ES2362244T3

ES2362244T3 - Conjugados polímeros de la caja a de hmgb1 y variantes de la caja a de hmgb1.

Info

Publication number: ES2362244T3
Application number: ES07818168T
Authority: ES
Inventors: Silvio Traversa; Chiara Lorenzetto; Valentina Mainero; Sebastiano Morena; Silvano Fumero; Luca Beccaria
Original assignee: Creabilis Therapeutics SpA
Current assignee: Creabilis Therapeutics SpA
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2011-06-30
Anticipated expiration: 2027-09-14

Abstract

Conjugado polímero del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humano y/o no humano (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1.

Description

La presente invención se refiere a nuevos conjugados polímeros del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1. Además, la invención se refiere a nuevos conjugados polímeros de variantes polipeptídicas del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 (Caja A de HMGB1) o de los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1. Además, la presente invención se refiere al uso de dichos conjugados polímeros para diagnosticar, prevenir, aliviar y/o tratar patologías asociadas con HMGB1 extracelular y/o asociadas con una expresión incrementada de RAGE.

La proteína HMGB1 pertenece a la familia de las proteínas del grupo de alta movilidad (HMG). Las proteínas del HMG, así denominadas debido a su elevada movilidad electroforética en geles de poliacrilamida, son las proteínas más ubicuas distintas de las histonas asociadas con cromatina aislada en las células eucariotas. Estas proteínas desempeñan un papel “arquitectónico” generalizado en la flexión, formación de bucles, plegamiento y envolvimiento del ADN, dado que distorsionan, flexionan o modifican estructuras y complejos de ADN con factores de transcripción

o histonas (Andersson et al., 2000; Agresti et al., 2003; Degryse et al., 2003). La proteína del grupo 1 de alta movilidad (HMGB1) es habitualmente un factor nuclear, en particular una molécula reguladora transcripcional que provoca la flexión del ADN y que facilita la unión de varios complejos transcripcionales.

Estructuralmente, la proteína HMGB1 es una proteína de aproximadamente 25 kDa con una secuencia altamente conservada entre los mamíferos, con lo que 2 de cada 214 aminoácidos tienen sustituciones conservativas en todas las especies de mamíferos. HMGB1 está presente de forma ubicua en todos los núcleos de los vertebrados, y en particular se puede encontrar en fibroblastos, neuronas, hepatocitos, gliocitos y en células derivadas de células madre hematopoyéticas, incluyendo monocitos/macrófagos, neutrófilos y plaquetas. La molécula de HMGB1 tiene una estructura tripartita compuesta de tres dominios distintos: dos dominios de unión a ADN, denominados Caja A y Caja B de HMG, y un término carboxilo ácido, que hace que la misma esté cargada bipolarmente.

Las dos cajas de HMGB están involucradas en la función de la proteína como elementos arquitectónicos de unión a ADN inespecíficos de la secuencia, confiriendo la capacidad para unirse a ADN en estructuras de ADN distorsionadas reconocidas y estabilizando el ensamblaje, la remodelación y el deslizamiento de nucleosomas. Ambas cajas A y B de HMG están formadas por 84 restos de aminoácidos muy conservados, están fuertemente cargados positivamente, y están dispuestas en tres hélices  que tienen un plegamiento similar en forma de L. La rama larga de la “L” contiene la hebra extendida N-terminal y la hélice III (Andersson et al., 2002; Agresti et al., 2003; Thomas, J.O. 2001), mientras que la rama corta comprende las hélices I y II. El análisis de la función estructural revela que el dominio de citosina proinflamatoria de HMGB1 es la Caja B, y en particular la secuencia de sus primeros 20 aminoácidos. La Caja A es un agonista extremadamente débil de la liberación de citosina proinflamatoria accionada por HMGB1, e inhibe competitivamente las actividades proinflamatorias de la Caja B y de toda la proteína. Por lo tanto, desde el punto de vista farmacológico, la Caja A actúa como un antagonista de las patologías inducidas y/o sostenidas por la Caja B y HMGB1.

