ES2357366T3 - Procedimientos de purificación de adenovirus. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de purificar partículas de adenovirus a partir de una preparación de cultivos celulares que comprende: a) lisar células dentro de la preparación de cultivo celular; b) aclarar el lisado que contiene las partículas adenovirales; c) tratar el lisado aclarado con nucleasa; y d) someter el lisado aclarado y tratado con nucleasa a cromatografía de intercambio aniónico; en el que los tampones usados en la cromatografía de intercambio aniónico comprenden un tensioactivo no iónico.
Description
Procedimientos de purificación de
adenovirus.
Esta solicitud reivindica beneficio, de
conformidad con 35 U.S.C. \NAK119(e), a la solicitud
provisional de los Estados Unidos 60/380,322, presentada el 14 de
mayo de 2.002.
No Aplicable.
No Aplicable.
La presente invención se refiere a
procedimientos de purificar partículas virales, especialmente
partículas de vectores de adenovirus recombinantes. Este
procedimiento se desarrolla para purificar adenovirus a partir de
lisado celular. Ello usa una combinación de precipitación selectiva,
filtración en profundidad y/o centrifugación, ultrafiltración,
digestión con nucleasas y cromatografía para producir producto
altamente purificado de forma sólida y económica.
Es este procedimiento, los niveles de DNA
huésped contaminante se reducen consistentemente a menos del límite
de cuantificación de un ensayo basado en PCR específico para DNA
humano (< 5 pg/10^{11} pv).
Los avances en las áreas del uso de los vectores
virales recombinantes para aplicaciones de terapia génica y
vacunación de DNA han creado una necesidad para elaboración y
purificación a gran escala de virus de calidad clínica. Una familia
tal de virus son los adenovirus. Los adenovirus se agrupan dentro de
la familia Adenoviridae, que se dividen entre el género
Aviadenovirus (de aves) y Mastadenovirus (de seres
humanos, de simios, bovinos, equinos, porcinos, ovinos, caninos y de
zarigüeyas). Una revisión de la familia Adenoviridae se puede
encontrar en Fundamental Biology, 3ª ed., Fields, B.N., Knipe, D.M.
y Howley, P.M., Ed., en el capítulo 30, páginas
979-1016 (1996), que se incorpora por la presente
mediante referencia. De interés específico en las aplicaciones de
vacunación génica y/o de terapia génica es el uso de un adenovirus
incompetente en replicación de primera generación (FG), hecho
defectivo por las deleciones de genes E1 y/o E1/E3, en base al
serotipo de adenovirus. Los adenovirus tienen un tropismo celular
amplio que incluye células que presentan antígenos especializadas
tales como macrófagos y células dendríticas, pueden infectar (si no
se replican en ellas) células de la mayoría de las especies
animales, y pueden producirse en grandes cantidades en líneas
celulares humanas apropiadas designadas para proporcionar el
producto del gen E1 in trans.
El genoma de adenovirus está generalmente
asociado a patologías benignas en seres humanos y la organización
genómica del virus se ha estudiado bien desde su descubrimiento en
los primeros años 50. Además, el genoma es susceptible de
manipulación, dependiendo de la estrategia usada para construir el
vector respectivo. Un virus de replicación incompetente (tal como un
vector Ad5gag en el que se han eliminado E1/E3 que expresa un
transgén gag del VIH, como se ejemplifica en el presente documento)
requiere una línea celular que complementa las deleciones. Cualquier
línea celular tal se puede usar para generar vectores virales
recombinantes, con líneas celulares preferidas, pero no limitantes,
que incluyen células 293 y células PER.C6^{TM}. Para este fin, se
han descrito numerosos vectores de adenovirus recombinantes de 1ª
generación en la bibliografía (por ejemplo, véase Bett, y col.,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8802-8806;
documentos WO 01/02607 y WO 02/22080). Los vectores adenovirales
"Cobardes" son un vector adenoviral de 2ª generación
generalmente desprovisto de secuencias codificantes de proteínas
víricas, frecuentemente con proteínas virales suplementadas in
trans por un virus coadyuvante (a menudo un adenovirus del que
se ha eliminado E1) cultivado con el adenovector dependiente de
adyuvante (HD) en una línea celular que lo envuelve (por
ejemplo, PER.C6^{TM}). Ausentes las proteínas virales, estos
vectores virales pueden, con carácter alternativo, suplementarse
in trans por una línea celular y/o "virus coadyuvante"
capaz de expresar las proteínas adenovirales estructurales y
funcionales necesarias para replicación, envoltura y rescate
exitoso. En vista de la mayor popularidad de estos vectores virales
y de la necesidad última para preparar cantidades a escala comercial
bien de una vacuna basada en virus o bien de un vehículo de terapia
génica, ha llegado a ser esencial para crear procedimientos
económicos y escalables de producción y purificación.
Los primeros informes de purificación
cromatográfica de adenovirus a pequeña escala se comunicaron en los
últimos años 50 y en los primeros años 60 (por ejemplo, véase
Klemperer y Pereira 1959, Virology 9: 536-545;
Philipson, 1960, Virology 10: 459-465; Haruna, y
col, 1961, Virology: 13 264-267), pero se
reemplazaron por centrifugación en un gradiente de CsCl. En la
última década la purificación cromatográfica de los adenovirus se ha
comunicado de nuevo.
\newpage
La Patente de los Estados Unidos N.º 5,837,520
(véase también Huyghe y col., 1995, Human Gene Therapy 6:
1403-1416) revela un procedimiento de purificar
adenovirus que comprende tratar el lisado celular con una nucleasa,
seguida por (1) intercambio aniónico y (2) cromatografía de iones
metálicos.
La Patente de los Estados Unidos 6,261,823
revela un procedimiento de purificar adenovirus que comprende
someter una preparación vírica a cromatografía de intercambio
aniónico seguida por cromatografía de exclusión por tamaño.
La Patente de los Estados Unidos 6,194,191
describe procedimientos de purificar adenovirus usando velocidades
de perfusión baja durante el cultivo celular, una etapa de lisis por
detergente, y/o una etapa de cromatografía individual.
Shabram y col., 1997 (Human Gene Therapy 8:
453-465) revela un procedimiento para medir la
concentración de Ad5 con cromatografía de intercambio aniónico
analítica.
A pesar de estas comunicaciones y otras,
persiste la necesidad de desarrollar un procedimiento a gran escala
para purificación de vectores virales generados dentro de sistemas
de cultivo de células huésped que trate tanto los asuntos
cuantitativos como los cualitativos que se imponen en una vacuna o
producto de terapia génica comercializado.
La presente invención se refiere a
procedimientos de purificar partículas virales. Pare este fin, la
presente invención se refiere a un procedimiento de purificar
partículas de adenovirus a partir de una preparación de cultivo
celular que comprende: a) lisar células dentro de la preparación de
cultivo celular; b) aclarar lisado que contiene las partículas
adenovirales; c) tratar el lisado aclarado con nucleasas; y d)
someter el lisado tratado con nucleasas, aclarado a cromatografía de
intercambio aniónico; en el que los tampones usados en la
cromatografía de intercambio aniónico comprenden un tensioactivo no
iónico. Un virus preferido para purificación por los procedimientos
revelados en el presente documento es cualquier serotipo de
adenovirus. El serotipo de adenovirus a purificar es bien una forma
de tipo silvestre, una forma modificada o una forma recombinante del
serotipo de adenovirus respectivo. La presente invención se
ejemplifica, pero no significa que se limite a ello, por un
procedimiento para purificar 5 partículas de vector de adenovirus
recombinante, 6 partículas de vector de adenovirus y 35 partículas
de vector de adenovirus. Otras partículas de vector de adenovirus
para purificación por los procedimientos revelados en el presente
documento incluyen, pero no se limitan a, 26 partículas de
adenovirus y 36 partículas de adenovirus.
El procedimiento de la presente invención puede
incluir las siguientes etapas de procedimiento: (1) liberar
partículas de virus a partir de células infectadas por una etapa de
lisis tal como una etapa de lisis por detergente; (2) precipitación
selectiva para eliminar un alto porcentaje de ácidos nucleicos
contaminantes; (3) filtración en profundidad y/o centrifugación para
eliminar restos celulares y precipitado de ácidos nucleicos; (4)
ultrafiltración para reducir volumen e intercambio de tampón; (5)
tratamiento de nucleasa para digerir los ácidos nucleicos que quedan
y para facilitar eliminación; (6) cromatografía de intercambio
aniónico para purificar virus de contaminantes celulares,
componentes de virus no ensamblados y cápsides vacías; (7)
ultrafiltración de flujo tangencial para eliminar adicionalmente
contaminantes así como para introducir un tampón de formulación; (8)
filtración estéril de la preparación del virus; (9) opcionalmente,
incluyendo etapa(s) adicional(es) para purificar
adicionalmente la preparación viral, tal como una etapa de
cromatografía de intercambio iónico dinámico, una etapa de adsorción
de fase inversa, y/o una etapa de cromatografía de hidroxiapatita; y
(10) opcionalmente, una etapa anterior a o en conjunción con
cromatografía de intercambio aniónico que es una etapa de de
filtración para eliminar partículas anterior a cargar en la columna
de cromatografía de intercambio iónico. La Tabla 1 esboza paso a
paso un procedimiento de purificación de AdV a modo de ejemplo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para purificar virus de tipo silvestre o recombinante,
especialmente adenovirus de tipo silvestre o recombinante, en el que
una o más etapas del procedimiento ejemplificado (véase Tabla 1) se
omiten. Una omisión la puede usar el técnico sobre la base de una
mezcla o de una combinación con el fin de generar un protocolo
completo para purificación de adenovirus que es cualitativamente
aceptable y se formula a una concentración susceptible de
aplicaciones clínicas y/o comerciales. Cualquier procedimiento
modificado preferentemente, pero no necesariamente, incluye al menos
las siguientes etapas: (1) lisis celular; (2) precipitación
selectiva de DNA; (3) aclarado; (4) una etapa de concentración (con
un tratamiento de nucleasa); con la etapa adicional de (5), que es
una etapa de intercambio aniónico, en cualquier orden razonable que
da como resultado la recuperación de las cantidades de calidad
comercial de adenovirus.
La presente invención se refiere adicionalmente
a incorporación de metodología más adelante en el procedimiento
adicional después de las etapas 1-5 tratadas en los
párrafos anteriores para incluir una o más, y en cualquier
combinación y/u orden razonable, de una etapa de ultrafiltración,
una etapa de filtración para eliminar particulados antes de cargar
sobre una columna de intercambio aniónico, una etapa de
cromatografía alternativa u ortogonal (que incluye pero no se limita
a una etapa de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
hidroxiapatita, y/o a etapas de cromatografía de adsorción en fase
inversa (por ejemplo, usando Amberlita XAD)), y/o una etapa de
filtración estéril.
Por lo tanto, la metodología revelada en el
presente documento cumple con la necesidad de un esquema de
purificación vírica que es susceptible de requerimientos de
producción comercial, a gran escala. Los procedimientos descritos en
el presente documento son especialmente útiles en el campo de
vacunas génicas/terapia génica para superar muchos defectos de los
procedimientos conocidos de purificación viral. Como se destaca por
toda esta memoria descriptiva, los procedimientos descritos en el
presente documento dan como resultado preparaciones de adenovirus
concentradas con cantidades despreciables de contaminación de DNA.
Se prefiere que las preparaciones de adenovirus de la presente
invención contengan adenovirus a al menos 1 x 10^{11} pv/ml y
preferentemente a más de 1 x 10^{12} pv/ml, teniendo mientras una
célula huésped residual de al menos de 100 picogramos/10^{11} pv,
o adicionalmente menos de 30 picogramos/10^{11} pv,
preferentemente menos de 10 picogramos/10^{11} pv y lo más
preferentemente menos de 5 picogramos/10^{11} pv.
Aún otro objeto de la presente invención se
ejemplifica como un procedimiento de purificar adenovirus, que
incluye, pero no necesariamente requiere cada una de las siguientes
etapas de procedimiento: (1) liberar partículas de virus a partir de
células infectadas por una etapa de lisis tal como una etapa de
lisis por detergente; (2) precipitación selectiva para eliminar un
alto porcentaje de ácidos nucleicos contaminantes; (3) filtración
y/o centrifugación en profundidad para eliminar restos celulares y
precipitado de ácidos nucleicos; (4) ultrafiltración para reducir
volumen e intercambio de tampón; (5) tratamiento de nucleasa para
digerir los ácidos nucleicos que quedan y para facilitar
eliminación; (6) cromatografía de intercambio aniónico para
purificar virus de contaminantes celulares, componentes de virus no
ensamblados; (7) ultrafiltración de flujo tangencial para eliminar
adicionalmente contaminantes así como para introducir un tampón de
formulación; (8) filtración estéril de la preparación del virus; (9)
opcionalmente, incluir etapa(s) adicional(es) para
purificar adicionalmente la preparación viral, tales como una etapa
de cromatografía de intercambio catiónico dinámico, una etapa de
adsorción de fase inversa, y/o una etapa de cromatografía de
hidroxiapatita; y (10) opcionalmente, una etapa anterior a o en
conjunción con cromatografía de intercambio aniónico que es una
etapa de de filtración para eliminar partículas anteriores a cargar
en la columna de cromatografía de intercambio
aniónico.
aniónico.
La Tabla 1 esboza un procedimiento de
purificación de Ad ejemplificado, paso a paso, en el que la
combinación y/o el orden de las etapas de procedimiento respectivas
pueden ser susceptibles de purificarse por el técnico.
Como se usa en el presente documento, "pv"
se refiere a - partícula viral -.
Como se usa en el presente documento, "AEX"
se refiere a - cromatografía de intercambio aniónico -.
Como se usa en el presente documento, "CEX"
se refiere a - cromatografía de intercambio catiónico -.
