ES2144386T3 - Ligando para el activador del receptor de nf-kappa b, el ligando es miembro de la superfamilia de tnf. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS LIGANDOS AISLADOS, UNOS ADN QUE CODIFICAN PARA DICHOS LIGANDOS, Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS FABRICADAS A PARTIR DE DICHOS LIGANDOS. SE PUEDEN USAR LOS LIGANDOS AISLADOS PARA REGULAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA. SON TAMBIEN UTILES PARA CRIBAR LOS INHIBIDORES DE DICHA RESPUESTA INMUNITARIA.

Description

Ligando para el activador del receptor de NF-\kappaB, el ligando es miembro de la superfamilia de TNF.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de las citoquinas, y más específicamente a pares receptor/ligando de citoquina que tienen actividad inmunorreguladora.

Antecedentes de la invención

El funcionamiento eficiente del sistema inmunitario requiere un balance sutil entre la proliferación y diferenciación celular y la muerte celular, a fin de asegurar que el sistema inmunitario es capaz de reaccionar a los antígenos extraños, pero no a los propios. Integrales con el proceso de regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria son varios miembros de la superfamilia Receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNF)/Receptor del Factor del Crecimiento de los Nervios (Smith et al., Science 248: 1019; 1990). Esta familia de receptores incluye dos receptores TNF diferentes (Tipo I y Tipo II; Smith et al., supra; y Schall et al., Cell 61: 361, 1990), el receptor del factor de crecimiento de los nervios (Johnson et al., Cell 47: 545, 1986), el antígeno CD40 de las células B (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), CD27 (Camerini et al., J. Immunol. 147: 3165, 1991), CD30 (Durkop et al., Cell 68: 421, 1992), el antígeno OX40 de las células T (Malleu et al., EMBO J. 9: 1063, 1990), el antígeno humano Fas (Itoh et al., Cell 66: 233, 1991), el receptor murino 4-1BB (Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989) y un receptor al que se hace referencia como Receptor Inductor de Apoptosis (AIR; USSN 08/720.864, presentada el 4 de octubre de 1996).

CD40 es un receptor presente en los linfocitos B, las células epiteliales y algunas líneas de células de carcinoma que interacciona con un ligando encontrado en las células T activadas, CD40L (documento USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994). La interacción de este par ligando/receptor es esencial para la respuesta inmunológica tanto celular como humoral. La transducción de señales por CD40 está mediada por la asociación del dominio citoplásmico de esta molécula con miembros de los factores asociados al receptor TNF (TRAFs; Baker y Reddy, Oncogene 12: 1, 1996). Se ha encontrado recientemente que los ratones que son deficientes en la expresión de TRAF3 debido a una disrupción direccionada en el gen que codifica TRAF3 parecen normales al nacer pero desarrollan hipoglucemia progresiva y empobrecimiento en glóbulos blancos periféricos, y mueren al cabo de aproximadamente 10 días de edad (Xu et al., Immunity 5: 407, 1996). Las respuestas inmunológicas de ratones quiméricos reconstituidos con células hepáticas fetales TRAF3^{-/-} se asemejan a las de los ratones deficientes en CD40, aunque las células DTRAF3^{-/-} parecen ser funcionalmente normales.

El papel crítico de TRAF3 en la transducción de señales puede residir en su interacción con uno de los otros miembros de la superfamilia de receptores TNF, por ejemplo, CD30 o CD27, que están presentes en las células T. Alternativamente, pueden existir otros miembros, todavía no identificados, de esta familia de receptores que interaccionan con TRAF3 y juegan un papel importante en el desarrollo post-natal así como en el desarrollo de un sistema inmunitario competente. La identificación de miembros adicionales de la superfamilia de receptores TNF podría proporcionar un medio adicional de regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria, así como proporcionar potencialmente una mejor comprensión en cuanto al desarrollo post-natal de los mamíferos.

El documento WO 98/25958 describe una secuencia de aminoácidos murina a la que se hace referencia como 499E9 y un anticuerpo que es inmunorreactivo con la secuencia de aminoácidos murina 499E9.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una contraestructura, o ligando, para un nuevo receptor al que se hace referencia como RANK (para receptor activador de NF-\kappaB), que es un miembro de la superfamilia TNF. El ligando, al que se hace referencia como RANKL, es una proteína transmembranal de Tipo 2 con un dominio intracelular que tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos, un dominio transmembranal y un dominio extracelular de aproximadamente 240 a 250 aminoácidos. Análogamente a otros miembros de la familia TNF a la que pertenece, RANKL tiene una región "espaciadora" entre el dominio transmembranal y el dominio de fijación de receptores que no es necesaria para la fijación de receptores. De acuerdo con ello, formas solubles de RANKL pueden comprender el dominio extracelular entero o fragmentos del mismo que incluyen la región de fijación de receptores.

RANK es una proteína transmembranal de Tipo I que tiene 616 residuos de aminoácidos, que es un miembro de la superfamilia TNFR, e interacciona con TRAF3. La excitación de RANK por sobre-expresión, co-expresión de RANK y RANKL fijado a la membrana, o por RANKL soluble o anticuerpos agonistas de RANK, da como resultado la regulación creciente del factor de transcripción NF-\kappaB, un factor de transcripción ubicuo que es utilizado de modo muy extenso en células del sistema inmunitario.

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes después de considerar la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 demuestra la influencia de RANK.Fc y hRANKL en el crecimiento de las células T activadas. Se cultivaron células T de sangre periférica humana como se describe en el Ejemplo 12; la recuperación de células T viables se determinó por conteos triplicados con azul tripán.

La Figura 2 ilustra la aptitud de RANKL para inducir la formación de aglomerados DC humanos. Células dendríticas (DC) funcionalmente maduras se generaron in vitro a partir de progenitores de médula ósea (BM) CD34^{+}, y se cultivaron como se describe en el Ejemplo 13. Se cultivaron DC CD1a^{+} en un cóctel de citoquinas aislado (Figura 2A), en cóctel más CD40L (Figura 2B), RANKL (Figura 2C), o RANKL desactivado por calentamiento (\DeltaH) (Figura 2D), y se fotografiaron luego utilizando un microscopio de inversión.

La Figura 3 demuestra que RANKL aumenta la capacidad alo-estimuladora de DC. Se incubaron células T alogénicas con números variables de DC irradiadas cultivadas como se describe en el Ejemplo 13. Los cultivos se pulsaron con [^{3}H]-timidina y las células se cosecharon sobre hojas de fibra de vidrio para conteo. Los valores representan el valor medio \pm la desviación estándar (SD) de cultivos triplicados.

La Figura 4 presenta una alineación de RANK humana con otros miembros de la familia TNFR en la región de pseudorrepeticiones extracelulares ricas en cisteína, estructuralmente conservadas. Se indican los enlaces disulfuro predichos (DS1-DS3). RANK y CD40 contienen sustituciones idénticas de aminoácidos (C^H, C^.G) que eliminan DS2 en la segunda pseudorrepetición.

La Figura 5 presenta una alineación de RANKL humana con otros miembros de la familia TNF.

Descripción detallada de la invención

Una nueva inserción parcial de cDNA con un marco de lectura abierto predicho que tiene cierta semejanza con CD40 se identificó en una base de datos que contenía información de secuencias de cDNAs generados a partir de células dendríticas (DC) derivadas de médula ósea humana. La inserción se utilizó para hibridación a transferencias de colonias generadas a partir de una genoteca de DC cDNA que contenía cDNAs de longitud total. Se analizaron varias hibridaciones de colonias, y se aislaron dos clones (SEQ ID Nos: 1 y 3). SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una proteína de longitud total predicha basada en alineación de las secuencias solapantes de SEQ ID Nos: 1 y 3.

RANK es un miembro de la superfamilia de receptores TNF; el mismo se asemeja estrechamente a CD40 en la región extracelular. Análogamente a CD40, RANK se asocia con TRAF2 y TRAF3 (como se ha determinado por ensayos de co-inmunoprecipitación sustancialmente como ha sido descrito por Rothe et al., Cell 83: 1243, 1995. TRAFs son críticamente importantes en la regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria. Por su asociación con diversos miembros de la superfamilia de receptores TNF, se transduce una señal a una célula. Dicha señal da como resultado la proliferación, diferenciación o apoptosis de la célula, dependiendo del receptor o receptores que se exciten y del o de los TRAF(s) que se asocien con el o los receptores; diferentes señales pueden transducirse a una célula por coordinación de diversos sucesos de señalización. Así, una señal transducida por un miembro de esta familia puede ser proliferativa, diferenciadora o apoptótica, dependiendo de otras señales que sean transducidas a la célula, y/o del estado de diferenciación de la célula. Dicha regulación exquisita de este camino proliferativo/apoptótico es necesaria para desarrollar y mantener protección contra los patógenos; los desequilibrios pueden dar como resultado una enfermedad autoinmune.

RANK se expresa en células epiteliales, algunas líneas de células B, y en células T activadas. Sin embargo, su expresión en las células T activadas es tardía, aproximadamente 4 días después de la activación. Esta evolución temporal de la expresión coincide con la expresión de Fas, un conocido agente de apoptosis. RANK puede actuar como señal anti-apoptótica, salvando las células que expresan RANK de la apoptosis como se sabe que hace CD40. Alternativamente, RANK puede confirmar una señal apoptótica en las circunstancias apropiadas, nuevamente de modo análogo a CD40. RANK y su ligando desempeñan probablemente un papel integral en la regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria.

Además, la letalidad post-natal de los ratones que tienen una disrupción direccionada del gen TRAF3 demuestra la importancia de esta molécula, no sólo en la respuesta inmunológica, sino en el desarrollo. El aislamiento de RANK, como proteína que se asocia con TRAF3, y su ligando, RANKL, permitirá la definición ulterior de este camino de señalización, y el desarrollo de modalidades diagnósticas y terapéuticas para uso en el área de las enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.

DNAs, Proteínas y Análogos

La presente invención proporciona polipéptidos humanos RANKL aislados, análogos (o muteínas) de los mismos que tienen una actividad exhibida por la molécula nativa (es decir, muteínas RANKL que se fijan específicamente a un RANK expresado en las células o inmovilizado en una superficie, o a anticuerpos RANKL específicos; formas solubles de los mismos que inhiben la señalización por RANK inducida por el ligando RANK) y fragmentos que son capaces de fijar RANK. Tales proteínas están sustancialmente exentas de materiales contaminantes endógenos y, opcionalmente, sin glicosilación asociada a un patrón nativo. Derivados de RANKL dentro del alcance de la invención incluyen también diversas formas estructurales de las proteínas primarias que retienen actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína RANKL puede hallarse en la forma de sales ácidas o básicas, o puede encontrarse en forma neutra. Los residuos de aminoácidos individuales pueden estar modificados también por oxidación o reducción. La estructura primaria de aminoácidos puede estar modificada por formación de conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y análogos, o por creación de mutantes de las secuencias de aminoácidos. Se preparan derivados covalentes por enlace de grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos o a los términos N o C.

Derivados de RANKL pueden obtenerse también por la acción de agentes de reticulación, tales como el éster de M-maleimidobenzoil-succinimida y N-hidroxisuccinimida, en los residuos cisteína y lisina. Las proteínas de la invención pueden estar unidas también covalentemente por grupos laterales reactivos a diversos sustratos insolubles, tales como estructuras de agarosa activadas por bromuro de cianógeno, activadas por bisoxirano, activadas por carbonildiimidazol o activadas por tosilo, o por adsorción a superficies de poliolefinas (con o sin reticulación por aldehído glutárico). Una vez fijadas a un sustrato, las proteínas pueden utilizarse para fijar selectivamente (para propósitos de ensayo o de purificación) anticuerpos generados contra las proteínas o contra otras proteínas que son similares a RANKL, así como otras proteínas que fijan RANKL u homólogos del mismo.

Formas solubles de RANKL están también dentro del alcance de la invención. La secuencia de nucleótidos y la secuencia predicha de aminoácidos de RANKL se muestra en SEQ ID NO: 12 (humana). El análisis por ordenador indicó que RANKL es una proteína transmembranal Tipo 2; RANKL murina contiene un dominio intracelular predicho de 48 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 247 aminoácidos, y RANKL humana contiene un dominio intracelular predicho de 47 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 249 aminoácidos.

RANKL soluble comprende un péptido de señal y el dominio extracelular o un fragmento del mismo que es capaz de fijar el polipéptido RANK. Un péptido de señal ilustrativo es el representado en SEQ ID NO: 9; otros péptidos de señal (o conductores) son bien conocidos en la técnica, e incluyen el de interleuquina-7 murina o la hormona de crecimiento humana. RANKL es similar a otros miembros de la familia TNF en que tiene una región de aminoácidos entre el dominio transmembranal y la región de fijación de receptores que no parece ser necesaria para la actividad biológica; se hace referencia a ésta como región "espaciadora". La alineación de la secuencia de aminoácidos indica que la región de fijación de receptores comprende desde aproximadamente el aminoácido 162 de RANKL humana hasta aproximada-mente el aminoácido 317 (correspondiente a los aminoácidos 139 a 294 de RANKL murina, SEQ ID NO: 10), comenzando con un residuo Ala que está conservado entre muchos miembros de la familia (aminoácido 162 de SEQ ID NO: 12).

