ES2358204T3 - Adenovirus quiméricos para uso en el tratamiento del cáncer. - Google Patents

Abstract

Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B, en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico; en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí; y en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral.

Description

Esta Solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional U.S. Serie nº 60/574.851, presentada el 26 de mayo de 2004, que se incorpora aquí como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención descrita aquí se refiere generalmente al campo de la biología molecular, y más específicamente a adenovirus oncolíticos que tienen aplicaciones terapéuticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es la causa principal de muerte en los Estados Unidos de América y en cualquier otra parte del mundo. Dependiendo del tipo de cáncer, típicamente se trata con cirugía, quimioterapia, y/o radiación. Estos tratamiento fracasan a 10 menudo, y está claro que son necesarias nuevas terapias, para ser usadas solas o en combinación con técnicas clásicas.

Un enfoque ha sido el uso de adenovirus, ya sea solos o como vectores capaces de suministrar proteínas terapéuticas contra el cáncer a células tumorales. Los adenovirus son virus de ADN bicatenario icosaédricos sin cubierta, con un genoma lineal de aproximadamente 36 mil pares de bases. Cada extremo del genoma vírico tiene una secuencia corta 15 conocida como la repetición terminal invertida (o ITR), que es necesaria para la replicación vírica. Todos los genomas de adenovirus humanos examinados hasta la fecha tienen misma organización general; esto es, los genes que codifican funciones específicas están situados en la misma posición en el genoma vírico. El genoma vírico contiene cinco unidades de transcripción tempranas (E1A, E1B, E2, E3, y E4), dos unidades tempranas retrasadas (IX e Iva2), y una unidad tardía (tardía principal) que se procesa para generar cinco familias de ARNm tardíos (L1-L5). Las proteínas codificadas 20 por los genes tempranos están implicadas en la replicación, mientras que los genes tardíos codifican proteínas estructurales víricas. Las porciones del genoma vírico se pueden sustituir fácilmente por ADN de origen extraño, y los adenovirus recombinantes son estructuralmente estables, propiedades que hacen a estos virus potencialmente útiles para la terapia génica (véase Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64).

Actualmente, los esfuerzos de investigación para producir terapia adenovírica clínicamente útil se han centrado en el 25 serotipo adenovírico Ad5. Las genéticas de este adenovirus humano están bien caracterizadas, y los sistemas están bien descritos para su manipulación molecular. Se han desarrollado métodos de producción de alta capacidad para apoyar aplicaciones clínicas, y existe cierta experiencia clínica con el agente. Véase, Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64. La investigación referida al uso de adenovirus (Ad) humanos en el tratamiento del cáncer se ha centrado en el desarrollo de adenovirus a base de Ad5 que tienen una mayor potencia en, o que se dirigen preferentemente a, 30 tipos de células tumorales específicos, y existe la necesidad de la generación de virus oncolíticos más potentes si la terapia adenovírica va a encontrar aplicación práctica en un marco clínico.

Ad5 es solo uno de los 51 serotipos adenovíricos actualmente conocidos, que se clasifican en subgrupos A-F, basándose en diversos atributos, incluyendo sus propiedades de hemoaglutinamiento ((véase, Shenk, “Adenoviridae: The Viruses y Their Replication,” en Fields Virology, Vol. 2, Cuarta Edición, Knipe, ea., Lippincott, Williams & Wilkins, p. 2265-35 2267 (2001)). Estos serotipos difieren en una variedad de niveles, por ejemplo patología en receptores celulares de seres humanos y roedores usados para la unión, pero estas diferencias se han ignorado principalmente como medios potenciales para desarrollar adenovirus oncolíticos más potentes (con la excepción de alteraciones de fibra; véanse Stevenson et al. (1997) J. Virol. 71:4782-4790; Krasnykh et al. (1996) J. Virol. 70: 6839-6846; Wickham et al. (1997) J.Virol. 71:8221-8229; Legrand et al. (2002) Curr. Gene Ther. 2:323-329; Barnett et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1-40 3:1-14; Solicitud de Patente US 2003/0017138).

La explotación de diferencias entre serotipos adenovíricos puede proporcionar una fuente de tratamientos a base de adenovirus, usando nuevos adenovirus con una mayor selectividad y potencia. Existe la necesidad de tales terapias a base de adenovirus mejoradas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN 45

La presente invención proporciona nuevos adenovirus quiméricos útiles para la terapia a base de virus. En particular, la invención proporciona adenovirus quiméricos que tienen un genoma que comprende una región E2B, en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico;

en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, 50 C, D, E, o F y son distintos entre sí; y

en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral.

En una realización, el adenovirus quimérico comprende además regiones que codifican proteínas fibra, hexón, y pentón, en el que los ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas son todos del mismo serotipo adenovírico. En otra realización, el adenovirus quimérico de la invención comprende una región E3 o E4 modificada.

En otra realización, el adenovirus quimérico demuestra un índice terapéutico mejorado en una célula tumoral de colon, mama, páncreas, pulmón, próstata, ovario o hematopoyética. En una realización particularmente preferida, el adenovirus quimérico presenta un índice terapéutico mejorado en células tumorales de colon.

En una realización preferida, la región E2B del adenovirus quimérico comprende SEC ID NO: 3. En una realización 5 particularmente preferida, el adenovirus quimérico comprende SEC ID NO: 1.

La presente invención proporciona un adenovirus quimérico recombinante, o una variante o derivado del mismo, que tiene un genoma que comprende una región E2B

en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una segunda secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico; 10

en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí;

en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico aumentado para una célula tumoral; y

en el que dicho adenovirus quimérico se ha hecho deficiente para la replicación a través de la supresión de una o más 15 regiones adenovíricas que codifican proteínas implicadas en la replicación adenovírica seleccionadas del grupo que consiste en E1, E2, E3 o E4.

En una realización, el adenovirus quimérico de la invención comprende además un gen heterólogo que codifica una proteína terapéutica, en el que dicho gen heterólogo se expresa dentro de una célula infectada con dicho adenovirus. En una realización preferida, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en citocinas y quimiocinas, anticuerpos, enzimas conversoras de profármacos, y proteínas inmunorreguladoras.

La presente invención proporciona usos para los adenovirus quiméricos de la invención para fines terapéuticos. En una realización, los adenovirus quiméricos se pueden usar para inhibir el crecimiento de células cancerígenas. En una realización particular, un adenovirus quimérico que comprende SEC ID NO: 1 es útil para inhibir el crecimiento de células de cáncer de colon. 25

En otra realización, los adenovirus de la invención son útiles como vectores para suministrar proteínas terapéuticas a células.

La presente invención proporciona un método para la producción de los adenovirus quiméricos de la invención, en el que el método comprende

a) reunir los serotipos adenovíricos que representan los subgrupos adenovíricos B-F, creando de ese modo una mezcla 30 adenovírica;

b) hacer pasar la mezcla adenovírica reunida procedente de la etapa (a) sobre un cultivo activamente creciente de células tumorales a una relación de partículas por célula suficientemente elevada para alentar la recombinación entre los serotipos, pero no tan alta como para producir la muerte celular prematura;

c) cosechar el sobrenadante de la etapa (b); 35

d) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en la etapa (c);

e) cosechar el sobrenadante del cultivo celular de la etapa (d) antes de cualquier signo de CPE;

f) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en la etapa (e); y

g) aislar el adenovirus quimérico del sobrenadante cosechado en la etapa (f) mediante purificación en placas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 40

Figura 1. Perfiles de tiempos de retención de Ad en una columna de TMAE HPLC. A) perfiles de retención para los serotipos de Ad individuales que se usaron para generar el conjunto vírico de partida original. B) Perfiles de retención de los conjuntos en la pasada 20 derivados de las estirpes celulares HT-29, Panc-1, MDA-231, y PC-3, respectivamente.

Figura 2. Actividad citolítica de los conjuntos víricos individuales. Se infectaron células A) HT-29, B) MDA-231, C) Panc-1 y D) PC-3 con sus conjuntos víricos respectivos a relaciones de partículas víricas (VP) por célula de 100 a 0,01. Se 45 llevaron a cabo ensayos con MTS en días diferentes tras la infección (según se indica) dependiendo de la estirpe celular. Cada punto de dato en el panel representa un ensayo realizado por cuadruplicado, y los resultados se expresan como la media +/- SD. El panel representa un experimento representativo, y todos los conjuntos víricos se ensayaron al menos tres veces independientes sobre la estirpe celular tumoral diana (leyenda de las figuras: - ● - Ad5; - □ - conjunto

vírico inicial; - ■ - conjunto derivado de células específicas, pasada 20).

Figura 3. Actividad citolítica de ColoAd1 y Ad5 sobre estirpes celulares tumorales humanas. Se llevó a cabo un ensayo con MTS sobre A) un panel amplio de estirpes celulares tumorales humanas, y B) sobre un panel de estirpes celulares de cáncer de colon humano, para determinar su potencia y especificidad potenciales. El ensayo con MTS se llevó a cabo en días diferentes, dependiendo de la estirpe celular. Cada panel es un experimento representativo que se ha 5 repetido al menos tres veces. Cada punto de dato en el panel representa un ensayo realizado por cuadruplicado, y los resultados se expresan como la media +/- SD (leyenda de la figura: - ● - Ad5; - □ - ColoAd1).

