ES2358330T5

ES2358330T5 - Formulaciones farmacéuticas líquidas de FSH y LH junto con un tensioactivo no iónico

Info

Publication number: ES2358330T5
Application number: ES04725385.1T
Authority: ES
Inventors: Fabrizio Samaritani; Piergiorgio Donati
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2004-04-02
Publication date: 2018-12-03
Anticipated expiration: 2024-04-02
Also published as: UA91960C2; CN1795012A; ES2358330T3; CN100488566C; ZA200507287B

Description

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DESCRIPCIÓN

Formulaciones farmacéuticas líquidas de FSH y LH junto con un tensioactivo no iónico

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de las formulaciones farmacéuticas de la hormona estimulante del folículo (abreviada generalmente como FSH por sus iniciales en inglés: follicle-stimulating hormone), formulaciones de la hormona luteinizante, (abreviada generalmente como LH por sus iniciales en inglés: luteinising hormone) y mezclas de FSH y hormona luteinizante (LH), así como a métodos para producir dichas formulaciones.

Antecedentes de la invención

La hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG) son proteínas inyectables que entran dentro de la clase de las gonadotropinas. La FSH, LH y hCG se usan solas y en combinación en el tratamiento de la infertilidad y los trastornos reproductivos en pacientes tanto hembras como machos.

En la naturaleza, la FSH y la LH son producidas por la glándula pituitaria. Para uso farmacéutico, la FSH y la LH y sus variantes se pueden producir por recombinación (rFSH y rLH) o se pueden producir a partir de la orina de mujeres post-menopáusicas (uFSH y uLH).

La FSH se usa en pacientes hembras para inducir la ovulación (OI) y en hiperestimulación ovárica controlada (COH) para técnicas de reproducción asistida (ART). En un régimen de tratamiento típico para la inducción de la ovulación, al paciente se le administran inyecciones diarias de FHS o de un variante (aproximadamente 75 a 300 UI de FSH/día) durante un periodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 días. En un régimen de tratamiento típico para la hiperestimulación ovárica controlada, al paciente se le administran inyecciones diarias de FHS o de un variante (aproximadamente 150-600 UI de FSH/día) durante un periodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 días.

La FSH también se usa para inducir la espermatogénesis en hombres que padecen oligospermia. Se ha usado con éxito un régimen que usa 150 UI de FSH 3 veces a la semana en combinación con 2.500 UI de hCG dos veces a la semana para obtener una mejora en el recuento del esperma en hombres que padecen hipogonadismo hipogonadotrópico1.

La LH se usa en pacientes hembras en combinación con la FSH en OI y en COH, particularmente en aquellas pacientes que tienen niveles muy bajos de LH endógena o resistencia a la LH, tales como mujeres que padecen hipogonadismo hipogonadotrópico (HH, Grupo I de la OMS) o pacientes mayores (es decir, de 35 años de edad o mayores) y en pacientes en las que la implantación embrionaria o el aborto temprano plantean problemas. La LH en combinación con la FSH ha estado disponible tradicionalmente en una preparación denominada gonadotropinas menopáusicas humanas (hMG) extraídas de la orina de mujeres post-menopáusicas. LA hMG tiene una relación de actividad FSH:LH de 1:1.

La CG actúa en el mismo receptor que la LH y produce las mismas respuestas. La CG tiene una semivida en la circulación mayor que la LH y por lo tanto se usa generalmente como una fuente de actividad LH de acción prolongada. La CG se usa en regímenes de OI y COH para imitar el pico natural de la LH y activar la ovulación. Una inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG) se usa para activar la ovulación al final de la estimulación con FSH o con una mezcla de FSH y LH. La CG también se puede usar junto con la FSH durante la estimulación para la OI y la COH con el fin de proporcionar actividad LH durante la estimulación en pacientes en los que se desea tener actividad LH, tales como los que se han mencionado anteriormente.

La FSH, la LH y la CG son miembros de la familia de las hormonas de glicoproteína, heterodímeros, que también incluye la hormona estimuladora del tiroides (abreviada generalmente como TSH por sus iniciales en inglés: thyroid stimulating hormone). Los miembros de esta familia son heterodímeros que comprenden una subunidad  y una . Las subunidades se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes. El heterodímero de la FSH humana (hFSH) consiste en: (i) una subunidad alfa de glicoproteína madura de 92 aminoácidos que también es común en los otros miembros de la familia humana (es decir, la gonadotropina coriónica (CG), la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del tiroides (TSH)); y (ii) una subunidad beta madura de 111 aminoácidos que es característica de la FSH2. El heterodímero de LH humana consiste en (i) la subunidad alfa de glicoproteína madura de 92 aminoácidos; y (ii) una subunidad beta madura de 112 aminoácidos que es característica de la LH3. Las subunidades alfa y beta de las glicoproteínas pueden tener tendencia a disociarse en las formulaciones debido a la interacción con un conservante, un tensioactivo y otros excipientes. La disociación de las subunidades lleva a la pérdida de potencia biológica4.

La FSH se formula para inyección intramuscular (IM) o subcutánea (SC). La FSH se suministra en forma liofilizada (sólida) en frascos o ampollas de 75 UI/frasco y 150 UI/frasco con una durabilidad de un año y medio a dos años si se almacena a 2-25ºC. La disolución para la inyección se forma reconstituyendo el producto liofilizado con agua para inyección (API). Para la inducción de la ovulación o la hiperestimulación ovárica controlada, se recomiendan

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Humectación Draves, segundos a 25ºC: Concentración al 1,0%: > 360 Concentración al 0,1%: > 360

Altura de espuma:

5 Ross Miles, 0,1%, mm a 50ºC: 80 Ross Miles, 0,1%, mm a 26ºC: 37 Dinámica, 0,1%, mm a 400 ml/min: > 600

Punto de turbidez en disolución acuosa, ºC: Concentración al 1%: > 100 10 Concentración al 10%: > 100 HLB (equilibrio hidrófilo-lipófilo): 24