El tercer dominio, el término carboxilo o cola ácida, está cargado muy negativamente, dado que contiene 30 restos repetitivos de ácido aspártico y glutámico, y está enlazado a las cajas por una región básica de alrededor de 20 restos. Las HMGB1 de ratón y de rata difieren de la forma humana sólo en dos sustituciones, que están localizadas en este tramo continuo C-terminal.

Además de su localización nuclear y su papel como regulador de factores de transcripción, HMGB1 se ha encontrado también en el medio extracelular, liberada activamente por células activadas del sistema inmunitario (monocitos y macrófagos), o liberada pasivamente por células deterioradas o necróticas (Andersson et al., 2002; Scaffidi et al., 2002; Bonaldi et al., 2002; Taniguchi et al., 2003; Friedman et al., 2003; Palumbo et al., 2004).

La HMGB1 liberada extracelularmente actúa como una citocina potente y como un factor estimulador de macrófagos extremadamente potente. HMGB1 actúa directamente uniéndose a la membrana celular, induciendo señalización y quimiotaxia, teniendo función semejante a una quimiocina (Yang et al., 2001) y actuando además indirectamente aumentando la expresión y secreción de citocinas pro-inflamatorias. Esto hace de la proteína HMGB1 extracelular una potente proteína quimiotáctica e inmunorreguladora que promueve una respuesta inmunitaria inflamatoria efectiva. Adicionalmente, otras proteínas pertenecientes a la familia de proteínas del HMG, y que son capaces de flexionar el ADN, se liberan junto con HMGB1 en el medio extracelular. Estas proteínas son, entre otras, HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, MHG-4L y SP100-HMG. Comparten con HMGB1 secuencias de aminoácidos altamente homólogas. Al igual que HMGB1, desencadenan/sostienen patologías inflamatorias que interaccionan con los mismos receptores, conduciendo a las mismas rutas de interacción aguas abajo.

En células sanas, HMGB1 migra al citoplasma por transporte tanto pasivo como activo. Sin embargo, todas las células cultivadas y monocitos en reposo contienen la mayor proporción de HMGB1 en el núcleo, lo que indica que, en condiciones basales, la importación es mucho más eficaz que la exportación. Las células podrían transportar HMGB1 fuera del núcleo acetilando restos de lisina, que son abundantes en HMGB1, neutralizando de ese modo su carga básica y haciendo que los mismos sean incapaces de funcionar como señales de localización nucleares. La hiperacetilación de HMGB1 nuclear determina la relocalización de esta proteína desde el núcleo al citoplasma (en los fibroblastos, por ejemplo), o su acumulación en endolisosomas secretores (en monocitos y macrófagos activados, por ejemplo), y el redireccionamiento subsiguiente hacia la liberación por una ruta secretora no clásica mediada por vesículas. La secreción de HMGB1 por monocitos ya activados es desencadenada luego por la lisofosfatidilcolina (LPC) bioactiva, que es generada más tarde en el sitio de inflamación a partir de fosfatidilcolina por la acción de la fosfolipasa secretora sPLA2 producida por monocitos varias horas después de su activación. Por lo tanto, parece que la secreción de HMGB1 está inducida por dos señales (Bonaldi et al., 2003) y tiene lugar en tres etapas: 1) inicialmente, una señal inflamatoria promueve la acetilación de HMGB1 y su relocalización desde el núcleo al citoplasma (etapa 1) y el almacenamiento en vesículas citoplásmicas secretoras (etapa 2); a continuación, una señal de secreción (ATP extracelular o lisofosfatidilcolina) promueve la exocitosis (tercera etapa) (Andersson et al., 2002; Scaffidi et al., 2002; Gardella et al., 2002; Bonaldi et al., 2003; Friedman et al., 2003).

La HMGB1 liberada ha sido identificada como uno de los ligandos que se unen al receptor RAGE. Este receptor se expresa en la mayoría de los tipos de células, y a un nivel elevado, principalmente en células endoteliales, en células de la musculatura lisa vascular, en monocitos y macrófagos, y en fagocitos mononucleares. El reconocimiento implica el terminal C de HMGB1. La interacción de HMGB1 y RAGE desencadena un periodo sostenido de activación celular mediado por el aumento de RAGE y señalización dependiente de receptores. En particular, la interacción de HMGB1 y RAGE activa varias rutas de transducción de señales intracelulares, que incluyen proteína cinasas activadas por mitógenos (MAPK), Cdc-42, p21ras, Rac y el factor de translocación nuclear B (NF-B), el factor de transcripción ligado clásicamente a procesos inflamatorios (Schmidt et al., 2001).