Como se usa en el presente documento, "TFF"
se refiere a - filtración de flujo tangencial -.
Como se usa en el presente documento,
"TNBP" se refiere a -fosfato de
tri-n-butilo -.
Como se usa en el presente documento, "CPC"
se refiere a - cloruro de cetilpiridinio -.
Como se usa en el presente documento "DB"
se refiere a - bromuro de domifeno -.
Como se usa en el presente documento "CTAB"
se refiere a - bromuro de cetiltrimetilamonio-.
Como se usa en el presente documento, "BTC"
se refiere a - cloruro de bencetonio -.
Como se usa en el presente documento "TTA"
se refiere a - cloruro de tetradeciltrimetil-amonio
-.
Como se usa en el presente documento
"PS-80" se refiere a - polisorbato 80 -.
Como se usa en el presente documento "SPA"
hace referencia a - agente de precipitación selectiva -. Un agente
de precipitación selectiva se define en el presente documento como
cualquier agente, compuesto o tal que, cuando se añade a una
preparación que contenga una población de virus, tales como
adenovirus, y moléculas contaminantes de ácidos nucleicos, afectará
la precipitación selectiva de una cantidad sustancial de moléculas
de ácido nucleico contaminantes desde el virus respectivo.
Como se usa en el presente documento, el término
"adenovirus" o "Ad" o "AdV" hace referencia a
cualquier adenovirus, incluyendo pero no limitado a cualquier
serotipo de adenovirus que es un virus de tipo silvestre, un virus
modificado (tal como un virus atenuado), y/o un virus recombinante,
tal como cualquier serotipo de adenovirus que es, por ejemplo, un
virus recombinante de 1ª o 2ª generación que puede o no puede
contener uno o más transgenes heterólogos insertados dentro del
vector de adenovirus recombinante respectivo.
Como se usa en el presente documento, el término
"célula huésped" o "línea celular huésped" se refiere a
cualquier línea celular de mamífero que mantiene replicación de un
virus respectivo, tal como un adenovirus de tipo silvestre,
modificado o recombinante. Se reconocerá que cualquiera de tales
líneas de células huésped se hace crecer en cultivo a una fase de
crecimiento conocida de la técnica, seguida por infección con una
reserva de simiente del virus respectivo, seguida después por
cultivo adicional en condiciones fisiológicamente aceptables, que da
como resultado la producción de una población de virus adicional,
que puede recogerse por los procedimientos descritos en el presente
documento.
Figura 1 muestra un ejemplo de cromatografía de
intercambio aniónico preparativo (AEX). La alimentación se ajustó a
aproximadamente 38 ms/cm y se cargó sobre Source 15Q. La columna se
lavó con 5 volúmenes de HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 0,39 M,
PS-80 al 0,1%, pH 7,5 y un gradiente lineal se llevó
a cabo a NaCl 0,47 M.
Figuras 2A, 2B y 2C muestran resultados de
cromatogramas de ensayos de intercambio aniónico a partir de la
etapa de cromatografía AEX preparativa. (A) alimentación; (B) flujo
a través de la columna; (C) reserva de producto. Las
identificaciones de pico son como sigue: 1 minuto - impurezas
misceláneas, PS-80; 7 minutos - proteína hexón; 11
minutos - partículas AdV; 16 minutos-ácido nucleico.
Figura 3 muestra un perfil de intercambio
aniónico preparativo para el Ejemplo 2. Se muestran carga, lavado y
elución.
Figura 4 muestra perfiles de precipitación de
adenovirus para detergentes catiónicos BTC, DB, CTAB, CPC y TTA.
Figura 5 muestra perfiles de precipitación de
DNA para detergentes catiónicos BTC, DB, CTAB, CPC y TTA.
Figura 6 muestra diversas capacidades para
filtración en profundidad de CE-25 y
DE-45 en diversas condiciones de mezclado.
Figura 7 muestra un análisis de
SDS-PAGE de un procedimiento de purificación de
adenovirus paso a paso (MRKAd5gag) a partir de un cultivo de 300
litros de células. La carga se normalizó a 6,34E9 pv.
Figura 8 muestra análisis de la proteína del gel
SDS-PAGE en el intermedio de producto de intercambio
aniónico (AEP) para tres preparaciones intermedias de adenovirus
ejemplificados. Todas las muestras se cargaron en 1,19e10 total pv.
Carril (1) Marcadores de peso molecular; (2) 0112A; (3) 0112C; (4)
0114; (5) 0113A1; (6) 0113A2; (7) 0113A3; (8) 0113B; (9) 0113C; (10)
0113D.
Figura 9 muestra tiempos de separación para
diversos serotipos de adenovirus recombinantes (Ad5, Ad24 y Ad35)
por cromatografía de intercambio aniónico.
Figura 10 muestra el efecto de la concentración
de bromuro de domifeno en diversos serotipos de adenovirus
recombinantes y de DNA de cada virus recombinante respectivo.
La presente invención se refiere a los
procedimientos de partículas víricas purificadoras de un lisado
celular.
Mientras que cualquier número de virus de tipo
silvestre o virus modificados y/o vectores víricos recombinantes
pueden ser susceptibles a esta metodología, un virus preferido es un
adenovirus de tipo silvestre o modificado o un vector adenoviral
recombinante, ejemplificado en el presente documento con un vector
de adenovirus recombinante de serotipo 5, 6 y 35Un virus preferido
para purificación es cualquier adenovirus de tipo silvestre,
modificado, mutado y/o recombinante (de nuevo, véase Fundamental
Biology, 3ª Ed., Fields, B.N., Knipe, D.M. y Howley, P.M., Ed., en
el capítulo 30, páginas 979-1016 (1996)). La
presente invención se refiere en parte a un procedimiento de
purificación en el que una etapa de post-lisis
incluye una etapa de precipitación selectiva por inclusión de un
agente de precipitación selectiva, que es preferentemente un
detergente catiónico, que retira de forma efectiva la mayoría de las
moléculas de ácido nucleico, así como otros restos celulares. La
metodología de la presente invención da como resultado la
recuperación de cantidades comercialmente viables de vector de
adenovirus con características de pureza excelentes, haciendo esta
metodología especialmente útil para la carga y la distribución de
las vacunas con base adenoviral o los productos de terapia génica
con base adenoviral. La presente invención se refiere a
procedimientos de obtener virus purificados a partir de
instalaciones de producción a gran escala que incluyen, en un
aspecto preferido, una combinación de precipitación, filtración en
profundidad y/o centrifugación, ultrafiltración, digestión por
nucleasas y cromatografía para producir de forma sólida y económica
producto altamente purificado. Los niveles de DNA de la célula
huésped están de forma constante por debajo de 5 pg/10^{11} pv
cuando se usan los procedimientos de la presente invención como se
ejemplifican en la Tabla 1. Será evidente para el técnico que una
medida del contenido en DNA de célula huésped no se entiende para
remitirse como una limitación para esta metodología. En cambio,
estos datos respaldan la esencia de la presente invención:una
metodología a gran escala para la generación de partículas virales
que da como resultado un producto altamente purificado que se puede
usar en ajustes clínicos y comerciales. Puede destacarse que la
importancia de lograr niveles de DNA particulares en el producto
final es específica de producto. Los productos para uso parenteral
en seres humanos requerirán los estándares más restrictivos pero,
incluso en ese caso, las metas pueden variar de 100 pg/dosis hasta
10 ng/dosis (``WHO Requirements for the Use of Animal Cells as in
vitro Substrates for the Production of Biologicals (Requirements
for Biological Substances N.º 50), WHO Technical Report Series, N.º
878, 1998) o más altas, y son probablemente para ajustarse
dependiendo de la indicación del producto.
Además, para productos basados en adenovirus, la
dosificación en general puede variar por encima de varios órdenes de
magnitud. Por lo tanto, no hay trascendencia específica de lograr
niveles de DNA residuales específicos más adelante (tales como más
adelante 5 pg/10^{11} pv) y, en la mayoría de las aplicaciones,
las variaciones de varias veces aproximadamente lote a lote no es
probable que sean importantes. Por lo tanto, como se destaca
anteriormente, se prefiere que las preparaciones de adenovirus de la
presente invención contengan adenovirus a al menos 1 x 10^{11}
pv/ml y preferentemente a más de 1 x 10^{12} pv/ml, teniendo
mientras una célula huésped residual de al menos menos de 100
picogramos/10^{11} pv, o adicionalmente menos de 30
picogramos/10^{11} pv, preferentemente menos de 10
picogramos/10^{11} pv y lo más preferentemente menos de 5
picogramos/10^{11} pv.
La Tabla 1 esboza un procedimiento de
purificación ejemplificado, paso a paso. Como se destaca en el
presente documento, una opción adicional para el procedimiento
descrito en el presente documento es la adición de una etapa de
filtración anterior a o en conjunción con cromatografía de
intercambio iónico. Es posible que en ciertos casos (que podrían
depender de los componentes particulares del medio de cultivo así
como de las propiedades tanto de la línea de producción celular como
del producto), particulados pequeños o "agregados" pueden bien
pasar a través de la etapa de aclarado primario o bien formarse
durante el tratamiento con nucleasas o durante la ultrafiltración,
en particular la ultrafiltración incorpora una etapa de
concentración. En este caso, se contempla una etapa de filtración
adicional para eliminar estos particulados antes de cargar sobre la
cromatografía de intercambio aniónico. El filtro podría situarse en
línea durante la carga de la columna, o podría usarse en una
operación independiente. La filtración se llevaría a cabo
generalmente usando filtros de cápsula o de cartucho disponibles.
Estos filtros en línea podrían bien estar basados en la profundidad
o bien estar basados en membranas. Los medios en estos filtros
podrían ser polipropileno, celulosa, ésteres de celulosa, fluoruro
de polivinilideno modificado, nylon, polietersulfona, o cualquier
otro material que sea consistente con unión a producto baja, además,
todos estos medios podrían estar presentes con o sin agentes
modificadores tales como tierra de diatomeas y/o resinas para
incrementar propiedades de filtro. El tamaño nominal de un filtro
tal estaría entre 0,2 micrómetro y 1 micrómetro.
La presente invención se refiere así a la
metodología que resulta en la purificación de partículas vectores de
adenovirus a partir de instalaciones de producción a gran escala que
producen cantidades comercialmente adecuadas de virus recuperado así
como también muestran excelentes características de pureza. El
término "gran escala" tal como se usa en el presente documento
se considera que es volúmenes de cultivo de células huésped totales
de más de aproximadamente 10 litros hasta aproximadamente 50.000
litros, con funcionamientos de aproximadamente 300 litros a
aproximadamente 20.000 litros siendo la norma.
En un aspecto a modo de ejemplo de la presente
invención, una combinación de lisis celular, precipitación con un
SPA, filtración en profundidad y/o centrifugación, ultrafiltración,
digestión con nucleasas y etapas de cromatografía se usan para
producir de forma sólida y económica producto altamente purificado,
dando como resultado niveles de DNA de células huésped residuales a
menos de niveles detectables cuando se usa un ensayo de
Q-PCR para DNA de células huésped. Una etapa de
lisis inicial proporciona liberación máxima de adenovirus
intracelular de las células huésped y proporciona un potencial para
inactivar agentes adventicios potenciales (en particular, virus con
envoltura tales como herpesvirus o retrovirus) que podrían
contaminar hipotéticamente el cultivo celular a un nivel bajo.
Como se ha indicado anteriormente, una primera
etapa de lisis de células infectadas permite cosechar tanto virus
asociados a células (intracelulares) como virus no asociados a
células (extracelulares) del medio de cultivo de células huésped.
Como resultado, ello proporciona flexibilidad en la selección de las
condiciones de cultivo que son óptimas para productividad de virus
general. Además, la presencia de detergente por todo el
procedimiento minimiza la asociación del virus con el DNA de la
célula huésped. La lisis de detergente de células huésped, aunque es
el procedimiento preferido de lisar células huésped que contengan
AdV, se puede reemplazar por procedimientos de lisis no mecánica
susceptibles de procedimientos de purificación a gran escala (tales
como tratamiento de enzimas) y/o procedimientos de cizallamiento
mecánico (tales como ultrafiltración de fibras huecas) para liberar
cantidades máximas de adenovirus. Cualquier componente de lisis
celular susceptible de introducción dentro de un sistema biológico
tal como protocolo de terapia génica o de purificación por vacuna se
puede usar para lisar las células huésped infectadas, a saber se
contempla un detergente o enzima conocido en la técnica para ser
útil en aplicaciones biológicas, incluyendo pero no limitado a
detergentes Tritón y/o Polisorbato-80. Además, un
disolvente tal como TNBP se puede añadir al lisado o al lisado
aclarado a concentraciones bajas (por ejemplo al 0,3%) para
complementar a estos detergentes en su capacidad para inactivar los
virus con cubierta. Además, la autolisis de las células huésped
infectadas puede proporcionar liberación sustancial de virus
intracelular. Por lo tanto, cualquier forma de lisis celular de que
se conoce en la técnica se puede usar para liberar virus
intracelulares dentro del medio de cultivo para recogida eventual
por los procedimientos revelados en el presente documento.
Tras la lisis, el DNA puede precipitarse de
forma selectiva por adición de una solución de SPA concentrada
dejando mientras el adenovirus en la fase líquida. Esta etapa tiene
en cuenta la precipitación selectiva de DNA de células huésped y
también incrementa la solidez en la parte posterior del proceso.
Como se ejemplifica en el presente documento, esta etapa de
precipitación temprana da como resultado una reducción de
aproximadamente el 90% en ácidos nucleicos tras aclarado.