Figura 4. Actividad citolítica de ColoAd1 y Ad5 sobre un panel de células normales. Células HS-27, HUVEC y SAEC (células primarias de fibroblastos, endoteliales, y epiteliales, respectivamente) se infectaron con ColoAd1 y Ad5 a relaciones de VP por célula de 100 a 0,01. Se llevó a cabo un ensayo con MTS en días diferentes tras la infección, dependiendo de la célula, y cada panel es un experimento representativo que se ha repetido al menos tres veces. Cada punto de dato en el panel representa un ensayo realizado por cuadruplicado, y los resultados se expresan como la media +/- SD (leyenda de la figura: - ● - Ad5; - □ - ColoAd1).

Figura 5. Actividad citolítica de ColoAd1, Ad5 y ONYX-015 sobre células endoteliales normales primarias (HUVEC) y una estirpe celular tumoral de colon (HT-29). Cada panel es un experimento representativo que se ha repetido al menos 15 tres veces. Cada punto de dato en el panel representa un ensayo realizado por cuadruplicado, y los resultados se expresan como la media +/- SD (leyenda de la figura: - ● - Ad5; - □ - ColoAd1; - ■ - Onyx-015).

Figura 6. Actividad citolítica de ColoAd1, Ad11p y Ad5 sobre una estirpe celular epitelial normal (SAEC) y una estirpe celular de cáncer de colon humano (HT-29). Cada panel es un experimento representativo que se ha repetido al menos tres veces. Cada punto de dato en el panel representa un ensayo realizado por cuadruplicado, y los resultados se expresan como la media +/- SD (leyenda de la figura: - ● - Ad5; - □ - Ad11p; - ■ - ColoAd1).

Figura 7. Actividad citolítica de virus recombinantes. Se construyeron virus recombinantes que representan cuatro poblaciones víricas (Adp11, ColoAd1, extremo izquierdo Ad11p/extremo derecho ColoAd1 (ColoAd1.1) y extremo izquierdo ColoAd1/extremo derecho Ad11p (ColoAd1.2)) como se describe en el Ejemplo 6. La actividad citolítica de cada población en las células HT29 se determinó como se describe previamente. (Leyenda de la figura: - ● - Ad5; - □ - Ad11p; - ■ - 25 ColoAd1; - ν - ColoAd1.1; - ▲ - ColoAd1.2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones

Excepto que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el que se entiende habitualmente por una persona de pericia normal en la técnica a la que pertenece esta invención. Generalmente, la nomenclatura usada aquí y los procedimientos de laboratorio descritos más abajo son aquellos bien conocidos y empleados habitualmente en la técnica.

Como se usa aquí, las expresiones “adenovirus”, “serotipo” o “serotipo adenovírico” se refiere a cualquiera de los 51 serotipos adenovíricos humanos actualmente conocidos, o aislados en el futuro. Véase, por ejemplo, Strauss, “Adenovirus infections in humans,” en The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, p. 451-596 (1984). Estos 35 serotipos se clasifican en los subgrupos A-F (véase Shenk, “Adenoviridae: The Viruses y Their Replication,” en Fields Virology, Vol. 2, Cuata Edición, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, p. 2265-2267 (2001), como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1

Subgrupo

Serotipo adenovírico

A

12, 18, 31

B

3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 51

C

1, 2, 5, 6

D

8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 50

E

4

F

40, 41

40

Como se usa aquí, “adenovirus quimérico” se refiere a un adenovirus cuya secuencia de ácidos nucleicos comprende las secuencias de ácidos nucleicos de al menos dos de los serotipos adenovíricos descritos anteriormente.

Como se usa aquí, “serotipo adenovírico progenitor” se refiere al serotipo adenovírico que representa el serotipo a partir del cual deriva la mayoría del genoma del adenovirus quimérico.

Como se usa aquí, la expresión “recombinación homóloga” se refiere a dos moléculas de ácido nucleico, teniendo cada 45 una secuencias homólogas, en las que las dos moléculas de ácido nucleico se cruzan o sufren recombinación en la región de homología.

Como se usa aquí, el término “potencia” se refiere al potencial lítico de un virus, y representa su capacidad para replicarse, lisarse, y extenderse. Para los fines de la actual invención, la potencia es un valor que compara la actividad citolítica de un adenovirus dado de la invención con la de Ad5 en la misma estirpe celular, es decir, potencia = IC50 de AdX/IC50 de Ad5, en la que X es el serotipo adenovírico particular que se está examinando, y en la que a la potencia de Ad5 se le da un valor de 1. 5

Como se usa aquí, la expresión “virus oncolítico” se refiere a un virus que extermina preferentemente células cancerígenas en comparación con células normales.

Como se usa aquí, la expresión “índice terapéutico” o “ventana terapéutica” se refiere a un número que indica el potencial oncolítico de un adenovirus dado, y se determina dividiendo la potencia del adenovirus en una estirpe celular cancerígena entre la potencia del mismo adenovirus en una estirpe celular normal (es decir, no cancerosa). 10

Como se usa aquí, el término “modificada” se refiere a una molécula con una secuencia nucleotídica o de aminoácidos que difiere de una secuencia nucleotídica o de aminoácidos de origen natural, por ejemplo de tipo salvaje. Una molécula modificada puede retener la función o actividad de una molécula de tipo salvaje, es decir, un adenovirus modificado puede retener su actividad oncolítica. Las modificaciones incluyen mutaciones a ácidos nucleicos como se describe más abajo. 15

Como se usa aquí, “mutación”, con referencia a un polinucleótido o un polipéptido, se refiere a un cambio de origen natural, sintético, recombinante, o químico, o diferencia de la estructura primaria, secundaria o terciaria de un polinucleótido o polipéptido, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, según se compara con un polinucleótido o polipéptido de tipo salvaje). Las mutaciones incluyen cambios tales como, por ejemplo, supresiones, inserciones, o sustituciones. Los polinucleótidos y polipéptidos que tienen tales mutaciones se 20 pueden aislar o generar usando métodos bien conocidos en la técnica.

Como se usa aquí, “supresión” se define como un cambio en las secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos en las que están ausentes uno o más polinucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente.

Como se usa aquí, “inserción” o “adición” es aquel cambio en una secuencia polinucleotídica o de aminoácidos que ha dado como resultado la adición de uno o más polinucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente, según se compara con la secuencia polinucleotídica o de aminoácidos de origen natural.

Como se usa aquí, “sustitución” resulta del reemplazo de uno o más polinucleótidos o aminoácidos por diferentes polinucleótidos o aminoácidos, respectivamente.

Como se usa aquí, la expresión “derivado adenovírico” se refiere a un adenovirus de la invención que se ha modificado de forma que se ha realizado una adición, supresión o sustitución a o en el genoma vírico, de forma que el derivado 30 adenovírico resultante muestra una potencia y/o índice terapéutico mayores que los del adenovirus progenitor, o de alguna otra manera es más terapéuticamente útil (es decir, menos inmunógeno, perfil de aclaramiento mejorado). Por ejemplo, un derivado de un adenovirus de la invención puede tener una supresión en uno de los genes tempranos del genoma vírico, incluyendo, pero sin limitarse a, la región E1A o E2B del genoma vírico.

Como se usa aquí, “variante”, con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que puede variar en estructura primaria, secundaria, o terciaria, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, según se compara con un polinucleótido o polipéptido de tipo salvaje). Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos puede contener una mutación o modificación que difiera de una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de referencia. En algunas realizaciones, una variante adenovírica puede ser una isoforma o polimorfismo diferente. Las variantes pueden ser polinucleótidos o polipéptidos de origen 40 natural, sintéticos, recombinantes, o modificados químicamente, aislados o generados usando métodos bien conocidos en la técnica. Los cambios en la secuencia polinucleotídica de la variante pueden ser silenciosos. Esto es, pueden no alterar los aminoácidos codificados por el polinucleótido. Cuando las alteraciones se limiten a cambios silenciosos de este tipo, una variante codificará un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que la referencia. Como alternativa, tales cambios en la secuencia polinucleótidica de la variante pueden alterar la secuencia de aminoácidos y un 45 polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia, dando como resultado cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos, como se describe más abajo. Tales cambios polinucleotídicos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Se pueden introducir diversas sustituciones de codones, tales como los cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un vector plasmídico o vírico o la expresión en un sistema procariota o eucariota particular.

Como se usa aquí, una “variante adenovírica” se refiere a un adenovirus cuya secuencia polinucleotídica difiere de un polinucleótido de referencia, por ejemplo un adenovirus de tipo salvaje, como se describe anteriormente. Las diferencias están limitadas, de manera que las secuencias polinucleotídicas del progenitor y de la variante son en conjunto similares y, en la mayoría de las regiones, idénticas. Como se usa aquí, se afirma que una primera secuencia nucleotídica o de 55 aminoácidos es “similar” a una segunda secuencia cuando una comparación de las dos secuencias muestra que tienen pocas diferencias de secuencias (es decir, las secuencias primera y segunda son casi idénticas). Como se usa aquí, las diferencias de secuencias polinucleotídicas presentes entre la variante adenovírica y el adenovirus de referencia no dan

como resultado una diferencia en la potencia y/o el índice terapéutico.

