, o que signi- fica que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais se- 15 quências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que são operativamente ligadas à seqüência de ácido nucleico a ser expressada.

Dentro de um vetor de expressão recombinante, "ligado operati- vamente" se destina a significar que a seqüência nucleotídica de interesse é 20 ligada à(s) sequência(s) regulatória(s) em um modo que permite a expressão de uma seqüência nucleotídica (por exemplo, em um sistema de transcri- ção/tradução in vivo, ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introdu- zido dentro da célula hospedeira). O termo "seqüência regulatória" se desti- na a incluir promotores, sítios de ligação de repressor, sítios de ligação de 25 ativador, melhoradores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, terminadores, sinais de poliadenilação ou outros elementos da es- trutura secundária de mRNA). Estas seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzy- mology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). As seqüências regula- 30 tórias incluem as que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência nucleotídica em muitos tipos de célula hospedeira e as que dirigem a ex- pressão de uma seqüência nucleotídica somente em algumas células hos- pedeiras. As seqüências regulatórias preferidas são, por exemplo, promoto- res como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, Ipp-, lac-, Ipp lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny,SP02, e-Pp- ore PL, que são usados preferivel- mente em bactérias. As seqüências regulatórias adicionais são, por exem- 5 pio, promotores de leveduras e fungos, como ADC1,MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promotores de plantas como CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos ou promotores de ubiquitina ou faseolina. Também é possível usar promotores artificiais. Será notado por um versado na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores 10 com a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expres- são de proteína desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos dentro de células hospedeiras para assim produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por á- cidos nucleicos de acordo com a invenção.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser

projetados para expressão dos polipeptídeos de acordo com a invenção em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os genes para as enzi- mas de grupo I podem ser expressados em células bacterianas como C. glu- tamicum e E. coli, células de insetos (usando vetores de expressão de bacu- 20 lovírus), células de leveduras e outros fungos (ver Romanos, Μ. A. et al. (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C. A. M.J. J. et al.(1991) em: Mo- re Gene Manipulations in Fungi, J. W.Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396- 428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J.(1991) em: Applied MoIecuIarGenetics of Fungi, Peberdy, J. F. etal., eds., 25 p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), células de plantas multice- Iulares e algas (ver Schmidt, R. e Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep:. 583-586). As células hospedeiras apropriadas são discutidas também em Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Aca- demic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão 30 recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, usando seqüências regulatórias de promotor T7 e polimerase T7.

Expressão de proteínas em procariotas é com maior frequência ‘ realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou indutiveis diri-

gindo a expressão de proteínas de fusão ou não de fusão.

Os vetores de fusão adicionam vários aminoácidos a uma prote- ína codificada nos mesmos, geralmente no término amino da proteína re- 5 combinante mas também para o término C ou fundidos dentro das regiões apropriadas nas proteínas. Estes vetores de fusão tipicamente servem a três fins:: 1) aumentar a expressão de proteína recombinante; 2) aumentar a so- Iubilidade da proteína recombinante; e 3) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando como um Iigante em purificação por afinidade. Com 10 frequência, em vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolí- tica é introduzido na junção da porção de fusão e da proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante a partir da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Estas enzimas, e su- as seqüências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e 15 enteroquinase.

Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Phar- macia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fundem glutationa S-transferase (GST), proteína E de ligação de ' 20 maltose, ou proteína A, respectivamente.

Exemplos de vetores de expressão de E. coli não-fusão indutí- veis apropriados incluem pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315), pLG338, pACYC184, pBR322,pUC18, pUC19, pKC30, pRep4,pHSI, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,plN-lll113-BI, egtll, pBdCI, e pET Ild 25 (Studier etal., Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89; e Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vetores. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018). A expres- são de gene-alvo do vetor thepTrc se baseia em transcrição de RNA polime- rase hospedeiro de um promotor de fusão trp-lac híbrido. A expressão de 30 gene-alvo a partir do vetor pET Ild se baseia na transcrição de um promotor de fusãoT7 gnlO-lac mediada por uma RNA polimerase viral coexpressada (T7gnl). Esta polimerase viral é fornecida por cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) a partir de um profago X residente abrigando um gene T7gnl sob o controle transcripcional do promotor IacUV 5. Para transforma- ção de outras variedades de bactérias, vetores apropriados podem ser sele- cionados. Por exemplo, os plasmídeos plJ101, plJ364, plJ702 e plJ361 são 5 conhecidos como sendo utilizáveis na transformação de Streptomyces, en- quanto os plasmídeos pUB110, pC194, ou pBD214 são apropriados para a transformação de espécies de Bacillus. Vários plasmídeos de uso na transfe- rência de informação genética em Corynebacterium incluem pHM1519,pBLI, pSA77, ou pAJ667 (Pouwels etal., eds. (1985) Cloning Vetors. Elsevier: New 10 York IBSN 0 444 904018).

Uma estratégia para maximizar a expressão de proteína recom- binante consiste em expressar a proteína em bactérias hospedeiras com uma capacidade prejudicada de clivar proteoliticamente a proteína recombi- nante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymo- 15 Iogy 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119-128). Outra es- tratégia consiste em alterar a seqüência de ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserido dentro de um vetor de expressão de modo que os códons indi- viduais para cada aminoácido sejam os preferivelmente usados na bactéria escolhida para a expressão, como C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucle- 20 ic Acids Res. 20: 2111-2118). Esta alteração de seqüências de ácido nuclei- co da invenção pode ser realizada por técnicas de síntese de DNA padrão.

Exemplos de vetores shuttle de C. glutamicum e E coli podem ser encontrados em Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93-8).

Em outra modalidade, o vetor de expressão de proteína vetor é 25 um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão em levedura S. cerevisiae incluem pYepSecI (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234),, 2i, pAG-1, Yep6, Yepl3, pEMBLYe23, pMFa(Kurjan e Hersko- witz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz etal., (1987) Gene 54: 113- 123), e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vetores e métodos 30 para a construção de vetores apropriados para uso em outros fungos, como os fungos filamentosos, incluem os detalhados em : van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt,P. J. (1991) em: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. ‘ Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, e Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors Elsevier: New York (IBSN O 444 904018).

Para os fins da presente invenção, uma ligação operativa é en- 5 tendida como sendo uma disposição seqüencial de promotor, seqüência de codificação, terminador, e, opcionalmente, outros elementos regulatórios de tal modo que cada um dos elementos regulatórios pode preencher sua fun- ção, de acordo com sua determinação, quando expressando a seqüência de codificação.

10 Para outros sistemas de expressão apropriados para tanto para

células procarióticas como eucarióticas, ver os capítulos 16 e 17 de Sam- brook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har- bor, NY, 2003.

15 Outro aspecto da invenção pertence a organismos ou células

hospedeiras dentro das quais um vetor de expressão recombinante da in- venção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados de modo interpermutável aqui. Deve-se entender que estes termos referem-se tão somente a uma célula em questão particu-

20 lar, mas também à progênie ou progênie em potencial desta célula. Porque algumas modificações podem ocorrer nas gerações sucessivas, devido às suas influências de mutação ou ambientais, esta progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula parental, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo como usado aqui.

25 DNA vetor pode ser introduzido dentro de células procarióticas

ou eucarióticas via técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Como usado aqui, os termos "transformação" e "transfecção", "conjugação" e "transdução" se destinam a fazer referência a várias técnicas reconhecidas na arte para a introdução do ácido nucleico estrangeiro (por exemplo, DNA

30 ou RNA linear (por exemplo, um vetor Iinearizado ou uma construção de ge- ne sozinha sem um vetor) ou ácido nucleico na forma de um vetor (por e- xemplo, plasmídeo, fago, fasmídeo, fagemídeo, transposon ou outro DNA) dentro de uma célula hospedeira, incluindo coprecipitação de fosfato de cál- cio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, , Iipofe- ção, competência natural, transferência mediada por produto químico ou ele- troporação. Os métodos apropriados para a transformação ou transfecção 5 de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, et al. (Mole- cular Cloning : A Laboratory Manual. 3a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003), e ou- tros manuais de laboratório.

A fim de identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido dentro das células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem os que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina e metotrexato. Ácido nuclei- co codificando um marcador selecionável pode ser introduzido dentro de uma célula hospedeira no mesmo vetor como o codificando polipeptídeos da presente invenção ou pode ser introduzido em um vetor separado. As célu- las estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármacos (por exemplo, células que foram in- corporadas no marcador selecionável irão sobreviver, enquanto as outras células morrem).

Em outra modalidade, micro-organismos recombinantes podem ser produzidos que contêm sistemas selecionados que permitem a expres- são regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão de uma seqüência nucleotídica da presente invenção sobre um vetor colocando o mesmo sob o 25 controle do Iac operon permite a expressão do gene somente na presença de IPTG. Estes sistemas regulatórios são bem conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, o método compreende cultivar os organis- mos da invenção (em que um vetor de expressão recombinante codificando, por exemplo, um polipeptídeo da presente invenção foi introduzido, ou den- 30 tro deste genoma foi introduzido um gene codificando uma enzima de tipo selvagem ou alterada) em um meio apropriado para a produção de metioni- na. Em outra modalidade, o método além disso compreende isolar metionina ‘ do meio ou da célula hospedeira.

Crescimento de meios de cultura de Escherichia coli e Coryne- bacterium glutamicum e condições de cultura

O versado na técnica conhece o cultivo de micro-organismos 5 comuns, como C.glutamicum e E.coli. Assim, um ensinamento geral será dado abaixo com relação ao cultivo de C.glutamicum. Uma informação cor- respondente pode ser recuperada de livros de texto padrão para o cultivo de E. coli.

As cepas de E. coli são cultivadas como rotina em caldo MB e LB, respectivamente (Follettie, M. T., Peoples, 0., Agoropoulou, C., e Sins- key, A J. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103). Meio mínimo para E. coli é M9 e MCGC modificado (Yoshihama, M., Higashiro, K., Rao, E. A., Akedo, M., Shanabruch, W G., Follettie, M. T., Walker, G. C., e Sinskey, A. J. (1985) J. Bacteriol. 162,591-507), respectivamente. Glicose pode ser adicionada a uma concentração final de 1%. Antibióticos podem ser adicionados nas se- guintes quantidades (microgramas por mililitro): ampicilina, 50; canamicina, 25; ácido nalidixico, 25; aminoácidos, vitaminas, e outros suplementos po- dem ser adicionados nas seguintes quantidades: metionina, 9,3 mM; argini- na, 9,3 mM; histidina, 9,3 mM; tiamina, 0,05 mM. As células de E. coli são ■ 20 cultivadas em rotina a 37 C, respectivamente.

Corynebacteria geneticamente modificada é tipicamente cultiva- da em meio de crescimento sintético ou natural. Vários meios de crescimen- to diferentes para Corynebacteria são tanto bem conhecidos como pronta- mente disponíveis (Lieb et al. (1989) AppI.Microbiol. Biotechnol., 32: 205- 25 210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patente DE 4.120.867; Liebl(1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryo- tes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag).

Estes meios consistem em uma ou mais fontes de carbono, fon- tes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e elementos de traço. As fontes 30 de carbono preferidas são açúcares, como mono-, di-, ou polissacarídeos. Por exemplo, glicose, frutose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribose, lactose, maltose, sacarose, rafinose, amido ou celulose servem como fontes de carbono excelentes. Também é possível fornecer açúcar ao meio via compostos complexos como melaços e outros subprodutos de refino de açúcar. Tam- bém pode ser vantajoso fornecer misturas de diferentes fontes de carbono. Outras fontes de carbono possíveis são álcoois e ácidos orgânicos, como metanol, etanol, ácido acético ou ácido láctico. As fontes de nitrogênio são geralmente de compostos de nitrogênio orgânicos ou inorgânicos, ou materi- ais contendo estes compostos. As fontes de nitrogênio exemplares incluem gás amônia ou sais de amônia, como NH4CI ou (NH4)2SO4, NH4OH, nitratos, ureia, aminoácidos ou fontes de nitrogênio complexas como licor de milho, farinha de soja, proteína de soja, extrato de levedura, extrato de carne e ou- tros.

A superprodução de metionina é possível usando fontes de en- xofre diferentes. Sulfatos, tiossulfatos, sulfitos e também fontes de enxofre mais reduzidas, como H2S e sulfetos e derivados, também podem ser usa- das. Também as fontes de enxofre orgânico como mercaptano, tioglicolatos, tiocianatos, e tioureia, aminoácidos contendo enxofre, como cisteína e outros compostos contendo enxofre podem ser usados para alcançar uma produ- ção eficiente de metionina. Formato também pode ser possível como um suplemento, como o são outras fontes de C1 como metanol ou formaldeído. São particularmente apropriados metanotiol e seu dímero dimetildissulfeto.

Os compostos de sal inorgânicos que podem ser incluídos no meio incluem os sais de cloreto, fosforoso- ou sulfato, de cálcio, magnésio, sódio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro. Os compostos quelantes podem ser adicionados ao meio para manter os íons metal em solução. Os compostos quelantes particularmente utilizáveis inclu- em os di-hidroxifenois, como catecol ou protocatecuato ou ácidos orgânicos, como ácido cítrico. É típico para o meio também conter outros fatores de crescimento, como vitaminas ou promotores de crescimento, cujos exemplos incluem biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotena- to e piridoxina. Os fatores de crescimento e sais com frequência se originam de componentes de meio complexo, como extrato de levedura, melaços, Ii- 1 cor de milho e outros. A composição exata dos compostos de meio depende fortemente do experimento imediato e é individualmente decidida para cada caso específico. Informação sobre a otimização do meio é disponível no livro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Eds. P. M.

5 Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN O 19 963577 3). Também é possível selecionar meios de crescimento a partir de fornecedo- res comerciais, como padrão 1 (Merck) ou BHI (infusão de núcleo de grão, DIFCO) ou outros.

Todos os componentes do meio devem ser esterilizados, ou por 10 calor (20 min a 0,1 MPa (1,5 bars) e 1210C) ou por filtração estéril. Os com- ponentes podem ser ou esterilizados juntos ou, se necessário, separada- mente.

Todos os componentes do meio podem estar presentes no co- meço do crescimento, ou eles podem ser opcionalmente adicionados conti- nuamente ou em batelada. As condições de cultura são definidas separada- mente para cada experiência.

A temperatura deve estar em uma faixa entre 15°C e 45°C. A temperatura pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o ex- perimento. O pH do meio pode estar na faixa de 5 a 8,5, preferivelmente em 20 torno de 7,0 e pode ser mantido por adição de tampões ao meio. Um tampão exemplar para este fim é tampão de fosfato de potássio. Os tampões sintéti- cos como MOPS, HEPES, ACES e outros podem ser alternativamente ou simultaneamente usados. Também é possível manter um pH da cultura constante através da adição de NaOH ou NH4OH durante o crescimento. Se 25 os componentes do meio completo, como extrato de levedura forem usados, a necessidade de tampões adicionais pode ser reduzida, devido ao fato de que muitos compostos completos têm elevadas capacidades de tampão. Se um fermentador for usado para cultivar os micro-organismos, o pH também pode ser controlado usando amônia gasosa.

O tempo de incubação está geralmente em uma faixa de várias

horas a vários dias. Este tempo é selecionado a fim de permitir que uma quantidade máxima de produto se acumule no caldo. As experiências de crescimento descritas podem ser realizadas em vários vasos, como placas de microtitulação, tubos de vidro, frascos de vidro ou fermentadores de vidro ou metal de tamanhos diferentes. Para a triagem de um grande número de clones, os micro-organismos devem ser cultivados em placas de microtitula- 5 ção, tubos de vidro, ou frascos de agitação, com ou sem anteparos. Preferi- velmente, são usados frascos de agitação de 100 ml, cheios com 10% (em volume) do meio de crescimento requerido. Os frascos devem ser agitados em um agitador giratório (amplitude 25 mm) usando uma faixa de velocidade de 100-300' rpm. As perdas por evaporação podem ser diminuídas pela ma- 10 nutenção de uma atmosfera úmida; alternativamente, uma correção mate- mática para perdas de evaporação deve ser realizada.

Se clones geneticamente modificados forem testados, um clone de controle não-modificado ou um clone de controle contendo o plasmídeo básico, sem qualquer inserto, também deve ser testado. O meio é inoculado 15 em um OD6OO de 0,5-1,5 usando células cultivadas em placas ágar, como placas CM (1 Og/I de glicose, 2,5g/l de NaCI, 2g/l de ureia, 10g/I de polipepto- na, 5g/l de extrato de levedura, 5g/l de extrato de carne, 22g/l de NaCI, 2g/l de ureia, 10g/I de polipeptona, 5g/l de extrato de levedura, 5g/l de extrato de carne, 22g/l de ágar, pH 6,8 com NaOH a 2M) que tinha sido incubada a 20 30°C.

A inoculação do meio é obtida ou por introdução de uma sus- pensão salina de células de C. glutamicum de placas CM ou adição de uma pré-cultura líquida desta bactéria.