Aunque los autores de la presente invención no
se comprometen con ninguna teoría, se cree que la adición de un SPA
tras la lisis celular da como resultado los grupos cargados
positivamente (y los anillos aromáticos, si están presentes) en los
compuestos que se unen a los grupos fosfato cargados negativamente
(y a los pares de bases) en las moléculas de DNA. Las colas
hidrófobas en los detergentes interactúan después unas con otras
dando como resultado precipitación. Los resultados experimentales
descritos en el presente documento mostraron que las moléculas de
DNA tienen afinidad más alta para los SPA que para los adenovirus,
por lo tanto las moléculas no interaccionarán con el adenovirus
hasta que la concentración de DNA en la fase líquida sea baja. Las
micelas mezcladas también proporcionan mayor solidez. Este mecanismo
proporciona la selectividad requerida durante la precipitación. Los
SPA que pueden ser útiles en poner en práctica la invención
descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a,
copolímeros de amina, compuestos de amino cuaternario y cualesquiera
mezclas respectivas de los mismos. Mezclas de SPA proporcionan
actuación similar a SPA puros mientras que incorporan mecanismos de
precipitación múltiples (es decir sitios de unión primarios). Se
puede añadir una mezcla de SPA al lisado celular según el tampón de
precipitación o se puede incorporar según una metodología de adición
de corte alto/de corte bajo. Más específicamente, las muchas formas
de polietileno imina (PEI) han mostrado ser muy efectivas en
neutralización de carga aniónica en exceso (impurezas de DNA),
especialmente en condiciones de pH ácidas y neutrales. Teóricamente,
los copolímeros que tienen masa molecular relativamente alta pueden
ser igual de eficientes.
Los compuestos de amonio cuaternario de las
siguientes siete clases han sido los más beneficiosos para la
presente invención. Éstos incluyen pero no se limitan a las
siguientes clases y ejemplos de productos comercialmente aceptables:
sales de monoalquiltrimetilamonio (ejemplos de productos
comercialmente disponibles incluyen bromuro de cetiltrimetilamonio o
cloruro de cetiltrimetilamonio como CTAB, bromuro de
tetradeciltrimetilamonio o cloruro de tetradeciltrimetilamonio
(TTA), cloruro de alquiltrimetilamonio, cloruro de
alquiarilltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio o cloruro
de dodeciltrimetilamonio, bromuro de
dodecildimetil-2-fenoxietilamonio,
hexadecilamina: sal de cloruro o de bromuro, dodecilamina o sal de
cloruro, y bromuro o cloruro de cetildimetilamonio), sales de
monoalquildimetilbencilamonio (ejemplos incluyen de cloruros de
alquildimetilbencilamonio y cloruro de bencetonio como BTC), sales
de dialquilmetilamonio (productos comerciales incluyen bromuro de
domifeno como DB, haluros de didecilmetilamonio, y cloruro o bromuro
de octododecilmetilamonio), sales de amonio heteroaromáticas (los
productos comerciales incluyen haluros de cetilpiridio (CPC o sal de
bromuro y bromuro o cloruro de hexadecilpìridinio), isómero cis de
1-[3-cloroalil]-3,5,7-triaza-1-azoniaadamantano,
bromuro de alquilisoquinolinio y cloruro de
alquildimetilnaftilmetilamonio (BTC 1110)), sales de amonio
cuaternario polisustituidas, (los productos comercialmente
disponibles incluyen, pero no se limitan a, sacarinato de
alquildibencilamonio y ciclosulfamato de
alquildimetiletilbencilamonio), sales de amonio biscuaternario (los
ejemplos de producto incluyen
1,10-bis(cloruro de
2-metil-4-aminoquinolinio)-decano,
hexano de
1,6-bis{1-metil-3-(2,2,6-trimetilciclohexil)-propildimetilamonio]
o cloruro de triclobisonio y el bis-quat se refieren
como CDQ por Buckman Brochures) y sales de amonio cuaternario
polimérica (incluye poliionenos tales como dicloruro de
poli[oxietileno(dimetiliminio)etileno(dimetiliminio)etileno],
dicloruro de
poli[N-3-dimetilamonio)propil]N-[3-etilneoxietilenodimetilamonio)propil]urea
y alfa-4-[cloruro de
1-tris(2-hidroxietil)amonio].
El lisado celular tratado con SPA se aclara por
filtración en profundidad para eliminar impurezas precipitadas y
restos celulares. La centrifugación con o sin filtración en
profundidad refinándola también es factible. Por lo tanto, el
aclarado del lisado precipitado se puede llevar a cabo usando
centrifugación sola, o usando centrifugación en tándem con una etapa
de aclarado refinándola tal como filtración en profundidad. Para
volúmenes mayores de líquido (mayores de aproximadamente 50 l), se
prefiere la centrifugación continua sobre los procedimientos por
lotes. La centrifuga continua puede tener un diseño tubular, como en
el CARR Powerfuge, o de disco, como en el Westfalia
CSA-1, si bien otros fabricantes y modelos
probablemente están siendo satisfactorios. En general, los tiempos
de residencia y la fuerza centrífuga requerida se impondrán por la
eficiencia del equipamiento individual así como la distribución de
tamaños en el precipitado y la metodología para seleccionar
condiciones apropiadas para eliminar precipitado pero ningún
adenovirus será patente para cualquiera experto en la técnica. El
Ejemplo 15 muestra el uso de centrifugación continua seguida por una
filtración en profundidad de refinado. El uso de centrifugación
continua se prefiere en aplicaciones donde la densidad celular es
alta (por ejemplo, retroalimentación o cultivo por perfusión) y/o
cuando los volúmenes son muy grandes (más grandes que 1000 l). El
lisado celular aclarado se concentra después según sea apropiado
(dependiendo de la masa celular y de la productividad del cultivo
del adenovirus, con 10-20 veces siendo típicas de
los procedimientos de lote simples), tratado con nucleasa y sometido
a diafiltración. La combinación de la precipitación y el aclarado
retira aproximadamente el 90% del DNA total y, dependiendo de las
afecciones de ultrafiltración/tratamiento con nucleasa, la pureza de
esta corriente puede ser suficiente para muchas aplicaciones.
Se ejemplifica en el presente documento y se
prefiere que una etapa de precipitación selectiva tenga lugar en la
primera etapa después de la lisis celular. Sin embargo, esta
preferencia no es de ninguna manera una limitación, ya que una etapa
de precipitación selectiva puede insertarse en otras fases de los
procedimientos de purificación para eliminar mejor moléculas de
ácidos nucleicos residuales y restos celulares a partir de un lisado
de células tamponadas o solución tampón que contiene Ad de fase
avanzada. Por ejemplo, la precipitación de detergentes puede
situarse alternativamente después del aclarado o la ultrafiltración
(concentración/diafiltración) con la adición de un aclarado
subsiguiente. El aclarado adicional puede tomar cualquiera de varias
formas incluyendo filtración en profundidad o filtración de
membrana.
Se puede contemplar una etapa de filtración para
eliminar restos celulares y precipitado de ácidos nucleicos. Esta
etapa proporciona un medio conveniente para eliminar económicamente
restos celulares y precipitado celular. Al elegir un filtro o un
esquema de filtro fue necesario asegurar una actuación sólida en
caso de que se produzcan cambios o variaciones corriente arriba.
Mantener el equilibrio entre buena actuación de aclarado y
rendimiento de etapa requiere investigar una amplia diversidad de
tipos de filtro con medios internos variantes. Los filtros adecuados
pueden usar filtros de celulosa, fibras de celulosa regeneradas,
fibras de celulosa combinadas con coadyuvantes de filtros
inorgánicos (por ejemplo tierra de diatomeas, perlita, sílice
ahumado), fibras de celulosa combinadas con coadyuvantes de filtro
inorgánico y resinas orgánicas, o cualquier combinación de las
mismas, y fibras poliméricas (ejemplos incluyen pero no se militan a
nylon, polipropileno, polietersulfona) para lograr eliminación
efectiva y recuperaciones de virus aceptables. En general, es
preferible pero no se requiere un procedimiento de fases múltiples.
Un procedimiento de dos o tres fases ejemplar consistiría en
filtro(s) tosco(s) para eliminar precipitado grande y
restos celulares seguido(s)
por filtros(s) de segunda fase de refinado con tamaños de poro nominales mayores de 0,2 micrómetros pero de menos de 1 micrómetros. La combinación óptima será una función de la distribución por tamaño de precipitado así como de otras variables. Además, operaciones de fase individual que usan un filtro relativamente estrecho o que usan centrifugación pueden producir también un producto de buena calidad. Más generalmente, cualquier aproximación de aclarado incluyendo filtración en línea, microfiltración, centrifugación, o suministro de coadyuvantes de filtro (por ejemplo tierra de diatomeas) en combinación con filtración en línea o con filtración en profundidad, que proporcione un filtrado de claridad adecuada para obstruir la membrana y/o resina en las etapas subsiguientes, será aceptable para practicar dentro de la presente invención.
por filtros(s) de segunda fase de refinado con tamaños de poro nominales mayores de 0,2 micrómetros pero de menos de 1 micrómetros. La combinación óptima será una función de la distribución por tamaño de precipitado así como de otras variables. Además, operaciones de fase individual que usan un filtro relativamente estrecho o que usan centrifugación pueden producir también un producto de buena calidad. Más generalmente, cualquier aproximación de aclarado incluyendo filtración en línea, microfiltración, centrifugación, o suministro de coadyuvantes de filtro (por ejemplo tierra de diatomeas) en combinación con filtración en línea o con filtración en profundidad, que proporcione un filtrado de claridad adecuada para obstruir la membrana y/o resina en las etapas subsiguientes, será aceptable para practicar dentro de la presente invención.
La filtración en profundidad o las filtraciones
en profundidad en combinación con centrifugación han sido los
procedimientos más sólidos de aclarado para la presente invención.
Éstos incluyen pero no se limitan a los siguientes ejemplos de
productos comercialmente aceptables: filtros en profundidad de la
serie AP de CUNO Incorporated (los ejemplos incluyen AP01), filtros
en profundidad de la serie CP de CUNO Incorporated (los ejemplos
incluyen CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90), filtros en profundidad
de serie HP Incorporados de CUNO (los ejemplos incluyen HP10, HP30,
HP50, HP60, HP70, HP90), filtros en profundidad de la serie CA de
CUNO Incorporated (los ejemplos incluyen CA10, CA30, CA50, CA60,
CA70, CA90), filtros en profundidad de la serie SP de CUNO
Incorporated (los ejemplos incluyen SP10, SP30, SP50, SP60, SP70,
SP90), filtros Delipid y Delipid Plus de CUNO, filtros en
profundidad de serie CE de Millipore Corporation (los ejemplos
incluyen CE15, CE20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70,
CE75), filtros en profundidad de serie DE de Millipore Corporation
(los ejemplos incluyen DE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE55,
DE560, DE65, DE70, DE75), filtros de serie Millipore Corporation HC
(los ejemplos incluyen A1HC, B1HC, COHC), Filtros de CUNO Polynet
(un ejemplo incluye Polynet-PB), filtros de
Millipore Clarigard y de Polygard, filtros de CUNO Life Assure,
filtros en profundidad de ManCel Associates (los ejemplos incluyen
pero no se limitan a PR 12 UP, PR12, PR 5 UP) y filtros de PALL o
Incorporados de SeitzSchenk (los ejemplos incluyen pero no se
limitan a Bio20, SUPRA EKIP, KS-50P).
Un aspecto adicional de los procedimientos
descritos son una serie de etapas para concentrar el Adenovirus,
añadir un tratamiento de nucleasa adicional (por ejemplo
Benzonasa^{TM}, EM Industries) e introducir un tampón de
intercambio por medio de diafiltración. El tamaño de membrana
seleccionado permite la eliminación de proteínas estructurales de
virus no ensambladas, detergente y nucleasa. La adición de
Benzonasa^{TM} no se requiere para derivar un producto que es
altamente puro por HPLC de intercambio aniónico pero conduce a
niveles de DNA residuales más bajos al final de esta etapa y
presumiblemente en el producto purificado final.
La membrana de ultrafiltración particular será
de un tamaño suficientemente pequeño para retener adenovirus pero lo
suficientemente grande para quitar impurezas de forma efectiva.
Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, los límites de
peso molecular nominales (NMWCO) entre 100 y 1000 kDa pueden ser
apropiados. La composición de membrana puede ser, pero no está
limitada a, celulosa regenerada, polietersulfona, polisulfona, o
derivados de las mismas. Estas membranas pueden ser láminas planas o
fibras huecas. Se prefiere ultrafiltración que usa modo de flujo
tangencial. Las pantallas favorecedoras de turbulencias pueden ser
también útiles para optimizar la eliminación de impurezas. En una
realización preferida, membranas de láminas planas de NMWCO PES de
300 kDa o de 500 kDa con una pantalla promotora de turbulencias (por
ejemplo Millipore Pellicon 2 Biomax con pantalla C) se usan en modo
de flujo tangencial. En modo de flujo tangencial, la etapa puede
controlarse ajustando un flujo cruzado fijo con o sin resistencia en
el retorno retenido, ajustando una presión transmembrana fija, o
fijando tanto el flujo cruzado como el flujo permeable.
El factor de concentración señalado como
objetivo durante la ultrafiltración será una función de las
condiciones de cultivo, incluyendo el medio usado, la densidad
celular y la productividad viral. Para el cultivo de lote con
densidad celular de infección de aproximadamente 10^{6}
células/ml, se prefiere concentración de 5 a 40 veces; se prefiere
especialmente concentración de 10 y 25 veces.
El tratamiento de nucleasas puede incluir el uso
de una nucleasa de amplio espectro (por ejemplo Benzonasa^{TM},
una DNasa, una RNasa, o cualquier combinación de las mismas.
Se prefiere una nucleasa o cóctel con las dos y
con actividad DNasa.