Como se usa aquí, el término “conservativo” se refiere a la sustitución de un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente que tiene propiedades químicas similares. Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen la sustitución de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, o una treonina por una serina. Las inserciones o supresiones están típicamente en el intervalo de alrededor de 1 a 5 aminoácidos. 5

Como se usa aquí, la expresión “no conservativa” se refiere a sustituir un resto de aminoácido por un resto de aminoácidos diferente que tiene propiedades químicas diferentes. Las sustituciones no conservativas incluyen, pero no se limitan a, ácidos aspártico (D) que es sustituido por glicina (G); asparagina (N) que es sustituida por lisina (K); o alanina (A) que es sustituida por arginina (R).

Los códigos de una sola letra para los restos de aminoácidos incluyen los siguientes: A = alanina, R = arginina, N = 10 asparagina, D = ácido aspártico, C = cisteína, Q = glutamina, E = ácido glutámico, G = glicina, H = histidina, I = isoleucina, L = leucina, K = lisina, M = metionina, F = fenialanina, P = prolina, S = serina, T = treonina, W = triptófano, Y = tirosina, V = valina.

Se apreciará que los polipéptidos contienen a menudo aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos citados habitualmente como los 20 aminoácidos de origen natural, y que muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, 15 se pueden modificar en un polipéptido dado, ya sea mediante procesos naturales tales como glucosilación y otras modificaciones postraduccionales, o mediante técnicas de modificación química, que son bien conocidas en la técnica. Incluso las modificaciones habituales que se producen naturalmente en polipéptidos son demasiado numerosas para enumerarlas exhaustivamente aquí, pero están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una bibliografía de investigación voluminosa, y son bien conocidas por los expertos en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en polipéptidos de la presente invención están, por citar unas pocas, acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de glavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un polinucleótido o derivado polinucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucación, glucosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación.

Tales modificaciones son bien conocidas por aquellos de pericia, y se han descrito con gran detalle en la bibliografía científica. En la mayoría de textos básicos, tales como, por ejemplo, I.E. Creighton, Proteins-Structure y Molecular Properties, 2ª Ed., W.H. Freeman y Company New York, 1993, se describen, por ejemplo, varias modificaciones particularmente comunes, glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP. Existen muchas revisiones detalladas sobre esta materia, tales como, por ejemplo, las proporcionadas por Wold, F., en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, p 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990 y Rattan et al., Protein Synthesis: Post-translational Modifications y Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992.

Se apreciará, como es bien conocido y como se ha sellado anteriormente, que los polipéptidos no siempre son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado de sucesos postraduccionales, incluyendo sucesos de procesamiento natural y sucesos provocados por la manipulación humana que no se producen naturalmente. Los 40 polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados se pueden sintetizar mediante procesos naturales no traduccionales e igualmente mediante métodos completamente sintéticos.

Las modificaciones se pueden producir en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos, y los términos amino y carboxilo. De hecho, el bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, por una modificación covalente, es habitual en polipéptidos de origen natural y sintéticos, tales modificaciones pueden estar presentes igualmente en polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, el resto amino terminal de los polipéptidos obtenidos en E. coli, antes del procesamiento proteolítico, casi invariablemente será N-formilmetionina.

Las modificaciones que se producen en un polipéptido a menudo serán una función de cómo se obtiene. Para polipéptidos obtenidos expresando en un hospedante un gen clonado, por ejemplo, la naturaleza y grado de las modificaciones 50 se determinarán en gran parte por la capacidad de modificación postraduccional de la célula hospedante y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como es bien conocido, la glucosilación no se produce a menudo en hospedantes bacterianos tales como E. coli. En consecuencia, cuando se desea la glucosilación, un polipéptido se debería expresar en un hospedante glucosilante, generalmente una célula eucariota. Las células de insectos llevan a cabo a menudo las mismas glucosilaciones postraduccionales que las células de mamíferos, y, por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insectos para expresar eficientemente proteínas de mamíferos que tienen patrones nativos de glucosilación, entre otras. Se aplican consideraciones similares a otras modificaciones.

Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o grado variable en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones.

Como se usa aquí, las siguientes expresiones se usan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos: “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia”, “identidad sustancial”, “similitud”, y “homólogo”. Una “secuencia de 5 referencia” es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud completa dada en un listado de secuencias, o puede comprender una secuencia génica o de ADNc completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos una longitud de 18 nucleótidos o 6 aminoácidos, frecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y a menudo al menos 48 nucleótidos o 10 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos pueden cada una (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica o de aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se llevan a cabo típicamente comparando secuencias de las dos moléculas a lo largo de una “ventana de comparación” para identificar y 15 comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una “ventana de comparación”, como se usa aquí, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones nucleotídicas contiguas o 6 aminoácidos en el que una secuencias polinucleotídica o secuencia de aminoácidos se puede comparar con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos, y en el que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, supresiones, sustituciones, y similares (es decir, saltos) de 20 por ciento 20 o menos según se compara con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), VectorNTI de Informatix, Geneworks, o MacVector software packages), o mediante inspección, y seleccionando el mejor alineamiento (es decir, que resulta del porcentaje más elevado de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado por los diversos métodos. 30

Como se usa aquí, la expresión “identidad de secuencia” significa que dos secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido a nucleótido o de resto a resto) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparece la base o resto de ácido nucleico (por ejemplo A, T, C, G, U, o I) idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, del tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Las expresiones “identidad sustancias”, como se usa aquí, representa una característica de una secuencia polinucleotídica o de aminoácidos en la que el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de 40 secuencia, más habitualmente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones nucleotídicas (6 aminoácidos), frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 24-48 posiciones nucleotídicas (8-16 aminoácidos), en el que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de 45 comparación. La secuencia de referencia puede ser un conjunto de una secuencia más grande. El término “similitud”, cuando se usa para describir un polipéptido, se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. El término “homólogo”, cuando se usa para describir un polinucleótido, indica que dos polinucleótidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan óptimamente, son idénticos, con inserciones o supresiones nucleotídicas apropiadas, en al menos 70% de los nucleótidos, habitualmente de alrededor de 75% a 99%, y más preferiblemente al menos alrededor de 98 a 99% de los nucleótidos.

Como se usa aquí, “homólogo”, cuando se usa para describir un polinucleótido, indica que dos polinucleótidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan óptimamente, son idénticos, con inserciones o supresiones nucleotídicas apropiadas, en al menos 70% de los nucleótidos, habitualmente de alrededor de 75% a 99%, 55 y más preferiblemente al menos alrededor de 98 a 99% de los nucleótidos.

Como se usa aquí, “reacción en cadena de la polimerasa” o “PCR” se refiere a un procedimiento en el que trozos específicos de ADN son amplificados como se describe en la Patente U.S. No. 4.683.195. Generalmente, es necesario que la información de la secuencia procedente de los extremos del fragmento polipeptídico de interés o más allá esté disponible, de forma que se puedan diseñar cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores se apuntarán entre sí, y 60 serán idénticos o similares en secuencia a las hebras opuestas del molde a amplificar. Los nucleótidos 5‟ terminales de los dos cebadores coincidirán con los extremos del material amplificado. La PCR se puede usar para amplificar secuencias de ADN específicas a partir del ADN genómico total, ADNc transcrito a partir del ARN celular total, secuencias

plasmídicas, etc. (véase generalmente Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

Como se usa aquí, “restricción” se produce típicamente en un intervalo de alrededor de Tm (temperatura de fusión) -5ºC (5º por debajo de la Tm de la sonda) hasta alrededor de 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm. Como entenderán los expertos en la técnica, se puede usar una hibridación restrictiva para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas idénticas, 5 o para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas similares o relacionadas. Como se usa aquí, la expresión “condiciones restrictivas” significa que la hibridación se producirá solo si hay al menos 95%, y preferiblemente al menos 97% de identidad entre las secuencias.

Como se usa aquí, “hibridación” incluye “cualquier proceso mediante el cual una hebra polinucleotídica se une a una hebra complementaria a través de emparejamiento de bases” (Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, 10 New York, N.Y., 1994).

Como se usa aquí, la expresión “dosis terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” se refiere a aquella cantidad de adenovirus que mejora los síntomas o estados de una enfermedad. Una dosis se considera una dosis terapéuticamente eficaz en el tratamiento de cáncer o su metástasis cuando se ralentiza o detiene el crecimiento tumoral o metastásico, o se encuentra que el tumor o la metástasis se contraen en tamaño, para conducir a una prolongación en la esperanza de 15 vida para el sujeto.

Adenovirus de la Invención

La presente invención proporciona adenovirus quiméricos que tienen un genoma en el que la secuencia nucleotídica de la región E2B del adenovirus quimérico comprende secuencias de ácidos nucleicos derivadas de al menos dos serotipos adenovíricos, serotipos los cuales se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E y F y son distintos 20 entre sí. Un adenovirus quimérico de la invención es oncolítico y demuestra un índice terapéutico aumentado para una célula tumoral.

Aislamiento de Adenovirus Quiméricos

Los adenovirus quiméricos de la invención se pueden producir usando modificación de una técnica denominada como “bioselección”, en la que un adenovirus con propiedades deseadas, tales como oncogenicidad aumentada o especificidad por un tipo celular, se genera a través del uso de selección genética en condiciones controladas (Yan et al. (2003) J. Virol. 77:2640-2650).

