ES2357603T3

ES2357603T3 - Método para producir proteínas gamma-carboxiladas.

Info

Publication number: ES2357603T3
Application number: ES04775534T
Authority: ES
Inventors: Christel Fenge; Ann LÖVGREN; Anders Thelin
Original assignee: MedImmune Ltd; AstraZeneca AB
Current assignee: MedImmune Ltd; AstraZeneca AB
Priority date: 2003-10-14
Filing date: 2004-10-12
Publication date: 2011-04-28
Anticipated expiration: 2024-10-12
Also published as: ES2532470T3; IL174633A0; JP4658946B2; TW200523365A; HK1155475A1; NZ578306A; UY28558A1; PL1678297T3; NZ546584A; IL226313A0; JP2007508820A; WO2005038019A1; US20050164367A1; US20110092429A1; CA2541764C; RU2009123931A; RU2372401C2; IL174633A; CN102443548A; BRPI0415277A

Abstract

Una célula huésped eucariota que comprende al menos un vector de expresión que comprende: una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y una molécula de ácido nucleico que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un segundo promotor, en el que el primer promotor se selecciona de promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV), pEF-1α, pRSV o pUbC, y el segundo promotor se selecciona de promotor temprano inmediato de SV40, promotor FIX minimizado o promotor de quinasa timidina de HSV.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y una molécula de ácido nucleico 5 que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un segundo promotor. La invención además se refiere a un método para producir una proteína que requiere gamma-carboxilación con altos rendimientos.

Antecedentes de la invención

El sangrado es un problema clínico común. Se da como consecuencia de enfermedad, traumatismo, cirugía 10 y tratamiento medicinal. Es urgente parar mecánicamente el sangrado. Esto puede ser difícil o incluso imposible debido a la localización del sangrado o porque difunda desde muchos vasos (pequeños). Los pacientes que están sangrando pueden requerir además un tratamiento con agentes que favorezcan la hemostasis. Pueden ser productos derivados de la sangre (hemoterapia), agentes que causen la liberación de agentes hemostáticos endógenos, factores de coagulación recombinantes (F), o agentes que retrasen la disolución de los coágulos de 15 sangre.

La primera línea de tratamiento entre los productos derivados de la sangre, a menudo obtenidos del hospital local, son sangre entera para la sustitución de volumen y apoyo de la hemostasis, glóbulos rojos empaquetados para la mejora de la capacidad del transporte de oxígeno, concentrados de plaquetas para hacer crecer el número de plaquetas (si es bajo o deficiente) y plasma congelado fresco para facilitar la hemostasis (coagulación de la sangre y 20 agregación de plaquetas). La segunda línea de productos derivados del plasma que facilitan la hemostasis son crioprecipitados de plasma, concentrados de complejo de protrombina, concentrados de complejo de protrombina activada y factores de coagulación purificados. Hoy en día están disponibles diversos factores de coagulación como proteínas recombinantes humanas, inactivos (factores de coagulación VIII y IX) y activados (factor de coagulación VIIa). 25

La hemofilia es un trastorno del sangrado hereditario o adquirido tanto con el factor de coagulación anormal o deficiente o anticuerpos dirigidos hacia un factor de coagulación que inhibe la función procoagulante. Las hemofilias más comunes son la hemofilia A (falta del factor de coagulación VIII) y la hemofilia B (factor IX). Los factores de coagulación simple purificados o recombinantes son el principal tratamiento de los pacientes con hemofilia. Los pacientes con anticuerpos inhibitorios presentan un problema con el tratamiento ya que también 30 pueden neutralizar el factor de coagulación que se administra al paciente. La forma activa de la proteína C (APC) es un inhibidor de la coagulación del plasma por degradación de los factores de coagulación Va y VIIIa activados. Se ha mostrado que la APC recombinante es un tratamiento eficaz de una indebida coagulación del plasma en pacientes con sépsis.

Los factores de coagulación para uso terapéutico se pueden obtener de plasma humano, aunque el 35 procedimiento de purificación no es simple y requiere de muchas etapas cuyos fines son, algunos, eliminar los virus contaminantes. Pero incluso con medidas de seguridad extensivas y la evaluación de productos derivados de la sangre, la contaminación con virus infecciosos o priones no puede descartarse. Debido a este riesgo, es muy deseable producir proteínas terapéuticas humanas a partir de células recombinantes cultivadas en medio sin componentes derivados de animales. Esto no siempre es inmediato ya que muchas proteínas requieren un huésped 40 mamífero para producirse en una forma totalmente funcional, es decir para modificarse correctamente post-translacionalmente. Entre los factores de coagulación producidos comercialmente en células recombinantes están FVII (NovoSeven), FVIII (Kogenate, Recombinate, Refacto) y FIX (BeneFix) (Roddie y Ludlam. Blood Rev. 11:169 - 177, 1997) y Proteína C Activa (Xigris). Uno de los principales obstáculos en la obtención de grandes cantidades de factores de coagulación humanos recombinantes completamente funcionales se basa en el dominio Gla presente en 45 FII, FVII, FIX, FX y proteína C. Este dominio contiene residuos de ácido glutámico que están modificados post-translacionalmente por la adición de grupos carboxilo. La producción de estos factores está dificultada por el hecho de que la sobre-expresión de estos da como resultado una proteína infra-carboxilada y, por lo tanto, inactiva. Las modificaciones Gla son el resultado de la acción de una enzima dependiente de la vitamina K denominada γ-glutamil carboxilasa (GGCX). Esta enzima ha sido estudiada extensivamente por muchos científicos, particularmente 50 aquellos implicados en la investigación del factor de coagulación (documento WO-A-8803926; Wu et al. Science 254(5038): 1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274(24):16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS letters 445:256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec et al., Eur J Biochem 269:6162-55 6172, 2002; Hallgren et al., Biochemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey et al., The Journal of Biological Chemistry 278(10):8363-8369, 2003). Al menos dos grupos científicos han intentado enfoques para incrementar los rendimientos expresando conjuntamente GGCX con el factor de coagulación FIX, pero no tuvieron éxito (Rehemtulla, et al. 1993, ibid; Hallgren et al. 2002, ibid). Considerando el gran interés en las proteínas γ-carboxiladas, se puede asumir que han fallado muchos más ensayos de expresión conjunta y que por eso no han 60 sido publicados.

Para el FII humano (protrombina) al menos 8 de cada 10 residuos Glu tienen que modificarse correctamente para obtener completamente la protrombina funcional (Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers y Walz 'Prothrombin and other vitamin K proteins', CRC Press, 1986). Se han realizado grandes esfuerzos en la obtención de unos altos niveles de producción de rhFII usando diversos sistemas diferentes tales como células CHO, células BHK, células 293 y sistemas de expresión de virus de vacuna, pero han fallado todos o 5 han dado como resultado un producto infra-carboxilado y por eso una protrombina funcionalmente inactiva (Jørgensen et al., J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2):129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid; Wu y Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999). Las primeras productividades publicadas para la protrombina recombinante carboxilada humana son bajas; 20 mg/L para 10 protrombina mutante (Côte et al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994), 0,55 mg/L para protrombina humana expresada en células CHO (completamente carboxilada, Jørgensen et al. 1987, ibid), 25 mg/L en células CHO (grado de carboxilación no mostrado, Russo et al. 1997, ibid).

El documento WO 92/19636 describe la clonación e identificación de la secuencia de una carboxilasa dependiente de la vitamina K humana y bovina. La solicitud sugiere la expresión conjunta de la carboxilasa 15 dependiente de la vitamina K y una proteína dependiente de la vitamina K en una célula huésped adecuada para preparar la proteína dependiente de la vitamina K. No se ilustra la expresión conjunta de la carboxilasa y la proteína dependiente de la vitamina K.

Son todavía necesarios mejores métodos para producir factores de coagulación de la sangre activados con altos rendimientos. La presente invención se establece para abordar esta necesidad. 20

Compendio de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona una célula huésped eucariota que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y una molécula de ácido nucleico que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la 25 expresión que comprenden un segundo promotor, en el que el primer promotor se selecciona de promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV), pEF-1alpha, pRSV o pUbC, y el segundo promotor se selecciona de promotor temprano inmediato de SV40, promotor FIX minimizado o promotor de quinasa timidina de HSV.

También se describe una célula que se modifica para expresar (i) una proteína que requiere gamma-carboxilación, y (ii) una γ-glutamil carboxilasa, en la que las proteínas (i) y (ii) se expresan en una proporción entre 30 10:1 y 500:1.

También se describe una célula huésped eucariota genéticamente modificada que comprende:

(i) una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína γ-glutamil carboxilasa en la que dicha proteína γ-glutamil carboxilasa que codifica la secuencia se une operativamente a secuencias control de la expresión que permiten la expresión de la proteína γ-glutamil carboxilasa por dicha célula; y 35

(ii) un polinucleótido que codifica una proteína que requiere carboxilación por la proteína γ-glutamil carboxilasa operativamente unida a secuencias control de la expresión que permiten la expresión de dicha proteína que requiere carboxilación por dicha célula;

en la que la célula es capaz de expresar la proteína γ-glutamil carboxilasa y la proteína que requiere carboxilación en la proporción de al menos 1:10. 40

El documento WO 02/29045 describe una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere una gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión y, una molécula de ácido nucleico que codifica una gamma-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la expresión.

De acuerdo con un aspecto más de la invención se proporciona un vector que comprende una molécula de 45 ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y una molécula de ácido nucleico que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un segundo promotor, en el que el primer promotor se selecciona de promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV), pEF-1alpha, pRSV o pUbC, y el segundo promotor se selecciona de promotor temprano inmediato de SV40, promotor FIX 50 minimizado o promotor de quinasa timidina de HSV.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención se proporciona un método para producir proteína gamma-carboxilada que comprende: (i) cultivar una célula eucariota adaptada para expresar una proteína que requiere gamma-carboxilación y γ-glutamil carboxilasa en una proporción de al menos 10:1, bajo condiciones adecuadas para la expresión de ambas proteínas, y (ii) aislar la proteína gamma-carboxilada. En una realización el método se usa 55 para producir el Factor IX humano gamma-carboxilado y en otra realización el método se usa para producir

protrombina humana gamma-carboxilada. En otra realización, la proteína gamma-carboxilada producida es el Factor X humano gamma-carboxilado.