Se puede contemplar una etapa de tratamiento con
nucleasas en cualquier punto del procedimiento, así como un
contenido de nucleasas residuales en el producto final es aceptable
para la aplicación. Se prefiere que el tratamiento con nucleasas
tenga lugar después del aclarado y se prefiere especialmente que el
tratamiento con nucleasas tenga lugar después del aclarado y de una
etapa de concentración, pero antes de una etapa de cromatografía de
intercambio aniónico. Una manifestación útil del procedimiento tiene
en cuenta el tratamiento con nucleasas en el aparato de
ultrafiltración después de la concentración. La permeación se puede
detener temporalmente durante una incubación de duración apropiada y
después se puede reiniciar para diafiltración.
La diafiltración en un tampón usando
ultrafiltración puede ser deseable. En la mayoría de las
aplicaciones, algunos volúmenes de lote de tampón se usarán para
asegurar el intercambio completo. Si la corriente se carga en una
columna de intercambio aniónico, se prefiere la diafiltración en un
tampón con pH entre 6,5 y 8,0, aunque no se requiere. Más
específicamente, la diafiltración en HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM,
NaCl 1 M, pH 7,5, con detergente para evitar agregación (tal como
PS-80 al 0,1%), puede ser apropiada.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se pone de relieve por toda esta memoria
descriptiva y como se muestra en la Tabla 1, se incluye una etapa de
cromatografía de intercambio iónico. Para purificación con
adenovirus de tipo 5 con Source 15Q, la concentración de NaCl para
cargar y lavar podría estar presumiblemente en cualquier punto entre
0,33 y 0,41 M a pH 7,5 y variaría a pH alternativos. El pH de los
tampones necesita ser suficientemente alto para unir a los
adenovirus (mayor que aproximadamente 6,5). Además, el pH del
sistema de tampón sería también suficientemente bajo para evitar la
inestabilidad viral. El pH máximo preciso que puede usarse dependerá
del perfil de estabilidad específica del serotipo de adenovirus y de
los componentes del tampón y puede determinarse fácilmente por el
técnico para esa aplicación particular. Como una guía y ciertamente
no como una limitación, un intervalo de pH de Ad5 podría variar
potencialmente desde aproximadamente 6-10, con
niveles preferidos de 6,5-9 e incluso más preferidos
de 6,5-8,0. La presencia de PS-80 al
0,1% en los tampones es crítica para lograr niveles de DNA
residuales bajos en el producto debido a que ello atenúa la
asociación virus/DNA y la agregación de virus. Estará dentro del
reino de la experimentación de rutina para el técnico experto
establecer concentraciones más altas o más bajas de detergente o
establecer detergentes alternativos que serían útiles para promover
la disociación de las partículas virales de otros virus así como de
diversos contaminantes celulares. También está dentro del mismo
reino de experimentación el que el técnico pueda elegir un
detergente alternativo para el tampón del procedimiento. Como un
ejemplo, pero no significando de ningún modo una limitación, los
tensioactivos no iónicos que podrían usarse potencialmente para
inhibir agregación en intercambio aniónico y durante todo el
procedimiento incluyen ésteres de ácidos grasos de polioxietileno
sorbitán, incluyendo pero no limitados a
Polisorbato-80 (Tween 80®) [como se ejemplifica en
el presente documento], Polisorbato-60 (Tween 60®),
Polisorbato-40 (Tween 40®) y
Polisorbato-20 (Tween 20®), éteres de alquilo de
polioxietileno, incluyendo pero no limitados a Brij 58®, Brij 35®,
así como otros tales como Tritón X-100®, Tritón
X-1140®, NP40®, Span 85 y la serie Plurónica de
tensioactivos no iónicos (por ejemplo Pluronic 121). De éstas, se
prefiere la serie de Polisorbatos. Se describe en el presente
documento que una resina tal como una resina Source 15Q (Amersham
Biosciences) tiene una capacidad extraordinariamente alta para
adenovirus que se pueden usar de forma efectiva debido a la
inhibición de agregación. Los casos que se conocen y la técnica
conocida parecen indicar que las cargas bajas (< 1 x 10^{12}
pv/ml de resina) son la norma industrial. Para Source 15Q, se
prefieren las columnas con alturas de lecho en exceso de 5 cm cuando
el diámetro de la columna excede de 10 cm. Las columnas con alturas
entre 10 y 25 cm trabajan especialmente bien. Aunque no se requiera,
es preferible implementar una estrategia que fraccione el pico de
producto principal de impurezas cromatomagráficamente relacionadas,
por ejemplo, usando un valor límite para absorbancia de UV. Otras
resinas que son adecuadas para purificación de adenovirus en este
procedimiento incluyen pero no se limitan en modo alguno a Source
30Q (Amersham Biosciences), Fractogel TMAE (EM Industries) y
Q-Sefarosa XL (Amersham Biosciences). Cualquier
intercambiador aniónico sería usable, otros que han demostrado los
autores de la presente invención incluyen Fractogel DEAE (EM
Industries), Q-Hyper D/F (Biosepra), Toyopearl
DEAE-650M (Tosohaas), Toyopearl
DEAE-750C (Tosohaas), y Toyopearl
QAE-550C (Tosohaas). Además, los productos de
cromatografía de membrana de intercambio iónico tales como aquellos
producidos por Pall (por ejemplo serie Mustang^{TM}) y Sartorius
(por ejemplo serie Sartobind) son adecuados para purificación de
adenovirus.
En cualquier realización particular de la
presente invención, el producto de intercambio iónico puede
diafiltrarse en cualquier realización particular de la presente
invención, el producto de intercambio iónico puede diafiltrarse en
tampón de formulación y filtrase de forma estéril. Alternativamente,
una etapa de cromatografía adicional (por ejemplo, intercambio
catiónico) puede añadirse bien antes o bien después de la
diafiltración con el potencial para incrementar la solidez de
eliminación de impurezas y/o de virus/priones. La ultrafiltración de
flujo tangencial es útil en eliminar proteína residual y ácido
nucleico residual y en intercambiar el virus en un tampón de
formulación. Esta etapa proporciona control de PS-80
y puede proporcionar eliminación de las impurezas residuales
incluyendo DNA, detergentes residuales y proteínas de las células
huéspedes. La presencia de PS-80 en la alimentación
y en el tampón de diafiltración minimiza el potencial de agregación
de productos. El control de flujo es importante para la reducción
efectiva de PS-80 en presencia de concentraciones de
adenovirus altas. La elección entre membranas de 300 kD y de 500 kD
está dictada por las soluciones de compromiso entre el rendimiento y
la eliminación de impurezas incrementada. Otras configuraciones de
membrana (tales como una fibra hueca) son sustitutos aceptables. Más
generalmente, la selección de condiciones para esta ultrafiltración
es similar a aquella descrita antes. Es decir, la membrana de
ultrafiltración particular seleccionada será de un tamaño
suficientemente pequeño para retener adenovirus pero lo
suficientemente grande para eliminar impurezas de forma efectiva.
Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, los límites de
peso molecular nominales (NMWCO) entre 100 y 1000 kDa pueden ser
apropiados. La composición de membrana puede ser, pero no está
limitada a, celulosa regenerada, polietersulfona, polisulfona, o
derivados de las mismas. Estas membranas pueden ser láminas planas o
fibras huecas. Se prefiere ultrafiltración que usa modo de flujo
tangencial. Las pantallas promotoras de turbulencias pueden ser
también útiles para optimizar la eliminación de impurezas. En una
realización, membranas de láminas planas de NMWCO PES de 300 kDa o
de 500 kDa con una pantalla promotora de turbulencias (por ejemplo
Millipore Pellicon 2 Biomax con pantalla C) se usan en modo de flujo
tangencial. En modo de flujo tangencial, la etapa puede controlarse
ajustando un flujo cruzado fijo (con o sin resistencia en el retorno
retenido), ajustando una presión transmembrana fija, o fijando tanto
el flujo cruzado como el flujo permeable. Se prefiere controlar el
flujo cruzado y el flujo permeable. El tampón de diafiltración
particular elegido sería un tampón de formulación apropiado (véase
documento WO 0166137) o un subgrupo de componentes deseados. Los
ejemplos incluyen, pero no se limitan a (1) Tris 5 mM, MgCl_{2} 1
mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5%, PS-80 al 0,005%, pH
8,0, (2) Tris 10 mM, Histidina 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM,
sacarosa al 5%, PS-80 al 0,005%, pH 7,4, (3) Tris 5
mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%,
PS-80 al 0,005%, pH 7,4 y (4) Tris 10 mM, Histidina
10 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5%,
PS-80 al 0,02%, EDTA 0,1 mM, etanol al 0,5% (v/v),
pH 7,4.
Se puede incluir una etapa de filtración
estéril, que es útil en eliminar carga biológica. El producto puede
filtrarse a través de membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF)
modificado de 0,22 micrómetros (por ejemplo Millipore Millipak).
Además de PVDF modificado, el filtro estéril puede estar construido
de una diversidad de otros materiales que se conocen bien en la
técnica y están disponibles para el técnico. Éstos pueden incluir
pero no se limitan a polipropileno, celulosa, ésteres de celulosa,
nylon, poliétersulfona, o cualquier otro material que es consistente
con producto de unión baja. El filtro puede tener una capa de
membrana individual o puede incorporar un prefiltro del mismo o de
diferente material. El producto puede mantenerse congelado o a
aproximadamente 4ºC para formulación y carga subsiguientes. Una
etapa adicional opcional más adelante en el procedimiento es la
inclusión de una etapa de purificación ortogonal con el fin de
quitar cualesquiera impurezas resultantes y/o otros agentes. Una
etapa tal incluye, pero no está limitada necesariamente a, una etapa
de cromatografía de intercambio catiónico. Si se elige, la operación
de la etapa del intercambio de cationes estaría en modo a través de
flujo. La segunda ultrafiltración se opera como antes salvo que se
puede reducir la concentración del tampón de diafiltración (por
ejemplo, a 10 mM). Después de la ultrafiltración y del intercambio
catiónico inmediatamente anterior, el pH del lote se redujo a 6,5
por medio de adición de un tampón de pH bajo (Histidina). pH más
bajos se pueden conseguir pero se corre el riesgo de pérdida de
adenovirus en el tampón de formulación ejemplificado; los pH más
altos reducen la eficacia de la etapa pero incrementan la
estabilidad de los adenovirus. De forma similar, se puede variar la
concentración de NaCl. Hasta la fecha, se ha evaluado un número de
resinas para recuperación de adenovirus incluyendo Poros 50HS,
Source 30S, Source 15S, SP Sefarosa HP, SP Sefarosa XL, SP Sefarosa
FF; se prefiere Source 30S. Inmediatamente después del intercambio
catiónico, el pH se incrementa para la formulación objetivo por la
adición de un tampón de Tris de pH alto. Además y como se destaca
anteriormente, los productos de cromatografía de membrana de
intercambio iónico tales como aquellos producidos por Pall (por
ejemplo serie Mustang^{TM}) y Sartorius (por ejemplo serie
Sartobind) son adecuados para purificación de adenovirus. El
producto puede después ser filtrado estéril como
anteriormente.
anteriormente.
Una etapa de adsorción en fase inversa se puede
añadir también, preferentemente tras aclarado de la primera etapa de
ultrafiltración. La adsorción en fase inversa puede retirar
detergentes incluyendo Tritón X-100 y bromuro de
domifeno así como componentes de medio de cultivos tales como rojo
fenol de Pluronicand así como una diversidad de otras impurezas
hidrófobas. Por lo tanto ello representa un procedimiento
conveniente para incrementar la solidez del procedimiento o para
eliminar las etapas anteriores en el procedimiento. La etapa de
adsorción puede operarse bien en modo de lote o bien en modo de
columna. En el modo por lotes, el adsorbente se eliminará
subsiguientemente usando una filtración, preferentemente en modo en
línea. En modo en columna, el lote se bombearía sobre la resina en
un tiempo de residencia adecuado para permitir adsorción de
detergentes y otras impurezas. Las resinas adecuadas tendrían una
tamaño de poro que excluye el producto y puede incluir cualquiera de
la serie XAD de Amberlite, por ejemplo XAD4, XAD16, XAD 1600, XAD
1180 (Rohm y Haas) o resinas similares a partir de otros fabricantes
por ejemplo Bio-Beads SM2
(Bio-Rad).
Una etapa de cromatografía de hidroxiapatita
puede considerarse también para eliminar impurezas adicionales. Esta
etapa puede operarse bien en modo de unir/eluir o bien en modo
dinámico. La etapa puede situarse después de la etapa de
ultrafiltración finalizando la UF con una diafiltración en un tampón
con aproximadamente fosfato 10 mM y NaCl 0,5 M a un pH preferido
entre 6,5 y 8. Un gradiente en fosfato para 0,4 M es suficiente para
elución de adenovirus.
Llegará a ser evidente tras la revisión de esta
memoria descriptiva que los procedimientos en la presente invención
son escalables, abarcando toda la gama desde los cultivos celulares
a escala más pequeña (por ejemplo, aproximadamente funcionamientos
de 5-10 litros) completamente a preparaciones a
escala comercial, tales como funcionamientos de 10.000 a 50.000 l.
Las secciones de Ejemplos 2 y 5 muestran datos de funcionamientos a
escala más pequeña, mientras que la discusión más adelante en esta
sección contempla, como un ejemplo y ciertamente no como una
limitación, un procedimiento de purificación de adenovirus a partir
de un cultivo de 1000 litros (l) (volumen de trabajo de 800 l) de
células PER.C6^{TM} (Crucell) infectadas anteriormente con el
vector de adenovirus respectivo. Para este fin, la Tabla 1 resume
los descriptores del procedimiento para un funcionamiento de
biorreactor de 1000 l profético (volumen de trabajo de 800 l) pero
será escalable linealmente. Las etapas del procedimiento inicial
(lisis, filtración en profundidad y ultrafiltración) suben con el
volumen del cultivo mientras que la cromatografía de intercambio
aniónico y las etapas subsiguientes suben con la entrada de
partículas virales. Por lo tanto, el tamaño de las etapas se basará
en una productividad de reactor estimada de 4 x 10^{13} partículas
virales por litro (pv/l). Con estas asunciones, se producirán
aproximadamente 1,6 x 10^{16} pv por lote. Adicionalmente, el
Ejemplo 9 muestra datos generados a partir de un funcionamiento de
600 l de Ad5.