Las propiedades típicas del Pluronic® F88 se indican a continuación: Peso molecular medio: 11.400; Punto de fusión/punto de fluidez crítica: 54ºC;

15 Forma física a 20ºC: sólido; Viscosidad (Brookfield) cps: 2.300 [líquido a 25ºC, pasta a 60ºC y sólido a 77ºC]; Tensión superficial, dinas/cm a 25ºC:

Concentración al 0,1%: 48,5 Concentración al 0,01%: 52,6 20 Concentración al 0,001%: 55,7

Tensión interfacial, dinas/cm a 25ºC frente al Nujol: Concentración al 0,1%: 20,5 Concentración al 0,01%: 23,3 Concentración al 0,001%: 27,0

25 Humectación Draves, segundos a 25ºC: Concentración al 1,0%: > 360 Concentración al 0,1%: > 360

Altura de espuma: Ross Miles, 0,1%, mm a 50ºC: 80 30 Ross Miles, 0,1%, mm a 26ºC: 37 Dinámica, 0,1%, mm a 400 ml/min: > 600

Punto de turbidez en disolución acuosa, ºC: Concentración al 1%: > 100 Concentración al 10%: > 100

35 HLB (equilibrio hidrófilo-lipófilo): 28

Las propiedades típicas del Pluronic® F68 se indican a continuación: Peso molecular medio: 8.400; Punto de fusión/punto de fluidez crítica: 52ºC; Forma física a 20ºC: sólido;

5 Viscosidad (Brookfield) cps: 1000 [líquido a 25ºC, pasta a 60ºC y sólido a 77ºC];

Tensión superficial, dinas/cm a 25ºC: Concentración al 0,1%: 50,3 Concentración al 0,01%: 51,2 Concentración al 0,001%: 53,6

10 Tensión interfacial, dinas/cm a 25ºC frente al Nujol: Concentración al 0,1%: 19,8 Concentración al 0,01%: 24,0 Concentración al 0,001%: 26,0

Humectación Draves, segundos a 25ºC: 15 Concentración al 1,0%: > 360 Concentración al 0,1%: > 360

Altura de espuma: Ross Miles, 0,1%, mm a 50ºC: 35 Ross Miles, 0,1%, mm a 26ºC: 40

20 Dinámica, 0,1%, mm a 400 ml/min: > 600 Punto de turbidez en disolución acuosa, ºC: Concentración al 1%: > 100 Concentración al 10%: > 100

HLB (equilibrio hidrófilo-lipófilo): 29 25 El tensioactivo preferido es el Pluronic® F68. El Pluronic® F68 está presente preferiblemente en la formulación a una concentración que es suficiente para mantener la estabilidad de la FSH y/o de la LH a lo largo del periodo de almacenamiento deseado (por ejemplo, de 6 a 12 a 24 meses) y también a una concentración que es suficiente para evitar las pérdidas de proteína debidas a adsorción sobre las superficies, tales como las del frasco, ampolla o cartucho o de la jeringa. 30 Preferiblemente, la concentración de Pluronic® F68, en formulaciones líquidas, es de justo o aproximadamente 0,01 mg/ml hasta justo o aproximadamente 1 mg/ml, más preferiblemente de justo o aproximadamente 0,05 mg/ml hasta

justo o aproximadamente 0,5 mg/ml, más particularmente preferido de justo o aproximadamente 0,2 mg/ml hasta justo o aproximadamente 0,4 mg/ml, lo más preferiblemente de o aproximadamente de 0,1 mg/ml. La hormona estimulante del folículo (FSH) en formulación liofilizada está presente preferiblemente a una

35 concentración (peso/peso) de justo o aproximadamente 0,1 a 10 g/mg de la formulación total. En un modo de realización, la hormona estimulante del folículo (FSH) está presente a una concentración de justo o aproximadamente 0,3 a 5 g/mg de la formulación total. En un modo de realización adicional, la hormona estimulante del folículo (FSH) está presente a una concentración de justo o aproximadamente 0,37 a 2 g/mg de la formulación total.

40 La hormona luteinizante (LH) en formulación liofilizada está presente preferiblemente a una concentración de justo o aproximadamente 0,1 a 3 g/mg de la formulación total. En un modo de realización, la hormona luteinizante (LH) está presente a una concentración de justo o aproximadamente 0,1 a 1 g/mg de la formulación total. En un modo de realización adicional, la hormona luteinizante (LH) está presente a una concentración de justo o

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aproximadamente 0,1 a 0,6 g/mg de la formulación total.

En las formulaciones líquidas –incluyendo las formulaciones reconstituidas-que comprenden FSH, preferiblemente la concentración de FSH en la formulación es de justo o aproximadamente 150 UI/ml hasta justo o aproximadamente

2.000 UI/ml, más preferiblemente de justo o aproximadamente 300 UI/ml hasta justo o aproximadamente 1.500 UI/ml, más particularmente preferible de justo o aproximadamente 450 hasta justo o aproximadamente 750, lo más preferiblemente de justo o aproximadamente 600 UI/ml.

En las formulaciones líquidas –incluyendo las formulaciones reconstituidas-que comprenden LH, preferiblemente la concentración de LH en la formulación es de justo o aproximadamente 50 UI/ml hasta justo o aproximadamente

2.000 UI/ml, más preferiblemente de justo o aproximadamente 150 UI/ml hasta justo o aproximadamente 1.500 UI/ml, más particularmente preferible de justo o aproximadamente 300 hasta justo o aproximadamente 750 UI/ml, particularmente preferible de justo o aproximadamente 625 UI/ml.