También se describe un método para la producción de una proteína gamma-carboxilada en una línea celular de un mamífero, que comprende la etapa de expresar, conjuntamente con dicha proteína que requiere gamma-carboxilación en la línea celular de un mamífero, una γ-glutamil carboxilasa, en la que la cantidad de 5 proteína expresada que requiere gamma-carboxilación es al menos 10 veces mayor que la cantidad de γ-glutamil carboxilasa expresada, y (ii) aislar la proteína gamma-carboxilada. En una realización el método se usa para producir el Factor IX humano gamma-carboxilado y en otra realización el método se usa para producir protrombina humana gamma-carboxilada. En otra realización, la proteína gamma-carboxilada producida es el Factor X humano gamma-carboxilado. 10

También se describe una proteína gamma-carboxilada aislada producida de acuerdo con los métodos anteriores, y el uso de proteína gamma-carboxilada aislada producida de acuerdo con los métodos anteriores en terapia de coagulación o el uso de proteína gamma-carboxilada aislada producida de acuerdo con los métodos anteriores para la fabricación de un medicamento para uso en terapia de coagulación.

También se describe una proteína gamma-carboxilada aislada producida de acuerdo con los métodos 15 anteriores, y el uso de proteína gamma-carboxilada aislada producida de acuerdo con los métodos anteriores en terapia de coagulación o el uso de la proteína gamma-carboxilada aislada producida de acuerdo con los métodos anteriores para la fabricación de un medicamento para uso en terapia de coagulación.

De acuerdo todavía con un aspecto más de la invención se proporciona un método para producir una composición farmacéutica adecuada para inducir la coagulación de la sangre o promocionar un incremento o 20 decrecimiento de la coagulación, que comprende purificar la proteína carboxilada activa expresada desde una célula huésped adaptada para expresar una proteína que requiere gamma-carboxilación y γ-glutamil carboxilasa en una proporción de entre 10:1 y 500:1 y mezclar la proteína carboxilada purificada con uno o varios vehículos farmacéuticamente aceptables o excipientes y una composición farmacéutica obtenible del método. En una realización, la proteína carboxilada activa es el Factor IX humano gamma-carboxilado y en otra realización la 25 proteína carboxilada activa es la protrombina humana gamma-carboxilada. En otra realización, la proteína carboxilada activa es el Factor X gamma-carboxilado.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1a representa un mapa de plásmido del vector de expresión conjunta de PN32 (protrombina + GGCX). 30

La Figura 1b representa un mapa de plásmido del vector de expresión Ptext5 (protrombina).

La Figura 2 representa un mapa de plásmido del vector de expresión conjunta de PP6 (protrombina + GGCX).

La Figura 3a representa un mapa de plásmido del vector de expresión conjunta de F9NopA (factor IX + GGCX).

La Figura 3b representa un mapa de plásmido del vector de expresión conjunta de F9hglx (factor IX + GGCX).

Descripción detallada de la invención 35

Los inventores han analizado un diferente enfoque para la expresión de factores de coagulación dependientes de la vitamina K recombinantes apropiadamente carboxilados a altos niveles, que implica la expresión conjunta del factor de coagulación dependiente de la vitamina K y una γ-glutamil carboxilasa (GGCX) en una proporción diferencial. Como ejemplo, los inventores han expresado una protrombina humana (rhFII) y GGCX humano. En vez de usar promotores fuertes para ambos rhFII y GGCX como han tratado otros (Rehemtulla et al., 40 1993, ibid; Hallgren et al., 2002, ibid), los inventores han usado una estrategia que se centra en la fuerte expresión de FII en combinación con la expresión débil o muy débil de GGCX, tal que la cantidad de GGCX expresada fue menor que 1/10 de la rhFII expresada. Para sorpresa de los inventores, esta estrategia condujo a altos niveles de rhFII secretado modificado correctamente y una buena viabilidad de las células huésped, incluso cuando las células se cultivaron en medio químicamente definido sin componente animal. Los inventores han clonado GGCX y 45 protrombina humana en un vector de expresión de tal forma que el nivel de mRNA de protrombina excede el del mRNA de GGCX por un factor de al menos 10. Esto da como resultado una producción con un gran exceso de proteína protrombina comparado con la proteína GGCX.

Como un ejemplo más, los inventores han expresado rhFIX usando los mismos vectores de expresión conjunta de GGCX. Esto dio como resultado líneas celulares productoras del mRNA del factor IX a niveles que 50 excedían los niveles de mRNA de GGCX por un factor de al menos 10 en un caso. En otra línea celular, la proporción del mRNA de factor IX: GGCX fue aproximadamente 4-5:1. Sólo la línea celular que proporcionaba una proporción de al menos 10:1 mostraba una productividad de rhFIX sustancialmente incrementada (Tabla 1).

Tabla 1. Resumen de la productividad y la proporción de mRNA proteína carboxilada:GGCX

NOMBRE DEL CLON/CONSTRUCTO: PROTEÍNA PRODUCIDA PRODUCCIÓN * DE PROTEÍNA TOTALMENTE ACTIVA (mg/l) PROPORCIÓN mRNA DE PROTEÍNA CARBOXILADA: GGCX, APROX. FUENTE DE DATOS

P1E2/PN32: Protrombina humana 40 250:1 Ejemplo 3

B2F4/PP6: 26 50:1 Ejemplo 5

H3B10/PP6: 30 30:1 Ejemplo 5

E1A9/PText5: 3,5 No GGCX Ejemplo 3

N4D5/F9NopA: FIX humano 7,3 45:1 Ejemplo 7

P1G9/F9hglx: 1,3 4:1 Ejemplo 7

IC4: 1¤ Sin GGCX Rehemtulla 1993, documento de EE.UU. Nº. 5.460.950

* La productividad se midió en cultivos de centrifugación bajo condiciones de cultivo similares. ¤ Datos de Rehemtulla 1993 y patente de EE.UU. Nº. 5.460.950.

Se puede esperar que los factores de coagulación dependientes de la vitamina K (FII, FVII, FIX, FX y sus formas activadas FIIa o trombina, FVIIa, FIXa, FXa) producidos por el presente método de expresión conjunta con GGCX sean útiles en la prevención y el tratamiento del sangrado después de traumatismo, cirugía o enfermedades 5 hepáticas, nefrológicas, de factores de coagulación de plaquetas o sangre (hemofilia). De la misma forma, se puede esperar que sean útiles el factor de coagulación de la proteína C y su forma activada APC en la prevención y el tratamiento de trastornos de coagulación incrementada con o sin niveles decrecientes de proteína C. El método también es aplicable a otras proteínas que requieren carboxilación post-translacional.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona una célula huésped eucariota que 10 comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y una molécula de ácido nucleico que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un segundo promotor, en el que el primer promotor se selecciona de promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV), pEF-1alpha, pRSV o pUbC, y el segundo promotor se selecciona de 15 promotor temprano inmediato de SV40, promotor FIX minimizado o promotor de quinasa timidina de HSV.

En una realización, la proporción de las proteínas expresadas está entre 10:1 y 1000:1, más preferiblemente entre 10:1 y 500:1 y todavía más preferiblemente entre 25:1 y 250:1. Una proporción particularmente adecuada es aproximadamente 200:1.

En realizaciones separadas, la proporción de las dos proteínas expresadas puede ser al menos 10:1, 30:1, 20 45:1, 50:1, 100:1, 200:1, 250:1, 300:1, 400:1, 500:1 y 1000:1.

En una realización particular, tanto la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que requiere gamma-carboxilación como las secuencias control asociadas a la expresión, y la molécula de ácido nucleico que codifica la γ-glutamil carboxilasa y las secuencias control asociadas a la expresión se localizan sobre el mismo vector de expresión. En otra realización, estas dos moléculas de ácido nucleico se localizan en vectores de 25 expresión separados.

De acuerdo con un aspecto más de la invención, se proporciona un ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan células huésped transfectadas o transformadas con un vector que comprende la secuencia de SEQ. ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 para la expresión 30 del Factor IX humano.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped capaz de expresar el factor de coagulación IX humano y enzimas gamma carboxilasas humanas, en la que el ácido nucleico que codifica

el factor de coagulación IX humano y el ácido nucleico que codifica la gamma carboxilasa se unen operativamente a secuencias control que son capaces de expresar las dos proteínas en una proporción de al menos 10:1, respectivamente.

También se describe una célula huésped eucariota no humana adaptada para expresar el factor de coagulación IX humano y enzimas gamma carboxilasa humanas en una proporción de al menos 10:1. El ácido 5 nucleico que codifica el factor de coagulación IX humano y el ácido nucleico que codifica la gamma carboxilasa se unen operativamente a secuencias control que son capaces de expresar las dos proteínas en una proporción de al menos 10:1, respectivamente.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped que alberga ácido nucleico exógeno que comprende el factor de coagulación IX humano que codifica el ácido nucleico bajo el control 10 del promotor hCMV y el ácido nucleico que codifica la carboxilasa humana bajo el control del promotor SV40.

También se describe un ácido nucleico de acuerdo con SEQ. ID NO: 1, SEQ. ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3

También se describen células huésped transfectadas o transformadas con un vector que comprende la secuencia de SEQ. ID NO: 1, SEQ. ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 para la expresión de protrombina humana.

También se describen células huésped capaces de expresar protrombina humana y enzimas gamma 15 carboxilasa humanas, en las que el ácido nucleico que codifica la protrombina humana y el ácido nucleico que codifica la gamma carboxilasa se unen operativamente a secuencias control que son capaces de expresar las dos proteínas en una proporción de al menos 10:1, respectivamente.