As condições de meio e cultura acima também podem ser apli- cadas para outros organismos como S. coei e T. maritima. Listagem de Seqüência

<110> BASF AG

<120> Metionina sintases com inibição reduzida de produto

<130> B 8484/MH

<14 0> PCT/EP2007/064471

<141> 21-12-2007

<150> EP 06 127 363.7

<151> 29-12-2006

<160> 32

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 1221

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<22 0>

<221> misc_aspecto

<223> metionina sintase MetH

<4 00> 1

Met Ser Thr Ser Val Thr Ser Pro Ala His Asn Asn Ala His Ser Ser

1 5 10 15

Glu Phe Leu Asp Ala Leu Ala Asn His Val Leu Ile Gly Asp Gly Ala 20 25 30

Met Gly Thr Gln Leu Gln Gly Phe Asp Leu Asp Val Glu Lys Asp Phe 35 40 45

Leu Asp Leu Glu Gly Cys Asn Glu He Leu Asn Asp Thr Arg Pro Asp 50 55 60

Val Leu Arg Gln Ile His Arg Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Leu 65 70 75 80

Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr 85 90 95

Asp Ile Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val 100 105 110 Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg 115 120 125

Arg Phe Val Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu 130 135 140

Gly His Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala 145 150 155 160

Leu Gly Ile Ile Asp Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr Ala 165 170 175

Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala 180 185 190

Met Ala Glu Leu Asp Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val 195 200 205

Glu Thr Thr Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu 210 215 220

Thr Ala Leu Gln Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala 225 230 235 240

Thr Gly Pro Asp Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Lys His 245 250 255

Ala Asp Ile Pro Val Ser Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu 260 265 270

Gly Lys Asn Gly Ala Glu Tyr Pro Leu Glu Ala Glu Asp Leu Ala Gln 275 280 285

Ala Leu Ala Gly Phe Val Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Met Val Gly Gly 290 295 300

Cys Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Asp Ala Val 305 310 315 320

Val Gly Val Pro Glu Gln Glu Thr Ser Thr Leu Thr Lys Ile Pro Ala 325 330 335

Gly Pro Val Glu Gln Ala Ser Arg Glu Val Glu Lys Glu Asp Ser Val 340 345 350

Ala Ser Leu Tyr Thr Ser Val Pro Leu Ser Gln Glu Thr Gly He Ser 355 360 365 Met Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ser Asn Gly Ser Lys Ala Phe Arg Glu 370 375 380

Ala Met Leu Ser Gly Asp Trp Glu Lys Cys Val Asp Ile Ala Lys Gln 385 390 395 400

Gln Thr Arg Asp Gly Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val

405 410 415

Gly Arg Asp Gly Thr Ala Asp Met Ala Thr Leu Ala Ala Leu Leu Ala 420 425 430

Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ile Met Ile Asp Ser Thr Glu Pro Glu Val 435 440 445

Ile Arg Thr Gly Leu Glu His Leu Gly Gly Arg Ser Ile Val Asn Ser 450 455 460

Val Asn Phe Glu Asp Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480

Met Lys Leu Val Lys Gln His Gly Ala Ala Val Val Ala Leu Thr Ile

485 490 495

Asp Glu Glu Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu His Lys Val Arg Ile Ala 500 505 510

Lys Arg Leu Ile Asp Asp Ile Thr Gly Ser Tyr Gly Leu Asp He Lys 515 520 525

Asp Ile Val Val Asp Cys Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr Gly Gln Glu 530 535 540

Glu Thr Arg Arg Asp Gly Ile Glu Thr Ile Glu Ala Ile Arg Glu Leu 545 550 555 560

Lys Lys Leu Tyr Pro Glu Ile His Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile

565 570 575

Ser Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Gln Val Leu Asn Ser Val Phe 580 585 590

Leu Asn Glu Cys Ile Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Ala His Ser 595 600 605

Ser Lys Ile Leu Pro Met Asn Arg Ile Asp Asp Arg Gln Arg Glu Val 610 615 620 Ala Leu Asp Met Val Tyr Asp Arg Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Pro Leu 625 630 635 640

Gln Glu Phe Met Gln Leu Phe Glu Gly Val Ser Ala Ala Asp Ala Lys 645 650 655

Asp Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Met Pro Leu Phe Glu Arg Leu 660 665 670

Ala Gln Arg Ile Ile Asp Gly Asp Lys Asn Gly Leu Glu Asp Asp Leu 675 680 685

Glu Ala Gly Met Lys Glu Lys Ser Pro Ile Ala Ile Ile Asn Glu Asp 690 695 700

Leu Leu Asn Gly Met Lys Thr Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln 705 710 715 720

Met Gln Leu Pro Phe Val Leu Gln Ser Ala Glu Thr Met Lys Thr Ala 725 730 735

Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Met Glu Glu Glu Ala Glu Ala Thr Gly 740 745 750

Ser Ala Gln Ala Glu Gly Lys Gly Lys Ile Val Val Ala Thr Val Lys 755 760 765

Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser 770 775 780

Asn Asn Gly Tyr Asp Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Gln Pro Leu Ser 785 790 795 800

Ala Met Leu Glu Ala Ala Glu Glu His Lys Ala Asp Val Ile Gly Met 805 810 815

Ser Gly Leu Leu Val Lys Ser Thr Val Val Met Lys Glu Asn Leu Glu 820 825 830

Glu Met Asn Asn Ala Gly Ala Ser Asn Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly 835 840 845

Ala Ala Leu Thr Arg Thr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Asn Glu Val Tyr 850 855 860

Thr Gly Glu Val Tyr Tyr Ala Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu 865 870 875 Met Asp Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Gly Glu Gly Leu Asp Pro Asn 885 890 895

Ser Pro Glu Ala Ile Glu Gln Ala Lys Lys Lys Ala Glu Arg Lys Ala 900 905 910

Arg Asn Glu Arg Ser Arg Lys Ile Ala Ala Glu Arg Lys Ala Asn Ala 915 920 925

Ala Pro Val Ile Val Pro Glu Arg Ser Asp Val Ser Thr Asp Thr Pro 930 935 940

Thr Ala Ala Pro Pro Phe Trp Gly Thr Arg Ile Val Lys Gly Leu Pro 945 950 955 960

Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asn Leu Asp Glu Arg Ala Leu Phe Met Gly 965 970 975

Gln Trp Gly Leu Lys Ser Thr Arg Gly Asn Glu Gly Pro Ser Tyr Glu 980 985 990

Asp Leu Val Glu Thr Glu Gly Arg Pro Arg Leu Arg Tyr Trp Leu Asp 995 1000 1005

Arg Leu Lys Ser Glu Gly Ile Leu Asp His Val Ala Leu Val Tyr 1010 1015 1020

Gly Tyr Phe Pro Ala Val Ala Glu Gly Asp Asp Val Val Ile Leu 1025 1030 1035

Glu Ser Pro Asp Pro His Ala Ala Glu Arg Met Arg Phe Ser Phe 1040 1045 1050

Pro Arg Gln Gln Arg Gly Arg Phe Leu Cys Ile Ala Asp Phe Ile 1055 1060 1065

Arg Pro Arg Glu Gln Ala Val Lys Asp Gly Gln Val Asp Val Met 1070 1075 1080

Pro Phe Gln Leu Val Thr Met Gly Asn Pro Ile Ala Asp Phe Ala 1085 1090 1095

Asn Glu Leu Phe Ala Ala Asn Glu Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Val

1100 1105 1110

His Gly Ile Gly Val Gln Leu Thr Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp 1115 1120 1125 His Ser Arg Val Arg Ser Glu Leu Lys Leu Asn Asp Gly Gly Ser

1130 1135 1140

Val Ala Asp Phe Asp Pro Glu Asp Lys Thr Lys Phe Phe Asp Leu

1145 1150 1155

Asp Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Phe Gly Tyr Gly Ser Cys Pro

1160 1165 1170

Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys Leu Val Glu Leu Leu Glu Pro Gly

1175 1180 1185

Arg Ile Gly Val Glu Leu Ser Glu Glu Leu Gln Leu His Pro Glu

1190 1195 1200

Gln Ser Thr Asp Ala Phe Val Leu Tyr His Pro Glu Ala Lys Tyr

1205 1210 1215

Phe Asn Val 1220

<210> 2 <211> 245 <212> PRT <213> Corynebacter <220> <221> DOMÍNIO <222> (1) . • (245) <223> Dominio de I: <4 00> 2 Met Ser Thr Ser Val 1 5 Glu Phe Leu Asp Ala 20 Met Gly Thr Gln Leu 35 Leu Asp Leu Glu Gly 50 Val Leu Arg Gln Ile 15

25 30

40 45

55 60 65 70 75 80

Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tvr 85 90 95

Asp Ile Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val

100 105 110

Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg 115 120 125

Arg Phe Val Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu 130 135 140

Gly His Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala 145 150 155 160

Leu Gly Ile Ile Asp Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr Ala 165 170 175

Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala 180 185 190

Met Ala Glu Leu Asp Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val 195 200 205

Glu Thr Thr Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu 210 215 220

Thr Ala Leu Gln Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala 225 230 235 240

Thr Gly Pro Asp Glu 245

<210> 3

<2ΐι> H

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase

<220>

<221> FONTE <222> (1) . . (11) I 76

<223> /Nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (1)..(1)

5 <223> /substituir="Val" /substituir="Arg"

<220>

<221> variante

<222> (2)..(2)

<223> /substituir="Glu" /substituir="Arg"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Aia" /substituir="Gln"

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Val"

<220>

<221> variante

<222> (5) .. (5)

<223> /substituir="Arg" /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (6)..(6)

<223> /substituir="Glu" /substituir="Ala" /substituir="Lys"

<220>

<221> variante

<222> (7) .. (7)

<223> /substituir="Gln" /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (9)..(9) <223> /substituir="Asn" /substituir="Ser"

<22 0>

<221> variante

<222> (10)..(10)

<223> /substituir="Thr" /substituir="Glu"

<220>

<221> variante

<222> (11) . . (11)

<223> /substituir="Arg"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) . . (7) , (9) . . (11)

<223> /nota="resíduos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para as referidas posições'"

<4 00> 3

Ser Ser Glu Phe Leu Asp Ala Leu Ala Asn His

10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

<221> FONTE

<222> (1)..(15)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<22 0>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Ile"

<22 0> <221> variante

<222> (2) . . (2)

<223> /substituir="Leu"

<220>

5 <221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Val" /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Ala" /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (7)..(7)

<223> /substituir="Gly"

<220>

<221> variante

<222> (8) . . (8)

<223> /substituir="Tyr"

<220>

<221> variante

<222> (11) . . (11)

<223> / substituir="Met" /subst:ituir="Glu"

<220>

<221> variante

<222> (12) . . (12)

<223> /substituir="Ile" /substituir="Phe"

<220>

<221> variante

<222> (13)..(13)

<223> /substituir="Met"

<220> <221> variante <222> (14) . . (14)

<223> /substituir="Ala" /substituir="Ser" /substituir="Lys"

<220>

<221> variante <222> (15) . . (15)

<223> /substituir="Gln" /substituir="Tyr"

<220>

<221> MISC_AS PECTO <222> (1) . . (4), (7) . . (8), (11) . . (15)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 4

Val Val Ile Gly Asp Gly Ala Met Gly Thr Gln Leu Gln Gly Phe

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

<221> FONTE

<222> (1)..(15)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Pro" /substituir="Tyr"

<220>

<221> variante

<222> (2) . . (2) <223> /substituir="Thr" /substituir="Asn"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Asp" /substituir="Glu

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Asp" /substituir="Ala" /substituir="Leu

<220>

<221> variante

<222> (5)..(5)

<223> /substituir="Asp" /substituir="Pro"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (6)..(6)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. marítima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (7) . . (7)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (8) . . (8)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (9) . . (9)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<22 0>

<221> MISC_ASPECTO <222> (10)..(10)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<220>

<221> MISC_ASPECTO <222> (11) . . (11)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<220>

<221> MISC_ASPECTO <222> (12) . . (12)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<220>

<221> MISC_ASPECT0 <222> (13) . . (13)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<22 0>

<221> variante <222> (14) . . (14)

<223> /substituir="Trp"

<220>

<221> MISC_ASPECTO <222> (14) . . (14)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição no microorganismo T.

maritima"

<220>

<221> variante <222> (15) . . (15)

<223> /substituir="Pro"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (15)..(15)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição no microorganismo T. maritima"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) . . (15)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tern preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 5

Leu Asp Val Glu Lys Phe Arg Gly Glu Arg Phe Ala Asp Asp Phe

1 5 10 15

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

<221> FONTE

<222> (1) . . (17)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (2)..(2)

<223> /substituir="Val"

<220>

<221> variante <222> (3)..(3)

<223> /substituir="Leu" /substituir="IIe"

<220>

<221> variante

<222> (4)..(4)

<223> /substituir="Ser" /substituir="Lys"

<220>

<221> variante <222> (5) . . (5)

<223> /substituir="Lys" /substituir="Ala"

<22 0>

<221> variante <222> (7) . . (7)

<223> /substituir="Glu"

<22 0>

<221> variante

<222> (8) . . (8)

<223> /substituir="Iie"

<220>

<221> variante

<222> (9)..(9)

<223> /substituir="Val" /substituir=”Ile"

<220>

<221> variante

<222> (10) . . (10)

<223> /substituir="Ala" /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (11)..(11)

<223> /substituir="Ser" /substituir="Ala" /substituir="Lys"

<22 0>

<221> variante <222> (12) . . (12)

<223> /substituir="Val"

<220>

<221> variante

<222> (14)..(14)

<223> /substituir="Glu" /substituir="Asn"

<220>

<221> variante

<222> (15)..(15)

<223> /substituir="Glu" /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (17)..(17)

<223> /substituir="Ile"

<220>

<221> MISC_AS PECTO

<222> (2) . . (5) , (7) . . (12) , (14) .. (15) , (17)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 6

Leu Asn Asp Thr Arg Pro Asp Val Leu Arg Gln Ile His Arg Ala Tyr 15 10 15

Phe

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase

<220>

<221> FONTE

<222> (1) . . (15) /substituir="Ser'

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase" <2 2 0>

<221> variante <222> (1)..(1)

<223> /substituir="Ala"

<22 0>

<221> variante <222> (2) . . (2)

<223> /substituir="Ser"

<220>

<221> variante <222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Val"

<220>

<221> variante

<222> (6) . . (6)

<223> /substituir="Cys"

<220>

<221> variante

<222> (7) . . (7)

<223> /substituir="Ile"

<22 0>

<221> variante

<222> (8) . . (8)

<223> /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (13)..(13)

<223> /substituir="Asn"

<220>

<221> variante

<222> (14) . . (14)

/substituir="Ile"

/substituir="Vai" 10

15

20

25

30

<223> /substituir="Ala" /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (15)..(15)

<223> /substituir="Thr"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) . . (2), (4) , (6) . . (8) , (13) . . (15)

<223> /nota="resíduos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<400> 7

Glu Ala Gly Ala Asp Leu Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Cys Asn

10 15

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

<221> FONTE

<222> (1) . . (9)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<22 0>

<221> variante

<222> (1)..(1)

<223> /substituir="His" <220>

<221> variante

<222> (2)..(2)

<223> /substituir="Ser" <22 0>

/substituir="Thr'

/substi tuir=”Arg"

/subStituir="Ile"

/substituir="Met' <221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Ala" /substituir="Lys"

<220>

<22i> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Met"

<220>

<221> variante

<222> (5) . . (5)

<223> /substituir="Gly" /substituir="Arg"

<220>

<221> variante

<222> (6) . . (6)

<223> /substituir="Glu” /substituir="Lys"

<220>

<221> variante

<222> (7) . . (7)

<223> /substituir="His"

<220>

<221> variante

<222> (8) . . (8)

<223> /substituir="Gln" /substituir="Gly"

<220>

<221> variante

<222> (9) . . (9)

<223> /substituir="Met" /substituir="Leu"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1)..(9)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições" <400> 8

Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr Asp Ile I 5

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial <22 0>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

<221> FONTE

<222> (1) . . (22)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Pro" /substituir="Glu"

<220>

<221> variante

<222> (2)..(2)

<223> /substituir="Glu" /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Lys"

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Val" /substituir="Ser" /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (5)..(5) 10

15

20

25

30

<223> <220> <2 21> <222> <223> <220> <221> <222> <22 3> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <22 3> <220> <221 > <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222>

/substituir="His"

variante (6) . . (6)

/substituir="Pro"

variante

(7) . . (7)

/substituir="Ile"

variante

(8) . . (8)

/substituir="Ser"

variante

(9) . . (9)

/substituir="Glu"

va riante

(10)..(10) /substituir="Ala"

variante (11)..(11)

/substituir="Ala"

variante (12)..(12) /substituir="Ala"

variante (13)..(13)

/substituir="Ala"

/substituir=

/substituir="Asn"

/substituir=

/substituir="Phe1

/substituir=

/substituir="Asn'

/substituir="Vai'

"Asp"

Vai"

"Arg" <223> /substituir="Arg" /substituir="Lys"

<220>

<221> variante <222> (14)..(14)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Ile"

<22 0>

<221> variante <222> (17)..(17)

<223> /substituir="Ala" /substituir="Arg"

<220>

<221> variante <222> (18) . . (18)

<223> /substituir="Cys" /substituir="Ala"

<220>

<221> variante <222> (20) .. (20)

<223> /substituir="Glu"

<220>

<221> variante <222> (22)..(22)

<223> /substituir="Met" /substituir="Trp” /substituir="Lys'

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) . . (14) , (17) . . (18), (20), (22)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 9

Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val Ala Arg 15 10 15

Glu Val Ala Asp Glu Phe 20

<210> 10 <211> 8

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

<221> FONTE

<222> (1) . . (8)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase" <220>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Ala" /substituir="Arg"

<220>

<221> variante

<222> (2) . . (2)

<223> /substituir="Thr"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Asp” /substituir="Pro"

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Glu"

<220>

<221> variante

<222> (5) . . (5)

<223> /substituir="Arg" /substituir="Lys"

<220>

<221> variante

<222> (6) . . (6) <2 2 3> /substituir="Gin” /substituir="Pro" <2 2 0> <221> variante <222> (8) . . (8) <223> /substituir="Trp" /substituir="Tyr" <220> <221> MISC ASPECTO <222> (1)..(8) <223> /nota="sem aminoácido nesta posição no microorganismo T. <220> maritima" <221> MISC ASPECTO <222> (1) . . (6) , (8) <223> /nota="resíduos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições" <4 00> 10 Gly Arg Asn Gly Met Arg Arg Phe 1 5 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> motivo de seqüência de metionina sintase <220> <221> FONTE <222> (1) .. (13) <223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase" <220> <221> variante <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Leu" /substituir="Ala" /substituir 10