En las formulaciones que comprenden tanto FSH como LH, la relación entre la FSH y la LH (FSH:LH, UI:UI, FSH medida mediante el ensayo de ganancia de peso ovárico en ratas y LH medida mediante el ensayo de ganancia de peso de la vesícula seminal en ratas) está preferiblemente en el intervalo de justo o aproximadamente 6:1 hasta justo o aproximadamente 1:6, más preferiblemente de justo o aproximadamente 4:1 hasta justo o aproximadamente 1:2, más particularmente preferido de justo o aproximadamente 3:1 hasta justo o aproximadamente 1:1. Las relaciones particularmente preferidas son 1:1 y 2:1.

En las formulaciones liofilizadas, el tensioactivo Pluronic® F68 está preferiblemente presente a una concentración de justo o aproximadamente 0,001 hasta justo o aproximadamente 0,1 mg por mg de la formulación total, más preferiblemente de justo o aproximadamente 0,01 hasta justo o aproximadamente 0,075 mg/mg.

Preferiblemente, la concentración de Pluronic® F68 en las formulaciones reconstituidas es de justo o aproximadamente 0,01 mg/ml hasta justo o aproximadamente 1 mg/ml, más preferiblemente de justo o aproximadamente 0,05 mg/ml hasta justo o aproximadamente 0,5 mg/ml, más particularmente preferido de justo o aproximadamente 0,2 mg/ml hasta justo o aproximadamente 0,4 mg/ml, lo más preferiblemente de justo o aproximadamente 0,1 mg/ml.

Preferiblemente, la FSH y la LH se producen por recombinación, de forma particularmente preferida se producen en células de ovario de hámster chino transfectadas con un vector o vectores que comprenden ADN que codifica para la subunidad alfa y la subunidad beta de glicoproteína humana de la FSH o la LH. El ADN que codifica para las subunidades alfa y beta puede estar presente en el mismo o en diferentes vectores.

La FSH y la LH recombinantes presentan varias ventajas frente a sus homólogas urinarias. Las técnicas de cultivo y aislamiento que usan células recombinantes permiten obtener lotes consistentes. Por el contrario, la FSH y la LH de origen urinario varían de forma importante de un lote a otro en características tales como pureza, patrón de glicosilación y sialilación y oxidación de las subunidades. Debido a la mayor consistencia entre lotes y pureza de la FSH y LH recombinantes, las hormonas pueden ser identificadas y cuantificadas fácilmente usando técnicas tales como focalización isoeléctrica (IEF, por sus iniciales en inglés). La facilidad con la que se pueden identificar y cuantificar la FSH y LH recombinantes permite llenar los frascos por masa de la hormona (dosificación en masa) en lugar de llenarlos por bioensayo.

Preferiblemente, las formulaciones de FSH de la presente invención tienen un pH de justo o aproximadamente 6,0 hasta justo o aproximadamente 8,0, más preferiblemente de justo o aproximadamente 6,8 hasta justo o aproximadamente 7,8, incluyendo un pH de aproximadamente 7,0, 7,2 y 7,4. Un tampón preferido es el de fosfato, siendo los contraiones preferidos los iones de sodio o potasio. Los tampones de fosfato con disolución salina son bien conocidos en la técnica, tal como la disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Las concentraciones de tampón en la disolución total pueden variar de justo o aproximadamente 5mM, 9,5mM, 10mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM y 500mM. Preferiblemente, la concentración de la disolución tampón es de justo o aproximadamente 10mM. Se prefiere particularmente una disolución tampón 10mM en iones fosfato con un pH de 7,0.

Preferiblemente, las formulaciones o mezclas de FSH y LH de la presente invención tienen un pH de justo o aproximadamente 6,0 hasta justo o aproximadamente 9,0, más preferiblemente de justo o aproximadamente 6,8 hasta justo o aproximadamente 8,5, incluyendo un pH de aproximadamente 7,0, 8,0 y 8,2, lo más preferiblemente un pH de justo o aproximadamente 8,0.

La invención se refiere a formulaciones líquidas así como a formulaciones secadas por congelación (liofilizadas) que pueden ser reconstituidas, en las que el disolvente (también para la reconstitución) es agua para inyección. Las formulaciones líquidas pueden ser para una dosis única o para múltiples dosis. Las formulaciones líquidas así como las secadas por congelación de FSH y/o de LH de la invención que se pretende que sean para su uso en múltiples dosis comprenden un agente bacteriostático elegido entre fenol y m-cresol. El más preferido es el m-cresol. El agente bacteriostático se usa en una cantidad que dé una concentración que sea eficaz para mantener la formulación esencialmente libre de bacterias (adecuada para inyección) durante el periodo de inyección de las múltiples dosis, que puede ser de justo o aproximadamente 12 ó 24 horas hasta justo o aproximadamente 12 ó 14

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días, preferiblemente de justo o aproximadamente 6 hasta justo o aproximadamente 12 días. El agente bacteriostático está presente preferiblemente en una concentración de justo o aproximadamente 0,1% (masa del agente bacteriostático/masa del disolvente) hasta justo o aproximadamente 2,0%, más preferiblemente de justo o aproximadamente 0,2% hasta justo o aproximadamente 1,0%. En el caso del fenol, se prefiere particularmente de justo o aproximadamente 0,5%. En el caso del m-cresol, la concentración particularmente preferida es de justo o aproximadamente 0,3% (por ejemplo, de justo o aproximadamente 3 mg/ml de API).

En un modo de realización preferido, la invención proporciona una composición farmacéutica líquida, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende FSH o una de sus variantes, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol.

En un modo de realización preferido adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica líquida, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende LH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol.

En todavía un modo de realización preferido adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica líquida, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende FSH y LH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol.

Preferiblemente, la FSH y la LH están presentes en una relación (FSH:LH) de justo o aproximadamente 2:1 hasta justo o aproximadamente 1:1.

En un modo de realización preferido adicional, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica líquida, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende elaborar una disolución acuosa de FSH o una de sus variantes, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol, y API.

En un modo de realización preferido adicional, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica líquida, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende elaborar una disolución acuosa de LH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol, y API.