También se describe una célula huésped eucariota no humana adaptada para expresar protrombina humana y enzimas gamma carboxilasa humanas en una proporción de al menos 10:1. En una realización particular, 20 el ácido nucleico que codifica la protrombina humana y el ácido nucleico que codifica la gamma carboxilasa se unen operativamente a secuencias control que son capaces de expresar las dos proteínas en una proporción de al menos 10:1, respectivamente.

De acuerdo con un aspecto más de la invención se proporciona una célula huésped que alberga ácido nucleico exógeno que comprende el ácido nucleico que codifica la protrombina humana bajo el control del promotor 25 hCMV y el ácido nucleico que codifica la carboxilasa humana bajo el control del promotor SV40.

La invención se ha ilustrado usando protrombina y el factor de coagulación IX como proteínas que requieren carboxilación. Sin embargo, diversas proteínas diferentes a la protrombina y el factor IX son dependientes de una γ-carboxilación correcta para su completa actividad biológica. Entre las conocidas de los hombres están el factor de coagulación FVII, que en este momento solo está disponible comercialmente producido en células de mamíferos 30 recombinantes a relativamente bajos niveles (aproximadamente 10 mg/L o menos). La presente invención será aplicable para mejorar la productividad de cualquier proteína que dependa de la γ-carboxilación, dichas proteínas incluyen, pero sin limitación: protrombina, factor de coagulación II (FII), factor de coagulación VII (FVII), factor de coagulación IX (FIX), factor de coagulación X (FX), proteína C, proteína S, proteína Z, proteína Bone Gla (también conocida como: BGP o osteocalcina), proteína de Matriz Gla (MGP), polipéptido 1 Gla rico en prolina (PRRG1), 35 polipéptido 2 Gla rico en prolina (PRRG2), proteína 6 específica de detención del crecimiento (Gas 6). Otras proteínas adecuadas son: proteína tipo FXa en veneno de serpientes elápidas (subfamilia Acanthophiina) y veneno del caracol cono (Conus textile).

Cada una de estas proteínas, incluyendo sus secuencias de ácido nucleico y aminoácido, son muy conocidas. La Tabla 2 identifica secuencias representativas de formas naturales y mutantes de las diversas 40 proteínas que se pueden usar en la presente invención.

Tabla 2.

DESCRIPCIÓN: cDNA EMBL ACC Nº. VARIANTES DE CORTE (PROTEÍNA) MUTACIONES GEN EMBL ACC Nº.

Glutamato gamma carboxilasa: BC013979 2; BC013979; AF253530 1 SNP (EMBL Nº. U65896); 2 SNPs (OMIM Nº. 137167) U65896

: V00595 1, V00595 aprox. 100 SNP's (EMBL Nº. AF478696) AF478696

Factor VII: AF466933 4, AF466933; AF272774; AR030786; AAN60063 21 SNPs (OMIM Nº. 277500) J02933

Factor IX: A01819 3; A01819; M19063 5 SNPs (EMBL Nº. A34669; AF536327); 108 SNPs (OMIM Nº. 306900) AF536327

Factor X: BC046125 4, BC040125; AR095306; AB005892 118 SNPs (EMBL Nº. M57285; AF503510); 14 SNPs (OMIM Nº. 227600) AF503510

Proteína C: BC034377 7, AB083690; AB083693; I09623; S50739; S72338 57 SNPs (EMBL Nº. AF378903); 25 SNPs (OMIM Nº. 176860) AF378903

Osteocalcina: AF141310 5; AF141310; AF141310; BC033656; X04143; X51699 X04143

Proteína GLA de Matriz: BC005272 1, BC005272

Específico detención del crecimiento 6; Factor estimulador de AXL: BC038984 1, BC038984

Proteína Z: M55670 2; AB033749; AB033749

Polipéptido 1 Gla rico en prolina (ácido G-carboxiglutámico): AF009242 2; AF009242;BC030786

Polipéptido 2 Gla rico en prolina (ácido G-carboxiglutámico): AF009243 2; AF009243; BC026032

Precursor de la proteína S dependiente de la Vitamina K: BC015801 1, BC015801 aprox. 100 SNPs (EMBL Nº. AY308744); 8 SNPs (OMIM Nº. 176880) AY308744

Será apreciado que la invención no está restringida a ninguna proteína particular o proteína que codifique la secuencia de una de estas proteínas que se expresan conjuntamente. Además, y en particular con respecto a factores de coagulación de la sangre, se han descrito numerosas formas mutantes de las proteínas en la técnica. La presente invención es igualmente aplicable a estas formas mutantes, incluyendo variantes alélicas naturales, de las 5 proteínas como es su secuencia natural. En una realización la invención se puede llevar a cabo con cualquier proteína natural o una con al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia con ésta.

La identidad de secuencia entre dos secuencias se puede determinar por análisis de alineamiento informático de pares, usando programas tales como, BestFit, PILEUP, Gap o FrameAlign. La herramienta de alineamiento preferido es BestFit. En la práctica, cuando se buscan secuencias similares/idénticas a la búsqueda 10 problema, a partir de una base de datos de la secuencia, generalmente es necesario realizar una identificación inicial de secuencias similares usando algoritmos adecuados tales como Blast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA, o Fasta3, y una matriz de evaluación tal como Blosum 62. Dichos algoritmos tratan de aproximarse muy cercanamente al algoritmo de alineamiento "oro-estándar" de Smith-Waterman. Por eso, el programa motor de

software/búsqueda preferido para uso en el ensamblaje de similaridad, es decir, cómo dos secuencias de polipéptidos primarias se alinean es Smith-Waterman. La identidad se refiere a emparejamientos directos, la similaridad proporciona sustituciones conservadoras.

La expresión "γ-glutamil carboxilasa" o "GGCX", según se usa en este documento, se refiere a una enzima dependiente de la vitamina K que cataliza la carboxilación de residuos de ácido glutámico. 5

Las enzimas GGCX están ampliamente distribuidas, y se han clonado a partir de muchas especies diversas tales como la ballena blanca Delphinapterus leucas, el pez sapo Opsanus tau, la gallina (Gallus gallus), la mixina (Myxine glutinosa), el límulo (Limulus polyphemus), y el caracol cono Conus textile (Begley et al., 2000, ibid; Bandyopadhyay et al. 2002, ibid). La carboxilasa del caracol cono es similar a la carboxilasa bovina y se ha expresado en células COS (Czerwiec et al. 2002, ibid). Otras proteínas similares a GGCX se pueden encontrar en 10 insectos y procariotas tales como Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster y Leptospira con números de entrada NCBI: gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281, gi 24197548 y (Bandyopadhyay et al., 2002, ibid), respectivamente. La enzima carboxilasa muestra una remarcable conservación evolutiva. Algunas de las enzimas no humanas han mostrado, o se puede predecir que tienen, una actividad similar a la de la GGCX humana que los inventores han usado, y se pueden usar por lo tanto como una alternativa a la enzima humana. 15

La Tabla 3 identifica secuencias representativas de proteínas homólogas predichas respecto a GGXC humana (clasificadas después del origen de las especies) que se puede usar en la presente invención.

Tabla 3.

Especies: Nº ID de entrada de la base de datos

Homo sapiens (hombre): NM_000821.2

HUMGLUCARB

HUMHGCA

BC004422

HSU65896

AF253530.1

Papio hamadryas (pez sapo): AC116665.1

Delphinapterus leucas (ballena blanca): AF278713

Bos taurus (bovino): NM_174066.2

BOVCARBOXG

BOVBGCA

Ovis aries (oveja doméstica): AF312035

Rattus norvegicus (rata común): NM_031756.1

AF065387

Mus musculus (ratón): NM_019802.1

AF087938

Opsanus tau (peces óseos): AF278714.1

Conus textile (moluscos): AY0044904.1

AF382823.2

Conus imperialis (moluscos): AF448234.1

Conus episcopatus (moluscos): AF448233.1

Conus omaria (moluscos): AF448235.1

Drosophila melanogaster (mosca de la fruta): NM_079161.2

Anopheles gambiae (mosquito): XM_316389.1

Especies: Nº ID de entrada de la base de datos

Secale cereale (monocotiledóneas): SCE314767

Triticum aestivum (trigo común): AF280606.1

Triticum urartu (monocotiledóneas): AY245579.1

Hordeum vulgare (cebada): BLYHORDCA

Leptospira interrogans (espiroquetas): AE011514.1

Streptomyces coelicolor (bacterias Gram+ alto GC): SCO939109

SC0939124

AF425987.1

Streptomyces lividans (bacterias Gram+ alto GC): SLU22894

Streptomyces viginiae ( bacterias Gram+ alto high GC): SVSNBDE

Micrococcus luteus (bacterias Gram+ alto GC): MLSPCOPER

Chlamydomonas reinhardtii (algas verdes): AF479588.1

Dictyostelium discoideum (moho del fango): AC115612.2

Coturnix coturnix (pájaros): AF364329.1

Bradyrhizobium japonicum (α-protoebacterias): AP005937.1

Rhodobacter sphaeroides (α-proteobacterias): RSY14197

Sinorhizobium meliloti (α-proteobacterias): RME603647

AF119834

Mesorhizobium loti (α-proteobacterias): AP003014.2

Chromobacterium violaceum (β-proteobacterias): AE016910.1

AE016918.1

Pseudomonas aeruginosa (γ-proteobacterias): AE004613.1

AF165882

Xanthomonas axonopodis (γ-proteobacterias): AE011706.1

Virus del herpes humano 8: KSU52064

KSU75698

AF305694

AF360120

AF192756

Cada una de las proteínas GGCX anteriormente identificadas y proteínas GGCX de otras especies se pueden usar como enzima carboxilasa en la presente invención.

Una forma de realizar la expresión diferencial de las dos proteínas expresadas conjuntamente es usar diferentes promotores como parte de las secuencias control respectivas de la expresión. La técnica está repleta de 5 ejemplos de diferentes promotores y otras secuencias control de la expresión que son capaces de expresar proteínas heterólogas en diferentes grados o dimensiones. La tecnología de expresión recombinante se lo bastante avanzada para que cualquier experto en la técnica de la expresión de proteína sea capaz de seleccionar promotores y otras secuencias control para realizar la expresión conjunta de la proteína que requiere carboxilación y la carboxilasa en la proporción deseada. La selección de dichos promotores particulares y otras secuencias control de 10 la expresión que se usan es un asunto de elección particular.

