ES2361409T3

ES2361409T3 - Generación de proteinas de unión sintéticas basadas en proteinas de ubiquitina.

Info

Publication number: ES2361409T3
Application number: ES04735010T
Authority: ES
Inventors: Markus Dr. Fiedler; Ulrike Fiedler; Rainer Rudolph
Original assignee: Scil Proteins GmbH
Current assignee: Navigo Proteins GmbH
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2011-06-16
Anticipated expiration: 2024-05-27
Also published as: ATE499382T1; JP2008500953A; JP4803817B2; JP5372992B2; JP2011201893A; EP1626985B1; EP2163559A1; US8790895B2; DK1626985T3; DE502004012225D1; PT1626985E; JP2011046722A; CA2524899C; CN103539851B; PL1626985T3; WO2004106368A1; EP2295446A1; US8791238B2; CA2524899A1; DE10324447A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de una proteína, presentando el procedimiento las siguientes etapas: a) seleccionar una proteína que se va a modificar del grupo de proteínas constituido por ubiquitina, SUMO-1, FAU, NEDD-8, UBL-1, Rub1, APG8, ISG15, URM1, HUB1, GDX, elongina B, PLIC2 (dominio N-terminal), parquina humana (dominio N-terminal); b) seleccionar una pareja de unión; c) determinar los aminoácidos expuestos en la superficie de la proteína de la etapa a); d) seleccionar posiciones de aminoácidos en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína, que incluye al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta y de forma opcional regiones en lámina plegada no beta; e) modificar las posiciones de aminoácidos seleccionadas mediante sustitución, inserción, deleción y/o modificación química, conservando el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina; f) poner en contacto la proteína modificada con la pareja de unión determinado en la etapa b); g) detectar aquellas proteínas que presentan una afinidad de unión, expresada en KD, por la pareja de unión predeterminada de 10 -5 M a 10 -12 M frente a la pareja de unión predeterminada en la etapa b), y que presentando modificaciones tales, que forman una región continua de 5 a 10 aminoácidos sobre la superficie de la proteína, en la que al menos se encuentran modificados cuatro aminoácidos expuestos en la superficie en la región en lámina plegada beta.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de proteínas modificadas que presentan un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, presentando la proteína basada en esta modificación una afinidad de unión no presente previamente frente a una pareja de unión predeterminada. La ubiquitina es una proteína pequeña, monomérica y citosólica, que aparece – con muy alta conservación de su secuencia – se encuentra en todas las células eucarióticas conocidas, desde los protozoos hasta los vertebrados. Juega en el organismo un papel básico en la regulación de la degradación controlada de proteínas propias de la célula. A este respecto las proteínas determinadas para la degradación se unen en el transcurso de una cascada enzimática covalentemente con ubiquitina o cadenas de poliubiquitina y se degradan selectivamente debido a este marcado. Según las revelaciones más recientes la ubiquitina o la marca de proteínas con ubiquitina juega también un importante papel en otros procesos celulares como en la importación de muchas proteínas o su regulación génica (Marx, 2002).

Además de la clarificación de su función fisiológica la ubiquitina es sobre todo debido a sus propiedades estructurales y químico-proteicas objeto de investigación. La cadena de polipéptidos de la ubiquitina se compone de 76 aminoácidos que están plegados en una estructura alfa/beta extraordinariamente compacta (Vijay-Kumar, 1987): aproximadamente el 87% de la cadena de polipéptidos toma parte mediante puentes de hidrógeno en la formación de los elementos estructurales secundarios. Como estructuras secundarias prominentes pueden servir vueltas helicoidales de tres y medio así como un plegamiento de lámina beta antiparalelo constituido por cuatro hebras. La disposición característica de estos elementos – un plegamiento de lámina beta antiparalelo expuesto en una superficie de la proteína, que se recubre sobre su parte posterior por una hélice alfa que se encuentra verticalmente sobre la misma, -es válido por lo general como el denominado motivo de plegamiento de tipo ubiquitina. La ubiquitina da por tanto nombre a la superfamilia de proteínas correspondiente ("proteínas de tipo ubiquitina") o familia de proteínas ("proteínas relacionadas con ubiquitina") (Murzin y col., 1995), proteínas tales como, por ejemplo, SUMO-1 (Müller y col., 2001), FAU (Michiels y col., 1993), NEDD-8 (Kumar y col., 1993), UBL-1 (Jones y Candino, 1993) y GDX (Filippi y col., 1990), que comprenden este motivo y un grado de identidad alto con la ubiquitina en su secuencia primaria. Una característica adicional de la estructura es una región hidrófoba remarcada en el interior de la proteína entre la hélice alfa y el plegamiento beta.

La preparación sintética de ubiquitina es posible debido a su pequeño tamaño tanto mediante síntesis química como también mediante procedimientos de ingeniería genética. Debido a las propiedades de plegamiento favorables la ubiquitina se puede producir mediante ingeniería genética con ayuda de microorganismos como, por ejemplo Escherichia coli en cantidades relativamente grandes opcionalmente en el citosol o el espacio periplasmático. Esta última estrategia se reserva debido al mildeu oxidante que domina en el periplasma habitualmente para la producción de proteínas secretoras. La preparación bacteriana simple y eficiente hace posible el uso de ubiquitina como pareja de fusión para otras proteínas extrañas que se tienen que preparar, cuya producción es problemática. Mediante la fusión con ubiquitina se puede logar una solubilidad mejorada y con ello un mejor rendimiento. El resultado obtenido en la presente invención de proporcionar ubiquitina como proteína de unión sintética universal hace posible un aprovechamiento completamente nuevo de sus propiedades químico-proteicas.

Entre aquellas proteínas, cuya función natural se usa para fines sintéticos – por ejemplo en biotecnología, bioanalítica o en medicina, son de especial relevancia los anticuerpos (es decir, las inmunoglobulinas). Debido a su capacidad para la unión específica no covalente próxima a cualquier sustancia deseada, estas representan la herramienta más importante para cualquier uso bioeconómico que requiera un reconocimiento, unión o separación de ligandos, receptores o moléculas diana de este tipo. Los procedimientos desarrollados en los últimos años para la biosíntesis funcional de fragmentos de anticuerpos en E. coli han ampliado el campo de aplicación de inmunoglobulinas, a la vez que también han hecho visibles las dificultades y límites.

Además de los fragmentos Fab y Fv que se obtienen en principio también mediante procedimientos químico-proteicos convencionales (Skerra y Plückthun, 1988) se podrían desarrollar con ayuda de procedimientos de ingeniería genética y en base a la constitución modular de las inmunoglobulinas diversas construcciones sintéticas (revisión de Dübel y Kontermann, 2001). Son de resaltar aquí fragmentos Fv de cadena simple (scFv) (Bird y col., 1988), fragmentos Fv de puentes disulfuro (dsFv) (Brinkmann y col., 1993) así como fragmentos de anticuerpos bivalentes (Carter y col., 1992) o biespecíficos (por ejemplo, Diabodies, Holliger y col., 1993). Para el diagnóstico y el uso en la terapia se pueden obtener mediante fusión genética de los fragmentos Ig recombinantes con módulos efectores proteínas bifuncionales. De este modo se disponen entre otros de fusiones con la fosfatasa alcalina (Muller y col., 1999) y la proteína de fluorescencia verde (GFP; Griep y col., 1999). Potencialmente son de mayor importancia fusiones de fragmentos de anticuerpos con radioisótopos o sustancias citotóxicas para el tratamiento de cáncer (inmunotoxinas; Reiter y Pastan, 1998). A este respecto se aprovecha la unión selectiva de fragmentos de Ig correspondientes en proteínas de superficie específicas sobre células tumorales para la aplicación dirigida específica del sitio de agentes terapéuticos (dirigida al tumor).

Los procedimientos para la preparación de fragmentos de anticuerpos en E. coli no hacen posible sin embargo sólo la preparación para diagnóstico y terapia en mejor calidad y cantidad, sino también la modificación sencilla y rápida de sus propiedades químico-proteicas e inmunoquímicas. La facilidad de manipulación de un huésped bacteriano permite la modificación no complicada de genes codificados por vectores de la proteína extraña con procedimientos biológico-moleculares convencionales. Mediante ingeniería de anticuerpos dirigida (Kontermann y Dübel, 2001) se pueden optimizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, en lo que respecta a su afinidad de unión o a su compatibilidad con huéspedes. Igualmente se pueden producir anticuerpos específicos o sus fragmentos contra distintas sustancias diana como estructuras de bajo peso molecular o, por ejemplo, proteínas sintéticamente, es decir, fuera del sistema inmune. Con procedimientos evolutivos de este tipo se preparan mediante la incorporación de mutaciones aleatorias bibliotecas sintéticas de fragmentos de anticuerpos, que pueden aproximarse en su extensión al repertorio humano (Knappik y col., 2000). Mediante estrategias de selección adecuadas como presentación en fago o presentación en ribosoma (Winter, 1998, Hoogenboom y col., 1998; Hanes y col., 2000) se aíslan en el caso de éxito fragmentos Ig funcionales con la propiedad de unión deseada. De esta forma es también posible obtener, por ejemplo, proteínas de unión para antígenos tales que provocaron con una inmunización clásica efectos tóxicos o sólo una respuesta inmune débil.

A pesar del éxito y posibilidades citadas que ofrece la ingeniería de anticuerpos, determinadas desventajas pueden limitar la aplicación práctica de anticuerpos. Así la preparación de cantidades suficientes es problemática: la producción de anticuerpos funcionales tiene lugar en sistemas de cultivo celular eucarióticos – un procedimiento de extraordinario coste –. Adicionalmente muchas aplicaciones terapéuticas presentan el inconveniente de la baja penetración en tejido de las moléculas de anticuerpo debido a su tamaño o bien su prolongado tiempo de residencia en el suero (aclaramiento en sangre lento). Se pueden preparar fragmentos más pequeños de anticuerpos como fragmentos scFv o Fab (véase anteriormente) en concreto por vía bacteriana y por tanto de coste en principio favorable, debido a sus propiedades de plegamiento favorables y la necesaria formación de varios puentes disulfuro los rendimientos de la producción recombinante se encuentran frecuentemente por debajo del nivel deseado. Adicionalmente los fragmentos de anticuerpos recombinantes son frecuentemente más estables y presentan una actividad de unión menor en comparación con anticuerpos parentales.

Para solventar tales limitaciones se investiga el principio de trasladar la unión de anticuerpos – a saber, la unión mediante una región expuesta en la superficie hipervariable, localizada sobre un esqueleto proteico conservado – a otras proteínas (Skerra, 2000). Es decir se varían principalmente bucles variables (loops) para generar una propiedad de unión sintética. A este respecto se parte por lo general de proteínas de unión naturales como, por ejemplo, lipocalinas (Beste y col., 1999) o del dominio de fibronectina de tipo III (Koide y col., 1998), cuyos sitios de unión – análogos a los anticuerpos – se forman a partir de estructuras “bucle” flexibles y cuya modificación hace posible el reconocimiento de otros como los ligandos naturales.

De forma alternativa a esto según el documento WO 01/04144 con proteínas de estructura en lámina plegada beta, que no presentan de por sí sitios de unión, se genera este sobre la superficie de la proteína. Mediante un sitio de unión sintético de nueva generación (véase más adelante) se pueden obtener, por ejemplo, variantes de la γcristalina – una proteína de estructura del cristalino de los ojos –, que interactúa con sustancias previamente definidas con afinidad y especificidad cuantificable. A diferencia de los sitios de unión presentes por la modificación citada anteriormente a modo de ejemplo y los formados en estructuras “bucle” flexibles, estos se generan según el documento WO 01/04144 como nuevos sobre la superficie de láminas plegadas beta. El documento WO 01/04144 describe no obstante comparativamente sólo la modificación de proteínas de mayor tamaño para la generación de nuevas propiedades de unión. Debido a su tamaño las proteínas se pueden modificar según el documento WO 01/04144 en el plano de la ingeniería genética sólo mediante procedimientos comparativamente costosos. En las proteínas dadas a conocer hasta ahora se modificó porcentualmente también una proporción relativamente pequeña de todos los aminoácidos para obtener la estructura completa de la proteína. En consecuencia se proporciona también una región relativamente más pequeña de la superficie proteica que se puede usar para la generación de propiedades de unión no presentes previamente. Adicionalmente el documento WO 01/04144 da a conocer experimentalmente sólo la generación de una propiedad de unión en moléculas pequeñas, de bajo peso molecular, sin embargo no en moléculas mayores como, por ejemplo, proteínas.

Por tanto un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de proteínas con nuevas afinidades de unión previamente no presentes, frente a parejas de unión seleccionadas, que no presenten las anteriores desventajas y adicionalmente moléculas de sustitución para anticuerpos que no presenten las desventajas anteriormente citadas de los anticuerpos.

De acuerdo con la invención este objetivo se consigue proporcionando un procedimiento para la preparación de proteínas modificadas según la reivindicación 1, que se basen sustancialmente en la estructura proteica de la proteína de partida, por ejemplo, de la ubiquitina y que presenten en su superficie un sitio de unión generado sintéticamente.

De forma particular se proporciona de acuerdo con la invención un procedimiento para la preparación de proteínas modificadas que presentan un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina así como fragmentos o proteínas de fusión de estas, que poseen el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, comprendiendo la proteína que conserva el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, debido a una o varias modificaciones de aminoácidos en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína, la al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta y de forma opcional regiones en lámina plegada no beta, presentando una afinidad de unión previamente no presente frente a una pareja de unión predeterminada, presentado el procedimiento las siguientes etapas:

a) seleccionar una proteína que se va a modificar del grupo de proteínas constituido por ubiquitina, SUMO-1, FAU, NEDD-8, UBL-1, Rub1, APG8, ISG15, URM1, HUB1, GDX, elongina B, PLIC2 (dominio N-terminal), parquina humana (dominio N-terminal);

b) seleccionar una pareja de unión;

c) determinar los aminoácidos expuestos en la superficie de la proteína de la etapa a);

d) seleccionar posiciones de aminoácidos en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína, que incluye al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta y de forma opcional regiones en lámina plegada no beta;

e) modificar las posiciones de aminoácidos seleccionadas mediante sustitución, inserción, deleción y/o modificación química, conservando el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina;

f) poner en contacto la proteína modificada con la pareja de unión determinado en la etapa b);

g) detectar aquellas proteínas que presentan una afinidad de unión, expresadas en por KD, por la pareja de unión predeterminado de 10-5 M a 10-12 M frente al pareja de unión predeterminada en la etapa b), y que presentando modificaciones tales, que forman una región continua de 5 a 10 aminoácidos sobre la superficie de la proteína, en la que al menos se encuentran modificados cuatro aminoácidos expuestos en la superficie en la región en lámina plegada beta.

Adicionalmente la presente invención tiene el objetivo de proporcionar procedimientos correspondientes para la obtención de las proteínas modificadas basadas en ubiquitina citadas anteriormente y aplicaciones para estas proteínas modificadas.

La invención describe por tanto también un procedimiento para la preparación de una proteína, seleccionada del grupo constituido por proteínas de la superfamilia de proteínas “proteínas de tipo ubiquitina”, proteínas que presenta un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina así como fragmentos o proteínas de fusión de estas, que presentan todas ellas un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, presentando la proteína debido a una o varias modificaciones una afinidad de unión no presente previamente frente a una pareja de unión predeterminada, obteniéndose mediante el siguiente procedimiento:

a) seleccionar una proteína que se va a modificar;

b) determinar una pareja de unión;

c) seleccionar aminoácidos en una región expuesta en la superficie de la proteína, que incluye al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta y de forma opcional regiones en lámina plegada no beta;

d) modificar los aminoácidos seleccionados, preferiblemente mediante sustitución, inserción, deleción y/o modificación química, conservando el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina;

e) poner en contacto la proteína modificada con la pareja de unión determinado en la etapa b);

f) detectar aquellas proteínas que presentan una afinidad de unión frente al pareja de unión predeterminado en la etapa b).

La invención proporciona por tanto proteínas o polipéptidos que se prepararon mediante modificación de proteínas o polipéptidos que poseen un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, como se define en la solicitud previa. A tal efecto pertenecen a la superfamilia “proteínas de tipo ubiquitina” todas las proteínas que posean un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina y fragmentos o proteínas de fusión de estas proteínas. Partiendo de estas proteínas o polipéptidos designados anteriormente con un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina se modifican uno o varios aminoácidos en la proteína o polipéptido original. Las modificaciones comprenden de forma particular el intercambio de aminoácidos, pero también inserciones y deleciones de uno o varios aminoácidos así como modificaciones químicas de aminoácidos. Estas modificaciones se llevan a cabo en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína que se va a modificar. La modificación de al menos un aminoácido comprende al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta, debiendo estar localizada la hebra en lámina plegada beta en la superficie de la proteína, de modo que se encuentra accesible para la pareja de unión o ligandos que pueda unirse con una afinidad determinable a la proteína modificada. En una forma de realización adicional de la invención se modifican además de los cambios en la hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta, también las regiones en lámina plegada no beta, que preferiblemente están expuestas en la superficie para influir en la afinidad de unión frente al pareja de unión predeterminada, de forma particular para aumentar y con ello elevar la especificidad.

Para el especialista en la técnica se encuentran disponibles técnicas conocidas de lo más diverso para la modificación de uno o varios aminoácidos. Estas se describen detalladamente a continuación. Se hace referencia complementaria a las publicaciones de Ausuebel y col., 1994, así como de Sambrook y col., 1989.

Ya se conocen modificaciones de aminoácidos de la región núcleo expuesta en la superficie de la ubiquitina (Finucane y col., Biochemistry, vol. 38, nº 36, 1999 o Lazar y col., Protein Science (1997), 6:1167-1178). Las modificaciones ahí recogidas se refieren a posiciones que debido a la localización en el núcleo hidrófobo no forman parte de uniones ya que no son accesibles para el disolvente o posibles parejas de unión.

A continuación se debe aclarar lo que se entiende en esta invención con la expresión “propiedad de unión no presente previamente” o bien sitio de unión sintético de nueva generación. Con esto se entiende que la proteína modificada no presenta en la región modifica previamente propiedad de unión alguna para una pareja de unión predeterminada o una pareja de unión natural de ubiquitina. En una forma de realización adicional de la invención se seleccionan las proteínas que se van a modificar de forma que no posean afinidad de unión alguna por la pareja de unión predeterminada. Las parejas de unión, que se pueden definir también como ligandos, presentan una afinidad mesurable con la proteína que se va a modificar de acuerdo con la invención. Como valor mínimo para la presencia de una propiedad de unión cuantificable, es decir la afinidad con la que se une la pareja, se puede preveer de acuerdo con la invención una constante de disociación para el complejo formado de KD = 10-5 M o menor. A partir de un valor de 10-5 M se puede considerar una afinidad de unión cuantificable. Se prefiere según cada aplicación un

10-12 10-11

10-6 10-7

valor de M A M, adicionalmente preferiblemente a M, por ejemplo, para aplicaciones cromatográficas o de 10-9 a 10-12 M, por ejemplo para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Otras afinidades de unión preferidas se encuentran en el intervalo de 10-7 a 10-10M, preferiblemente hasta 10-11 M. Los procedimientos para la determinación de las afinidades de unión son conocidos y se describen además en las siguientes páginas. Con modificación se entienden de acuerdo con la invención sustituciones de aminoácidos, inserciones, deleciones o modificaciones químicas.

Como proteínas que se van a modificar se usan de acuerdo con la invención proteínas que presentan un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, a saber SUMO-1, FAU, NEDD-8, UBL-1, y GDX así como Rub1, APG8, ISG15, URM1, HUB1, elongina B, PLIC2 (dominio N-terminal), parquina humana (dominio N-terminal) así como ubiquitina. Todas estas proteínas pertenecen a la superfamilia de “proteínas que tipo ubiquitina”.