En la presente invención, una mezcla de adenovirus de diferentes serotipos se reúne y se hace pasar, preferiblemente al menos dos veces, sobre un cultivo subconfluente de células tumorales a una relación de partículas por célula suficientemente elevada para fomentar la recombinación entre serotipos, pero no tan alta como para producir la muerte celular 30 prematura. Una relación preferida de partículas por célula por célula es aproximadamente 500 partículas por célula, y se determina fácilmente por la persona experta en la técnica. Como se usa aquí, un “cultivo subconfluente” de células se refiere a un cultivo de monocapa o en suspensión en el que las célula están creciendo activamente. Para que las células crezcan como una monocapa, un ejemplo sería un cultivo en el que aproximadamente 50% a 80% del área disponible para el crecimiento celular esté cubierta con células. Se prefiere un cultivo en el que aproximadamente 75% del área de 35 crecimiento esté cubierta con las células.

En una realización preferida, la mezcla adenovírica es aquella que incluye serotipos adenovíricos representativos de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E y F. los adenovirus del grupos A no están incluidos en la mezcla, puesto que están asociados con formación de tumores en roedores. Las estirpes celulares tumorales preferidas útiles en el proceso de bioselección incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de mama, colon, páncreas, pulmón y próstata. Algunos 40 ejemplos de estirpes celulares de tumores sólidos útiles para la pasada “bioselectiva” de la mezcla adenovírica incluyen, pero no se limitan a, las células MDA231, HT29, PAN-1 y PC-3. Las estirpes celulares hematopoyéticas incluyen, pero no se limitan a, las células linfoides B Raji y Daudi, células eritroblastoides K-562, células mieloides U937, y células linfoides T HSB2.

Los adenovirus producidos durante estas pasadas iniciales se usan para infectar células tumorales inactivas a una relación de partícula a célula suficientemente baja para permitir la inserción de una célula por no más de un adenovirus. Después de hasta 20 pasadas en estas condiciones, el sobrenadante de la última pasada se cosecha antes del efecto citopático visible (CPE, véase Virology, Vol.2, Cuarta Edición, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, p. 135-136) para incrementar la selección de virus muy potentes. El sobrenadante cosechado se puede concentrar mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Un método preferido para lograr células inactivas, es decir, aquellas en 50 las que se ha detenido el crecimiento celular activo, en un cultivo de monocapa es permitir que el cultivo crezca durante 3 días tras la confluencia, en el que confluencia significa que está ocupada todo el área disponible para el crecimiento celular (cubierta con células). De forma similar, los cultivos en suspensión se pueden hacer crecer hasta densidades caracterizadas por la ausencia de crecimiento celular activo.

El perfil serotípico del sobrenadante concentrado, que contiene el conjunto adenovírico bioseleccionado, se puede examinar midiendo los tiempos de retención del conjunto vírico cosechado en una columna de intercambio aniónico, en la que se sabe que diferentes serotipos adenovíricos tienen tiempos de retención característicos (Blanche et al. (2000)

Gene Therapy 7:1055-1062); véase el Ejemplo 3, Figuras 1A y B. Los adenovirus de la invención se pueden aislar del sobrenadante concentrado mediante dilución y purificación en placas, u otras técnicas bien conocidas en la técnica, y se pueden hacer crecer para la caracterización posterior. Para determinar la secuencia de los adenovirus quiméricos aislados, se usan técnicas bien conocidas en la técnica (véase el Ejemplo 5).

Un ejemplo de un adenovirus quimérico de la invención es el adenovirus quimérico ColoAd1, que se aisló usando células de colon HT29 en el proceso de bioselección. ColoAd1 tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 1. La mayoría de la secuencia nucleotídica de ColoAd1 es idéntica a la secuencia nucleotídica del serotipo Ad11 (SEC ID NO: 2) (Stone et al. (2003) Virology 309:152-165; Mei et al. (2003) J. Gen. Virology 84:2061-2071). Existen dos supresiones en la secuencia nucleotídica de ColoAd1, en comparación con Ad11: una supresión de 2444 pares de bases de longitud en la región de la unidad de transcripción E3 del genoma (pares de bases 27979 a 30423 de SEC ID NO: 2), y una 10 segunda supresión, más pequeña, de 25 pares de bases de longitud (pares de bases 33164 a 33189 de SEC ID NO: 2), en el gen E4orf4. La región de la unidad de transcripción E2B (SEC ID NO: 3) de ColoAd1, que codifica las proteínas adenovíricas ADN polimerasa y la proteína terminal, está situada entre los pares de bases 5067 y 10354 de SEC ID NO: 1, y está en un área de recombinación homóloga entre los serotipos Ad11 y Ad3. En esta región de ColoAd1 hay cambios de 198 pares de bases, en comparación con la secuencia de Ad11 (SEC ID NO: 1). Los cambios dan como resultado tramos de nucleótidos en la región E2B de ColoAd1 que son homólogos a la secuencia dentro de una porción de la región E2B de Ad3 (SEC ID NO: 8), teniendo el tramo de homología más largo entre ColoAd1 y Ad3 414 pp de longitud. La región E2B de ColoAd1 (SEC ID NO: 3) confiere potencia aumentada al adenovirus de ColoAd1 en comparación con el adenovirus de Ad11 sin modificar (véase el Ejemplo 6; Fig 7). En otras realizaciones, un adenovirus quimérico de la invención puede comprender secuencias de ácidos nucleicos procedentes de más de dos serotipos adenovíricos. 20

Un adenovirus quimérico de la invención se puede evaluar en busca de su selectividad en un tipo tumoral específico mediante examen de su potencial lítico en un panel de células tumorales derivadas del mismo tejido sobre el cual inicialmente se hizo pasar el conjunto adenovírico. Por ejemplo, el adenovirus quimérico ColoAd1 (SEC ID NO: 1), que derivó inicialmente de un conjunto adenovírico que se hizo pasar sobre estirpes celulares tumorales de colon HT-29, se volvió a examinar tanto en células HT-29 como en un panel de otras estirpes celulares tumorales derivadas de colon, 25 incluyendo DLD-1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48, y CoIo320DM (véase la Figura 3B). Cualesquiera estirpes celulares tumorales de colon disponibles serían igualmente útiles para tal evaluación. Los clones adenovíricos aislados procedentes de conjuntos adenovíricos seleccionados en otros tipos de células tumorales se pueden ensayar de forma similar en un panel de células tumorales adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, estirpes celulares de próstata (por ejemplo estirpes celulares DU145 y PC-3); estirpes celulares pancreáticas (por ejemplo, la estirpe celular Panc-1); 30 estirpes celulares de tumor mamario (por ejemplo, la estirpe celular MDA231), y estirpes celulares ováricas (por ejemplo la estirpe celular OVCAR-3). Otras estirpes celulares tumorales disponibles son igualmente útiles en el aislamiento e identificación de adenovirus de la invención.

Los adenovirus quiméricos de la invención tienen un índice terapéutico aumento en comparación con los serotipos adenovíricos de los que derivan (véase la Figura 6, que compara la actividad citolítica de los adenovirus quiméricos Colo-35 Ad1 con Ad11p).

La invención también engloba adenovirus quiméricos que se construyen usando técnicas recombinantes bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales adenovirus quiméricos comprenden una región de secuencia nucleotídica derivada de un serotipo adenovírico que se incorpora mediante técnicas recombinantes en el genoma de un segundo serotipo adenovírico. La secuencia incorporada confiere una propiedad, por ejemplo especificidad tumoral o potencia mejorada, 40 al serotipo adenovírico progenitor. Por ejemplo, la región E2B de ColoAd1 (SEC ID NO: 3) se puede incorporar en el genoma de Ad35 o Ad9.

Derivados Adenovíricos

La invención también engloba y describe un adenovirus quimérico de la invención que está modificado para proporcionar otros adenovirus quiméricos terapéuticamente útiles. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, las descritas 45 más abajo.

Una modificación descrita es la producción de derivados del adenovirus quimérico que carece sustancialmente de la capacidad para unirse a p53, como resultado de una mutación en el gen adenovírico que codifica la proteína E1 B-55K. Tales virus tienen generalmente suprimida parte, o toda, la región E1 B-55K (véase la Patente U.S. Nº 5.677.178). La Patente U.S. Nº 6.080.578 describe, entre otras cosas, mutantes de Ad5 que tienen supresiones en la región de la proteína E1 B-55K que es responsable de la unión a p53. Otra modificación a los adenovirus quiméricos son las mutaciones en la región E1A, como se describe en las Patentes U.S. Nos 5.801.029 y 5.972.706. Estos tipos de modificaciones proporcionan derivados de los adenovirus quiméricos de la invención con mayor selectividad por células tumorales.