En una realización, las secuencias control asociadas con la proteína que requieren la gamma-carboxilación comprenden un promotor fuerte. En una realización, es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV). Un promotor fuerte se define en este documento como un promotor que da un aumento de más de 1000 transcritos/célula. Un promotor débil se define en este documento como un promotor que da un aumento de menos de 1000 transcritos/célula. 5

En otra realización, las secuencias control asociadas con la γ-glutamil carboxilasa comprenden un promotor débil. En una realización, el promotor temprano es el SV40. En otra realización, la proteína que requiere gamma-carboxilación y la γ-glutamil carboxilasa están bajo el control de diferentes elementos promotores con el promotor que controla la expresión de la γ-glutamil carboxilasa que es más débil que el promotor que controla la expresión de la proteína que requiere gamma-carboxilación. 10

En otra realización, la γ-glutamil carboxilasa está bajo el control del promotor temprano SV40 y la proteína que requiere la gamma-carboxilación está bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV). En una realización de acuerdo con este aspecto particular de la invención, la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor X humano. En otra realización, la proteína que requiere gamma-carboxilación es la protrombina humana. En otra realización, la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor IX humano. 15

La invención se ha ilustrado mediante el uso del promotor CMV fuerte (Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985) para sobre-expresar el Factor IX o la protrombina y el promotor SV40 más débil (Wenger et al. Anal Biochem 221:416-418, 1994) para controlar la expresión de GGCX. Otros promotores fuertes que se podrían usar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación, pEF-1α [gen de la subunidad del factor-1α de elongación humano) (Mizushima y Nagata, Nuc Acids Res 18:5322, 1990; Goldman et al., BioTechniques 21:1013-1015, 1996), 20 pRSV [virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc Natl Acad Sci USA 79:6777-6781, 1982)] y pUbC [ubiquitina humana (Schorpp et al., Nuc Acids Res 24:1787-1788, 1996)].

Es importante asegurarse de que la proteína que se produce (proteína que requiere carboxilación) lo sea en exceso comparado con la enzima de modificación, dando una proporción de al menos 10:1. Lo modos de lograr un nivel de expresión bajo de la enzima de modificación (γ-glutamil carboxilasa) incluyen: 25

1) El uso de un promotor débil para controlar la expresión de la enzima de modificación incluyendo, pero sin limitación, el promotor temprano inmediato de SV40, el promotor FIX minimizado (Rouet et al., The Journal of Biological Chemistry 267:20765-20773,1992) o el promotor de quinasa timidina de HSV (Wenger et al., 1994, ibid).

2) Mutar las secuencias del promotor o potenciador de un promotor fuerte para reducir la fuerza del promotor. 30

3) Eliminar o cambiar la secuencia Kozak (señal de iniciación de la translación) para reducir la eficacia de la translación (Kozak. Nuc Acids Res 15:8125-8148, 1987;

Kozak. Proc Natl Acad Sci USA 87:8301-83051987, 1990).

4) Clonar el ácido nucleico que codifica la proteína que se produce (proteína que requiere la carboxilación) y el ácido nucleico que codifica GGCX en vectores separados y transfectar con un gran exceso del constructo que 35 contiene la proteína que se produce de modo que se genere una célula con múltiples copias del constructo que contiene la proteína que se produce.

5) Clonar el DNA que codifica la proteína que se produce y el DNA que codifica los vectores de modificación de GGCX en vectores separados, transfectar conjuntamente o transfectar de forma separada, y usar un sistema de amplificación para amplificar la expresión de la proteína que se produce. 40

6) Aislar una línea celular estable que exprese recombinantemente bajos niveles de GGCX (pero por encima de los niveles endógenos) y usarlo como línea de la célula huésped para la expresión de proteínas que necesitan la γ-carboxilación.

7) Introducir mutación(ones) en la GGCX para disminuir la afinidad del sustrato de GGCX.

Además de estos, el experto en la técnica de expresión de proteínas recombinantes estará al tanto a otros 45 métodos que se podrían usar para generar una célula huésped que exprese la proteína que requiere carboxilación y la proteína carboxilasa en una proporción de al menos 10:1.

También se describe una célula que se modifica o adapta para expresar (i) una proteína que requiere gamma-carboxilación, y (ii) una γ-glutamil carboxilasa, en la que las proteínas (i) y (ii) se expresan en una proporción entre 10:1 y 500:1. En una realización particular, la γ-glutamil carboxilasa se expresa entre 2 y 5 veces por encima 50 de los niveles endógenos (es decir, los de una célula no modificada o adaptada).

También se describe una célula recombinante adaptada para expresar (i) la proteína γ-glutamil carboxilasa por encima de los niveles constitutivos encontrados en una célula inadaptada equivalente y (ii) una proteína que requiere carboxilación, en la que la cantidad de proteína γ-glutamil carboxilasa expresada y proteína que requiere carboxilación está en la proporción de al menos 1:10. 55

(i) una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína γ-glutamil carboxilasa en la que dicha proteína γ-glutamil carboxilasa que codifica la secuencia se une operativamente a secuencias control de la expresión que permiten la expresión de la proteína γ-glutamil carboxilasa por dicha célula; y

(ii) un polinucleótido que codifica una proteína que requiere carboxilación por la proteína γ-glutamil carboxilasa 5 operativamente unida a secuencias control de la expresión que permiten la expresión de dicha proteína que requiere carboxilación por dicha célula;

en la que la célula es capaz de expresar la proteína γ-glutamil carboxilasa y la proteína que requiere carboxilación en la proporción de al menos 1:10.

También se describe una célula adaptada para expresar una proteína que requiere gamma-carboxilación y 10 γ-glutamil carboxilasa, en la que el ácido nucleico que codifica la proteína que requiere gamma-carboxilación y el ácido nucleico que codifica la γ-glutamil carboxilasa están bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas para asegurar que la cantidad de proteína expresada que requiere gamma-carboxilación sea de al menos 10 veces la cantidad de la proteína γ-glutamil carboxilasa.

Al menos una de la proteína que requiere gamma-carboxilación y la γ-glutamil carboxilasa es expresada a 15 partir del ácido nucleico que ha se ha introducido en la célula por tecnología recombinante. Un modo alternativo de trabajar la invención es expresar la proteína endógena (proteína que requiere la carboxilación o la carboxilasa), pero con sustitución de las secuencias control endógenas (promotor etc.) con secuencias heterólogas para obtener el nivel deseado de expresión.

La célula anfitriona es preferentemente una célula eucariota. Las células huésped típicas incluyen, pero sin 20 limitación, células de insecto, células de levadura y células de mamífero. Las células de mamífero son particularmente preferidas. Las líneas de células de mamífero incluyen, pero sin limitación, las células CHO, HEK, NS0, 293, Per C.6, BHK y COS, y sus derivados. En una realización, la célula huésped es la de la línea celular CHO-S de mamífero.

La sobre-expresión de proteínas dependientes de la carboxilación ha dado como resultado recientemente 25 de forma general productos infra-carboxilados. Esto es debido a que se está limitando la capacidad de carboxilación de la célula huésped endógena. Por otra parte, la enorme (de 16 a 70 veces) sobre-expresión de la actividad de GGCX no mejora el rendimiento del producto (Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90: 4611-4615, 1993), (Berkner y Pudota, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 446-471, 1998), (Hallgren et al., Biochemistry 41(50): 15045-15055, 2002). La razón de esto no se entiende del todo. La invención de los inventores requiere una sobre-expresión 30 moderada de GGCX. Esto asegura que se expresen de la célula niveles mayores que los endógenos de GGCX, por ejemplo, cuando el nivel de actividad de GGCX se eleve solo de 1,5 a 5 veces. En este nivel moderadamente elevado, se obtuvieron niveles sorprendentemente altos de rhFII completamente carboxilado como se muestra en el Ejemplo 1.

Se apreciará por lo tanto que la proporción de expresión de la proteína que requiere carboxilación y la 35 carboxilasa que distingue esta invención de previas investigaciones de expresión conjunta, excluye los niveles de GGCX que son producidos endógenamente. Para cumplir la alta productividad requerida, es necesario expresar la carboxilasa y la proteína que requiere carboxilación a niveles por encima de los encontrados en células normales.

En una realización, se usa una célula o una línea celular que tiene poca o ninguna carboxilasa constitutivamente expresada y/o proteína que requiere carboxilación. 40

En una realización, la γ-glutamil carboxilasa se expresa al menos lo mismo o igual al 10% de la cantidad de la proteína que requiere gamma-carboxilación. En otras realizaciones alternativas, la γ-glutamil carboxilasa se expresa al menos lo mismo o igual al 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25% 0,1%, 0,05% o 0,01% de la cantidad de la proteína que requiere gamma-carboxilación.

El grado de expresión de las dos proteínas se puede medir usando técnicas familiares a cualquier experto 45 en la técnica. Éstas incluyen medidas directas, por ejemplo, midiendo la actividad biológica de la proteína, o la cantidad de proteína (por ejemplo, usando anticuerpos), o medidas indirectas, por ejemplo vía la medida de niveles de transcripción del mRNA (por ejemplo, análisis Taqman como en el Ejemplo 3). Las siguientes referencias describen formas de medir la actividad de la enzima GGCX (Lingenfelter et al., Biochemistry 35: 8234-8243, 1996; Berkner et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471, 1998; Hallgren et al., Biochemistry 41(50): 15045-15055, 2002; 50 y, Berkner et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246, 1992).

Para los fines de esta invención, la proporción de la expresión de las dos proteínas se determina indirectamente vía el nivel de transcripción del mRNA (por ejemplo, por análisis Taqman).