Además, fragmentos del dominio extracelular proporcionarán también formas solubles de RANKL. Los expertos en la técnica reconocerán que la región de fijación de receptores real puede ser diferente de la predicha por análisis mediante ordenador. Así, es de esperar que el aminoácido N-terminal de una RANKL soluble se encuentre dentro de aproximadamente 5 aminoácidos a cada lado del residuo Ala conservado. Alternativamente, la totalidad o una porción de la región espaciadora puede estar incluida en el término N de una RANKL soluble, como puede ser la totalidad o una porción de los dominios transmembranal y/o intracelular, con tal que la RANKL soluble resultante no esté asociada a la membrana. De acuerdo con ello, una RANKL soluble tendrá un aminoácido N-terminal seleccionado del grupo constituido por los aminoácidos 1 a 162 de SEQ ID NO: 13. Preferiblemente, el aminoácido del terminal amino está comprendido entre los aminoácidos 69 y 162 de SEQ ID NO: 13 (RANKL humana). Análogamente, el aminoácido del terminal carboxi puede estar comprendido entre los aminoácidos 313 y 317 de SEQ ID NO: 13 (RANKL humana). Los expertos en la técnica pueden preparar estas formas y formas solubles adicionales por experimentación de
rutina.

Pueden prepararse fragmentos utilizando técnicas conocidas para aislar una porción deseada de la región extracelular, y pueden prepararse, por ejemplo, por comparación de la región extracelular con las de otros miembros de la familia TNF (de la cual forma parte RANKL) y selección de formas similares a las preparadas para otros miembros de la familia. Alternativamente, pueden utilizarse sitios de restricción únicos o métodos PCR que se conocen en la técnica para preparar numerosas formas truncadas que pueden expresarse y analizarse en cuanto a actividad.

Otros derivados de las proteínas RANKL comprendidos dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregativos de las proteínas o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia de polipéptido de señal (o conductor) en la región N-terminal de la proteína que dirige por co-traducción o post-traducción la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a su sitio de función dentro o fuera de la membrana o pared celular (v.g., el conductor del factor \alpha de levadura).

Las fusiones de proteínas pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de proteínas RANKL y homólogos (v.g., poli-His). La secuencia de aminoácidos de las proteínas de la invención puede estar enlazada también a un péptido de identificación tal como ha sido descrito por Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204 (1988). Un péptido fuertemente antigénico de este tipo proporciona un epítope enlazado reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que permite el ensayo rápido y la purificación fácil de la proteína recombinante expresada. La secuencia de Hopp et al. es escindida también específicamente por la enteroquinasa mucosal bovina, permitiendo la eliminación del péptido de la proteína purificada. Proteínas de fusión protegidas terminalmente con tales péptidos pueden ser también resistentes a la degradación intracelular en E. coli.

Las proteínas de fusión comprenden adicionalmente la secuencia de aminoácidos de una RANKL enlazada a una región Fc de inmunoglobulina. Una región Fc ilustrativa es una IgG_{1} humana, teniendo un nucleótido una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8. Pueden utilizarse también fragmentos de una región Fc, al igual que muteínas Fc. Por ejemplo, ciertos residuos dentro de la región bisagra de una región Fc son críticos para fijación de alta afinidad a Fc\gammaRI. Canfield y Morrison (J. Exp. Med. 173: 1483; 1991) consignaron que Leu_{(234)} y Leu_{(235)} eran críticas para fijación con afinidad alta de IgG_{3} a Fc\gammaRI presente en células U937. Resultados similares fueron obtenidos por Lund et al. (J. Immunol. 147: 2657, 1991; Molecular Immunol. 29: 53, 1991). Tales mutaciones, solas o en combinación, pueden producirse en una región Fc de IgG_{1} para disminuir la afinidad de IgG_{1} para FcR. Dependiendo de la porción de la región Fc utilizada, una proteína de fusión puede expresarse como un dímero, por formación de puentes disulfuro intercatenarios. Si las proteínas de fusión se producen con ambas cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, es posible formar un oligómero proteínico con tantas como 4 regiones RANKL.

En otra realización, las proteínas RANKL comprenden adicionalmente un péptido de oligomerización tal como un dominio cremallera de leucina. Las cremalleras de leucina fueron identificadas originalmente en varias proteínas de fijación de DNA (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988). El dominio de cremallera de leucina es un término utilizado para hacer referencia a un dominio peptídico conservado presente en estas (y otras) proteínas, que es responsable de la dimerización de las proteínas. El dominio de cremallera de leucina (al que se hace referencia también en esta memoria como dominio de oligomerización, o formador de oligómeros) comprende una repetición de heptada repetitiva, con cuatro o cinco residuos leucina intercalados con otros aminoácidos. Ejemplos de dominios de cremallera de leucina son los encontrados en el factor de transcripción de levadura GCN4 y una proteína de fijación de DNA termoestable encontrada en hígado de rata (C/EBP; Landschulz et al. Science 243: 1681, 1989). Dos proteínas de transformación nucleares, fos y jun, exhiben también dominios de cremallera de leucina, como lo hace el producto génico del proto-oncogén murino, c-myc (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios de cremallera de leucina preferentemente en forma de un heterodímero (O'Shea et al., Science 245: 646, 1989; Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1989). El domino de cremallera de leucina es necesario para la actividad biológica (fijación de DNA) en estas proteínas.

Las proteínas fusógenas de varios virus diferentes, con inclusión de paramixovirus, coloravirus, virus del sarampión y muchos retrovirus, poseen también dominios de cremallera de leucina (Buckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990). Los dominios de cremallera de leucina en estas proteínas fusógenas virales están próximos a la región transmembranal de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cremallera de leucina podrían contribuir a la estructura oligómera de las proteínas fusógenas. La oligomerización de las proteínas fusógenas virales está implicada en la formación de poros de fusión (Spruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3523, 1991). Se ha comunicado también recientemente que los dominios de cremallera de leucina juegan un papel en la oligomerización de los factores de transcripción del choque térmico (Rabindran et al., Science 259: 230, 1993).

Los dominios de cremallera de leucina se pliegan como serpentines enrollados, cortos y paralelos. (O'Shea et al., Science 254: 539; 1991). La arquitectura general del serpentín enrollado paralelo ha sido bien caracterizada, con un empaquetamiento del tipo de "botones en ojales" como fue propuesto por Crick en 1953 (Acta Crystallogr. 6: 689). El dímero formado por un dominio de cremallera de leucina es estabilizado por la repetición de heptada, designada (abcdefg)_{n} de acuerdo con la notación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293; 1975), en la cual los residuos a y d son generalmente residuos hidrófobos, siendo d una leucina, que están alineados en la misma cara de una hélice. Residuos de carga opuesta se encuentran comúnmente en las posiciones g y e. Así pues, en un serpentín enrollado paralelo formado por dos dominios de cremallera de leucina helicoidales, los "botones" formados por las cadenas laterales hidrófobas de la primera hélice están empaquetados en los "ojales" formados entre las cadenas laterales de la segunda hélice.

Los residuos leucina en la posición d aportan grandes energías de estabilización hidrófoba, y son importantes para la formación de dímeros (Krystek et al., Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991). Lovejoy et al. comunicaron recientemente la síntesis de un haz helicoidal \alpha de tres cadenas en el cual las hélices están dirigidas arriba-arriba-abajo (Science 259: 1288, 1993). Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrófoba proporciona la principal fuerza impulsora para la formación de serpentines enrollados a partir de monómeros helicoidales. Estos estudios indican también que interacciones electrostáticas contribuyen a la estequiometría y la geometría de los serpentines
enrollados.

Varios estudios han indicado que aminoácidos conservadores pueden encontrarse en sustitución de residuos leucina individuales con una disminución mínima de la aptitud para la formación de dímeros; sin embargo, los cambios múltiples dan usualmente como resultado la pérdida de esta aptitud (Landschulz et al., Science 243: 1681, 1989; Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1989; Hu et al., Science 250: 1400, 1990). Van Heekeren et al. comunicaron que cierto número de residuos amino diferentes pueden encontrarse en sustitución de los residuos leucina en el dominio de cremallera de leucina de GCN4, y encontraron adicionalmente que algunas proteínas GCN4 que contienen dos sustituciones leucina eran débilmente activas (Nucl. Acids. Res. 20: 3721, 1992). La mutación de las leucinas heptádicas primera y segunda del dominio de cremallera de leucina de la proteína de fusión con el virus del sarampión (MVF) no afectaba la formación de sincitios (una medida de la fusión celular inducida por virus); sin embargo, la mutación de la totalidad de los cuatro residuos leucina impedía la fusión completamente (Buckland et al., J. Gen. Virol. 3: 1703, 1992). Ninguna de las mutaciones afectaba a la aptitud de MVF para formar un tetrámero.

Se ha encontrado que las sustituciones de aminoácidos en los residuos a y d de un péptido sintético que representa el dominio de cremallera de leucina GCN4 cambian las propiedades de oligomerización del dominio de cremallera de leucina (Alber, Sexto Simposium de la Sociedad de Proteínas, San Diego, CA). Cuando todos los residuos en la posición a están cambiados a isoleucina, la cremallera de leucina forma todavía un dímero paralelo. Cuando, además de este cambio, todos los residuos leucina en la posición d están cambiados también a isoleucina, el péptido resultante forma espontáneamente un serpentín enrollado paralelo trímero en solución. La sustitución de todos los aminoácidos en la posición d con isoleucina y en la posición a con leucina da como resultado un péptido que se tetrameriza. Los péptidos que contienen estas sustituciones se designan también como dominios de cremallera de leucina.

La presente invención incluye también RANKL con o sin glicosilación de patrón nativo asociada. Las proteínas expresadas en levadura o sistemas de expresión de mamífero, v.g. las células COS-7, pueden ser similares o ligeramente diferentes en peso molecular y patrón de glicosilación a las moléculas naturales, dependiendo del sistema de expresión. La expresión de DNAs que codifican las proteínas de la invención en bacterias tales como E. coli proporciona moléculas no glicosiladas. Análogos mutantes funcionales de la proteína RANKL que tienen sitios de glicosilación en N desactivados pueden producirse por síntesis de oligonucleótidos y ligación o por técnicas de mutagénesis orientada. Estas proteínas análogas pueden producirse en una forma homogénea, de carbohidratos reducidos con buen rendimiento utilizando sistemas de expresión de levadura. Los sitios de glicosilación en N en proteínas eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A_{1}-Z, donde A_{1} es cualquier aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta secuencia, la asparagina proporciona un grupo amino de cadena lateral para unión covalente de carbohidrato. Dicho sitio puede ser eliminado por reemplazamiento de Asn o del residuo Z por otro aminoácido, deleción de Asn o Z, o inserción de un aminoácido distinto de Z entre A_{1} y Z, o un aminoácido distinto de Asn entre Asn y A_{1}.

Derivados de la proteína RANKL pueden obtenerse también por mutaciones de la RANKL nativa o subunidades de la misma. Una proteína RANKL mutada, como se contempla en esta memoria, es un polipéptido homólogo a una proteína RANKL nativa, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la proteína nativa debido a una o una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. El efecto de cualquier mutación realizada en un DNA que codifica un péptido mutado puede ser determinado fácilmente por análisis de la aptitud del péptido mutado para fijar su contraestructura de una manera específica. Además, la actividad de análogos, muteínas o derivados de RANKL puede determinarse por cualquiera de los ensayos descritos en esta memoria (por ejemplo, inducción de la activación de NF-\kappaB).

Análogos de las proteínas de la invención pueden construirse, por ejemplo, por realización de diversas sustituciones de residuos o secuencias o deleción de residuos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos cisteína pueden ser delecionados o reemplazados con otros aminoácidos para impedir la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después de renaturalización. Otros métodos distintos de la mutagénesis implican modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para intensificar la expresión en sistemas de levadura en los cuales está presente actividad de la proteasa KEX2.

Cuando se adopta una estrategia de deleción o inserción, debería considerarse el efecto potencial de la deleción o inserción sobre la actividad biológica. Subunidades de las proteínas de la invención pueden construirse por deleción de residuos o secuencias terminales o internos. Formas solubles de RANKL pueden prepararse y testarse fácilmente en cuanto a su aptitud para inducir la activación de NF-\kappaB. Polipéptidos correspondientes a las regiones citoplásmicas, y fragmentos de los mismos (por ejemplo, un dominio de muerte) pueden prepararse por técnicas similares. Una orientación adicional en cuanto a los tipos de mutaciones que pueden hacerse se proporciona por una comparación de la secuencia de RANKL con proteínas que tienen estructuras similares, y por realización de análisis estructurales de las proteínas RANKL de la invención.

Generalmente, las sustituciones deberían hacerse de manera conservadora; es decir, los aminoácidos sustitutos más preferidos son aquéllos que no afectan a la actividad biológica de RANKL (es decir, la aptitud de las proteínas de la invención para fijar anticuerpos a la proteína nativa correspondiente de manera sustancialmente equivalente, la aptitud para fijar la contraestructura sustancialmente del mismo modo que la proteína nativa, la aptitud para inducir una señal de RANKL, o la aptitud para inducir la activación de NF-\kappaB). Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de aminoácidos situados fuera del o de los dominios de fijación (sean áreas ligando/receptor o áreas de fijación de anticuerpos para el dominio extracelular, o regiones que interaccionan con otras proteínas intracelulares en cuanto al dominio citoplásmico), y sustitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de la proteína nativa. Ejemplos adicionales incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala uno por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas.