Un ejemplo de una modificación englobada por la invención es un adenovirus quimérico que muestra un grado aumentado de especificidad tisular debido a la colocación de la replicación vírica bajo el control de un promotor específico de 55 tejidos, como se describe en la Patente U.S. Nº 5.998.205. La replicación de un adenovirus quimérico de la invención también se puede poner bajo el control de un elemento sensible a E2F, como se describe en la Solicitud de Patente U.S. Nº 09/714.409. Esta modificación da un mecanismo de control de la replicación vírica basada en la presencia de E2F, dando como resultado una mayor especificidad por el tejido tumoral, y es distinto del control realizado por un promotor específico de tejidos. En estas dos realizaciones, el promotor específico de tejidos y el elemento sensible a E2F están operablemente ligados a un gen adenovírico que es esencial para la replicación del adenovirus.

Otra modificación englobada por la invención es el uso de un adenovirus quimérico de la invención, p.ej. ColoAd1, como el esqueleto principal para la producción de nuevos vectores adenovíricos con replicación deficiente. Como se describe en Lai et al. ((2002) DNA Cell Bio. 21:895-913), los vectores adenovíricos que tienen una replicación deficiente se pueden usar para suministrar y expresar genes terapéuticos. Se proporcionan aquí vectores adenovíricos tanto de primera generación (en los que las regiones E1 y E3 están suprimidas) como de segunda generación (en los que la región E4 está suprimida adicionalmente) derivados de los adenovirus quiméricos de la invención. Tales vectores se producen fácilmente usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica (véase Imperiale y Kochanek (2004) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 273:335-357; Vogels et al. (2003) J. Virol. 77:8263-8271). 10

Una modificación adicional englobada por la invención es la inserción de un gen heterólogo, útil como un marcador o informador para rastrear la eficiencia de la infección vírica. Una realización de este tipo de modificación es la inserción del gen de timidina cinasa (TK). La expresión de TK en las células infectadas se puede usar para rastrear el nivel de virus que queda en las células tras la infección vírica, usando sustratos radiomarcados de la reacción de TK (Sangro et al. (2002) Mol. Imaging Biol. 4:27-33). 15

Los métodos para la construcción de los adenovirus quiméricos modificados son generalmente conocidos en la técnica. Véanse, Mittal, S. K. (1993) Virus Res. 28:67-90 y Hermiston, T. et al. (1999) Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods y Protocols, W.S.M. Wold, ed, Humana Press. Se usan técnicas estándar para métodos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis polinucleotídica, y cultivo y transformación microbiana (p.ej., electroporación, lipofección). Generalmente, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del 20 fabricante. Las técnicas y procedimientos se llevan a cabo generalmente según métodos convencionales en la técnica y diversas referencias generales (véase generalmente Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que se proporcionan a lo largo de este documento. La nomenclatura usada aquí y los procedimientos de laboratorio en química analítica, química sintética orgánica, y formulación farmacéutica descritos más abajo son bien conocidos y se emplean habitualmente en la técnica. 25

Determinación del Potencial Terapéutico

Los adenovirus quiméricos de la invención se pueden evaluar para determinar su utilidad terapéutica mediante examen de su potencial lítico en células tumorales derivadas de tejidos de interés como dianas terapéuticas. Las estirpes celulares tumorales útiles para evaluar tales adenovirus incluyen, pero no se limitan a, estirpes celulares de colon, incluyendo, pero sin limitarse a, las estirpes celulares DLD-1, HCT116, HT29, LS1034 y SW48; estirpes celulares de próstata, incluyendo, pero sin limitarse a, estirpes celulares DU145 y PC-3; estirpes celulares pancreáticas, incluyendo, pero sin limitarse a, la estirpe celular Panc-1; estirpes celulares de tumor de mama, incluyendo, pero sin limitarse a, la estirpe celular MDA231; y estirpes celulares ováricas, incluyendo, pero sin limitarse a, la estirpe celular OVCAR-3. Las estirpes celulares hematopoyéticas incluyen, pero no se limitan a, las células linfoides B Raji y Daudi, células eritroblastoides K562, células mieloides U937, y células linfoide T HSB2. Para evaluar e identificar los adenovirus de la invención para uso en 35 el tratamiento de neoplasia, se pueden usar cualesquiera otras estirpes celulares tumorales que estén disponibles.

La actividad citolítica de los adenovirus de la invención se puede determinar en estirpes celulares tumorales representativas, y los datos se pueden convertir en una medida de la potencia, usando como patrón (es decir, dándole una potencia de 1) un virus que pertenece al subgrupo C, preferiblemente Ad5. Un método preferido para determinar la actividad citolítica es un ensayo con MTS (véase el Ejemplo 4, Figura 2). 40

El índice terapéutico de un adenovirus de la invención en una estirpe celular tumoral particular se puede calcular comparando la potencia de un adenovirus dado en una estirpe celular tumoral con la potencia del mismo adenovirus en una estirpe celular no cancerosa. Las estirpes celulares no cancerosas preferidas son células SAEC, que tienen un origen epitelial, y las células HUVEC, que tienen origen endotelial (véase la Figura 4). Estos dos tipos celulares representan células normales a partir de las cuales derivan órganos y vasculatura, respectivamente, y son representativos de sitios 45 probables de toxicidad durante la terapia adenovírica, dependiendo del modo de suministro del adenovirus. Sin embargo, la práctica de la invención no está limitada al uso de estas células, y también se pueden usar otras estirpes celulares no cancerosas (por ejemplo, células B, células T, macrófagos, monocitos, fibroblastos).

Los adenovirus quiméricos de la invención se pueden evaluar además en busca de su capacidad para seleccionar el crecimiento de células neoplásicas (es decir, cáncer) mediante su capacidad para reducir la tumorigénesis o la carga de 50 células neoplásicas en ratones atímicos que poseen un trasplante de células neoplásicas, en comparación con ratones no tratados que poseen una carga de células neoplásicas equivalente (véase el Ejemplo 7).

La evaluación de los adenovirus de la invención también se puede llevar a cabo usando explantes tumorales humanos primarios (Lam et al. (2003) Cancer Gene Therapy; Grill et al. (2003) Mol. Therapy 6:609-614), que proporcionan condiciones de ensayo presentes en tumores que normalmente no se pueden producir usando los estudios de xenoinjertos 55 tumorales.

Utilidad Terapéutica

La presente invención proporciona el uso de adenovirus quiméricos de la invención para la inhibición del crecimiento celular tumoral, así como para el uso de vectores adenovíricos derivados de estos adenovirus quiméricos para suministrar proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de neoplasia y otras enfermedades.

Composiciones Farmacéuticas y Administración 5

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los adenovirus quiméricos de la invención formuladas para administración terapéutica a un paciente. Para uso terapéutico, una composición estéril que contiene una dosis farmacológicamente eficaz de adenovirus se administra a un paciente humano o un paciente no humano veterinario para el tratamiento, por ejemplo, de una afección neoplásica. Generalmente, la composición comprenderá alrededor de 1011 o más partículas adenovíricas en una suspensión acuosa. A menudo se emplea un vehículo 10 o excipiente farmacéuticamente aceptable en tales composiciones estériles. Se puede usar una variedad de disoluciones acuosas, p.ej. agua, agua tamponada, disolución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, y similar. Estas disoluciones son estériles y generalmente libres de materia en partículas distinta del vector adenovírico deseado. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requieran para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponantes del pH, agentes de ajuste de la toxicidad, y similares, 15 p.ej. acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato de sodio, etc. Se pueden incluir excipientes que potencian la infección de las células por adenovirus (véase la Patente U.S. Nº 6.392.069).

Los adenovirus de la invención también se pueden suministrar a células neoplásicas mediante suministro liposómico o inmunoliposómico; tal suministro se puede dirigir selectivamente a células neoplásicas basándose en una propiedad de la superficie celular presente en la población de células neoplásicas (p.ej., la presencia de una proteína de superficie 20 celular que se una a una inmunoglobulina en un inmunoliposoma). Típicamente, una suspensión acuosa que contiene los viriones se encapsula en liposomas o inmunoliposomas. Por ejemplo, se puede encapsular una suspensión de viriones adenovíricos en micelas para formar inmunoliposomas por métodos convencionales (Patente U.S. Nº 5.043.164, Patente U.S. Nº 4.957.735, Patente U.S. Nº 4.925.661; Connor y Huang, (1985) J. Cell Biol. 101: 581; Lasic D.D. (1992) Nature 355: 279; Novel Drug Delivery (eds. Prescott y Nimmo, Wiley, New York, 1989); Reddy et al. (1992) J. Immunol. 25 148:1585). Para dirigir los viriones a esas células, se pueden usar inmunoliposomas que comprenden un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de de la célula cancerígena (p.ej., CALLA, CEA) presente en las células cancerígenas del individuo. (Fisher (2001) Gene Therapy 8:341-348).

Para incrementar adicionalmente la eficacia de los adenovirus de la invención, se pueden modificar para que muestren mayor tropismo para tipos de células tumorales particulares. Por ejemplo, como se muestra en el documento 30 PCT/US98/04964, se puede modificar una proteína en el revestimiento exterior de un adenovirus para que presente un agente químico, preferiblemente un polipéptido, que se une a un receptor presente en células tumorales en un grado mayor que en células tumorales. (Véase también las Patentes U.S. Nos 5.770.442 y 5.712.136). El polipéptido puede ser un anticuerpo, y es preferiblemente un anticuerpo monocatenario.