15

20

25

30

<220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> < 2 2 0 > <221> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223>

variante

(4) . . (4)

/substituir="Val"

variante

(5) . . (5)

/substituir="Met"

variante (8) . . (8)

/substituir="Thr"

variante

(9) . . (9)

/substituir="Asn"

variante

(10)..(10) /substituir="Arg"

variante (11) . . (11)

/substituir="Thr"

variante (12)..(12)

/substituir="Ala"

variante (13)..(13)

/substituir="Thr"

/substituir="Asp"

/substituir="Ile'

/substítuir="Gly"

/substituir="Glu"

/substituir="Tyr" 10

15

20

25

30

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (2), (4) . . (5), (8) . . (13)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<400> 11 Val Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> motivo de seqüência de metionina sintase <220> <221> FONTE <222> (1) . . (20) <223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase" <220> <221> variante <222> (1) · · (1) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> variante <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Asp" /substituir="Glu" <220> <221> variante <222> (3) . . (3) <223> /substituir="Vai" /substituir="Gly" /substituir: <220> <221> variante ·■ rz 1 " 10

15

20

25

30

<222> <223> <2 2 0> <221> <222> <223> <220> <22 1> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <22 3> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>

(4).. (4)

/substituir="Phe”

variante

(5) . . (5)

/substituir="Vai"

variante

(6) . . (6)

/substituir="Asp"

variante

(7) . . (7)

/substituir="Ala"

variante

(8) . . (8)

/substituir="Glu”

variante

(9) .. (9)

/substituir="Gln"

variante

(10)..(10) /substituir="Arg"

variante

(11) . . (H)

/substituir="Asn"

variante

/substituir="Tyrr

/substituir="Alar

/substituir=

/subs ti tuir=" Asn'1

/substituir="Arg'

/substituir="Ser"

/substituir=

"Glu"

"Thr " * <222> <223> <220> <221> <222>

<223> <220> <221> <222> 10 <223> <220> <221> <222> <223>

<220> <221> <222> <223> <220> 20 <221> <222> <22 3> <220> <221> 25 <222>

<223> <220> <221> <222> 30 <223> <220> <221>

(12)..(12)

/substituir="Thr"

variante

(13) . . (13) /substituir="Glu"

variante

(14) . . (14)

/substituir="Ala"

variante

(15)..(15)

/substituir="Leu"

variante

(16)..(16)

/substituir="Vai"

variante

(17) . . (17)

/substituir="Ala"

variante

(18) . . (18) /substituir="Glu"

variante (20) . . (20)

/substituir="Ala"

misc ASPECTO

/substituir="Val'

/substituir="Lys'

/substituir="Ile"

/substituir="Met"

/substituir="Vai" <222> (I) . . (18), (20)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 12

Phe Thr Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala Leu Gly Ile Ile 15 10 15

Glu Gly Gly Gly 20

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase

<220>

<221> FONTE

<222> (1) . . (7)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (2) .. (2)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Gly"

<22 0>

<221> variante

<222> (3)..(3)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Ile"

<220>

<221> variante

<222> (4) .. (4)

<223> /substituir="Ile"

<220>

<221> variante <222> (5) . . (5)

<223> /substituir="Val" /substituir="Phe"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (2) . . (5)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<400> 13

Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr

1 5

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <22 0>

<221> FONTE

<222> (1) . . (14)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Phe" /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Thr" /substituir="Ile"

<220>

<221> variante

<222> (5) . . (5)

<223> /substituir="Asn" /substituir="Glu" < 2 2 O >

<221> variante

<222> (6) . . (6)

<223> /substituir="Thr" /substituir="Ala" /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (9) . . (9)

<223> /substituir="Ser"

<22 0>

<221> variante

<222> (11) . . (11)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Phe"

<220>

<221> variante

<222> (12)..(12)

<223> /substituir="Ala"

<220>

<221> variante

<222> (13) . . (13)

<223> /substituir="Ala"

<220>

<221> variante

<222> (14) . . (14)

<223> /substituir="Arg" /substituir="Lys"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) , (3) , (5) . . (6), (9) , (11). . (14)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 14

Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln 15 10 1 <210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

5 <220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase

^ r\ v i- £- \j ^

<221> FONTE

<222> (1) . . (12)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Val"

<22 0>

<221> variante

<222> (2) . . (2)

<223> /substituir="Gly" /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Leu” /substituir="Val" /substituir="Arg"

<22 0>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Asp" /substituir="Glu"

<220>

<221> variante

<222> (5)..(5)

<223> /substituir="Val"

<220>

<221> variante <222> (6) . . (6)

<223> /substituir="Phe"

<220>

<221> variante

<222> (7) . . (7)

<223> /substituir="Leu"

<2?0>

<221> variante

<222> (8) .. (8)

<223> /substituir="Met"

<220>

<221> variante

<222> (9) .. (9)

<223> /substituir="Val" /substituir="Ue" /substituir="Ala"

<22 0>

<221> variante

<222> (10)..(10)

<223> /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (Il)--(Il)

<223> /substituir="Gly" /substituir="Met"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) . . (11)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 15

Leu Asp Thr Phe Leu Pro He He Cys His Val Thr

I 5 10

<210> 16 <211> 13 1 <212> PRT

<213> Artificial <22 0>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase

5 <22 0>

<221> FONTE

^ 2 2 2 > '!'..'13'

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<22 0>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Ile" /substituir="Phe"

<220>

<221> variante

<222> (2) . . (2)

<223> /substituir="Thr" /substituir="Asp"

<22 0>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Asp" /substituir="Glu"

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Ala" /substituir="Lys"

<220>

<221> variante

<222> (5)..(5)

<223> /substituir="Ser"

<22 0>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (6)..(6)

<223> /nota="sem aminoácido nesta posição nos microorganismos T. maritima, C. glutamicum, Str. coelicolor"

<22 0>

<221> variante

<222> (7) . . (7)

<223> /substituir="Arg"

<220>

<221> variante

<222> (6) . . (8)

<223> /substituir="Thr" /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (10) . . (10)

<223> /substituir="Leu" /substituir="Ser" /substituir="Thr"

<220>

<221> variante

<222> (12) . . (12)

<223> /substituir="Gln" /substituir="Thr"

<220>

<221> variante

<222> (13)..(13)

<223> /substituir="Thr" /substituir="Asp"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) . . (8), (10), (12) .. (13)

<223> /nota="residuos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 16

Val Glu Thr Thr Gly Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu

10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT 1 <213> Artificial

<220>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

5 <221> FONTE

<222> (1) . . (7)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase" <220>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="Glu" /substituir="Ala"

<220>

<221> variante

<222> (2) . . (2)

<223> /substituir="Asn"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

<223> /substituir="Phe"

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

<223> /substituir="Tyr" /substituir="Ala"

<220>

<221> variante

<222> (5) . . (5)

<223> /substituir="Asn'' /substituir="Ile"

<220>

<221> variante

<222> (6) . . (6)

<223> /substituir="Ser" /substituir="Thr"

<220> <221> variante

<222> (7) . . (7)

<223> /substituir="Phe"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (1) . . (7)

<223> /nota="resíduos dados na seqüência não tem preferência relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 17 Gly Ala Ala Leu Thr Ala Leu

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial <22 0>

<223> motivo de seqüência de metionina sintase <220>

<221> FONTE

<222> (1) . . (17)

<223> /nota="motivo de seqüência de metionina sintase"

<220>

<221> variante

<222> (1) . . (1)

<223> /substituir="His" /substituir="Glu"

<220>

<221> variante

<222> (2) . . (2)

<223> /substituir="Ala"

<220>

<221> variante

<222> (3) . . (3)

com <223> /substituir="Glu" /substituir="Asp"

<220>

<221> variante

<222> (4) . . (4)

5 <223> /substituir=''Ala"

<220>

<221> variante

<222> (5)..(5)

<223> /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (6) .. (6)

<223> /substituir="Thr" /substituir="Ala"

<220>

<221> variante

<222> (7)..(7)

<223> /substituir=”Phe" /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (9)..(9)

<223> /substituir="Ile"

<220>

<221> variante

<222> (12) . . (12)

<223> /substituir="Ser"

<220>

<221> variante

<222> (13) .. (13)

<223> /substituir="Leu"

<220>

<221> variante

<222> (16) . . (16) <223> /substituir="Ala" /substituir="Glu"

<220>

<221> MISC_ASPECTO

<222> (!) . . (7) , (9) , (12) . . (13), (16)

<223> /nota="resíduos dados na seqüência não tem preferência com relação aos nas anotações para referidas posições"

<4 00> 18

Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala Thr Gly Pro Asp

15

1 5 10 Glu <210> 19 <211> 1221 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MUTAGENE <222> (33)..(33) <223> metionina sintase MetH carregando mutação M33A <4 00> 19 Met Ser Thr Ser Val Thr Ser Pro Ala His Asn Asn Ala His 1 5 10 Glu Phe Leu Asp Ala Leu Ala Asn His Val Leu Ile Gly Asp 15

20 25 30

Ala Gly Thr Gln Leu Gln Gly Phe Asp Leu Asp Val Glu Lys Asp Phe 35 40 45

Leu Asp Leu Glu Gly Cys Asn Glu Ile Leu Asn Asp Thr Arg Pro Asp 50 55 60

Val Leu Arg Gln Ile His Arg Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Leu 65 70 75 80

Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr

85 90 95

Asp Ile Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val * 100 105 110

Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg 115 120 125

Arg Phe Val Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu 5 130 135 140

Gly His Aia Pro Tyr Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala 145 150 155 160

Leu Gly Ile Ile Asp Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Iie Glu Thr Ala 165 170 175

Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala 180 185 190

Met Ala Glu Leu Asp Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val 195 200 205

Glu Thr Thr Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu

210 215 220

Thr Ala Leu Gln Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala 225 230 235 240

Thr Gly Pro Asp Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Lys His 245 250 255

Ala Asp Ile Pro Val Ser Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu 260 265 270

Gly Lys Asn Gly Ala Glu Tyr Pro Leu Glu Ala Glu Asp Leu Ala Gln 275 280 285

Ala Leu Ala Gly Phe Val Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Met Val Gly Gly 290 295 300

Cys Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Asp Ala Val 305 310 315 320

Val Gly Val Pro Glu Gln Glu Thr Ser Thr Leu Thr Lys Ile Pro Ala 325 330 335

Gly Pro Val Glu Gln Ala Ser Arg Glu Val Glu Lys Glu Asp Ser Val 340 345 350

Ala Ser Leu Tyr Thr Ser Val Pro Leu Ser Gln Glu Thr Gly Ile Ser 355 360 365

Met Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ser Asn Gly Ser Lys Ala Phe Arg Glu 370 375 380

Ala Met Leu Ser Gly Asp Trp Glu Lys Cys Val Asp Ile Ala Lys Gln 385 390 395 400

Gln Thr Arg Asp Gly Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val 405 410 415

Gly Arg Asp Gly Thr Ala Asp Met Ala Thr Leu Ala Ala Leu Leu Ala 420 425 430

Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ile Met Ile Asp Ser Thr Glu Pro Glu Val 435 440 445

Ile Arg Thr Gly Leu Glu His Leu Gly Gly Arg Ser Ile Val Asn Ser 450 455 460

Val Asn Phe Glu Asp Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480

Met Lys Leu Val Lys Gln His Gly Ala Ala Val Val Ala Leu Thr Ile 485 490 495

Asp Glu Glu Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu His Lys Val Arg Ile Ala 500 505 510

Lys Arg Leu Ile Asp Asp Ile Thr Gly Ser Tyr Gly Leu Asp Ile Lys 515 520 525

Asp Ile Val Val Asp Cys Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr Gly Gln Glu 530 535 540

Glu Thr Arg Arg Asp Gly Ile Glu Thr Ile Glu Ala Ile Arg Glu Leu 545 550 555 560

Lys Lys Leu Tyr Pro Glu Ile His Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile 565 570 575

Ser Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Gln Val Leu Asn Ser Val Phe 580 585 590

Leu Asn Glu Cys Ile Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Ala His Ser 595 600 605

Ser Lys Ile Leu Pro Met Asn Arg Ile Asp Asp Arg Gln Arg Glu Val 610 615 620

Ala Leu Asp Met Val Tyr Asp Arg Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Pro Leu 625 630 635 640

Gln Glu Phe Met Gln Leu Phe Glu Gly Val Ser Ala Ala Asp Ala Lys 645 650 655

Asp Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Met Pro Leu Phe Glu Arg Leu 660 665 670

Ala Gln Arg Ile Ile Asp Gly Asp Lys Asn Gly Leu Glu Asp Asp Leu 675 680 685

Glu Ala Gly Met Lys Glu Lys Ser Pro Ile Ala Ile Ile Asn Glu Asp 690 695 700

Leu Leu Asn Gly Met Lys Thr Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln 705 710 715 720

Met Gln Leu Pro Phe Val Leu Gln Ser Ala Glu Thr Met Lys Thr Ala 725 730 735

Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Met Glu Glu Glu Ala Glu Ala Thr Gly 740 745 750

Ser Ala Gln Ala Glu Gly Lys Gly Lys Ile Val Val Ala Thr Val Lys 755 760 765

Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser 770 775 780

Asn Asn Gly Tyr Asp Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Gln Pro Leu Ser 785 790 795 800

Ala Met Leu Glu Ala Ala Glu Glu His Lys Ala Asp Val Ile Gly Met

805 810 815

Ser Gly Leu Leu Val Lys Ser Thr Val Val Met Lys Glu Asn Leu Glu 820 825 830

Glu Met Asn Asn Ala Gly Ala Ser Asn Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly 835 840 845

Ala Ala Leu Thr Arg Thr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Asn Glu Val Tyr 850 855 860

Thr Gly Glu Val Tyr Tyr Ala Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu 865

Met Asp Glu Val Ser Pro Glu Ala

900

Arg Asn Glu Arg 915

Ala Pro Val Ile 930

Thr Ala Ala Pro 945

Leu Ala Glu Phe Gln Trp Gly Leu

980

Asp Leu Val Glu 995

Arg Leu Lys Ser Glu Gly Ile 1010 1015

Gly Tyr Phe Pro Ala Val Ala 1025 1030

Glu Ser Pro Asp Pro His Ala 1040 1045

Pro Arg Gln Gln Arg Gly Arg 1055 1060

Arg Pro Arg Glu Gln Ala Val 1070 1075

Pro Phe Gln Leu Val Thr Met 1085 1090

Asn Glu Leu Phe Ala Ala Asn 1100 1105

His Gly Ile Gly Val Gln Leu

880 Pro Asn 895

Lys Lys Lys Ala Glu Arg Lys Ala 905 910

Ala Ala Glu Arg Lys Ala Asn Ala 925

Ser Asp Val Ser Thr Asp Thr Pro 940

Thr Arg Ile Val Lys Gly Leu Pro 955 960

Asp Glu Arg Ala Leu Phe Met Gly 970 975

Gly Asn Glu Gly Pro Ser Tyr Glu 985 990

Pro Arg Leu Arg Tyr Trp Leu Asp 1005

Leu Asp His Val Ala Leu Val Tyr 1020

Glu Gly Asp Asp Val Val Ile Leu 1035

Ala Glu Arg Met Arg Phe Ser Phe 1050

Phe Leu Cys Ile Ala Asp Phe Ile 1065

Lys Asp Gly Gln Val Asp Val Met 1080

Gly Asn Pro Ile Ala Asp Phe Ala 1095

Glu Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Val 1110

Thr Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp

870 875

Met Ala Glu Lys Arg Gly Glu Gly Leu Asp 885 890

Ile Glu Gln Ala

Ser Arg Lys Ile 920

Val Pro Glu Arg 935

Pro Phe Trp Gly 950

Leu Gly Asn Leu 965

Lys Ser Thr Arg

Thr Glu Gly Arg 1000 1115 1120 1125

His Ser Arg Val Arg Ser Glu Leu Lys Leu Asn Asp Gly Gly Ser 1130 1135 1140

Val Ala Asp Phe Asp Pro Glu Asp Lys Thr Lys Phe Phe Asp Leu 5 1145 1150 1155

Asp Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Phe Gly Tyr Gly Ser Cys Pro 1160 1165 1170

Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys Leu Val Glu Leu Leu Glu Pro Gly 1175 1180 1185

10 Arg Ile Gly Val Glu Leu Ser Glu Glu Leu Gln Leu His Pro Glu 1190 1195 1200

Gln Ser Thr Asp Ala Phe Val Leu Tyr His Pro Glu Ala Lys Tyr 1205 1210 1215

Phe Asn Val

1220 <210> 20 <211> 1221 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MUTAGENE <222> (33)..(33) <223> metionina sintase MetH carregando mutação M33L <4 00> 20 Met Ser Thr Ser Val Thr Ser Pro Ala His Asn Asn Ala His Ser 1 5 10 15 Glu Phe Leu Asp Ala Leu Ala Asn His Val Leu Ile Gly Asp Gly 20 25 30 Gly Gly Thr Gln Leu Gln Gly Phe Asp Leu Asp Val Glu Lys Asp 35 40 45 Leu Asp Leu Glu Gly Cys Asn Glu Ile Leu Asn Asp Thr Arg Pro 50 55 60 Val Leu Arg Gln Ile His Arg Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Leu 65 70 75 80

Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr 85 90 95

Asp Ile Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val 100 105 110

Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg 115 120 125

Arg Phe Val Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu 130 135 140

Gly His Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala 145 150 155 160

Leu Gly Ile Ile Asp Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr Ala 165 170 175

Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala 180 185 190

Met Ala Glu Leu Asp Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val 195 200 205

Glu Thr Thr Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu

210 215 220

Thr Ala Leu Gln Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala 225 230 235 240

Thr Gly Pro Asp Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Lys His 245 250 255

Ala Asp Ile Pro Val Ser Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu 260 265 270

Gly Lys Asn Gly Ala Glu Tyr Pro Leu Glu Ala Glu Asp Leu Ala Gln 275 280 285

Ala Leu Ala Gly Phe Val Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Met Val Gly Gly 290 295 300

Cys Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Asp Ala Val 305 310 315 320 Val Gly Val Pro Glu Gln Glu Thr Ser Thr Leu Thr Lys Ile Pro Ala 325 330 335

Gly Pro Val Glu Gln Ala Ser Arg Glu Val Glu Lys Glu Asp Ser Val 340 345 350

Ala Ser Leu Tyr Thr Ser Val Pro Leu Ser Gln Glu Thr Gly Ile Ser 355 360 365

Met Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ser Asn Gly Ser Lys Ala Phe Arg Glu 370 375 380

Ala Met Leu Ser Gly Asp Trp Glu Lys Cys Val Asp Ile Ala Lys Gln 385 390 395 400

Gln Thr Arg Asp Gly Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val 405 410 415

Gly Arg Asp Gly Thr Ala Asp Met Ala Thr Leu Ala Ala Leu Leu Ala 420 425 430

Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ile Met Ile Asp Ser Thr Glu Pro Glu Val 435 440 445

Ile Arg Thr Gly Leu Glu His Leu Gly Gly Arg Ser He Val Asn Ser 450 455 460

Val Asn Phe Glu Asp Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480

Met Lys Leu Val Lys Gln His Gly Ala Ala Val Val Ala Leu Thr Ile 485 490 495

Asp Glu Glu Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu His Lys Val Arg Ile Ala 500 505 510

Lys Arg Leu Ile Asp Asp He Thr Gly Ser Tyr Gly Leu Asp Ile Lys 515 520 525

Asp Ile Val Val Asp Cys Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr Gly Gln Glu 530 535 540

Glu Thr Arg Arg Asp Gly He Glu Thr He Glu Ala Ile Arg Glu Leu 545 550 555 560

Lys Lys Leu Tyr Pro Glu Ile His Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile 565 570 575 Ser Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Gln Val Leu Asn Ser Val Phe 580 585 590

Leu Asn Glu Cys Ile Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Ala His Ser 595 600 605

Ser Lys Ile Leu Pro Met Asn Arg Ile Asp Asp Arg Gln Arg Glu Val 610 615 620

Ala Leu Asp Met Val Tyr Asp Arg Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Pro Leu 625 630 635 640

Gln Glu Phe Met Gln Leu Phe Glu Gly Val Ser Ala Ala Asp Ala Lys 645 650 655

Asp Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Met Pro Leu Phe Glu Arg Leu 660 665 670

Ala Gln Arg Ile Ile Asp Gly Asp Lys Asn Gly Leu Glu Asp Asp Leu 675 680 685

Glu Ala Gly Met Lys Glu Lys Ser Pro Ile Ala Ile Ile Asn Glu Asp 690 695 700

Leu Leu Asn Gly Met Lys Thr Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln 705 710 715 720

Met Gln Leu Pro Phe Val Leu Gln Ser Ala Glu Thr Met Lys Thr Ala 725 730 735

Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Met Glu Glu Glu Ala Glu Ala Thr Gly 740 745 750

Ser Ala Gln Ala Glu Gly Lys Gly Lys Ile Val Val Ala Thr Val Lys 755 760 765

Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser 770 775 780

Asn Asn Gly Tyr Asp Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Gln Pro Leu Ser 785 790 795 800

Ala Met Leu Glu Ala Ala Glu Glu His Lys Ala Asp Val Ile Gly Met 805 810 815

Ser Gly Leu Leu Val Lys Ser Thr Val Val Met Lys Glu Asn Leu Glu 820 825 830 I 116

Glu Met Asn Asn Ala Gly Ala Ser Asn Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly 835 840 845

Ala Ala Leu Thr Arg Thr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Asn Glu Val Tyr 850 855 860

Thr Gly Glu Val Tyr Tyr Ala Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu 865 870 875 880

Met Asp Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Gly Glu Gly Leu Asp Pro Asn 885 890 895

Ser Pro Glu Ala Ile Glu Gln Ala Lys Lys Lys Ala Glu Arg Lys Ala 900 905 910

Arg Asn Glu Arg Ser Arg Lys Ile Ala Ala Glu Arg Lys Ala Asn Ala 915 920 925

Ala Pro Val Ile Val Pro Glu Arg Ser Asp Val Ser Thr Asp Thr Pro 930 935 940

Thr Ala Ala Pro Pro Phe Trp Gly Thr Arg Ile Val Lys Gly Leu Pro 945 950 955 960

Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asn Leu Asp Glu Arg Ala Leu Phe Met Gly 965 970 975

Gln Trp Gly Leu Lys Ser Thr Arg Gly Asn Glu Gly Pro Ser Tyr Glu 980 985 990

Asp Leu Val Glu Thr Glu Gly Arg Pro Arg Leu Arg Tyr Trp Leu Asp 995 1000 1005

Arg Leu Lys Ser Glu Gly Ile Leu Asp His Val Ala Leu Val Tyr 1010 1015 1020

Gly Tyr Phe Pro Ala Val Ala Glu Gly Asp Asp Val Val Ile Leu 1025 1030 1035

Glu Ser Pro Asp Pro His Ala Ala Glu Arg Met Arg Phe Ser Phe 1040 1045 1050

Pro Arg Gln Gln Arg Gly Arg Phe Leu Cys Ile Ala Asp Phe Ile 1055 1060 1065

Arg Pro Arg Glu Gln Ala Val Lys Asp Gly Gln Val Asp Val Met 1070 1075 1080 Pro Phe Gln Leu Val Thr Met Gly Asn Pro ile Ala Asp Phe Ala 1085 1090 1095

Asn Glu Leu Phe Ala Ala Asn Glu Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Val 1100 1105 1110

His Gly Ile Gly Val Gln Leu Thr Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp 1115 1120 1125

His Ser Arg Val Arg Ser Glu Leu Lys Leu Asn Asp Gly Gly Ser 1130 1135 1140

Val Ala Asp Phe Asp Pro Glu Asp Lys Thr Lys Phe Phe Asp Leu 1145 1150 1155

Asp Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Phe Gly Tyr Gly Ser Cys Pro 1160 1165 1170

Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys Leu Val Glu Leu Leu Glu Pro Gly 1175 1180 1185

Arg Ile Gly Val Glu Leu Ser Glu Glu Leu Gln Leu His Pro Glu 1190 1195 1200

Gln Ser Thr Asp Ala Phe Val Leu Tyr His Pro Glu Ala Lys Tyr 1205 1210 1215

Phe Asn Val 1220 <210> 21 <211> 1221 <212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> MUTAGENE <222> (86)..(86)

<223> metionina sintase MetH carregando mutação F86L <400> 21

Met Ser Thr Ser Val Thr Ser Pro Ala His Asn Asn Ala His Ser Ser 15 10 15

Glu Phe Leu Asp Ala Leu Ala Asn His Val Leu Ile Gly Asp Gly Ala ‘ 20 25 30

Met Gly Thr Gln Leu Gln Gly Phe Asp Leu Asp Val Glu Lys Asp Phe 35 40 45

Leu Asp Leu Glu Gly Cys Asn Glu Ile Leu Asn Asp Thr Arg Pro Asp 5 50 55 60

Val Leu Arg Gln Ile His Arg Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Leu 65 70 75 80

Val Glu Thr Asn Thr Leu Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr 85 90 95

Asp Ile Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val 100 105 110

Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg 115 120 125

Arg Phe Val Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu 130 135 140

Gly His Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala 145 150 155 160

Leu Gly Ile Ile Asp Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr Ala 165 170 175

Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala 180 185 190

Met Ala Glu Leu Asp Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val 195 200 205

Glu Thr Thr Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu

210 215 220

Thr Ala Leu Gln Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala 225 230 235 240

Thr Gly Pro Asp Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Lys His 245 250 255

Ala Asp Ile Pro Val Ser Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu 260 265 270

Gly Lys Asn Gly Ala Glu Tyr Pro Leu Glu Ala Glu Asp Leu Ala Gln 275 280 285

Ala Leu Ala Gly Phe Val Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Met Val Gly Gly 290 295 300

Cys Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Asp Ala Val 305 310 315 320

Val Gly Val Pro Glu Gln Glu Thr Ser Thr Leu Thr Lys Ile Pro Ala 325 330 335

Gly Pro Val Glu Gln Ala Ser Arg Glu Val Glu Lys Glu Asp Ser Val 340 345 350

Ala Ser Leu Tyr Thr Ser Val Pro Leu Ser Gln Glu Thr Gly Ile Ser 355 360 365

Met Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ser Asn Gly Ser Lys Ala Phe Arg Glu 370 375 380

Ala Met Leu Ser Gly Asp Trp Glu Lys Cys Val Asp Ile Ala Lys Gln 385 390 395 400

Gln Thr Arg Asp Gly Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val 405 410 415

Gly Arg Asp Gly Thr Ala Asp Met Ala Thr Leu Ala Ala Leu Leu Ala 420 425 430

Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ile Met Ile Asp Ser Thr Glu Pro Glu Val 435 440 445

Ile Arg Thr Gly Leu Glu His Leu Gly Gly Arg Ser Ile Val Asn Ser 450 455 460

Val Asn Phe Glu Asp Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480

Met Lys Leu Val Lys Gln His Gly Ala Ala Val Val Ala Leu Thr Ile 485 490 495

Asp Glu Glu Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu His Lys Val Arg Ile Ala 500 505 510

Lys Arg Leu Ile Asp Asp Ile Thr Gly Ser Tyr Gly Leu Asp Ile Lys 515 520 525

Asp Ile Val Val Asp Cys Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr Gly Gln Glu ‘ 530 535 540

Glu Thr Arg Arg Asp Gly Ile Glu Thr Ile Glu Ala Ile Arg Glu Leu 545 550 555 560

Lys Lys Leu Tyr Pro Glu Ile His Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile 5 565 570 575

Ser Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Gln Val Leu Asn Ser Val Phe 580 585 590

Leu Asn Glu Cys Ile Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Ala His Ser 595 600 605

Ser Lys Ile Leu Pro Met Asn Arg Ile Asp Asp Arg Gln Arg Glu Val 610 615 620

Ala Leu Asp Met Val Tyr Asp Arg Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Pro Leu 625 630 635 640

Gln Glu Phe Met Gln Leu Phe Glu Gly Val Ser Ala Ala Asp Ala Lys 645 650 655

Asp Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Met Pro Leu Phe Glu Arg Leu 660 665 670

Ala Gln Arg Ile Ile Asp Gly Asp Lys Asn Gly Leu Glu Asp Asp Leu 675 680 685

Glu Ala Gly Met Lys Glu Lys Ser Pro Ile Ala Ile Ile Asn Glu Asp 690 695 700

Leu Leu Asn Gly Met Lys Thr Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln 705 710 715 720

Met Gln Leu Pro Phe Val Leu Gln Ser Ala Glu Thr Met Lys Thr Ala 725 730 735

Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Met Glu Glu Glu Ala Glu Ala Thr Gly 740 745 750

Ser Ala Gln Ala Glu Gly Lys Gly Lys Ile Val Val Ala Thr Val Lys 755 760 765

Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser 770 775 780

Asn Asn Gly Tyr Asp Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Gln Pro Leu Ser 785 790 795 800

Ala Met Leu Glu Ala Ala Glu Glu His Lys Ala Asp Val Ile Gly Met 805 810 815

Ser Gly Leu Leu Val Lys Ser Thr Val Val Met Lys Glu Asn Leu Glu 820 825 830

Glu Met Asn Asn Ala Gly Ala Ser Asn Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly 835 840 845

Ala Ala Leu Thr Arg Thr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Asn Glu Val Tyr 850 855 860

Thr Gly Glu Val Tyr Tyr Ala Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu 865 870 875 880

Met Asp Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Gly Glu Gly Leu Asp Pro Asn 885 890 895

Ser Pro Glu Ala Ile Glu Gln Ala Lys Lys Lys Ala Glu Arg Lys Ala 900 905 910

Arg Asn Glu Arg Ser Arg Lys Ile Ala Ala Glu Arg Lys Ala Asn Ala 915 920 925

Ala Pro Val Ile Val Pro Glu Arg Ser Asp Val Ser Thr Asp Thr Pro 930 935 940

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Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asn Leu Asp Glu Arg Ala Leu Phe Met Gly 965 970 975

Gln Trp Gly Leu Lys Ser Thr Arg Gly Asn Glu Gly Pro Ser Tyr Glu 980 985 990

Asp Leu Val Glu Thr Glu Gly Arg Pro Arg Leu Arg Tyr Trp Leu Asp 995 1000 1005

Arg Leu Lys Ser Glu Gly Ile Leu Asp His Val Ala Leu Val Tyr 1010 1015 1020

Gly Tyr Phe Pro Ala Val Ala Glu Gly Asp Asp Val Val Ile Leu 1025 1030 1035

Glu Ser Pro Asp Pro His Ala Ala Glu Arg Met Arg Phe Ser Phe ‘ 1040 1045 1050

Pro Arg Gln Gln Arg Gly Arg Phe Leu Cys Ile Ala Asp Phe Ile 1055 1060 1065

Arg Pro Arg Glu Gln Ala Val Lys Asp Gly Gln Val Asp Val Met 5 1070 1075 1080

Pro Phe Gln Leu Val Thr Met Gly Asn Pro Ile Ala Asp Phe Ala 1085 1090 1095

Asn Glu Leu Phe Ala Ala Asn Glu Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Val 1100 1105 1110

His Gly Ile Gly Val Gln Leu Thr Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp 1115 1120 1125

His Ser Arg Val Arg Ser Glu Leu Lys Leu Asn Asp Gly Gly Ser 1130 1135 1140

Val Ala Asp Phe Asp Pro Glu Asp Lys Thr Lys Phe Phe Asp Leu 1145 1150 1155

Asp Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Phe Gly Tyr Gly Ser Cys Pro 1160 1165 1170

Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys Leu Val Glu Leu Leu Glu Pro Gly 1175 1180 1185

Arg Ile Gly Val Glu Leu Ser Glu Glu Leu Gln Leu His Pro Glu 1190 1195 1200

Gln Ser Thr Asp Ala Phe Val Leu Tyr His Pro Glu Ala Lys Tyr 1205 1210 1215

Phe Asn Val

1220

<210> 22 <211> 1221 <212> PRT <213> Corynebacterium <220> <221> MUTAGENE <222> (134) . . (134) <223> metionina sintase MetH carregando mutação S134N <4 00> 22

Met Ser Thr Ser Val Thr Ser Pro Ala His Asn Asn Ala His Ser Ser 15 10 15

Glu Phe Leu Asp Ala Leu Ala Asn His Val Leu Ile Gly Asp Gly Ala 20 25 30

Met Gly Thr Gln Leu Gln Gly Phe Asp Leu Asp Val Glu Lys Asp Phe 35 40 45

Leu Asp Leu Glu Gly Cys Asn Glu Ile Leu Asn Asp Thr Arg Pro Asp 50 55 60

Val Leu Arg Gln Ile His Arg Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Leu 65 70 75 80

Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr 85 90 95

Asp Ile Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val 100 105 110

Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg 115 120 125

Arg Phe Val Val Gly Asn Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu 130 135 140

Gly His Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala 145 150 155 160

Leu Gly Ile Ile Asp Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr Ala 165 170 175

Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala 180 185 190

Met Ala Glu Leu Asp Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val 195 200 205

Glu Thr Thr Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu

210 215 220

Thr Ala Leu Gln Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala 225 230 235 240 * Thr Gly Pro Asp Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Lys His

245 250 255

Ala Asp Ile Pro Val Ser Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu 260 265 270

5 Gly Lys Asn Gly Ala Glu Tyr Pro Leu Glu Ala Glu Asp Leu Ala Gln 275 280 285

Ala Leu Ala Gly Phe Val Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Met Val Gly Gly 290 295 300

Cys Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Asp Ala Val 10 305 310 315 320

Val Gly Val Pro Glu Gln Glu Thr Ser Thr Leu Thr Lys Ile Pro Ala 325 330 335

Gly Pro Val Glu Gln Ala Ser Arg Glu Val Glu Lys Glu Asp Ser Val 340 345 350

15 Ala Ser Leu Tyr Thr Ser Val Pro Leu Ser Gln Glu Thr Gly Ile Ser 355 360 365

Met Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ser Asn Gly Ser Lys Ala Phe Arg Glu 370 375 380

Ala Met Leu Ser Gly Asp Trp Glu Lys Cys Val Asp Ile Ala Lys Gln ' 20 385 390 395 400

Gln Thr Arg Asp Gly Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val 405 410 415

Gly Arg Asp Gly Thr Ala Asp Met Ala Thr Leu Ala Ala Leu Leu Ala 420 425 430

25 Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ile Met Ile Asp Ser Thr Glu Pro Glu Val 435 440 445

Ile Arg Thr Gly Leu Glu His Leu Gly Gly Arg Ser Ile Val Asn Ser 450 455 460

Val Asn Phe Glu Asp Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Ile 30 465 470 475 480

Met Lys Leu Val Lys Gln His Gly Ala Ala Val Val Ala Leu Thr Ile 485 490 495 Asp Glu Glu Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu His Lys Val Arg Ile Ala 500 505 510

Lys Arg Leu Ile Asp Asp Ile Thr Gly Ser Tyr Gly Leu Asp Ile Lys 515 520 525

Asp Ile Val Val Asp Cys Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr Gly Gln Glu 530 535 540