Una primera etapa en un procedimiento de
purificación de la presente invención es una etapa de lisis de
células huésped, que mantiene liberación máxima de partículas de
adenovirus de las células así como que mantiene una oportunidad para
inactivar potencialmente agentes adventicios. Como se menciona
anteriormente, un disolvente (por ejemplo TNBP) puede añadirse
también a concentración baja (es decir, al 0,3%) para incrementar la
eficiencia de la inactivación de los agentes adventicios. El
mantenimiento prolongado de una corriente de lisado o de lisado
aclarado que incorpora TNBP puede conducir potencialmente a un
decrecimiento en infectividad del producto. A partir de un
procedimiento de cultivo de adenovirus de 800 l, se añadirán
procedimientos de cultivo de adenovirus, aproximadamente 8 litros de
Tritón X-100 al 10% y 40 litros de Tris 0,5 M,
MgCl_{2} 40 mM, PS-80 al 1% se añadirán al
biorreactor con agitación suave. La lisis celular se completará en 2
horas pero se mantendrá durante tiempo adicional para propósitos de
eliminación vírica. El lisado celular se mantiene después a 4ºC o se
purifica inmediatamente. Esta etapa de lisis inicial,
independientemente de la escala del cultivo de adenovirus, tiene en
cuenta la recogida tanto de virus asociados a células
(intracelulares) como de virus no asociados a células
(extracelulares). Como un resultado, ello proporciona flexibilidad
en la selección de las condiciones de cultivo que son óptimas para
productividad de virus general. Además, la presencia de detergente
por todo el procedimiento minimizará la asociación del virus con el
DNA de la célula huésped.
Como se ha indicado anteriormente, un esquema de
purificación preferido incorpora una etapa para precipitar moléculas
de ácidos nucleicos de células huésped de precipitados y otros
restos celulares así como incrementa solidez de los procedimientos
posteriores. Continuando una descripción de un procedimiento de
purificación proyectado para un funcionamiento de 800 l,
aproximadamente 60 l de bromuro de domifeno al 0,5% (CTAB o CPC se
pueden sustituir con algún ajuste de la concentración final), se
añaden lentamente al biorreactor o tanque de cosecha para una
concentración final de aproximadamente el 0,04%. Si es necesario, la
concentración de SPA optima para un funcionamiento específico se
puede determinar usando estudios de sonda a escala de 1 ml. La
adición por debajo de la superficie del SPA se prefiere pero no se
requiere. El lisado precipitado es aclarado inmediatamente. Una
precipitación tal dará como resultado aproximadamente una reducción
del 90% en ácido nucleico tras aclarado. Además, se pueden flocular
otras impurezas (restos celulares, etc.) durante esta precipitación.
Cuando se compara con el control no precipitado el rendimiento de la
filtración en profundidad puede estar potenciado espectacularmente y
pueden incrementarse los rendimientos a través de la filtración en
profundidad. El producto aclarado de un funcionamiento de 800 l tal
será significativamente menos turbio y la realización de la
ultrafiltración subsiguiente estará marcadamente incrementada.
El lisado celular tratado con SPA se aclara para
eliminar impurezas precipitadas y restos celulares. Esta etapa puede
incluir bien una filtración en profundidad o bien una etapa de
centrifugación con o sin una etapa de refinado por filtración en
profundidad. Cualquiera que sea la etapa que se incorpore, el lisado
aclarado de la célula se concentrará después 10-20
veces, se tratará opcionalmente con nucleasa, y se someterá a
diafiltración. La combinación de la precipitación y el aclarado
eliminará aproximadamente el 90% del DNA total y, dependiendo de las
afecciones de ultrafiltración/tratamiento con nucleasa, la pureza de
esta corriente puede ser suficiente para muchas aplicaciones. Más
específicamente, una etapa de filtración en profundidad será útil
para eliminar restos celulares y ácidos nucleicos del huésped.
Cuando se opta por la filtración en profundidad, el lisado celular
se filtrará a través de dos filtros en profundidad en serie para
eliminar los restos celulares. La filtración usará dos cartuchos de
filtro de 40,64 centímetros (16 pulgadas) de CE20 de Millipore
Millistak (6,967 m^{2} (75 pie^{2})) seguidos por dos cartuchos
de 40,64 centímetros (16 pulgadas) de CE50 de Millistak (6,967
m^{2} (75 pies^{2})). Estas áreas incluyen un factor de
seguridad de al menos 2. La filtración se llevará a cabo usando una
velocidad de flujo de aproximadamente 96,875 l/h/m^{2} (9
l/h/pie^{2}). El líquido que quede en la caja protectora se
desplazará con presión de aire. La filtración en profundidad
proporciona un medio conveniente para eliminar económicamente restos
celulares y precipitado celular. Se conocerá por el técnico experto
al menos tras revisión de esta memoria descriptiva que la selección
de filtro real puede cambiarse para optimizar adicionalmente el
rendimiento o la eliminación de impurezas. Como se destacó
anteriormente, la centrifugación es una alternativa viable a la
filtración en profundidad que puede ser especialmente aplicable en
funcionamientos a gran escala.
En el esquema de purificación según se muestra
en la Tabla 1, se incorporan las etapas de concentración,
tratamiento de nucleasas y diafiltración con el fin de reducir
volumen de lotes, digerir y eliminar ácidos nucleicos y promover un
intercambio de tampones. Más específicamente, el lisado aclarado se
concentrará desde aproximadamente 800 l hasta aproximadamente 40 l
usando una ultradiafiltración de volumen constante con una membrana
de poliétersulfona (PES) NMWCO de 300 kD en condiciones de flujo
constante. Tras la concentración, se añadirán 0,6 MM Unidades de
Benzonasa^{TM} (15 U/ml) directamente a lo retenido y se
recircularán lentamente en el sistema de ultrafiltración con
mezclado. Después de 1-2 horas a temperatura
ambiente, el lote se someterá a diafiltración frente a 5 volúmenes
(200 l) de HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, NaCl 1 M, pH 7,5 en
condiciones de flujo constante. Se destacaría que el tamaño de
membrana seleccionado se tendrá en cuenta para la eliminación de las
proteínas estructurales del virus no ensambladas, las micelas de
detergentes y la Benzonasa^{TM}. Un MWCO más grande (por ejemplo
500 kD) puede proporcionar también realización adecuada. La adición
de Benzonasa^{TM} no se requiere para obtener un pico que es
altamente puro por HPLC de intercambio aniónico pero conducirá a
niveles de DNA residuales más bajos al final de esta etapa y
presumiblemente en el producto purificado final.
La etapa de cromatografía de intercambio
aniónico (AEX) de la Tabla 1 será útil para purificar el virus a
partir de las proteínas de las células huésped, de los ácidos
nucleicos de las células huésped, y de los componentes no
ensamblados de virus. La conductividad del lote se ajustará a 38 mS
por la adición de aproximadamente 62 l de HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2
mM, PS-80 al 0,1%, pH 7,5. Tras la dilución, el lote
se bombeará sobre una columna de resina Source 15Q (Amersham
Biosciences) a una carga de aproximadamente 5 x 10^{12} partículas
por ml de resina. Para MRKAd5gag, esto corresponde a una columna de
alrededor de 5 litros (alrededor de 20 cm H x 16 cm D). Tras
cargar, la columna se lavará con 5 volúmenes de HEPES 50 mM,
MgCl_{2} 2 mM, NaCl 0.39 M, PS-80 al 1%, pH 7,5
para eliminar el Tritón residual y las impurezas de proteínas. El
producto se eluye después en un gradiente lineal de 4 volúmenes a
NaCl 0,47 M y se recoge en base a la señal de A_{260}. La
necesidad de controlar la temperatura durante este procedimiento se
dictará por el tiempo de procesamiento y la estabilidad del AdV en
esta fase. La carga a una conductividad de 38 mS es aproximadamente
equivalente a NaCl 0,38 M. La concentración de sales es adecuada
para unir partículas de adenovirus pero no las impurezas
relacionadas; ello se traduce en una capacidad de unión más alta
para adenovirus. La presencia de PS-80 al 0,1% (o un
compuesto relacionado en una concentración biológicamente efectiva)
en los tampones será crítica para lograr niveles de DNA residual
bajos en el producto debido a que atenúa la asociación virus/DNA y
la agregación de virus. La resina Source 15Q tiene una capacidad de
unión extremadamente alta para adenovirus
que se puede usar de forma efectiva debido a que los autores de la presente invención están inhibiendo agregación.
que se puede usar de forma efectiva debido a que los autores de la presente invención están inhibiendo agregación.
La ultrafiltración de flujo tangencial es una
etapa mostrada en la Tabla 1 que es útil para eliminar también
proteína y ácido nucleico residual así como para intercambiar virus
en un tampón de formulación. Brevemente, el área de la membrana (300
kD de MWCO PES) está seleccionada para una carga de
1-2 x 10^{16} pv perm^{2}. El producto AEX se
diluirá a alrededor de 1,1 x 10^{12} pv/ml (aproximadamente 16
litros) y se someterá a diafiltración después usando control de
flujo contra 5 volúmenes de tampón de formulación (Tris 5 mM,
MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5%, PS-80
al 0,005%, pH 8,0). La etapa se operó a aproximadamente 4ºC y el
producto se mantuvo a 4ºC hasta la filtración estéril. Esta etapa
proporcionará control de PS-80 y puede proporcionar
eliminación de las impurezas residuales incluyendo DNA y proteínas
de las células huéspedes. La presencia de PS-80 en
la alimentación y en el tampón de diafiltración minimizará el
potencial para agregación de productos. El control de flujo es
importante para la reducción efectiva de PS-80 en
presencia de concentraciones de adenovirus altas. Las membranas de
500 kD pueden sustituirse, sin embargo, hay algún potencial para
permeación de virus. Otras configuraciones de membrana (por ejemplo,
fibra hueca) proporcionan sustitutos aceptables.
La filtración estéril puede añadirse, como por
la Tabla 1, para eliminar la carga biológica. La parte retenida
final se filtrará a través de membrana de fluoruro de polivinilideno
(PVDF) modificada de 0,22 micrómetros (por ejemplo Millipore
Millipak 200) usando una carga de filtro de aproximadamente 3 x
10^{13} pv/cm^{2}. Además de PVDF modificado, el filtro estéril
puede estar construido de una diversidad de otros materiales que se
conocen bien en la técnica y están disponibles para el técnico.
Estos pueden incluir pero no se limitan a polipropileno, celulosa,
ésteres de celulosa, nylon, poliétersulfona, o cualquier otro
material que es consistente con producto de unión baja. El filtro
puede tener una capa de membrana individual o puede incorporar un
prefiltro del mismo o de diferente material. El producto puede
mantenerse congelado o a aproximadamente 4ºC para formulación y
carga subsiguientes.
Una etapa de purificación ortogonal se puede
añadir para ocuparse de la eliminación de impurezas así como para
una eliminación de agentes adventicios. Las etapas de purificación
ortogonal no se requieren necesariamente y pueden evaluarse por el
técnico experto e implementarse a su vez en base la necesidad. La
concentración de la dosis clínica más alta, la solidez de la
eliminación de impurezas y las cuestiones del sustrato celular
relativas a tumorogenicidad, virus adventicios y priones definen
todas estas necesidades para el técnico experto. Las etapas
potenciales incluyen cromatografía de intercambio catiónico
dinámica, adsorción en fase inversa y cromatografía de
hidroxiapatita. El intercambio catiónico dinámico es particularmente
deseable porque proporcionaría un factor de eliminación alta para
PrP y muchos virus adventicios potenciales, incluyendo virus
adeno-asociados (AAV).
Como se señala en el presente documento, la
presente invención se refiere a purificación de virus de tipo
silvestre, modificados o recombinantes. De interés específico en la
vacunación genética y/o en las aplicaciones de terapia génica es el
uso de un adenovirus incompetente de replicación de 1ª o 2ª
generación, inactivado por deleción de E1 o por deleciones
adicionales, incluyendo vectores de adenovirus "cobardes". El
genoma de adenovirus está generalmente asociado a patologías
benignas en seres humanos y la organización genómica del virus se ha
estudiado bien desde su descubrimiento en los primeros años 50.
Además, el genoma es susceptible de manipulación, dependiendo de la
estrategia usada para construir el vector respectivo. Un virus de
replicación incompetente (tal como un vector Ad5gag en el que se han
eliminado E1/E3 que expresa un transgén gag del VIH, como se
ejemplifica en el presente documento) requiere una línea celular que
complemente las deleciones. Cualquier línea celular se puede usar
para generar vectores virales recombinantes, con líneas celulares
preferidas, pero no limitantes, que incluyen células 293 y células
PER.C6^{TM}. Para este fin, se han descrito numerosos vectores de
adenovirus recombinantes de 1ª generación en la bibliografía (por
ejemplo, véase Bett, y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:
8802-8806; documentos WO 01/02607 y WO 02/22080).