En un modo de realización preferido adicional, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica líquida, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende elaborar una disolución acuosa de FSH y LH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol, y API.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica envasada que comprende administrar una disolución que comprende FSH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica envasada que comprende administrar una disolución que comprende FSH y LH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente mcresol.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un artículo elaborado para uso farmacéutico en humanos que comprende un frasco que comprende una disolución de FSH o una de sus variantes de la FSH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol, y material escrito que indica que dicha disolución puede guardarse durante un periodo de justo o aproximadamente veinticuatro horas o más después del primer uso. Preferiblemente, el material escrito indica que la disolución puede guardarse

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un artículo elaborado para uso farmacéutico en humanos que comprende un frasco que comprende una disolución de FSH y LH, el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol, e información escrita que indica que dicha disolución puede guardarse durante un periodo de justo o aproximadamente veinticuatro horas o más después del primer uso. Preferiblemente, el material escrito indica que la disolución puede guardarse hasta justo o aproximadamente 12 ó 14 días después del primer uso.

En un modo de realización particularmente preferido, la formulación comprende m-cresol y Pluronic® F68. Los inventores han encontrado sorprendentemente que las formulaciones que comprenden Pluronic® F68 no precipitan en presencia de m-cresol, un problema observado con otros tensioactivos.

Antes de su primer uso, es decir antes de que el precinto del frasco, ampolla o cartucho haya sido roto, las formulaciones de la invención pueden guardarse durante al menos justo o aproximadamente 6 meses, 12 meses o 24 meses. En las condiciones de almacenamiento preferidas, antes de su primer uso, las formulaciones se mantienen protegidas de la luz brillante (preferiblemente en la oscuridad) y a temperaturas de justo o

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aproximadamente 2-8ºC, más preferiblemente de justo o aproximadamente 4-5ºC.

En un modo de realización específico, la invención proporciona una formulación liofilizada para reconstitución, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende FSH o una de sus variantes y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa.

En un modo de realización específico adicional, la invención proporciona una formulación liofilizada para reconstitución, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende LH y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa.

En un modo de realización específico adicional, la invención proporciona una formulación liofilizada, preferiblemente para uso en múltiples dosis, que comprende FSH y LH y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa.

En un modo de realización específico adicional, la invención proporciona un método para elaborar una formulación liofilizada, preferiblemente para uso en múltiples dosis después de su reconstitución, que comprende formar una mezcla de FSH o de una de sus variantes con el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y someter dicha mezcla a liofilización.

En un modo de realización específico adicional, la invención proporciona un método para elaborar una formulación liofilizada, preferiblemente para uso en múltiples dosis después de su reconstitución, que comprende formar una mezcla de LH con el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa y someter dicha mezcla a liofilización.

En un modo de realización específico adicional, la invención proporciona un método para elaborar una formulación liofilizada, preferiblemente para uso en múltiples dosis después de su reconstitución, que comprende formar una mezcla de FSH y LH, así como el tensioactivo Pluronic® F68 y someter dicha mezcla a liofilización.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica envasada que comprende administrar una mezcla liofilizada que comprende FSH y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica envasada que comprende administrar una mezcla liofilizada que comprende LH y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa en un frasco.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica envasada que comprende administrar una mezcla liofilizada que comprende FSH así como LH y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa en un frasco.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un artículo elaborado para uso farmacéutico en humanos que comprende un primer frasco o frasco que contiene FSH o una de sus variantes de la FSH liofilizados y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa. Un segundo frasco o frasco contiene un diluyente para reconstitución, preferiblemente agua y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un artículo elaborado para uso farmacéutico en humanos que comprende un primer frasco o frasco que contiene LH o una de sus variantes de la LH liofilizados y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa. Un segundo frasco o frasco contiene un diluyente para reconstitución, preferiblemente agua y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente mcresol.

En todavía otro modo de realización preferido, la invención proporciona un artículo elaborado para uso farmacéutico en humanos que comprende un primer frasco o frasco que contiene FSH o una de sus variantes de la FSH así como LH o una de sus variantes de la LH liofilizados y el tensioactivo Pluronic® F68, metionina y sacarosa. Un segundo frasco o frasco contiene un diluyente para reconstitución, preferiblemente agua y un agente bacteriostático elegido entre m-cresol y fenol, preferiblemente m-cresol.

En un modo de realización particularmente preferido, el disolvente para reconstitución comprende m-cresol. Los inventores han encontrado que las formulaciones liofilizadas que comprenden Pluronic® F68, metionina y sacarosa no precipitan cuando se reconstituyen con un diluyente que contiene m-cresol, un problema observado con otros tensioactivos, por ejemplo Tween.

Las formulaciones liofilizadas de la invención se pueden mantener al menos durante justo o aproximadamente 6 meses, 12 meses o 24 meses. En las condiciones de almacenamiento preferidas, antes de su primer uso, las formulaciones se mantienen protegidas de la luz brillante (preferiblemente en la oscuridad) y a temperaturas de justo

o aproximadamente 2-8ºC, más preferiblemente de justo o aproximadamente 4-5ºC.

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sus variantes de la FSH, la LH, o una mezcla de FSH y LH (“proteína”) y el Pluronic® F68 y un agente bacteriostático elegido entre el fenol y el m-cresol en un diluyente acuoso. La mezcla de los componentes y su disolución en un diluyente acuoso se realiza usando procedimientos convencionales de disolución y mezcla. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad medida de FSH o de un variante de la FSH, LH o una mezcla de FSH y LH en una disolución tamponada se combina con Pluronic® F68, metionina y sacarosa y un agente bacteriostático elegido entre fenol y m-cresol en una disolución tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la proteína, el Pluronic® F68 y el agente bacteriostático en las concentraciones deseadas. La disolución resultante se suministra entonces en frascos, ampollas o cartuchos. Las variaciones de este procedimiento serán reconocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el orden en el que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulación, son todos factores que pueden ser optimizados para la concentración y los medios de administración usados.