Glu Thr Arg Arg Asp Gly Ile Glu Thr Ile Glu Ala Ile Arg Glu Leu 545 550 555 560

Lys Lys Leu Tyr Pro Glu Ile His Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile 565 570 575

Ser Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Gln Val Leu Asn Ser Val Phe 580 585 590

Leu Asn Glu Cys Ile Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Ala His Ser 595 600 605

Ser Lys Ile Leu Pro Met Asn Arg Ile Asp Asp Arg Gln Arg Glu Val 610 615 620

Ala Leu Asp Met Val Tyr Asp Arg Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Pro Leu 625 630 635 640

Gln Glu Phe Met Gln Leu Phe Glu Gly Val Ser Ala Ala Asp Ala Lys 645 650 655

Asp Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Met Pro Leu Phe Glu Arg Leu 660 665 670

Ala Gln Arg Ile Ile Asp Gly Asp Lys Asn Gly Leu Glu Asp Asp Leu 675 680 685

Glu Ala Gly Met Lys Glu Lys Ser Pro Ile Ala Ile Ile Asn Glu Asp 690 695 700

Leu Leu Asn Gly Met Lys Thr Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln 705 710 715 720

Met Gln Leu Pro Phe Val Leu Gln Ser Ala Glu Thr Met Lys Thr Ala 725 730 735

Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Met Glu Glu Glu Ala Glu Ala Thr Gly 740 745 750 1 Ser Ala Gln Ala Glu Gly Lys Gly Lys Ile Val Val Ala Thr Val Lys

755 760 765

Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser 770 775 780

5 Asn Asn Gly Tyr Asp Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Gln Pro Leu Ser 785 790 795 800

Ala Met Leu Glu Ala Ala Glu Glu His Lys Ala Asp Val Ile Gly Met 805 810 815

Ser Gly Leu Leu Val Lys Ser Thr Val Val Met Lys Glu Asn Leu Glu 820 825 830

Glu Met Asn Asn Ala Gly Ala Ser Asn Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly 835 840 845

Ala Ala Leu Thr Arg Thr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Asn Glu Val Tyr 850 855 860

Thr Gly Glu Val Tyr Tyr Ala Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu 865 870 875 880

Met Asp Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Gly Glu Gly Leu Asp Pro Asn 885 890 895

Ser Pro Glu Ala Ile Glu Gln Ala Lys Lys Lys Ala Glu Arg Lys Ala 900 905 910

Arg Asn Glu Arg Ser Arg Lys Ile Ala Ala Glu Arg Lys Ala Asn Ala 915 920 925

Ala Pro Val Ile Val Pro Glu Arg Ser Asp Val Ser Thr Asp Thr Pro 930 935 940

Thr Ala Ala Pro Pro Phe Trp Gly Thr Arg Ile Val Lys Gly Leu Pro 945 950 955 960

Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asn Leu Asp Glu Arg Ala Leu Phe Met Gly 965 970 975

Gln Trp Gly Leu Lys Ser Thr Arg Gly Asn Glu Gly Pro Ser Tyr Glu 980 985 990

Asp Leu Val Glu Thr Glu Gly Arg Pro Arg Leu Arg Tyr Trp Leu Asp 995 1000 1005 Arg Leu Lys Ser Glu Gly Ile Leu Asp His Val Ala Leu Val Tyr 1010 1015 1020

Gly Tyr Phe Pro Ala Val Ala Glu Gly Asp Asp Val Val Ile Leu 1025 1030 1035

Glu Ser Pro Asp Pro His Ala Ala Glu Arg Met Arg Phe Ser Phe 1040 1045 1050

Pro Arg Gln Gln Arg Gly Arg Phe Leu Cys Ile Ala Asp Phe Ile 1055 1060 1065

Arg Pro Arg Glu Gln Ala Val Lys Asp Gly Gln Val Asp Val Met 1070 1075 1080

Pro Phe Gln Leu Val Thr Met Gly Asn Pro Ile Ala Asp Phe Ala 1085 1090 1095

Asn Glu Leu Phe Ala Ala Asn Glu Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Val 1100 1105 1110

His Gly Ile Gly Val Gln Leu Thr Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp 1115 1120 1125

His Ser Arg Val Arg Ser Glu Leu Lys Leu Asn Asp Gly Gly Ser 1130 1135 1140

Val Ala Asp Phe Asp Pro Glu Asp Lys Thr Lys Phe Phe Asp Leu 1145 1150 1155

Asp Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Phe Gly Tyr Gly Ser Cys Pro 1160 1165 1170

Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys Leu Val Glu Leu Leu Glu Pro Gly 1175 1180 1185

Arg Ile Gly Val Glu Leu Ser Glu Glu Leu Gln Leu His Pro Glu 1190 1195 1200

Gln Ser Thr Asp Ala Phe Val Leu Tyr His Pro Glu Ala Lys Tyr 1205 1210 1215

Phe Asn Val

1220

<210> 23 <211> 3666 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc ASPECTO

<4 00> 23

atgtctactt cagttacttc accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat 60

gcgttggcaa accatgtgtt gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt 120

gacctggacg tggaaaagga tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac 180

10 acccgccctg atgtgttgag gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg 240

gttgagacca atacttttgg ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat 300

cgttgccgtg agcttgccta caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg 360

gggccgggcc gaaacggcat gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag 420

cttccatcgc tgggccatgc accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg 480

15 cttggcatca tcgacggtgg tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt 540

caggtcaagg ctgcggttca cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg 600

cccattattt gccacgtcac cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc 660

ggtgccgcgt tgacagcgct gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc 720

accggcccag atgagatgag cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct 780

■ 20 gtgtcggtga tgcctaacgc aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca 840

cttgaggctg aggatttggc gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc 900

atggtgggtg gttgttgtgg caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg 960

gttggtgttc cagagcagga aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ccctgttgag 1020

caggcctccc gcgaggtgga gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca 1080

25 ttgtcccagg aaaccggcat ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag 1140

gcattccgtg aggcaatgct gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag 1200

caaacccgcg atggtgcaca catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc 1260

accgccgata tggcgacctt ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg 1320

attgactcca ccgagccaga ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc 1380

30 atcgttaact ccgtcaactt tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc 1440

atgaaactgg taaagcagca cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc 1500

caggcacgta ccgctgagca caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc 1560 ggcagctacg gcctggatat caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct 1620

actggccagg aagaaaccag gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg 1680

aagaagctct acccagaaat ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg 1740

aaccctgctg cacgccaggt tcttaactct gtgttcctca atgagtgcat tgaggctggt 1800

5 ctggactctg cgattgcgca cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc 1860

cagcgcgaag tggcgttgga tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg 1920

caggaattca tgcagctgtt tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct 1980

gaacagctgg ccgctatgcc tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat 2040

aagaatggcc ttgaggatga tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc 2100

atcaacgagg accttctcaa cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag 2160

atgcagctgc cattcgtgct gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg 2220

gaaccgttca tggaagagga agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc 2280

aaaatcgtcg tggccaccgt caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac 2340

atcattttgt ccaacaacgg ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc 2400

gccatgttgg aagcagcgga agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt 2460

gtgaagtcca ccgtggtgat gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc 2520

aattacccag tcattttggg tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc 2580

aacgaggtgt acaccggtga ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg 2640

atggatgagg tgatggcaga aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct 2700

attgagcagg cgaagaagaa ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt 2760

gccgcggagc gtaaagctaa tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc 2820

accgatactc caaccgcggc accaccgttc tggggaaccc gcattgtcaa gggtctgccc 2880

ttggcggagt tcttgggcaa ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg 2940

aaatccaccc gcggcaacga gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga 3000

ccacgcctgc gctactggct ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc 3060

ttggtgtatg gctacttccc agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc 3120

ccggatccac acgcagccga acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg 3180

ttcttgtgca tcgcggattt cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg 3240

gacgtcatgc cattccagct ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag 3300

ttgttcgcag ccaatgaata ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc 3360

accgaagcat tggccgagta ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac 3420

ggtggatctg tcgctgattt tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac 3480 cgcggcgccc gcttctcctt tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag 3540 ctggtggaat tgctcgagcc aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg 3600 cacccagagc agtccacaga cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac 3660 gtctaa 3666

<210> 24 <211> 735 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_ASPECTO

<223> domínio de ligação de homocisteína de metionina sintase metH <4 00> 24

atgtctactt cagttacttc accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat 60 gcgttggcaa accatgtgtt gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt 120 gacctggacg tggaaaagga tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac 180 acccgccctg atgtgttgag gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg 240 gttgagacca atacttttgg ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat 300 cgttgccgtg agcttgccta caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg 360 gggccgggcc gaaacggcat gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag 420 cttccatcgc tgggccatgc accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg 480 cttggcatca tcgacggtgg tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt 540 caggtcaagg ctgcggttca cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg 600 cccattattt gccacgtcac cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc 660 ggtgccgcgt tgacagcgct gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc 720 accggcccag atgag 735 <210> 25

<211> 3666

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> misc_ASPECTO

<223> seqüência de codificação de metionina sintase MetH carregando mutação Μ33Α <4 00> 25

atgtctactt cagttacttc accagcccac aacaacgcac attcctccga . atttttggat 60 gcgttggcaa accatgtgtt gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt 120 gacctggacg tggaaaagga tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac 180 acccgccctg atgtgttgag gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg 240 gttgagacca atacttttgg ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat 300 cgttgccgtg agcttgccta caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg 360 gggccgggcc gaaacggcat gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag 420 cttccatcgc tgggccatgc accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg 480 cttggcatca tcgacggtgg tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt 540 caggtcaagg ctgcggttca cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg 600 cccattattt gccacgtcac cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc 660 ggtgccgcgt tgacagcgct gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc 720 accggcccag atgagatgag cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct 780 gtgtcggtga tgcctaacgc aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca 840 cttgaggctg aggatttggc gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc 900 atggtgggtg gttgttgtgg caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg 960 gttggtgttc cagagcagga aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ccctgttgag 1020 caggcctccc gcgaggtgga gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca 1080 ttgtcccagg aaaccggcat ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag 1140 gcattccgtg aggcaatgct gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag 1200 caaacccgcg atggtgcaca catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc 1260 accgccgata tggcgacctt ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg 1320 attgactcca ccgagccaga ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc 1380 atcgttaact ccgtcaactt tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc 1440 atgaaactgg taaagcagca cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc 1500 caggcacgta ccgctgagca caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc 1560 ggcagctacg gcctggatat caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct 1620 actggccagg aagaaaccag gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg 1680 aagaagctct acccagaaat ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg 1740 aaccctgctg cacgccaggt tcttaactct gtgttcctca , atgagtgcat ' tgaggctggt 1800 * ctggactctg cgattgcgca cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc 1860

cagcgcgaag tggcgttgga tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg 1920

caggaattca tgcagctgtt tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct 1980

gaacagctgg ccgctatgcc tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat 2040

aagaatggcc ttgaggatga tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc 2100

atcaacgagg accttctcaa cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag 2160

atgcagctgc cattcgtgct gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg 2220

gaaccgttca tggaagagga agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc 2280

aaaatcgtcg tggccaccgt caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac 2340

10 atcattttgt ccaacaacgg ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc 2400

gccatgttgg aagcagcgga agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt 2460

gtgaagtcca ccgtggtgat gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc 2520

aattacccag tcattttggg tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc 2580

aacgaggtgt acaccggtga ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg 2640

15 atggatgagg tgatggcaga aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct 2700

attgagcagg cgaagaagaa ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt 2760

gccgcggagc gtaaagctaa tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc 2820

accgatactc caaccgcggc accaccgttc tggggaaccc gcattgtcaa gggtctgccc 2880

ttggcggagt tcttgggcaa ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg 2940

• 20 aaatccaccc gcggcaacga gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga 3000

ccacgcctgc gctactggct ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc 3060

ttggtgtatg gctacttccc agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc 3120

ccggatccac acgcagccga acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg 3180

ttcttgtgca tcgcggattt cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg 3240

25 gacgtcatgc cattccagct ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag 3300

ttgttcgcag ccaatgaata ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc 3360

accgaagcat tggccgagta ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac 3420

ggtggatctg tcgctgattt tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac 3480

cgcggcgccc gcttctcctt tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag 3540

30 ctggtggaat tgctcgagcc aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg 3600

cacccagagc agtccacaga cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac 3660

gtctaa 3666 <210> 26 <211> 3666 <212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<2 21> misc_ASPECTO

<223> seqüência de codificação de metionina sintase MetH carregando mutação M33L <4 00> 26

atgtctactt cagttacttc accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat 60

gcgttggcaa accatgtgtt gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt 120

gacctggacg tggaaaagga tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac 180

acccgccctg atgtgttgag gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg 240

gttgagacca atacttttgg ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat 300

cgttgccgtg agcttgccta caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg 360

gggccgggcc gaaacggcat gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag 420

cttccatcgc tgggccatgc accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg 480

cttggcatca tcgacggtgg tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt 540

caggtcaagg ctgcggttca cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg 600

cccattattt gccacgtcac cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc 660

ggtgccgcgt tgacagcgct gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc 720

accggcccag atgagatgag cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct 780

gtgtcggtga tgcctaacgc aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca 840

cttgaggctg aggatttggc gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc 900

atggtgggtg gttgttgtgg caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg 960

gttggtgttc cagagcagga aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ccctgttgag 1020

caggcctccc gcgaggtgga gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca 1080

ttgtcccagg aaaccggcat ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag 1140

gcattccgtg aggcaatgct gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag 1200

caaacccgcg atggtgcaca catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc 1260

accgccgata tggcgacctt ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg 1320

attgactcca ccgagccaga ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc 1380 atcgttaact ccgtcaactt tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc 1440 atgaaactgg taaagcagca cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc 1500 caggcacgta ccgctgagca caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc 1560 ggcagctacg gcctggatat caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct 1620 actggccagg aagaaaccag gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg 1680 aagaagctct acccagaaat ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg 1740 aaccctgctg cacgccaggt tcttaactct gtgttcctca atgagtgcat tgaggctggt 1800 ctggactctg cgattgcgca cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc 1860 cagcgcgaag tggcgttgga tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg 1920 caggaattca tgcagctgtt tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct 1980 gaacagctgg ccgctatgcc tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat 2040 aagaatggcc ttgaggatga tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc 2100 atcaacgagg accttctcaa cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag 2160 atgcagctgc cattcgtgct gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg 2220 gaaccgttca tggaagagga agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc 2280 aaaatcgtcg tggccaccgt caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac 2340 atcattttgt ccaacaacgg ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc 2400 gccatgttgg aagcagcgga agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt 2460 gtgaagtcca ccgtggtgat gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc 2520 aattacccag tcattttggg tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc 2580 aacgaggtgt acaccggtga ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg 2640 atggatgagg tgatggcaga aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct 2700 attgagcagg cgaagaagaa ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt 2760 gccgcggagc gtaaagctaa tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc 2820 accgatactc caaccgcggc accaccgttc tggggaaccc gcattgtcaa gggtctgccc 2880 ttggcggagt tcttgggcaa ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg 2940 aaatccaccc gcggcaacga gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga 3000 ccacgcctgc gctactggct ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc 3060 ttggtgtatg gctacttccc agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc 3120 ccggatccac acgcagccga acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg 3180 ttcttgtgca tcgcggattt cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg 3240 gacgtcatgc cattccagct ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag 3300 20

25

30

ttgttcgcag ccaatgaata ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc 3360 accgaagcat tggccgagta ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac 3420 ggtggatctg tcgctgattt tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac 3480 cgcggcgccc gcttctcctt tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag 3540 ctggtggaat tgctcgagcc aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg 3600 cacccagagc agtccacaga cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac 3660 gtctaa 3666 <210> 27

<211> 3666

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_ASPECT0

<223> seqüência de codificação de metionina sintase MetH carregando mutação

F8 6L

<4 00> 27 cagttacttc accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat 60 atgtctactt gcgttggcaa accatgtgtt gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt 120 gacctggacg tggaaaagga tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac 180 acccgccctg atgtgttgag gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg 240 gttgagacca atacttttgg ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat 300 cgttgccgtg agcttgccta caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg 360 gggccgggcc gaaacggcat gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag 420 cttccatcgc tgggccatgc accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg 480 cttggcatca tcgacggtgg tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt 540 caggtcaagg ctgcggttca cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg 600 cccattattt gccacgtcac cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc 660 ggtgccgcgt tgacagcgct gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc 720 accggcccag atgagatgag cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct 780 gtgtcggtga tgcctaacgc aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca 840 cttgaggctg aggatttggc gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc 900 atggtgggtg gttgttgtgg caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg 960 ί gttggtgttc cagagcagga aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ■ ccctgttgag 1020 caggcctccc gcgaggtgga gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac . ctcggtgcca 1080 ttgtcccagg aaaccggcat ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag 1140 gcattccgtg aggcaatgct gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag 1200 caaacccgcg atggtgcaca catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc 1260 accgccgata tggcgacctt ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg 1320 attgactcca ccgagccaga ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc 1380 atcgttaact ccgtcaactt tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc 1440 atgaaactgg taaagcagca cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc 1500 caggcacgta ccgctgagca caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc 1560 ggcagctacg gcctggatat caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct 1620 actggccagg aagaaaccag gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg 1680 aagaagctct acccagaaat ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg 1740 aaccctgctg cacgccaggt tcttaactct gtgttcctca atgagtgcat tgaggctggt 1800 ctggactctg cgattgcgca cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc 1860 cagcgcgaag tggcgttgga tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg 1920 caggaattca tgcagctgtt tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct 1980 gaacagctgg ccgctatgcc tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat 2040 aagaatggcc ttgaggatga tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc 2100 atcaacgagg accttctcaa cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag 2160 atgcagctgc cattcgtgct gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg 2220 gaaccgttca tggaagagga agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc 2280 aaaatcgtcg tggccaccgt caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac 2340 atcattttgt ccaacaacgg ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc 2400 gccatgttgg aagcagcgga agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt 2460 gtgaagtcca ccgtggtgat gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc 2520 aattacccag tcattttggg tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc 2580 aacgaggtgt acaccggtga ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg 2640 atggatgagg tgatggcaga aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct 2700 attgagcagg cgaagaagaa ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt 2760 gccgcggagc gtaaagctaa tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc 2820 accgatactc caaccgcggc accaccgttc tggggaaccc i gcattgtcaa i gggtctgccc 2880 10