En una realización, la proteína que requiere gamma carboxilación es un factor de coagulación dependiente de la vitamina K. En otra realización más, la proteína que requiere gamma-carboxilación se selecciona 55 preferiblemente del grupo que consiste en: protrombina, factor de coagulación II, factor de coagulación FII, factor de coagulación VII, factor de coagulación FVII, factor de coagulación IX, factor de coagulación FIX, factor de

coagulación X, factor de coagulación FX, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína Bone Gla, proteína de Matriz Gla, proteína específica de detención del crecimiento 6 y proteína del tipo FXa de Acanthophiinae.

En una realización particular, la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor IX. En otra realización particular, la proteína que requiere gamma-carboxilación es la protrombina. En otra realización, la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor X. 5

La presente invención tiene aplicación general en proteínas que requieren la carboxilación de cualquier fuente. Sin embargo, si la proteína expresada tiene que usarse para fines terapéuticos no humanos, las proteínas humanas son particularmente preferidas.

En una realización, la γ-glutamil carboxilasa es de origen de ratón, rata, bovino o caracol cono. En otra realización, la γ-glutamil carboxilasa es una proteína humana. 10

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para producir proteína gamma-carboxilada que comprende: (i) cultivar una célula eucariota adaptada para expresar una proteína que requiere gamma-carboxilación y γ-glutamil carboxilasa en una proporción de al menos 10:1, bajo condiciones adecuadas para la expresión de ambas proteínas, y (ii) aislar la proteína gamma-carboxilada.

También se describe un método para la producción de una proteína gamma-carboxilada en una línea 15 celular de un mamífero, que comprende la etapa de expresar conjuntamente con dicha proteína que requiere la gamma-carboxilación en la línea celular de un mamífero una γ-glutamil carboxilasa, en la que la cantidad de la proteína expresada que requiere gamma-carboxilación es al menos 10 veces mayor que la cantidad de la γ-glutamil carboxilasa expresada; y (ii) aislar la proteína gamma-carboxilada.

Un método para producir una proteína gamma-carboxilada que comprende: 20

a) la modificación genética de una célula eucariota para introducir un primer polinucleótido que codifica una proteína que requiere la carboxilación y las secuencias control de la expresión que la acompañan y un segundo polinucleótido que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control de la expresión que la acompañan para producir una célula huésped eucariota capaz de la expresión conjunta de la proteína que requiere carboxilación y una proteína γ-glutamil carboxilasa en una proporción de al menos 10:1; b) cultivar la célula en 25 un medio de cultivo adecuado bajo condiciones que permitan que la primera y segunda secuencias de polinucleótidos sean expresadas; y c) aislar la proteína carboxilada del medio o células huésped.

Los vectores de expresión normalmente incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de la translación, opcionalmente un péptido señal, un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también contienen normalmente uno o más gen(es) marcador(es) de resistencia a 30 los antibióticos para la selección. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, cósmidos o virus tales como fago o retrovirus. La secuencia codificante del polipéptido se sitúa bajo el control de un promotor apropiado (es decir, HSV, CMV, TK, RSV, SV40 etc), elementos de control y terminador de la transcripción (estas son las secuencias control asociadas a la expresión) de modo que la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido se transcriba en RNA en la célula huésped transformada o transfectada por el constructo del vector de 35 expresión. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o secuencia líder para la secreción del polipéptido fuera de la célula huésped. Los vectores preferidos comprenderán normalmente al menos un sitio de clonación múltiple. En ciertas realizaciones habrá un sitio de clonación o múltiples sitios de clonación situados entre el promotor y el gen que se expresa. Dichos sitios de clonación se pueden usar para crear proteínas de fusión del extremo N-terminal clonando una segunda secuencia de ácido nucleico en el sitio de clonación de modo que sea 40 contigua y en marco con la secuencia del gen. En otras realizaciones, puede haber un sitio de clonación o múltiples sitios de clonación situados inmediatamente corriente abajo del gen para facilitar la creación de fusiones del extremo C-terminal de una forma similar a las fusiones del extremo N-terminal descritas más arriba.

La célula huésped se puede modificar genéticamente (tener ácidos nucleicos extra introducidos) por numerosos métodos, muy conocidos por cualquier experto en la técnica, tales como transfección, transformación y 45 electroporación.

También se describe la proteína gamma carboxilada purificada producida por los métodos de la presente invención y su uso en terapia con coagulantes.

También se describe un método para promocionar el incremento o decrecimiento de la coagulación en un sujeto que comprende administrar una cantidad farmacológicamente eficaz de una proteína gamma-carboxilada 50 aislada obtenida por los métodos descritos más arriba a un paciente que lo necesita.

De acuerdo con un aspecto más de la invención, se proporciona un método para producir una composición farmacéutica adecuada para inducir la coagulación de la sangre, que comprende purificar la proteína carboxilada activa expresada de una célula huésped adaptada para expresar una proteína que requiere gamma-carboxilación y γ-glutamil carboxilasa en una proporción de al menos 10:1 y mezclar la proteína carboxilada purificada con uno o 55 varios vehículos farmacéuticamente aceptables o excipientes.

Los agentes terapéuticos proteicos se almacenan normalmente congelados, refrigerados, a temperatura ambiente, y/o en un estado liofilizado.

Las composiciones de la invención se pueden obtener por procedimientos convencionales usando excipientes farmacéuticos convencionales, muy conocidos en la técnica, pero lo más probablemente estarán en una forma adecuada para la inyección, tanto parenteralmente como directamente en el sitio de la herida. 5

Las suspensiones acuosas contienen en general el ingrediente activo en forma de polvo finamente dividido junto con uno o más agentes de suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes de dispersión o agentes humectantes tales como lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos (por ejemplo estearato de polioxietileno) o productos de condensación de óxido de etileno con 10 alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales procedentes de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietileno-sorbitol o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales procedentes de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietileno-sorbitol o productos de condensación de óxido de 15 etileno con ésteres parciales procedentes de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietileno-sorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes (tales como p-hidroxibenzoato de etilo o propilo, antioxidantes (tales como ácido ascórbico), agentes colorantes, agentes saporíferos y/o agentes edulcorantes (tales como sacarosa, sacarina o aspartamo).

Se pueden formular suspensiones oleosas suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal (tales como 20 aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco) o en un aceite mineral (tal como parafina líquida). Las suspensiones oleosas también pueden contener un agente espesante tal como cera de abejas, parafina sólida o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes tales como los indicados anteriormente y agentes aromatizantes, para proporcionar una preparación oral apetitosa. Se pueden conservar estas composiciones por la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico. 25

Los polvos adecuados para la preparación de una preparación acuosa para la inyección, por la adición de un diluyente adecuado, generalmente contiene el ingrediente activo junto con vehículos adecuados y excipientes, agentes de suspensión y uno o varios estabilizadores o conservantes. El diluyente puede contener otros excipientes adecuados, tales como conservantes, modificantes de la tonicidad y estabilizantes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite 30 en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, tal como aceite de oliva o aceite de cacahuete o un aceite mineral, tal como por ejemplo parafina líquida o una mezcla de cualquiera de éstos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser, por ejemplo, gomas que se encuentran en la naturaleza tales como goma arábiga o goma de tragacanto, fosfátidos que se encuentran en la naturaleza tales como soja, lecitina, ésteres o ésteres parciales procedentes de ácidos grasos y anhídridos de hexitol (por ejemplo monooleato de sorbitán) y productos de 35 condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, tales como monooleato de sorbitán polioxietilénico.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en la forma de una solución estéril o suspensión en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, que se puede formular de acuerdo con procedimientos conocidos usando uno o varios de los agentes de dispersión o humectación apropiados y agentes de suspensión, que se han mencionado más arriba. Una preparación inyectable, estéril, también puede ser 40 una solución o suspensión inyectable, estéril, en un diluyente o disolvente aceptable por vía parenteral, no tóxico, por ejemplo, una disolución en 1,3-butanodiol.

Para más información sobre Formulación se remite al lector al capítulo 25.2 en el Volumen 5 de Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; jefe del panel editorial), Pergamon Press 1990; o, Volumen 99 de Drugs and the pharmaceutical sciences; Protein formulation and delivery (Eugen J. McNally, editor ejecutivo), 45 Marcel Dekker Inc 2000.

La cantidad de principio activo que se combina con uno o más excipientes para producir una forma de dosificación única variará necesariamente dependiendo del hospedador tratado y de la vía de administración particular. Por ejemplo, una formulación destinada a la inyección a humanos contendrá en general, por ejemplo, de 0,5 mg a 2 g de agente activo mezclado con una cantidad apropiada y conveniente de excipientes que puede variar 50 desde aproximadamente 5 a aproximadamente 98 por ciento en peso de la composición total. Las formas de dosificación individuales contendrán en general de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo. Las terapias con proteínas normalmente se liofilizan. Para más información sobre Vías de Administración y Regímenes de Dosificación se remite al lector al Capítulo 25,3 en el Volumen 5 de Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; jefe del panel editorial), Pergamon Press 1990. 55

El tamaño de la dosis para propósitos terapéuticos o profilácticos de un compuesto de la invención variará naturalmente de acuerdo con la naturaleza y la gravedad de las afecciones, la edad y el sexo del animal o paciente y la vía de administración de acuerdo con principios muy conocidos de medicina. Cuando se usa un compuesto para fines terapéuticos o profilácticos, se administrará en general de manera que se reciba una dosis diaria en el intervalo, por ejemplo, de 0,5 mg a 75 mg por kg de peso corporal, dada si es necesario en dosis divididas. En 60

general, se administrarán dosis más bajas cuando se emplee una vía parenteral. Así, por ejemplo, para administración intravenosa, se usará en general una dosis en el intervalo de, por ejemplo, 0,5 mg a 30 mg por kg de peso corporal. De manera similar, para la administración por inhalación, se usará una dosis en el intervalo de, por ejemplo, 0,5 mg a 25 mg por kg de peso corporal.

La invención se ilustrará a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitantes: 5

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de DNA recombinantes dentro del desarrollo de la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A 10 Practical Approach, Vols. I, II, & III, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods in Enzymology, Academic Press; Weir et al., eds., Handbook of Experimental Immunology, 5ª ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997).