En un modo de realización preferido, las formulaciones líquidas de la invención se elaboran preparando disoluciones madre individuales de concentración conocida de todos los componentes de la formulación (por ejemplo, disolución tampón de fosfato de sodio, sacarosa, metionina, FSH y/o LH), y tomando cantidades volumétricas alícuotas para formar una “disolución madre” de la misma composición que la formulación final. La “disolución madre” se filtra preferiblemente a través de una membrana Duropore® (Millipore) 0,22 micrones PDF para eliminar los microorganismos y a continuación las alícuotas se administran en frascos individuales, tal como frascos, ampollas o cartuchos.

Las formulaciones liofilizadas de la presente invención se pueden preparar mediante un procedimiento que comprende mezclar la FSH o una de sus variantes de la FSH, la LH o una de sus variantes de la LH, o una mezcla de FSH y LH, y Pluronic® F68, metionina y sacarosa, así como otros excipientes de tipo tampón y someter la mezcla a liofilización. La mezcla de los componentes y su liofilización se realizan usando procedimientos convencionales. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de FSH o una de sus variantes de la FSH, LH o una de sus variantes de la LH o una mezcla de FSH y LH, con Pluronic® F68, metionina y sacarosa y la mezcla resultante se liofiliza y a continuación se suministra en frascos, ampollas o cartuchos. Las variaciones de este procedimiento serán reconocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el orden en el que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulación, son todos factores que pueden ser optimizados para la concentración y los medios de administración usados.

Las formulaciones de la invención se pueden administrar usando dispositivos reconocidos. Los ejemplos que comprenden estos sistemas de frasco único incluyen dispositivos de lápiz-inyector para administrar una disolución tal como EasyJect®, Gonal-F® Pen, Humaject®, NovoPen®, B-D® Pen, AutoPen® y Optipen®.

Los productos reivindicados en la presente memoria incluyen material envasado. El material envasado proporciona, además de la información requerida por las agencias reguladoras, las condiciones en las que se debe usar el producto. El material envasado de la presente invención proporciona instrucciones a los pacientes para reconstituir la FSH o una de sus variantes de la FSH en el diluyente acuoso para formar una disolución y para usar la disolución durante un periodo de veinticuatro horas o más para el producto en dos frascos de producto húmedo/seco. Para el producto en disolución en un solo frasco, la etiqueta indica que dicha disolución puede ser almacenada después de su primer uso por un periodo de veinticuatro horas o más, preferiblemente hasta 12 ó 14 días. Los productos reivindicados en la presente memoria son útiles para su uso como producto farmacéutico en humanos.

Las formulaciones estables conservadas pueden ser administradas a los pacientes como disoluciones límpidas. La disolución puede ser para un solo uso o puede ser reutilizada varias veces y puede ser suficiente para un solo ciclo

o varios ciclos del tratamiento del paciente y, por lo tanto, proporciona un régimen de tratamiento más conveniente que el que está disponible actualmente.

La FSH o una de sus variantes de la FSH, la LH o las mezclas de FSH y LH en las formulaciones o disoluciones, tanto estables como conservadas, descritas en la presente memoria, pueden ser administradas a un paciente según la presente invención mediante varios métodos de administración, incluyendo inyección SC o IM; administración transdérmica, pulmonar, transmucosal, implantes, por bomba osmótica, cartucho, microbomba, oral y otros medios apreciados por los expertos en la técnica, como es bien conocido en la técnica.

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar adicionalmente la preparación de las formulaciones y composiciones de la invención. El alcance de la invención no debe ser considerado como consistente únicamente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Formulaciones comparativas Materiales

Item: Fabricante

r-hFSH masiva usada como candidato para las formulaciones: Laboratorios Serono SA

D-Manitol (DAB, Ph Eur, BP, FU, USP, FCC, E421): Merck

Sacarosa (DAB, Ph Eur, BP, NF): Merck

NaCl (ACS, ISO): Merck

Na2HPO4·2H2O (GR para análisis): Merck

NaH2PO4·H2O (GR para análisis): Merck

Alcohol bencílico (GR para análisis): Merck

m-Cresol (para síntesis): Merck

TWEEN 20 (polisorbato 20) (para síntesis): Merck

Pluronic® F68 (Poloxámero 188): Sigma

l-Metionina (para bioquímica): Merck

Ácido ortofosfórico al 85% (Ph Eur, BP, NF): Merck

Cartucho de vidrio de 1,5 ml: SFAM (con silicona Aguettant)

Cauchos de tipo A: West Company

Cierre alabeado: Aguettant

Millex-GV Unidad de filtro con jeringa – Durapore: Millipore

Filtros de membrana Durapore de 0,22 m GV: Millipore

Jeringa de plástico de 20 ml Plastipak: Becton Dickinson

Soporte de acero para filtración: Sartorius

Equipo

Sistemas de HPLC: Detector modelo 486 ó 490 Controlador modelo 600S Waters 2

Bomba modelo 626 Automuestreador modelo 717

pH-metro: Modelo9 654 Metrohm 1

Osmómetro: 030-D Osmomat 1

El siguiente estudio evaluó los siguientes parámetros para un gran número de formulaciones:  Compatibilidad del tensioactivo y el agente bacteriostático  Oxidación de la subunidad alfa

10 Las formulaciones eran formulaciones para dosis múltiples y estaban contenidas bien en TWEEN 20 o bien en Pluronic® F68, así como un agente bacteriostático. Se evaluaron los tres agentes bacteriostáticos siguientes:  Alcohol bencílico al 0,9%  m-Cresol al 0,3%

 Fenol al 0,5%

El TWEEN 20 y el Pluronic® F68 se usaron en el siguiente intervalo de concentraciones:  TWEEN 20: intervalo de 10 a 100 g/g  Pluronic® F68: intervalo de 10 a 100 g/g

Las disoluciones preparadas se recogen en la Tabla 1.