Terapia Adenovírica 35

Los adenovirus de la invención, o sus composiciones farmacéuticas, se pueden administrar para el tratamiento terapéutico de una enfermedad neoplásica o cáncer. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente ya afectado por la enfermedad neoplásica particular, en una cantidad suficiente para curar o al menos parcialmente detener la afección y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una “dosis terapéuticamente eficaz” o “dosis eficaz”. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la afección, del estado general del paciente, y de la vía de administración.

Por ejemplo, pero no a título de limitación, un paciente humano o un mamífero no humano que tiene una enfermedad neoplásica sólida o hematológica (p.ej. carcinoma pancreático, de colon, ovárico, pulmonar, o de mama, leucemia o mieloma múltiple) se puede tratar administrando una dosis terapéuticamente eficaz de un adenovirus apropiado de la invención, es decir, aquella que se ha demostrado que tiene un índice terapéutico mejorado para ese tipo de tejido. Por 45 ejemplo, un adenovirus quimérico preferido para el tratamiento de cáncer de colon sería el adenovirus ColoAd1 (SEC ID NO: 1). Las suspensiones de partículas adenovíricas infecciosas se pueden suministrar a tejido neoplásico por diversas vías, incluyendo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, y tópica. Se puede administrar una suspensión adenovírica que contiene alrededor de 103 a 1012 o más partículas viriónicas por ml mediante infusión (p.ej., en la cavidad peritoneal para tratar cáncer ovárico, en la vena porta para tratar hepatocarcinoma o metástasis hepáticas de otros 50 tumores primarios no hepáticos) u otra vía adecuada, incluyendo la inyección directa en una masa tumoral (p.ej., un tumor de mama), enema (p.ej., cáncer de colon), o catéter (p.ej., cáncer de vejiga). Otras vías de administración pueden ser adecuadas para carcinomas de otros orígenes, es decir, inhalación como una niebla (p.ej., para el suministro pulmonar para tratar carcinoma broncogénico, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma pulmonar no microcítico, adenocarcinoma pulmonar, o cáncer laríngeo). O aplicación directa a un sitio tumoral (p.ej., carcinoma broncogénico, carcinoma 55 nasofaríngeo, carcinoma laríngeo, carcinoma de cuello uterino).

La terapia adenovírica que usa los adenovirus de la actual invención se puede combinar con otros protocolos antineoplásicos, tales como quimioterapia o terapia de rayos X convencional, para tratar un cáncer particular. El tratamiento

puede ser concurrente o secuencial. Un agente quimioterapéutico preferido es cisplatino, y la dosis preferida se puede escoger por el médico basándose en la naturaleza del cáncer a tratar, y otros factores considerados de forma habitual al administrar cisplatino. Preferiblemente, el cisplatino se administrará intravenosamente a una dosis de 50-120 mg/m2 durante 3-6 horas. Más preferiblemente, se administra intravenosamente a una dosis de 80 mg/m2 durante 4 horas. Un segundo agente quimioterapéutico preferido es 5-fluorouracilo, que se administra a menudo en combinación con cisplatino. La dosis preferida de 5-fluorouracilo es 800-1200 mg/m2 por día durante 5 días consecutivos.

La terapia adenovírica que usa los adenovirus de la actual invención como vectores adenovíricos también se puede combinar con otros genes que se sabe que son útiles en la terapia a base de virus. Véase la Patente U.S. Nº 5.648.478. En tales casos, el adenovirus quimérico comprende además un gen heterólogo que codifica una proteína terapéutica, incorporado en el genoma vírico, de manera que el gen heterólogo es expresado en una célula infectada. Una proteína 10 terapéutica, como se usa aquí, se refiere a una proteína que sería de esperar que proporcione algún beneficio terapéutico cuando se expresa en una célula dada.

En una realización, el gen heterólogo es un gen activador de profármaco, tal como citosina desaminasa (CD) (véanse, las Patentes U.S. Nos 5.631.236; 5.358.866; y 5.677.178). En otras realizaciones, el gen heterólogo es un inductor conocido de la muerte celular, p.ej. apoptina o proteína de muerte adenovírica (ADP), o una proteína de fusión, p.ej. glucoproteína de membrana fusogénica (Danen-Van Oorschot et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. 94:5843-5847; Tollefson et a1.(1996) J. Virol. 70:2296-2306; Fu et al. (2003) Mol. Therapy 7:48-754, 2003; Ahmed et al. (2003) Gene Therapy 10:1663-1671; Galanis et al. (2001) Human Gene Therapy 12(7): 811-821).

Otros ejemplos de genes heterólogos, o sus fragmentos, incluyen aquellos que codifican proteínas inmunomoduladoras, tales como citocinas o quimiocinas. Los ejemplos incluyen interleucina 2, Patentes U.S. Nos 4.738.927 y 5.641.665; 20 interleucina 7, Patentes U. S. N. 4.965.195 y 5.328.988; e interleucina 12, Patente U.S. Nº 5.457.038; factor alfa de necrosis tumoral, Patente U.S. Nos 4.677.063 y 5.773.582; interferón gamma, Patentes U.S. Nos 4.727.138 y 4.762.791; o GM CSF, Patentes U.S. Nos 5.393.870 y 5.391.485, Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8:119-128). Proteínas inmunomoduladoras adicionales incluyen además proteínas inflamatorias de macrófagos, incluyen MIP-3. También se puede usar la proteína quimiotáctica de monolitos (MCP-3 alfa); una realización preferida de un gen heterólogo es un gen quimérico que consiste en un gen que codifica una proteína que atraviesa membranas celulares, por ejemplo VP22 o TAT, fusionada a un gen que codifica una proteína que es preferiblemente tóxica para el cáncer pero no para las células normales.

Los adenovirus quiméricos de la invención también se pueden usar como vectores para suministrar genes que codifican moléculas de ARN terapéuticamente útiles, es decir, ARNsi (Dorsett y Tuschl (2004) Nature Rev Drug Disc 3:318-329). 30

En algunos casos, se pueden incorporar genes en un adenovirus quimérico de la invención para potenciar adicionalmente la capacidad del virus oncolítico para erradicar el tumor, aunque no tenga ningún impacto directo sobre el propio tumor - estos incluyen genes que codifican proteínas que comprometen la presentación de MHC clase I (Hewitt et al. (2003) Immunology 110: 163-169), bloquean el complemento, inhiben los IFN y los mecanismos inducidos por IFN, quimiocinas y citocinas, la muerte a base de células NK (Orange et al., (2002) Nature Immunol. 3:1006-1012; Mireille et 35 al. (2002) Immunogenetics 54:527-542; Alcami (2003) Nature Rev. Immunol. 3:36-50; reducen la respuesta inmunitaria (p.ej., IL-10, TGF- Beta, Khong y Restifo (2002) Nature Immunol. 3:999-1005; 2002) y metaloproteasas que pueden romper la matriz extracelular y potenciar la extensión del virus en el tumor (Bosman y Stamenkovic (2003) J. Pathol. 2000:423-428; Visse y Nagase (2003) Circulation Res. 92:827-839).

Kits 40

La invención se refiere más a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Asociado con tal recipiente o recipientes puede estar un aviso en forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de fármacos o productos biológicos, que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta del producto para administración humana. 45

La presente invención se describe además mediante los siguientes ejemplos, que son ilustrativos de realizaciones específicas de la invención, y diversos usos de la misma. Estas ejemplificaciones, que ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no reflejan las limitaciones o circunscriben el alcance de la invención descrita.

Excepto que se indique de otro modo, la práctica de la presente invención emplea técnicas convencionales de cultivo celular, biología molecular, microbiología, manipulación de ADN recombinante, ciencia inmunológica, que están dentro 50 de la pericia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, p.ej., Cell Biology: a Laboratory Handbook: J. Celis (Ed). Academic Press. N.Y. (1996); Graham, F.L. y Prevec, L. Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines. En: Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed) Butterworth. P. 363-390; Grahan y Prevec Manipulation of adenovirus vectors. En: Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. p. 109-55 128, 1991; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), y Ausubel et al. (1995), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

EJEMPLOS

Métodos

Se usan técnicas estándar para métodos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis polinucleotídica, cultivo y transformación microbiana (p.ej., electroporación, lipofección). Generalmente, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se llevan a cabo 5 generalmente según métodos convencionales en la técnica y diversas referencias generales (véase generalmente Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que se proporcionan a lo largo de este documento. La nomenclatura usada aquí y los procedimientos de laboratorio en química analítica, química sintética orgánica, y formulación farmacéutica y suministro, y tratamiento de pacientes. Los métodos para la construcción de mutantes adenovíricos son generalmente conocidos en la técnica. 10 Véanse Mittal, S. K., Virus Res.,1993, vol: 28, páginas 67-90; y Hermiston, T. et al., Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods y Protocols, W.S.M. Wold, ed, Humana Press, 1999. Además, el genoma del adenovirus 5 está registrado como acceso #M73260 de Genbank 10, y el virus está disponible de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A., con el número de acceso VR-5.