Ejemplo 1

Amplificación de cDNA que codifica FII (hPT) humano y GGCX humano 15

Se compró mRNA de hígado humano de Clontech y se realizó la síntesis de cDNA usando el sistema Superscript de Invitrogen. El cDNA obtenido se usó como plantilla para la amplificación de FII humano usando:

cebador PTF0 5'-ATTCCTCAGTGACCCAGGAGCTGACA-3', (SEQ ID NO: 3) y

cebador PTEXT 5'-CTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTTCTGTATCCACTTCTT-3', (SEQ ID NO: 4).

GGCX humano se amplificó usando: 20

cebador hglx5, 5'-TCCGCAGAGCAATGGCGGTGTCT-3', (SEQ ID NO: 5) y

hglx3, 5'-CCAACATCTGGCCCCTTCAGAACT-3', (SEQ ID NO: 6).

El producto PCR que codifica FII se clonó directamente en el vector tratado con TA-TOPO pCDNA3.1V5/His (Invitrogen). La selección de un clon con cDNA de hFII insertado en la dirección correcta dio el constructo control de Ptext5 (Fig. 1 b). El cDNA que codifica GGCX bajo el control del promotor SV40 se obtuvo por transferencia del 25 GGCX que codifica el fragmento de pCDNA3.1V5/His TA-TOPO al vector de pZeoSV2+ (Invitrogen), usando las enzimas de restricción BamH1 y NotI. Los sitios de restricción EcoRV-NotI corriente abajo del inserto GGCX se eliminaron. Un fragmento de ClaI-BclI romo del plásmido pZeoSV2-GGCX resultante (que contiene el promotor SV40 y el inserto que contiene GGCX, pero no el sitio de poliadenilación y señal de poliadenilación corriente abajo de la secuencia que codifica GGCX) se clonó entonces en el sitio de restricción de DraIII romo de pCDNA3.1+ 30 (Invitrogen). Un clon con el fragmento pSV40-GGCX insertado en tándem (igual dirección transcripcional) respecto al promotor CMV se seleccionó y un FII de KpnI-NotI romo que codifica el fragmento de Ptext5 se clonó en el sitio EcoRV para obtener el constructo PN32 (Fig. 1a). Las secuencias de DNA de PN32 y Ptext5 son como en el Apéndice 2. Todos los métodos de clonación estaban de acuerdo con los métodos estándar y/o los procedimientos recomendados por los fabricantes. 35

El constructo de PN32 contiene las siguientes características clave:

- El promotor temprano inmediato del citomegalovirus (hCMV) humano que controla la transcripción del cDNA de protrombina humano seguido de la señal de poliadenilación de la Hormona de Crecimiento Bovina (BGH) para la terminación de la transcripción eficiente y la poliadenilación de mRNA.

- El promotor temprano de SV40 que controla la transcripción del cDNA de γ-carboxilasa humana (GGCX) sin un 40 sitio o señal de poliadenilación aparente.

- Otras características son las mostradas en la Figura 1 a).

Para la comparación del constructo de PText5 sin GGCX se usó (Figura 1b). La secuencia de nucleótidos de PTEXT5 se muestra en SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos de PN32 se muestra en SEQ ID NO: 2

Líneas celulares productoras de protrombina obtenidas 45

Los dos constructos en la Figura 1 se transfectaron en células CHO-S (Invitrogen). Los transfectantes estables se seleccionaron y rastrearon sin eran clones altamente productivos usando un ensayo comercialmente disponible para la actividad de protrombina (Chromogenix). En este ensayo las muestras que contienen protrombina se trataron primero con toxina de veneno de serpiente (Ecarina - disponible de Sigma) para generar trombina. La actividad de la trombina se analizó entonces por la adición de un sustrato cromogénico (S-2238) - que genera color 50 cuando se procesa por trombina. La transfección y selección de clones se hicieron en paralelo con ambos constructos. El cultivo celular se hizo en medio DMEM que contenía 9% de suero bovino fetal inactivado por calor. Los clones obtenidos se adaptaron entonces para hacer crecer en medio sin componente animal. El clon de mejor

producción obtenido fue de la transfección con PN32 (FII + GGCX), que proporcionó hasta 400mg/L de protrombina recombinante humana cuando se cultivaba en medio químicamente definido sin componente animal (muy en exceso de cualquier nivel publicado). El rhFII producido recombinantemente se purificó (de acuerdo con el método descrito en Josic et al., Journal of Chromatography B, 790:183-197, 2003), y se fraccionó por cromatografía de intercambio iónico usando una columna de Q-Sepharose de acuerdo con técnicas estándar, para obtener rhFII completamente-5 carboxilado puro. Del rhFII producido del fermentador hasta 78 mg/L estaban completamente-carboxilados y tenían la misma actividad biológica que la protrombina purificada del plasma humano. La carboxilación se analizó por secuenciación del extremo N-terminal de la proteína y por ensayo de protrombinasa (Mao et al. JBC, 273:30086-30091, 1998). La generación de trombina se activó en plasma pobre en plaquetas humano por la adición de factor de tejido, y el potencial de trombina endógeno se midió esencialmente como se describe en Stig et al., (Blood 10 Coagulation and Fibrinolysis, 14:457-462, 2003).

El mejor clon obtenido con el constructo de PText5 dio una productividad de hasta 10 mg/L en medio químicamente definido sin componente animal, que está en el mismo intervalo publicado en la bibliografía. La acción de la protrombina completamente-carboxilada obtenida del clon de PText5 se estimó en aproximadamente el 50%. La recuperación final del rhFII completamente activo fue así al menos diez veces más alta usando el constructo de 15 PN32 que contiene una disposición con bajo nivel de expresión de la γ-carboxilasa. Para cada uno de los constructos se identificaron varios clones con niveles de expresión similares.

Ejemplo 2

Medición de la actividad de ggcx en líneas celulares de CHO

Dos líneas celulares CHO-S productoras de rhFII, obtenidas por transfección con el constructo PN32 20 (expresión conjunta de GGCX humano) y PTEXT5 (sin expresión conjunta de GGCX), respectivamente, se cultivaron en botellas de centrifugación usando medio sin proteína suplementado con 5 µg/ml de vitamina K. Un décimo del medio de cultivo se reemplazó diariamente. Las células se recogieron después de 7 días de cultivo y se prepararon microsomas como se describe en Berkner et al., (Proc Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246 1992). El FII recombinante humano se purificó a partir del sobrenadante del cultivo de las células recogidas. La actividad de 25 GGCX se midió como se describe en Berkner y Pudota (Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471 1998; y, Lingenfelter y Berkner (Biochemistry 35: 8234-8243, 1996). Las medidas de los inventores mostraron que la actividad de GGCX era 1,5 veces mayor en la línea celular de CHO humana que expresa conjuntamente GGCX comparado con la línea celular de CHO que expresa solo rhFII, usando las mismas condiciones de cultivo.

Ejemplo 3 30

Análisis de la expresión de mRNA por Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcripción Inversa a Tiempo Real (RT-PCR) de γ-Carboxilasa y Protrombina en líneas celulares CHO-S

Dos líneas celulares CHO-S obtenidas por transfección estable con los constructos PN32 (FII+GGCX) y Ptext5 (solo FII) respectivamente, se cultivaron en botellas de centrifugación usando medio sin proteína suplementado con vitamina K. Las muestras de cultivo se retiraron después de 4, 5 y 6 días de cultivo para cubrir los 35 niveles máximos estimados en la producción de mRNA. El RNA se aisló con Trizol™ de acuerdo con el protocolo suministrado por el vendedor, Invitrogen. El RNA aislado se trató con DNaseI con el kit DNA-free™ de Ambion. La síntesis de cDNA se llevó a cabo usando cebadores de hexámero aleatorios y los contenidos del kit del Sistema de Síntesis Superscript™First-Strand para RT-PCR, Invitrogen.

Los cebadores y las sondas marcadas con Vic para la RT-PCR a Tiempo Real se seleccionaron usando el 40 software Primer Express™, Applied Biosystems.

Oligonucleótidos de γ-Carboxilasa Humanos

5'ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3': Cebador directo (SEQ ID NO: 7)

5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3': Cebador inverso (SEQ ID NO: 8)

5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3': Sonda (SEQ ID NO: 9)

Longitud de amplicón 86 bp

Oligonucleótidos de Protrombina Humana 45

5' TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3': Cebador directo (SEQ ID NO: 10)

5' CATCCGAGCCCTCCACAA 3': Cebador inverso (SEQ ID NO: 11)

5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3': Sonda (SEQ ID NO: 12)

Longitud de amplicón 69 bp

Los cebadores se fabricaron en Operon/Qiagen y las sondas se pidieron a Applied Biosystems. También se usaron cebadores de control GAPDH de roedor y sondas (Applied Biosystems; Protocolo de Reactivos de Control de GAPDH TaqMan® Rodent de ABI Nº 4308318)-Longitud de amplicón 177 bp. Las reacciones RT-PCR a tiempo real se realizaron en el detector de secuencia Prism™ 7700 de ABI, Applied Biosystems. La longitud esperada de los 5 productos PCR amplificados se confirmó en geles de agarosa. Las series de dilución para investigar la eficiencia de las reacciones PCR se llevaron a cabo para todos los tres genes. Los niveles de expresión de γ-Carboxilasa y Protrombina se presentan respecto a la expresión del gen control, GAPDH de roedor.

Protrombina

: CHO-S PText5 día 4 CHO-S PText5 día 5 CHO-S PText5 día 6 CHO-S PN32 día 4 CHO-S PN32 día 5 CHO-S PN32 día 6

2^-delta Ct: 0,008014 0,076239 0,066677 0,204948 0,322343 0,364334

10

γ-Carboxilasa

2^-delta Ct: 3,39E-07 0 0 0,000277 0,00159 0,001568

A partir de los niveles de expresión relativos, el rhFII:GGCX detectado, se calcularon proporciones de aproximadamente 74-232:1 dependiendo del día de recuperación de la muestra. Para la línea celular transfectada con PN32, la expresión conjunta de rhFII y GGCX, el número de transcrito por célula se calculó que era 15 aproximadamente 8 para el mRNA de GGCX y aproximadamente 2000 para el mRNA de rhFII, dando así una proporción rhFII:GGCX de aproximadamente 250:1. Los transcritos de mRNA control de GAPDH/célula fueron para la misma muestra aproximadamente 4000.