Los vectores adenovirales "Cobardes" son un vector adenoviral
de 2ª generación generalmente desprovisto de secuencias codificantes
de proteínas víricas, frecuentemente con proteínas virales
suplementadas en trans por un virus coadyuvante (a menudo un
adenovirus del que se ha eliminado E1) cultivado con el adenovector
dependiente de coadyuvante (HD) en una línea celular que los
empaqueta (por ejemplo, PER.C6^{TM}). Ausentes las proteínas
virales, estos vectores virales pueden, con carácter alternativo,
suplementarse en la traducción por una línea celular capaz de
expresar las proteínas estructurales y funcionales adenovirales
necesarias para replicación, envoltura y rescate exitoso. En vista
de la mayor popularidad de estos vectores virales y de la necesidad
definitiva para preparar cantidades a escala comerciales bien de una
vacuna de vector viral o bien de un vehículo de terapia génica, ha
llegado a ser esencial desarrollar metodología cualitativa y
cuantitativa más eficiente para producción de vectores de adenovirus
recombinantes de calidad comercial. Se entenderá que los serotipos
alternativos, incluyendo pero no limitados a los serotipos 2, 4, 12,
6, 17, 24, 26, 31, 33, 34 35, 36 y 16 son de purificación
susceptible por medio de los procedimientos a gran escala revelados
en el presente documento. Los serotipos adenovirales 2, 5 y 6, 24,
26, 35 y 36, particularmente 5 se prefieren para usar en esta
invención, dado que en este punto temporal, se sabe más sobre este
serotipo generalmente que otros serotipos y se conocen sus
secuencias de DNA completas. El adenovirus de serotipo 5 prototipo
se ha secuenciado completamente (Chroboczek y col., 1992 J. Virology
186: 280, que se incorpora por la presente mediante referencia).
Ellos también pertenecen a los adenovirus del subgrupo C, que no
están asociados con malignidades de seres humanos o de roedores. Sin
embargo, como se destaca anteriormente, se prevé que se puede usar
en esta invención cualquier serotipo de adenovirus, incluyendo
quiméricos (tal como un virus Ad recombinante "cambiado", donde
dicha región E4 de un serotipo (por ejemplo, Ad5) remplaza la región
similar de un serotipo alternativo (por ejemplo, Ad24)), que puede
tener en cuenta el crecimiento de los virus quiméricos Ad24 en una
línea celular (por ejemplo, PERC6) que expresa una región Ad5 E1.
Además, los serotipos no humanos (por ejemplo, las cepas de
adenovirus que infectan al chimpancé) pueden purificarse también por
los procedimientos descritos en el presente documento. Un vector Ad5
recombinante, pero de ninguna manera limitante, ejemplificado es
MRKAd5gag, así como Mrkad5pol, ambos de los cuales se revelan en el
documento WO 02/22080. Otro vector de Ad relacionado es Ad5gag, como
se revela en el documento WO 01/02607. Ambas de estas publicaciones
PCT se incorporan en el presente documento por referencia.
La célula huésped para usar en el procedimiento
presentado en el presente documento comprende cualquier línea
celular de mamífero que respalde replicación de la línea celular
respectiva, especialmente cualquier línea celular huésped conocida
en la técnica que respalde infección y replicación de un vector
adenoviral de 1ª o 2ª generación. Una célula hospedadora preferida
es una línea celular hospedadora que respalda infección y
replicación de un adenovirus recombinante del que se ha eliminado E1
y/o E1/E3.
Como se desvela en el presente documento, un
virus incompetente en replicación (tal como un Ad5gag, como se
ejemplifica en el presente documento) requiere una línea celular
coadyuvante que complemente la deleción de E1 del Ad5. Cualquier
línea celular tal se puede usar para generar virus recombinante, con
líneas celulares preferidas, pero no limitantes, que incluyen
células 293, células PER.C6^{TM}, células 911 de una línea celular
retinal embrionaria humana (Fallaux y col. 1996, Human Gene Therapy
7: 215-222); aminocitos transformados por E1
(Schiedner y col. 2000, Human Gene Therapy 11:
2105-2116); una línea celular A549 transformada con
E1 para un carcinoma de pulmón humano (Imler y col. 1996, Gene
Therapy 3: 75-84) y GH329: HeLa (Gao y col. 2000,
Human Gene Therapy 11: 213-219). Una línea celular
tal se transforma para respaldar replicación y empaquetamiento de un
adenovirus recombinante respectivo, tal como un adenovirus
recombinante en el que se ha eliminado E1 o E1/E3. Líneas celulares
adicionales que se pueden usar en la presente invención son de nuevo
líneas celulares que se han adaptado para actuar como células
huésped para un virus termoestable en particular. Es preferible que
la línea celular sea una línea celular continua y es más preferible
que la fuente de células cultivadas se origine a partir de un tejido
no neoplásico. Es también preferible que la fuente sea mamífera, lo
más probablemente de un origen primate, y especialmente de origen
humano. De nuevo, una línea celular preferida es una línea celular
que es útil para la propagación de un virus recombinante en el que
se ha delecionado E1 de Ad o E1/E3 de Ad; un virus recombinante que
complementa vector de adenovirus con E1 delecionado incluidas líneas
celulares transfectadas con el gen que codifica E1 de Ad que se han
seleccionado por este fenotipo transformado, tales como células 293
(células epiteliales de riñón humano) y PER.C6^{TM} (retinoblastos
embrionarios humanos). Otros tipos celulares incluyen pero no se
limitan a células HeLa, células A549 cells, células KB, células
CKT1, células NIH/sT3, células Vero, células de Ovario de Hámster
Chino (CHO), o cualesquiera células eucariotas que respalden el
ciclo de vida del adenovirus.
Cualesquiera procedimientos de producción de
virus anteriores en el procedimiento conocidos en la técnica que se
puede adaptar a cultivo celular a gran escala de células huésped de
mamíferos se pueden usar para generar el material de partida (es
decir, un cultivo de células huésped infectadas por virus que se han
sometido a un periodo tras la infección de crecimiento del cultivo
tal como para maximizar la cantidad de virus intracelular y
extracelular) para la metodología de purificación de la presente
invención, tomando en cuenta modificaciones conocidas por el técnico
según sea apropiado para tener en cuenta, por ejemplo, cambios en
densidad celular o la presencia de microtransportadores. Esta
metodología se conoce en la técnica (por ejemplo, véase Patente de
los Estados Unidos N.º 6,194,191 para una revisión de técnicas de
cultivo conocidas en la técnica, así como "Culture of Animal
Cells: A Manual of Basic Techniques", 2000, Ed. R.I. Freshney,
Wiley-Liss, ambos documentos incorporados por la
presente mediante referencia) y se pueden adaptar de virus a virus y
de sitio a sitio con el fin de optimizar la producción de virus. Por
ejemplo, las células PER.C6^{TM} se pueden cultivar en un
biorreactor de 300 l con 240 l de volumen de trabajo y se pueden
infectar con un Adenovirus recombinante que codifica un transgén gag
de VIH (tal como MRKAd5gag o Ad5gag) a una concentración celular
viable de 0,59 x 10^{6} células/ml a una multiplicidad de
infección (MOI) de 280 pv/célula. Aproximadamente cincuenta horas
después de la infección (hpi), el biorreactor se cosecha, a una
concentración celular total de aproximadamente 0,55 x 10^{6}
cells/ml con viabilidad del 55%. Al tiempo del inicio de esta
operación unitaria, aproximadamente el 25% del virus es el
sobrenadante, como por un ensayo de AEX. De forma similar, las
células PER.C6^{TM} se cultivan en Biorreactores de Onda de 20 l
con un volumen de trabajo de 10 l y se infectan con un vector de
adenovirus que codifica un transgén nef de VIH a una multiplicidad
de infección (MOI) de aproximadamente 290 partículas virales por
célula (pv/célula) y una concentración de células viables de
aproximadamente 0,72 x 10^{6} células/ml. Aproximadamente
cincuenta horas después de la infección (hpi), se cosechan dos
biorreactores de onda a una concentración celular total de
aproximadamente 0,66 x 10^{6} cells/ml con viabilidad del 81%. Al
tiempo del comienzo de la concentración, el 20,4% del virus estuvo
en los ensayos de AEX de intercambio de sobrenadante por anión.
Los siguientes Ejemplos
no-limitantes se presentan para ilustrar mejor la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cromatografía de intercambio aniónico (AEX)
con ciertas condiciones de selección de resina y operación de
columna (concentración de NaCl y pH) mantiene altas capacidades de
carga de virus. Se muestra también en el presente documento que la
inclusión de un detergente (por ejemplo PS-80) en
los tampones en funcionamiento inhibe las agregaciones durante la
carga y la elución. En conjunto, se revela en el presente documento
que el uso de la resina AEX según se practica mejorará
5-20 veces por encima de los procedimientos
previamente comunicados, con capacidad demostrada (pero no
necesariamente limitada) a 2,0 x 10^{13} pv/ml de resina. Son
cruciales para la implementación de un procedimiento económicamente
eficiente y sólido la elección de resina con una alta capacidad
dinámica para adenovirus y metodologías para asegurar que la
capacidad puede usarse sin agregación de producto. Tres avances
significativos tratan de estos asuntos: (1) Se ha seleccionado
Source 15Q (Amersham Biosciences) por su alta capacidad -otras
resinas que incluyen Source 30Q (Amersham Biosciences) y Fractogel
TMAE (EM Industries) también proporcionan resultados aceptables
aunque con capacidades más bajas que están causadas probablemente
por proporciones de área de superficie efectiva frente a volumen
menores; (2) se ha añadido PS-80 a los tampones de
funcionamiento al 0,1% evitando agregación; y (3) el producto está
cargado a una conductividad que es lo suficientemente alta
asegurando que el hexón de adenovirus libre y las impurezas
similares cromatográficamente no se unan a la resina. Por ejemplo,
la carga a una conductividad de 38 mS es aproximadamente equivalente
a NaCl 0,38 M. La concentración de sales es adecuada uniendo
partículas de adenovirus pero no las impurezas relacionadas; ello se
traduce en una capacidad de unión más alta para adenovirus. La
conductividad óptima dependerá del serotipo de adenovirus (por
ejemplo, el Adenovirus de Tipo 6 se cargaría a aproximadamente NaCl
0,33 M dado que esta concentración permite al hexón libre permanecer
no unido pero permite a las partículas virales unirse fácilmente).
Estas condiciones dan como resultado una etapa que opera
significativamente más eficientemente que otras condiciones
comunicadas. La Figura 1 muestra como opera este procedimiento. Para
propósitos ilustrativos, se muestra un cromatograma preparativo
usando el procedimiento descrito en una corriente que no ha sufrido
precipitación selectiva. En cambio, el lisado aclarado se ha tratado
con niveles altos de nucleasa. Además, la alimentación (Figura 2A),
el flujo dinámico (Figura 2B), y el eluido (Figura 2C) del
funcionamiento preparativo se muestran en un gradiente de 10
volúmenes de NaCl 0,3-0,6 M en la Figura
2A-C. Es patente que usando esta aproximación, el
pico que consta predominantemente de hexón de adenovirus puede
moverse al flujo a través del funcionamiento eliminando así
cualquier competición uniendo y significativamente incrementando la
resolución de adenovirus a partir de estas impurezas y la capacidad
de la columna. El producto de intercambio aniónico puede someterse a
diafiltración en tampón de formulación y filtrarse de forma estéril.
Alternativamente, una etapa de cromatografía adicional (por ejemplo,
intercambio iónico) puede añadirse bien antes o bien después de la
diafiltración con el potencial incrementando la solidez de
eliminación de impurezas y/o de virus/priones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron aproximadamente 12,5 litros de
material lisado con Tritón de MRKAd5gag (lote 0114) a partir de
funcionamiento de reactor de 300 l y se dividió entre alícuotas de
9,5 y de 3 l. Las alícuotas se precipitaron por separado en vasos de
precipitados de Nalgene de 20 litros. Se especificaron parámetros de
mezcla para cada alícuota reduciendo la escala de condiciones de
precipitación de 1000 litros razonables manteniendo un tiempo de
renovación volumétrico constante. Ambas alícuotas se precipitaron
añadiendo DB a una concentración final de 0,0435% en peso/volumen
usando una solución concentrada (DB al 2% en NaCl 40 mM). La
velocidad de adición de esta mezcla fue 0,3 ml/minuto para cada
litro de lisado. La solución de DB se añadió por debajo de la
superficie. El uso de la adición por debajo de la superficie está
respaldado por datos generados por los autores de la invención.
Una vez se completó la precipitación, la
filtración en profundidad se llevó a cabo secuencialmente en cada
alícuota usando el mismo aparato de filtración. El aclarado se llevó
a cabo usando un filtro CE-25 de Millipore Opticap
en serie con un Millipore Opticap DE-45. Ambos
filtros proporcionaron áreas de superficie de filtración de 0,093
m^{2} (1 pie^{2}). Todos los 12,5 litros de material precipitado
se procesaron exitosamente con una presión máxima acumulada en cada
filtro de 6,895 x 10^{3} pascales (1 psi). Tras el aclarado la
turbidez se redujo desde aproximadamente 540 a 3,6 NTU. Como se
muestra en la Tabla 2, el rendimiento a través de esta etapa fue
sólo el 60% pero pareció estar causado por fenómenos de adsorción y
se exacerbó por lo tanto por el rendimiento bajo usado en este
ejemplo.
Sólo 9,5 litros de este material se procesaron
hasta el producto final. Se llevaron a cabo concentración y
diafiltración usando un ultrafiltro de NMWCO PES de 500 Da de 0,1
m^{2} (Millipore Pellicon 2). Esta membrana se incorporó en un
aparato TFF conteniendo un alojamiento de filtro de membrana y una
bomba de lóbulo. Un factor de concentración de 20 se llevó a cabo en
el material aclarado disminuyendo el volumen de lote total. Después
de concentración, se añadió Benzonasa^{TM} a 15 U/ml de material y
el lote se hizo recircular en el sistema dos horas con la conducción
de permeado cerrada. Después de incubación el lote se sometió a
diafiltración frente a 5 volúmenes de HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM,
NaCl 1 M, pH 7,5.