Las proteínas que se pueden usar de acuerdo con la invención de la superfamilia de proteínas de tipo ubiquitina se definen de la forma más exacta. Se hace referencia sólo al siguiente sitio web: http://bip.weizmann.ac.il/scop/index.html. La familia de las proteínas de tipo ubiquitina se define como superfamilia, a la que pertenece la familia de las proteínas relacionadas con la ubiquitina. Todos los componentes de esta superfamilia se caracterizan principalmente por láminas plegadas β dispuestas antiparalelamente, que están subdividas en segmentos α y β. El plegamiento se define como beta-Grasp y por tanto similar a ubiquitina. La región núcleo se define como sigue: beta(2)-alfa-beta(2), en donde las cifras indican la cantidad de hebras, formando la suma de hebras la lámina plegada β. La disposición de la hoja beta mixta es 2143, en donde la posición de las hebras desde el punto de vista de la lámina plegada va de izquierda a derecha (término amino abajo, término carboxi arriba). Es característico para los componentes de la proteína de tipo ubiquitina por tanto una lámina plegada β antiparalela expuesta en una superficie de la proteína, que se cubre por su parte posterior con una hélice α superpuesta verticalmente. Este motivo de plegamiento de tipo ubiquitina es característico de las proteínas que se pueden usar y modificar de acuerdo con la invención y limita inequívocamente los componentes de la familia de otras proteínas. Considerando esta definición están comprendidos también por la invención los dominios N-terminales similares a ubiquitina de PLIC-2 y el dominio similar a ubiquitina de parquina.

El especialista en la técnica puede deducir conclusiones previas en función de comparaciones de secuencias, los denominados alineamientos o superposiciones de estructura, sobre si las proteínas se tratan de un miembro de la superfamilia de proteínas de proteínas de tipo ubiquitina. Evidentemente la seguridad final la da siempre un análisis de estructura, por ejemplo, un análisis de estructura por cristalografía de rayos X o espectroscopía de resonancia nuclear multidimensional. Se pueden conseguir buenos pronósticos también mediante análisis de estructura con ayuda de algoritmos genéticos.

Otras informaciones sobre la superfamilia de la ubiquitina se encuentran, por ejemplo, en la publicación de Larsen y col., 2002. Se hace referencia complementaria también a la publicación de Buchberger y col., 2001. Buchberger describe el plegamiento β-Grasp típico como característico de proteínas de tipo ubiquitina con una estructura secundaria de organización beta-beta-alfa-beta-beta-alfa-beta, es decir, la disposición de cinco hebras beta en forma de una “lámina mixta” en la disposición 21534. Es de reseñar que UBX no presenta homología alguna en la secuencia primaria, por ejemplo, con ubiquitina (Buchberger y col., 2001), sin embargo – debido a su estructura tridimensional, que es idéntica a la de ubiquitina, por ejemplo, -se incluye a a las proteínas de tipo ubiquitina. A este respecto se indica que en la ubiquitina están provistos los aminoácidos en posiciones 48 y 49 se consideran, en parte, como hebra beta independiente (Vijay-Kumar, 1987). Esta quinta hebra, que se localizaría en la estructura de ubiquitina tras la hélice daría a la “lámina mixta” la disposición 21534, presenta sin embargo sólo dos aminoácidos, y por tanto es discutible designar esta hebra constituida por dos aminoácidos como lámina plegada beta. Según Buchberger y col. (2001) se podrían considerar como se citó anteriormente también proteínas con la disposición 21534 en la superfamilia de las proteínas de tipo ubiquitina. Para la presente invención se seleccionó para la disposición de las hebras beta en la ubiquitina la definición 2143 descrita anteriormente en detalle.

Las proteínas de la familia y superfamilia citadas son por lo general muy conservadoras. Por ejemplo, la ubiquitina presenta según lo conocido hasta ahora idéntica secuencia de aminoácidos en todos los mamíferos. La ubiquitina de levadura presenta sólo una desviación en tres aminoácidos. La ubiquitina humana o la ubiquitina de mamíferos se compone de 76 aminoácidos y presenta la estructura que se describe al comienzo.

De acuerdo con la invención la proteína que se va a modificar debería presentar una concordancia en la secuencia de aminoácidos con la proteína de partida que se modifica, por ejemplo, la ubiquitina humana, de al menos un 30%, preferiblemente al menos 40% o 50%, adicionalmente preferiblemente al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95%, presentando la proteína igualmente un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, como se definió anteriormente.

De acuerdo con la invención están comprendidos también fragmentos de las proteínas citadas, en tanto contengan el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina descrito al comienzo, así como fusiones de las proteínas citadas con otras proteínas. En el caso de tales fragmentos y proteínas de fusión se entienden en el marco de esta invención datos de posición de aminoácidos que se refieren siempre a la posición correspondiente en ubiquitina humana. Ejemplos de parejas de fusión son enzimas (indicadores), toxinas u otras proteínas de unión etc. Adicionalmente es posible el acoplamiento químico o con sustancias de bajo peso molecular como biotina, digoxigenina, sustancias fluorescentes y/o luminiscentes etc.

En el caso de proteínas de fusión se puede modificar de acuerdo con la invención una proteína ya fusionada. De acuerdo con la invención está comprendido también que se fusione una parte tras modificación o selección. Esto se puede llevar a cabo respectivamente según procedimientos conocidos por el especialista en la técnica.

Según la presente invención la proteína que se selecciona para la preparación de la proteína modificada, es preferiblemente ubiquitina humana o ubiquitina de otro origen, por ejemplo una ubiquitina de otro mamífero. La invención se describe por tanto a continuación particularmente en el ejemplo de la ubiquitina humana. Mediante varios ejemplos se describe la modificación de la ubiquitina humana para obtener una proteína que se puede designar también como muteína, que muestra una afinidad de unión no presente previamente frente a una pareja de unión predeterminada. Como ubiquitinas de mamífero se tienen en cuenta de forma particular ubiquitinas de roedores, de animales domésticos y de animales de aprovechamiento en el ámbito de animales mamíferos. Si se conoce el campo de aplicación de las proteínas producidas de acuerdo con la invención, es decir, se va a usar por ejemplo la proteína modificada como medicamento para el tratamiento de enfermedades en humanos, se puede usar preferiblemente una proteína human como proteína de partida que se va a modificar; esto es válido análogamente para el ámbito de aplicación que corresponda. Se debe prestar atención a que las realizaciones siguientes sólo se acometen con ubiquitina humana a título de ejemplo. A partir del fundamento de esta descripción y de los ejemplos citados es posible para el especialista en la técnica modificar de acuerdo con la invención otras proteínas con motivos de plegamiento específicos de ubiquitina. Por tanto la invención no se limita a ubiquitina humana o a ubiquitina en general. Las indicaciones y realizaciones correspondientes se tienen que entender como configuraciones a modo de ejemplo de la invención que no obstante son especialmente preferidas.

La ubiquitina humana o de mamífero presenta, como se citó al comienzo, 76 aminoácidos. Los aminoácidos de cuatro hebras beta que contribuyen a la formación de la lámina plegada beta antiparalela son, de acuerdo con la invención en correspondencia con la estructura 1UBQ en la base de datos PDB (http://www.rcsb.org/pdb/index.html) las siguientes posiciones de aminoácidos:

Primera hebra (aminoterminal): de 2 a 7; segunda hebra en lámina plegada beta: de 12 a 16; tercera hebra: de 41 a 45; cuarta hebra (carboxiterminal): de 66 a 71. La situación de las hebras desde el punto de vista de la lámina plegada (término amino abajo, término carboxi arriba) desde izquierda a derecha es: 2ª, 1ª, 4ª, 3ª, hebra, formando la cadena de polipéptidos entre la 1ª y 4ª hebras la hélice alfa.

Selección y modificación de los aminoácidos que se van a modificar:

Partiendo de los datos de estructura correspondientes, tal como se encuentran disponibles con libre acceso por ejemplo en el Protein Data Bank™ (Berman y col., 2000; http://www.rcsb.org/pdb), se pueden localizar en la proteína de partida, por ejemplo, en el esqueleto proteico de ubiquitina, mediante análisis asistido por ordenador las posiciones de aquellos aminoácidos cuyas cadenas laterales están expuestas en la superficie, es decir dan al disolvente o a una pareja de unión potencial. Además se pueden identificar con análisis asistido por ordenador aquellos aminoácidos en la proteína de partida, por ejemplo, ubiquitina, cuya sustitución aleatoria pudiera tener presuntamente ningún o sólo un pequeño efecto negativo sobre la estabilidad del esqueleto proteico. Estas informaciones pueden representar un primer indicio para la idoneidad de cualquier aminoácido individual como elemento de un sitio de unión, lo que se debe comprobar luego en la práctica. En una forma de realización preferida de la presente invención se seleccionaron los aminoácidos en las posiciones 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 y 66 en la ubiquitina humana, por ejemplo, en base a su exposición en la superficie y a la tolerancia de toda la estructura frente al intercambio aleatorio. Las posiciones citadas se encuentran próximas espacialmente unas de otras al comienzo de la primera hebra en lámina plegada beta aminoterminal (pos. 2, 4, 6) así como en el bucle (pos. 62, 63) o bien al comienzo de la hebra en lámina plegada beta carboxiterminal (pos. 64, 65, 66) y forman con sus cadenas laterales de aminoácidos una región contigua en la superficie de la ubiquitina (figura 1). Mediante sustituciones de aminoácidos aleatorias (“aleatorización”) en la región analizada se puede generar -de forma análoga a los puntos de unión al antígeno de anticuerpos– una región expuesta en la superficie hipervariable sobre la estructura proteica intacta de la ubiquitina.

Con ayuda del software ProSAII (“Análisis de Estructuras de Proteínas”; Proceryon Biosciences, Salzburgo) se pudo determinar por ejemplo la estabilidad de la proteína de 104 variantes en comparación con la ubiquitina (WT) y una prueba al azar de igual magnitud de variantes, en la que se sustituyen los restos de un “epítopo de control” (posiciones aleatorizadas 24, 28, 31, 32, 35, 37, 38, 39). A este respecto aproximadamente el 19% de las variantes generadas in silico, que fueron sustituidas aleatoriamente en la región de los sitios de unión, presentan al menos estabilidad tan alta como la ubiquitina (WT), mientras que aproximadamente el 90% serían más estables que el portador del “epítopo de control” (figura 2). Este resultado asistido por ordenador puede servir luego como indicación de la elección de aminoácidos adecuados.

Según una forma de realización preferida se seleccionaron –partiendo de los datos de estructura disponibles de la ubiquitina humana– en primer lugar ocho posiciones de aminoácidos en la región de los sitios de unión que se generan. Mediante las modificaciones aleatorias de la secuencia primera en esta región (mutagénesis aleatoria) y subsiguiente selección específica se obtuvieron aquellas variantes que presentan la actividad de unión deseada de un hapteno o antígeno dado previamente o bien en general una pareja de unión predeterminada. Si bien a las proteínas modificadas obtenidas de este modo se les atribuye una nueva propiedad de unión, estas permanecen en lo que respecta a la estructura y propiedades químico-proteicas sustancialmente idénticas a la proteína de partida. Por tanto presentan ventajas como, por ejemplo, pequeño tamaño, gran estabilidad, preparación económica así como facilidad de modificación, emparejado con mayor afinidad y especificidad por un ligando definido previamente. La idoneidad de la ubiquitina como estructura de esqueleto para la generación de proteínas de unión sintéticas no era previsible, ya que 1º) la tolerancia del esqueleto frente al intercambio de aminoácidos de gran extensión no era de esperar debido al pequeño tamaño de la ubiquitina y 2º) la funcionalidad de los sitios de unión sintéticos con inclusión de la lámina plegada beta rígida y no flexible no era esperada de antemano.

Por antígeno se entiende de acuerdo con la invención una sustancia a la que se une un anticuerpo. El término antígeno comprende haptenos, péptidos, proteínas, azúcares, ADN, etc. De Roche Lexikon Medizin (4ª edición; http://www.gesundheit.de/roche) se desprende la siguiente definición para antígeno y hapteno, que se asume para la presente invención:

Antígeno (AG): designación de cualquier sustancia que es reconocida por el sistema inmune como extraña (“no propia”). Desencadena en la mayoría de los casos una reacción inmune que conduce a la inmunidad (= “inmunógeno”); en el caso de alergia (= “alérgeno”) o atopía (“atopígeno”) esta se supera. El AG desencadena una reacción de defensa humoral (reacción de antígeno-anticuerpo) y/o mediada por células (véase más adelante inmunidad). Si se admite el AG del sistema inmune (inmunotolerancia) se denomina también como “tolerogén”. Los antígenos son efectivos frente a sustancias complejas y de alto peso molecular (partículas de albúmina, polisacáridos, nucleótidos y múltiples compuestos sintéticos) con agrupaciones que se pueden caracterizar químicamente (determinantes), que son responsables de la respuesta inmune. Se diferencia entre 1) la mayor parte de los AG completos de alto peso molecular, que pueden desencadenar solos una reacción inmune, 2) como hapteno de bajo peso molecular (= semiantígeno), que actúa como inmunógeno ya tras el acoplamiento a una molécula portadora de gran tamaño. Se designa por ejemplo como xenó-, aló-o isógenos, AG autólogo; auto-AG, hetero-AG, AG de transplante, AG tumoral, AG de virus.

Hapteno: compuesto químico de bajo peso molecular, sencillo, que es responsable de la especificidad de un antígeno (AG) o bien es capaz mediante su estructura (determinante) de la unión específica del antígeno, al contrario que el AG completo, pero sin generar alergia alguna. Llega a ser un antígeno completo (antígeno) tras unión a una partícula de albúmina denominada portador.

Cabe destacar que con ayuda de la presente invención también es posible generar variantes de la ubiquitina, que presentan una propiedad de unión frente a sustancias no inmunogénicas como parejas de unión como, por ejemplo, marcadores de tumor.

En una forma de realización preferida de la presente invención se realiza una modificación, preferiblemente una sustitución al menos parcialmente en dos o varios aminoácidos directamente adyacentes en la secuencia primaria, encontrándose los aminoácidos adyacentes en la estructura terciaria adicionalmente preferiblemente al menos parcialmente en una hebra en lámina plegada beta de la proteína. Normalmente cualquier intercambio de un aminoácido en una proteína va acompañado de una afección en la estabilidad de la proteína. Pueden soportarse intercambios aislados sin desestabilización sustancial dado el caso en base al efecto de aminoácidos adyacentes. Con una modificación de una región completa, por ejemplo, de una unidad estructural constituida por varios aminoácidos adyacentes ya no se puede huir de una influencia en la estabilidad de los aminoácidos directamente adyacentes. En consecuencia hasta ahora en el estado de la técnica se modificaron sólo aminoácidos de la ubiquitina no directamente adyacentes. Fue sorprendente que con una modificación profunda de regiones de la proteína de este tipo mediante modificación de aminoácidos directamente adyacentes no se redujese esencialmente la estabilidad de la proteína. Fue sorprendente y no esperado el hecho de que dos aminoácidos directamente adyacentes en ubiquitina o proteínas con motivo de plegamiento de tipo ubiquitina se pudieran intercambiar sin que se viese perjudicada la estabilidad y estructura de la proteína.

La modificación de aminoácidos directamente adyacentes tiene además, particularmente en el caso de la ubiquitina relativamente pequeña, la ventaja de que se realiza una modificación por ingeniería genética más fácil que en el caso de los aminoácidos no directamente adyacentes. Según esta forma de realización se puede preparar por tanto una generación facilitada de una mayor cantidad de proteínas modificadas tanto sobre planos de proteína como también sobre planos de ADN.

Preferiblemente la cantidad de sustituciones de aminoácidos directamente adyacentes va de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 8 en los aminoácidos directamente adyacentes de secuencia primaria, adicionalmente preferiblemente de 3 a 7 o de 4 a 6 en los aminoácidos directamente adyacentes de secuencia primaria.

Si se sustituyen aminoácidos directamente adyacentes en la secuencia primaria una parte de estos aminoácidos puede alcanzar la región de una hebra en lámina plegada beta. Esta parte que se alcanza en la región de una hebra en lámina plegada beta puede presentar una longitud de dos o más aminoácidos, preferiblemente dos o tres aminoácidos. La región de aminoácidos directamente adyacentes se encuentra por tanto al comienzo o al final de una región de hebra en lámina plegada beta que preferiblemente es de 2 a 3 aminoácidos de longitud.

En una forma de realización preferida adicional se modifican 5 o más aminoácidos directamente adyacentes, preferiblemente se sustituyen, formando dos o más, preferiblemente dos o tres aminoácidos directamente adyacentes el comienzo o el final de una región de hebra en lámina plegada beta. Como límite superior para la cantidad total de aminoácidos modificados directamente adyacentes se pueden preveer en este caso preferiblemente 8, 9 ó 10 aminoácidos, con especial preferencia 8 aminoácidos.

En el caso de la modificación de aminoácidos directamente adyacentes en una hebra en lámina plegada beta de la ubiquitina estos aminoácidos están por lo general todos expuestos en la superficie, encontrándose estos aminoácidos al comienzo o al final de una hebra en lámina plegada beta. En este caso se puede aceptar que todos los aminoácidos sean partícipes de la generación de la nueva propiedad de unión.

En una forma de realización preferida de la presente invención se modifican para la generación de una región con nuevas propiedades de unión aquellos aminoácidos que forman una región contigua sobre la superficie de la proteína. De este modo se puede generar una región contigua con una propiedad de unión no presente previamente. Por “región conjunta” se entiende lo siguiente de acuerdo con la invención: aminoácidos que interactúan debido a la carga, estructura especial e hidrofobia/hidrofilia de sus cadenas laterales de la forma correspondiente con su entorno. El entorno puede ser el disolvente, entre otros, agua, u otras moléculas, por ejemplo, aminoácidos espacialmente adyacentes. Mediante la información de estructura de la proteína así como el software correspondiente se puede representar la superficie de la proteína. Por ejemplo se puede visualizar la región límite entre los átomos de la proteína y el disolvente incluyendo la información cómo se estructura esta región límite, cuyos segmentos de superficie son accesibles para el disolvente o cómo se dispone la distribución de carga sobre la superficie. Se puede reconocer una región contigua, por ejemplo, mediante una visualización con un software adecuado. Tales procedimientos son conocidos por el especialista en la técnica. Fundamentalmente se encuentra disponible de acuerdo con la invención también toda la región expuesta en la superficie como región contigua sobre la superficie para una modificación para la generación de nuevas propiedades de unión. Preferiblemente una modificación puede comprender para este fin también la región en hélice α.

Forzosamente es necesaria la modificación de aminoácidos en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína que comprenda al menos una hebra en lámina plegada β de la región en lámina plegada β. La estructura en lámina plegada beta se define porque se presenta esencialmente en forma de planchas y casi completamente extendida. Por el contario a las hélices alfa que se forman a partir de una parte continua de la cadena de polipéptidos, las láminas plegadas beta se pueden formar a partir de distintas regiones de la cadena de polipéptidos. De este modo se pueden conseguir en la estructura primaria otras regiones separadas en proximidad directa. Una hebra beta presenta una longitud normalmente de 5 a 10 aminoácidos y se encuentra casi completamente extendida. Las hebras beta se encuentran tan estrechamente cercanas una de otra que forman puentes de hidrógeno entre el grupo C=O de una y el grupo NH de la otra hebra o viceversa. Las láminas plegadas beta pueden estar constituidas por varias hebras y tienen una estructura en forma de planchas. A este respecto el átomo alfa de C se encuentra siempre intercambiado por encima o por debajo del plano en forma de plancha. Las cadenas laterales de aminoácidos siguen este patrón y por tanto se dirigen alternativamente una hacia arriba y una hacia abajo. Según cada orientación de las hebras beta se diferencian láminas plegadas en paralelo y en antiparalelo. De acuerdo con la invención se pueden mutagenizar ambas y usarse para la preparación de las proteínas reivindicadas.

Para la mutagénesis de la estructura en lámina plegada beta se seleccionan regiones en lámina plegada beta en la proteína que son cercanas a la superficie. Se pueden identificar aminoácidos expuestos en la superficie en función de la estructura cristalina de rayos X presente. Si no se encuentra ninguna estructura cristalina entonces se puede ensayar mediante análisis informático, en función de las regiones en lámina plegada beta expuestas en la superficie de la estructura primaria presentes y predecir la accesibilidad de posiciones de aminoácidos individualmente (www.embl heideberg.de/predictprotein/predictprotein.html) o modelizar la estructura de la proteína en 3d (www.expasy.ch/swissmo/SWISS-MODEL.html) y con ello obtener la confirmación de posibles aminoácidos expuestos en la superficie.

Sin embargo son también posibles mutagénesis en la lámina plegada beta en las que se obtiene una preselección que lleva tiempo de las posiciones de aminoácidos que se van a mutagenizar. Aquellas regiones de ADN que codifican las estructuras en lámina plegada beta se aíslan de su entorno de ADN, se somete a una mutagénesis controlada aleatoriamente y a continuación se integran de nuevo en el ADN que codifica la proteína de cual se recogieron previamente. Esto es seguido de un procedimiento de selección de mutantes con las propiedades de unión deseadas.