Ejemplo 4

Producción de FII humano 20

El cDNA de FII humano y GGCX clonado en el Ejemplo 1 se insertó en pCDNA3.1 de la misma forma que en el Ej.1. Para dar los niveles de GGCX más altos, la señal de poliadenilación de pZeoSV2+ se incluyó en el fragmento de pSV40-GGCX-pA clonado en el sitio de DraIII romo de pCDNA3.1. Un clon con el fragmento que contiene GGCX en el orden inverso comparado con el Ej. 1 se seleccionó. La clonación del fragmento FII se hizo entonces de la misma forma que en el Ej. 1. El constructo final PP6 se muestra en la Figura 2 y la secuencia de 25 nucleótidos PP6 se muestra en SEQ ID NO: 13.

Dos líneas celulares productoras de protrombina, B2F4 y H3B10 se obtuvieron transfectando CHO-S como se describe en el Ej. 1. La Protrombina de estas dos líneas celulares se purificó y caracterizó como en el Ej. 1. Los cultivos de B2F4 dieron productividades en el intervalo de 30-70 mg/L y la acción del completamente carboxilado de 55-87% (cuanto más rhFII menos completamente carboxilado). La adición de butirato dio una productividad algo más 30 alta pero decreció la actividad de rhFII completamente carboxilado y no fue considerado beneficioso. H3B10 crece lentamente y dio una productividad de aproximadamente 50 mg/L, que era alta respecto a la cantidad de células en el cultivo, y la actividad de rhFII completamente carboxilado fue aproximadamente 60%. Comparado con la línea celular obtenida en el ejemplo 1, se produjo menos rhFII completamente carboxilado usando el constructo PP6 para una línea celular CHO. La producción de protrombina recombinante completamente activa está todavía lejos, sin 35 embargo, por encima de anteriores niveles publicados.

Ejemplo 5

Análisis de RT-PCR a Tiempo Real de la expresión de γ-Carboxilasa y Protrombina en líneas celulares de CHO-S midiendo la cantidad de mRNA

Las líneas celulares B2F4 y H3B10 del ejemplo 4 se analizaron por análisis PCR a tiempo real por el mismo 40 método y los mismos cebadores que en el Ej. 3. Las muestras de cultivo de 10 ml se recogieron en la productividad máxima para que fuera equivalente a las muestras en el Ej. 3. Para el clon H3B10 las muestras fueron desde el día 10 debido al lento crecimiento de este clon, y para el clon B2F4 las muestras fueron desde el día 6.

Tabla 4. Resultados del análisis RT-PCR a tiempo real de líneas celulares productoras de protrombina que expresan conjuntamente GGCX. Dos cultivos de centrifugación de 100 ml independientes para cada B2F4 y H3B 10 se muestrearon para el análisis RT-PCR a tiempo real.

Transcrito: Nº células total Cantidad resultante de RNA total RNA total usado para RT-PCR Cantidad mRNA en RT-PCR Número de células en RT-PCR Ct Copias mRNA Copias mRNA/célula

P1E2 * Día 6

PT: 2,00E+07 2,39E-04 1,25E-08 2,50E-09 1,05E+03 19 2,10E+06 2005

GGCX: 2,00E+07 2,39E-04 1,25E-08 2,50E-09 1,05E+03 27 8,19E+03 8

GAPDH: 2,00E+07 2,39E-04 1,25E-08 2,50E-09 1,05E+03 18 4,19E+06 4010

B2F4-1 Día 6

PT: 1,30E+07 2,20E-04 1,25E-08 2,50E-09 7,39E+02 19,2 1,83E+06 2472

GGCX: 1,30E+07 2,20E-04 1,25E-08 2,50E-09 7,39E+02 24,1 6,11E+04 83

GAPDH: 1,30E+07 2,20E-04 1,25E-08 2,50E-09 7,39E+02 19,8 1,20E+06 1631

B2F4-2 Día 6

PT: 1,10E+07 1,40E-04 1,25E-08 2,50E-09 9,82E+02 19.2 1,83E+06 1859

GGCX: 1,10E+07 1,40E-04 1,25E-08 2,50E-09 9,82E+02 24,1 6,11E+04 62

GAPDH: 1,10E+07 1,40E-04 1,25E-08 2,50E-09 9,82E+02 19 2,10E+06 2135

H3B10-1 Día 10

PT: 1,10E+07 2,90E-04 1,25E-08 2,50E-09 4,74E+02 17,77 4,92E+06 10375

GGCX: 1,10E+07 2,90E-04 1,25E-08 2,50E-09 4,74E+02 23,4 9,93E+04 210

GAPDH: 1,10E+07 2,90E-04 1,25E-08 2,50E-09 4,74E+02 17,96 4,31E+06 9095

H3B10-2. Día 10

PT: 8,90E+06 3,10E-04 1,25E-08 2,50E-09 3,59E+02 19.2 1,83E+06 5087

GGCX: 8,90E+06 3,10E-04 1,25E-08 2,50E-09 3,59E+02 25,3 2,66E+04 74

GAPDH: 8,90E+06 3,10E-04 1,25E-08 2,50E-09 3,59E+02 18,9 2,25E+06 6263

* Datos de P1E2 del ejemplo 3 para comparación.

5

La proporción calculada de mRNA de rhFII: El mRNA de GGCX fue aproximadamente 30:1 para el clon H3B10, aproximadamente 50:1 para el clon B2F4 y aproximadamente 250:1 para el clon P1E2.

Ejemplo 6

Producción de factor IX de coagulación humano (FIX)

El cDNA del factor IX de coagulación humano se amplificó a partir del cDNA de hígado del reservorio de 5 gen humano comprado de Invitrogen. Los cebadores de oligonucleótidos fueron para:

el extremo 5'; F9f.ampl.: 5'-CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-3' (SEQ ID NO: 16),

y el extremo 3'; F9r.ampl.: 5'- CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA -3' (SEQ ID NO: 17).

La clonación de la secuencia correcta fue confirmada por la secuenciación del DNA. El fragmento de FIX humano fue amplificado por PCR usando la polimerasa Pfx (Invitrogen) y los cebadores de clonación para producir 10 un fragmento del extremo romo. El fragmento del extremo romo se fosforiló usando T4 polinucleótido cinasa, y se clonó en los vectores de pCDNA-GGCX EcoRV digeridos y de-fosforilados del Ej. 1 y Ej. 4. De este modo, se obtuvieron los constructos para la expresión conjunta de análogos de FIX y GGCX humano respecto a los constructos de expresión conjunta usados para la producción de protrombina humana (Ej.1 y 4). La clonación de las secuencias correctas se confirmó por la secuenciación del DNA y la expresión transitoria en células COS-7. El 15 constructo del vector F9NopA se puede ver en la Fig. 3a y el constructo del vector F9hglx se muestra en la Fig. 3b. La diferencia entre los vectores F9NopA y F9hglx es la dirección de transcripción del gen de GGCX. La secuencia de nucleótidos de F9NopA se muestra en SEQ ID NO: 14 y la secuencia de nucleótidos de F9hglx se muestra en SEQ ID NO: 15

Establecimiento de líneas celulares productoras de rhFIX 20

Los constructos de rhFIX se transfectaron en células CHO-S usando el procedimiento descrito en el Ej. 1. Para cada constructo de FIX se rastrearon aproximadamente 3000 clones para la expresión de rhFIX por ELISA de sobrenadantes de células. Los anticuerpos usados fueron de Haemathology Technology Inc. y DakoCytomation. Los clones se seleccionaron y se adaptaron para hacerlos crecer en medio de CHO químicamente definido sin proteína. Las células se cultivaron tanto en matraces en T a 37 °C como en botellas de centrifugación a 32-37 °C. La 25 concentración de CO2 fue 5% para ambos tipos de cultivos. El rhFIX producido se purificó hasta homogeneidad por cromatografía de intercambio aniónico de Q-Sepharose a pH 7,0. La actividad de hFIX recombinante se determinó por ensayo de coagulación usando plasma deficiente de FIX (Precision Biologic). El clon de rhFIX de mejor producción obtenido fue N4D5, que se obtuvo usando el constructo de F9NopA, produjo hasta 4 µg/ml de rhFIX activo cultivado en medio químicamente definido sin proteína en matraz T. El crecimiento en la botella de 30 centrifugación del mismo clon produjo hasta 7,1 µg/ml de rhFIX. La productividad global, incluyendo también el rhFIX carboxilado incompletamente, no activo, se estimó por transferencia Western que era al menos 30 µg/ml. El clon de mejor producción obtenido con el constructo de rhFIX F9hglx fue P1G9 que produjo 0,7 (matraz T) - 1,3 (de centrifugación) µg/ml rhFIX bajo condiciones similares. Los resultados indican que la productividad de rhFIX mejoró por la expresión conjunta de GGCX a un bajo nivel usando el constructo de F9NopA, pero que la expresión conjunta 35 de GGCX usando el constructo F9hglx, fue menos beneficiosa. También se observó que el constructo de F9NopA, que aumentaba el clon de N4D5, generalmente dio señales de ELISA mayores que el constructo de F9hglx, que aumentaba el clon de P1G9, en rastreos simultáneos según la productividad durante el procedimiento de desarrollo de la línea celular.

La productividad de la línea celular de N4D5 es aproximadamente 4-6 mejor que los niveles previamente 40 publicados obtenidos bajo condiciones comparables, en los que IC4, IGB, r-FIX BHK y r-FIX 293 son el nombre de los clones mencionados en las referencias (Tabla 5).

Tabla 5. Comparación de la productividad a partir de líneas celulares productoras de FIX humano.