Virus y Estirpes Celulares 15

Los serotipos de Ad3 (cepa GB), Ad4 (cepa RI-67), Ad5 (cepa Adenoid 75), Ad9 (cepa Hicks), Ad11p (sepa Slobitski), Ad16 (cepa Ch. 79) y todas la estirpes celulares, con excepción de las siguientes, se adquirieron de la ATCC: MDA231-mt1 (un derivado aislado por Dr. Deb Zajchowski a partir de un xenoinjerto implantado subcutáneamente que crece rápidamente de células MDA231) y Panc1-sct (obtenida por Dra. Sandra Biroc de un xenoinjerto implanta subcutáneamente que crece rápidamente de células Panc1), HUVEC (Vec Technologies, Rensselaer, NY), y SAEC (Clonetics, 20 Walkersville, MD). Ad40 fue un regalo generoso del Dr. William S.M. Wold at St. Louis University.

Ejemplo 1 - Purificación y Cuantificación Víricas

Los bloques vicios se propagaron en células 293 y se purificaron en gradientes de CsCl (Hawkins et al., 2001). El método usado para cuantificar las partículas víricas se basa en el de Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453-465, con la excepción de que se usó el intercambiador aniónico TMAE Fractogel en lugar de Resource Q. de forma breve, se 25 empaquetó una columna de 1,25 ml con Fractogel EMD TMAE-650 (S) (número de catalogo #116887-7 EM Science, Gibbstown, NJ 08027). La separación mediante HPLC se llevó a cabo en una HPLC Agilent HP 1100, usando las siguientes condiciones: Tampón A = 50 mM de HEPES, pH 7,5; Tampón B = 1,0 M de NaCl en Tampón A; caudal de 1 ml por minutos. Después del equilibrado de la columna durante no menos de 30 minutos en Tampón A, se cargaron aproximadamente 109-1011 partículas víricas de muestra en la columna en un volumen de 10-100 ul, seguido de 4 volúmenes de columna de Tampón A. Se aplicó un gradiente lineal que se extiende a lo largo de 16 volúmenes de columna y que termina en 100% de Tampón B.

El efluente de la columna se monitorizó a A260 y A280 nm, se calcularon las áreas de los picos, y se determinó la relación 260 a 280 nm. Los picos víricos se identificaron como aquellos picos que tienen una relación A260/A280 próxima a 1,33. Con cada serie de muestras, se incluyó un patrón del virus. El número de partículas víricas por ml del patrón se 35 determinó usando el método de Lehmberg et al. (1999) J. Chrom. B, 732:411-423}. En el intervalo de concentraciones víricas usado, el área del pico de A260 nm de cada muestra es directamente proporcional al número de partículas víricas en la muestra. El número de partículas víricas por ml en cada muestra de ensayo se calculó multiplicando el número conocido de partículas víricas por ml en el patrón por la relación del área del pico vírico de A260 nm de la muestra al área del pico vírico de A260 nm del patrón. 40

La columna se regeneró después de cada gradiente de muestra lavando con dos volúmenes de columna de NaOH 0,5 N, seguido de dos volúmenes de columna de 100% de Tampón A, 3 volúmenes de columna de 100% de Tampón B, y después 4 volúmenes de columna de 100% de Tampón A.

Ejemplo 2 - Bioselección

Los serotipos víricos que representan los subgrupos Ads B-F se reunieron y se hicieron pasar sobre cultivos subconfluentes de las estirpes celulares tumorales diana a una relación elevada de partículas por célula durante dos rondas para hacer que se produjese la recombinación entre los serotipos. El sobrenadante (1,0, 0,1, 0,01, 0,001 ml) procedente de la segunda ronda de los cultivos subconfluentes con infección elevada de partículas víricas por célula se usó entonces para infectar una serie de matraces de cultivos titulares T-75 superconfluentes de estirpes celulares tumorales diana PC-3, HT-29, Panc-1 y MDA-231. Para lograr la superconfluencia, cada estirpe celular se sembró en relaciones de división que permitieron que cada estirpe celular alcanzara la confluencia entre 24 y 40 horas después de la siembra, y se dejó que las células crecieran un total de 72 horas después de la siembra antes de la infección. Esto se hizo para maximizar la confluencia de las células para imitar las condiciones de crecimiento en tumores sólidos humanos.

El sobrenadante de cultivo celular se cosechó del primer matraz en la serie de dilución de 10 veces que no mostró ningún signo de CPE en el día 3 ó 4 después de la infección (en el caso de HT-29 y PC-3, esto se modificó para las 55 pasadas 10-20 para la cosecha del segundo matraz, es decir, cosecha 100 veces por debajo de la dilución en la que se detectó CPE en el día 3 después de la infección). Cada cosecha sirvió como el material de partida para la pasada sucesiva del virus. Este proceso se repitió hasta que el conjunto vírico logró 20 pasadas bioselectivas.

Los virus individuales procedentes de cada conjunto bioseleccionado se aislaron mediante dos sondas de purificación en placas en células A549 usando métodos estándar Tollefson, A., Hermiston, T.W., y Wold, W.S.M.; „Preparation and Titration of CsCI-banded Adenovirus Stock‟ en Adenovirus Methods and Protocols, Humana Press, 1999, p. 1-10, W.S.M. Wold, Ed). De forma breve, las diluciones del sobrenadante cosechado de la 20ª basada sobre cada estirpe 5 tumoral diana se usaron para infectar células A549 en un ensayo de placa estábndar. Las placas de pocillos individualizados se cosecharon, y se usó el mismo método de ensayo de placa para generar la segunda ronda de placas individuales procedentes de estas cosechas. Las placas de pocillos aislados procedentes de la segunda ronda de purificación en placas se consideraron puras, se prepararon cultivos infectados usando estas placas purificadas, y se determinó la potencia oncolítica de estos sobrenadantes de cultivos mediante el ensayo con MTS como se describe. 10

Ejemplo 3 - Caracterización del Serotipo

Los serotipos adenovíricos aventales que comprenden los conjuntos víricos o el adenovirus ColoAd1 aislado se identificaron usando cromatografía de intercambio aniónico, similar a lo descrito en Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453: 465, con la excepción de que se usó el medio intercambiador aniónico TMAE Fractogel (EM Industries, Gibbstown, NJ) en lugar de Resource Q, como se describe en el Ejemplo 1 (véase la Figura 1). 15

El tipo 5 de adenovirus eluyó a aproximadamente 60% de Tampón B durante el gradiente. Los otros serotipos (3, 4, 9, 11p, 16, 35, y 40) eluyeron cada uno a un tiempo de retención característico, consistente con los tiempos de retención en Q Sepharose XL publicados por Blanche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055-1062.

Ejemplo 4 - Ensayo Citolítico

La capacidad lítica vírica se midió usando una modificación del ensayo de MTT (Shen et al., 2001). De forma breve, se 20 usó el ensayo de MTS (Promega, Ensayo de Proliferación Celular no Radioactivo Acuoso CellTiter 96®) en lugar del ensayo de MTT, puesto que la conversión de MTS por las células en formazano acuoso soluble reduce tiempo y elimina el uso de un disolvente orgánico volátil asociado con el ensayo con MTT.

Para llevar a cabo el ensayo, se sembraron células a una densidad definida para cada estirpe celular tumoral que generaron una monocapa confluente en 24 h. Estas células sembradas densamente se dejaron crecer durante 2 días adicionales antes de la exposición al o a los virus de ensayo. Las infecciones de células tanto tumorales como normales primarias se llevaron a cabo por cuadruplicado con diluciones en serie de tres veces de los virus, partiendo de una relación de partículas por célula de 100 y terminando a una relación de partículas por célula de 0,005. Las células infectadas se incubaron a 37ºC, y el ensayo de MTS se llevó a cabo en los puntos de tiempo indicados para las células primarias individuales o las estirpes celulares tumorales. Las células infectadas falsamente sirvieron como controles negativos y 30 establecieron el punto de supervivencia del 100% para el ensayo dado.

Ejemplo 5 - Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN de los ADN genómicos de Ad11p (SEC ID NO: 2) y de ColoAdl (SEC ID NO: 1) se llevó a cabo según lo siguiente. De forma breve, se digirió ADN adenovírico purificado procedente de ColoAdl y Ad11p con la endonucleasa de restricción Sau3A1 y se clonó al azar en el vector pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA). Los clones 35 positivos se propagaron y se secuenciaron usando los cebadores M13R y KS (Stratagene, La Jolla, CA). La reacciones de secuencias individuales se recortaron, se evitaron y se ensamblaron usando Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan). Los saltos en la cobertura se amplificaron con cebadores oligonucleotídicos personalizados, y se secuenciaron. Los extremos de los genomas víricos se secuenciaron directamente del ADN adenovírico. En todos, cada genoma se secuenció a una cobertura 3X+ y 431 bases a una cobertura 2X. 40

Para determinar el origen de la región E2B de ColoAdl, se generaron dos conjuntos de cebadores, uno para el gen E2B pTP (9115 pb, 5‟GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3‟ (SEC ID NO: 4) y 9350 pb, 5‟ GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGT3‟ (SEC ID NO: 5)), y uno para el gen de ADN polimerasa (7520 pb, 5‟CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3‟ (SEC ID NO: 6) y 7982 pb, 5‟GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3‟ (SEC ID NO: 7)) y se usaron para aislar mediante PCR fragmentos de ADN procedentes de los diversos serotipos (Ad3, 4, 5, 9, 11p, 16 y 40) usando reactivos del kit de PCR 45 Advantage 2 (Clonetics, Walkersville, MD; Cat #K1910-Y), y se ensayaron en un termociclador PTC-200 de MJ Research (Watertown, MA). Estos fragmentos se secuenciaron subsiguientemente junto con la secuencia de ADN de Ad3 usando la secuenciación de terminador de colgante en un analizador genético ABI 3100.