De acuerdo con varias pruebas experimentales, la HMGB1 liberada puede interaccionar también con receptores pertenecientes a una o más subclases de la familia de los receptores de tipo Toll. Además, HMGB1 puede interaccionar también con el dominio semejante a lectina N-terminal funcional (D1) de trombomodulina. Debido a la capacidad del dominio D1 funcional de la trombomodulina para interceptar y unirse a HMGB1 circulante, se evita la interacción con los receptores RAGE y los receptores de tipo Toll.

Cuando se libera in vivo, HMGB1 es una citocina extremadamente potente y un potente factor estimulador de macrófagos. De hecho, al igual que otros mediadores citocínicos de la endotoxemia, HMGB1 activa in vitro una cascada de citocinas proinflamatorias múltiples (TNF, IL-1, IL-1, IL-1Ra, IL-6, IL-8, MIP-1 y MIP-1) procedentes de macrófagos humanos. Por lo tanto, HMGB1 se comporta como un mediador tardío durante la inflamación aguda, y participa de manera importante en la patogénesis de la inflamación sistémica después de que se ha resuelto la respuesta de los mediadores tempranos.

Además, el aumento de RAGE observado en entornos proinflamatorios y la expresión aumentada demostrada de este receptor en una variedad de enfermedades agudas y crónicas proporcionan soporte para RAGE como una diana atractiva para intervenciones médicas futuras relacionadas con la inflamación.

Los efectos pro-inflamatorios observados de HMGB1 in vitro y la correlación entre los niveles de HMGB1 circulante y el desarrollo de la secuencia patógena de la inflamación sistémica in vivo indican que la selección como diana terapéutica de esta molécula semejante a citocina debería ser de valor clínico importante, sugiriendo nuevos enfoques terapéuticos por una administración “tardía” de antagonistas/inhibidores (selectivos) de las actividades extracelulares de HMGB1.

Por lo tanto, se realizaron varios intentos a fin de bloquear esta proteína quimio-citocina HMGB1 extracelular. Varios enfoques importantes se dirigieron a la administración de anticuerpos contra HMGB1, de anticuerpos contra fragmentos de HMGB1 (por ejemplo, Cajas de HMGB1), de anticuerpos para RAGE, de RAGE soluble (sRAGE), de piruvato de etilo (Czura et al., 2003; Lotze et al., 2003) y el dominio semejante a lectina N-terminal (D1) de trombomodulina.

La Caja A de HMGB1, uno de los dos dominios de unión a ADN en HMGB1, ha sido identificada como un antagonista específico de HMGB1: la Caja A recombinante altamente purificada protegía a los ratones contra la septicemia experimental letal incluso cuando el tratamiento inicial se demoró 24 horas después de la inducción de la patología, sugiriendo adicionalmente que los antagonistas de HMGB1 se pueden administrar con éxito en una ventana clínicamente relevante más ancha que la utilizada para otras citocinas conocidas (Yang et al., 2004).

El análisis de la función estructural de mutantes truncados de HMGB1 reveló que el dominio de la Caja A de HMGB1 desplaza competitivamente la unión saturable de HMGB1 a macrófagos, antagonizando específicamente las actividades de HMGB1. Como ya se ha visto con la actividad protectora de anticuerpos anti-HMGB1, la administración de la Caja A restablece los ratones de la septicemia incluso cuando el tratamiento se ha iniciado tan tarde como 24 horas después de la inducción quirúrgica de la septicemia (Yang et al., 2004). Antagonistas o inhibidores de HMGB1 seleccionados del grupo de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a una proteína HMGB1, secuencias antisentido de genes de HMGB1 y antagonistas de los receptores de HMGB1 se conocen desde los documentos US 6.468.533, WO 02/74337 y US 2003/0144201.