15

20

25

30

ttggcggagt tcttgggcaa ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg 2940 aaatccaccc gcggcaacga gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga 3000 ccacgcctgc gctactggct ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc 3060 ttggtgtatg gctacttccc agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc 3120 ccggatccac acgcagccga acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg 3180 ttcttgtgca tcgcggattt cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg 3240 gacgtcatgc cattccagct ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag 3300 ttgttcgcag ccaatgaata ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc 3360 accgaagcat tggccgagta ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac 3420 ggtggatctg tcgctgattt tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac 3480 cgcggcgccc gcttctcctt tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag 3540 ctggtggaat tgctcgagcc aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg 3600 cacccagagc agtccacaga cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac 3660 gtctaa 3666 <210> 28 <211> 3666 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> mi s c _ASPECTO <223> seqüência de codificação de metionina sintase MetH carregando muta S134N <400> 28

atgtctactt cagttacttc accagcccac aacaacgcac attcctccga atttttggat 60 gcgttggcaa accatgtgtt gatcggcgac ggcgccatgg gcacccagct ccaaggcttt 120 gacctggacg tggaaaagga tttccttgat ctggaggggt gtaatgagat tctcaacgac 180 acccgccctg atgtgttgag gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg 240 gttgagacca atacttttgg ttgcaacctg ccgaacttgg cggattatga catcgctgat 300 cgttgccgtg agcttgccta caagggcact gcagtggcta gggaagtggc tgatgagatg 360 gggccgggcc gaaacggcat gcggcgtttc gtggttggtt ccctgggacc tggaacgaag 420 cttccatcgc tgggccatgc accgtatgca gatttgcgtg ggcactacaa ggaagcagcg 480 cttggcatca tcgacggtgg tggcgatgcc tttttgattg agactgctca ggacttgctt 540 caggtcaagg ctgcggttca cggcgttcaa gatgccatgg ctgaacttga tacattcttg 600

cccattattt gccacgtcac cgtagagacc accggcacca tgctcatggg ttctgagatc 660

ggtgccgcgt tgacagcgct gcagccactg ggtatcgaca tgattggtct gaactgcgcc 720

accggcccag atgagatgag cgagcacctg cgttacctgt ccaagcacgc cgatattcct 780

5 gtgtcggtga tgcctaacgc aggtcttcct gtcctgggta aaaacggtgc agaataccca 840

cttgaggctg aggatttggc gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc 900

atggtgggtg gttgttgtgg caccacacct gagcacatcc gtgcggtccg cgatgcggtg 960

gttggtgttc cagagcagga aacctccaca ctgaccaaga tccctgcagg ccctgttgag 1020

caggcctccc gcgaggtgga gaaagaggac tccgtcgcgt cgctgtacac ctcggtgcca 1080

ttgtcccagg aaaccggcat ttccatgatc ggtgagcgca ccaactccaa cggttccaag 1140

gcattccgtg aggcaatgct gtctggcgat tgggaaaagt gtgtggatat tgccaagcag 1200

caaacccgcg atggtgcaca catgctggat ctttgtgtgg attacgtggg acgagacggc 1260

accgccgata tggcgacctt ggcagcactt cttgctacca gctccacttt gccaatcatg 1320

attgactcca ccgagccaga ggttattcgc acaggccttg agcacttggg tggacgaagc 1380

atcgttaact ccgtcaactt tgaagacggc gatggccctg agtcccgcta ccagcgcatc 1440

atgaaactgg taaagcagca cggtgcggcc gtggttgcgc tgaccattga tgaggaaggc 1500

caggcacgta ccgctgagca caaggtgcgc attgctaaac gactgattga cgatatcacc 1560

ggcagctacg gcctggatat caaagacatc gttgtggact gcctgacctt cccgatctct 1620

actggccagg aagaaaccag gcgagatggc attgaaacca tcgaagccat ccgcgagctg 1680

aagaagctct acccagaaat ccacaccacc ctgggtctgt ccaatatttc cttcggcctg 1740

aaccctgctg cacgccaggt tcttaactct gtgttcctca atgagtgcat tgaggctggt 1800

ctggactctg cgattgcgca cagctccaag attttgccga tgaaccgcat tgatgatcgc 1860

cagcgcgaag tggcgttgga tatggtctat gatcgccgca ccgaggatta cgatccgctg 1920

caggaattca tgcagctgtt tgagggcgtt tctgctgccg atgccaagga tgctcgcgct 1980

gaacagctgg ccgctatgcc tttgtttgag cgtttggcac agcgcatcat cgacggcgat 2040

aagaatggcc ttgaggatga tctggaagca ggcatgaagg agaagtctcc tattgcgatc 2100

atcaacgagg accttctcaa cggcatgaag accgtgggtg agctgtttgg ttccggacag 2160

atgcagctgc cattcgtgct gcaatcggca gaaaccatga aaactgcggt ggcctatttg 2220

gaaccgttca tggaagagga agcagaagct accggatctg cgcaggcaga gggcaagggc 2280

aaaatcgtcg tggccaccgt caagggtgac gtgcacgata tcggcaagaa cttggtggac 2340

atcattttgt ccaacaacgg ttacgacgtg gtgaacttgg gcatcaagca gccactgtcc 2400

gccatgttgg aagcagcgga agaacacaaa gcagacgtca tcggcatgtc gggacttctt 2460 I 139

gtgaagtcca ccgtggtgat gaaggaaaac cttgaggaga tgaacaacgc cggcgcatcc 2520

aattacccag tcattttggg tggcgctgcg ctgacgcgta cctacgtgga aaacgatctc 2580

aacgaggtgt acaccggtga ggtgtactac gcccgtgatg ctttcgaggg cctgcgcctg 2640

atggatgagg tgatggcaga aaagcgtggt gaaggacttg atcccaactc accagaagct 2700

attgagcagg cgaagaagaa ggcggaacgt aaggctcgta atgagcgttc ccgcaagatt 2760

gccgcggagc gtaaagctaa tgcggctccc gtgattgttc cggagcgttc tgatgtctcc 2820

accgatactc caaccgcggc accaccgttc tggggaaccc gcattgtcaa gggtctgccc 2880

ttggcggagt tcttgggcaa ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg 2940

aaatccaccc gcggcaacga gggtccaagc tatgaggatt tggtggaaac tgaaggccga 3000

ccacgcctgc gctactggct ggatcgcctg aagtctgagg gcattttgga ccacgtggcc 3060

ttggtgtatg gctacttccc agcggtcgcg gaaggcgatg acgtggtgat cttggaatcc 3120

ccggatccac acgcagccga acgcatgcgc tttagcttcc cacgccagca gcgcggcagg 3180

ttcttgtgca tcgcggattt cattcgccca cgcgagcaag ctgtcaagga cggccaagtg 3240

gacgtcatgc cattccagct ggtcaccatg ggtaatccta ttgctgattt cgccaacgag 3300

ttgttcgcag ccaatgaata ccgcgagtac ttggaagttc acggcatcgg cgtgcagctc 3360

accgaagcat tggccgagta ctggcactcc cgagtgcgca gcgaactcaa gctgaacgac 3420

ggtggatctg tcgctgattt tgatccagaa gacaagacca agttcttcga cctggattac 3480

cgcggcgccc gcttctcctt tggttacggt tcttgccctg atctggaaga ccgcgcaaag 3540

ctggtggaat tgctcgagcc aggccgtatc ggcgtggagt tgtccgagga actccagctg 3600

cacccagagc agtccacaga cgcgtttgtg ctctaccacc cagaggcaaa gtactttaac 3660

gtctaa 3666 <210> 29 <211> 1170 <212> PRT

<220>

<221> misc_ASPECTO

<223> metionina sintase metH

<4 00> 29

Met Ala Ser Ser Pro Ser Thr Pro Pro Ala Asp Thr Arg Thr Arg Val 15 10 15

Ser Aia Leu Arg Glu Ala Leu Ala Thr Arg Val Val Val Ala Asp Gly 1 20 25 30

Ala Met Gly Thr Met Leu Gln Ala Gln Asn Pro Thr Leu Asp Asp Phe 35 40 45

Gln Gln Leu Glu Gly Cys Asn Glu Val Leu Asn Leu Thr Arg Pro Asp 5 50 55 60

Ile Val Arg Ser Val His Glu Glu Tyr Phe Ala Ala Gly Val Asp Cys 65 70 75 80

Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Asn His Ser Ala Leu Gly Glu Tyr 85 90 95

Asp Ile Pro Glu Arg Val His Glu Leu Ser Glu Ala Gly Ala Arg Val 100 105 110

Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Phe Gly Ala Arg Asp Gly Arg Gln Arg 115 120 125

Trp Val Leu Gly Ser Met Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Thr Leu Gly 130 135 140

His Ala Pro Tyr Thr Val Leu Arg Asp Ala Tyr Gln Arg Asn Ala Glu 145 150 155 160

Gly Leu Val Ala Gly Gly Ala Asp Ala Leu Leu Val Glu Thr Thr Gln 165 170 175

Asp Leu Leu Gln Thr Lys Ala Ser Val Leu Gly Ala Arg Arg Ala Leu 180 185 190

Asp Val Leu Gly Leu Asp Leu Pro Leu Ile Val Ser Val Thr Val Glu 195 200 205

Thr Thr Gly Thr Met Leu Leu Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu Thr

210 215 220

Ala Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala Thr

225 230 235 240

Gly Pro Ala Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ala Arg His Ser

245 250 255

Arg Ile Pro Leu Thr Cys Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu Gly

260 265 270

Lys Asp Gly Ala His Tyr Pro Leu Thr Ala Pro Glu Leu Ala Asp Ala 275 280 285

His Glu Thr Phe Val Arg Glu Tyr Gly Leu Ser Leu Val Gly Gly Cys 290 295 300

Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Leu Arg Gln Val Val Glu Arg Val Arg 305 310 315 320

Asp Thr Ala Pro Thr Ala Arg Asp Pro Arg Pro Glu Pro Gly Ala Ala 325 330 335

Ser Leu Tyr Gln Thr Val Pro Phe Arg Gln Asp Thr Ser Tyr Leu Ala 340 345 350

Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ala Asn Gly Ser Lys Lys Phe Arg Glu Ala 355 360 365

Met Leu Asp Gly Arg Trp Asp Asp Cys Val Glu Met Ala Arg Asp Gln 370 375 380

Ile Arg Glu Gly Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val Gly 385 390 395 400

Arg Asp Gly Val Ala Asp Met Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ala Thr 405 410 415

Ala Ser Thr Leu Pro Ile Val Leu Asp Ser Thr Glu Val Asp Val Ile 420 425 430

Arg Ala Gly Leu Glu Lys Leu Gly Gly Arg Ala Val Ile Asn Ser Val 435 440 445

Asn Tyr Glu Asp Gly Ala Gly Pro Glu Ser Arg Phe Ala Arg Val Thr 450 455 460

Lys Leu Ala Arg Glu His Gly Ala Ala Leu Ile Ala Leu Thr Ile Asp 465 470 475 480

Glu Val Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu Lys Lys Val Glu Ile Ala Glu 485 490 495

Arg Leu Ile Asp Asp Leu Thr Gly Asn Trp Gly Ile His Glu Ser Asp 500 505 510

Ile Leu Val Asp Cys Leu Thr Phe Thr Ile Cys Thr Gly Gln Glu Glu 515 520 525

Ser Arg Lys Asp Gly Leu Ala Thr Ile Glu Gly Ile Arg Glu Leu Lys 1 530 535 540

Arg Arg His Pro Asp Val Gln Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile Ser 545 550 555 560

Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Ile Leu Leu Asn Ser Val Phe Leu 5 565 570 575

Asp Glu Cys Val Lys Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Val His Ala Ser 580 585 590

Lys Ile Leu Pro Ile Ala Arg Phe Asp Glu Glu Gln Val Thr Thr Ala 595 600 605

Leu Asp Leu Ile Tyr Asp Arg Arg Arg Glu Gly Tyr Asp Pro Leu Gln 610 615 620

Lys Leu Met Gln Leu Phe Glu Gly Ala Thr Ala Lys Ser Leu Lys Ala 625 630 635 640

Ser Lys Ala Glu Glu Leu Ala Ala Leu Pro Leu Glu Glu Arg Leu Lys 645 650 655

Arg Arg Ile Ile Asp Gly Glu Lys Asn Gly Leu Glu Gln Asp Leu Asp 660 665 670

Glu Ala Leu Arg Glu Arg Pro Ala Leu Glu Ile Val Asn Asp Thr Leu 675 680 685

Leu Asp Gly Met Lys Val Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln Met 690 695 700

Gln Leu Pro Phe Val Leu Gln Ser Ala Glu Val Met Lys Thr Ala Val 705 710 715 720

Ala His Leu Glu Pro His Met Glu Lys Thr Asp Asp Asp Gly Lys Gly 725 730 735

Thr Ile Val Leu Ala Thr Val Arg Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys 740 745 750

Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser Asn Asn Gly Tyr Asn Val Val Asn 755 760 765

Leu Gly Ile Lys Gln Pro Val Ser Ala Ile Leu Glu Ala Ala Asp Glu 770 775 780

His Arg Ala Asp Val Ile Gly Met Ser Gly Leu Leu Val Lys Ser Thr 785 790 795 800

Val Ile Met Lys Glu Asn Leu GIu Glu Leu Asn Gln Arg Lys Leu Ala 805 810 815

Ala Asp Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly Ala Ala Leu Thr Arg Ala Tyr 820 825 830

Val Glu Gln Asp Leu His Glu Ile Tyr Asp Gly Glu Val Arg Tyr Ala 835 840 845

Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu Met Asp Ala Leu Ile Gly Ile 850 855 860

Lys Arg Gly Val Pro Gly Ala Lys Leu Pro Glu Leu Lys Gln Arg Arg 865 870 875 880

Val Arg Ala Ala Thr Val Glu Ile Asp Glu Arg Pro Glu Glu Gly His 885 890 895

Val Arg Ser Asp Val Ala Thr Asp Asn Pro Val Pro Thr Pro Pro Phe 900 905 910

Arg Gly Thr Arg Val Val Lys Gly Ile Gln Leu Lys Glu Tyr Ala Ser 915 920 925

Trp Leu Asp Glu Gly Ala Leu Phe Lys Gly Gln Trp Gly Leu Lys Gln 930 935 940

Ala Arg Thr Gly Glu Gly Pro Ser Tyr Glu Glu Leu Val Glu Ser Glu 945 950 955 960

Gly Arg Pro Arg Leu Arg Gly Leu Leu Asp Arg Leu Gln Thr Asp Asn 965 970 975

Leu Leu Glu Ala Ala Val Val Tyr Gly Tyr Phe Pro Cys Val Ser Lys 980 985 990

Asp Asp Asp Leu Ile Val Leu Asp Asp Asp Gly Asn Glu Arg Thr Arg 995 1000 1005

Phe Thr Phe Pro Arg Gln Arg Arg Gly Arg Arg Leu Cys Leu Ala 1010 1015 1020

Asp Phe Phe Arg Pro Glu Glu Ser Gly Glu Thr Asp Val Val Gly 1025 1030 1035

Phe Gln Val Val Thr Val Gly Ser Arg Ile Gly Glu Glu Thr Ala 1 1040 1045 1050

Arg Met Phe Glu Ala Asn Ala Tyr Arg Asp Tyr Leu Glu Leu His 1055 1060 1065

Gly Leu Ser Val Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp His 5 1070 1075 1080

Ala Arg Val Arg Ser Glu Leu Gly Phe Ala Gly Glu Asp Pro Ala 1085 1090 1095

Glu Met Glu Asp Met Phe Ala Leu Lys Tyr Arg Gly Ala Arg Phe 1100 1105 1110

Ser Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Pro Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys 1115 1120 1125

Ile Ala Ala Leu Leu Glu Pro Glu Arg Ile Gly Val His Leu Ser 1130 1135 1140

Glu Glu Phe Gln Leu His Pro Glu Gln Ser Thr Asp Ala Ile Val 1145 1150 1155

Ile His His Pro Glu Ala Lys Tyr Phe Asn Ala Arg 1160 1165 1170

<210> 30 <211> 1226 <212> PRT

<213> Escherichia coli <220>

<221> misc_ASPECTO

<223> metionina sintase dependente de cobalamina MetH

<400> 30

Ser Ser Lys Val Glu Gln Leu Arg Ala Gln Leu Asn Glu Arg Ile Leu 15 10 15

Val Leu Asp Gly Gly Met Gly Thr Met Ile Gln Ser Tyr Arg Leu Asn 20 25 30

Glu Ala Asp Phe Arg Gly Glu Arg Phe Ala Asp Trp Pro Cys Asp Leu 35 40 45

Lys Gly Asn Asn Asp Leu Leu Val Leu Ser Lys Pro Glu Val Ile Ala 50 55 60

Ala Ile His Asn Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Ile Ile Glu Thr 65 70 75 80