Las mutaciones en secuencias de nucleótidos construidas para expresión de proteínas análogas o fragmentos de las mismas deben preservar, por supuesto, la fase de marco de lectura de las secuencias codificantes y preferiblemente no crearán regiones complementarias que pudieran hibridarse para producir estructuras secundarias de mRNA tales como bucles u horquillas que podrían afectar de manera desfavorable a la traducción del mRNA.

No todas las mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína RANKL o fragmentos de la misma se expresarán en el producto final; por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos para intensificar la expresión, fundamentalmente con objeto de evitar bucles de estructura secundaria en el mRNA transcrito (véase el documento EPA 75.444A, que se incorpora en esta memoria por referencia), o para proporcionar codones que son traducidos más fácilmente por el hospedador seleccionado, v.g., los codones de preferencia de E. coli bien conocidos para expresión en E. coli.

Aunque un sitio de mutación puede estar predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación esté predeterminada per se. Por ejemplo, con objeto de seleccionar características óptimas de mutantes, puede realizarse una mutagénesis aleatoria y las proteínas mutadas expresadas pueden escrutarse respecto a la actividad deseada. Las mutaciones pueden introducirse en loci particulares por síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácido deseada.

Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis orientada dirigida a oligonucleótidos a fin de proporcionar un gen alterado que tenga codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, deleción, o inserción requerida. Métodos ilustrativos de realización de las alteraciones arriba expuestas han sido descritos por Walter et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las Patentes U.S. Núms. 4.518.584 y 4.737.462 describen técnicas adecuadas, y se incorporan por referencia en esta memoria.

Una realización de la invención es

un DNA que codifica una proteína que tiene un aminoácido como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive;

moléculas de DNA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el DNA de la invención que son capaces de fijación de polipéptido;

un DNA que comprende un nucleótido como se indica en los nucleótidos 1-951 de SEQ ID NO: 12; un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO: 12, y un DNA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO: 13.

Realizaciones adicionales de las proteínas de la invención incluyen polipéptidos RANKL codificados por un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1 a 951 de SEQ ID NO: 12, nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO: 12 y un polipéptido RANKL que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO: 13. En una realización preferida, polipéptidos de la invención son aquéllos que son idénticos al menos aproximadamente en un 90% a un polipéptido RANKL codificado por un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1 a 951 de SEQ ID NO: 12, o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO: 3.

El porcentaje de identidad puede determinarse utilizando un programa de ordenador, por ejemplo, el programa de ordenador GAP descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible del Grupo de Genética de Ordenador de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). Para fragmentos derivados de la proteína RANKL, la identidad se calcula sobre la base de la porción de la proteína RANKL que está presente en el fragmento.

La actividad biológica de los análogos o muteínas de RANKL puede determinarse testando la aptitud de los análogos o muteínas para inducir una señal a través de RANK, por ejemplo, activación o transcripción como se describe en los Ejemplos de esta memoria. Alternativamente, pueden utilizarse ensayos adecuados, por ejemplo, un inmunoensayo enzimático o una transferencia de puntos, empleando un anticuerpo que se fija a RANKL nativa, o una forma soluble de RANK, para evaluar la actividad de análogos o muteínas de RANKL. Ensayos adecuados incluyen también, por ejemplo, ensayos que miden la aptitud de un péptido o muteína de RANKL para fijar células que expresan RANK, y/o los efectos biológicos en las mismas. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.

Fragmentos de las secuencias de nucleótidos RANKL que codifican fragmentos de proteínas que son capaces de fijar el polipéptido RANK son también útiles. En una realización, tales fragmentos comprenden al menos aproximadamente 17 nucleótidos consecutivos, con preferencia aproximadamente al menos 25 nucleótidos, más preferiblemente al menos 30 nucleótidos consecutivos, del DNA de RANKL descrito en esta memoria. Complementos de DNA y RNA de tales fragmentos se proporcionan en esta memoria, junto con formas monocatenarias y bicatenarias de los DNAs RANKL de SEQ ID Nos: 10 y 12, y los que codifican los polipéptidos mencionados anteriormente. Un fragmento de DNA RANKL comprende por regla general al menos aproximadamente 17 nucleótidos, con preferencia desde aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos. Tales fragmentos de ácido nucleico (por ejemplo, una sonda que corresponde al dominio extracelular de RANKL) se utilizan como sonda o como iniciadores en una reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Las sondas encuentran uso también en la detección de la presencia de ácidos nucleicos RANKL en ensayos in vitro y en procedimientos tales como transferencias Northern y Southern. Pueden identificarse también tipos de células que expresan RANKL. Tales procedimientos son bien conocidos, y el técnico experto puede seleccionar una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación particular propuesta. Para PCR, se emplean iniciadores 5' y 3' correspondientes a los términos de una secuencia de DNA RANKL a fin de amplificar dicha secuencia, utilizando técnicas convencionales.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos RANKL son oligonucleótidos de sentido o antisentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenaria (sea RNA o DNA) capaz de fijarse a secuencias diana de mRNA RNAKL (sentido) o DNA RANKL (antisentido). La aptitud para crear un oligonucleótido antisentido u oligonucleótido de sentido, basado en una secuencia de cDNA para una proteína dada, se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1998 y van der Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988.

Usos de DNAs, Proteínas y Análogos

Los DNAs, proteínas y análogos de RANKL descritos en esta memoria tendrán numerosos usos, que incluyen la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, formas solubles de RANKL serán útiles para transducción de señales por vía de RANK. Composiciones RANKL (tanto proteína como DNAs) serán útiles también en el desarrollo de anticuerpos para RANKL, tanto aquéllos que inhiben la fijación a RANK como los que no lo hacen. Una realización de la invención es un anticuerpo inmunorreactivo con un polipéptido RANKL de la invención, que no es inmunorreactivo con la secuencia de aminoácidos murina denominada 499E9 en WO 98/25958. Los DNAs de la invención son útiles para la expresión de proteínas recombinantes, y como sondas para análisis (sea cuantitativo o cualitativo) de la presencia o distribución de transcritos RANKL.

Las proteínas de la invención serán útiles también en la preparación de kits que se utilizan para detectar RANK o RANKL soluble, o monitorizar la actividad relacionada con RANK, por ejemplo, en muestras de pacientes. Las proteínas RANKL encontrarán usos también en la monitorización de la actividad relacionada con RANK en otras muestras o composiciones, como es necesario cuando se realiza un cribado para antagonistas o miméticos de esta actividad (por ejemplo, péptidos o moléculas pequeñas que inhiben o mimetizan, respectivamente, la interacción). Una diversidad de formatos de ensayo son útiles en tales kits, que incluyen (pero sin carácter limitante) ELISA, transferencia de puntos, ensayos de fijación en fase sólida (tales como los que utilizan un biosensor), ensayos de formato rápido y bioensayos.

El uso de un polipéptido RANKL purificado en el cribado para inhibidores potenciales es importante y puede eliminar virtualmente la posibilidad de reacciones de interferencia con contaminantes. Un ensayo de cribado de este tipo puede utilizar el dominio extracelular de RANKL, o un fragmento del mismo. La detección de la actividad inhibidora de una molécula implicaría típicamente el uso de una forma soluble de RANKL derivada del dominio extracelular en un ensayo de cribado para detectar moléculas capaces de fijar RANK e inhibir la fijación de RANKL.

Adicionalmente, pueden utilizarse también polipéptidos RANKL para diseño basado en la estructura de inhibidores de RANKL. Dicho diseño basado en estructura se conoce también como "diseño racional de fármacos". Los polipéptidos RANKL pueden analizarse tridimensionalmente mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear o modelización de homología, todos los cuales son métodos bien conocidos. El uso de información estructural de RANKL en sistemas de software de modelización molecular para ayudar al diseño de inhibidores está abarcado también por la invención. Dicha modelización y diseño de fármacos asistida(o) por ordenador pueden utilizar información tal como análisis químico conformacional, potencial electrostático de las moléculas, plegado de proteínas, etc. Un método particular de la invención comprende analizar la estructura tridimensional de RANKL para sitios probables de fijación de sustratos, síntesis de una nueva molécula que incorpora un sitio reactivo predictivo, y ensayo de la nueva molécula como se ha descrito arriba.

Además, como se muestra en los ejemplos de esta memoria, formas solubles de RANKL serán útiles para inducir la maduración de células dendríticas (DC), y para mejorar su capacidad alo-estimulante. De acuerdo con ello, las proteínas RANKL serán útiles en el aumento de una respuesta inmunológica, y pueden utilizarse para estos propósitos sea ex vivo (es decir, en la obtención de células tales como DC de un individuo, exposición de las mismas a un antígeno y citoquinas ex vivo, y readministración de las mismas al individuo) o in vivo (es decir, como un adyuvante de vacuna que aumentará la inmunidad humoral y/o celular). RANKL será útil también para promover la viabilidad de las células T en presencia de TGFB, que será útil también en la regulación de una respuesta inmunológica.

Expresión de RANKL Recombinante

Las proteínas de la presente invención se producen preferiblemente por métodos de DNA recombinante mediante inserción de una secuencia de DNA que codifica la proteína RANKL o un análogo de la misma en un vector de expresión recombinante y expresión de la secuencia de DNA en un sistema de expresión recombinante en condiciones que promueven la expresión. Las secuencias de DNA que codifican las proteínas proporcionadas por esta invención pueden ensamblarse a partir de fragmentos de cDNA y enlazadores oligonucleotídicos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, a fin de proporcionar un gen sintético que es susceptible de ser insertado en un vector de expresión recombinante y expresarse en una unidad recombinante de transcripción.

Vectores de expresión recombinantes incluyen fragmentos de DNA sintéticos o derivados de cDNA, que codifican RANKL, u homólogos, muteínas o análogos bioequivalentes de los mismos, enlazados operativamente a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados derivados de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Tales elementos reguladores incluyen un promotor de transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de fijación de ribosoma de mRNA adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción, como se describe en detalle más adelante. Adicionalmente, puede incorporarse la aptitud para replicarse en un hospedador, conferida usualmente por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes.

Las regiones de DNA están enlazadas operativamente cuando las mismas están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el DNA de un péptido de señal (conductor secretorio) está enlazado operativamente a DNA para un polipéptido si se expresa como precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de fijación de ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo está posicionado de tal modo que permite la traducción. Por regla general, enlazado operativamente significa contiguo y, en el caso de conductores secretores, contiguo y en marco de lectura. Las secuencias de DNA que codifican RANKL, u homólogos o análogos de las mismas que deben expresarse en un microorganismo no contendrán preferiblemente intrón alguno que pudiera terminar prematuramente la transcripción del DNA en mRNA.

Vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del vector de clonación pBR322 bien conocido (ATCC 37017). Vectores comerciales de este tipo incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de "cadena principal" pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural a expresar. E. coli se transforma típicamente utilizando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona por tanto medios simples para identificación de células transformadas.

Los promotores utilizados comúnmente en vectores de expresión microbiana recombinantes incluyen el sistema de promotores de \beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), el sistema del promotor triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; y EPA 36.776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor P_{L} del fago \lambda y el represor termolábil cI857ts. Vectores plasmídicos disponibles de la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor P_{L} \lambda incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092) y pPLc28, residente en E. coli RR1 (ATCC 53082).

Secuencias de promotores adecuados en vectores de levadura incluyen los promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato-quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfo-glicerato-mutasa, piruvato-quinasa, triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa, y glucoquinasa. Vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en R. Hitzeman et al., EPA 73657.

Vectores de levadura preferidos pueden ensamblarse utilizando secuencias de DNA a partir de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) y secuencias de DNA de levadura que incluyen un promotor ADH2 reprimible por glucosa y un conductor de secreción del factor \alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). El conductor del factor \alpha de levadura, que dirige la secreción de proteínas heterólogas puede insertarse entre el promotor y el gen estructural para ser expresado. Véase, v.g., Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia conductora puede modificarse de modo que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia conductora a genes extraños.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción en vectores de expresión a utilizar en la transformación de células de vertebrados pueden ser proporcionadas por fuentes virales. Por ejemplo, promotores e intensificadores utilizados comúnmente se derivan de Polyoma, Adenovirus 2, el Virus 40 de los Simios (SV40), y citomegalovirus humano. Secuencias de DNA derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen de SV40, el promotor precoz y tardío, el intensificador, el sitio de remodelación y los sitios de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para expresión de una secuencia de DNA heteróloga. Los promotores precoz y tardío son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento que contiene también el origen de replicación viral de SV40 (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Pueden utilizarse también fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio BglI localizado en el origen de replicación viral. Adicionalmente, el promotor genómico viral, las secuencias de control y/o de señal pueden utilizarse, con tal que tales secuencias de control sean compatibles con la célula hospedadora seleccionada. Vectores ilustrativos pueden construirse como se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983).

Un sistema útil para expresión estable a alto nivel de cDNAs receptores de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127 puede construirse sustancialmente como ha sido descrito por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Se hace referencia a un vector eucariota preferido para expresión de DNA de RANKL como pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991), e incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), y el virus Epstein-Barr (EBV). Otros vectores preferidos incluyen pDC409 y pDC410, que se derivan de pDC406. pDC410 se derivó de pDC406 sustituyendo el origen de replicación de EBV con secuencias que codificaban el antígeno T grande de SV40. pDC409 difiere de pDC406 en que un sitio de restricción Bgl II fuera del sitio de clonación múltiple ha sido delecionado, haciendo único el sitio Bgl II dentro del sitio de clonación múltiple.