Un intento prometedor para inhibir y/o antagonizar la proteína quimio-citocina HMGB1 extracelular se basa por lo tanto en la prueba experimental de que los dos dominios de unión de alta afinidad para ADN, es decir, la Caja A de HMGB1 y la Caja B de HMGB1, que están presentes en la molécula de HMGB1, tienen dos papeles opuestos en la proteína liberada en el espacio extracelular. La actividad principal de la Caja B de HMGB1 es mediar las actividades proinflamatorias atribuidas a la proteína HMGB1. Por otro lado, la Caja A de HMGB1 actúa como un antagonista, compitiendo con la actividad proinflamatoria del dominio de la Caja B.

La solicitud de patente WO 2006/024547 describe variantes polipeptídicas de la Caja A de HMGB1, o de fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1, que se obtienen a través de mutaciones sistemáticas de aminoácidos individuales de la proteína de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje. Por lo tanto, el documento WO 2006/024547 proporciona nuevos agentes como inhibidores y/o antagonistas selectivos de HMGB1 extracelular y su uso para prevenir, aliviar y/o tratar el amplio espectro de patologías asociadas e inducidas por la quimiocina HMGB1 extracelular y/o por la cascada de múltiples citocinas inflamatorias provocadas por la liberación extracelular de las proteínas quimiocinas HMGB1.

La eficacia de la administración de fármacos proteicos sintéticos se puede ver impedida in vivo por factores tales como solubilidad a pH fisiológico, eliminación rápida por filtración glomerular, aclaramiento y metabolismo celular, así como absorción fácil. La eficacia de la administración oral está impedida, por ejemplo, puesto que las proteínas son digeridas si se toman oralmente. Por otro lado, la eficacia de la administración sistémica está impedida puesto que las proteínas por debajo de 65-70 kDa son aclaradas rápidamente del organismo. En muchos casos, tales efectos desventajosos conducen a un cumplimiento reducido del paciente y a una eficacia reducida del fármaco, previniendo un uso terapéutico efectivo de tales agentes proteicos.

Una estrategia exitosa para mejorar la eficacia y la duración de los efectos de los agentes proteicos y para reducir los efectos toxicológicos potenciales es la unión covalente de un agente proteico biológicamente activo a diversos polímeros. Uno de los polímeros que se usa más a menudo en la técnica para mejorar las propiedades farmacológicas y toxicológicas de un agente activo es polietilenglicol, PEG de forma breve. Los polímeros de polietilenglicol (PEG) son anfifílicos, no tóxicos e inmunológicamente inertes, y se pueden conjugar a fármacos para manipular muchas de las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas.

En la técnica se dan a conocer muchas modificaciones covalentes de proteínas útiles terapéuticas con polietilenglicol (PEG). La unión covalente de PEG a una proteína (“pegilación”) es útil a fin de extender la semivida de circulación de las proteínas, puesto que incrementa el tamaño efectivo de las proteínas y reduce su velocidad de aclaramiento del organismo. Además, la modificación de una proteína con PEG incrementa la solubilidad de la proteína, la estabilidad, y disminuye la inmunogenicidad de la proteína.

El problema subyacente a la presente invención fue por lo tanto la provisión de nuevos agentes proteicos terapéuticamente útiles, que actúen como antagonistas y/o inhibidores selectivos de HMGB1 extracelular. Por lo tanto, el alcance de la presente invención fue explotar las características peculiares de algunos polímeros, en particular de PEG, a fin de desarrollar nuevas formas de administración del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB-1 (Caja A de HMGB1), que muestran la misma si no una actividad farmacológica incluso superior y además un comportamiento farmacocinético y toxicológico mejorado en comparación con el polipéptido de la Caja A de HMGB1 no conjugado, y que permiten lograr la mejor disponibilidad de la Caja A de HMGB1 o de un fragmento biológicamente activo de la misma en diversas vías de administración posibles.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un nuevo conjugado polímero del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 (Caja A de HMGB1) de tipo salvaje humano y/o no humano o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1. En SEC ID NO: 1 se muestra la secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1 humana. Una Caja A de HMGB1 no humana preferida es la Caja A de HMGB1 de Anapheles gambia, cuya secuencia se muestra en SEC ID NO: 301.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un conjugado polímero de una variante polipeptídica del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 humano y/o no humano o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1, con lo que la secuencia de aminoácidos de dicha variante polipeptídica difiere de la secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje por la mutación de uno o más aminoácidos individuales.