En una forma de realización adicional de la invención, como ya se citó anteriormente, se seleccionan las regiones en lámina plegada beta próximas a la superficie y se identifican dentro de estas regiones seleccionadas las posiciones de aminoácidos que se van a mutagenizar. Estas posiciones de aminoácidos así seleccionadas se puede someter a mutagénesis sobre plano de ADN, es decir, un codón que codifica un determinado aminoácido se intercambia por un codón que codifica otro aminoácido específico seleccionado previamente, o se realiza este intercambio en el marco de una mutagénesis aleatoria comprobándose la posición de aminoácido que se intercambia, pero por contra no el codón que codifica el nuevo aminoácido aún no determinado.

Los aminoácidos expuestos en la superficie son accesibles para el disolvente del entorno. Con una accesibilidad de los aminoácidos en la proteína de más del 8% en comparación con la accesibilidad de los aminoácidos en el tripéptido modelo Gly-X-Gly hablamos de aminoácidos expuestos en la superficie. Estas regiones proteicas o posiciones de aminoácidos individuales son también sitios de unión preferidos para posibles parejas de unión que se deben seleccionar de acuerdo con la invención. Se hace referencia complementaria también a Connolly y col., 1983, y Shrake y col., 1973, cuyas revelaciones se recogen por completo en la solicitud.

Se pueden generar variantes del esqueleto proteico de ubiquitina, que se diferencian por intercambios de aminoácidos en la región de los sitios de unión sintéticos de nueva generación de la proteína parental y entre ellas, mediante mutagénesis dirigida de los segmentos de secuencia correspondientes. A este respecto se pueden reemplazar o sustituir aminoácidos con determinadas propiedades como, por ejemplo, polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia o hidrofilia por aminoácidos con otras propiedades correspondientes. La expresión “mutagénesis” comprende además de sustituciones también inserciones y deleciones. Sobre los planos de proteínas se pueden llevar a cabo las modificaciones también por modificación química de las cadenas laterales de aminoácidos según procedimientos conocidos por el especialista en la técnica.

Como punto de partida para la mutagénesis de los segmentos de secuencia correspondientes puede servir, por ejemplo, el ADNc de una proteína de tipo ubiquitina, que se puede preparar, modificar y reproducir con los procedimientos conocidos por el especialista en la técnica. Para la modificación dirigida específica de sitio de la ubiquitina en regiones relativamente pequeñas de la secuencia primaria (aproximadamente de 1 a 3 aminoácidos) se dispone de reactivos y procedimientos que se adquieren comercialmente ("Quick Change", Stratagene; "Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit", Biorad). Para la mutagénesis dirigida específica de sitio de regiones mayores el especialista en la técnica dispone de realizaciones especiales, por ejemplo, de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A este respecto, por ejemplo, se puede usar una mezcla de oligodesoxinucleótidos sintéticos, que presentan en las posiciones deseadas composiciones de pares de bases degeneradas, para la incorporación de la mutación. Esto se puede conseguir también con el uso de análogos a pares de bases con origen distinto a ADN genómico como, por ejemplo, inosina.

El punto de partida de la mutagénesis de una o varias hebras en lámina plegada β de la región en lámina plegada β así como de forma opcional de la región en lámina plegada no β puede ser, por ejemplo, el ADNc de una proteína de tipo ubiquitina o también el ADN genómico. También se puede preparar sintéticamente el gen que codifica la proteína.

Para la mutagénesis se dispone de los procedimientos conocidos más diversos, tratándose de procedimientos de mutagénesis específica del sitio, procedimientos de mutagénesis dirigida aleatoriamente, la mutagénesis con ayuda de PCR o procedimientos comparables.

En una forma de realización preferida de la invención se predeterminan las posiciones de aminoácidos que se van a someter a mutagénesis. La elección de los aminoácidos que se van a modificar se realiza bien en función de la proteína que se va a modificar y/o en función de la pareja de unión seleccionada. En cualquier caso se aborda en general una biblioteca de diversos mutantes que se criba con ayuda de procedimientos conocidos. Una elección previa de los aminoácidos que se van a modificar es especialmente sencilla de acometer si se dispone de suficiente información de la estructura de la proteína que se va a modificar. Pero también es posible alterar la proteína con el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina sin información de la estructura con ayuda de procedimientos que emplean mutagénesis aleatoria y subsiguiente selección, en tanto posea afinidad de unión con los ligandos o parejas de unión predeterminados.

Los procedimientos de mutagénesis dirigida así como la mutagénesis de segmentos de secuencia más largos, por ejemplo mediante PCR, mediante mutagénesis química o mediante uso de cepas mutadoras bacterianas responden igualmente al estado de la técnica y se pueden usar de acuerdo con la invención.

En una forma de realización de la invención la mutagénesis se realiza mediante ensamblado de oligonucleótidos de ADN con el codón de aminoácido NNK. Evidentemente se pueden usar también otros codones (tripletes).

Las mutaciones son tales que se conserva la estructura en lámina plegada beta. Por lo general la mutagénesis se encuentra en la cara exterior de una región en lámina plegada beta expuesta a la superficie de la proteína. Esta comprende tanto mutagénesis específica del sitio como también controlada aleatoriamente. Las mutagénesis específicas del sitio que comprenden una región relativamente pequeña en la estructura primaria (aproximadamente de 3 a 5 aminoácidos) se pueden llevar a cabo con el kit comercial de Stratagene (QuickChange) o Bio-Rad (kit para mutagénesis in vitro Muta-Gene phagemid) (véanse los documentos US-A-5.789.166; US-A-4.873.192).

Para regiones mayores de una mutagénesis dirigida específica de sitio se debe preparar un casete de ADN, obteniéndose la región que se va a someter a mutagénesis mediante ensamblado de oligonucleótidos que contienen las posiciones mutadas y las no modificadas (Nord y col., 1997; McConell y Hoess, 1995). Las mutagénesis controladas aleatoriamente se pueden llevar a cabo mediante multiplicación del ADN en cepas mutadoras o mediante una amplificación por PCR (PCR proclive al error) (por ejemplo, Pannekoek y col., 1993). A este respecto se usa una polimerasa con mayor tasa de error. Para aumentar el grado de mutagénesis o bien combinar distintas mutaciones, se pueden combinar las mutaciones en los fragmentos de PCR mediante redistribución de ADN (Stemmer, 1994). Se da una recapitulación sobre estas estrategias de mutagénesis en enzimas por parte de Kuchner y Arnold (1997). Para llevar a cabo esta mutagénesis controlada aleatoriamente en una región de ADN seleccionada se debe construir igualmente un casete de ADN que se usa para la mutagénesis.

El intercambio aleatorio de aminoácidos según un ejemplo de realización de la presente invención en las posiciones 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 y 66 de la ubiquitina se puede realizar con especial facilidad mediante PCR, ya que las posiciones citadas se encuentran próximas al término amino o al término carboxi de la proteína. En consecuencia los codones que se van a manipular se encuentran en los extremos 5' o 3' de la hebra de ADNc correspondiente. De este modo el primer oligodesoxinucleótido en su secuencia usado para una reacción de PCR mutágena -previsto con los codones de las posiciones 2, 4 y 6 que van a mutar – corresponde a la hebra de codificación del término amino de la ubiquitina. El segundo oligodesoxinucleótido corresponde en consecuencia – hasta los codones de las posiciones 62, 63, 64, 65 y 66 que van a mutar – al menos parcialmente a la hebra que no codifica la secuencia de polipéptidos del término carboxi. Con ambos oligodesoxinucleótidos se puede llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa con uso de la secuencia de ADN que codifica el esqueleto proteico de la ubiquitina como matrices.

Adicionalmente se puede incorporar el producto de amplificación obtenido con uso de oligodesoxinucleótidos de flanqueo, que incorporan por ejemplo secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción, a una reacción en cadena de la polimerasa. Las moléculas de ADN sintéticas obtenidas se pueden ligar, es decir unir, tras la hidrólisis con las endonucleasas de restricción adecuadas con secuencias de ácidos nucleicos preparadas en correspondencia, por ejemplo, de vectores de clonación o expresión. Tales protocolos y sistemas se adquieren comercialmente y son conocidos por el especialista en la técnica, por ejemplo, en Novagen (Madison, WI), IBA (Göttingen) o New England Biolabs (Beverly, MA)): de acuerdo con la invención se prefiere pasar el casete génico obtenido a un sistema vector, que sea adecuado para el uso en los siguientes procedimientos de selección para el aislamiento de variantes de la ubiquitina con propiedades de unión para un hapteno o antígeno previamente determinado.

Según una forma de realización preferida de la presente invención se modifican sólo posiciones de aminoácidos para la formación de una nueva propiedad de unión, que no pertenecen a las regiones que forman parte en la ubiquitina no modificada de uniones a parejas de unión de ubiquitina natural. De este modo se puede asegurar que no sólo se modifican propiedades de unión presentes previamente de la ubiquitina.

Las regiones para la modificación se pueden seleccionar básicamente si estas pueden ser accesibles para una posible pareja de unión, y si la estructura global de la proteína se muestra presuntamente tolerante frente a una modificación.

Según la presente invención se pueden modificar, preferiblemente sustituir, en la proteína, preferiblemente ubiquitina de mamíferos, al menos el 15% de los aminoácidos que se encuentran en las hebras beta, preferiblemente al menos el 20%, adicionalmente preferiblemente al menos el 25%, para generar una propiedad de unión no presente previamente. Como máximo se modifican a este respecto preferiblemente aproximadamente el 40% de los aminoácidos que se encuentran en las hebras beta, adicionalmente preferiblemente como máximo aproximadamente 35% y aún más preferiblemente aproximadamente el 30%.

Según un ejemplo de realización de la presente invención se modificaron, por ejemplo, 6 de los 24 aminoácidos que se encuentran en las hebras beta para generar una propiedad de unión para una pareja de unión predeterminada. La elección de un mayor número de aminoácidos para modificaciones da la posibilidad de generar una biblioteca mayor de proteínas con afinidad de unión, de modo que aumenta la probabilidad de que una de estas proteínas modificadas presente una afinidad de unión cuantificable y/o alta con una pareja de unión predeterminada.

Adicionalmente se puede realizar además de una modificación en hebras beta también una modificación en otras regiones expuestas en la superficie de la proteína, preferiblemente por ejemplo en regiones bucle. Estas regiones modificadas pueden tomar parte también en la unión de nueva generación además de las regiones modificadas en las hebras beta.

Según una forma de realización preferida adicional de la presente invención se pueden modificar al menos 6, preferiblemente al menos 8, aminoácidos expuestos en la superficie de una ubiquitina, preferiblemente ubiquitina de mamífero o humano, prefiriéndose una sustitución como modificación. Estos al menos 6 aminoácidos modificados expuestos en la superficie forman luego la región con afinidad de unión con la pareja de unión predeterminada. A este respecto se prefiere especialmente que se encuentren al menos 4, preferiblemente al menos 6, adicionalmente preferiblemente al menos 8 de los aminoácidos expuestos en la superficie en una región en lámina plegada beta, es decir, en una hebra en lámina plegada beta o distribuidos en varias hebras beta. Además se prefiere que se encuentren al menos 5 de los aminoácidos modificados, preferiblemente sustituidos en la vecindad directa en la secuencia primaria.

En una forma de realización preferida adicional de la presente invención se modifican en la proteína aminoácidos en al menos dos, preferiblemente exactamente dos, de las cuatro hebras beta, para generar una nueva propiedad de unión. Igualmente se prefiere una modificación en tres o cuatro de las cuatro hebras beta para la generación de una propiedad de unión no presente previamente frente a un asociado de unión seleccionado.

Se prefiere especialmente que se modifiquen, preferiblemente se sustituyan, los aminoácidos en la hebra aminoterminal y la hebra carboxiterminal, para generar nuevas propiedades de unión. Se prefiere a este respecto adicionalmente que se modifiquen, preferiblemente se sustituyan, adicionalmente aminoácidos en el bucle limitante en la hebra en lámina plegada beta carboxiterminal.

Se prefiere especialmente una modificación, preferiblemente sustitución, en las siguientes posiciones de una ubiquitina de mamífero, preferiblemente ubiquitina humana: 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, 66. Estos aminoácidos forman una región conjunta expuesta en la superficie contigua sobre la superficie de la ubiquitina, que resulta especialmente adecuada para la generación de proteínas modificadas con una afinidad de unión previamente no presente frente a una pareja de unión.

La sustitución de aminoácidos para la generación de nuevas propiedades de unión se puede realizar de acuerdo con la invención con aminoácidos deseados, es decir en la modificación para la generación de nuevas propiedades de unión no se tiene que tender en cuenta que los aminoácidos presenten una propiedad química similar o bien una cadena lateral similar a los aminoácidos intercambiados, sino que dispongan de aminoácidos deseados para tal fin.

Según esta invención pueden seleccionarse como proteínas que se modifican para la generación de afinidades de unión previamente no presentes frente a las parejas de unión seleccionadas que ya presentan antes de esta modificación otras modificaciones como sustituciones, inserciones, deleciones y/o modificaciones químicas, de modo que se eliminan funciones biológicas y/o químico-proteicas de la proteínas o se dotan de nuevas. Así por ejemplo se pueden eliminar ya de antemano las propiedades de unión de ubiquitina en su pareja de unión natural.

De este modo se usó en una forma de realización de la presente invención una variante de la ubiquitina humana, en la que se sustituyó el aminoácido fenilalanina en la posición 45 por triptófano. De este modo se pudo proporcionar manteniendo la estructura y estabilidad de la ubiquitina una proteína que presenta en base al intercambio mejores propiedades espectroscópicas frente a la ubiquitina.

En otra forma de realización de la presente invención se sustituyeron por ejemplo en ubiquitina humana las posiciones 44, 48, 54, 70, 72 y 75 y se delecionó el aminoácido 76. De este modo se pudieron proporcionar con mantenimiento de la estructura y estabilidad de ubiquitina una proteína que ya no puede desempeñar las funciones naturales de la ubiquitina.

En total se obtiene si se usa una ubiquitina ya modificada previamente, nuevas propiedades de unión no presentes previamente, preferiblemente una ubiquitina en la que se intercambian en total al menos 10, preferiblemente al menos 15 aminoácidos de la ubiquitina natural o en general una ubiquitina de mamífero. Según un ejemplo de realización se podría obtener una ubiquitina modificada que presenta manteniendo su estructura original 14 sustituciones y una deleción. Referido a la cantidad total de aminoácidos de la ubiquitina esto corresponde a un porcentaje de aproximadamente 20%. Esto era extraordinariamente sorprendente y no era de esperar ya que normalmente es suficiente un porcentaje mucho más pequeño para alterar el plegamiento de la proteína.

La etapa de la modificación de los aminoácidos seleccionados se realiza de acuerdo con la invención preferiblemente mediante mutagénesis sobre el plano del gen mediante mutagénesis aleatoria, es decir, un intercambio aleatorio de los aminoácidos seleccionados. Preferiblemente se realiza la modificación en la etapa d) mediante procedimientos de ingeniería genética para la modificación de un ADN que pertenece a la proteína correspondiente. Preferiblemente se realiza la expresión de la proteína en organismos procariotas o eucariotas.

Se puede preparar igualmente preferiblemente una proteína modificada de acuerdo con la invención mediante síntesis química. En esta forma de realización se llevan a cabo las etapas c) a d) de la reivindicación 1 en una etapa.

Selección o detección de aminoácidos con afinidad de unión con una pareja de unión predeterminada:

Después de generar una biblioteca de proteínas mediante modificación de aminoácidos seleccionados se ponen en contacto las proteínas modificadas de acuerdo con la invención con una pareja de unión predeterminada, para hacer posible dado el caso una unión de las parejas entre ellas si se da una afinidad de unión.

La puesta en contacto se realiza de acuerdo con la invención preferiblemente mediante un procedimiento de presentación y selección adecuada como los procedimientos de presentación en fago, presentación en ribosoma, presentación en ARNm o presentación en superficie celular, presentación en superficie de levadura o presentación en superficie bacteriana, preferiblemente mediante el procedimiento de presentación en fago. Para la explicación completa se hace referencia también a las siguientes referencias bibliográficas: Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 572-579; Wells y Lowmann, Curr. Opin. Strut. Biol. 2 (1992), 597-604; Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins -A Laboratory Manual (1996), Academic Press. Los procedimientos citados anteriormente son conocidos por el especialista en la técnica y se pueden usar de acuerdo con la invención, incluyendo variaciones de los mismos.

La determinación de si la proteína modificada presenta una afinidad de unión cuantificable con una pareja de unión predeterminada se puede realizar de acuerdo con la invención preferiblemente mediante uno o varios de los siguientes procedimientos: ELISA, espectroscopía de resonancia de plasmón superficial, espectroscopía de fluorescencia, FACS, calorimetría de valoración isotérmica y ultracentrifugación analítica.

Como ejemplo de un procedimiento de selección de acuerdo con la invención para variantes de ubiquitina con propiedades de unión se describe a continuación una forma adaptada a este uso del procedimiento de presentación en fago. Igualmente pueden ser de utilidad, por ejemplo, procedimientos para la presentación en bacterias (presentación en superficie bacteriana; Daugherty y col., 1998) o células de levadura (presentación en superficie de levadura; Kieke y col., 1997) o bien sistemas de selección sin células como la presentación en ribosoma (Hanes y Plückthun, 1997; He y Taussig, 1997) o la presentación en cis (Odegrip y col., 2003) o la presentación en ARNm. A este respecto se consigue una unión física transitoria de geno-y fenotipo mediante el acoplamiento de las variantes de proteína con el ARNm correspondiente sobre el ribosoma.

En el procedimiento de presentación en fago aquí descrito se presentan variantes recombinantes de la ubiquitina sobre fagos filamentosos, mientras que el ADN de codificación de la variante presentada se presenta empaquetado simultáneamente en forma de hebra individual en la cápsida de fagos. De este modo se pueden seleccionar después de un enriquecimiento de la afinidad variantes con propiedades determinadas de una biblioteca y cuya información genética se amplifica con la infección de bacterias adecuadas o bien se incorpora un ciclo de enriquecimiento adicional. La presentación de la ubiquitina mutada en la superficie del fago se consigue mediante la fusión genética con una secuencia de señal aminoterminal – preferiblemente de la secuencia de señal PeIB – y una proteína de envoltura o superficie del fago – preferiblemente la fusión carboxiterminal con la proteína de envoltura pIII o un fragmento de la misma. Adicionalmente la proteína de fusión codificada puede contener también otros elementos funcionales como, por ejemplo, un apéndice de afinidad o un epítopo de anticuerpo para la detección y/o la purificación por cromatografía de afinidad o una secuencia de reconocimiento de la proteasa para la escisión específica de la proteína de fusión en el transcurso del enriquecimiento de la afinidad. Adicionalmente se puede encontrar entre el gen para la variante de ubiquitina y la región de codificación para la proteína de envoltura del fago

o su fragmento, por ejemplo, un codón de parada Amber, que se lee en una cepa supresora adecuada durante la traducción en parte mediante la inclusión de un aminoácido.

El vector bacteriano que es adecuado para el procedimiento de selección tras el aislamiento de variantes de ubiquitina con propiedades de unión para un hapteno o antígeno determinado previamente y se inserta en el casete del gen para la proteína de fusión descrita, se designa como fásmido. Este presenta, entre otros, la región intergenética de un fago filamentoso (por ejemplo, M13 o f1) o de una parte del mismo, lo que con superinfección de las células bacterianas que portan el fagémido con fagos ayudantes como, por ejemplo, M13K07 conduce a un empaquetamiento de una hebra cerrada del ADN fásmido en la envoltura del fago. Los fagémidos así generados se secretan por la bacteria y presentan la variante de ubiquitina codificada respectiva – en base a su fusión con la proteína de envoltura pIII o su fragmento – sobre su superficie. Mediante la presencia de proteínas de envoltura pIII nativas en el fagémido se conserva esta capacidad de cepas de bacterias adecuadas de infectar de nuevo y con ello se consigue la posibilidad de multiplicar el ADN correspondiente. De este modo se asegura la unión física entre el fenotipo de la variante de ubiquitina – es decir, su propiedad de unión potencial – y su genotipo. En el presente ejemplo se usa el fásmido construido a tal fin pMUBI-1 (figura 3) para la inserción de la secuencia de codificación de variantes de ubiquitina y para la obtención de fagémidos.