Tabla 1: Formulaciones comparativas

ID : Na2HPO4 2H2O (mg/g) NaH2PO4 2H2O (mg/g) r-hFSH* Pluronic® F68 (g/g) TWEEN 20 (g/g) Agente Bacteriostático Excipiente (mg/g)

1P: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - Fenol 0,5% Sacarosa 70,6

2P: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - Fenol 0,5% Manitol 38,7

3P: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - Fenol 0,5% Sacarosa 70,6

4P: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - Fenol 0,5% Manitol 38,7

5P: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 Fenol 0,5% Sacarosa 70,6

6P: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 Fenol 0,5% Manitol 38.7

7: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 Alcohol bencílico 0,9% NaCl 6,0

8: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa 62,3

9: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 Alcohol bencílico 0,9% Manitol 34,1

10: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 m-Cresol 0,3% NaCl 7,6

11: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 m-Cresol 0,3% Sacarosa 78,0

12: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 m-Cresol 0,3% Manitol 42,7

13: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 Alcohol bencílico 0,9% NaCl 6,0

14: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa 62,3

15: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 Alcohol bencílico 0,9% Manitol 34,1

16: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 m-Cresol 0,3% NaCl 7,6

17: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 m-Cresol 0,3% Sacarosa 78,0

18: 1,11 0,45 600 UI/g - 10 m-Cresol 0,3% Manitol 42,7

19: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - Alcohol bencílico 0,9% NaCl 6,0

20: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa 62,3

21: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - Alcohol bencílico 0,9% Manitol 34,1

22: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - m-Cresol 0,3% NaCl 7,6

23: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - m-Cresol 0,3% Sacarosa 78.0

24: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - m-Cresol 0,3% Manitol 42,7

25: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - Alcohol bencílico 0,9% NaCl 6,0

26: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa 62,3

27: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - Alcohol bencílico 0,9% Manitol 34,1

28: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - m-Cresol 0,3% NaCl 7,6

29: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - m-Cresol 0,3% Sacarosa 78.0

30: 1,11 0,45 600 UI/g 10 - m-Cresol 0,3% Manitol 42,7

* Se añadió FSH a las formulaciones en función de su potencia biológica en lugar del contenido de proteína.

Del examen visual de las formulaciones se determinó que el TWEEN 20 no se puede usar con m-cresol y fenol porque las formulaciones de FSH que contienen TWEEN 20 y m-cresol o TWEEN 20 y fenol presentaban una suspensión blanca opalescente. Por el contrario, las formulaciones de FSH que contienen Pluronic® F68 no

5 presentaron este problema con m-cresol y fenol. El uso del Pluronic® F68 permite el uso de fenol y m-cresol. Combinación de FSH y Pluronic® F68 con antioxidantes Se evaluó la capacidad de los siguientes antioxidantes para inhibir la oxidación de la subunidad  en presencia de

Pluronic® F68:  Metionina: intervalo de 10 a 100 g/g 10  Ácido ascórbico: intervalo de 10 a 100 g/g

Se usaron sacarosa y manitol como agentes de tonicidad y se añadieron TWEEN 20 o Pluronic® a una concentración 100 g/g. Las formulaciones preparadas se listan en la Tabla 2.

Tabla 2: Formulaciones comparativas con y sin metionina

ID : Na2HPO4 2H2O (mg/g) NaH2PO4 H2O (mg/g) r-hFSH* Pluronic® F68 (g/g) TWEEN (g/g) Ácido Ascórbico (g/g) Metionina (g/g) Agente Bacteriostático Excipiente

31: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - - m-Cresol 0,3% Sacarosa

32: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - - m-Cresol 0,3% Manitol

33: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 - - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

34: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 - - Alcohol bencílico 0,9% Manitol

35: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

36: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - - Alcohol bencílico 0,9% Manitol

37: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 10 m-Cresol 0,3% Sacarosa

38: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 10 m-Cresol 0,3% Manitol

39: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 100 m-Cresol 0,3% Sacarosa

40: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 100 m-Cresol 0,3% Manitol

41: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 10 - m-Cresol 0,3% Sacarosa

42: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 10 - m-Cresol 0,3% Manitol

43: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 100 - m-Cresol 0,3% Sacarosa

44: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 100 - m-Cresol 0,3% Manitol

45: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 - 10 Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

46: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 - 10 Alcohol bencílico 0,9% Manitol

47: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 - 100 Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

48: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 - 100 Alcohol bencílico 0,9% Manitol

49: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 10 - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

50: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 10 - Alcohol bencílico 0,9% Manitol

51: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 100 - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

52: 1,11 0,45 600 UI/g - 100 100 - Alcohol bencílico 0,9% Manitol

53: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 10 Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

54: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 10 Alcohol bencílico Manitol

0,9%

55: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 100 Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

56: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 100 Alcohol bencílico 0,9% Manitol

57: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 10 - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

58: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 10 - Alcohol bencílico 0,9% Manitol

59: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 100 - Alcohol bencílico 0,9% Sacarosa

60: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 100 - Alcohol bencílico 0,9% Manitol

61: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - - Fenol Sacarosa

62: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - - Fenol Manitol

63: 1,11 0,45 600 UI/g Fenol Sacarosa

64: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 10 Fenol Manitol

65: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 100 Fenol Sacarosa

66: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - - 100 Fenol Manitol

67: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 10 - Fenol Sacarosa

68: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 10 - Fenol Manitol

69: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 100 - Fenol Sacarosa

70: 1,11 0,45 600 UI/g 100 - 100 - Fenol Manitol

Se prepararon 20 g de cada formulación en tubos de polipropileno Falcon y se filtraron a través de una unidad de filtro de jeringa Millex-GV de 0,22 m, 3 cm2, de Durapore, a continuación se analizaron según el siguiente esquema: 5