En el contexto de la presente invención, “HMGB1” incluye la forma no acetilada o/y la forma acetilada de HMGB1. Igualmente, “proteínas homólogas a HMGB1” incluye la forma no acetilada o/y la forma acetilada de las proteínas homólogas a HMGB1. Las proteínas homólogas a HMGB1 preferidas son HMGB2, HMGB3, HMGB-1L10, HMG-4L o/y SP100-HMG.

Los nuevos conjugados polímeros de la presente invención muestran una mayor solubilidad en agua, una manejabilidad farmacéutica mejorada, una farmacocinética y biodisponibilidad mejoradas, y/o una toxicidad y/o inmunogenicidad reducidas en comparación con el polipéptido de HMGB1 no conjugado o variante polipeptídica. Además, se encontró sorprendentemente que la conjugación del polipéptido de la Caja A de HMGB1 o variante polipeptídica y/o fragmento no altera la actividad biológica de la proteína.

El resto polimérico según la presente invención ha de ser biocompatible, puede ser de origen natural o semisintético

o sintético, y puede tener una estructura lineal o ramificada. Los polímeros ejemplares incluyen sin limitación polialquilenglicoles, poli(óxidos de alquileno), poli(ácido acrílico), poliacrilatos, poliacrilamida o derivados N-alquílicos de la misma, poli(ácido metacrílico), polimetacrilatos, poli(ácido etilacrílico), polietilacrilatos, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), dextrano, quitosano, poliaminoácidos.

En una realización muy preferida de la presente invención, el polímero es polietilenglicol (PEG) o polietilenglicol, en el que el grupo OH terminal puede estar opcionalmente modificado, por ejemplo, con grupos alquilo de C1-C5 o grupos acilo de C1-C5, preferiblemente con grupos alquilo de C1, C2 o C3 o grupos acilo de C1, C2 o C3. Preferiblemente, el polietilenglicol modificado es metoxi-polietilenglicol (mPEG).

El polímero usado según la presente invención tiene un peso molecular que oscila desde 100 hasta 100.000 Da, preferiblemente de 5.000 a 50.000 Da. En una realización muy preferida de la invención, el polímero es PEG, que tiene preferiblemente un grupo OH y/o metoxi terminal, con un peso molecular que oscila desde 10.000 hasta 40.000 Da, y preferiblemente desde 20.000 hasta 40.000 Da. En la realización más preferida, en la presente invención se usa un PEG que tiene preferiblemente un grupo OH y/o metoxi terminal con un peso molecular medio de 20.000 Da

o de 40.000 Da.

El resto polimérico del conjugado polímero de la invención está conjugado al polipéptido de HMGB1 o variante polipeptídica mediante un enlace químico covalente, a fin de proporcionar un conjugado estable.

Los sitios de conjugación preferidos en el resto de la Caja A de HMGB1 se seleccionan de un resto de lisina, cisteína, histidina, arginina, tirosina, serina, treonina, aspartato y glutamato, o del grupo amino N-terminal del resto proteico. El conjugado polímero de la presente invención puede ser un conjugado mono-, di-y multipegilado. Preferiblemente, los conjugados polímeros de la invención están monopegilados.

El resto polímero está habitualmente enlazado de forma covalente al resto de la Caja A de HMGB1 a través de un grupo enlazador. En particular, en el contexto de la presente invención, el término grupo enlazador significa un grupo que se obtiene mediante la reacción química entre el resto polipeptídico y el resto polimérico. El grupo enlazador puede ser cualquier resto conocido por los expertos en la técnica de conjugación de polímeros, obtenido mediante la reacción del grupo activo en el resto de aminoácido del resto de la Caja A de HMGB1 y el polímero o el polímero activado por un grupo reactivo. Los grupos enlazadores ejemplares incluyen sin limitación grupos alquileno, amina, amida, carbamato, carboxilato, carbonilo, éster, éter, tioéter y disulfuro. Preferiblemente, el grupo enlazador es un enlace de amina, que se obtiene mediante la reacción del resto de aminoácido N-terminal con el resto polimérico activado con un grupo reactivo aldehídico y la reducción subsiguiente.