Los fásmidos obtenidos se pueden seleccionar en relación a la unión de sus variantes de ubiquitina presentadas en haptenos o antígenos predeterminados mediante procedimientos conocidos por el especialista en la técnica. A tal fin se pueden inmovilizar las variantes de ubiquitina presentadas, por ejemplo, en sustancia diana unida a placas de microtítulos y eluir específicamente tras separación de variantes no unidas. La elución se realiza preferiblemente con soluciones básicas como, por ejemplo, trietilamina 100 mM. De forma alternativa se puede realizar la elución en condiciones ácidas, la proteolisis o la adición directa de bacterias infectables. Los fagémidos así obtenidas se pueden reamplificar y enriquecer mediante ciclos sucesivos de selección y amplificación de variantes de ubiquitina con propiedades de unión para un hapteno o antígeno determinado previamente.

La caracterización adicional de las variantes de ubiquitina obtenidas de esta forma se puede realizar como fagémido, es decir, en fusión con los fagos o tras reclonación de los casetes génicos correspondientes en un vector de expresión adecuado como proteína soluble. Los procedimientos correspondientes son conocidos por el especialista en la técnica o se describen en la bibliografía. La caracterización puede comprender, por ejemplo, la determinación de la secuencia de ADN y con ello de la secuencia primaria de las variantes aisladas. Además se puede determinar la especificidad de las variantes aisladas, por ejemplo, mediante procedimientos inmunológicos convencionales como ELISA o espectroscopía de resonancia de plasmón superficial, espectroscopía de fluorescencia, FACS, calorimetría de valoración isotérmica o ultracentrifugación analítica. En lo que respecta al análisis de estabilidad se conocen por el especialista en la técnica, por ejemplo, procedimientos espectroscópicos en relación con desplegamiento químico o físico.

En el procedimiento de presentación en ribosoma usado igualmente se preparan variantes de ubiquitina mediante un sistema de transcripción/traducción libres de células y se presentan como complejo con el ARNm correspondiente así como el ribosoma. A este respecto se parte de una de las bibliotecas de ADN descritas anteriormente en las que los genes de las variantes se presentan fusionadas con secuencias regulatorias correspondientes para la expresión y la biosíntesis proteica. Mediante la deleción del codón de parada en los extremos 3’ de la biblioteca génica así como uniones experimentales adecuadas (baja temperatura, alta concentración de Mg2+) se conserva el complejo ternario de la proteína en crecimiento, ARNm y ribosoma durante la trascripción/traducción in vitro.

Estos complejos se pueden seleccionar en lo que respecta a la unión de la variante de ubiquitina presentada sobre ellos en haptenos o antígenos predeterminados mediante los procedimientos conocidos por el especialista en la técnica. A tal fin se pueden inmovilizar transitoriamente las variantes de ubiquitina presentadas en los complejos de ribosomas, por ejemplo, en sustancias diana unida a placas de microtítulos o bien se unen tras unión en solución a partículas magnéticas. Tras la separación de las variantes que no se unen se puede eluir específicamente la información genética de variantes de unión activa mediante descomposición del complejo de ribosomas en forma de ARNm. La elución se realiza preferiblemente con EDTA 50 mM. El ARNm así obtenido se puede aislar y reconducir con procedimientos adecuados a ADN (reacción de transcriptasa inversa) y se reamplifican los ADN así obtenidos.

Mediante ciclos sucesivos de transcripción / traducción in vitro, se pueden enriquecer las variantes de ubiquitina con propiedades de unión para un hapteno o antígeno determinados previamente.

La caracterización adicional de las variantes de ubiquitina obtenidas de esta forma se puede realizar tras reclonación de los casetes génicos correspondientes en un vector de expresión adecuado como proteína soluble como se citó anteriormente. Los procedimientos correspondientes son conocidos por el especialista en la técnica o se describen en la bibliografía.

Preferiblemente a continuación de la etapa (d) de detección de las proteínas con una afinidad de unión frente a una pareja de unión predeterminada sigue una etapa de aislamiento y/o enriquecimiento de la proteína detectada.

Tras la expresión de proteínas modificadas de acuerdo con la invención con el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina se pueden purificar y enriquecer adicionalmente estas mediante procedimientos conocidos. Los procedimientos seleccionados dependen de algunos factores conocidos por el especialista en la técnica, por ejemplo del vector de expresión usado, del organismo huésped, del ámbito de uso posterior, del tamaño de la proteína y otros factores. Para la purificación sencilla se pueden fusionar las proteínas modificadas de acuerdo con la invención con otras secuencias de péptidos, que muestran una mayor afinidad con los materiales de separación. Tales fusiones se seleccionan preferiblemente de modo que no modifiquen de forma desventajosa la funcionalidad de la proteína de ubiquitina, o que se puedan separar de nuevo mediante integración de sitios de corte de proteasa específicos tras la purificación. Tales procedimientos son conocidos igualmente por el especialista en la técnica.

De acuerdo con la invención y particularmente se pueden aislar según los procedimientos ya descritos variantes generales de la ubiquitina con afinidad de unión para una pareja de unión determinada previamente como, por ejemplo, un hapteno o antígeno.

Como pareja de unión para las proteínas modificadas preparadas de acuerdo con la invención se pueden usar todas las moléculas biológica y médicamente activas y de relevancia. A continuación se citan a modo de ejemplo posibles parejas de unión. Sin embargo se debe observar que esta lista se puede completar con una pluralidad de otros posibles ligandos. De forma similar a la relación de anticuerpo a antígeno se puede completar la lista de las parejas de unión potenciales con otros ligados potenciales.

Preferiblemente se tratan las parejas de unión de un receptor biológico, preferiblemente receptor acoplado con proteína G (GPCR; por ejemplo, receptor GLP-1 humano, receptor PTH humano), o receptor EGF, HER2, HER3, VEGF/R1-4, Ep-CAM, o un ligando o un dominio del mismo, un marcador tumoral (antígeno de membrana específico de próstata (PSMA)), citoquina (factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), factor de necrosis tumoral beta (TNF-β)), interleuquinas (por ejemplo, IL-2, IL-6, IL-11, IL-12), factores de crecimiento (por ejemplo, NGF (factor de crecimiento de nervios) y su proforma ProNGF, BMPs, EGF, MIA, MIA-2, FGFs, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), PDGF, PlGF, IGFs), quinasas, integrinas (por ejemplo, receptor de glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)), HSA (albúmina de suero humano), fimbrias F4, antígeno de célula T y B, preferiblemente CD4, CD11, CD14, CD16, CD20, CD22, CD25, CD34, CD47, CD56, CD83, CD154, CTLA-4, una inmunoglobulina o una parte de la misma, por ejemplo, un anticuerpo completo (por ejemplo, inmunoglobulina G, E, M), una parte FC, por ejemplo, de inmunoglobulina humana M o una región de un anticuerpo en la región del sitio de unión del antígeno, o un azúcar (Lewis Y, Lewis X), o una toxina por ejemplo micotoxina o una hormona, por ejemplo, hidrocortisona.

Se trata de una ventaja especial de la presente invención que las proteínas modificadas o ubiquitinas sean activas tanto intra-como también extracelularmente, es decir, se unen a su pareja de unión correspondiente dentro y fuera de una célula.

Es una ventaja especial que las proteínas modificadas o ubiquitinas de la presente invención puedan unirse de forma cuantificable tanto a hapteno, por tanto moléculas pequeñas, como también a antígenos, por tanto moléculas grandes, como también a proteínas. Con esta variabilidad de proteínas modificadas de acuerdo con la invención se proporcionan universalmente una gran amplitud de parejas de unión y posibles parejas de unión de nueva generación.

Las proteínas de la presente invención se pueden usar además para la detección y para la determinación cuantitativa así como para la separación y aislamiento de la pareja de unión correspondiente.

Un uso adicional se encuentra en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades en las que está implicada la pareja de unión correspondiente.

Como ya se citó anteriormente la presente invención se refiere también a la modificación intencionada de posiciones de aminoácidos individuales, que se encuentran fuera de los sitios de unión sintéticos generados de nuevo. Así se pueden ocupar, por ejemplo, posiciones, que están ocupadas en la ubiquitina natural con aminoácidos que son responsables de su función biológica, con otros aminoácidos. De este modo se obtiene un esqueleto de ubiquitina inactivo – en referencia a sus funciones biológicas que se refieren por ejemplo a la interacción con enzimas de la cascada de ubiquitinilación -, que sin embargo es sustancialmente idéntico en lo referente a su estructura y a las propiedades químico-proteicas con la proteína de partida. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante la determinación de la tasa de expresión en E. coli, el análisis de la estabilidad con procedimientos espectroscópicos como medida de fluorescencia o dicroísmo circular en unión con desplegamiento químico o físico o la detección en ensayos convencionales inmunológicos como ELISA.

Por ejemplo, se puede impedir mediante las sustituciones Arg54 y Arg72 respectivamente con Leu la interacción con el enzima E1 que se activa con ubiquitina (Burch y Haas, 1994). Adicionalmente los aminoácidos Lys48 así como Val70 a Gly76, entre otros, toman parte en la interacción con el enzima E2 que se conjuga con la ubiquitina, lo que se impide con las sustituciones correspondientes (Miura y col., 1999). Además la unión de ubiquitina con proteínas determinadas para la degradación proteolítica o la unión covalente con cadenas de poliubiquitina que se realiza selectivamente con los restos Gly75 y Gly76 y se puede impedir con sustituciones correspondientes. Finalmente los intercambios de Ile44Ala y Val70Ala impiden sustancialmente el contacto de ubiquitina con la proteasa 26S y con ello la degradación de proteínas marcadas con ubiquitina (Beal y col., 1996). En una realización preferida de la invención un esqueleto de proteína ubiquitina modificado con las sustituciones Ile44Ala, Lys48Arg, Arg54Leu, Val70Ala, Arg72Leu, Gly75Ala así como con la deleción Gly76 sirve como punto de partida para la obtención de ubiquitinas modificadas con nuevas propiedades de unión. Este esqueleto de proteína ubiquitina modificado es sustancialmente idéntico a ubiquitina en lo que respecta a su estructura y sus propiedades químico-proteicas, es decir, estabilidad, desplegamiento, capacidad de producción en E. coli, interacción con antisuero anti-ubiquitina, etc., lo que se determinó con los procedimientos anteriormente citados.

Fue sorprendente que las modificaciones citadas por separado en las distintas referencias se pudieran resumir en una única ubiquitina, sin cambiar su estructura o estabilidad esencialmente.

Es sorprendente con el enfoque descrito en el que se fundamenta esta invención, que sea posible obtener proteínas modificadas basadas en proteínas con un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, que presenten por un lado nuevas propiedades de unión generadas y por otro lado posean sustancialmente las propiedades químico-proteicas de la ubiquitina. A este respecto las proteínas modificadas basadas en ubiquitina presentan constantes de disociación preferiblemente de 10-6 M o inferior, por ejemplo de 10-6 a 10-12 M, que son comparables con las de anticuerpos o sus fragmentos. Además se consigue generar de forma asombrosa proteínas modificadas con propiedades de unión específicas opcionalmente contra moléculas grandes como proteínas o también moléculas pequeñas como haptenos u hormonas. A este respecto se pueden unir las sustancias diana o clases de sustancias diana definidas previamente con mayor selectividad. La funcionalidad observada de los sitios de unión sintéticos de nueva generación en lo que respecta a la afinidad y especificidad no era de esperar a priori ya que otras regiones de los sitios de unión se encuentran en la lámina plegada beta prevista en general como rígida y no flexible. En contraposición a esto se configuran sitios de unión naturales universales como, por ejemplo, los de anticuerpos – mediante estructuras curvas (“bucle”) flexibles.

Es además sorprendente que el esqueleto proteico de ubiquitina usado en este caso tolere de forma clara las profundas modificaciones realizadas de la secuencia primaria, sin que se vea perjudicado el plegamiento de la cadena de polipéptidos. Esto no es sólo inesperado a la vista de la cantidad de intercambios de aminoácidos – se podrían cambiar aproximadamente el 20% de la secuencia de la ubiquitina natural -, sino también en base a la situación de las posiciones modificadas en el esqueleto proteico. Así por ejemplo no sería de esperar a priori una tolerancia frente a intercambios dentro de la lámina plegada beta prevista en general como rígida e inflexible, de forma particular de aminoácidos no directamente adyacentes.

Partiendo de las secuencias de ADN mutadas obtenidas de proteínas modificadas basadas en ubiquitina, se pueden preparar estas mediante procedimientos conocidos de ingeniería genética. Se prefiere a este respecto – debido al bajo coste y al elevado rendimiento – la producción en un huésped procariota, lo que no excluye sin embargo el posible uso de sistemas eucariotas o sin células. Por lo general se sintetiza tras inserción de la secuencia de ADN en un vector de expresión adecuado y la transformación, transfección o infección de organismos correspondientes, la proteína modificada extraña para la célula mediante el sistema de transcripción/traducción bacteriano. A este respecto se puede adecuar el procedimiento de preparación a proteínas modificadas individuales con las nuevas propiedades de unión. De este modo se puede secretar por ejemplo con el uso de E. coli como huésped la proteína modificada basada en ubiquitina mediante una secuencia de señal adecuada en el espacio periplasmático o se producen en el citosol. Si la proteína modificada de esta invención no se pliega en la célula y se agrega, es igualmente posible el repliegue funcional de tales partículas de inclusión. Los sistemas sin células pueden ser ventajosos, por ejemplo, en variantes con menores tasas de expresión o efecto tóxico en el organismo huésped. Son conocidos por el especialista en la técnica procedimientos de ingeniería genética adecuados para la preparación o purificación de proteínas recombinantes y se describen en la bibliografía (por ejemplo, Sambrook y col., 2001).

En consecuencia es posible proporcionar proteínas modificadas basadas en ubiquitina con nueva afinidad de unión mediante la generación de un sitio de unión sintético, cuya superficie muy variable permite el reconocimiento molecular de ligados establecidos previamente como, por ejemplo, haptenos, péptidos, proteínas y otras macromoléculas o moléculas menores como, por ejemplo, hormonas.

Adicionalmente se pueden obtener en base a las múltiples propiedades de superficie de la región aleatorizada mediante procedimientos de selección adecuados también proteínas modificadas basadas en ubiquitina con otras propiedades como propiedades de unión. Esto puede ser, por ejemplo, una nueva actividad catalítica no presente previamente para una reacción química definida previamente. Esta propiedad permite, por ejemplo, si la pareja de unión es una molécula o estado transitorio, que se una a la proteína modificada catalizando la respectiva reacción.

La presente invención abarca por tanto proporcionar moléculas como ubiquitina como molécula esqueleto para la incorporación de nuevas propiedades de unión previamente no presentes.

Adicionalmente se puede generar según esta invención una biblioteca génica en la etapa d) del procedimiento, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria. La presente invención comprende según una forma de realización también bibliotecas génicas producidas de esta forma. Particularmente están comprendidas aquellas bibliotecas génicas que se produjeron a partir de ubiquitina humana, que se sustituyó en las posiciones de aminoácidos 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 y 66.

Adicionalmente se puede modificar el esqueleto proteico fuera de los sitios de unión sintéticos para dotar a la proteína modificada de funciones adicionales. Esto se puede comprender, por ejemplo, la incorporación adicional o el intercambio de aminoácidos o péptidos individuales – preferiblemente en el término amino y carboxi-, para obtener conjugados de proteína mediante acoplamiento químico con reactivos adecuados. Tales fusiones se pueden producir también mediante procedimientos de ingeniería genética directamente mediante la unión del gen de la proteína modificada con el de la pareja de fusión. Esto facilita –en comparación con los anticuerpos-que únicamente un gen extraño y por tanto sólo una cadena de polipéptidos se deba expresar o plegar funcionalmente con el huésped bacteriano. Tales parejas de fusión pueden ser enzimas, citotoxinas, dominio de unión y de multimerización

o también proteínas modificadas con la misma o distintas especificidad de unión.

La proteína modificada proporcionada de acuerdo con la invención con el motivo de plegamiento típico de la ubiquitina puede estar dirigida al sitio y unida covalentemente con una proteína de igual especificidad o también de distinta especificidad, para obtener de este moto propiedades de unión divalentes o biespecíficas frente a una o varias parejas de unión.

De este modo se pudieron unir covalentemente entre ellas, por ejemplo, dos variantes iguales de la ubiquitina que se obtuvieron mediante el procedimiento descrito anteriormente y que se unen al mismo antígeno, dirigidas al sitio mediante un resto de cisteína incorporado adicionalmente singular, mediante procedimientos conocidos por el especialista en la técnica. Tales proteínas de unión divalentes se caracterizan de acuerdo con la invención frente a las monovalentes por una unión aparentemente más fuerte (efecto de avidez).

Igualmente se pueden unir entre ellas dos variantes de ubiquitina que unen distintos antígenos, con procedimientos correspondientes de un modo que se obtengan exclusivamente moléculas de unión biespecíficas. Para la unión selectiva de tales heterodímeros se pueden usar polipétidos que se componen de aminoácidos cargados positiva o negativamente y están fusionados con los extremos carboxiterminales de la pareja de fusión. Estos denominados apéndices poliiónicos interactúan entre ellos – con uso simultáneo de aminoácidos cargados – selectivamente electrostáticamente y las proteínas de unión de distinta especificidad se unen entre ellas en relación 1:1 deseada. En la terapia de cáncer pueden entrar en contacto estos agentes biespecíficos con la dirección de estructuras de superficie correspondientes, por ejemplo, células tumorales con células efectoras del sistema inmune para destruir las primeras.

Adicionalmente las variantes de ubiquitina, que se aislaron con uno de los procedimientos anteriormente descritos y por tanto ya presentan propiedades de unión para un antígeno determinado, se pueden modificar de modo que se mejore su afinidad y/o especificidad. Para ello se pueden llevar a cabo nuevas sustituciones de aminoácidos dirigidas y/o aleatorias dentro y/o fuera del sitio de unión. Son conocidos por el especialista en la técnica

5 procedimientos correspondientes para tales procedimientos de maduración. La maduración de variantes de ubiquitina presentes puede comprender afinidad y especificidad, pero no se debe limitar a estas. Otras propiedades de las proteínas que se pueden mejorar son, por ejemplo, estabilidad, solubilidad y nivel de producción en procariotas. En el marco de la presente invención se aumentó en un factor de 10, por ejemplo, la afinidad de una variante de ubiquitina que se une a la parte Fc de inmunoglobulina M mediante el intercambio dirigido de dos aminoácidos dentro del sitio de unión.

A las proteínas modificadas basadas en ubiquitina proporcionadas por la presente invención se les dota – de forma análoga a los anticuerpos y sus fragmentos – de un amplio espectro de aplicación. Este comprende aplicaciones de diagnóstico y terapéuticos así como procedimientos de cromatografía. Así se pueden detectar directamente sustancias diana en ensayos bioanalíticos discrecionales como ELISA, transferencia de Western-Blot entre otros.

15 Adicionalmente son adecuadas proteínas modificadas de acuerdo con la invención que se unen, por ejemplo, a inmunoglobulinas y están conjugadas con un enzima o fluoróforo, como molécula reportera secundaria universal en sistemas de ensayo adecuados. Las proteínas modificadas basadas en ubiquitina presentan utilidad en aplicaciones terapéuticas debido a sus propiedades ventajosas como, por ejemplo, el tratamiento de enfermedades tumorales o infecciosas. En esto se pueden aprovechar efectos que se basan en el bloqueo del receptor o de ligados mediante unión específica de la proteína modificada. Igualmente se pueden destruir proteínas modificadas con las nuevas propiedades de unión, que se unen a proteínas de superficie en células tumorales mediante conjugación con efectores adecuados de tales células o bien activar pre-toxinas correspondientes selectivamente en tejidos tumorales.

Para las proteínas modificadas y seleccionadas de acuerdo con la invención se dispone por tanto de un amplio panel

25 de posibilidades de aplicación. Las posibilidades de aplicación no se encuentran sólo en el ámbito médico-terapéutico, sino también en el ámbito de la analítica, de la industria alimentaria y de los piensos, de los complementos dietéticos, de la cosmética, del diagnóstico médico y no médico y del análisis entre otros. El ámbito de aplicación depende evidentemente del tipo de pareja de unión seleccionada.