La cromatografía de intercambio aniónico se
llevó a cabo a una carga de 2,4 x 10^{12} pv/ml. La caída de
presión a través de la columna no se incrementará durante la carga
indicando que la corriente estuvo esencialmente libre de restos y de
agentes contaminantes. Además, casi no se vio ninguna absorbancia de
UV (a 260 ó 280 nm) durante la carga del producto, o tras la elución
del producto (Figura 3). Estas observaciones demostraron que el
grueso de las impurezas se eliminó anteriormente en el procedimiento
de cromatografía de intercambio aniónico y son consistentes con los
datos de impurezas más adelante.
La segunda ultrafiltración se llevó a cabo
usando cinco membranas de 50 cm^{2}, 500 kD PES. Se dirigieron
cinco volúmenes de diafiltración intercambiando el virus en el
tampón de formulación. Como se muestra en la Tabla 2, el rendimiento
a través de esta etapa se disminuyó pero probablemente fue causado
por permeación de virus y/o por carga de membrana baja. El producto
se filtró de forma estéril después con un filtro de 0,22 micrómetros
Millipore Sterivex GV de 10 cm^{2}. No se vio acumularse presión
durante la filtración estéril lo que sugiere una falta de virus
agregado. Nótese que los rendimientos de procedimiento actuales son
conservadores dado que no tienen en cuenta toma de muestras
sustancial para propósitos analíticos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los datos de eliminación de Proteínas y DNA se
ilustran en Tabla 3. Nótese que los niveles de DNA residuales están
por debajo del límite de cuantificación del ensayo después de
intercambio aniónico indicando que el procedimiento ejemplificado
tiene solidez de procedimiento sustancial. Los niveles de proteínas
específicos no cambian a partir del procedimiento de UF1 al producto
final y están cerca de los niveles teóricos para adenovirus. Esta
observación es bastante consistente con la carencia de señal UV
expuesta en el flujo a través de la AEX preparativa y el lavado de
la AEX preparativa. La "limpieza" potenciada de la corriente a
través de precipitación y aclarado se cree que es la causa principal
de este incremento. La Tabla 3 también muestra que la infectividad
se mantiene a través del procedimiento.
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Se estudiaron tensioactivos alternativos para
investigar la especificidad relativa de diferentes tipos de
detergentes catiónicos. Este ejemplo estipula comprensión adicional
de la selectividad incrementada de DB. La Tabla 4 contiene la lista
de tensioactivos usada en este ejemplo junto con sus pesos de
fórmula y sus estructuras moleculares correspondientes.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Las alícuotas de 1 ml de lisado celular se
trataron con un intervalo de concentraciones de tensioactivos y se
agitaron inmediatamente. Tras filtración con filtros de jeringuilla
de 0,45 micrómetros, las muestras se analizaron para concentración
de DNA por medio del ensayo de Picogreen (Molecular Probes) y la
concentración de adenovirus se determinó usando un ensayo de HPLC de
intercambio aniónico. La Figura 4 expone los perfiles de
precipitación de adenovirus.
Una longitud de cadena más corta (por ejemplo,
CTAB frente a TTA) presenta un perfil de precipitación más distinto.
Aunque 0,03% es la concentración de tensioactivo permisible máxima
antes de la precipitación de adenovirus tanto para CTAB como para
TTA; los perfiles de DNA son diferentes (véase Figura 5). En
comparación se encontró que los perfiles de precipitación de DB y de
BTC eran casi idénticos. Aunque, cuando se desiste de mover el punto
en el que comienza la precipitación de adenovirus, la selectividad
de DNA es mayor para DB que para BTC en todas las concentraciones
(véase Figura 5). Es decir, el contacto entre el nitrógeno cargado
positivamente de BTC y el grupo de fósforo de DNA puede impedirse
estéricamente por la proximidad cercana del anillo de benceno en
BCT. Un resultado de la carga que está protegida o carecer de una
cola hidrófoba distintiva puede tener la culpa también. Se puede
concluir, sin embargo, que las estructuras que forman anillos son
más sólidas y selectivas para DNA. La interacción hidrófoba
propuesta podría ser la fuerza motriz para este fenómeno. Una
diferencia única aunque significativa entre las moléculas de CPC y
CTAB es la presencia de un anillo piridinio. La carga positiva se
distribuye por todo este anillo. Como se ve en la Figura 5 la
precipitación inicial de adenovirus por CPC y CTAB comienza en el
0,03%. Además el perfil de precipitación es mucho menos agresivo
cuando la carga positiva se distribuye. Sin embargo, como se muestra
también en la Figura 5, CTAB precipita más DNA para una mayoría de
las concentraciones de tensioactivos.
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La precipitación de DNA de bromuro de domifeno
(DB) en el lisado de PERC.6^{TM} es sensible a las condiciones de
mezcla. La actuación de la filtración en profundidad para diferentes
concentraciones de mezcla generadas por velocidad de impulsor
diferente se evalúa en este Ejemplo. MRKAd5gag0114 se precipitó a
diversas velocidades de impulsor de 30, 65 y 250 RPM. El aclarado
consistió en una filtración en profundidad de dos fases. Los
precipitados se filtraron primero usando un CE-25 de
Millipore Millistak +50 (0,00186 m^{2} (0,02 pies^{2})) a 96,875
l/hr/m^{2} (9 l/hr/pie^{2}). El material se almacenó y filtró
usando un DE-45 Millipore Millistak +50 (0,00186
m^{2} (0,02 pies^{2})) a la misma velocidad de flujo. Las caídas
de presión como una función del rendimiento para diversas
condiciones de mezcla se comparan con el control antes de la
precipitación en la Figura 6. La mezcla a 30 RPM mostró un
incremento significativo en rendimiento para el filtro a 137,9 x
10^{3} pascales manométricos (20 psig) según se compara con el
caso de control, pero mostró pérdidas en rendimiento general en
relación a las condiciones de mezcla a 65 y 250 RPM. Las otras
condiciones de mezcla mostraron menores rendimientos que el caso
control para el filtro CE-25, pero mostraron
rendimientos mayores en general entre precipitación y filtración en
profundidad que el caso de control. La dependencia de aclarado en
condiciones de mezcla subraya la importancia de la reoptimización
después de que se han determinado las condiciones de mezcla. Como
para el rendimiento del DE-45, se observó
acumulación de presión pequeña
(< 6,895 x 10^{3} pascales (< 1 psi)) en todas las suspensiones examinadas. Así dado que el DE-45 nunca llegó a cerrar su capacidad, el filtro CE-25 es el factor limitante en el esquema de aclarado. Aunque los filtros de CE-25 redujeron la turbidez para cantidades que varían, como se ve en la Tabla 5, los siguientes filtros de DE-45 redujeron la turbidez de los lisados precipitados a menos de 6 NTU, mientras que sólo redujeron la turbidez del lisado no precipitado a 10.
(< 6,895 x 10^{3} pascales (< 1 psi)) en todas las suspensiones examinadas. Así dado que el DE-45 nunca llegó a cerrar su capacidad, el filtro CE-25 es el factor limitante en el esquema de aclarado. Aunque los filtros de CE-25 redujeron la turbidez para cantidades que varían, como se ve en la Tabla 5, los siguientes filtros de DE-45 redujeron la turbidez de los lisados precipitados a menos de 6 NTU, mientras que sólo redujeron la turbidez del lisado no precipitado a 10.
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Se llevó a cabo un cultivo a escala celular de
240 l en el biorreactor de 300 l. Este lote confirmó la
escalabilidad del proceso de purificación con operaciones unitarias
individuales que corren al equivalente de 60 a 214 litros de
suspensión celular. El rendimiento del procedimiento general fue del
54% según se midió por la HPLC de intercambio aniónico. La
proporción de infectividad (pv/IU) y el contenido específico de DNA
de cada producto final fueron (31 pv/IU) y (< 16,5 pg/10^{11}
pv), respectivamente, y fueron comparables a datos históricos.
Lisis - La lisis se completó por la
adición de tampones concentrados logrando concentraciones finales de
Tritón X-100 al 0,1% y
Polisorbato-80 al 0,05%. El lisado se mantuvo
durante toda una noche a temperatura ambiente antes de la etapa de
precipitación por detergente.
Precipitación - La precipitación de DNA
se llevó a cabo a escala de 214 l en el biorreactor. Una solución de
bromuro de domifeno al 0,5% con NaCl 40 mM se añadió por encima de
la superficie durante aproximadamente dos horas a una concentración
final de bromuro de domifeno al 0,04%. El agitador se operó a 80 rpm
durante este tiempo. La velocidad de agitación se seleccionó
operando a un tiempo de recambio volumétrico que se ha demostrado
que es efectivo a escala menor y que podría implementarse a escala
mayor. Después de la precipitación, aproximadamente 153 kg de lisado
precipitado se transfirieron por filtración profunda.
Filtración en Profundidad - El lisado
precipitado se aclaró con un esquema de filtración en profundidad de
dos fases. Para este funcionamiento, se usaron cartuchos Millistak
de 30,48 centímetros (doce pulgadas) con un filtro CE20 de 0,6324
metros cuadrados (6,8 pies cuadrados) seguido por un filtro
CE-50 de 0,6324 metros cuadrados (6,8 pies
cuadrados). La filtración se llevó a cabo a una velocidad de flujo
constante de 2 l/minuto y se recuperaron 144,2 kg de lisado
aclarado. El rendimiento general fue del 84%.
Ultrafiltración - Aproximadamente 60 l de
lisado aclarado se concentraron 20 veces con 0,3 m^{2} de área de
membrana (PES de 500 kDa de Millipore Pellicon II). La velocidad de
recirculación se mantuvo a 1 l/minuto y se controló el flujo
permeable a 0,3 l/min. La digestión con nucleasas se llevó a cabo
por la adición de Benzonasa^{TM} a 15 U/ml seguidas por dos horas
de incubación a temperatura ambiente. A continuación, el tampón se
intercambió con 5 volúmenes de diafiltración de HEPES 50 mM,
MgCl_{2} 2 mM, NaCl 1 M, pH 7,5 para eliminación de impurezas. El
producto se mantuvo durante toda una noche a 4ºC.
Cromatografía de Intercambio Aniónico -
El producto de UF1 se diluyó a una conductividad de 38 mS/cm usando
HEPES 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, PS-80 0,1%, pH 7,5. Se
empaquetó una columna FineLine de diámetro de 10 cm (Amersham
Biosciences) con un total de 863,5 ml de resina Source 15Q (Amersham
Biosciences). Se cargó el producto a una velocidad lineal de 1,5
cm/min, se lavó con 5 volúmenes de columna de HEPES 50 mM,
MgCl_{2} 2 mM, NaCl 0,39 M, PS-80 al 0,1%, pH 7,5
y después se eluyó durante un gradiente de cuatro columnas a NaCl
0,47 M.
Ultrafiltración - El pico de producto se
diluyó y ajustó a una concentración de adenovirus de aproximadamente
1,05 x 10^{12} pv/ml y a una concentración de sal de NaCl 1 M. El
lote se sometió a diafiltración en tampón de formulación (Tris 5 mM,
NaCl 75 mM, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%, PS-80
al 0,005%, pH 8,0) por medio de membrana PES de 500 kDa de 0,1
m^{2} (Millipore Pellicon II Biomax). El flujo permeable se
mantuvo a 80 ml/min.
Filtración Estéril - Lo retenido por
ultrafiltración se filtró de forma estéril con un filtro
Millipak-20 de Millipore (100 cm^{2}) a una
velocidad de flujo de alimentación constante de 150 ml/min.
La Tabla 6 muestra la etapa y los rendimientos
netos de MRKAd5gag. Este lote produjo 1,91E15 partículas virales con
un rendimiento neto general del 54%. Nótese que en varios ejemplos
la entrada a una etapa es significativamente menor que el
rendimiento de la etapa anterior debido a la toma de muestras.
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La Figura 7 muestra análisis descritos por
SDS-PAGE del lote ejemplificado así como algunos
experimentos adicionales que no se describen en el presente
documento. Los carriles 2-4, en particular, muestran
procedimientos intermedios de este ejemplo y demuestran la alta
pureza del producto dado que todas las bandas significativas se
identifican como proteínas estructurales de adenovirus.
La Tabla 7 resume la eliminación de DNA para el
lote. Se logró reducción logarítmica de DNA de más de 2 por
precipitación y filtración en profundidad. De nuevo, se logran los
niveles en o cerca del límite de detección del ensayo. La Tabla 7
presenta también el perfil de eliminación de detergente durante este
funcionamiento ejemplificado. Los detergentes se eliminaron ambos de
forma efectiva en intercambio aniónico y en la segunda
ultrafiltración. La cantidad de detergente en la corriente de
producto se redujo hasta bajar el límite de detección del ensayo
(aproximadamente 0,001%) después de UF2.
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MRKAd5gag comparando un procedimiento que
incorpora precipitación de CTAB y no incorpora ningún tratamiento
con nucleasas (armC) con un procedimiento que usa niveles de
nucleasa elevados (Benzonasa^{TM} a 150 U/ml, RNasa a 150 U/ml)
pero ninguna precipitación (Rama ALa Tabla 8 contiene los datos de
eliminación del DNA residual para ambas ramas de purificación.
Nótese que la precipitación de CTAB reduce la precipitación general
de DNA en el procedimiento mientras el caso de base logra la mayoría
de su eliminación a través del tratamiento con nucleasas (UFI CR a
UFI DR). Los niveles de DNA en el Producto de Intercambio Aniónico
(AEP) están dentro de la variabilidad del ensayo. Estos datos
muestran que una etapa de precipitación basada en detergente puede
reemplazar un tratamiento de nucleasas de alta concentración
enteramente sin un impacto sobre la calidad del producto.