Ensayo analítico: t = 0 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas

HPLC en fase inversa para la subunidad alfa oxidada (%): X X X X X

HPLC de exclusión de tamaño para la cuantificación de la proteína (g/g): X X X X X

HPLC de exclusión de tamaño cualitativa de las subunidades libres: X X X X X

(X): Ensayo realizado

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30

La HPLC en fase inversa muestra que en las formulaciones que contienen FSH, Pluronic® F68, m-cresol y metionina (a 10 y 100 g/ml), la oxidación de la subunidad  de la FSH cuando la formulación se almacena a 40ºC se redujo considerablemente frente a la formulación que no contenía metionina como se puede observar en la Figura 1. En función de la media de dos experimentos, en la formulación que no contiene metionina, el porcentaje de la subunidad  oxidada es 2,3 a t = 0, 4,0 a t = 1 semana y 7,1 a t = 2 semanas. En la formulación que contiene 10 g/ml de metionina, el porcentaje de la subunidad  oxidada es 2,0 a t = 0, 3,2 a t = 1 semana y 3,8 a t = 2 semanas. En la formulación que contiene 100 g/ml de metionina, el porcentaje de la subunidad  oxidada es 1,8 a t = 0, 1,7 a t = 1 semana y 1,3 a t = 2 semanas.

Ejemplo 2

Formulación para dosis única de FSH recombinante para inyección subcutánea o intramuscular.

En función de los resultados del Ejemplo 1, se preparó la siguiente formulación.

Los componentes 1 a 7 mostrados en la Tabla 3 se prepararon como disoluciones volumétricas en API. Se añadieron alícuotas de cada disolución a una vasija de mezcla para formar una “disolución madre”. La disolución madre se suministró en frascos de forma que contuvieran 10,9 microgramos (150 UI) o 5,45 microgramos (75 UI) de FSH. Con la FSH recombinante, la bioactividad y la actividad específica son consistentes, permitiendo que la FSH se dosifique por masa en vez de por bioensayo.

Tabla 3: Componentes de las formulaciones de FSH para dosis única

Componente : Descripción 150 UI de FSH 75 UI de FSH

1: rhFSH (g/frasco) 10,9 (150 UI) 5,45 (75 UI)

2: Sacarosa (mg/frasco) 15,00 7,50

3: NaH2PO4 H2O (mg/frasco) 0,111 0,0555

4: Na2HPO4 2H2O (mg/frasco) 0,273 0,1365

5: Pluronic® F68 (mg/frasco) 0,025 0,0125

6: Metionina (mg/frasco) 0,025 0,0125

7: m-cresol (mg/frasco) 0,75 0,375

8: pH 7,0 7,0

9: API c.s.p. 1 ml c.s.p. 0,5 ml

Los frascos se rellenaron y se sellaron en condiciones estériles. La formulación tiene una durabilidad de has dos años a temperatura ambiente.

Ejemplo 3

Formulación líquida para múltiples dosis de FSH recombinante para inyección subcutánea o intramuscular

En función de los resultados del Ejemplo 1, se preparó la siguiente formulación para dosis múltiples.

Los componentes 1 a 7 mostrados en la Tabla 4 se prepararon como disoluciones volumétricas en API. Se añadieron alícuotas de cada disolución a una vasija de mezcla para formar una “disolución madre”. La disolución madre se suministró en frascos de forma que contuvieran 22,2 microgramos (305 UI) o 33,3 microgramos (458 UI) y 66,7 microgramos (916 UI) de FSH. Las formulaciones resultantes permitían administrar un total de 300, 450 y 900 UI de FSH.

Los cartuchos se llenaron y se sellaron en condiciones estériles. La formulación para dosis múltiples se puede almacenar a o aproximadamente a 2-8ºC, más preferiblemente a o aproximadamente a 4-5ºC, hasta el primer uso durante hasta dos años. Después del primer uso, el cartucho debe almacenarse a o aproximadamente a 2-8ºC, más preferiblemente a o aproximadamente a 4-5ºC durante el periodo de dosis múltiples, que puede ser de 24 horas, 2 días o hasta 12 ó 14 días.

Tabla 4: Componentes de las formulaciones de FSH para múltiples dosis

Comp. : Descripción 300 UI de FSH 450 UI de FSH 900 UI de FSH

1: rhFSH (g/cartucho) 22,2 (305 UI) 33,3 (458 UI) 66,7 (916 UI)

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Ejemplo 7 Experimentos de estabilidad para las formulaciones líquidas para múltiples dosis de FSH mezclada con LH. 7.1.-Análisis por HPLC en fase inversa del contenido de proteína

Se evaluó el contenido de proteína en la formulación del ejemplo 5 (6 dosis), tanto para la FSH como para

la LH, usando el método de HPLC en fase inversa. El contenido de proteína (FSH y LH) se midió en el tiempo cero y después de 1, 2, 3 y 6 meses de almacenamiento de la formulación a 4ºC. Los resultados se muestran en la tabla 8 en microgramos de FSH o de LH por gramo de disolvente.

7.2.-Ensayo de la subunidad alfa oxidada

Se midió el porcentaje de subunidad alfa oxidada en una formulación del ejemplo 5 mediante un método de HPLC en fase inversa (RP-HPLC). El porcentaje de subunidad alfa oxidada se midió en el tiempo cero y después de 1, 2, 3 y 6 meses de

almacenamiento a 4ºC. Los resultados se muestran en la tabla 8. 7.3.-Ensayo in vivo para la FSH Se analizó la actividad de la FSH en la formulación del ejemplo 5 (6 dosis) usando el bioensayo de ganancia de peso

ovárico de Steelman-Pohley en el tiempo cero y después de 1, 2, 3 y 6 meses de almacenamiento a 4ºC. Los resultados se muestran en la tabla 8 en unidades internacionales (UI) por gramo de disolvente.