En el ámbito de la terapia y profilaxis humana y médico-veterinaria se pueden preparar medicamentos farmacéuticamente efectivos mediante procedimientos conocidos. Estas composiciones se pueden administrar, según cada preparación galénica, por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, transdérmica o mediante otros procedimientos de aplicación. El tipo y forma de la preparación farmacéutica depende del tipo de enfermedad que se va a tratar, de la dificultad de la enfermedad, del paciente que se va a tratar y además de factores conocidos por los facultativos médicos. La administración se puede realizar bien por vía parenteral mediante

35 inyección o infusión, sistémica, rectal u otros procedimientos habituales.

Las composiciones se proyectan de modo que contengan una dosis terapéuticamente efectiva. La cantidad de dosis a administrar depende del organismo que se va a tratar, del tipo de enfermedad, de la edad y peso del paciente y otros factores que son conocidos.

Las composiciones pueden contener coadyuvantes conocidos. A estos pertenecen, por ejemplo, agentes estabilizantes, tensioactivos, sales, tampones, colorantes y similares.

La composición farmacéutica puede presentarse en forma de un preparado líquido, de una crema, de una loción para la aplicación por vía tópica, de un aerosol, en forma de polvos, gránulos, comprimidos, supositorios o cápsulas, en forma de una emulsión o de un preparado liposomal. Las composiciones son preferiblemente esterilizadas, no pirógenas e isotónicas y contienen los aditivos conocidos habituales y compatibles farmacéuticamente. Se hace

45 referencia complementariamente a las prescripciones de la farmacopea de EEUU.

Los siguientes ejemplos sirven para aclarar adicionalmente la invención. La invención se representa particularmente en el ejemplo de la modificación de ubiquitina. Sin embargo la invención no se limita a este, sino que los siguientes ejemplos muestran la realización de la invención en base a la descripción precedente. Para dar a conocer completamente la invención se hace referencia también a la solicitud y a las referencias bibliográficas citadas que se incorporaron en su totalidad como referencia en la solicitud.

La presente invención se aclara a continuación de forma detallada en función de los ejemplos y figuras adjuntas, en los que

Fig. 1 muestra una región del sitio de unión sintético, de nueva generación, sobre la superficie de la ubiquitina natural (código PDB: lubi);

Fig. 2 representa los resultados del análisis asistido por ordenador de la estabilidad de la proteína de respectivamente 104 variantes, que se sustituyeron aleatoriamente en posiciones 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, 66, en comparación con la ubiquitina (WT) y un epítopo de control;

Fig. 3 aclara el vector fásmido pMUBI-1 para el uso en la selección de proteínas modificadas basadas en ubiquitina 5 con nuevas propiedades de unión;

Fig. 4 aclara la forma de proceder en la construcción de una biblioteca de variantes de ubiquitina;

Fig. 5 muestra el resultado de un experimento ELISA para la detección de la unión de una proteína modificada basada en ubiquitina seleccionada mediante presentación en fago en la proteína correspondiente;

Fig. 6 muestra el resultado de un experimento ELISA para la detección de la unión de una proteína modificada 10 basada en ubiquitina seleccionada mediante presentación en ribosoma en la proteína correspondiente;

Fig. 7 muestra el resultado de un experimento BIACORE para la detección de la unión de una proteína modificada basada en ubiquitina seleccionada mediante presentación en ribosoma en la proteína correspondiente;

Fig. 8 muestra el resultado de un experimento ELISA para la detección de la especificidad de unión de una proteína modificada basada en ubiquitina seleccionada mediante presentación en fago en el hapteno correspondiente;

15 Fig. 9 muestra el resultado de un experimento ELISA para la detección de la unión mejorada de una variante obtenida por mutagénesis secundaria de SPU-3-A7, una proteína de unión basada en ubiquitina seleccionada mediante presentación en fago para IgM-Fc, en su antígeno;

Fig. 10 representa el resultado de un experimento para el acoplamiento covalente dirigido al sitio de dos proteínas basadas en ubiquitina mediante restos de cisteína singulares carboxiterminales mediante bis-maleimido-hexano.

20 Figura 1: estructura cristalina de la ubiquitina natural (código PDB: lubi; Vijay-Kumar y col., 1987) con los sitios de unión generados sintéticamente sobre la superficie. La representación tridimensional de los elementos de estructura secundaria se realizó con el programa PyMOL (De-Lano Scientific, San Francisco). Los restos que se deben sustituir aleatoriamente en la biblioteca preparada a título de ejemplo comprenden las posiciones 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, 66 y se representan con sus cadenas laterales.

25 Figura 2: generación de un sitio de unión sobre la superficie de la ubiquitina natural (código PDB: lubi). Los restos que se deben sustituir aleatoriamente en la biblioteca que se va a producir (posiciones representadas en verde claro 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65, 66), se seleccionaron mediante análisis asistido por ordenador en lo que respecta a su exposición al disolvente y del efecto estabilizante o desestabilizante que podría tener un intercambio de aminoácidos en las posiciones correspondientes. Con ayuda del software ProSAII se determinó luego la estabilidad de la proteína

30 respectivamente de 104 variantes en comparación con la ubiquitina (WT) y una prueba al azar de igual tamaño de variantes, en la que se habían sustituido los restos de un “péptido de control” (posiciones representadas en azul oscuro 24, 28, 31, 32, 35, 37, 38, 39). Como medida de la estabilidad se da a este respecto el valor del potencial Cα/Cβ combinado ("zp-comb"). A este respecto aproximadamente el 19% de las variantes generadas in silico que se habían sustituido aleatoriamente en la región de los sitios de unión, presentan una estabilidad al menos tal alta como

35 la ubiquitina (WT), mientras que aproximadamente el 90% eran más estables que los soportes del “epítopo de control". En consecuencia la generación de un sitio de unión mediante sustituciones de aminoácidos aleatorias en la región analizada se debería tolerarse por parte de la estructura proteica de la ubiquitina, sin cuya estabilidad se vería influenciada negativamente. Este procedimiento de cálculo ofrece una ayuda en la elección de aminoácidos expuestos en la superficie adecuados.

40 Figura 3: el vector fásmido pMUBI-1 para el uso en la selección de variantes MUBI mediante presentación en fago. Se usa pMUBI-1 para la preparación de bibliotecas de fagos y codifica bajo el control de transcripción del promotor/operador de tetraciclina (tetp/o) para una proteína de fusión a partir de la secuencia de señal PelB, del gen para la variante de ubiquitina, MyCUT-Tag y un fragmento C-terminal de la proteína de envoltura de fagos (AS 253 406, delta gpIII). Amber designa la posición del codón de parada Amber en el gen de fusión. La inserción del casete

45 génico mutado del MUBI se realiza mediante los dos sitios de corte SfiI. flIg, blaP, tetR, Ori, ColE1 y Cat-designan la región intergénica del fago fl, el gen represor de tetraciclina bajo control del promotor β-lactamasa, el origen de replicación y el gen cloramfenicol-acetiltransferasa.

Figura 4: procedimiento en la construcción de una biblioteca por presentación en fago de variantes de ubiquitina.

Figura 5: unión de la variante de ubiquitina SPU-1-D10 de la selección mediante presentación en fago frente a recGLP1-R en el dominio aminoterminal preparado recombinante del receptor GLP-1 humano en ELISA. Se recubre una cantidad correspondiente de pocillos de una placa de microtítulos durante la noche a 4º C con recGLP1-R o bien con BSA o el dominio aminoterminal preparado recombinante del receptor PTH humano (recPTH-R). Se saturaron los sitios de unión que quedan mediante incubación con BSA al 3% en PBS con Tween al 0,5% (2 horas, temperatura ambiente (RT)). Se aplicó SPU-1-D10 en series de concentración en PBST 0,1 durante 90 min a 30º C. Se detectó la proteína modificada unida con antisuero anti-ubiquitina (1 : 10 en PBST 0,1, 60 min a 30º C) y anticuerpo anti-conejo (1 : 2000 en PBST 0,1, 60 min a 30º C) conjugado con peroxidasa. La detección se llevó a cabo con ayuda del kit ImmunoPure de Pierce. Entre las etapas se lavó tres veces con PBST 0,1 – antes de la detección con cromógeno adicionalmente 3 veces con PBS -. La intensidad de señal se detectó tras detención de la reacción de color con H2SO4 a 405 nm y se aplicó contra la respectiva concentración de la proteína modificada. La determinación del valor KD en condiciones de equilibrio se realizó mediante regresión no lineal.

Figura 6: unión de la variante de ubiquitina SPW-11-A1 de la selección mediante presentación en ribosoma en VEGF en ELISA. La realización del experimento correspondía a la de la figura 5. La determinación de valor de KD en condiciones de equilibrio se realizó mediante regresión no lineal.

Figura 7: unión de la variante de ubiquitina SPU-11-58 de la selección mediante presentación en ribosoma en VEGF en BIACORE. Se inmovilizó sobre la superficie de un canal de un CM5-Chips en primer lugar VEGF, mientras se mantenía sin carga un canal de referencia. En la aplicación de distintas concentraciones de SPU-11-58 se sintetizó respectivamente la señal neta del evento de unión. La duración de la inyección para todas las soluciones fue de 2 min con una velocidad de flujo de 35 µl/min. Las señales de unión de distintas concentraciones de SPU-11-58 (1,3 µM, 0,65 µM, 0,325 µM, 0,163 µM, 0,081 µM) se representan superpuestas relativamente respecto al inicio de la inyección. Después de cada medida se regeneró la superficie con un pulso de 15 s con HCl 10 mM. La determinación del valor de KD se realizó con ayuda del software BIAevaluation 3.1 (Biacore).

Figura 8: unión de la variante de ubiquitina SPU-3-H13 de la selección frente a hidrocortisona en esteroides en ELISA. Respectivamente se recubrieron tres pocillos de una placa de microtítulos con conjugado de hidrocortisona-, testosterona-, y estradiol-BSA o bien con BSA y con PU-3-H13 (4 µM) o bien se incubaron con el esqueleto de proteína de ubiquitina no modificado en la región de los sitios de unión (50 µM) respectivamente en PBST 0,1 (90 min a 30º C). La detección de unión se realizó con conjugado de Ni-NTA/peroxidasa (1 : 500 en PBST 0,1, 60 min a 30º C) y con ayuda del kit ImmunoPure de Pierce. Bloqueo y lavado: véase la figura 5. La intensidad de la señal se detectó tras detener la reacción de color con H2SO4 a 405 nm y se registraron los valores medios de tres medidas.

Figura 9: comparación de la unión de las variantes de ubiquitina SPU-2-A7 y SPU-2-A7(62/63) en Fc-IgM tras maduración de la afinidad mediante mutagénesis aleatoria dirigida al sitio en ELISA. La realización del experimento correspondía a la de la figura 5. La determinación del valor de KD en condiciones de equilibrio se realizó mediante regresión no lineal.

Figura 10: análisis del acoplamiento covalente dirigido al sitio de dos proteínas basadas en ubiquitina mediante restos de cisteína singulares carboxiterminales mediante SDS-PAGE. Se aplicaron respectivamente 20 µl de la proteína no acoplada (carril 1) así como del preparado tras la reacción de acoplamiento (carril 2). A continuación de la electroforesis se coloreó el gel con coomassie. Las masas molares del patrón de tamaños (carril M) se dan en kDa.

Ejemplo 1: Preparación de un gen de ubiquitina sintético para la selección de proteínas modificadas con afinidad de unión de nueva generación

Los trabajos de ingeniería genética se llevaron a cabo en tanto no se indique otra cosa según protocolos convencionales habituales para el especialista en la técnica como, por ejemplo, Sambrook y col. (2001).

Para la preparación de la secuencia de ADN (Nº ID Sec: 1) de un esqueleto proteico de ubiquitina modificada con las sustituciones Ile44Ala, Lys48Arg, Arg54Leu, Val70Ala, Arg72Leu, Gly75Ala así como con la deleción de Gly76 como punto de partida para la obtención de proteínas de unión sintéticas se procedió como sigue: para la síntesis génica se llevó a cabo una reacción PCR en un volumen de 50 µl, en el que se dispone como moldes respectivamente 2,5 µl de seis oligodesoxinucleótidos (Nº ID Sec: 2, Nº ID Sec: 3, Nº ID Sec: 4, Nº ID Sec: 5, Nº ID Sec: 6, Nº ID Sec: 7; resp. 0,1 µM), que representan en su secuencia de pares de bases en su totalidad el gen que se va a sintetizar. A este respecto las secuencias de los oligodesoxinucleótidos usados correspondían respectivamente a segmentos de 40 a 50 pares de bases de longitud de la hebra de ADN de codificación o de no codificación del gen sintético y solapados alternativamente en sus extremos 3' y 5' con aproximadamente 15 bases. Adicionalmente el preparado contenía respectivamente 2,5 µl de cebador de flanqueo (Nº ID Sec: 8, Nº ID Sec: 9; 10 µM) así como 5 µl de tampón 10x Taq (Tris/HCl 100 mM pH 9,0, KCl 500 mM, 1% (v/v) de Triton X-100), 3 µl de MgCl2 25 mM y 4 µl de dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 2,5 mM cada uno). Tras rellenar con H2O se calentó el preparado de reacción en el termociclador a fin de realizar la desnaturalización durante 2 min a 94º C. Luego se añadieron 2,5 U de la Taqpolimerasa (Promega) con calentamiento (Hot Start) y se inició el programa PCR. Se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 55º C y durante 1,5 min a 72º C. Se realizó una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C.

El producto de PCR deseado se identificó mediante electroforesis en gel de agarosa analítica y se purificó en el preparado con ayuda del kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen). Se usaron 1,0 ng del ADN aislado como molde para una segunda amplificación, realizándose esta vez con uso de la Pfu-polimerasa (Promega) igualmente en un volumen de 50 µl. Para ello se usaron 5 µl del tampón 10x Pfu suministrado conjuntamente (Tris/HCl 200 mM, pH 8,8, MgCl2 20 mM, KCl 100 mM, (NH4)2SO4 100 mM, 1 % (v/v) de Triton X-100, 1 mg/ml de BSA) así como 4 µl de dNTP-Mix y se rellenó con H2O. Adicionalmente el preparado contenía cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 8, Nº ID Sec: 9; 10 µM) para la incorporación de sitios de corte adecuados. El producto de PCR deseado se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y se insertó con ayuda del kit de clonación de PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante en el vector de clonación pCR®4Blunt-TOPO®. Con el preparado de reacción con ligadura correspondiente se transformaron las células químicamente competitivas suministradas conjuntamente y se cambiaron de placa a una placa de ágar con medio LB/Amp/Kan. Se incubó la placa durante 16 horas a 37º C y se analizaron las colonias en crecimiento en relación al producto de ligadura deseado. Para ello se preparó ADN plásmido a pequeña escala con ayuda del kit de aislamiento de plásmido de la compañía Qiagen siguiendo las indicaciones del fabricante y se sometió a digestión con enzimas de restricción con las endonucleasas de ADN NdeIy XhoI (New England Biolabs), cuyas secuencias de reconocimiento se habían incorporado mediante los cebadores de flanqueo en el producto de PCR. Se llevó a cabo un análisis de secuencia de ADN con plásmidos que presentan el patrón de corte esperado, en la región del casete génico insertado con ayuda de la Taq ADN-polimerasa. A este respecto se usó el kit de secuenciación CycleReader™ AutoDNA (Fermentas) siguiendo las indicaciones del fabricante así como 0,5 µg de ADN plásmido y 1,0 pmol del cebador marcado con fluorescencia correspondiente. La hebra de ADN de nueva síntesis se marcó durante la reacción de polimerasa y se bloqueó en el extremo mediante la inclusión de di-desoxinucleótidos estadísticamente, pero de forma específica a las bases. Los fragmentos de ADN fluorescentes que se generan se separaron a continuación en un autómata de secuenciación en licor mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-urea y se hicieron visibles como patrón de bandas para A, C, G, T en trazas adyacentes.

Los casetes génicos con la secuencia de ADN correcta se recortaron con digestión con enzimas de restricción NdeI/XhoI preparativa a partir del vector de clonación pCR®4Blunt-TOPO® y se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa. La inserción del gen para el esqueleto proteico de ubiquitina modificado se realizó en el vector de expresión pET20B(-) (Novagen) para la producción de la proteína correspondiente o bien en el vector fásmido pMUBI-1 para la construcción de una biblioteca de variantes de ubiquitina.

Ejemplo 2: preparación de una biblioteca de variantes de ubiquitina

Para la mutagénesis dirigida al sitio aleatoria de 8 codones en el término amino o carboxi del gen de la ubiquitina sintético se llevaron a cabo dos reacciones de PCR consecutivas. La primera etapa de amplificación tuvo lugar con uso de la Pfu-polimerasa (Promega) en un volumen de 10 x 50 µl. Para ello se usaron por preparado 5 µl del tampón 10x Pfu suministrado conjuntamente así como 4 µl de dNTP-Mix y se rellenó con H2O. Adicionalmente el preparado contenía respectivamente 2,5 µl de cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 10, Nº ID Sec: 11; 10 µM) para la ejecución del intercambio de pares de bases deseado. Como moldes se usaron 1,0 ng de pMUBI-1, que portaba el gen de ubiquitina sintético no mutado. Tras adición de 2,5 U de la Pfu-polimerasa (véase anteriormente) se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 60º C y durante 1,5 min a 72º C cada uno. Se realizó una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C. Para la degradación selectiva de las matrices-ADN usadas se añadieron por preparado de reacción 10 U de DpnI y se incubó durante 1 hora a 37º C. Se asiló el producto de PCR deseado mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y el kit de extracción en gel de QIAquick (Qiagen).

La segunda etapa de amplificación se llevó a cabo en un preparado de 1.000 µl, usándose aproximadamente 1,0 ng del producto obtenido en la primera reacción de PCR y se usó la Taq-polimerasa. Se pipeteó el preparado de reacción – adaptado a 20 veces el volumen – como se indicó anteriormente en tampón 10x Taq, MgCl2 25 mM, dNTP-Mix así como los cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 12, Nº ID Sec: 13; 10 µM), que se biotinilaron en sus extremos 5' y portaban respectivamente secuencias de reconocimiento no compatibles entre ellas. Tras rellenar con H2O se añadieron 2,5 U de la Taq-polimerasa con calentamiento (véase anteriormente) y se inició el programa de PCR. Se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 60º C y durante 1,5 min a 72º C cada uno. Se realizó una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C.

La escisión subsiguiente del producto de amplificación obtenido se realizó directamente en el preparado de reacción PCR. Para ello se mezclaron en un volumen total de 4.000 µl la solución de PCR completa con el volumen correspondiente del tampón II 10x suministrado conjuntamente (Tris/HCl 100 mM, pH 7,9, MgCl2 100, NaCl 500 mM, ditiotreitol 10 mM), solución de 10x BSA y H2O. Adicionalmente se añadieron 4.000 U del enzima de restricción SfiI (New England Biolabs) y se incubó durante 16 horas a 50º C. Se aisló el ADN del preparado con ayuda del kit MinElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen) y se recogió en 400 µl de H2O esterilizada. Para la separación del producto de PCR con SfiI no recortado se mezcló el ADN aislado con igual volumen de “solución de unión” (Dynal), que contenía 1,0 mg/ml de esferas magnéticas con estreptavidina acoplada en la superficie ("Dynabeads Kilobase Binder"), y se incubó durante 4,5 horas en un mezclador de rodillos a temperatura ambiente (RT). Las esferas se precipitaron con ADN biotinilado dado el caso aún presente, mientras que el ADN completo con escisión de SfiI, que no debía presentar extremos biotinilados, permanecía en el sobrenadante y se precipitó durante la noche. El gen de ubiquitina así obtenido con escisión de SfiI y mutagenizado en las posiciones deseadas se disolvió en H2O esterilizada, se desalinizó de nuevo con ayuda del kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen) y presentaba finalmente una concentración de 200 fmol/µl en H2O.

Para la preparación del vector receptor se aisló el fásmido pMUBI-1 siguiendo las indicaciones del fabricante con fragmento (vector) de SfiI recortado y de mayor tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y el kit de extracción con gel QIAquick (Qiagen). Para impedir la ligadura intramolecular se desfosforilaron sus extremos 5’. Para ello se usaron 0,5 U de la fosfatasa alcalina de Shrimp (Pandalus borealis) así como el tampón suministrado conjuntamente en un volumen total de 200 µl. Se incubó la mezcla durante 90 min a 37º C, se aisló el ADN del preparado con ayuda del kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen) y se desalinizó de nuevo (kit de purificación por PCR QIAquick). El ADN del fragmento vector mostraba finalmente una concentración de 50 fmol/µl en H2O. Para la ligadura se incubaron 1,6 pmol del fragmento de PCR y 8,0 pmol del fragmento vector de pMUBI-1 en presencia de 2 U de T4 de ADN-ligasa (GibcoBRL) en un volumen total de 1.600 µl (Tris/HCl 50 mM, pH 7,6, MgCl2 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM, PEG-8.000 al 5% (p/v)) durante tres días a 16º C. Tras calentamiento del preparado a 65º C durante 15 min se precipitó el ADN. Para ello se mezclaron respectivamente 100 µl de la solución de reacción con 100 µl de etanol así como 10 µl de NaAc 5 M, pH 3,0 y se conservaron durante 16 horas a -20º C. A continuación se centrifugó (60 min, 12.500 g), se lavó con etanol (70% en v/v, -20º C), se centrifugó de nuevo y se disolvió el ADN precipitado finalmente en 60 µl de H2O esterilizada.