La región E2B de Ad3 se secuenció utilizando ADN de Ad3 aislado y cebadores solapantes. La información de secuencias se analizó usando el programa Vector NTI (Informatix). 50

Ejemplo 6 - Construcción de Virus Recombinantes

Los ADN genómicos de Ad11p (SEC ID NO: 2) y ColoAdl (SEC ID NO: 1) se purificaron a partir de partículas víricas obtenidas mediante gradiente de CsCl. Los ADN genómicos se digirieron con Pac1, que corta a cada uno solo una vez en el genoma vírico. El corte de Pac1 se produce en la base 18141 en la secuencia nucleotídica de ColoAd1 (SEC ID NO: 1), y en la base 18140 en la secuencia nucleotídica de Ad11 (SEC ID NO: 2). Los ADN digeridos se mezclaron en 55

cantidades iguales y se ligaron en presencia de T4 ADN ligasa, a 16ºC toda la noche. Esta mezcla de ligación se transfectó en células A549 usando el kit de transfección de CaPO4 de Invitrogen, Carlsbad, CA (Cat #K2780-01). Las placas aisladas se recogieron y se identificaron mediante digestión con enzimas de restricción y análisis mediante PCR para distinguir las cuatro poblaciones víricas (Ad11p, ColoAdl, Ad11p de extremo izquierdo/ColoAd1 de extremo derecho (ColoAd1.1) y ColoAdl de extremo izquierdo/Ad11p de extremo derecho (ColoAdl.2)). 5

La capacidad lítica vírica de cada población se determinó en varias estirpes celulares, incluyendo las estirpes celulares HT29 y HUVEC, como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados demostraban el orden de potencia, desde el menos potente al más potente, como Ad11p, ColoAdl.2, ColoAdl.1, ColoAdl (véase la Figura 7 para los resultados en células HT29).

También se construyeron adenovirus quiméricos pCJ144 y pCJ146, que contienen el genoma de longitud completa de 10 ColoAdl, en el que se ha restaurado la región E3 y E4 de Ad11p de tipo salvaje, respectivamente. Estas modificaciones se introdujeron mediante recombinación homóloga en BJ5183 E. coli (Chartier et al. (1996) J. Virol. 70:4805-4810). Estos dos adenovirus quiméricos demostraron una capacidad lítica reducida en células HT29 y HUVEC, en comparación con ColoAdl o ColoAdl.2.

Ejemplo 7 - Eficacia in vivo de Adenovirus 15

En un experimento con ratones atímicos de xenoinjerto de tumor humano típico, se inyectaron a los animales con 5 x 106 células subcutáneamente en el flanco posterior del ratón. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 100-200 ul, se inyectan con vehículo (PBS) o con virus a 2 x 1010 partículas durante cinco días consecutivos (1 x 1011 partículas en total). Una reducción en el tamaño del tumor se observaría con relación al control de PBS y virus de control adicionales (Ad5, ONYX-015). 20

Ejemplo 8 - Selectividad de ColoAd1 sobre Explantes de Tejidos Humanos Primarios

Muestras de tejido procedentes de tumores colorrectales y tejidos normales adyacentes retirados durante cirugía se colocaron en medio de cultivo y se infectaron con números iguales de virus ColoAdl o Ad5. Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron a las 24 horas después de la infección, y se determinó el número de partículas víricas producidas. ColoAdl produjo más partículas víricas por partícula de entrada que Ad5 en el tejido tumoral, mientras que produjo menos partículas por partícula de entrada que Ad5 en el tejido normal.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Harden, Paul Hermiston, Terry Kuhn, Irene

30

<120> ADENOVIRUS QUIMÉRICOS PARA USO EN EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER

<130> 53183AWOM1

<150> US 60/574.851 35

<151> 2004-05-26

<160> 8

<170> Patentln version 3.2 40

<210> 1

<211> 32325

<212> ADN

<213> Adenovirus 45

<400> 1

<210> 2

<211> 34794

<212> ADN

<213> Adenovirus 5

<400> 2

<210> 3

<211> 5287

<212> ADN

<213> Adenovirus 5

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial 5

<220>

<223> cebador

<400> 4 10

gggagtttcg cgcggacacg g 21

<210> 5

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

5

<220>

<223> cebador

<400> 5

gcgccgccgc cgcggagagg t 21 10

<210> 6

<211> 24

<212> ADN

<213> secuencia artificial

15

<220>

<223> cebador

<400> 6

cgagagccca ttcgtgcagg tgag 24 20

<210> 7

<211> 24

<212> ADN

<213> secuencia artificial

25

<220>

<223> cebador

<400> 7

gctgcgacta ctgcggccgt ctgt 24 30

<210> 8

<211> 4195

<212> ADN

<213> Adenovirus

35

<400> 8

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B,

   en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico;

   en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, 5 C, D, E, o F y son distintos entre sí; y

   en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral.
2. 2. El adenovirus de la reivindicación 1, que comprende además regiones que codifican proteínas fibra, hexón, y pentón, en el que el ácido nucleico que codifica las proteínas fibra, hexón, y pentón de dicho adenovirus proceden del mismo serotipo adenovírico. 10
3. 3. El adenovirus de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además una región E3 modificada, o que comprende además una región E4 modificada.
4. 4. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula tumoral es una célula tumoral de colon, de mama, de páncreas, de pulmón, de próstata, ovárica, o hematopoyética.
5. 5. El adenovirus de la reivindicación 4, en el que dicha célula tumoral es una célula tumoral de colon. 15
6. 6. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia nucleotídica de región E2B de dicho adenovirus comprende SEC ID NO: 3.
7. 7. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia nucleotídica de dicho adenovirus comprende SEC ID NO: 1.
8. 8. Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B 20

   en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una segunda secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico, y

   en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí;

   en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico aumentado para una célula tumoral, y

   en el que dicho adenovirus quimérico se ha hecho deficiente para la replicación a través de la supresión de una o más regiones adenovíricas que codifican proteínas implicadas en la replicación adenovírica seleccionadas del grupo que consiste en E1, E2, E3 o E4.
9. 9. El adenovirus de replicación deficiente de la reivindicación 8, en el que se han suprimido las regiones E1 y E3. 30
10. 10. El adenovirus de replicación deficiente de la reivindicación 9, que comprende además una supresión de la región E4.
11. 11. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un gen heterólogo, en el que dicho gen heterólogo es expresado en una célula infectada con dicho adenovirus.
12. 12. El adenovirus de la reivindicación 11, en el que dicho gen heterólogo es timidina cinasa.
13. 13. El adenovirus de la reivindicación 11, en el que dicho gen heterólogo codifica una proteína terapéutica seleccionada 35 del grupo que consiste en citocinas y quimiocinas, anticuerpo, enzimas conversoras de profármacos, y proteínas inmunorreguladoras.
14. 14. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso en terapia.
15. 15. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso en el tratamiento de enfermedad neoplásica o cáncer, o para inhibir el crecimiento de una célula cancerígena. 40
16. 16. Un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerígena, que comprende infectar a dicha célula cancerígena in vitro con el adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
17. 17. El adenovirus de la reivindicación 15 o el método de la reivindicación 16, en el que dicha célula cancerígena es una célula cancerígena de colon.
18. 18. El adenovirus o el método de la reivindicación 17, en el que la secuencia nucleotídica de dicho adenovirus comprende SEC ID NO: 1.
19. 19. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso para suministrar una proteína terapéutica a una célula.
20. 20. Un método para aislar el adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho método comprende 5

    a) reunir los serotipos adenovíricos que representan los subgrupos adenovíricos B-F, creando de ese modo una mezcla adenovírica;

    b) hacer pasar la mezcla adenovírica reunida procedente de la etapa (a) sobre un cultivo activamente creciente de células tumorales a una relación de partículas por célula suficientemente elevada para alentar la recombinación entre los serotipos, pero no tan alta como para producir la muerte celular prematura; 10

    c) cosechar el sobrenadante de la etapa (b);

    d) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en la etapa (c);

    e) cosechar el sobrenadante del cultivo celular de la etapa (d) antes de cualquier signo de CPE;

    f) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en la etapa (e); y

    g) aislar el virus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 del sobrenadante cosechado en la etapa (f) mediante purificación en placas.
21. 21. El método de la reivindicación 20, en el que la etapa (b) se lleva a cabo dos veces antes de cosechar el sobrenadante en la etapa (c).
22. 22. El método de la reivindicación 20, en el que las etapas (e) y (f) se repiten hasta 20 veces antes de la etapa (g).
23. 23. El método de la reivindicación 20, en el que se lleva a cabo una segunda ronda de purificación en placas tras la 20 etapa (g).
24. 24. El método de la reivindicación 20, en el que la célula tumoral es una célula tumoral de colon, de mama, de páncreas, de pulmón, de próstata, ovárica, o hematopoyética.
25. 25. Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B,

    en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y 25 una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico;

    en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí; y

    en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral;

    producido por un método de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24. 30