Asn Thr Phe Asn Ser Thr Thr Ile Ala Met Ala Asp Tyr Gln Met Glu 85 90 95

Ser Leu Ser Ala Glu Ile Asn Phe Ala Ala Ala Lys Leu Ala Arg Ala 100 105 110

Cys Ala Asp Glu Trp Thr Ala Arg Thr Pro Glu Lys Pro Arg Tyr Val 115 120 125

Ala Gly Val Leu Gly Pro Thr Asn Arg Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp 130 135 140

Val Asn Asp Pro Ala Phe Arg Asn Ile Thr Phe Asp Gly Leu Val Ala 145 150 155 160

Ala Tyr Arg Glu Ser Thr Lys Ala Leu Val Glu Gly Gly Ala Asp Leu 165 170 175

Ile Leu Ile Glu Thr Val Phe Asp Thr Leu Asn Ala Lys Ala Ala Val 180 185 190

Phe Ala Val Lys Thr Glu Phe Glu Ala Leu Gly Val Glu Leu Pro Ile 195 200 205

Met Ile Ser Gly Thr Ile Thr Asp Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser Gly 210 215 220

Gln Thr Thr Glu Ala Phe Tyr Asn Ser Leu Arg His Ala Glu Ala Leu 225 230 235 240

Thr Phe Gly Leu Asn Cys Ala Leu Gly Pro Asp Glu Leu Arg Gln Tyr 245 250 255

Val Gln Glu Leu Ser Arg Ile Ala Glu Cys Tyr Val Thr Ala His Pro 260 265 270

Asn Ala Gly Leu Pro Asn Ala Phe Gly Glu Tyr Asp Leu Asp Ala Asp 275 280 285

Thr Met Ala Lys Gln Ile Arg Glu Trp Ala Gln Ala Gly Phe Leu Asn 290 295 300

Ile Val Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr Pro Gln His Ile Ala Ala Met * 305 310 315 320

Ser Arg Ala Val Glu Gly Leu Ala Pro Arg Lys Leu Pro Glu Ile Pro 325 330 335

Val Ala Cys Arg Leu Ser Gly Leu Glu Pro Leu Asn Ile Gly Glu Asp 5 340 345 350

Ser Leu Phe Val Asn Val Gly Glu Arg Thr Asn Val Thr Gly Ser Ala 355 360 365

Lys Phe Lys Arg Leu Ile Lys Glu Glu Lys Tyr Ser Glu Ala Leu Asp 370 375 380

Val Ala Arg Gln Gln Val Glu Asn Gly Ala Gln Ile Ile Asp Ile Asn 385 390 395 400

Met Asp Glu Gly Met Leu Asp Ala Glu Ala Ala Met Val Arg Phe Leu 405 410 415

Asn Leu Ile Ala Gly Glu Pro Asp Ile Ala Arg Val Pro Ile Met Ile 420 425 430

Asp Ser Ser Lys Trp Asp Val Ile Glu Lys Gly Leu Lys Cys Ile Gln 435 440 445

Gly Lys Gly Ile Val Asn Ser Ile Ser Met Lys Glu Gly Val Asp Ala 450 455 460

Phe Ile His His Ala Lys Leu Leu Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Val Val 465 470 475 480

Val Met Ala Phe Asp Glu Gln Gly Gln Ala Asp Thr Arg Ala Arg Lys 485 490 495

Ile Glu Ile Cys Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Thr Glu Glu Val Gly 500 505 510

Phe Pro Pro Glu Asp Ile Ile Phe Asp Pro Asn Ile Phe Ala Val Ala 515 520 525

Thr Gly Ile Glu Glu His Asn Asn Tyr Ala Gln Asp Phe Ile Gly Ala 530 535 540

Cys Glu Asp Ile Lys Arg Glu Leu Pro His Ala Leu Ile Ser Gly Gly 545 550 555 560

Val Ser Asn Val Ser Phe Ser Phe Arg Gly Asn Asp Pro Val Arg Glu 565 570 575

Ala Ile His Ala Val Phe Leu Tyr Tyr Ala Ile Arg Asn Gly Met Asp 580 585 590

Met Gly Ile Val Asn Ala Gly Gln Leu Ala Ile Tyr Asp Asp Leu Pro 595 600 605

Ala Glu Leu Arg Asp Ala Val Glu Asp Val Ile Leu Asn Arg Arg Asp 610 615 620

Asp Gly Thr Glu Arg Leu Leu Glu Leu Ala Glu Lys Tyr Arg Gly Ser 625 630 635 640

Lys Thr Asp Asp Thr Ala Asn Ala Gln Gln Ala Glu Trp Arg Ser Trp

645 650 655

Glu Val Asn Lys Arg Leu Glu Tyr Ser Leu Val Lys Gly Ile Thr Glu 660 665 670

Phe Ile Glu Gln Asp Thr Glu Glu Ala Arg Gln Gln Ala Thr Arg Pro 675 680 685

Ile Glu Val Ile Glu Gly Pro Leu Met Asp Gly Met Asn Val Val Gly 690 695 700

Asp Leu Phe Gly Glu Gly Lys Met Phe Leu Pro Gln Val Val Lys Ser 705 710 715 720

Ala Arg Val Met Lys Gln Ala Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Ile Glu

725 730 735

Ala Ser Lys Glu Gln Gly Lys Thr Asn Gly Lys Met Val Ile Ala Thr 740 745 750

Val Lys Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Ile Val Gly Val Val 755 760 765

Leu Gln Cys Asn Asn Tyr Glu Ile Val Asp Leu Gly Val Met Val Pro 770 775 780

Ala Glu Lys Ile Leu Arg Thr Ala Lys Glu Val Asn Ala Asp Leu Ile 785 790 795 800

Gly Leu Ser Gly Leu Ile Thr Pro Ser Leu Asp Glu Met Val Asn Val

805 810 815

Aia Lys Glu Met Glu Arg Gln Gly Phe Thr Ile Pro Leu Leu Ile Gly * 820 825 830

Gly Ala Thr Thr Ser Lys Ala His Thr Ala Val Lys Ile Glu Gln Asn 835 840 845

Tyr Ser Gly Pro Thr Val Tyr Val Gln Asn Ala Ser Arg Thr Val Gly 5 850 855 860

Val Val Ala Ala Leu Leu Ser Asp Thr Gln Arg Asp Asp Phe Val Ala 865 870 875 880

Arg Thr Arg Lys Glu Tyr Glu Thr Val Arg Ile Gln His Gly Arg Lys 885 890 895

Lys Pro Arg Thr Pro Pro Val Thr Leu Glu Ala Ala Arg Asp Asn Asp 900 905 910

Phe Ala Phe Asp Trp Gln Ala Tyr Thr Pro Pro Val Ala His Arg Leu 915 920 925

Gly Val Gln Glu Val Glu Ala Ser Ile Glu Thr Leu Arg Asn Tyr Ile 930 935 940

Asp Trp Thr Pro Phe Phe Met Thr Trp Ser Leu Ala Gly Lys Tyr Pro 945 950 955 960

Arg Ile Leu Glu Asp Glu Val Val Gly Val Glu Ala Gln Arg Leu Phe 965 970 975

Lys Asp Ala Asn Asp Met Leu Asp Lys Leu Ser Ala Glu Lys Thr Leu 980 985 990

Asn Pro Arg Gly Val Val Gly Leu Phe Pro Ala Asn Arg Val Gly Asp 995 1000 1005

Asp Ile Glu Ile Tyr Arg Asp Glu Thr Arg Thr His Val Ile Asn 1010 1015 1020

Val Ser His His Leu Arg Gln Gln Thr Glu Lys Thr Gly Phe Ala 1025 1030 1035

Asn Tyr Cys Leu Ala Asp Phe Val Ala Pro Lys Leu Ser Gly Lys 1040 1045 1050

Ala Asp Tyr Ile Gly Ala Phe Ala Val Thr Gly Gly Leu Glu Glu 1055 1060 1065

Asp Ala Leu Ala Asp Ala Phe Glu Ala Gln His Asp Asp Tyr Asn 1070 1075 1080

Lys Ile Met Val Lys Ala Leu Ala Asp Arg Leu Ala Glu Ala Phe 1085 1090 1095

Ala Glu Tyr Leu His Glu Arg Val Arg Lys Val Tyr Trp Gly Tyr

1100 1105 1110

Ala Pro Asn Glu Asn Leu Ser Asn Glu Glu Leu Ile Arg Glu Asn 1115 1120 1125

Tyr Gln Gly Ile Arg Pro Ala Pro Gly Tyr Pro Ala Cys Pro Glu 1130 1135 1140

His Thr Glu Lys Ala Thr Ile Trp Glu Leu Leu Glu Val Glu Lys 1145 1150 1155

His Thr Gly Met Lys Leu Thr Glu Ser Phe Ala Met Trp Pro Gly 1160 1165 1170

Ala Ser Val Ser Gly Trp Tyr Phe Ser His Pro Asp Ser Lys Tyr 1175 1180 1185

Tyr Ala Val Ala Gln Ile Gln Arg Asp Gln Val Glu Asp Tyr Ala 1190 1195 1200

Arg Arg Lys Gly Met Ser Val Thr Glu Val Glu Arg Trp Leu Ala 1205 1210 1215

Pro Asn Leu Gly Tyr Asp Ala Asp 1220 1225

<210> 31 <211> 768 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <4 00> 31

Met Arg Asn Arg Arg Glu Val Ser Lys Leu Leu Ser Glu Arg Val Leu 15 10 15

Leu Leu Asp Gly Ala Tyr Gly Thr Glu Phe Met Lys Tyr Gly Tyr Asp

20 25 30

Asp Leu Pro Glu Glu Leu Asn Ile Lys Ala Pro Asp Val Val Leu Lys 35 40 45 * Val His Arg Ser Tyr Ile Glu Ser Gly Ser Asp Val Ile Leu Thr Asn

50 55 60

Thr Phe Gly Ala Thr Arg Met Lys Leu Arg Lys His Gly Leu Glu Asp 65 70 75 80

5 Lys Leu Asp Pro Ile Val Arg Asn Ala Val Arg Ile Ala Arg Arg Ala

85 90 95

Ala Gly Glu Lys Leu Val Phe Gly Asp Ile Gly Pro Thr Gly Glu Leu 100 105 HO

Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Thr Leu Phe Glu Glu Phe Tyr Glu Asn Phe 115 120 125

Arg Glu Thr Val Glu Ile Met Val Glu Glu Gly Val Asp Gly Ile Ile 130 135 140

Phe Glu Thr Phe Ser Asp Ile Leu Glu Leu Lys Ala Ala Val Leu Ala 145 150 155 160

Ala Arg Glu Val Ser Arg Asp Val Phe Leu Ile Ala His Met Thr Phe

165 170 175

Asp Glu Lys Gly Arg Ser Leu Thr Gly Thr Asp Pro Ala Asn Phe Ala 180 185 190

Ile Thr Phe Asp Glu Leu Asp Ile Asp Ala Leu Gly Ile Asn Cys Ser 195 200 205

Leu Gly Pro Glu Glu Ile Leu Pro Ile Phe Gln Glu Leu Ser Gln Tyr 210 215 220

Thr Asp Lys Phe Leu Val Val Glu Pro Asn Ala Gly Lys Pro Ile Val 225 230 235 240

Glu Asn Gly Lys Thr Val Tyr Pro Leu Lys Pro His Asp Phe Ala Val

245 250 255

His Ile Asp Ser Tyr Tyr Glu Leu Gly Val Asn Ile Phe Gly Gly Cys 260 265 270

Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Val Lys Leu Phe Arg Lys Val Leu Gly 275 280 285

Asn Arg Lys Pro Leu Gln Arg Lys Lys Lys Arg Ile Phe Ala Val Ser 290 295 300 Ser Pro Ser Lys Leu Val Thr Phe Asp His Phe Val Val Ile Gly Glu 305 310 315 320

Arg Ile Asn Pro Ala Gly Arg Lys Lys Leu Trp Ala Glu Met Gln Lys 325 330 335

Gly Asn Glu Glu Ile Val Ile Lys Glu Ala Lys Thr Gln Val Glu Lys 340 345 350

Gly Ala Glu Val Leu Asp Val Asn Phe Gly Ile Glu Ser Gln Ile Asp 355 360 365

Val Arg Tyr Val Glu Lys Ile Val Gln Thr Leu Pro Tyr Val Ser Asn 370 375 380

Val Pro Leu Ser Leu Asp Ile Gln Asn Val Asp Leu Thr Glu Arg Ala 385 390 395 400

Leu Arg Ala Tyr Pro Gly Arg Ser Leu Phe Asn Ser Ala Lys Val Asp 405 410 415

Glu Glu Glu Leu Glu Met Lys Ile Asn Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Gly 420 425 430

Thr Leu Ile Val Leu Leu Met Gly Lys Asp Val Pro Lys Ser Phe Glu 435 440 445

Glu Arg Lys Glu Tyr Phe Glu Lys Ala Leu Lys Ile Leu Glu Arg His 450 455 460

Asp Phe Ser Asp Arg Val Ile Phe Asp Pro Gly Val Leu Pro Leu Gly 465 470 475 480

Ala Glu Gly Lys Pro Val Glu Val Leu Lys Thr Ile Glu Phe Ile Ser 485 490 495

Ser Lys Gly Phe Asn Thr Thr Val Gly Leu Ser Asn Leu Ser Phe Gly 500 505 510

Leu Pro Asp Arg Ser Tyr Tyr Asn Thr Ala Phe Leu Val Leu Gly Ile 515 520 525

Ser Lys Gly Leu Ser Ser Ala Ile Met Asn Pro Leu Asp Glu Thr Leu 530 535 540

Met Lys Thr Leu Asn Ala Thr Leu Val Ile Leu Glu Lys Lys Glu Leu 545 550 555 560 Pro Arg Ala Glu Val Lys Glu Glu Lys Leu Val Glu Ile Ile Leu Ser 565 570 575

Gly Asn Arg Ser Glu Leu Glu Lys Leu Val Glu Asp Phe Leu Lys Glu 580 585 590

Lys Asp Pro Leu Ser Val Ile Glu Glu His Leu Arg Pro Ala Met Glu 595 600 605

Arg Ile Gly Glu Leu Tyr Asp Lys Gly Lys Ile Phe Leu Pro Gln Leu 610 615 620

Ile Leu Ala Ala Gln Thr Val Lys Pro Val Phe Asp Lys Leu Thr Ser 625 630 635 640

Met Leu Pro Ser Asp Ser Gln Gly Glu Thr Phe Val Ile Ala Thr Val 645 650 655

Lys Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Ile Val Ala Ser Val Ile 660 665 670

Arg Ser Ser Gly Tyr Arg Val Val Asp Leu Gly Lys Asp Val Asp Thr 675 680 685

Ser Glu Ile Val Glu Ala Val Glu Lys Glu Arg Pro Val Ala Leu Gly 690 695 700

Leu Ser Ala Met Met Thr Thr Thr Val Gly Arg Ile Lys Glu Val Val 705 710 715 720

Glu Lys Leu Lys Glu Lys Asn Leu Lys Ile Pro Val Ile Val Gly Gly 725 730 735

Ala Ser Leu Asn Glu Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ala Asp Tyr Tyr 740 745 750

Ala Lys Asn Ala Ser Glu Ala Val Lys Ile Leu Lys Ser Leu Gly Arg 755 760 765

<210> 32 <211> 1068 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> seqüência de consenso <220>

<22ι> misc^aspecto

<223> seqüência de consenso metH (de Corynebacterium glutamicum, Streptomyces coelicoior, Escherichia coli e Thermotoga marítima)

<4 00> 32

Ser Ser Thr Pro Ala Ser Lys Val Ser Glu Leu Arg Asp Ala Leu Ala 15 10 15

Glu Arg Val Leu Val Leu Asp Gly Ala Met Gly Thr Met Leu Gln Ala 20 25 30

Tyr Leu Asp Leu Asp Asp Phe Asp Leu Glu Gly Cys Asn Glu He Leu 35 40 45

Asn Leu Thr Arg Pro Asp Val Val Arg Ala He His Arg Ala Tyr Phe 50 55 60

Glu Ala Gly Ala Asp He He Glu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Thr Ile 65 70 75 80

Ala Leu Ala Asp Tyr Asp He Glu Asp Arg Leu Glu He Ala Phe Ala 85 90 95

Ala Ala Arg Val Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Phe Gly Ala Arg Gly 100 105 110

Lys Arg Phe Val Leu Gly Ser Leu Gly Pro Thr Thr Lys Leu Pro Ser 115 120 125

Leu Gly His Ala Pro Phe Asp Asp Leu Arg Glu Ala Tyr Arg Glu Ser 130 135 140

Ala Glu Gly Leu Val Glu Gly Gly Ala Asp Ala He Leu He Glu Thr 145 150 155 160

Gln Asp Leu Leu Gln Leu Lys Ala Ala Val Leu Ala Val Arg Ala Leu 165 170 175

Asp Glu Leu Gly Leu Asp Leu Pro He He He Ser Val Thr Val Glu

180 185 190

Thr Thr Gly Thr Met Leu Ser Gly Ser Glu He Gly Ala Phe Leu Thr 195 200 205 Ala Leu Asp Pro Leu Gly He Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala Thr 210 215 220

Gly Pro Asp Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Arg His Ala 225 230 235 240

Asp Ile Pro Leu Thr Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu Gly

245 250 255

Lys Gly Ala Glu Tyr Pro Leu Asp Ala Asp Asp Leu Ala Ala Ile Asp 260 265 270

Ser Phe Val Glu Tyr Gly Leu Ser Ile Val Gly Gly Cys Cys Gly Thr 275 280 285

Thr Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Lys Ala Val Gly Leu Ala Pro 290 295 300