Para la electroporación se usó el gen Pulser® II-System (Biorad) así como cubetas con una distancia entre electrodos de 1,0 mm (Biozym) a 4º C en sala fría. Se transformaron los XL1Blue de E. coli electrocompetitivos (Stratagene) respectivamente con 3,5 µl de la solución obtenida anteriormente siguiendo las indicaciones del fabricante. La suspensión de células obtenida se cambió de placa a cinco placas de ágar (20 x 20 cm) con medio de LB/cloroamfenicol. Se incubaron las placas durante 16 horas a 37º C y se contaron las colonias en crecimiento. La biblioteca construida contenía según esto 2,8 x 107 clones independientes de las cuales cada 10.000 debían presentarse en la biblioteca. Las colonias se hicieron nadar luego en un total de 100 ml de medio SOC con 10% (v/v) de glicerina y se conservaron en alícuotas de 1,0 ml a -80º C. De los clones obtenidos se aisló arbitrariamente, con ayuda del kit DNA-Miniprep de la compañía Qiagen, 12 seleccionados de vectores plásmidos y se analizó la secuencia de ADN en la región del gen de ubiquitina mutagenizado. A este respecto todos los clones presentaron secuencias funcionales, es decir, ningún desplazamiento del marco de lectura por inserciones o deleciones – así como distintas sustituciones completamente cualitativas en las posiciones mutagenizadas. No se encontraban presentes intercambios aleatorios fuera de las regiones mutagenizadas.

Ejemplo 3: síntesis de variantes de ubiquitina en la superficie de fagos y selección de variantes de ubiquitina frente a proteínas y haptenos

Para la producción de fagémidos con variantes presentes en la superficie de la ubiquitina mutada se inocularon 100 ml de medio 2xYT/cloroamfenicol con 1,0 ml del cultivo de glicerina obtenido en el ejemplo 2 y se incubó durante 16 horas a 37º C y 220 rpm. Con 10 ml de este cultivo estacionario se inoculó medio 1 12xYT/cloroamfenicol y se agitó a 37º C y 220 rpm hasta una densidad de células de DO600 = 0,4. Luego se realizó la infección con 1013 ufc de fagos de levadura M13KO7 y una incubación a 37º C sin agitar durante 30 min. Tras adición de 50 mg/l de canamicina se agitó durante 30 min a 37º C y 220 rpm y luego se indujo la expresión génica en pMUBI-1 mediante ajuste del cultivo a 0,2 mg/l de tetraciclina anhidra (solución madre: 2,0 mg/ml en DMF). La temperatura de incubación se redujo luego a 26º C y se agitó el cultivo durante 16 horas a 220 rpm. Se sedimentaron las células finalmente mediante centrifugación (30 min, 12.000 g, 4º C) y se retiró mientras se filtraba el sobrenadante (0,45 µm). Se obtuvieron los fagémidos obtenidas mediante adición de ¼ del volumen de PEG 6.000 al 20% (en p/v), NaCl 2,5 M e incubación durante 1 hora sobre hielo y se precipitaron mediante centrifugación (30 min, 12.000 g, 4º C). Los fagémidos se disolvieron luego en 4 ml de PBS enfriado con hielo esterilizado (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM), se conservaron durante 30 min en hielo y se centrifugaron (30 min, 12.000 g, 4º C). Se adicionó al sobrenadante ¼ del volumen de PEG 6.000 al 20 % (en p/v), NaCl 2,5 M, se obtuvo los fagémidos de nuevo mediante incubación durante 1 hora en hielo y se precipitó mediante centrifugación (30 min, 12.000 g, 4º C). Se disolvieron luego los fagémidos de nuevo en 4 ml de PBS enfriado con hielo esterilizado, se conservaron durante 30 minutos en hielo y se centrifugaron (30 min, 12.000 g, 4º C). Se mezcló el sobrenadante en relación 1 : 1 con albúmina de suero bovino (BSA) al 4 % (en p/v) en PBS, se incubó durante 30 min en un mezclador de rodillos a RT y luego se usó directamente para el enriquecimiento de la afinidad.

Como matriz de afinidad para el aislamiento de fagémidos con variantes de ubiquitina presentes en la superficie, que deberían unirse a las sustancias diana definidas previamente, se recubrieron respectivamente 24 pocillos de una placa de microtítulos con la sustancia correspondiente. Como sustancias diana sirvieron los dominios aminoterminales preparados recombinantes del receptor GLP-1 humano (recGLP1-R; Bazarsuren y col., 2002), de la parte Fc de inmunoglobulina M humana (Fc-IgM) así como en hidrocortisona acoplada con BSA (HC), que se inmovilizaron durante la noche a 4º C en la placa de microtítulos.

Se bloquearon sitios de unión no cubiertos en la superficie de la placa de microtítulos mediante incubación de los pocillos respectivamente con 400 µl de BSA al 4% en PBS durante 90 min a RT. Luego se pipetearon por pocillo 100 µl de la solución de fagémido preparada y se incubó durante 90 min a RT (temperatura ambiente). Se separaron los fagémidos no unidas mediante lavado doble con PBS con 0,05 % (en v/v) de Tween 20 (PBST 0,05), doble incubación con 400 µl de BSA al 4% en PBS durante 5 min y doble lavado con PBS así como agitación vigorosa. Los fagémidos unidas a la matriz de afinidad se eluyeron finalmente con ayuda de 100 µl de trietilamina 100 mM por pocillo e incubación durante 10 min a RT. Las soluciones se purificaron con los fagémidos eluidas – separadas según las sustancias diana respectivas – y se neutralizaron inmediatamente mediante adición de ½ del volumen de Tris/HCl 1 M, pH 7,4. Se transfirió la solución obtenida respectiva para la infección de XL1Blue de E. coli a 20 ml de un cultivo con una densidad de células de DO600 = 0,4 y se agitó durante 30 min a 37º C y 220 rpm. Se lavaron de nuevo los pocillos de la placa de microtítulos (5 x PBST 0,05, 1 x PBS) y se añadieron respectivamente 100 µl de un cultivo de XL1Blue de E. coli con una densidad de células de DO600 = 0,4. Después de una incubación a 37º C durante 30 min se purificaron estas células de las infectadas previamente. La suspensión de células respectiva se cambió de placa a una placa de ágar (20 x 20 cm) con medio de LB/cloramfenicol y contenían habitualmente entre 105 y 107 clones formadores de colonias. Las placas se incubaron durante 16 horas a 37º C, se hicieron nadar las colonias en crecimiento con 10 ml de medio SOC con glicerina al 10% (en v/v) y se conservaron en alícuotas de 1,0 ml a -80º C.

Para la producción de fagos reiterada y nuevos ciclos de enriquecimiento de afinidad se repitió el procedimiento descrito, usándose para el crecimiento de las células bacterianas respectivamente diez veces menos volumen de cultivo y seleccionándose condiciones de lavado más estrictas (segunda ronda: lavado 3 veces con PBST 0,1, triple incubación con BSA al 4 % en PBS durante 5 min y triple lavado con PBS; tercera ronda: lavado seis veces con PBST 0,1, triple incubación con BSA al 4 % en PBS durante 5 min y lavado tres veces con PBS).

Ejemplo 4: aislamiento y caracterización de fagémidos monoclonales con unión específica al sustrato diana (ELISA de fagos individuales)

De los clones obtenidos tras la tercera ronda de enriquecimiento de afinidad en recGLP1-R, Fc-IgM así como HC se seleccionaron aleatoriamente respectivamente 96 y se analizaron en ELISA de fagos individuales en lo referente a su unión al antígeno o hapteno correspondiente. Para ello se inocularon 300 µl de medio 2xYT/cloroamfenicol con una colonia aislada y se agitó durante 18 horas a 37º C y 220 rpm. Se inocularon respectivamente a 80 µl de este cultivo estacionario 4 ml de medio 2xYT/cloroamfenicol y se agitó durante 4 horas a 37º C y 180 rpm. Para posibilitar el trabajo en paralelo se usaron 4 placas "Deep-Well" (Qiagen; respectivamente de 24 pocillos). Tras infección de las células XL1Blue respectivamente con aproximadamente 1011 ufc de fagos de levadura M13KO7 se incubaron durante 30 minutos a 37º C. Después de otros 30 minutos a 37º C y 180 rpm se realizó la adición de 50 mg/l de canamicina. Luego se agitó durante 30 minutos a 37º C y 220 rpm y se indujo la expresión génica en pMUBI-1 mediante ajuste del cultivo a 0,2 mg/l de tetraciclina anhidra (solución madre: 1,0 mg/ml en DMF). La temperatura del incubador se redujo luego hasta 22º C y se agitó el cultivo durante 16 horas a 180 rpm. Se sedimentaron finalmente las células mediante centrifugación (30 min, 5.000 g , 4º C) y se transfirieron los sobrenadantes a placas "Deep-Well" nuevas. Los fagémidos contenidos se obtuvieron mediante adición de 1 volumen de PEG 6.000 al 20% (en p/v), NaCl 2,5 M e incubación durante 1 hora en hielo y se precipitaron mediante centrifugación (30 min, 5.000 g, 4º C). Los fagémidos se disolvieron luego en 1,0 ml de PBS enfriado con hielo esterilizado y se mezclaron en relación 1 : 1 con BSA al 6% en PBST 0,1 y se incubaron durante 1 hora a RT.

Para la realización del ELISA se cubrió por fagémido monoclonal que se va a analizar cada uno de los pocillos de una placa de microtítulos durante la noche a 4º C con solución de antígeno y una solución con BSA. Para la saturación de los sitios de unión deseados en la superficie del plástico se bloqueó cada pocillo durante 2 horas con BSA al 3% (en p/v) PBST 0,5. Los pocillos se lavaron luego tres veces con PBST 0,1 y se desincrustaron. A continuación se pipetearon en cada uno 100 µl de la solución de fagémido preparada anteriormente en los pocillos correspondientes de la placa. Después de una duración de incubación de dos horas se lavaron tres veces con PBST 0,1. Para la detección de fagémidos unidas se diluyó un conjugado de anticuerpo-peroxidasa anti-M13 (Amersham Pharmacia Biotech) en relación 1 : 5.000 en PBST 0,1 y se añadió a cada pocillo 100 µl del mismo. Después de una hora de incubación a RT se limpiaron los pocillos tres veces con PBST 0,1, luego tres veces con PBS. Finalmente se pipetearon respectivamente 100 µl del kit ImmunoPure (Pierce) y se detuvo la reacción de color tras 15 min mediante adición de 100 µl de H2SO4 2 M. La medida de la extinción se realizó con ayuda de un lector Sunrise Remote Readers (Tecan) a 450 nm.

El ADN de variantes de ubiquitina en fagémidos, que muestran en ELISA una señal de unión relativamente fuerte en el antígeno respectivo – pero no en BSA – (respectivamente aproximadamente 20), se secuenció con ayuda del cebador Nº ID Sec: 14 y el procedimiento anteriormente descrito. Una parte de las secuencias de ADN analizadas presentaban desplazamientos del marco de lectura o codón de parada Amber y por tanto no se usaron posteriormente. A modo de ejemplo se enumeran en la tabla 1 sustituciones de aminoácidos de variantes de ubiquitina que se obtuvieron de este modo y se analizaron posteriormente.

Tabla 1: sustituciones de aminoácidos en la región de los sitios de unión de nueva generación de proteínas modificadas basadas en ubiquitina tras selección frente a distintas sustancias diana mediante presentación en fago

Selección: Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos.

2:: 4: 6: 62: 63: 64: 65: 66:

SPU/: - Gln Phe Lys Gln Lys Glu Ser Thr

SPU-1-D10: RecGLP-1-R Ser Phe Pro Tyr Ser Lys Pro Ser

SPU-2-A7: Fc-IgM Ser Leu Pro Pro Pro Gly Arg Asn

SPU-3-H13: HC Gly Gly Lys Phe Phe Val Thr Asn

SPU-15-G7: TNFα Tyr Cys Asn Asn Leu Ser Trp Gln

SPU-15-E1: TNFα Gln Ala Ile Met Phe Gln Thr Ser

/SPU: esqueleto proteico de ubiquitina sin sustituciones en la bolsa de unión

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Ejemplo 5: síntesis de variantes de ubiquitina en un sistema de transcripción / traducción in vitro y selección de variantes de ubiquitina frente a proteínas mediante presentación en ribosoma

La preparación de una construcción de expresión para la transcripción / traducción in vitro así como la selección de proteínas de unión mediante presentación en ribosoma se realizó según las indicaciones de Schaffitzel y col. (2001). 10 Sin embargo en contraposición a esto no se usó en el presente caso biblioteca alguna de fragmentos de anticuerpos, sino bibliotecas análogas a las descritas en el ejemplo 2 de variantes de ubiquitina. Se preparó una de estas bibliotecas sobre la base de la secuencia de ADN (Nº ID Sec: 1) para un esqueleto proteico de ubiquitina modificado con las sustituciones Ile44Ala, Lys48Arg, Arg54Leu, Val70Ala, Arg72Leu, Gly75Ala así como con la deleción de Gly76. Se preparó una segunda biblioteca sobre la base de la secuencia de ADN (Nº ID Sec: 15) para

15 un esqueleto proteico de ubiquitina modificado con la sustitución Phe45Trp.

En una primera etapa se prepararon los genes sintéticos mutagenizados en 8 codones que corresponden al ejemplo 2 de las variantes de ubiquitina, que representan la biblioteca, sobre la base de Nº ID Sec: 1 o bien Nº ID Sec: 15 mediante PCR. Esto se llevó a cabo con uso de Pfu-polimerasa (Promega) en un volumen de 50 µl. Para ello se usaron 5 µl del tampón 10x Pfu suministrado conjuntamente así como 4 µl de dNTP-Mix y se rellenó con H2O. 20 Además el preparado contenía respectivamente 2,5 µl de cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 16 y Nº ID Sec: 17 para la biblioteca sobre la base de Nº ID Sec: 1 así como Nº ID Sec: 18 y Nº ID Sec: 19 para la biblioteca sobre la base de Nº ID Sec: 15; 10 µM) para la introducción del intercambio de pares de bases deseado. Como molde se usó respectivamente 1,0 ng de ADN-plásmido, que portaba el gen de ubiquitina sintético no mutado Nº ID Sec: 1 o Nº ID Sec: 15. Tras adición de 2,5 U de Pfu-polimerasa se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 65º C y

25 durante 1,5 min a 72º C cada vez. Se realizó una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C. Se aisló el producto de PCR deseado mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen).

El denominado espaciador – un distanciador que comprende una parte de la proteína de envoltura III del bacteriófago M13 y se prolonga tras la traducción in vitro de la proteína en crecimiento desde el canal de ribosomas 30 para asegurar una presentación óptima de las variantes de ubiquitina –, se sintetizó en dos reacciones de PCR consecutivas. Esto ocurrió en primer lugar en un volumen total de 50 µl con 5 µl del tampón 10x Pfu suministrado conjuntamente, 4 µl de dNTP-Mix y una cantidad correspondiente de H2O. Además el preparado contenía respectivamente 2,5 µl de cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 20 y Nº ID Sec: 21; 10 µM) así como 1,0 ng de ADN del bacteriófago M13. Tras adición de 2,5 U de Pfu-polimerasa se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 35 65º C y durante 1,5 min a 72º C cada vez. Se realizó una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C. El producto de PCR deseado se asiló mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa, el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) y sirvió como molde para la segunda reacción de PCR. Esta se llevó a cabo con uso de Pfu-polimerasa (Promega) en un volumen de 50 µl. Se usaron para ello 5 µl del tampón 10x Pfur suministrado conjuntamente así como 4 µl de dNTP-Mix y se rellenó con H2O. Además el preparado contenía respectivamente 2,5 µl de cebadores 40 de flanqueo (Nº ID Sec: 22 y Nº ID Sec: 21; 10 µM). Se usó como molde respectivamente 1,0 ng de DNA de la reacción de PCR previa. Tras adición de 2,5 U de Pfu-polimerasa se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 55º C y durante 1,5 min a 72º C cada vez. Se realizó una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C. El

producto de PCR deseado se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen).

En la etapa siguiente se fusionaron los genes sintetizados mutagenizados en 8 codones para las variantes de ubiquitina, que sintetizan la biblioteca, mediante una reacción de PCR acoplada con el ADN-espaciador proporcionado. Esto se llevó a cabo con uso de Pfu-polimerasa (Promega) en un volumen de 50 µl. Para ello se usaron 5 µl del tampón 10x Pfu suministrado conjuntamente así como 4 µl de dNTP-Mix y se rellenó con H2O. Adicionalmente el preparado contenía respectivamente 2,5 µl de cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 23 y Nº ID Sec: 21; 10 µM). Como moldes se usaron respectivamente 500 ng de la ADN-biblioteca así como 500 ng de ADNespaciador de las reacciones de PCR precedentes. Tras adición de 2,5 U de Pfu-polimerasa se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 50º C y durante 1,5 min a 72º C cada vez. Tuvo lugar una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C. Se aisló el producto de PCR deseado mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen).

En la etapa final se incorporaron con ayuda de una reacción PCR secuencias regulatorias correspondientes (promotor T7, sitios de unión de ribosomas) para la reacción de transcripción / traducción in vitro y se preparó la construcción de expresión lineal. La reacción se llevó a cabo en un preparado de 500 µl usándose aproximadamente 500 ng del producto obtenido en la reacción de PCR previa y se usó la Taq-polimerasa. Se pipeteó al preparado de reacción – adaptado a 10 veces el volumen – como se cita en el ejemplo 2 en tampón 10x Tab, MgCl2 25 mM, dNTP-Mix así como los cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 24, Nº ID Sec: 21; 10 µM). Después de rellenar con H2O se añadieron 2,5 U de la Taq-polimerasa y se inició el programa de PCR. Se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 65º C y durante 1,5 min a 72º C cada vez. Se llevó a cabo una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C. Se aisló el producto PCR deseado mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa, el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) y se pudo usar directamente para la reacción de transcripción / traducción in vitro.

Para la reacción de transcripción / traducción in vitro se usó el kit de E. coli RTS100 (Roche; nº cat. 3186 148) siguiendo las indicaciones del fabricante. A este respecto se mezclaron con la pipeta cuidadosamente 24,0 µl de lisado de E. coli, 20,0 µl de mezcla de reacción, 24,0 µl de mezcla de aminoácidos (sin Met), 2,0 µl de metionina, 10,0 µl de tampón de reacción (10 x), 2,0 µl de MgAc (500 mM), 2,0 µl de ADN Anti_ssrA (200 µM) así como 20,0 µl de la biblioteca de ADN respectiva (0,5 – 1,0 µg) y se incubó durante 60 min a 30º C o 37º C. Se llevaron a cabo las siguientes etapas en sala fría o bien sobre hielo. Se enfrió el preparado de reacción durante 5 min sobre hielo y se detuvo la reacción mediante adición de 400 µl de WBT (Tris/HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, MgAc 50 mM, Tween 20 al 0,1%) con BSA al 3%. Este tampón puede contener dado el caso 2,5 mg/ml de heparina (Sigma). Las porciones no disueltas del preparado se precipitaron mediante centrifugación durante 5 min a 13 000 rpm y a 4º C, permaneciendo en el sobrenadante los complejos ternarios en variante de ubiquitina, de ARNm correspondiente y ribosoma.