Una línea de células útil que permite la replicación episómica de vectores de expresión, tales como pDC406 y pDC409, que contienen el origen de replicación de EBV, es CV-1/EBNA (ATCC CRL10478). La línea de células CV-1/EBNA se derivó por transfección de la línea de células CV-1 con un gen que codificaba el antígeno 1 nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA-1) y expresaba constitutivamente EBNA-1 dirigido por el intensificador/promotor inmediato-precoz de CMV humano.

Células Hospedadoras

Las células hospedadoras transformadas son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión construidos utilizando técnicas de DNA recombinante y que contienen secuencias que codifican las proteínas de la presente invención. Las células hospedadoras transformadas pueden expresar la proteína deseada (RANKL, u homólogos o análogos de la misma), pero las células hospedadoras transformadas para propósitos de clonación o amplificación del DNA de la invención no precisan expresar la proteína. Las proteínas expresadas se secretarán preferiblemente en el sobrenadante de cultivo, dependiendo del DNA seleccionado, pero pueden depositarse en la membrana celular.

Células hospedadoras adecuadas para expresión de proteínas incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores, bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo E. coli o Bacillus spp. Las células eucariotas superiores incluyen líneas de células establecidas de origen mamífero como se describe más adelante. Los sistemas de traducción exentos de células podrían emplearse también para producir proteínas utilizando RNAs derivados de las construcciones de DNA descritas en esta memoria. Vectores apropiados de clonación y expresión para uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, y de mamífero, han sido descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripción pertinente se incorpora por la presente como referencia.

Pueden utilizarse hospedadores de expresión procariotas para expresión de RANKL, u homólogos o análogos de la misma que no requieren procesamiento extensivo proteolítico y de disulfuro. Vectores de expresión procariotas comprenden generalmente uno o más marcadores fenotípicos seleccionables, por ejemplo un gen que codifica proteínas que confieren resistencia a antibióticos o que suministra un requerimiento autotrófo, y un origen de replicación reconocido por el hospedador que asegura la amplificación dentro del hospedador. Hospedadores procariotas adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque pueden emplearse también otros como cuestión de elección.

RANKL recombinante puede expresarse también en hospedadores de levadura, preferiblemente de las especies Saccharomyces, tales como S. cerevisiae. Levaduras de otros géneros, tales como Pichia o Kluyveromyces pueden emplearse también. Los vectores de levadura contendrán generalmente un origen de replicación a partir del plásmido de levadura 2\mu o una secuencia de replicación autónoma (ARS), promotor, DNA codificante de la proteína, secuencias para poliadenilación y terminación de la transcripción, y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levadura incluirán un origen de replicación y un marcador seleccionable que permita la transformación tanto de la levadura como de E. coli, v.g. el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, y un promotor derivado de un gen de levadura fuertemente expresado que induce la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona luego un entorno eficaz para detección de la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

Protocolos adecuados de transformación de levadura son conocidos por los expertos en la técnica: una técnica ilustrativa ha sido descrita por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, seleccionando transformantes Trp^{+} en un medio selectivo constituido por 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo. Las cepas hospedadoras transformadas por vectores que comprenden el promotor ADH2 pueden dejarse crecer para la expresión en un medio rico constituido por 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, y 1% de glucosa suplementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre después de agotamiento del medio glucosa. Los sobrenadantes de levadura brutos se recogen por filtración y se mantienen a 4ºC antes de la purificación ulterior.

Diversos sistemas de cultivo de células de mamífero o de insecto pueden emplearse para expresar la proteína recombinante. Sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto han sido revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), y otras líneas de células capaces de expresar un vector apropiado que incluyen, por ejemplo, las líneas de células CV-1/EBNA (ATCC CRL10478), L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor e intensificador adecuado enlazado al gen a expresar, y otras secuencias 5' o 3' flanqueantes no transcritas, y secuencias 5' o 3' no traducidas, tales como los sitios de fijación de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de remodelación, y secuencias de terminación de la transcripción.

Purificación de RANKL recombinante

RANKL purificada, y homólogos o análogos de la misma se preparan por cultivo de sistemas hospedador/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinantes de los DNAs de la presente invención, que se purifican luego a partir de los medios de cultivo o extractos de células. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en el medio de cultivo pueden concentrarse primeramente utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.

Después del paso de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una molécula de proteína o de lectina o anticuerpo de contraestructura unida a un soporte adecuado. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio de anión, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse un paso de intercambio de catión. Cambiadores de catión adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía de filtración con gel proporciona también un medio de purificación de las proteínas de la
invención.

La cromatografía de afinidad es un método particularmente preferido de purificación de RANKL y homólogos de la misma. Por ejemplo, una RANKL expresada como proteína de fusión que comprende una región de inmunoglobulina Fc puede purificarse utilizando cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G. Además, una proteína RANKL que comprende un dominio de oligomerización de cremallera puede purificarse en una resina que comprende un anticuerpo específico para el dominio de oligomerización de cremallera. Anticuerpos monoclonales contra la proteína RANKL pueden ser útiles también en purificación por cromatografía de afinidad, utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. Puede utilizarse también un ligando para preparar una matriz de afinidad para purificación de RANKL por afinidad.

Finalmente, pueden emplearse uno o más pasos de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios RP-HPCL hidrófobos, v.g., gel de sílice que tiene grupos colgantes metilo u otros grupos alifáticos, para purificar ulteriormente una composición de RANKL. Algunos o la totalidad de los pasos de purificación que anteceden, en diversas combinaciones, pueden emplearse también para proporcionar una proteína recombinante homogénea.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aísla usualmente por extracción inicial a partir de pelets de células, seguida por uno o más pasos de concentración, salificación, e intercambio acuoso de iones o cromatografía de exclusión de tamaños. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para los pasos de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteína recombinante pueden someterse a disrupción por cualquier método conveniente, con inclusión de sometimiento a ciclos congelación-descongelación, tratamiento por ultrasonidos, disrupción mecánica, o uso de agentes de lisis celular.

La fermentación de levaduras que expresan la proteína de la invención como una proteína secretada simplifica notablemente la purificación. La proteína recombinante secretada que resulta de una fermentación en gran escala puede purificarse por métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos pasos HPLC secuenciales de fase inversa para purificación de GM-CSF humano recombinante en una columna HPLC preparativa.

La proteína sintetizada en cultivo recombinante se caracteriza por la presencia de componentes celulares, con inclusión de proteínas, en cantidades y de un carácter que dependen de los pasos de purificación realizados para recuperar la proteína de la invención a partir del cultivo. Estos componentes serán ordinariamente de origen levadura, procariota o eucariota superior no humano, y preferiblemente están presentes en cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de aproximadamente 1 por ciento en peso. Adicionalmente, el cultivo de células recombinantes permite la producción de las proteínas de la invención exentas de otras proteínas que pueden estar asociadas normalmente con las proteínas cuando se encuentran en la naturaleza en las especies de origen.

Usos y Administración de las Composiciones RANKL

La presente invención proporciona métodos de utilización de composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de una proteína y un diluyente y vehículo adecuado, y métodos para regulación de una respuesta inmunológica o inflamatoria. Se contempla también el uso de RANKL en asociación con receptores de citoquinas o citoquinas solubles, u otras moléculas inmunorreguladoras.

Para uso terapéutico, la proteína purificada se administra a un paciente, preferiblemente un humano, para tratamiento de una manera apropiada para la indicación. Así, por ejemplo, composiciones de proteína RANKL administradas para regular la función inmunitaria pueden administrarse por inyección de bolus, infusión continua, liberación sostenida desde implantes, u otra técnica adecuada. Típicamente, un agente terapéutico se administrará en la forma de una composición que comprende RANKL purificada, en asociación con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales vehículos serán no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones
empleadas.

Ordinariamente, la preparación de tales composiciones proteínicas implica combinación de la proteína de la invención con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de peso molecular bajo (menor que aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos con inclusión de glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con seroalbúmina coespecífica son diluyentes ilustrativos apropiados. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado utilizando soluciones excipientes apropiadas (v.g., sacarosa) como diluyentes. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse en pruebas. La cantidad y frecuencia de administración dependerán, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación de que se trate, la respuesta deseada, el estado del paciente, etcétera.

Como se muestra en esta memoria, RANKL tiene efectos beneficiosos sobre diversas células importantes en el sistema inmunitario. De acuerdo con ello, RANKL puede administrarse a un individuo como un adyuvante de vacuna, o como un agente terapéutico para regular en el sentido creciente una respuesta inmunológica, por ejemplo, una enfermedad infecciosa. Además, se ha encontrado que NF-\kappaB juega un papel protector en la prevención de la muerte apoptótica de las células inducida por TNF-\alpha o quimioterapia. De acuerdo con ello, los agonistas de RANK (es decir, RANKL y anticuerpos agonistas) serán útiles en la protección de las células que expresan RANK contra los efectos negativos de la quimioterapia o la presencia de niveles altos de TNF-\alpha tal como sucede en la sepsis (v.g., a saber, Barinaga, Science 274: 724, 1996, y los artículos de Beg y Baltimore y Wang et al., páginas 782 y 784 del mismo ejemplar de Science).

Los ejemplos que siguen se ofrecen a modo de ilustración, y no con carácter de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden hacerse variaciones de la invención materializada en los ejemplos, especialmente a la vista de la doctrina de las diversas referencias citadas en esta memoria, cuyas descripciones se incorporan por referencia.

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Ejemplo 1

El ejemplo describe la identificación y el aislamiento de un DNA codificante de un nuevo miembro de la superfamilia de receptores TNF. Una inserción de cDNA parcial con un marco de lectura abierto predicho que tiene cierta semejanza con CD40 (un antígeno de la superficie celular presente en la superficie de las células B humanas tanto normales como neoplásticas, que se ha demostrado juega un papel importante en la proliferación y diferenciación de las células B; Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), se identificó en una base de datos que contenía información de secuencias de cDNAs generados por células dendríticas (DC) derivadas de médula ósea humana. La inserción se separó del vector por digestión con endonucleasas de restricción, se purificó en gel, se marcó con ^{32}P, y se utilizó para hibridación a transferencias de colonias generadas a partir de una genoteca de cDNA de DC que contenía inserciones mayores de cDNA utilizando técnicas de hibridación y lavado de alta severidad (hibridación en 5 x SSC, 50% de formamida a 42ºC durante una noche, lavado en 0,5 x SSC a 63ºC); otras condiciones adecuadas de alta severidad se describen en Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 1989), 9,52-9,55. Los experimentos iniciales produjeron un clon al que se hizo referencia como 9D-8A (SEQ ID NO: 1); el análisis subsiguiente indicó que este clon contenía la totalidad excepto el extremo 5' de un cDNA nuevo, con secuencia de intrones predicha en el extremo 5' final (nucleótidos 1-92 de SEQ ID NO: 1). Se realizaron hibridaciones de colonias adicionales, y se aisló un segundo clon. El segundo clon, al que se hizo referencia como 9D-15C (SEQ ID NO: 3), contenía el extremo 5' sin interrupción de intrones, pero no el extremo 3' entero. SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de una proteína de longitud total basada en la alineación de las secuencias solapantes de SEQ ID NOs. 1 y 3.

La proteína codificada se designó RANK, para activador del receptor de NF-\kappaB. El cDNA codifica una proteína transmembranal predicha de Tipo 1 que tiene 616 residuos de aminoácidos, con una secuencia de señal predicha de 24 aminoácidos (el sitio de escisión predicho por el ordenador se encuentra detrás de Leu24), un dominio extracelular de 118 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 383 aminoácidos. La región extracelular de RANK exhibía una homología de aminoácidos importante (38,5% de identidad, 52,3% de semejanza) a CD40. Un vector de clonación (pBluescript SK^{-}) que contenía la secuencia RANK humana, designada pBluescript:huRANK (en E. coli DH10B), se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 20 de febrero de 1996, bajo los términos del Tratado de Budapest, y ha recibido el número de acceso 98285.

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Ejemplo 2

Este ejemplo describe la realización de una construcción de DNA de RANK para expresar una proteína de fusión RANK/Fc. Se construyó una forma soluble de RANK fusionada a la región Fc de IgG_{1} humana en el vector de expresión de mamífero pDC409 (USSN 08/571.579). Este vector de expresión codifica la secuencia conductora del marco de lectura abierto del citomegalovirus (CMV) R27080 (SEQ ID NO: 9), seguido por los aminoácidos 33-213 de RANK, seguido por una forma mutada del dominio constante de IgG_{1} humana, que exhibe afinidad reducida para los receptores Fc (SEQ ID NO: 8; para la proteína de fusión, la porción Fc de la construcción consistía en Arg3 hasta Lys232). Se preparó también un vector de expresión alternativo que abarca los aminoácidos 1-213 de RANK (utilizando la secuencia conductora nativa) seguido por la muteína IgG_{1}. Se encontró que ambos vectores de expresión inducían niveles altos de expresión de la proteína de fusión RANK/Fc en las células transfectadas.