7.4.-Ensayo in vivo para la LH Se analizó la actividad de la LH en la formulación del ejemplo 5 (6 dosis) usando el bioensayo de ganancia de peso de la vesícula seminal en ratas en el tiempo cero y después de 1, 2, 3 y 6 meses de almacenamiento a 4ºC. Los resultados se muestran en la tabla 8 en unidades internacionales (UI) por gramo de disolvente.

7.5.-Evaluación de la subunidad libre (rFSH + rLH) Se evaluó el porcentaje de subunidad libre en una formulación del ejemplo 5 por SDS-PAGE. Las medidas se realizaron en el tiempo cero y después de 1, 2, 3 y 6 meses de almacenamiento a 4ºC. Los

resultados se dan como porcentaje de la proteína total (rFSH + rLH) y se muestran en la tabla 8. 7.5.-Evaluación de agregados Se evaluó el porcentaje de agregados en una formulación del ejemplo 5 por SDS-PAGE como se ha descrito

anteriormente para la evaluación de la subunidad libre en 7.5, excepto que los agregados de mayor peso molecular se determinaron como el porcentaje de la proteína total (rFSH + rLH). Las medidas se realizaron en el tiempo cero y después de 1, 2, 3 y 6 meses de almacenamiento a 4ºC. Los resultados se muestran en la tabla 8.

7.6.-Partículas visibles

Se evaluaron las partículas visualmente en la formulación del ejemplo 5 en el tiempo cero y después de 3 y 6 meses de almacenamiento a 4ºC. Los resultados se muestran en la tabla 8. 7.7.-pH El pH de una formulación del ejemplo 5 se midió en el tiempo cero y después de 1, 2, 3 y 6 meses de

almacenamiento a 4ºC. Los resultados se muestran en la tabla 8.

Tabla 8. Parámetros analíticos para una formulación líquida de FSH y LH (2:1) en el tiempo cero y después de almacenamiento a 4ºC durante 1, 2, 3 y 6 meses

Análisis: Tiempo 0 1 mes 2 meses 3 meses 6 meses

Contenido de rFSH por RP-HPLC (microgramos/g): 46,50 46,98 46,71 46,31 44,98

Contenido de rLH por RP-HPLC (microgramos/g): 11,74 11,81 12,68 12,67 13,21

% de subunidad alfa oxidada: 2,29 2,17 2,08 2,48 2,95

Análisis in vivo para la FSH 553 (UI/g): 566 No No No 578

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-Controlar de nuevo el pH y opcionalmente ajustarlo a pH 7,0 ± 0,1 con NaOH al 10% o H3PO4 diluido. -Filtrar la disolución con una membrana Durapore de 0,22 m con una relación de filtración no menor de 15 g/cm2, con una corriente de nitrógeno gaseoso con una presión no superior a 1,5 atm. -Recoger la disolución en un frasco previamente esterilizado. 5 -Rellenar el frasco de vidrio con la disolución filtrada, poner el tapón y colocar los frascos rellenos en una bandeja de aluminio inoxidable.

-Cargar las bandejas en el liofilizador y liofilizar el producto usando el siguiente ciclo de liofilización:  Equilibrar a +4ºC durante aproximadamente 20 minutos.  Llevar los estantes a una temperatura de -25ºC y mantenerla durante 2 horas.

10  Llevar los estantes a una temperatura de -15ºC y mantenerla durante 1 hora.  Llevar los estantes a una temperatura de -45ºC y mantenerla durante 3 horas.  Llevar el condensador a una temperatura de -65ºC.  Aplicar vacío a la cámara.  Cuando el vacío alcance un valor de 7x10-2 mbares, subir la temperatura del estante hasta -10ºC y

15 mantenerla durante 14 horas.  Aumentar la temperatura del estante hasta +35ºC en 8 horas y mantenerla hasta el final del ciclo (14

horas).  Romper el vacío permitiendo la entrada de nitrógeno en la cámara.  Realizar el taponado con el sistema automático del liofilizador.

20  Sellar los frascos tapados con tapones abatibles adecuados. Las formulaciones A y B se han almacenado a 25 ± 2ºC y se ha evaluado su estabilidad y actividad biológica como

se indica a continuación. Antes de analizar las composiciones, se han reconstituido usando agua para inyección que comprendía 0,3% de m-cresol como agente bacteriostático. Los valores de estabilidad y actividad biológica se determinaron como sigue:

25  Análisis in vivo para la FSH: se analizó la actividad FSH de la formulación usando el bioensayo de ganancia de peso ovárico de Steelman-Pohley.  Análisis in vivo para la LH: se analizó la actividad LH de la formulación usando el bioensayo de ganancia de peso de la vesícula seminal en ratas.  Análisis de la subunidad alfa oxidada: el porcentaje de subunidad alfa oxidada se midió mediante un método de 30 HPLC en fase inversa (RP-HPLC).  Evaluación de la subunidad libre (rFSH + rLH): el porcentaje de subunidad libre se evaluó por SDS-PAGE.  Evaluación de agregados: el porcentaje de agregados se evaluó por SDS-PAGE como se ha descrito anteriormente para la evaluación de la subunidad libre. Los análisis biológicos se han realizado cumpliendo con las regulaciones de la Farmacopea Europea. En particular,

35 los análisis se han publicado en la monografía “Menotropin”. La tabla 9 resume los resultados de los ensayos analíticos relacionados con la estabilidad y la actividad biológica de la formulación A. Los valores se determinaron en 4 puntos de control: a tiempo cero, después de 1 mes, 3 meses y 6 meses de almacenamiento, a una temperatura de almacenamiento de 25  2ºC.

Tabla 9

Ensayo: Tiempo cero 1 mes 3 meses 6 meses

Actividad biológica FSH U.I.: 416 420 415 417

Actividad biológica LH U.I.: 276 250 259 270

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Claims

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