Como matriz de afinidad para el aislamiento de complejos de ribosoma ternarios con variantes de ubiquitina presentes en la superficie, que se deben unir a sustancias diana definidas previamente, se recubrieron 2 pocillos de una placa de microtítulos con la sustancia correspondiente. Como sustancias diana sirvieron el factor de crecimiento VEGF preparado recombinante que se inmovilizó durante la noche a 4º C en la placa de microtítulos. Los sitios de unión no cubiertos en la superficie de la placa de microtítulos se bloquearon mediante incubación de los pocillos respectivamente con 400 µl de BSA al 3% en WBT durante 90 min a RT. Después de separar la solución de bloqueo se añadieron por pocillo 250 µl de la solución con complejos de ribosoma ternarios de la reacción de transcripción / traducción in vitro y se incubó durante 60 min a 4º C y 50 rpm. Se separaron luego los complejos no unidos mediante lavado cinco veces por ejemplo con WBT (300 µl por pocillo, 3 min, 4º C, 50 rpm) y fuerte agitación. Se obtuvieron finalmente en la matriz de afinidad complejos no unidos con ayuda de 100 µl de EB (Tris/HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 1,5 M, EDTA 20 mM) – este tampón puede contener dado el caso 50 µg/ml de ARN de levadura (Sigma) – por pocillo e incubación durante 5 min a 4º C y 50 rpm en ARNm, se descomponen la proteína y las subunidades ribosómicas.

El aislamiento de ARN de la suspensión obtenida se realizó lo más rápidamente posible a temperatura ambiente y con uso del kit RNAeasy de Qiagen (nº cat. 74104) siguiendo las indicaciones del fabricante. A este respecto se realizó la elución del ARN en la última etapa con 30 µl de H2O sin ARNasa. Para la degradación de ADN eventualmente desplazado de construcciones de expresión lineales se trató la solución de ARN obtenida con DNasa I (Invitrogen). A tal fin se realizó la adición de 3 µl de tampón de DNasa (10x) y 3 µl de DNasa I (1 u/µl) y la incubación durante 15 min a temperatura ambiente. La DNasa se inactivó luego mediante adición de 3 µl de EDTA 25 mM y la incubación durante 10 min a 65º C. El ARN así obtenido se complementó con ayuda de la reacción de transcriptasa inversa. Se mezclaron en esto en primer lugar 8,5 µl del ARN con 0,5 µl del oligodesoxinucleótido T7te (Nº ID Sec: 21; 100 µM) y 4,0 µl de dNTP (2,5 mM cada uno), se incubó durante 5 min a 65º C y luego se puso sobre hielo durante 1 min. Luego se incorporaron como componentes adicionales 4,0 µl de tampón RT (5x), 1,0 µl de DTT (0,1 M), 1,0 µl de RNAsin (Promega) así como 1,0 µl de transcriptasa III SS-inversa (200 u/µl; Invitrogen) y se incubó durante 60 min a 55º C.

El preparado de reacción de la reacción de transcriptasa inversa se usó mediante PCR directamente para la nueva re-amplificación de las variantes de ubiquitina enriquecidas en información genética así como para la reincorporación de las secuencias regulatorias para un nuevo ciclo de selección. Para ello se llevaron a cabo dos reacciones de PCR consecutivas con uso del sistema PCR Expand High Fidelity (Roche) en un volumen total de 50 µl. Se usaron para 5 ello 5 µl del tampón 10x suministrado conjuntamente (incl. MgCl2 15 mM) así como 4 µl de dNTP-Mix y se rellenó con H2O. Adicionalmente el preparado de reacción contenía respectivamente 2,5 µl de cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 23 y Nº ID Sec: 21; 10 µM) así como 2,5 µl de dimetil-sulfóxido (DMSO). Se usaron como moldes 2,5 o 5,0 µl de la reacción RT previa. Después de añadir 0,75 µl de mezcla de polimerasa (3,5 u/µl) se incubó en 25 ciclos durante 15 s a 94º C, 30 s a 50º C y durante 1,0 min a 72º C cada vez. Se realizó una incubación subsiguiente 10 durante 7 min a 72º C. Se aisló el producto de PCR deseado mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa así como el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) y se pudo usar directamente para la segunda reacción PCR. Para esta se usaron 5 µl del tampón 10x suministrado conjuntamente (incl. MgCl2 15 mM) así como 4 µl de dNTP-Mix y se rellenó con H2O hasta 50 µl. Adicionalmente el preparado contenía respectivamente 2,5 µl de cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 24 y Nº ID Sec: 21; 10 µM). Como molde se usó el ADN completo de la reacción PCR previa.

15 Tras adición de 0,75 µl de mezcla de polimerasa (3,5 u/µl) se incubó en 25 ciclos durante 15 s a 94º C, 30 s a 50º C y durante 1,0 min a 72º C cada vez. Se realizó una incubación subsiguiente durante 7 min a 72º C. Se aisló el producto de PCR deseado mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) y se pudo usar directamente para la transcripción / traducción in vitro de un nuevo ciclo de selección.

20 De forma alternativa se realizó la clonación del gen correspondiente en el vector de expresión pET20B(-) (véase anteriormente). Esto posibilitó el análisis de las variantes de ubiquitina obtenidas en relación a su secuencia de ADN, cuya preparación recombinante en E. coli así como su purificación en una etapa se realizó mediante cromatografía de afinidad de quelato metálico inmovilizado (IMAC) con ayuda de un péptido hexahistidina fusionado carboxiterminal (véase más adelante). Se citan a título de ejemplo en la tabla 2 sustituciones de aminoácidos de

25 variantes de ubiquitina que se obtuvieron de este modo y se analizaron posteriormente.

Tabla 2: sustituciones de aminoácidos en la región de los sitios de unión de nueva generación de proteínas modificadas basadas en ubiquitina tras selección frente a distintas sustancias diana mediante presentación en ribosoma

Selección: Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos.

2:: 4: 6: 62: 63: 64: 65: 66:

SPU/: - Gln Phe Lys Gln Lys Glu Ser Thr

SPU-11-RD3/1: VEGF Arg Arg Ala Arg His Gly Thr Ser

SPU-11-A8: VEGF Leu Leu Trp Ser Leu Ser Gly Ile

SPU-11-58: VEGF Leu Leu Trp Arg Ser Asp Leu Asn

SPW-11-A1: VEGF Phe Trp Val Gly His Gln Arg Gly

/SPU: esqueleto proteico de ubiquitina sin sustituciones en la bolsa de unión

30 Ejemplo 6: preparación y purificación de las proteínas modificadas basadas en ubiquitina

Se realizó la caracterización de propiedades químico-proteicas de variantes de ubiquitina seleccionadas en fagémidos con señal de unión relativamente fuerte en ELISA y con secuencia de ADN funcional tras la clonación del gen correspondiente en el vector de expresión pET20B(-) (véase anteriormente). Esto hace posible la preparación recombinante de las respectivas variantes mediante BL21/pUBS de E. coli así como su purificación en una etapa

35 mediante cromatografía de afinidad de quelato metálico inmovilizado (IMAC) con ayuda de un péptido hexahistidina fusionado carboxiterminal.

Para la preparación recombinante de proteínas modificadas basadas en ubiquitina con nuevas propiedades de unión se inocularon 50 ml de medio 2xYT/Amp/Kan con una colonia aislada correspondiente y se agitó durante 16 horas a 37º C y 220 rpm. Con este cultivo previo se inocularon 1,5 de medio 12xYT/Amp/Kan en relación 1 : 50 y se incubó 40 hasta conseguir una densidad de células de DO600 = 0,5 a 37º C y 220 rpm. Tras inducción de la expresión de gen extraño mediante adición de 1 mM/I α-D-isopropil tiogalactosida (IPTG) se agitó otras 3 horas a 37º C y 220 rpm. Se sedimentaron luego las células mediante centrifugación (30 min, 5.000 g, 4º C) y se resuspendieron en 40 ml de NPI-20 (NaH2PO4 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM). Se realizó la clarificación de las células mediante incubación de media hora con 200 µg/ml de lisozima y 500 U de benzonasa a RT así como cinco pulsos con 45 ultrasonidos respectivamente durante 15 s. Se sedimentaron los detritos celulares tras centrifugación (30 min,

15.000 g, 4º C) y el sobrenadante, que contenía la proteína de célula completa soluble, se pudo usar directamente para una IMAC subsiguiente.

La cromatografía se realizó en un equipo FPLC ÄKTA™-Explorer (Amersham Pharmacia Biotech) con uso de una columna HP quelante de 5 ml HiTrap (Amersham Pharmacia Biotech) a RT y una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se 5 equilibró en primer lugar la columna con 5 volúmenes de columna de NPI-20, a partir de lo cual se condujo la proteína de célula completa por la columna. Se arrastró la proteína no unida mediante lavado con 30 volúmenes de columna de NPI-20. Se realizó la elución con un gradiente lineal de 20 mM a 250 mM de imidazol con un total de 20 volúmenes de columna recogiéndose el eluido en fracciones de 2,5 ml. Las fracciones, que contenían la variante de ubiquitina purificada, se analizaron y purificaron mediante electroforesis en gel de SDS-piliacrilamida. Los

10 rendimientos obtenidos de las variantes de ubiquitina recombinantes purificadas se encontraban a este respecto entre 10 y 30 mg/l de volumen de cultivo.

Ejemplo 7: caracterización de las propiedades de unión de proteínas modificadas basadas en ubiquitina con nuevas propiedades de unión

La unión de las variantes de ubiquitina seleccionadas respectivas, que se habían purificado como se describe en el

15 ejemplo 6, a recGLP1-R, Fc-IgM así como HC se detecta con ELISA bien con un conjugado de Ni/NTA-peroxidasa (Qiagen) o bien con un antisuero anti-ubiquitina (Sigma) de conejos. Para ello se cubrieron pocillos de placas de microtítulos durante la noche a 4º C con el antígeno correspondiente y por ejemplo BSA para la detección de unión no específica y para la saturación de los sitios de unión deseados se bloqueó durante 2 horas con BSA al 3% (en p/v) PBST 0,5. Se lavaron luego las placas 3 veces con PBST 0,1 y se desincrustaron. A continuación se pipeteó

20 100 µl de la solución de la proteína modificada purificada respectiva en PBST 0,1 en escalonamiento de concentración (de no diluido hasta dilución 1 : 16) en los pocillos de la placa. Después de una duración de la incubación de dos horas se lavó tres veces con PBST 0,1. Para la detección de la proteína modificada unida se diluyó el conjugado Ni/NTA-peroxidasa en relación 1 : 500 o bien el antisuero anti-ubiquitina en relación 1 : 10 en PBST 0,1 y se añadió 100 µl del mismo a cada pocillo. Después de una hora de incubación a RT se realizó

25 directamente la detección del conjugado Ni/NTA-peroxidasa (véase a continuación) o bien la incubación con un anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa (1 : 2.500 en PBST 0,1) durante una hora a RT. Para la detección se lavaron los pocillos tres veces con PBST 0,1, luego tres veces con PBS. Finalmente se pipetearon respectivamente 100 µl del kit ImmunoPure (Pierce) y se detuvo la reacción de color después de 15 min mediante adición de 100 µl de H2SO4 2 M. La medida de la extinción se realizó con ayuda de un lector Sunrise Remote

30 (Tecan) a 450 nm. Los valores así obtenidos de la intensidad de absorción se valoraron con ayuda del programa informático "Sigma Plot". A tal fin se registró la extinción medida frene a la concentración de proteína usada correspondiente y se ajustó la curva obtenida con ayuda de la fórmula (1) mediante regresión no lineal.

imagen1

Suponiendo un equilibrio de asociación/disociación entre el antígeno inmovilizado y la proteína modificada, 35 entonces:

x = concentración de la proteína modificada usada

y = concentración del complejo antígeno / proteína modificada (medida aquí indirectamente mediante la actividad enzimática del enzima reportero)

a = concentración total del antígeno inmovilizado

40 b = constantes de disociación (KD)

A título de ejemplo se representan en la figura 5 las curvas de unión obtenidas a partir de un experimento ELISA de este tipo de variantes de ubiquitina SPU-1-D10, que se han obtenido a partir del enriquecimiento de afinidad en recGLP1-R mediante presentación en fago según el ejemplo 3 y 4. Adicionalmente en la figura 6 se representan las curvas de unión de la variante de ubiquitina SPW-11-A1, que se ha obtenido a partir del enriquecimiento de afinidad

45 en VEGF mediante presentación en ribosoma según el ejemplo 5. Se resumen en la tabla 3 los datos de unión obtenidos para las proteínas modificadas basadas en ubiquitina seleccionadas individualmente con nuevas propiedades de unión.

Para el análisis cuantitativo de la unión de variantes de ubiquitina en un antígeno definido previamente se usó igualmente un sistema BIACORE 3000 (Biacore). Para tales medidas de resonancia de plasmones de superficie (Surface Plasmon Resonance, SPR) se posicionó un portador capaz de la inmovilización del analito (Sensor-Chip) en el equipo y se acopló con el sistema de microflujo integrado en él (Integrated µ-Fluidic Cartridge, IFC). Esto permitió una corriente de fluido continua desde el recipiente del tampón sobre la superficie del Chip y una detección de la unión en el portador de analito cuasi en solución.

5 Para la medida se acopló en primer lugar la molécula diana, por ejemplo, VEGF, mediante acoplamiento NHS/EDC por grupos amino primarios en la superficie de carboxi-metildextrán del sensor Chip CM5 (Biacore) siguiendo las indicaciones del fabricante. Las medidas se llevaron a cabo a 25º C y un flujo de tampón continuo de 35 µl/min. Como tampón de paso y disolvente de las proteínas usadas se usó PBS (esterilizado por filtración y desgasificado) con adición de 0,005% de detergente P-20 (Biacore). La interacción de distintas concentraciones de variantes de

10 ubiquitina, que se inyectaron en la cinta de muestras, se pudo detectar con el VEGF inmovilizado debido a la señal de SPR generada. La señal se cuantificó como las denominadas unidades de resonancia (Resonance Units, RU) en función del tiempo y se generaron las curvas de unión correspondientes. Se valoraron las curvas de unión obtenidas con ayuda del software BIAevaluation (versión 3.1; Biacore) y se determinó el valor de la constante de disociación (KD). A título de ejemplo se representan en la figura 7 las curvas de unión obtenidas en un experimento BIACORE de

15 este tipo de la variante de ubiquitina SPU-11-58, que se había obtenido a partir del enriquecimiento de afinidad en VEGF mediante presentación en ribosoma según el ejemplo 5. Se resumen en la tabla 3 los datos de unión obtenidos para las proteínas modificadas basadas en ubiquitina seleccionadas individualmente.

Tabla 3: constantes de disociación de complejos de proteínas modificadas basadas en ubiquitina seleccionadas y distintas sustancias diana

Proteína modificada Sustancia diana Valor de KD aparente

SPU-1-D10/ recGLP1-R 166 ± 0,06 nM

SPU-2-A71 Fc-IgM 9,4 ± 0,9 µM

SPU-3-H131 HC 10,7 ± 1,0 nM

SPU-11-RD3/12 VEGF 25 µM

SPU-11-A82 VEGF 70 nM

SPU-11-582 VEGF 50 nM

SPW-11-A11 VEGF 1,2 ± 0,1 µM

SPU-15-G71 TNF-α < 1,0 µM

SPU-15-E11 TNF-α < 1,0 µM

1Análisis mediante ELISA; 2Análisis mediante BIACORE

20 Adicionalmente se ensayaron proteínas modificadas individuales en relación a la especificidad de su unión. A tal fin se llevaron a cabo experimentos ELISA con una concentración adecuada individual de la proteína modificada como se describió anteriormente. A este respecto se cubrieron los pocillos correspondientes de las placas de microtítulos con el sustrato diana así como con sustancias estructuralmente similares. A modo de ejemplo se representan en la figura 8 las curvas de unión obtenidas en un experimento ELISA de este tipo de la variante de ubiquitina SPU-3-H13,

25 que se había obtenido a partir del enriquecimiento de afinidad en HC según el ejemplo 3 y 4.

Ejemplo 8: mejora de las propiedades de unión de proteínas de unión basadas en ubiquitina mediante mutagénesis secundaria dirigida al sitio

Sobre la base de la variante de ubiquitina SPU-2-A7, que muestra una propiedad de unión nueva frente a Fc-IgM, se estableció una estrategia de aplicación general para la maduración de la afinidad. Esta comprendía en primer lugar

30 la nueva sustitución aleatoria de posiciones seleccionadas en los sitios de unión de nueva generación sobre planos de ADN así como la expresión paralela subsiguiente, purificación y análisis de unión respectivamente de 96 de las variantes correspondientes. El uso de este “formato de 96” permite la transferencia de esta estrategia a robots de laboratorio y por tanto el análisis de variantes con gran rendimiento.

Para ello se mutaron aleatoriamente en dos preparados en paralelo los codones de dos posiciones respectivas (62 y

35 63 así como 64 y 65) mediante PCR. Se llevaron a cabo las reacciones correspondientes en un volumen respectivo de 50 µl, usándose aproximadamente 1.0 ng del gen para SPU-2-A7 insertado en pET20B(-) y se usó la Taqpolimerasa. Se pipeteó al preparado de reacción, como se preparó en el ejemplo 2, tampón 10x Taq, MgCl2 25 mM, dNTP-Mix así como los cebadores de flanqueo (Nº ID Sec: 12, Nº ID Sec: 25 para la mutación de las posiciones 62 y 63 o bien Nº ID Sec: 12, Nº ID Sec: 26 para la mutación de las posiciones 64 y 65; 10 µM). Tras rellenar con H2O se añadieron 2,5 U de Taq-polimerasa y se inició el programa PCR. Se incubó en 25 ciclos durante 1 min a 94º C, 1 min a 55º C y durante 1,5 min a 72º C cada vez. Se realizó una incubación subsiguiente durante 5 min a 72º C. Los productos de PCR deseados se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa y el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Los fragmentos de ADN obtenidos, que presentaban respectivamente las bibliotecas de SPU-2-A7 mutagenizado en posiciones 62/63 o 64/65, se recortaron mediante digestión con enzimas de restricción NdeI/XhoI preparativa y se aislaron de nuevo mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa. La inserción de bibliotecas de genes para el SPU-2-A7 modificado se realizó en el vector de expresión pET20B(-) (Novagen; véase el ejemplo 1) para la producción de la proteína correspondiente.

Tras la transformación de E. coli electrocompetitivo, por ejemplo Nova-Blue o células BL21, se obtuvieron colonias aisladas que contenían en forma de plásmido de expresión la información genética respectiva de un clon de la biblioteca obtenida. Se inocularon con 96 de estas colonias asiladas respectivamente 300 µl de 2xYT/Amp/Kan y se agitó durante la noche a 37º C y a 200 rpm. Se inocularon respectivamente a 100 µl de estos cultivos 96 x 4 ml de 2xYT/Amp/Kan y se incubó hasta conseguir una densidad celular de DO600 = 0,5 a 37º C y 220 rpm. A tal fin se usaron respectivamente cuatro placas de 24 cultivos (Qiagen). Tras la inducción de expresión de gen extraño mediante adición de 1 mM/L α-D-isopropil tiogalactosida (IPTG) se agitaron otras 3 horas a 37º C y 180 rpm o durante la noche a 30º C y 180 rpm. Se sedimentaron las células mediante centrifugación (30 min, 4.000 g, 4º C) y se recogió el sobrenadante. La degradación celular se realizó mediante lisis física (congelación por choque y descongelación) o química (detergentes) así como la adición de lisozima (200 µg/ml) y benzonasa 10 u/ml en volumen final). La purificación de las variantes de SPU-2-A7 de la proteína de célula completa obtenida se realizó con ayuda del kit BioRobot 9600 de Qiagen y una estación de vacío de funcionamiento manual (QIAvac 96, Qiagen). Las soluciones de proteína obtenidas se analizaron cuantitativamente en un experimento ELISA, que correspondía al diseño correspondiente al ejemplo 7, en lo referente a su unión a Fc-IgM. Se sometieron variantes de SPU-2-A7 con señal de unión relativamente fuerte en ELISA a la comprobación de la funcionalidad de su gen o del análisis de las sustituciones realizadas de una secuenciación de ADN. Se prepararon recombinantemente a escala de 1,5 l candidatos muy prometedores y se purificaron mediante cromatografía de afinidad de metalquelato inmovilizado (IMAC) con ayuda del péptido hexahistidina fusionado carboxiterminal. Para la cuantificación de la afinidad se llevó a cabo un ELISA dependiente de la concentración como se describe en el ejemplo 7 en comparación con SPU-2-A7 – la variante de ubiquitina partiendo de la cual se realizó la maduración. A título de ejemplo se representan en la figura 9 las curvas de unión obtenidas de este experimento ELISA de la variante de ubiquitina SPU-2-A7 así como SPU-2A7(62/63). Esta variante de afinidad madurada muestra con KD = 1,0 µM en comparación con SPU-2-A7 una fuerza de unión mejorado en un factor de 10.