Para obtener la proteína RANK/Fc, se transfecta un plásmido de expresión RANK/Fc en células CV-1/EBNA, y se recogen los sobrenadantes durante aproximadamente 1 semana. La proteína de fusión RANK/Fc se purifica por medios bien conocidos en la técnica para purificación de las proteínas de fusión Fc, por ejemplo, por cromatografía en columna de Sepharose con proteína A, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (a saber, Pharmacia, Uppsala, Suecia). La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida indicaba que la proteína RANK/Fc purificada migraba con un peso molecular de \sim55 kDa en presencia de un agente reductor, y con un peso molecular de \sim110 kDa en ausencia de un compuesto reductor.

La secuenciación del aminoácido N-terminal de la proteína purificada producida utilizando el conductor R27080 de CMV demostró un 60% de escisión después de Ala20, 20% de escisión después de Pro22 y 20% de escisión después de Arg28 (que es el sitio de escisión de Furina; los residuos de aminoácidos se refieren a SEQ ID NO: 9); el análisis de aminoácidos N-terminal de la proteína de fusión expresada con el conductor nativo demostró escisión predominantemente después de Gln25 (80% después de Gln25 y 20% después de Arg23; los residuos de aminoácidos hacen referencia a SEQ ID NO: 6, RANK de longitud total). Ambas proteínas de fusión eran capaces de fijarse a un ligando para RANK de manera específica (a saber, se fijaban a la superficie de diversas líneas de células tales como una línea de células de timoma de murino, EL4), lo que indicaba que la presencia de aminoácidos adicionales en el término N de RANK no interfiere con su aptitud para fijarse a RANKL. Además, la construcción que comprendía el conductor de CMV codificaba RANK que comenzaba en el aminoácido 33: así pues, se espera que un péptido de RANK que tenga un término N en un aminoácido comprendido entre Arg23 y Pro33, inclusive, sea capaz de fijarse a un ligando para RANK de manera específica.

Otros miembros de la superfamilia de receptores TNF tienen una región de aminoácidos entre el dominio transmembranal y el dominio de fijación de ligandos al que se hace referencia como región "espaciadora", que no es necesaria para la fijación de ligandos. En RANK, los aminoácidos comprendidos entre 196 y 213 se predice que forman una región espaciadora de este tipo. De acuerdo con ello, se espera que una forma soluble de RANK que termina con un aminoácido en esta región retenga la capacidad para fijarse a un ligando para RANK de una manera específica. Los aminoácidos C-terminales preferidos para péptidos RANK solubles se seleccionan del grupo constituido por los aminoácidos 213 y 196 de SEQ ID NO: 6, aunque pueden utilizarse como término C otros aminoácidos comprendidos en la región espaciadora.

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Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales contra RANK. Preparaciones de RANK recombinante purificada, por ejemplo, o células transfectadas que expresaban niveles altos de RANK, se emplean para generar anticuerpos monoclonales contra RANK utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas en la Patente U.S. 4.411.993. Puede utilizarse también como inmunógeno DNA que codifica RANK, por ejemplo, como ha sido revisado por Pardoll y Beckerleg en Immunity 3: 165, 1995. Tales anticuerpos serán probablemente útiles en la interferencia con la señalización inducida por RANK (anticuerpos antagonistas o bloqueantes) o en la inducción de una señal por reticulación de RANK (anticuerpos agonistas, como componentes de ensayos de diagnóstico o de investigación para RANK o actividad de RANK, o en purificación de RANK por afinidad.

Para inmunizar roedores, se emulsiona un inmunógeno RANK en un adyuvante (tal como adyuvante de Freund completo o incompleto, alumbre, u otro adyuvante, tal como el adyuvante R700 de Ribi (Ribi, Hamilton, MT), y se inyecta en cantidades que van desde 10 a 100 \mug subcutáneamente en un roedor seleccionado, por ejemplo ratones Balb/c o ratas Lewis. El DNA puede administrarse intradérmicamente (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519, 1994) o por vía intramuscular (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156, 1993); se ha encontrado que la solución salina es un diluyente adecuado para antígenos basados en DNA. De 10 días a 3 semanas más tarde, los ratones inmunizados se refuerzan con inmunógeno adicional y se refuerzan después periódicamente de acuerdo con un programa de inmunización semanal, bisemanal o cada tercera semana.

Se toman periódicamente muestras de suero por sangría retro-orbital o escisión en el extremo de la cola para sometimiento a test por ensayo de transferencia de puntos (sándwich de anticuerpos), ELISA (ensayo de inmunosorbente unido a enzima), inmunoprecipitación, u otros ensayos adecuados, con inclusión del análisis FACS. Después de la detección de un título de anticuerpos apropiado, los animales positivos reciben una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. Tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se recogen los esplenocitos, y se fusionan a una línea de células de mieloma murina (v.g., NS1 o preferiblemente Ag 8.653 [ATCC CRL1580]). Las líneas de células de hibridoma generadas por este procedimiento se extienden en placas de microtitulación múltiples en un medio selectivo (por ejemplo, uno que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina, o HAT) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos mieloma-mieloma, e híbridos esplenocito-esplenocito.

Los clones de hibridoma así generados pueden someterse a cribado por ELISA respecto a reactividad con RANK, por ejemplo, por adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al. Immunochem. 8: 871 (1971) y en la Patente U.S. 4.703.004. Una técnica de cribado preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckman et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990). Los clones positivos se inyectan luego en las cavidades peritoneales de roedores singénicos para producir ascitis que contiene concentraciones elevadas (>1 mg/ml) del anticuerpo monoclonal anti-RANK. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse por precipitación con sulfato de amonio seguida por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse también cromatografía de afinidad basada en la fijación del anticuerpo a proteína A o proteína G, al igual que cromatografía de afinidad basada en fijación a la proteína RANK.

Se generaron anticuerpos monoclonales utilizando la proteína de fusión RANK-Fc como inmunógeno. Estos reactivos se sometieron a cribado para confirmar la reactividad contra la proteína RANK. Utilizando los métodos descritos en esta memoria para monitorizar la actividad de los mAbs, se aislaron tanto bloqueantes (es decir, anticuerpos que se fijan a RANK e inhiben la fijación de un ligando a RANK) como no bloqueantes (es decir, anticuerpos que se fijan a RANK y no inhiben la fijación de ligando).

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Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la inducción de la actividad de NF-\kappaB por RANK en células 296/EBNA (la línea de células se derivó por transfección de la línea de células 293 con un gen que codificaba el antígeno-1 nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA-1) que expresan constitutivamente EBNA-1 impulsado por el intensificador/promotor inmediato-precoz de CMV humano). La activación de la actividad de NF-\kappaB se midió en las células 293/EBNA esencialmente como ha sido descrito por Yao et al., (Immunity 3: 811, 1995). Se prepararon extractos nucleares y se analizaron respecto a la actividad de NF-\kappaB por un ensayo de retardación en gel utilizando un oligonucleótido de 25 pares de bases que abarcaba los sitios de fijación de NF-\kappaB. Se sembraron dos millones de células en cápsulas de 10 cm dos días antes de la transfección del DNA y se cultivaron en medio DMEM-F12 que contenía 2,5% de FBS (suero bovino fetal). Las transfecciones de DNA se realizaron como se describe en esta memoria para los ensayos del promotor/informador
IL-8.

Se prepararon extractos nucleares por solubilización de núcleos aislados con NaCl 400 mM (Yao et al., supra). Los oligonucleótidos que contenían un sitio de fijación de NF-\kappaB se reasociaron y marcaron terminalmente con ^{32}P utilizando polinucleótido-quinasa de DNA T4. Las reacciones de desplazamiento de movilidad contenían 10 \mug de extracto nuclear, 4 mg de poli(dI-dC) y 15.000 cpm de oligonucleótido bicatenario marcado y se incubaron a la temperatura ambiente durante 20 minutos. Los complejos proteína-DNA resultantes se resolvieron en un gel de poliacrilamida nativo al 6% en tampón 0,25 X Tris-borato-EDTA.

La sobreexpresión de RANK dio como resultado la inducción de la actividad de NF-\kappaB como se muestra por un desplazamiento apropiado en la movilidad de la sonda reactiva en el gel. Se observaron resultados similares cuando se excitó RANK por un ligando que fija y traduce una señal a las células que expresan el receptor (es decir, por co-transfección de células con DNA de RANK humano y RANKL murino; véase el Ejemplo 7 más adelante), y sería de esperar que ocurriera cuando la excitación se realiza con anticuerpos agonistas.

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Ejemplo 5

Este ejemplo describe un sistema génico promotor/informador basado en el promotor humano de Interleuquina-8 (IL-8) utilizado para analizar la activación de la transcripción génica in vivo. Se sabe que la inducción de la transcripción del gen de IL-8 humano por las citoquinas Interleuquina-1 (IL-1) o el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha) depende de sitios de fijación de los factores de transcripción NF-\kappaB y NF-IL-6 intactos. La fusión del promotor con un cDNA que codifica el receptor IL-4 murino (mIL-4R) permite la medida de la activación del promotor por detección de la proteína informadora heteróloga (mIL-4R) en la superficie celular de las células transfectadas.

Se transfectan células epiteliales de riñón humano (293/EBNA) (por el método de DEAE/DEXTRANO) con plásmidos que codifican: 1) la construcción informador/promotor (a la que se hace referencia como pIL-8rep), y 2) el o los cDNAs de interés. Las concentraciones de DNA se mantienen siempre constantes por la adición de DNA de vector vacío. Las células 293/EBNA se extienden en placas a una densidad de 2,5 x 10^{4} células/ml (3 ml/pocillo) en una placa de 6 pocillos y se incuban durante 2 días antes de la transfección. Dos días después de la transfección, se detecta el receptor mIL-4 por un radioinmunoensayo (RIA) descrito más adelante.

En un experimento de este tipo, las células 293/EBNA se co-transfectaron con DNA codificante de RANK y con DNA codificante de RANKL (véase el Ejemplo 7 más adelante). La co-expresión de este receptor y su contraestructura por las células da como resultado la activación del proceso de señalización de RANK. Para tales estudios de co-transfección, la concentración de DNA/pocillo para la transcripción de DEAE era como sigue: 40 ng de pIL-8rep (pBluescript SK-vector (Stratagene)]; 0,4 ng de CD40 (cDNA codificante de CD40, un receptor de control; vector pCDM8); 0,4 ng de RANK (DNA codificante de RANK; vector pDC409), y o bien 1-50 ng de CD40L (DNA que codifica el ligando para CD40, que actúa como control positivo cuando se somete a co-transfección con CD40 y como control negativo cuando se somete a co-transfección con RANK; en pDC304) o RANKL (DNA codificante de un ligando para RANK; en pDC406). Pueden realizarse experimentos similares utilizando RANKL soluble o anticuerpos agonistas para RANK a fin de excitar las células transfectadas con RANK.

Para el RIA específico de mIL-4R, se marca un anticuerpo monoclonal reactivo con mIL-4R con ^{125}I por un método de conjugación con cloramina T; la actividad específica resultante es típicamente 1,5 x 10^{16} cpm/nmol. Después de 48 horas, las células transfectadas se lavan una sola vez con medio (DMEM/F12, 5% FBS). Los sitios de fijación inespecífica se bloquean por la adición de medio de fijación precalentado que contiene 5% de leche desnatada seca e incubación a 37ºC/5% CO_{2} en una incubadora de cultivo de tejidos durante 1 hora. Se decanta el medio de bloqueo y se añade a las células tampón de fijación que contiene ^{125}I anti-mIL-4R (clon M1; IgG1 de rata) y se incuba con sacudidas a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación de las células con el anticuerpo radiomarcado, se lavan concienzudamente las células con tampón de fijación (2X) y dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se someten a lisis en 1 ml de NaOH 0,5M, y se mide la radiactividad total con un contador gamma.

Utilizando este ensayo, las células 293/EBNA co-transfectadas con DNAs que codificaban RANK demostraron activación transcripcional, como se muestra por la detección de muIL-4R en la superficie celular. La sobreexpresión de RANK dio como resultado la transcripción de muIL-4R, como lo hizo la excitación de RANK por RANKL. Se observaron resultados similares cuando se excita RANK por anticuerpos agonistas.

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Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la asociación de RANK con proteínas TRAF. La interacción de RANK con proteínas citoplásmicas TRAF se demostró por ensayos de co-inmunoprecipitación esencialmente como ha sido descrito por Hsu et al. (Cell 84: 299; 1996). Resumidamente, se co-transfectaron células 293/EBNA con plásmidos que dirigen la síntesis de RANK y TRAF2 (FLAG®; SEQ ID NO: 7) marcado con epítope, o TRAF3. Dos días después de la transfección, se marcaron las proteínas de la superficie con éster de biotina, y se lisaron las células en un tampón que contenía 0,5% de NP-40. RANK y las proteínas asociadas con este receptor se inmunoprecipitaron con anti-RANK, se lavaron concienzudamente, se resolvieron por separación electroforética en un gel de SDS-poliacrilamida al 6-10% y se transfirieron por electroforesis a una membrana de nitrocelulosa para transferencia Western. La asociación de las proteínas TRAF2 y TRAF3 con RANK se visualizó por sondeo de la membrana con un anticuerpo que reconoce específicamente el epítope FLAG®. TRAFs 2 y 3 no producían inmunoprecipitado con anti-RANK en ausencia de la expresión de RANK.