Ala Arg Asp Lys Pro Glu Ile Ala Ser Leu Tyr Ser Pro Val Pro Leu 305 310 315 320

Gln Asp Thr Phe Val Met Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ala Asn Gly Ser

325 330 335

Lys Lys Phe Arg Glu Ala Met Leu Asp Gly Lys Trp Glu Asp Cys Val 340 345 350

Asp Ile Ala Lys Gln Gln Val Arg Asp Gly Ala His Met Leu Asp Leu 355 360 365

Asn Val Asp Tyr Val Gly Arg Asp Gly Val Ala Asp Met Glu Lys Leu 370 375 380

Ala Asn Leu Leu Ala Thr Ala Ser Thr Leu Pro Ile Met Ile Asp Ser 385 390 395 400

Thr Glu Val Asp Val Ile Arg Lys Gly Leu Glu Leu Gly Gly Arg Ser

405 410 415

Ile Val Asn Ser Val Asn Val Glu Asp Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg 420 425 430

Phe Arg Ile Ile Lys Leu Leu Lys Lys His Gly Ala Ala Leu Ile Val 435 440 445

Leu Thr Ile Asp Glu Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu Lys Lys Val Glu 450 455 460 Ile Ala Glu Arg Leu Ile Lys Ile Leu Thr Gly Trp Gly Ile Asp Asp 465 470 475 480

Ile Ile Val Asp Pro Leu Thr Phe Pro Ile Ala Thr Gly Gln Glu Glu 485 490 495

Ser Arg Lys Asp Gly Ile Glu Thr Ile Glu Ala Ile Arg Glu Ile Lys 500 505 510

Arg Lys His Pro Asp Ile Asn Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile Ser 515 520 525

Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Leu Leu Asn Ser Val Phe Leu Glu 530 535 540

Cys Ile Lys Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Val Asn Ala Ser Lys Ile 545 550 555 560

Leu Pro Met Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Asp Ala Leu Asp Leu Ile 565 570 575

Tyr Asp Arg Arg Glu Gly Tyr Asp Pro Leu Gln Glu Leu Met Gln Leu 580 585 590

Phe Glu Gly Ala Ser Ala Asp Lys Ala Lys Ala Glu Glu Leu Arg Ala 595 600 605

Leu Pro Leu Glu Glu Arg Leu Arg Ile Ile Asp Gly Asp Lys Asn Gly 610 615 620

Leu Glu Gln Asp Leu Glu Glu Ala Leu Lys Glu Lys Ser Pro Ile Glu 625 630 635 640

Ile Ile Asn Glu Leu Leu Asp Gly Met Lys Val Val Gly Glu Leu Phe 645 650 655

Gly Ser Gly Gln Met Gln Leu Pro Gln Val Leu Gln Ser Ala Glu Val 660 665 670

Met Lys Thr Ala Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Met Glu Ala Ser Ala 675 680 685

Glu Ala Gly Lys Gly Thr Ile Val Ile Ala Thr Val Lys Gly Asp Val 690 695 700

His Asp Ile Gly Lys Asn Ile Val Asp Ile Ile Leu Ser Asn Asn Gly 705 710 715 720 * Tyr Asp Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Val Pro Leu Ser Ala Ile Leu

725 730 735

Glu Ala Ala Glu Glu His Arg Ala Asp Val Ile Gly Leu Ser Gly Leu 740 745 750

5 Leu Val Lys Ser Thr Val Ile Met Lys Glu Val Leu Glu Glu Leu Asn 755 760 765

Asn Ala Ala Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly Ala Ala Leu Thr Arg Ala 770 775 780

Tyr Val Glu Asn Asp Leu Glu Ile Tyr Ser Gly Glu Val Tyr Tyr Ala 785 790 795 800

Arg Asn Ala Ser Glu Gly Leu Arg Leu Met Asp Ala Leu Ile Ala Asp 805 810 815

Lys Arg Gly Asp Ser Pro Glu Ala Lys Lys Glu Arg Lys Arg Arg Ala 820 825 830

Ala Thr Leu Glu Ala Pro Asp Arg Ser Asp Val Ala Thr Asp Asn Pro 835 840 845

Pro Pro Phe Gly Thr Arg Val Val Lys Gly Ile Leu Glu Phe Leu Asn 850 855 860

Leu Asp Glu Ala Leu Phe Gly Gln Trp Gly Leu Lys Arg Glu Gly Pro 865 870 875 880

Ser Tyr Glu Asp Leu Val Glu Ser Glu Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu 885 890 895

Asp Arg Leu Ser Asp Leu Leu Ala Leu Val Tyr Gly Tyr Phe Pro Ala 900 905 910

Val Ala Gly Asp Asp Ile Ile Ile Leu Asp Asp Asp Glu Arg Met Arg 915 920 925

Phe Ser Phe Pro Arg Gln Arg Gly Arg Leu Cys Leu Ala Asp Phe Ile 930 935 940

Arg Pro Lys Glu Gly Asp Val Ile Gly Phe Gln Leu Val Thr Met Gly 945 950 955 960

Ile Ala Asp Ala Leu Phe Ala Ala Asn Asp Tyr Arg Asp Tyr Leu Glu 965 970 975 Val His Gly Leu Ala Val Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp 980 985 990

His Ala Arg Val Arg Ser Glu Leu Ala Asp Pro Asp Glu Asp Leu Phe 995 1000 1005

Leu Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Gly Tyr Gly Ala Cys Pro Asp 1010 1015 1020

Leu Glu Asp Arg Ala Lys Ile Glu Leu Leu Glu Pro Glu Arg Ile 1025 1030 1035

Gly Val Leu Ser Glu Glu Phe Gln Leu His Pro Glu Gln Ser Thr 1040 1045 1050

Asp Ala Phe Val Ile His His Pro Glu Ala Lys Tyr Phe Asn Val 1055 1060 1065

Claims (27)

1. Seqüência nucleotídica codificando pelo menos um polipeptí- deo que é uma metionina sintase dependente de cobalamina enzimatica- mente ativa ou um fragmento funcional da mesma tendo a propriedade de inibição reduzida de produto por metionina.

2. Seqüência nucleotídica de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo codificado carrega pelo menos uma mutação em sua se- qüência de aminoácido comparada com a seqüência de aminoácido de tipo selvagem de modo que a atividade enzimática da referida metionina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou do referido fragmento funcional é inibida por metionina em uma extensão menor do que a atividade enzimática de uma metionina sintase dependente de cobalamina enzimati- camente ativa ou fragmento funcional que carrega a seqüência de aminoáci- do do tipo selvagem.

3. Seqüência nucleotídica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida metionina sintase dependente de cobalamina enzimatica- mente ativa ou fragmento funcional da mesma tendo a propriedade de inibi- ção reduzida de produto por metionina carrega a mutação em seu domínio de ligação de homocisteína.

4. Seqüência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, selecionada dentre o grupo de seqüências de DNA consistindo em: a) seqüências de DNA compreendendo a seqüência nucleotídica codifi- cando pelo menos uma metionina sintase dependente de cobalamina enzi- maticamente ativa ou fragmento funcional da mesma tendo a propriedade de inibição reduzida de produto por metionina que carrega pelo menos uma mu- tação em SEQ ID No. 1. b) seqüências de DNA compreendendo a seqüência nucleotídica carre- gando a mutação em SEQ ID No 23. c) seqüência de DNA que é pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de DNA de a) ou b) d) seqüência de DNA ou pelo menos uma parte da mesma que hibridiza sob condições estringentes em uma seqüência nucleotídica de a), b) ou c).

5. Seqüência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, selecionada dentre o grupo consistindo em: a) seqüência de DNA compreendendo a seqüência nucleotídica codifi- cando pelo menos uma metionina sintase dependente de cobalamina enzi- maticamente ativa ou fragmento funcional da mesma tendo a propriedade de inibição reduzida de produto por metionina que carrega pelo menos uma mu- tação em SEQ ID No. 2. b) seqüências de DNA compreendendo a seqüência nucleotídica carre- gando a mutação em SEQ ID No 24. c) seqüência de DNA que é pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de DNA de a) ou b) d) seqüência de DNA ou pelo menos uma parte da mesma que hibridiza sob condições estringentes em uma seqüência nucleotídica de a), b) ou c).

6. Seqüência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, codificando pelo menos uma metionina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou fragmento funcional da mesma tendo a proprieda- de de inibição reduzida de produto por metionina que carrega pelo menos uma mutação em uma seqüência selecionada dentre o grupo de SEQ IDs No. 3 a 18.

7. Seqüência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6, codificando pelo menos uma metionina sintase dependente de cobalamina enzimaticamente ativa ou fragmento funcional da mesma que carrega pelo menos uma mutação em uma posição correspondendo a M33, F86 ou S134 deSEQIDNo.1.

8. Seqüência de DNA de acordo com a reivindicação 7, em que M33 ou aminoácido correspondente é mudado em G ou A, F86 ou o amino- ácido correspondente é mudado em L, e S 134 ou o aminoácido correspon- dente é mudado em N.

9. Seqüência de DNA de acordo com a reivindicação 8, codifi- cando um polipeptídeo de acordo com SEQ ID Nos. 19, 20, 21 ou 22.

10. Seqüência de DNA de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 9, em que a atividade enzimática da metionina sintase depen- dente de cobalamina enzimaticamente ativa codificada ou um fragmento funcional da mesma tendo uma propriedade de inibição reduzida de produto por metionina é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 100% e preferivelmente pelo menos um fator de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50,100 ou 1000 menos inibida na presença de metionina comparada a uma me- tionina sintase dependente de cobalamina de tipo selvagem correspondente.

11. Vetor compreendendo em direção 5' a 3': a) um promotor que é funcional para expressão de seqüências nucleotí- dicas em uma célula hospedeira b) operativamente ligado ao mesmo uma seqüência nucleotídica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, c) uma seqüência de terminação.

12. Polipeptídeo codificado por uma seqüência nucleotídica co- mo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

13. Célula hospedeira compreendendo uma seqüência nucleotí- dica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, em que a célula hospedeira é um micro-organismo que é preferivelmente seleciona- do dentre o grupo consistindo em C. glutamicum, E. coli, S. coei e T. maríti- ma.

15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, em que o micro-organismo é selecionado dentre o grupo consistindo em Corynebac- terium glutamicum (ATCC 13032), Corynebacterium acetoglutamicum (ATCC15806), Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC 13870), Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539), Corynebacterium melassecola (ATCC17965), Corynebacterium glutamicum (KFCC10065), Corynebaeterium glu- tamicum (DSM 17322), Corynebacterium efficiens (YS-314) e Corynebacte- rium glutamicum (ATCC21608).

16. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 15, em que o(s) gene(s) endógeno(s) para metionina sinteta- se(s) dependente(s) de cobalamina é (são) deletado(s) ou funcionalmente rompido(s).

17. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 16, em que a quantidade e/ou a atividade de pelo menos uma das seguintes seqüências nucleotídicas é aumentada em comparação com o organismo hospedeiro iniciai correspondente: • seqüência nucleotídica codificando para aspartato quinase IysC, • seqüência nucleotídica codificando para glicerina aldeído-3-fosfato desidrogenase gap, • seqüência nucleotídica codificando para 3-fosfatoglicerato quinase pgk, • seqüência nucleotídica codificando para piruvatocarboxilase pyc, • seqüência nucleotídica codificando para triosefosfato isomerase tpi, • seqüência nucleotídica codificando para homosserina-O- acetiltransferase metA, • seqüência nucleotídica codificando para cistationa-gama-sintase metB, • seqüência nucleotídica codificando para cistationa-gama-liase metC, · seqüência nucleotídica codificando para serina-hidroximetil trans- ferase glyA, • seqüência nucleotídica codificando para O-acetil-homosserina- sulfidrilase metY, • seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina amino- transferase serC, • seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina-fosfatase serB, seqüência nucleotídica codificando para serina acetiltransferase cysE, • seqüência nucleotídica codificando para homosserina- desidrogenase hom, · seqüência nucleotídica codificando para metionina sintase metE, • seqüência nucleotídica codificando para fosfatoadenosina- fosfatossulfato-redutase cysH, • seqüência nucleotídica codificando para sulfato adenilil transfera- se-subunidade I, · seqüência nucleotídica codificando para CysN-sulfato adenilil transferase-subunidade 2, • seqüência nucleotídica codificando para ferredoxina-NADP- redutase, • seqüência nucleotídica codificando para ferredoxina, · seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato- desidrogenase, e/ou • seqüência nucleotídica codificando para frutose-1-6-bisfosfatase.

18. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 17, em que a quantidade e/ou a atividade de pelo menos uma das seguintes seqüências nucleotídicas é reduzida em comparação com o organismo hospedeiro inicial correspondente: • seqüência nucleotídica codificando para homosserina quinase thrB, • seqüência nucleotídica codificando para treonina desidratase ilvA, • seqüência nucleotídica codificando para treonina sintase thrC, • seqüência nucleotídica codificando para meso-diaminopimelato- D-desidrogenase ddh, • seqüência nucleotídica codificando para fosfoenolpiruvato car- bóxi quinase pck, • seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato-6- isomerase pgi, • seqüência nucleotídica codificando para piruvato-oxidase poxB, • seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato sin- tase dapA, • seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato re- dutase dapB, • seqüência nucleotídica codificando para diaminopicolinato- descarboxilase IysA1 • seqüência nucleotídica codificando para glicosil transferase e/ou • seqüência nucleotídica codificando para Iactato hidrogenase.

19. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 18, em que eficiência de produções de metionina é aumentada por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 100% e preferivelmente pelo menos um fator de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100 ou 1000 em comparação com uma célula hospedeira inicial em que nenhuma se- quência como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, é ex- pressada.

20. Método de produzir metionina em um organismo hospedeiro, em que a seqüência nucleotídica como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 11, é expressada em um organismo hospedeiro.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o orga- nismo hospedeiro é um micro-organismo que é preferivelmente selecionado dentre o grupo consistindo em C. glutamicum, E. coli, S. coei e T. marítima.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o micro- organismo é selecionado dentre o grupo consistindo em Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032), Corynebacterium acetoglutamicum (ATCC 15806), Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC 13870), Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539), Corynebacterium melassecola (ATCC 17965), Corynebacterium glutamicum (KFCC10065), Corynebacterium glu- tamicum (DSM 17322), Corynebacterium efficiens (YS-314) e Corynebacte- rium glutamicum (ATCC21608).

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, compreendendo as seguintes etapas: a) transfectar um vetor como definido na reivindicação 11, em uma célula hospedeira, b) cultivar as células hospedeiras e opcionalmente 5 c) recuperar metionina.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, em que o(s) gene(s) endógeno(s) para metionina sintetase(s) dependente(s) de cobalamina é (são) deletado(s) ou funcionalmente rompido(s).

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, em que a quantidade e/ou a atividade de pelo menos uma das seguin- tes seqüências nucleotídicas é aumentada em comparação com o organis- mo hospedeiro inicial correspondente: • seqüência nucleotídica codificando para aspartato quinase IysC, · seqüência nucleotídica codificando para glicerina aldeído-3-fosfato desidrogenase gap, • seqüência nucleotídica codificando para 3-fosfatoglicerato quinase pgk> • seqüência nucleotídica codificando para piruvatocarboxilase pyc, · seqüência nucleotídica codificando para triosefosfato isomerase tpi, • seqüência nucleotídica codificando para homosserina-O- acetiltransferase metA, • seqüência nucleotídica codificando para cistationa-gama-sintase metB, • seqüência nucleotídica codificando para cistationa-gama-liase metC, • seqüência nucleotídica codificando para serina-hidroximetil trans- ferase glyA, · seqüência nucleotídica codificando para O-acetil-homosserina- sulfidrilase metY, • seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina amino- transferase serC, • seqüência nucleotídica codificando para fosfatosserina-fosfatase serB, • seqüência nucleotídica codificando para serina acetiltransferase cysE, • seqüência nucleotídica codificando para homosserina- desidrogenase hom, • seqüência nucleotídica codificando para metionina sintase metE, • seqüência nucleotídica codificando para fosfatoadenosina- fosfatossulfato-redutase cysH, • seqüência nucleotídica codificando para sulfato adenilil transfera- se-subunidade I, • seqüência nucleotídica codificando para CysN-sulfato adenilil transferase-subunidade 2, · seqüência nucleotídica codificando para ferredoxina-NADP- redutase, • seqüência nucleotídica codificando para ferredoxina, • seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato- desidrogenase, e/ou · seqüência nucleotídica codificando para frutose-1-6-bisfosfatase.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, em que a quantidade e/ou a atividade de pelo menos uma das seguin- tes seqüências nucleotídicas é reduzida em comparação com o organismo hospedeiro inicial correspondente: · seqüência nucleotídica codificando para homosserina quinase thrB, • seqüência nucleotídica codificando para treonina desidratase ilvA, • seqüência nucleotídica codificando para treonina sintase thrC, · seqüência nucleotídica codificando para meso-diaminopimelato- D-desidrogenase ddh, • seqüência nucleotídica codificando para fosfoenolpiruvato car- bóxi quinase pck, • seqüência nucleotídica codificando para glicose-6-fosfato-6- isomerase pgi, • seqüência nucleotídica codificando para piruvato-oxidase poxB, · seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato sin- tase dapA, • seqüência nucleotídica codificando para di-hidrodipicolinato re- dutase dapB, • seqüência nucleotídica codificando para diaminopicolinato- descarboxilase IysA1 • seqüência nucleotídica codificando para glicosil transferase e/ou • seqüência nucleotídica codificando para Iactato hidrogenase.

27. Uso de seqüências nucleotídicas como definidas em qual- quer uma das reivindicações 1 a 11, para produzir metionina.