Línea celular/constructo: Cantidad de rhFIX activo producido Productividad total (µg/ml) Referencia

Matraz T (µg/ml): Centrifugado (µg/ml)

N4D5/F9NopA CHO, bajo expr. conjunta de GGXC: 4 7,1 >30 Ejemplo 6

P1G9/F9hglx CHO, medio expr. conjunta de GGCX: 0,7 1,3 Nd Ejemplo 6

IC4 CHO, HA (control) expr. conjunta: 0,9 nd 30 Rehemtulla 1993.

IC4 CHO. Alta expr. conjunta de GGCX: 1 nd 29 Rehemtulla 1993.

IC4: 0,9 nd 20 Documento de EE.UU. Nº. 5.460.950

1G8 CHO: 1,5 nd 43 Kaufman, RJ et al 1986 JBC 261:9622-9628

r-FIX BHK: 0,004/24h nd 0,004/24h Hallgren 2002

r-FIX 293: 0,004/24h nd 0,004/24h Hallgren 2002

Ejemplo 7

Análisis de RT-PCR a Tiempo Real de la expresión de γ-Carboxilasa y Factor IX en líneas celulares de CHO-S midiendo la cantidad de mRNA

Se cultivaron clones productores de hFIX recombinantes en botellas de centrifugación a 32-37 °C, en 100 5 ml de medio químicamente definido sin proteína suplementado con Vitamina K. Las muestras de 5-10 ml se recogieron a la concentración máxima de rhFIX y se analizaron según el contenido de transcritos de FIX humano y GGCX, así como transcritos del gen de control de GAPDH (interno). El procedimiento fue como en el ejemplo 3. Los cebadores para rhFIX fueron como sigue:

Cebadores del Factor IX Humano 10

5' AATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTG 3': Cebador directo (SEQ ID NO: 18)

5' CACTGCTGGTTCACAGGACTTCT 3': Cebador inverso (SEQ ID NO: 19)

5' TCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAAC 3': Sonda (SEQ ID NO: 20)

Longitud de amplicón 84 bp

Se encontraron niveles de RNA Mensajero máximos en diferentes días dependiendo de la temperatura del cultivo y del tamaño del inóculo del cultivo. Los niveles máximos de mRNA se encontraron que correspondían bien con la concentración máxima de rhFIX en el medio de cultivo. 15

Tabla 6. Resultados del análisis RT-PCR a Tiempo Real de clones productores de rhFIX.

Lote de la línea celular: Día de cultivo 2^-delta Ct FIX 2^-delta Ct GGCX proporción de mRNA FIX:GGCX

N4D5-100: 11 0,255253 0,005461 47:1

N4D5-2: 14 0,264866 0,006201 43:1

P1G9-A: 6 0,022982 0,005601 4:1

P1G9-B: 8 0,04181 0,007687 5:1

A partir de los análisis RT-PCR a Tiempo Real, los inventores también encontraron que, aunque los valores de 2^-delta Ct variaban con el tiempo de cultivo y la condiciones, las proporciones de mRNA de FIX:GGCX fueron aproximadamente iguales para cada clon. Para el clon que mejor producía rhFIX N4D5 la proporción fue 20 aproximadamente 45:1. El análisis de otro clon, P1G9, dio una proporción menor de aproximadamente 4,5:1. El clon P1G9 produjo solo 20% de la cantidad rhFIX producida por N4D5.

Listado de Secuencias:

SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 13

Secuencia PP6

SEQ ID NO: 14

Secuencia F9NopaA

SEQ ID NO: 15

F9hglx

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AstraZeneca AB

<120> Proteína

<130> 101165-1P WO 5

<140> PCT/SE2004/001453

<141> 12-10-2004

<150> 0324044.7

<151> 14-10-2003

<160> 15 10

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 7422

<212> DNA

<213> Artificial 15

<220>

<223> Vector

<400> 1

<210> 2

<211> 10139

<212> DNA

<213> Artificial 5

<220>

<223> Vector

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens 5

<400> 3

attcctcagt gacccaggag ctgaca 26

<210> 4

<211> 42

<212> DNA 10

<213> Homo sapiens

<400> 4

ctactctcca aactgatcaa tgaccttctg tatccacttc tt 42

<210> 5

<211> 23 15

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

tccgcagagc aatggcggtg tct 23

<210> 6 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ccaacatctg gccccttcag aact 24 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7 30

acacctctgg ttcagacctt tctt 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8 5

aatcgctcat ggaaaggagt attt 24

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens 10

<400> 9

caacaaaggc tccaggagat tgaacgc 27

<210> 10

<211> 22

<212> DNA 15

<213> Homo sapiens

<400> 10

tggaggacaa aaccgaaaga ga 22

<210> 11

<211> 18 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

catccgagcc ctccacaa 18

<210> 12 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

ctcctggaat cctacatcga cgggc 25 30

<210> 13

<211> 10238

<212> DNA

<213> Artificial

<220> 35

<223> Vector

<400> 13

<210> 14

<211> 9683

<212> DNA

<213> Artificial 5

<220>

<223> Vector

<400> 14

<210> 15

<211> 9781

<212> DNA

<213> Artificial 5

<220>

<223> Vector

<400> 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula huésped eucariota que comprende al menos un vector de expresión que comprende:

una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y

una molécula de ácido nucleico que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la 5 expresión que comprenden un segundo promotor,

en el que el primer promotor se selecciona de promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV), pEF-1α, pRSV o pUbC, y

el segundo promotor se selecciona de promotor temprano inmediato de SV40, promotor FIX minimizado o promotor de quinasa timidina de HSV. 10
2. La célula huésped que se reivindica en la reivindicación 1, en la que las moléculas de ácido nucleico están dentro de un vector de expresión sencillo.
3. La célula huésped que se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en la que el primer promotor es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV) y el segundo promotor es el promotor temprano de SV40. 15
4. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína que requiere gamma-carboxilación se selecciona del grupo que consiste en: factor de coagulación VII, factor de coagulación IX, protrombina (factor de coagulación II), factor de coagulación X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína Bone Gla, proteína de Matriz Gla, proteína específica de detención del crecimiento 6 y proteína del tipo FXa de Acanthophiinae. 20
5. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína que requiere gamma-carboxilación es un factor de coagulación dependiente de la vitamina K.
6. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor IX.
7. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína que 25 requiere gamma-carboxilación es el Factor X.
8. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína que requiere gamma-carboxilación es la protrombina.
9. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína que requiere gamma-carboxilación es la proteína C. 30
10. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor VII.
11. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la proteína que requiere gamma-carboxilación es una proteína humana.
12. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la γ-glutamil 35 carboxilasa es una proteína humana.
13. Una célula como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula de mamífero, célula de levadura o célula de insecto.
14. Una célula como se reivindica en la reivindicación 13, en la que la célula es una célula de mamífero. 40
15. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y una molécula de ácido nucleico que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un segundo promotor,

en el que el primer promotor se selecciona de promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV), 45 pEF-1α, pRSV o pUbC, y

el segundo promotor se selecciona de promotor temprano inmediato de SV40, promotor FIX minimizado o promotor de quinasa timidina de HSV.
16. Un vector como se reivindica en la reivindicación 15, en el que el primer promotor es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV) y el segundo promotor es el promotor temprano de SV40. 50
17. Un vector como se reivindica en la reivindicación 15 o 16, en elque la proteína que requiere gamma-carboxilación se selecciona del grupo que consiste en: factor de coagulación VII, factor de coagulación IX, protrombina (factor de coagulación II), factor de coagulación X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína Bone Gla, proteína de Matriz Gla, proteína específica de detención del crecimiento 6 y proteína del tipo FXa de Acanthophiinae. 5
18. Un vector como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor IX.
19. Un vector como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor X.
20. Un vector como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la proteína 10 que requiere gamma-carboxilación es la protrombina.
21. Un vector como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es la proteína C.
22. Un vector como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor VII. 15
23. Un método para producir la proteína gamma-carboxilada que comprende:

(i) cultivar una célula eucariota que comprende al menos un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias control asociadas a la expresión que comprenden un primer promotor y

una molécula de ácido nucleico que codifica una γ-glutamil carboxilasa y secuencias control asociadas a la 20 expresión que comprenden un segundo promotor,

en el que el primer promotor se selecciona del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV), pEF-1α, pRSV y pUbC, y

el segundo promotor se selecciona del promotor temprano inmediato de SV40, promotor FIX minimizado o promotor de quinasa timidina de HSV, y 25

(ii) aislar la proteína gamma-carboxilada.
24. Un método como se reivindica en la reivindicación 23, en el que la proteína gamma-carboxilada se selecciona del grupo que consiste en: factor de coagulación VII, factor de coagulación IX, protrombina (factor de coagulación II), factor de coagulación X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína Bone Gla, proteína de Matriz Gla, proteína específica de detención del crecimiento 6 y proteína del tipo FXa de Acanthophiinae. 30
25. Un método como se reivindica en la reivindicación 23 o 24, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es un factor de coagulación dependiente de la vitamina K o su forma activada.
26. Un método como se reivindica en la reivindicación 23 o 25, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor IX o su forma activada.
27. Un método como se reivindica en la reivindicación 23 o 25, en el que la proteína que requiere 35 gamma-carboxilación es el Factor X o su forma activada.
28. Un método como se reivindica en la reivindicación 23 o 25, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es la protrombina o su forma activada.
29. Un método como se reivindica en la reivindicación 23 o 25, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es la proteína C o su forma activada. 40
30. Un método como se reivindica en la reivindicación 23 o 25, en el que la proteína que requiere gamma-carboxilación es el Factor VII o su forma activada.
31. Un método para producir una composición farmacéutica adecuada para inducir la coagulación de la sangre o promover un incremento o decrecimiento de la coagulación, que comprende la etapas de

(i) expresar una proteína carboxilada activa en una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 1, 45

(ii) purificar la proteína carboxilada activa, y

(iii) mezclar la proteína carboxilada purificada con uno o varios vehículos farmacéuticamente aceptables o excipientes.