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Ejemplo 7

Este ejemplo describe el aislamiento de un ligando para RANK, al que se hace referencia como RANKL, por clonación de la expresión directa. El ligando se clonó esencialmente como se describe en USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994 (cuya descripción relevante se incorpora por referencia en esta memoria), para CD40L). Resumidamente, se preparó una genoteca a partir de un clon de una línea de células de timoma de ratón EL-4 (ATCC TIB 39), denominada EL-40.5, derivada por clasificación 5 veces con la proteína de fusión CD40/Fc biotinilada en un FACS (clasificador de células activado por fluorescencia). La genoteca de cDNA se preparó utilizando metodología estándar: el DNA plasmídico se aisló y se transfectó en células CV1-EBNA sub-confluentes utilizando un método de DEAE-dextrano. Se cribaron los transfectantes por autorradiografía de diapositivas en cuanto a la expresión de RANKL utilizando un método de fijación en dos pasos con proteína de fusión RANK/Fc como la preparada en el Ejemplo 2, seguido por anticuerpo anti-IgG humana de cabra radioyodado.

Se aisló y se secuenció un clon que codificaba una proteína que fijaba específicamente RANK; el clon se designó 11H. Un vector de expresión que contenía la secuencia RANKL murina, designado pDC406: muRANK-L (en E. coli DH10B), se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 20 de diciembre de 1996, de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest, y recibió el número de acceso 98284. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos predicha de este clon se ilustran en SEQ ID NO: 10. Este clon no contenía una metionina iniciadora; se obtuvieron clones de longitud total adicionales a partir de una genoteca 7B9 (preparada sustancialmente como se describe en la Patente U.S. 5.599.905, expedida el 4 de febrero de 1997); se encontró que la región 5' era idéntica a la de RANKL humana como se muestra en SEQ ID no: 12, aminoácidos 1 a 22, excepto por la sustitución e un Gly en lugar de un Thr en el residuo 9.

Este ligando es útil para evaluar la capacidad de RANK para fijarse a RANKL por numerosos ensayos diferentes. Por ejemplo, pueden utilizarse células transfectadas que expresan RANKL en un ensayo FACS (o un ensayo similar) para evalular la capacidad de RANK soluble en la fijación de RANKL. Además, pueden prepararse formas solubles de RANKL y utilizarse en ensayos que son conocidos en la técnica (a saber, los ensayos ELISA o BIAcore esencialmente como se describe en el documento USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994). RANKL es útil también en la purificación de RANK por afinidad, y como reactivo en métodos para medir los niveles de RANK en una muestra. RANKL soluble es útil también en la inducción de la activación de NF-\kappaB y por tanto en la protección de las células que expresan RANK contra la apoptosis.

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Ejemplo 8

Este ejemplo describe el aislamiento de un ligando humano de RANK (RANKL) utilizando una técnica basada en PCR. Se utilizaron iniciadores oligonucleotídicos específicos del ligando murino de RANK en reacciones PCR que utilizaban como moldes cDNAs de la primera cadena derivados de una línea de células humana. Los iniciadores correspondían a los nucleótidos 478-497 y al complemento de los nucleótidos 858-878 del ligando RANK murino (SEQ ID NO: 10). Una banda amplificada de aproximadamente 800 pb de longitud procedente de una reacción que utilizaba la línea de células epidermoides humanas KB (ATCC CCL-17) se purificó en gel, y se determinó su secuencia de nucleótidos; la secuencia tenía un 85% de identidad con la región correspondiente del ligando RANK murino, confirmando que el fragmento procedía de RANKL humana.

Para obtener cDNAs de RANKL humana de longitud total, se radiomarcaron dos oligonucleótidos específicos de RANKL humana derivados de la secuencia de nucleótidos del producto PCR KB, y se utilizaron como sondas de hibridación para cribar una genoteca de cDNA de PBL humano preparada en lambda gt10 (Stratagene, La Jolla, CA), sustancialmente como se describe en la Patente US 5.599.905, expedida el 4 de febrero de 1997. Se identificaron y purificaron varias placas de hibridación positivas, se subclonaron sus insertos en pBluescript SK^{-} (Stratagene, La Jolla, CA), y se determinó su secuencia de nucleótidos. Se encontró un aislado, PBL3) que codificaba la mayor parte de la RANKL humana predicha, pero se encontró que faltaban aproximadamente 200 pb de la región codificante 5'. Se encontró un segundo aislado, PDL5, que codificaba gran parte de la RANKL humana predicha, con inclusión del extremo 5' entero y 200 pb adicionales de secuencia 5' no traducida.

El extremo 5' de PBL5 y el extremo 3' de PBL3 se ligaron uno a otro para formar un cDNA de longitud total que codificaba RANKL humana. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predichas del ligando RANK humano de longitud total se muestran en SEQ ID NO: 12. El ligando RANK humano comparte 83% de identidad de nucleótidos y 84% de identidad de aminoácidos con el ligando RANK murino. Un vector plasmídico que contenía la secuencia RANKL humana, designado pBluescript:huRANK-L (en E. coli DH10B), se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 11 de marzo de 1997 de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest, y recibió el número de acceso 98354.

RANKL murina y humana son proteínas transmembranales de Tipo 2. RANKL murina contiene un dominio intracelular predicho de 48 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 247 aminoácidos. RANKL humana contiene un dominio intracelular de 47 aminoácidos predicho, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 249 aminoácidos.

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Ejemplo 9

Este ejemplo describe el mapeado cromosómico de RANK humana utilizando estrategias de mapeado basadas en PCR. Se realizaron las asignaciones cromosómicas humanas iniciales utilizando iniciadores PCR específicos de RANK y RANKL y un kit BIOS de DNA PCRable Híbrido de Células Somáticas procedente de Laboratories (New Haven, CT), siguiendo las instrucciones del fabricante. RANK mapeaba al cromosoma humano 18; el ligando de RANK mapeaba al cromosoma humano 13. Se analizó un mapeado más detallado utilizando un panel de mapeado híbrido de radiación Genebridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, HuntsVille, AL; descrito en Walter, MA et al., Nature Genetics 7:22-28, 1994). Los datos procedentes de este análisis se sometieron luego electrónicamente al Mapeador Híbrido de Radiación MIT (URL: http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) siguiendo las instrucciones contenidas en dicho documento. Este análisis proporcionaba nombres de marcadores genéticos específicos que, cuando se sometieron electrónicamente al navegador NCBI Entrez (URL: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Entrez/query?db=c&form=0), propor-cionaron las localizaciones específicas del mapa. RANK mapeaba al cromosoma 18q22.1, y RANKL mapeaba al cromosoma 13q14.

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Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales contra RANKL. Se emplean preparaciones de RANKL purificado recombinante, por ejemplo, o células paralizadas que expresan niveles altos de RANKL, para generar anticuerpos monoclonales contra RANKL utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas en la Patente US 4.411.993. DNA codificante de RANKL puede utilizarse también como inmunógeno, por ejemplo, como ha sido revisado por Pardoll y Beckerleg en Immunity 3:165, 1995. Tales anticuerpos serán probablemente útiles en interferencia con la señalización de RANKL (anticuerpos antagonistas o bloqueantes), como componentes de ensayos de diagnóstico o de investigación para RANKL o actividad de RANKL, o en purificación de RANKL por afinidad.

Para inmunizar roedores, se emulsiona el inmunógeno RANKL en un adyuvante (tal como adyuvante de Freund completo o incompleto, alumbre, u otro adyuvante, tal como el adyuvante Ribi R700 (Ribi, Hamilton, MT), y se inyecta en cantidades comprendidas entre 10 y 100 \mug subcutáneamente en un roedor seleccionado, por ejemplo, ratones BALB/c o ratas Lewis. Puede administrarse RNA intradérmicamente (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519, 1994) o por vía intramuscular (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156, 1993); se ha encontrado que la solución salina es un diluyente adecuado para antígenos basados en DNA. De 10 días a 3 semanas después, los ratones inmunizados se refuerzan con inmunógeno adicional y se refuerzan periódicamente después de ello de acuerdo con un protocolo de inmunización semanal, bisemanal o cada tercera semana.

Se toman periódicamente muestras de suero por hemorragia retro-orbital o escisión en el extremo de la cola para someter a test en cuanto al ensayo de transferencia de puntos (sándwich de anticuerpos), ELISA (ensayo de inmunosorbente unido a enzima), inmunoprecipitación, u otros ensayos adecuados, con inclusión de análisis FACS. A continuación de la detección de un título de anticuerpos apropiado, los animales positivos reciben una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. Tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se recogen los esplenocitos, y se fusionan a una línea de células de mieloma murina (v.g., NS1 o preferiblemente Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Las líneas de células de hibridoma generadas por este procedimiento se extienden en placas de microtitulación múltiples en un medio selectivo (por ejemplo, uno que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina, o HAT) para inhibir la purificación de las células no fusionadas, híbridos mieloma-mieloma, e híbridos esplenocito-esplenocito.

Los clones de hibridoma así generados pueden cribarse por ELISA respecto a reactividad con RANKL, por ejemplo, por adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al., Immunochem. 8:871 (1971) y en la Patente US 4.703.004. Una técnica de cribado preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckmam et al., J. Immunol. 144:4212 (1990). Los clones positivos se inyectan luego en las cavidades peritoneales de roedores singénicos para producir ascitis que contiene concentraciones altas (> 1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-RANK. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse por precipitación con sulfato de amonio seguida por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse también cromatografía de afinidad basada en la fijación del anticuerpo a proteína A o proteína G, al igual que la cromatografía de afinidad basada en la fijación a la proteína RANKL. Utilizando los métodos descritos en esta memoria para monitorizar la actividad de los mAbs, se aíslan anticuerpos tanto bloqueantes (es decir, anticuerpos que fijan RANKL e inhiben la fijación a RANK) como no bloqueantes (es decir, anticuerpos que fijan RANKL y no inhiben la fijación).

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Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que la expresión de RANK puede estar regulada en sentido creciente. Se purificaron células T de sangre periférica humana por clasificación mediante citometría de flujo o por selección negativa utilizando cuentas recubiertas de anticuerpo, y se activaron con placas recubiertas con anti-CD3 (OKT3, Dako) o fitohemaglutinina en presencia o ausencia de diversas citoquinas, con inclusión de interleuquina-4 (IL-4), Factor \beta del Crecimiento Transformante (TGF-\beta) y otras citoquinas disponibles comercialmente (IL1-\alpha, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-\gamma, TNF-\alpha). La expresión de RANK se evaluó por FACS en un experimento de evolución temporal desde el día 2 al día 8, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón mAb144 (preparado como se describe en el Ejemplo 3), como se muestra en la tabla siguiente. Los resultados se expresan como "+" a "++++" haciendo referencia al aumento relativo en la intensidad de tinción con anti-RANK. Se realizaron también experimento de doble marcación utilizando a la vez anticuerpos anti-RANK y anti-CD8 o anti-CD4.

TABLA 1 Regulación creciente de RANK por Citoquinas

1

De las citoquinas ensayadas, IL-4 y TGF-\beta aumentaban el nivel de expresión de RANK tanto en células CD8+ citotóxicas como en células DCD4+ adyuvantes, desde el día 4 al día 8. La combinación de IL-4 y TGF-\beta actuaba sinérgicamente para regular en sentido creciente la expresión de este receptor en las células T activadas. Esta combinación particular de citoquinas es secretada por las células T supresoras, y se cree que es importante en la generación de tolerancia (revisado en Mitchison y Sieper, Z. Rheumatol. 54:141, 1995), implicando la interacción de RANK en la regulación de una respuesta inmunológica frente a la tolerancia o la inducción de una respuesta inmunológica activa.

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Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra la influencia de RANK.Fc y hRANKL en el crecimiento de las células T activadas. La adición de TGF\beta a linfocitos T de sangre periférica humana activados con anti-CD3 induce parada de la proliferación y finalmente la muerte de la mayoría de los linfocitos dentro de los primeros pocos días de cultivo. Los autores de la invención ensayaron el efecto de las interacciones RANK:RANKL sobre las células T tratadas con TGF\beta por adición de RANK.Fc o RANKL soluble humana a cultivos de células T.

Se cultivaron células T de sangre periférica humana (7x10^{5} PBT) durante 6 días en placas de 24 pocillos recubiertas con anti-CD3 (OKT3, 5 \mug/ml) y anti-Flag (M1, 5 \mug/ml) en presencia de TGF\beta (1 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml) con o sin hRANKL soluble recombinante marcada con FLAG (1 \mug/ml) o RANK.Fc (10 \mug/ml). La recuperación de células T viables se determinó por conteos triplicados con azul tripán.

La adición de RANK-Fc reducía significativamente el número de células T viables recuperadas al cabo de 6 días, mientras que RANKL aumentaba notablemente la recuperación de células T viables (Figura 1). Así pues, RANKL endógena o exógena aumenta el número de células T viables generadas en presencia de TGF\beta. TGF\beta, junto con IL-4 ha sido implicado en la regulación de la respuesta inmunológica cuando es secretado por el subconjunto T_{H}3/células reguladoras. Se cree que estas células T median la supresión circunstante de las células T efectoras. De acuerdo con ello, RANK y su ligando pueden actuar de una manera auto/paracrina para influir en la tolerancia a las células T. además, se sabe que TGF\beta juega un papel en la evasión del sistema inmunitario efectuada por ciertos organismos patógenos u oportunistas. Además de jugar un papel en el desarrollo de la tolerancia, RANK puede jugar también un papel en la evasión del sistema inmunitario por los patógenos.