Ejemplo 9: acoplamiento dirigido específico de sitio de dos proteínas basadas en ubiquitina mediante restos de cisteína carboxiterminales singulares mediante reactivos de bis-maleimida

La unión de dos variantes de ubiquitina idénticas se realizó covalentemente mediante restos de cisteína especialmente incorporados para ello con ayuda de bis-maleimido-hexano (BMH, Pierce). Para ello se incorporó en primer lugar un codón correspondiente para cisteína seguido de uno para prolina en el extremo 3’ del marco de lectura – es decir en la proteína carboxiterminal tras el péptido de hexahistidina-. El resto de prolina subsiguiente debió proteger a este respecto la proteína resultante de la degradación proteolítica durante la producción y purificación. La inserción de los pares de bases correspondientes se realizó con ayuda del kit de mutagénesis dirigida específica de sitio Quick Change™ (Stratagene) siguiendo las indicaciones del fabricante y con uso de oligodesoxinucleótidos Nº ID Sec: 27 y Nº ID Sec: 28 así como del gen de una variante de ubiquitina (Nº ID Sec: 15) en pET20B(-) como molde. Se analizaron clones obtenidos mediante secuenciación de ADN y se usaron colonias que poseían el plásmido de expresión con la inserción deseada para la producción recombinante y purificación según el ejemplo 6.

La proteína purificada se dializó frente a PBS con EDTA 1 mM y β-mercaptoetanol 5 mM y sirvió con una concentración de aproximadamente 1 mg/ml para la reacción de acoplamiento subsiguiente usada en el PBS, EDTA 1 mM como tampón de reacción. Para ello se redujo el resto cisteína libre en primer lugar mediante ajuste de la solución de proteína hasta di-tio-treitol 100 mM (DTT) e incubación durante una hora a temperatura ambiente. Luego se separaron los reactivos reductores de la proteína con ayuda de una columna PD10 Sephadex G-25 M (Amersham Biosciences), a esta se adicionó dos veces un exceso molar de reactivo de acoplamiento (solución madre: 100 mM BMH en DMSO) y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Se separó de nuevo BMH en exceso con ayuda de una columna PD10. Para saturar el reactivo de acoplamiento presente dado el caso se añadió al preparado de acoplamiento así obtenido de nuevo una cantidad equimolar de proteína recién reducida. Esta segunda etapa de acoplamiento tuvo lugar durante 2 horas a temperatura ambiente.

El preparado de acoplamiento obtenido con este procedimiento se analizó mediante SDS-PAGE (figura 10) y se evaluó el grado de acoplamiento. Este alcanzó para el procedimiento descrito aproximadamente 40%.

Bibliografía:

•: Ausuebel, F.M., Brent, R., Kinston, R.E., Moore, D.D., Seidmann, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (1994): Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc.

•: Bazarsuren, A., Grauschopf, U., Wozny, M., Reusch, D., Hoffmann, E., Schaefer, W., Panzner, S. y Rudolph,

R. (2002) In vitro folding, functional characterization, and disulfide pattern of the extracellular domain of human GLP-1 receptor. Biophys. Chem. 96, 305-318.

•: Beal, R., Deveraux, Q., Xia, G., Rechsteiner, M. y Pickart, C. (1996) Surface hydrophobic residues of multiubiquitin chains essential for proteolytic targeting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 861-866.

•: Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T. N., Weissig, H., Shindyalov, I. N. y Bourne, P. E. (2000) The Protein Data Bank. Nucleic Acid Res., 28, 235-242.

•: Beste, G. Schmidt, F. S., Stibora, T. y Skerra, A. (1999) Small antibody-like proteins with predescribed ligand specificities derived from the lipocalin fold. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1898-1903.

•: Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, R., Lee, S. M., Pope, H. S., Riordan, G.

S. y Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins. Science 242, 423-426.

•: Burch, T. J. y Haas, A. L. (1994) Site-directed mutagenesis of Ubiquitin. Differential roles for Arginine in the interaction with Ubiquitin-activating enzyme. Biochemistry 33, 7300-7308.

•: Brinkmann, U., Reiter, Y., Jung, S. H., Lee, B. y Pastan, I. (1993) A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv-Fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7538-7542.

•: Buchberger A, Howard MJ, Proctor M, Bycroft M, National Library of Medicine, J Mol Bil. 2001 Mr 16; 307(1); 17-24.

•: Carter, P., Kelley, R. F., Rodrigues, M. L., Snedecor, B., Covarrubias, M., Velligan, M. D., Wong, W. L. T., Rowland, Kotts, C. E., Carver, M. E., Yang, M., Bourell, J. H., Shepard, H. Connolly, M.L. (1983) "Solvent-Accessible Surfaces of Proteins and Nucleic Acids" Science, 221, 709 -713.

•: M. y Henner, D. (1992) High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment. Biotechnology 10, 163-167.

•: Daugherty, P. S., Chen, G., Olsen, M. J., Iverson, B. L. y Georgiou, G. (1998) Antibody affinity maturation using bacterial surface display. Protein Eng. 11, 825-832.

•: Dübel, S. y Kontermann, R. E. (2001) Recombinant Antibodies. In: Kontermann, R. y Dübel, S. (Hrsg.) "Antibody Engineering." Springer Verlag, Heidelberg.

•: Filippi, M., Tribioli, C. y Toniolo, D. (1990) Linkage and sequence conservation of the X-linked genes DX253 (P3) and DXS254E (GdX) in mouse and man. Genomics 7, 453-457.

•: Griep, R. A., van Twisk, C., van der Wolf, J. M. y Schots, A. (1999) Fluobodies: green fluorescent single-chain Fv fusion proteins. J. Immunol. Methods 230, 121-130.

•: Hanes, J., Jermutus, L., Weber-Bornhauser, S., Bosshard, H. R. y Plückthun, A. (1998) Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14130-14135.

•: Hanes, J., Schaffitzel, C., Knappik, A. y Plückthun, A. (2000) Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display. Nature Biotechnology 18, 1287-1292.

•: He, M. y Taussig, M. J. (1997) Antibody-ribosome-mRNA (ARM) complexes as efficient selection particles for in vitro display and evolution of antibody combining sites. Nucleic Acids Res. 25, 5132-5134.

•: Holliger, P., Prospero, T. y Winter, G. (1993) "Diabodies": small bivalent and bispecific antibodies. Proc. Natl. Sci. USA 90, 6444-6448.

•: Hoogenboom, H. R., de Bruine, A. P., Hufton, S. E., Hoet, R. M., Arends, J. W. y Roovers, R. C. (1998) Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology 4, 1-20.

•: Jones, D. y Candido, E. P. (1993) Novel ubiquitin-like ribosomal protein fusion genes from the nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. J. Biol. Chem. 268, 19545-195451.

•: Kieke, M. C., Cho, B. K., Boder, E. T., Kranz, D. M. y Wittrup, K. D. (1997) Isolation of anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display. Protein Eng. 10, 1303-1310.

•: Knappik, A., Ge, S., Honegger, A., Pack, P., Fischer, M., Wellnhofer, G., Hoess, A., Wölle, J., Plückthun, A. y Virnekäs, B. (2000) Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J. Mol. Biol., 296, 57-86.

•: Koide, A., Bailey, C. W., Huang, X. y Koide, S. (1998) The fibronectin type III domain as ascaffold for novel binding proteins. J. Mol. Biol. 284, 1141-1151.

•: Kuchner, O. and Arnold, F.H. (1997): Directed evolution of enzyme catalysts. TIBTECH 15, 523-530.

•: Kumar, S., Yoshida, Y. y Noda, M. (1993) Cloning of a cDNA which encodes a novel ubiquitin-like protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 393-399.

•: Larsen CN, Wang H., National Library of Medicine; J Proteome Res. 2002 Sep-Oct; 1(5): 411-9.

•: Marx, J. (2002) Ubiquitin lives up to its name. Science 297, 1792-1794.

•: McConell S. and Hoess R.H. (1995): Tendamistat as a scaffold for conformationally constrained phage peptide libraries. J. Mol. Biol. 250, 460-470.

•: Michiels, L., Van der Rauwelaert, E., Van Hasselt, F., Kas, K. y Merregaert, J. (1993) Fau cDNA encodes a ubiquitin-like-S30 fusion protein and is expressed as an antisense sequence in the Finkel-Biskis-Reilly murine sarcoma virus. Oncogene 8, 2537-2546.

•: Miura, T., Klaus, W., Gsell, B., Miyamoto, C. y Senn, H. (1999) Characterization of the binding interface between Ubiquitin and class I human Ubiquitin-conjugating enzyme 2b by multidimensional heteronuclear NMR spectroscopy in solution. J. Mol. Biol. 290, 213-228.

•: Muller, B.H., Chevrier, D., Boulain, J.-C y Guesdon, J.-L. (1999) Recombinant single-chain Fv antibody fragment-alkaline phosphatase conjugate for one-step immunodetection in molecular hybridization. J. Immunol. Methods 227, 177-185.

•: Muller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G. y Jentsch, S. (2001) SUMO, ubiquitins mysterious cousin. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 202-210.

•: Murzin A. G., Brenner S. E., Hubbard T. y Chothia C. (1995). SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. J. Mol. Biol. 247, 536-540.

•: Nord K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M. and Nygren, P.A. (1997); Binding proteins selected from combinatorial libraries of an beta-helical bacterial receptor domain. Nat. Biotechnol. 8, 772-777.

•: Odegrip, R., Coomber, D., Eldridge, B., Herderer, R., Kuhlman, P. A., Ullman, C., Fitz-Gerald, K. y McGregor,

D. (2003) CIS display: In vitro selection ofpeptides from libraries ofprotein-DNA complexes. PNAS 101, 28062810.

•: Pannekoek, H., van Meijer M., Schleef, R.R., Loskutoff, d.J. and Barbas, C.F. (1993): Functional display of human plasminogen-activator inhibitor 1 (PAI-1) on phages: Novel perspectives for structure-function analysis by error-prone DNA synthesis. Gene 128, 135-140.

•: Reiter, Y. y Pastan, I. (1998) Recombinant Fv immunotoxins and Fv fragments as novel agents for cancer therapy and diagnosis. Trends Biotechnol. 16, 513-520.

•: Sambrook, J., Maniatis, T. and Fritsch, E.F. (1989): Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold spring Harbor. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York.

•: Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

•: Shrake, A. and Rupley, J.A. (1973) Environment and Exposure to Solvent of Protein Atoms. Lysozyme and Insuline. J. Mol. Biol. 79, 351-371.

•: Skerra, A. y Plückthun, A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 240, 1038-1041.

•: Schaffitzel, C., Zahnd, C., Amstutz, P., Luginbühl, B. y Plückthun, A.(2001) In vitro selection and evolution of protein-ligand interactions by ribosome display. In: Protein-Protein Interactions, A Molecular Cloning Manual,

E. Golemis, Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001, pp. 535-567.

•: Skerra, A. (2000) Engineered protein scaffolds for molecular recognition. J. Mol. Recognit. 13, 167-187.

•: Stemmer, W.P.C. (1994): Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370, 389-391.

•: Vijay-Kumar, S., Bugg, C. E. y Cook, W. J. (1987) Structure ofUbiquitin refined at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 194, 531-544.

•: Winter, G. (1998) Synthetic human antibodies and a strategy for protein engineering. FEBS Lett. 430, 92-94.

•: Wintrode, P. L., Makhatadze, G. I. y Privalov, P. L. (1994) Thermodynamics of Ubiquitin unfolding. Proteins Struct. Funct. Genet. 18, 246-253.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Scil Proteins GmbH

<120> Generación de proteínas de unión sintéticas basadas en ubiquitina

<130> P17437

<150> DE 103 24 447.6

<151> 23-05-2003

<160> 34

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 291

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<223> Secuencia de ADN para un esqueleto de proteína ubiquitina modificado

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<223> Secuencia de ubiquitina modificada como base para biblioteca

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<212> ADN

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<223> Oligodesoxinucleótido

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<223> Construcción de una biblioteca de variantes de ubiquitina

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<212> ADN

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<223> Construcción de una biblioteca de variantes de ubiquitina

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<212> PRT

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<223> Construcción de una biblioteca de variantes de ubiquitina

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<223> cualquier aminoácido

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<223> cualquier aminoácido

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<223> cualquier aminoácido

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<221> MISC_FEATURE

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<223> cualquier aminoácido

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<212> ADN

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<223> Construcción de una biblioteca de variantes de ubiquitina

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la preparación de una proteína, presentando el procedimiento las siguientes etapas:

a) seleccionar una proteína que se va a modificar del grupo de proteínas constituido por ubiquitina, SUMO-1, FAU, NEDD-8, UBL-1, Rub1, APG8, ISG15, URM1, HUB1, GDX, elongina B, PLIC2 (dominio N-terminal), parquina humana (dominio N-terminal);

b) seleccionar una pareja de unión;

c) determinar los aminoácidos expuestos en la superficie de la proteína de la etapa a);

d) seleccionar posiciones de aminoácidos en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína, que incluye al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta y de forma opcional regiones en lámina plegada no beta;

e) modificar las posiciones de aminoácidos seleccionadas mediante sustitución, inserción, deleción y/o modificación química, conservando el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina;

f) poner en contacto la proteína modificada con la pareja de unión determinado en la etapa b);

g) detectar aquellas proteínas que presentan una afinidad de unión, expresada en KD, por la pareja de unión predeterminada de 10-5 M a 10-12 M frente a la pareja de unión predeterminada en la etapa b), y que presentando modificaciones tales, que forman una región continua de 5 a 10 aminoácidos sobre la superficie de la proteína, en la que al menos se encuentran modificados cuatro aminoácidos expuestos en la superficie en la región en lámina plegada beta.
2.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa e) se lleva a cabo mediante síntesis química de la proteína modificada.
3.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la modificación en la etapa e) se realiza mediante modificación de ingeniería genética de un ADN perteneciente a la proteína modificada correspondiente, y la expresión de la proteína se realiza en organismos huésped procariotas o eucariotas o in vitro.
4.

Procedimiento según la reivindicación 3, en el que en la etapa e) se genera una biblioteca génica.
5.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa e) se lleva a cabo mediante mutagénesis aleatoria una sustitución aleatoria de los aminoácidos seleccionados.
6.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa f) se realiza la puesta en contacto con la pareja de unión predeterminada mediante un procedimiento de selección adecuado, preferiblemente el procedimiento de presentación en fago, presentación en ribosoma, presentación en ARNm, presentación en CIS o presentación en superficie celular, presentación en superficie de levadura, presentación en superficie bacteriana, de forma particular preferiblemente mediante el procedimiento de presentación en fago.
7.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa g) se realiza la detección de las proteínas con una afinidad de unión con la pareja de unión predeterminada mediante uno o varios de los siguientes procedimientos: ELISA, espectroscopía de resonancia de plasmón superficial, espectroscopía de fluorescencia, FACS, calorimetría de valoración isotérmica o ultracentrifugación analítica.
8.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que tras la etapa g) sigue una etapa de aislamiento y/o enriquecimiento de la proteína detectada con afinidad de unión con la pareja de unión predeterminada.
9.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína es madurada mediante procedimientos conocidos en lo que respecta a su afinidad de unión, su especificidad de unión y/o otras propiedades químico-proteicas, por ejemplo, estabilidad, solubilidad o rendimiento.
10.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína se une de forma dirigida de sitio y covalentemente con una proteína de igual o distinta especificidad, con lo que se obtiene una proteína bivalente o biespecífica.
11.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína humana es ubiquitina u otra ubiquitina de mamífero.
12.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que las modificaciones comprenden una región continua de 6 a 8 aminoácidos sobre la superficie de la proteína.
13.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera y cuarta hebra en lámina plegada beta está modificada en sus aminoácidos expuestos en la superficie.
14.

Procedimiento según la reivindicación 13, en el que de forma opcional adicionalmente en la ubiquitina de mamífero están modificadas las regiones de aminoácidos 62 a 65 de las regiones en lámina plegada no beta.
15.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la modificación es una sustitución, inserción, deleción, modificación química o combinaciones de las mismas, y comprende uno o varios aminoácidos, preferiblemente una sustitución, al menos parcial de aminoácidos adyacentes o no directamente adyacentes en la secuencia primaria, en el que preferiblemente los aminoácidos modificados que no son adyacentes en la secuencia primaria forman en la estructura secundaria una región de unión preferiblemente continua para la pareja de unión.
16.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que el número de modificaciones, preferiblemente sustituciones, de aminoácidos directamente adyacentes en la secuencia primaria es de 2 a 8 aminoácidos directamente adyacentes, adicionalmente preferiblemente de 3 a 7 o de 4 a 6 o de 2 a 4 aminoácidos directamente adyacentes.
17.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que una parte de los aminoácidos modificados directamente adyacentes en la secuencia primaria se encuentra en una región de inicio o final de una hebra en lámina plegada beta, presentando esta parte una longitud de dos o más aminoácidos, preferiblemente de dos o tres aminoácidos.
18.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados 5 o más aminoácidos directamente adyacentes en la primaria secuencia, preferiblemente sustituidos, de los cuales uno, dos

o más, preferiblemente dos o tres, aminoácidos directamente adyacentes forman el comienzo o el final de una región de hebra en lámina plegada beta.
19.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados aminoácidos en aquellas posiciones que no pertenecen a regiones que son parte de una proteína natural según la reivindicación 1 en uniones con parejas de unión de ubiquitina naturales.
20.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos el 25% de los aminoácidos presentes en las hebras beta de la proteína, preferiblemente ubiquitina, están modificados.
21.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se realiza una modificación de aminoácidos también en regiones bucle de la proteína.
22.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se trata de ubiquitina humana o una proteína homóloga a esta, y en el que están modificados al menos 8 aminoácidos de la ubiquitina expuestos en la superficie, preferiblemente sustituidos, de modo que estos aminoácidos modificados comprenden la región con afinidad de unión con la pareja de unión.
23.

Procedimiento según la reivindicación 22, en el que al menos seis de los ocho aminoácidos expuestos en la superficie se encuentran en una región de la proteína que está asignada a la región de lámina plegada beta.
24.

Procedimiento según la reivindicación 22 o 23, en el que al menos 5 de los aminoácidos modificados, preferiblemente sustituidos, se encuentran adyacentes directamente entre sí en la secuencia primaria.
25.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados aminoácidos que se encuentran en la hebra en lámina plegada beta aminoterminal y/o en la hebra en lámina plegada beta carboxiterminal de la proteína.
26.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados adicionalmente aminoácidos que se encuentran en el bucle que sigue a la hebra en lámina plegada beta carboxiterminal.
27.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína modificada es ubiquitina humana que se sustituyó, delecionó, insertó y/o modificó químicamente, preferiblemente se sustituyó, en las posiciones 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 y 66.
28.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína que se selecciona para la modificación, ya presenta inserciones, deleciones, sustituciones y/o modificaciones químicas, de modo que se han suprimido o se han generado de nuevo funciones biológicas y/o químico-proteicas de la proteína.
29.

Procedimiento según la reivindicación 28, en el que en la proteína se encuentran intercambiados tras la modificación en total al menos 10, preferiblemente al menos 15 aminoácidos de la ubiquitina.
30.

Procedimiento según la reivindicación 28 ó 29, en el que la proteína que se selecciona para la modificación por sustitución, inserción y/o deleción es ubiquitina humana que está sustituida en una o varias de las siguientes posiciones: 44, 48, 54, 70, 72, 75, y en la que está delecionada la posición de aminoácido 76, de modo tal que la ubiquitina ya no presenta sustancialmente interacción con su pareja de unión natural.
31.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína es ubiquitina humana que contiene en la posición 45 la sustitución fenilalanina por triptófano.
32.

Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la pareja de unión es un antígeno o un hapteno.

5 33. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la afinidad de unión, expresada en KD, con la pareja de unión predeterminada es 10-6 M a 10-12 M, adicionalmente preferiblemente hasta 10-12 M o 10 9 a 10-12 M.
34. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se obtienen proteínas para la

detección, para la determinación cuantitativa, para la separación y/o para el aislamiento de la pareja de unión 10 correspondiente por medio de procedimientos en sí conocidos, tales como técnicas de cromatografía o de adsorción.
35. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se obtienen proteínas para el diagnóstico, profilaxis y tratamiento de enfermedades, en el que toma parte la pareja de unión correspondiente directa o indirectamente.