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En este ejemplo, los procedimientos que usan
precipitación de CPC o DB (sin ningún uso de nucleasa) se comparan
con un alto control de nucleasa. En particular, se comparan los
siguientes escenarios de purificación:
- 0113A:
- ninguna precipitación, Benzonasa y RNasa 150 U/ml cada una, carga de AEX a aproximadamente 5 x 10^{12} pv/ml.
- 0113C:
- precipitado con CPC, sin uso de nucleasa, carga de AEX a aproximadamente 5x10^{12} pv/ml.
- 0113D:
- precipitado con DB, sin uso de nucleasa, carga de AEX a aproximadamente 5 x 10^{12} pv/ml.
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Los rendimientos de la etapa son comparables a
lo largo de las tres ramas salvo para rendimientos de UF1
inusualmente bajos en la rama A (véase Tabla 9).
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Los datos de DNA residuales para el lote se
enumeran en la Tabla 10. Estos datos sugieren una eficiencia general
alta para los procedimientos basados en precipitación incluso en la
ausencia de cualquier uso de nucleasa. El producto de intercambio
aniónico no se procesó por UF2 en este ejemplo, de tal forma que los
productos finales no están disponibles.
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La eliminación de proteínas se muestra más
adelante en la Tabla 11La eficiencia de eliminación de proteínas en
la etapa UF1 parece estar significativamente incrementada antes de
la precipitación, pero las diferencias de pureza en la etapa de AEP
no se pueden discernir usando proteína total dado que la gran
mayoría está presente en el producto. Como un resultado, una
impureza proteica relativa a los AEP se trata por análisis de
SDS-PAGE en el Ejemplo 8.
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Mientras que se muestra que CTAB no tiene un
efecto sobre la infectividad de adenovirus (lote 0112), las
diferencias estructurales y las diferencias en los mecanismos
posibles de precipitación de CPC y de DB garantizaron datos de
infectividad adicionales. Para estas tres purificaciones, la
proporción de partículas virales frente a unidades de infección fue
como sigue: A-26 pv/UI; C-32 pv/UI;
D-29 pv/UI. Estas proporciones son equivalentes
estadísticamente y demuestran que los procedimientos esbozados en el
presente documento no tienen impacto en la infectividad del
producto.
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Se llevó a cabo análisis de proteínas en gel de
SDS-PAGE en muestras en curso a partir de lotes de
purificación en desarrollo de MRKAd5gag0112, MRKAd5gag0113 (Ejemplo
7) y MRKAd5gag0114 (Ejemplo 2), como se muestra en la Figura 8. Se
pueden hacer varias observaciones importantes. Primero, incorporar
precipitación de CTAB (0112C, carril 3) parece conducir a pureza de
proteínas más alta en el Producto de Intercambio Aniónico (AEP) que
en la rama de control (0112A, carril 2). Segundo, los carriles
5-10 muestran pureza similar a partir del AEP a
pesar de las siguientes variaciones de procedimiento: (a) la carga
de AEX a 5, 10 y 15 x 10^{12} pv por ml de resina con tratamiento
de Benzonasa^{TM} a 150 U/ml y sin precipitación
(0113A1-A3-carriles
5-7); (b) uso de sólo 5 U/m de Benzonasa sin
precipitación (0113B-carril 8); (c) precipitación de
CPC o de DB sin uso de nucleasas (carriles 9 y 10 de 0113). Tercero,
el AEP del lote 0114 (carril 4),que incorpora tanto precipitación de
DB como uso de niveles bajos de Benzonasa, muestra mejor pureza de
proteínas (por ejemplo menos de 39 KDa y 50 KDa de impurezas).
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El procedimiento se aumentó a escala
adicionalmente, empezando con 600 l de lisado celular. Los
procedimientos específicos usados son similares a aquellos descritos
en el Ejemplo 5, pero incluyen las siguientes diferencias: (1) la
filtración en profundidad se llevó a cabo con un filtro CE20 de
Millipore seguido por un filtro CP50 de CUNO (que incorpora carga
positiva) en una proporción de área 2:1, (2) se usaron ultrafiltros
de 300 kDa, (3) se incluye PS-80 al 0,1% en el
tampón de diafiltración y (4) un adenovirus recombinante sometido a
purificación fue MRKAd5pol, que se describe en detalle en
publicación PCT WO 02/22080.
Los rendimientos para este procedimiento se
muestran en la Tabla 12. La infectividad del producto final se
confirmó por un ensayo TCID_{50}, con una proporción de
infectividad de 4 pv/UI. El tamaño de partícula promedio por
Dispersión de Luz Dinámica fue 123 nm, consistente con las
expectativas teóricas. Niveles de DNA residuales específicos,
niveles de proteínas totales y productos residuales de procesos se
muestran en la Tabla 13. Estos datos confirman adicionalmente la
escalabilidad del proceso.
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En este ejemplo, se purifica el adenovirus de
tipo 6 (del subgrupo C). Los cambios de procedimiento en este
ejemplo están predominantemente en la etapa de cromatografía de
intercambio aniónico. Allí, el producto de UF1 se diluyó a
aproximadamente 30,7 mS/cm y se cargó sobre la resina de Source 15Q.
La columna se lavó con un tampón que contiene NaCl 0,32 M. La
elución de producto tuvo lugar a través de un gradiente de volumen
de cuatro columnas a una concentración de NaCl final de 0,41 M. Por
lo demás, el procedimiento se hace funcionar esencialmente como se
describe en el Ejemplo 9.
Los rendimientos a partir de esta purificación
demuestran que la actuación del procedimiento es comparable a Ad5
(Tabla 14). Específicamente, los niveles de DNA residuales por
Q-PCR se redujeron exponencialmente por encima de 2
tras precipitación y aclarado. Los niveles se redujeron a 3
pg/10^{11} pv en el producto. Los valores de proteína totales
específicos (Tabla 15) indican también que la inmensa mayoría de la
proteína total se elimina por el final de UF1 y las impurezas
residuales se normalizan tras AEX. Como se ve con adenovirus de tipo
5 este dato indica que los tipos de adenovirus en el mismo subgrupo
se pueden purificar.
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En este ejemplo, se purifica el adenovirus de
tipo 35 (del subgrupo B). Los cambios de procedimiento según se
comparan con el Ejemplo 5 estuvieron predominantemente en la etapa
de cromatografía de intercambio aniónico preparativo. Allí, el
producto de UF1 se diluyó a aproximadamente 28 mS/cm y se cargó
sobre la resina de Source 15Q. La columna se lavó con NaCl 0,29 M y
se eluyó en un gradiente de cuatro volúmenes de columna a NaCl 0,38
M. Por lo demás, el procedimiento se hizo funcionar esencialmente
como se describe en los Ejemplos 5 y 9.
Los rendimientos de esta purificación demuestran
que la actuación del proceso es comparable a Ad5 (Tabla 16). Los
niveles de DNA residuales específicos por Q-PCR se
redujeron exponencialmente por encima de 3 tras precipitación y
aclarado a 11 ng/10^{11} pv. Los niveles se redujeron a 1,0
ng/10^{11} pv tras la primera ultrafiltración (UF1). Los valores
de proteínas totales específicos (Tabla 17) también indican que la
inmensa mayoría de la proteína total se elimina por el final de UF1;
estos datos indican que este producto alcanza pureza relativamente
sin purificación cromatográfica alguna y que muchos subgrupos de
adenovirus pueden purificarse por el procedimiento existente, a
saber sometiendo a un lisado aclarado, precipitado por SPA a una
etapa de ultrafiltración individual.
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Se inyectaron cantidades pequeñas de adenovirus
purificados por cromatografía o por ultracentrifugación con CsCl en
una columna de Source 15Q a escala analítica (véase Figura 9). En
este ejemplo, se usó un gradiente de NaCl de 0,2 a 0,6 M. El
procedimiento es claramente capaz de unir/eluir virus a partir de
subgrupo C (Ad5), subgrupo D (Ad24), o subgrupo B (Ad35). Además,
inyectando nuevos tipos con un tipo conocido (en este caso Ad5), el
tiempo de elución relativa se puede calcular; a partir del tiempo de
elución relativo y del conocimiento de tampones preparativos para
Ad5, se pueden determinar fácilmente tampones preparativos para
cualquier otro serotipo. Este cambio es la única modificación
notable necesaria para adaptar esta invención a otros serotipos de
adenovirus.
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Un intervalo de concentraciones de DB (0 al
0,065%) se añadió a viales de 1 m de lisados celulares de adenovirus
diferentes que contenían aproximadamente Tritón al 0,1%,
PS-80 al 0,05%, MgCl_{2} 2 mM y Tris 25 mM, pH 8.
Las células se prepararon en cultivo de suspensión con infección a
aproximadamente 10^{6} células/ml. Estas muestras se removieron y
filtraron inmediatamente con filtros de jeringuilla de 0,45
micrómetros. Se retiraron alícuotas para la determinación de
concentraciones de adenovirus y DNA por medio de ensayos de
AEX-HPLC y de Picogreen.
Como se muestra en la Figura 10, los adenovirus
no precipitan de forma medible a concentraciones de cloruro de
domifeno por debajo del 0,05%. Por lo tanto, la adición de bromuro
de domifeno a niveles entre 0,03 y 0,05% dará como resultado
precipitación selectiva de DNA. Para las propiedades de corriente
particulares usadas en el presente documento, la adición al 0,04% es
adecuada para todos los serotipos. La precipitación de impurezas
residuales por CPC, CTAB y SPA alternativos mencionados muestra
también actuación similar en subgrupos de adenovirus múltiples.
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La purificación de adenovirus usando un
procedimiento que incluye intercambio catiónico puede venir por una
cromatografía de intercambio aniónico como se describe en los
ejemplos anteriores. Este ejemplo describe el procesamiento del
producto de intercambio aniónico por una segunda ultrafiltración, un
ajuste de pH, un intercambio catiónico dinámico y un segundo ajuste
de pH/tampón para llegar a un producto en un tampón de formulación
final.
El producto de intercambio aniónico se diluyó y
ajustó a una concentración de adenovirus de aproximadamente 1,77 x
10^{12} pv/ml y a una concentración de sal de NaCl 1 M. El lote se
sometió a ultrafiltración en tampón (Tris 5 mM, NaCl 10 mM,
MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%, PS-80 al 0,005%, pH
7,4) por medio de tres membranas de PES de 0,05 m^{2} de 300 kDa
(Millipore Pellicon XL). El flujo permeable se mantuvo a 80
ml/min-m^{2}.
Se ajustó el pH de la parte retenida
ultrafiltrada a aproximadamente 6,5 con tampón (Tris 5 mM, Histidina
0,2 M, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%,
PS-80 al 0,005%, HCl 50 mM, pH 6,5) antes de la
etapa de cromatografía de intercambio catiónico.
Se empaquetó una columna Vantage L de 1,6 cm de
diámetro (Millipore Corporation) con 18,8 ml de resina Source 30S
(Amersham Biosciences). El producto se cargó a una velocidad lineal
de 1 cm/minuto y se lavó con 6 volúmenes de columna de tampón (Tris
5 mM, Histidina 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, sacarosa 5%,
PS-80 al 0,02%, pH 6,5).
La operación se llevó a cabo en modo dinámico y
la recogida del producto se detuvo una vez la A_{260} se aproximó
al nivel de línea base. El producto se ajustó a condiciones de
formulación añadiendo Tris 0,17 M, Histidina 10 mM, NaCl 2,27 M,
MgCl_{2} 1 mM, sacarosa al 5%, PS-80 al 0,02%,
tampón al pH 9,3La Tabla 18 muestra el rendimiento para este
procedimiento.
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Este ejemplo demuestra que una centrífuga
continua con un filtro de profundidad de refinado se puede usar
aclarando el lisado celular precipitado. El lisado celular
precipitado de un Ad5 se centrifugó usando una centrífuga continua
CARR Pilot Powerfuge a un tiempo de residencia de 2 minutos y tanto
a 20.000 G como a 10.00 G. El recipiente usado tiene un volumen de
aproximadamente 1 litro. El centrado se alimentó continuamente
dentro de un filtro de profundidad CP50 de CUNO a 1,50696
LPM/m^{2} (0,14 LPM/pie^{2}). Las muestras de centrado y de
filtrado de puntos temporales se tomaron periódicamente controlando
el progreso del aclarado. Los rendimientos de adenovirus por toda la
centrifugación estaban en exceso del 90%, con un rendimiento de
aclarado general del 80%. La turbidez del lisado aclarado fue menos
de 2 NTU. El lisado aclarado almacenado después se procesó más
adelante según se describe en otros ejemplos con resultados
similares en términos de eliminación de DNA residual, pureza de
proteínas e infectividad del producto.
La presente invención no está limitada en
alcance por las reivindicaciones específicas descritas en el
presente documento. De hecho, varias modificaciones de la invención
además de aquellas descritas en el presente documento serán patentes
para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción
anterior. Se pretende que dichas modificaciones entren dentro del
ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (6)
1. Un procedimiento de purificar partículas de
adenovirus a partir de una preparación de cultivos celulares que
comprende:
- a)
- lisar células dentro de la preparación de cultivo celular;
- b)
- aclarar el lisado que contiene las partículas adenovirales;
- c)
- tratar el lisado aclarado con nucleasa; y
- d)
- someter el lisado aclarado y tratado con nucleasa a cromatografía de intercambio aniónico;
en el que los tampones usados en la
cromatografía de intercambio aniónico comprenden un tensioactivo no
iónico.
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2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el tensioactivo no iónico es polisorbato-80
(PS-80).
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2 en el que la nucleasa de la etapa c) es
benzonasa.
4. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior en el que el producto de intercambio
aniónico se somete a diafiltración en tampón de la formulación y se
filtra de forma estéril.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4
que comprende una etapa de cromatografía adicional antes o después
de la diafiltración.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5 en
el que la etapa de cromatografía adicional es una etapa de
cromatografía de intercambio catiónico.
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