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Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra la influencia de la interacción de RANK en las células dendríticas CD1a^{+} (DC). Se generaron células dendríticas (CD) funcionalmente maduras in vitro a partir de progenitores de médula ósea (BM) CD34+. De modo resumido, células BM humanas procedentes de individuos voluntarios sanos normales se fraccionaron por densidad utilizando medio Ficoll y se aislaron por inmunoafinidad células CD34+ utilizando una columna matriz anti-CD34 (Ceprate, CellPro). Las células BM CD34+ se cultivaron luego en GM-CSF humano (20 ng/ml), IL-4 humana (20 ng/ml), TNF-\alpha humano (20 ng/ml), Flt3L humana derivada de CHO (FL; 100 ng/ml) en medio Super McCoy's suplementado con 10% de suero de ternero fetal en una incubadora totalmente humidificada a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 14 días. Se clasificaron luego DC CD1a^{+} y HLA-DR^{+} utilizando un equipo FACStar Plus^{TM}, y se utilizaron para la evaluación biológica de RANK.

En DC CD1a^{+} humanas derivadas de células de la médula ósea CD34^{+}, únicamente un subconjunto (20-30%) de CD1a^{+} DC expresaban RANK en la superficie celular como se evaluó por análisis citométrico de flujo. Sin embargo, la adición de CD40L a los cultivos de DC dio como resultado la expresión de RANK en la superficie de la mayoría de DC CD1a^{+}. Se ha demostrado que CD40L activa DC por intensificación de la formación de aglomerados in vitro, induc-
ción de cambios morfológicos en DC y regulación creciente de la expresión de HLA-DR, CD54, CD58, CD80 y CD86.

La adición de RANKL a los cultivos de DC aumentaba significativamente el grado de agregación de DC y la formación de aglomerados con respecto a los cultivos de control, análogamente a los efectos observados con CD40L (Figura 2). Se cultivaron DC CD1a^{+} humanas clasificadas en un cóctel de citoquinas (GM-CSF, IL-4, TNF-\alpha y FL) (panel superior izquierdo), en cóctel más CD40L (1 \mug/ml) (superior derecho), en cóctel más RANKL (1 \mug/ml) (inferior izquierdo), o en cóctel más RANKL desactivada por calentamiento (\DeltaH) (1 \mug/ml) (inferior derecho) en placas de cultivo de 24 pocillos con fondo plano en 1 ml de medio de cultivo durante 48-72 horas y se fotografiaron luego utilizando un microscopio de inversión. Un aumento en la agregación de DC y la formación de aglomerados por encima de los cultivos de control no era evidente cuando se utilizó RANKL desactivada por calentamiento, lo que indicaba que este efecto era dependiente de la proteína biológicamente activa. Sin embargo, el análisis fenotípico inicial de la expresión de las moléculas de adhesión indicaba que la aglomeración inducida por RANKL no se debía a niveles incrementados de CD2, CD11a, CD54 o CD58.

La adición de RANKL a DC CD1a^{+} aumentaba su capacidad alo-estimuladora en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) al menos de 3 a 18 veces, comparable a DC cultivadas con CD40L (Figura 3). Se incubaron células T alogénicas (1 x 10^{5}) con números variables de DC irradiadas (2000 rad) cultivadas como se ha indicado arriba para la Figura 2 en cápsulas de cultivo de 96 pocillos con fondo redondo en 0,2 ml de medio de cultivo durante 4 días. Los cultivos se pulsaron con 0,5 mCi de [^{3}H]-timidina durante 8 horas y las células se recogieron sobre hojas de fibra de vidrio para conteo en un contador \beta de fase gaseosa. Los conteos de ruido de fondo para las células T o DC cultivadas solas eran < 100 cpm. Los valores representan la media \pm la desviación estándar (SD) de cultivos triplicados. RANKL desactivada por calentamiento no tenía efecto alguno. La actividad alo-estimuladora de DC no aumentaba tampoco cuando se utilizaron RANKL y CD40L en combinación, debido posiblemente a que la capacidad funcional de DC había alcanzado un nivel máximo con cualquiera de las citoquinas sola. Ni RANKL y CD40L intensificaban el crecimiento in vitro de DC a lo largo del periodo de cultivo de 3 días. Al contrario que CD40L, RANKL no aumentaba significativamente los niveles de expresión de HLA-DR ni la expresión de CD80 o CD86.

RANKL puede aumentar la formación de aglomerados de DC y la capacidad funcional sin modular moléculas conocidas implicadas en la adhesión celular (CD18, CD54), presentación de antígeno (HLA-DR) o coestimulación (CD86), todas las cuales están reguladas por señalización mediante CD40/CD40L. La carencia de un efecto sobre la expresión de estas moléculas sugiere que RANKL puede regular la función de DC por uno o más caminos alternativos distintos de CD40/CD40L. Dado que CD40L regula la expresión superficial de RANK o DC generada in vitro, y que CD40L está regulado en el sentido creciente en las células T activadas durante las interacciones celulares DC-T, RANK y su ligando pueden formar una parte importante de la cascada de activación que se induce durante la expansión de las células T mediada por DC. Adicionalmente, el cultivo de DC en RANKL da como resultado niveles reducidos de la expresión de CD1b/c, y niveles incrementados de CD83. Estas dos moléculas están moduladas análogamente durante la maduración de DC por CD40L (Caux et al. J. Exp. Med. 180:1263; 1994), indicando que RANKL induce la maduración de DC.

Se hace referencia a las células dendríticas como células presentadoras de antígeno "profesionales", y tienen una alta capacidad para sensibilizar las células T restringidas por el MHC. Existe un interés creciente en la utilización de células dendríticas ex vivo como adyuvantes de vacunas para enfermedades tumorales o infecciosas (véase, por ejemplo, Romani, et al., J. Exp. Med., 180:83, 1994). Por consiguiente, un agente tal como RANKL que induce la maduración de DC e intensifica la capacidad de las células dendríticas para estimular una respuesta inmunológica será probablemente útil en inmunoterapia de diversas enfermedades.

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Ejemplo 14

Este ejemplo describe el aislamiento del homólogo murino de RANK, al que se hace referencia como muRANK. Se aisló muRANK por una combinación de PCR de especies cruzadas e hibridación de colonias. La conservación de los residuos Cys en las pseudorrepeticiones ricas en Cys de los dominios extracelulares de las proteínas miembros de la superfamilia TNFR se aprovechó para diseñar iniciadores PCR basados en RANK humana a utilizar en cDNAs murinos de la primera cadena procedentes de diversas fuentes. Tanto el iniciador de sentido aguas arriba como el iniciador antisentido aguas abajo se diseñaron de modo que tuvieran sus extremos 3' terminados con residuos Cys.

El iniciador de sentido aguas arriba codificaba los nuecleótidos 272-295 de SEQ ID NO: 5 (región codificante de los aminoácidos 79-86); el iniciador antisentido aguas abajo codificaba el complemento de los nucleótidos 409-427 (región codificante de los aminoácidos 124-130). Se establecieron reacciones PCR estándar y se ejecutaron utilizando estos iniciadores y cDNAs de la primera cadena procedentes de diversas líneas de células murinas o fuentes de tejidos. Se realizaron 30 ciclos de reacción de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 20 segundos. Los productos PCR se analizaron por electroforesis, y se observaron bandas específicas en varias muestras. La banda procedente de una muestra se purificó en gel y la secuenciación del DNA reveló que la secuencia entre los iniciadores era idéntica aproximadamente en un 85% a la secuencia de nucleótidos de RANK humana correspondiente.

Una genoteca de cDNA basada en plásmidos preparada a partir de la línea de epitelio hepático fetal murina FLE18 (una de las líneas de células identificada como positiva en el cribado por PCR) se cribó respecto a cDNAs de RANK de longitud total utilizando sondas oligonucleotídicas específicas de RANK murina derivadas de la secuencia RANK murina determinada por secuenciación del producto PCR. Dos cDNAs, uno de los cuales codificaba el extremo 5', en tanto que el otro codificaba el extremo 3' de RANK murina de longitud total (basado en la comparación de secuencias con el RANK humano de longitud total) se recombinaron para generar un cDNA de RANK murina de longitud total. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de muRANK se muestran en SEQ ID Núms.: 14 y 15.

El cDNA codifica una proteína transmembranal predicha de Tipo 1 que tiene 625 residuos de aminoácidos, con una secuencia señal predicha de 30 aminoácidos, un dominio extracelular de 184 aminoácidos, un dominio extramembranal de 21 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 390 aminoácidos. La región extracelular de muRANK exhibía una homología significativa de aminoácidos (69,7% de identidad, 80,8% de semejanza) con huRANK. Las personas con experiencia en la técnica reconocerán que el sitio de escisión real puede ser diferente del predicho por ordenador; de acuerdo con ello, el terminal N de RANK puede estar comprendido entre el aminoácido 25 y el aminoácido 35.

Otros miembros de la superfamilia de receptores TNF tienen una región de aminoácidos entre el dominio transmembranal y el dominio de fijación de ligando al que se hace referencia como región "espaciadora", que no es necesaria para la fijación de ligandos. En muRANK, se predice que los aminoácidos comprendidos entre 197 y 214 forman una región espaciadora de este tipo. De acuerdo con ello, se espera que una forma soluble de RANK que termina con un aminoácido en esta región retenga la aptitud para fijar un ligando de RANK de manera específica. Aminoácidos preferidos del terminal C para péptidos solubles RANK se seleccionan del grupo constituido por los aminoácidos 214 y 197 de SEQ ID NO: 14, aunque pueden utilizarse como término C otros aminoácidos comprendidos en la región espaciadora.

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Ejemplo 15

Este ejemplo ilustra la preparación de varias formas solubles diferentes de RANK y RANKL. Se utilizaron técnicas estándar de corte y ligación con enzimas de restricción, en combinación con aislamiento basado en PCR de fragmentos para los cuales no existían sitios de restricción convenientes. Cuando se utilizó PCR, los productos PCR se secuenciaron para comprobar si se habían introducido mutaciones de cualquier tipo; no se encontró mutación alguna.

Además de la huRANK/Fc descrita en el Ejemplo 2, se preparó otra proteína de fusión RANK/Fc por ligación de DNA que codificaba los aminoácidos 1-213 de SEQ ID NO: 6, a DNA que codificaba los aminoácidos 3-232 de la muteína Fc descrita previamente (SEQ ID NO: 8). Se preparó una construcción similar para RANK murina, ligando el DNA codificante de los aminoácidos 1-213 de RANK murina de longitud total (SEQ ID NO: 15) a DNA codificante de los aminoácidos 3-232 de la muteína Fc (SEQ ID NO: 8).

Se preparó una versión poli-His soluble y marcada de huRANKL por ligación de DNA codificante del péptido conductor de la cadena kappa de inmunoglobulina (SEQ ID NO: 16) a DNA codificante de una versión corta del marcador FLAG^{TM} (SEQ ID NO: 17), seguido por codones que codificaban Gly Ser, y a continuación un marcador poli-His (SEQ ID NO: 18), seguido por codones que codificaban Gly Thr Ser, y DNA que codificaba los aminoácidos 138-317 de SEQ ID NO: 13. Se preparó una versión soluble marcada poli-His de RANKL murina por ligación de DNA que codificaba el conductor CMV (SEQ ID NO: 9) a codones que codificaban Arg Thr Ser, seguido por DNA que codificaba poli-His (SEQ ID NO: 18) seguido por DNA que codificaba los aminoácidos 119-294 de SEQ ID NO: 11.

Se preparó una forma oligómera soluble de huRANKL por ligación de DNA que codificaba el conductor CMV (SEQ ID NO: 9) a un codón que codificaba Asp seguido por DNA que terminaba en una cremallera de "leucina" formadora de trímero (SEQ ID NO: 19), y luego por codones que codificaban Thr Arg Ser, seguido por los aminoácidos 138-317 de SEQ ID NO: 13.

Estas y otras construcciones se preparan por experimentación rutinaria. Los diversos DNAs se insertan luego en un vector de expresión adecuado, y se expresan. Vectores de expresión particularmente preferidos son aquéllos que pueden utilizarse en células de mamífero. Por ejemplo, pDC409 y pDC304, descritos en esta memoria, son útiles para expresión transitoria. Para transfección estable, se prefiere el uso de células CHO; varios vectores útiles se describen en el documento USSN 08/785150, actualmente concedida, por ejemplo, uno de los vectores de expresión 2A5-3 derivados de \lambda descritos en dicho documento.

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Ejemplo 16

Este ejemplo demuestra que la expresión de RANKL puede regularse en sentido creciente en células T murinas. Se obtuvieron las células de ganglios linfáticos mesentéricos de ratones C57BL/6, y se activaron con placas recubiertas con anti-CD3, Concanavalina A (ConA) o miristato-acetato de forbol en combinación con ionomicina (anti-CD3: 500A2; Immunex Corporation, Seattle, WA; ConA, PMA, ionomicina, Sigma, St. Louis, MO) sustancialmente como se describe en esta memoria, y se cultivaron durante aproximadamente 2 a 5 días. La expresión de RANKL se evaluó en un análisis de tres colores por FACS, utilizando anticuerpos para los marcadores de las células T CD4, CD8 y CD45RB, y RANK/Fc, preparados como se describe en esta memoria.

RANKL no se expresaba en las células T murinas no estimuladas. Las células T estimuladas con cualquiera de anti-CD3, ConA, o PMA/ionomicina, exhibían una expresión diferencial de RANKL: Las células CD4^{+}/CD45R^{Lo} y CD4^{+}/CD45RB^{Hi} eran positivas para RANKL, pero las células CD8+ no lo eran. No se observaba RANKL en las células B, análogamente a los resultados observados con las células humanas.

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Ejemplo 17

Este ejemplo ilustra los efectos de RANKL murina sobre la proliferación y activación celulares. Diversas células o líneas representativas de células que juegan un papel en una respuesta inmunológica (bazo, timo y ganglios linfáticos murinos) se evaluaron por cultivo de las mismas en condiciones que promovían su viabilidad, en presencia o ausencia de RANKL. RANKL no estimulaba la proliferación de ninguna de las células ensayadas. Una sola línea de células, una línea de células de macrófagos a la que se hace referencia como RAW 264.7 (número de acceso a ATCC, TIB 71) exhibía algunos signos de activación.

Las células RAW producen constitutivamente pequeñas cantidades de TNF-\alpha. La incubación con RANKL humana o murina aumentaba la producción de TNF-\alpha por estas células de una manera dependiente de la dosis. Los resultados no se debían a contaminación de las preparaciones de RANKL con endotoxina, dado que la ebullición de RANKL durante 10 minutos anulaba la producción de TNF-\alpha, mientras que un tratamiento similar de la endotoxina purificada (LPS) no afectaba a la aptitud de la LPS para estimular la producción de TNF-\alpha. A pesar del hecho de que RANKL activaba la línea de células de macrófagos RAW T64.7 para la producción de TNF-\alpha, ni RANKL humana ni RANKL murina estimulaban la producción de óxido nítrico por estas células.

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Ejemplo 18

Este ejemplo ilustra los efectos de RANKL murina sobre el crecimiento y desarrollo del timo en ratones fetales. Se inyectaron ratones preñados con 1 mg de RANK/Fc o proteína de control de vehículo (seroalbúmina murina; MSA) los días 13, 16 y 19 de gestación. Después del nacimiento, los neonatos continuaron siendo inyectados con RANK/Fc por vía intraperitoneal (IP) sobre una base diaria, comenzando a una dosis de 1 \mug, y duplicando la dosis aproximadamente cada 4 días, para una dosis final de 4 \mug. Los neonatos se tomaron los días 1, 8 y 15 después del nacimiento, se extirparon sus timos y sus bazos, y se examinaron respecto a tamaño, celularidad y composición fenotípica.

Se observó una ligera reducción en el tamaño del timo el día 1 en los neonatos nacidos de la hembra inyectada con RANK/Fc; no se observó una disminución similar en tamaño en los neonatos de control. El día 8, se redujeron el tamaño del timo y la celularidad en aproximadamente 50% de los animales tratados con RANK/Fc en comparación con los ratones tratados con MSA. El análisis fenotípico demostró que las proporciones relativas de poblaciones diferentes de células T en el timo eran las mismas en los ratones RANK/Fc que en el grupo de control, lo que indicaba que la celularidad disminuida era debida a una depresión global en el número de células T tímicas, en oposición a una disminución en una o más poblaciones específicas. Los neonatos tratados con RANK/Fc no eran significativamente diferentes de los neonatos de control el día 15 con respecto a tamaño, celularidad o fenotipo de las células tímicas. No se observó diferencia significativa alguna en el tamaño del bazo, la celularidad o la composición en ninguno de los momentos evaluados. La diferencia en celularidad el día 8 y no el día 15, puede sugerir que RANK/Fc pueda hacer valer su efecto al principio del desarrollo del timo.

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Ejemplo 19

Este ejemplo demuestra que la región C-terminal del dominio citoplásmico de RANK es importante para la fijación de varias proteínas TRAF diferentes. RANK contiene al menos dos motivos PXQX(X)T reconocibles que son probablemente sitios de acoplamiento de TRAF. Por esta razón, se evaluó la importancia de diversas regiones del dominio citoplásmico de RANK para fijación de TRAF. Se preparó una proteína de fusión RANK/GST sustancialmente como se describe en Smith y Johnson, Gene 67:31 (1988), y se utilizó en la preparación de diversas truncaciones como se describe a continuación.

La comparación de la secuencia de nucleótidos de RANK murina y humana indicó que existían varias regiones conservadas que podrían ser importantes para la fijación de TRAF. En consecuencia, se desarrolló una técnica basada en PCR para facilitar la preparación de diversas truncaciones C-terminales que podrían retener las regiones conservadas. Se diseñaron iniciadores PCR para introducir un codón de parada y un sitio de enzima de restricción en los puntos seleccionados, produciendo las truncaciones descritas a continuación en la Tabla 1. La secuenciación confirmó que no se había introducido mutación indeseable alguna en las construcciones.

Se prepararon proteínas TRAF radiomarcadas (^{35}S-Met, Cys) por traducción in vitro utilizando un kit de lisado de reticulocitos disponible comercialmente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Las proteínas de fusión GST truncadas se purificaron sustancialmente como se describe en Smith y Johnson (supra). Resumidamente, se transfectaron E. coli con un vector de expresión que codificaba una proteína de fusión, y se indujeron para expresar la proteína. Se lisaron las bacterias, se retiró el material insoluble, y la proteína de fusión se aisló por precipitación con cuentas recubiertas de glutation (Sepharose 4B, Pharmacia, Uppsala, Suecia).

Se lavaron las cuentas y se incubaron con diversas proteínas TRAF radiomarcadas. Después de los pasos de incubación y lavado, los complejos proteína de fusión/TRAF se separaron de las cuentas por ebullición en SDS al 0,1% + \beta-mercaptoetanol, y se cargaron en geles de SDS al 12% (Novex). Los geles se sometieron a autorradiografía, y se registró la presencia o ausencia del material radiomarcado. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 2.

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TABLA 2 Fijación de Diversas Proteínas TRAF al Dominio Citoplásmico de RANK

2

Estos resultados indican que TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 y TRAF6 se fijan a la porción más distal del dominio citoplásmico de RANK (entre los aminoácidos G544 y A616). TRAF6 tiene también un sitio de fijación entre S339 e Y421. En este experimento, TRAF5 se fijaba también al dominio citoplásmico de RANK.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Immunex Corporation

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ligando para el Activador del Receptor de NF-kappa B

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Immunex Corporation, Law Department

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(B)

CALLE: 51 University Street

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: WA

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 98101

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

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(B)

ORDENADOR: Apple Power Macintosh

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: Apple Operating System 7.5.5

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(D)

SOFTWARE: Microsoft Word para Power Macintosh 6.0.1

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22 de diciembre de 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/064.671

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 de octubre de 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/813.509

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de marzo de 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/772.330 (60/064.671)

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de diciembre de 1996

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Perkins, Patricia Anne

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34693

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(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 2852-WO

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: (206)587-0430

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(B)

TELEFAX: (206)233-0644

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 3115 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CLASE DE CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: HOMO SAPIENS

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(vii)

FUENTE INMEDIATA:

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(A)

GENOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA

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(B)

CLON: 9D-8A

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 93..1868

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

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3

4

5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 591 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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7

8

9

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(2) INFORMACIÓN: PARA SEQ ID NO:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1391 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CLASE DE CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

GENOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: 9D-15C

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 39..1391

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 451 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3136 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

GENOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: RANGO DE LONGITUD TOTAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 39..1886

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 616 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Péptido FLAG®

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 232 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Humano

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Muteína IgG1 Fc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: CMV (Conductor R2780)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Metl-Arg28 es el péptido conductor real; Arg29 refuerza el sitio de {}\hskip3.65cm escisión de furina; los nucleótidos codificantes Thr30 y Ser31 añaden {}\hskip3.65cm un sitio Spe1.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1630 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

GENOTECA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: RANKL

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..884

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 294 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 954 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

GENOTECA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: huRANKL (longitud total)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..951

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 317 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1878 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Murino

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

GENOTECA: Epitelio de Hígado Fetal Murino

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: muRANK

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1875

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 625 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

39

Claims (38)

1. Un DNA aislado seleccionado del grupo constituido por:

(a) un DNA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive;

(b) moléculas de DNA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el DNA de (a) que son capaces de fijación del polipéptido RANK;

(c) un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1-951 de SEQ ID NO: 12;

(d) un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO: 12; y

(e) un DNA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO: 13.

2. El DNA aislado de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido RANKL que es idéntico al menos aproximadamente en un 90% en secuencia de aminoácidos a RANKL como está codificado por el DNA de la reivindicación 1 (c) o la reivindicación 1 (e).

3. El DNA aislado de la reivindicación 1 (a), (b) o (d) que codifica un polipéptido RANKL soluble.

4. Un DNA aislado que codifica un RANKL soluble, seleccionado del grupo constituido por:

(a) un DNA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 69 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive; y

(b) moléculas de DNA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el DNA de (a) que son capaces de fijación del polipéptido RANK.

5. El DNA aislado de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un DNA que codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por un dominio de inmunoglobulina Fc, una muteína de inmunoglobulina Fc, un marcador FLAG^{TM}, un péptido que comprende al menos aproximadamente 6 residuos His, una cremallera de leucina, y combinaciones de los mismos.

6. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un proceso para preparar una proteína RANKL, que comprende cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7 en condiciones que promueven la expresión y recuperación de la RANKL.

9. Un polipéptido RANKL aislado seleccionado del grupo constituido por:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive;

(b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK; y

(c) un polipéptido RANKL codificado por un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1 a 951 de SEQ ID NO: 12;

(d) un polipéptido RANKL codificado por un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO: 12;

\newpage

(e) un polipéptido RANKL que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO: 13.

10. La proteína de acuerdo con la reivindicación 9, que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos aproximadamente en un 90% al polipéptido de la reivindicación 9 (c) o la reivindicación 9 (e).

11. La proteína de acuerdo con la reivindicación 9 (a), (b) o (d), que es una RANKL soluble.

12. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 9, 10 ó 11 que tiene una secuencia de aminoácidos diferente por tener una deleción, inserción o sustitución.

13. Una proteína RANKL soluble de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende adicionalmente un péptido seleccionado del grupo constituido por un dominio de inmunoglobulina Fc, una muteína de inmunoglobulina Fc, un marcador FLAG^{TM}, un péptido que comprende al menos aproximadamente 6 residuos His, una cremallera de leucina, y combinaciones de los mismos.

14. Un anticuerpo inmunorreactivo con el polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9, que no es inmunorreactivo con el polipéptido que tiene la secuencia siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

15. Un método in vitro de inducción de la maduración de células dendríticas (DC), que comprende poner en contacto DC CD1a+ con una cantidad de un polipéptido RANKL seleccionado de:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive; y

(b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK, suficiente para dar como resultado niveles reducidos de CD1b/c, y niveles incrementados de CD83, expresión en las DC, en condiciones que promueven la viabilidad de las DC.

16. Un método de intensificación de la capacidad alo-estimuladora in vitro en células dendríticas (DC), que comprende poner en contacto DC CD1a+ con una cantidad de un polipéptido RANKL seleccionado de:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive; y

(b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK, suficiente para aumentar la capacidad alo-estimuladora de las DC en una reacción de linfocitos mixtos (MLR), en condiciones que promueven la viabilidad de las DC.

17. Un método in vitro de promoción de la viabilidad de las células T en presencia de TGF\beta, que comprende poner en contacto células T que han estado expuestas a TGF\beta con una cantidad de un polipéptido RANKL seleccionado de:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive; y

(b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK,

suficiente para aumentar el número de células T que permanecen viables en presencia de TGF\beta, en condiciones que promoverían la viabilidad de las células T en ausencia de TGF\beta.

18. Un adyuvante para una vacuna contra tumores o una vacuna contra una enfermedad infecciosa que comprende células dendríticas CD1a^{+} que se han incubado con un polipéptido RANKL de acuerdo con el método de la reivindicación 15.

19. Uso de un polipéptido RANKL seleccionado de:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive; y

(b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK, para efectuar un cribado respecto a un inhibidor de la activación de NF-kappa B.

20. Una composición que comprende el polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, y un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

21. Un kit para detectar RANK o RANKL solubles, o monitorizar la actividad relacionada con RANK, que comprende un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13.

22. Un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para uso en el cribado respecto a un inhibidor de RANK.

23. Un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para uso en el diseño basado en estructura de inhibidores de RANKL.

24. Un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para uso en el aumento de una respuesta inmunológica.

25. Una composición que comprende un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para uso en el aumento de una respuesta inmunológica.

26. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 25, en asociación con un receptor soluble de citoquinas o una citoquina u otra molécula inmunoreguladora.

27. Un adyuvante de vacuna que comprende un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13.

28. Uso de un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13 en el desarrollo de anticuerpos para RANKL.

29. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para uso en la inhibición de la fijación a RANK.

30. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para uso en la interferencia con la señalización de RANKL.

31. Una composición que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para uso en la inhibición de la fijación a RANK.

32. Un polipéptido RANKL soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13 para uso como agonista de RANK.

33. El uso de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el polipéptido induce la actividad de NF-kappa B.

34. Una composición que comprende un polipéptido RANKL soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13 para uso como un agonista de RANK.

35. Una composición de acuerdo con la reivindicación 33 para inducir la actividad de NF-kappa B.

36. Un método de preparación de un anticuerpo que comprende utilizar un polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9 como inmunógeno.

37. Un método de preparación en un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende utilizar un polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9 como inmunógeno.

38. Una composición que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14.