Además, el grupo enlazador puede contener opcionalmente uno o más grupos espaciadores. En el contexto de la presente invención, un grupo espaciador se define como un grupo bifuncional que tiene en ambos términos un grupo terminal funcional reactivo. Con el un grupo terminal reactivo, el espaciador reacciona con el resto polimérico o con el grupo reactivo en el resto polimérico. Con el otro grupo funcional en el otro término, el grupo espaciador se une al grupo funcional en el resto de aminoácido del resto de la Caja A de HMGB1. Los grupos espaciadores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de grupos espaciadores incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas hetero-, bifuncionales o polímero. Por ejemplo, el grupo espaciador se puede representar mediante grupos alquilo de C6-C12 bifuncionales o grupos alquilo heterobifuncionales que contienen de 1-3 heteroátomos seleccionados de N, S y O, o una cadena de PEG bifuncional corta intermedia.

La unión covalente del polímero al resto de la Caja A de HMGB1 para obtener el conjugado polímero de la invención se puede lograr mediante técnicas de síntesis química conocidas. Por ejemplo, en una realización ejemplar de la presente invención, la conjugación polimérica se puede lograr haciendo reaccionar un polímero de Nhidroxisuccinimida (por ejemplo NHS-PEG) con los grupos amina libres en los restos de aminoácidos, preferiblemente en los restos de lisina, o en el aminoácido N-terminal del polipéptido de la Caja A de HMGB1. Como alternativa, la conjugación polimérica se logra mediante reacción de un PEG-aldehído al término N del polipéptido mediante aminación reductora. Además, los conjugados polímeros se pueden obtener también haciendo reaccionar una PEG-maleimida a un resto de Cys del polipéptido de la Caja A de HMGB1 o variante polipeptídica.

En el contexto de la presente invención, la expresión “resto de la Caja A de HMGB1” indica, dentro del compuesto del conjugado polímero, el resto polipeptídico. Por tanto, esta expresión se refiere a la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje y a sus fragmentos biológicamente activos, así como a variantes polipeptídicas de la Caja A de HMGB1 y de sus fragmentos biológicamente activos.

En el contexto de la presente invención, cuando se haga referencia a la expresión “Caja A de HMGB1 o secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1”, se refiere tanto a la Caja A de HMGB1 humana como no humana. En una realización preferida de la presente invención, el resto de la Caja A de HMGB1 deriva del tipo salvaje de la proteína de la Caja A de HMGB1 humana, y del tipo salvaje de la proteína de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia.

“Fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1”, como se usa aquí, quiere decir que engloba partes de la proteína de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje conocida, para las cuales todavía es observable al menos una de las actividades biológicas de la proteína madura correspondiente cuando se estén usando ensayos conocidos. Preferiblemente, un fragmento de la proteína madura se considera como biológicamente activo si se puede determinar la actividad antagonista con respecto a la actividad proinflamatoria de la Caja B de HMGB1 y la proteína HMGB1 como un todo. Los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 nativa son fragmentos de al menos 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 aminoácidos. Los fragmentos biológicamente activos preferidos de la Caja A de HMGB1 nativa usados en el contexto de la presente invención comprenden fragmentos de al menos 77 o de al menos 54 aminoácidos, respectivamente.

El término “mutación”, como se usa en el contexto de la presente invención, se puede entender como sustitución, supresión y/o adición de un aminoácido individual en la secuencia diana. Preferiblemente, la mutación de la secuencia diana en la presente invención es una sustitución. La sustitución puede ocurrir con diferentes aminoácidos codificados genéticamente o mediante aminoácidos no codificados genéticamente. Los ejemplos de aminoácidos no codificados genéticamente son homocisteína, hidroxiprolina, ornitina, hidroxilisina, citrulina, carnitina, etc.

En una realización más preferida de la presente invención, las variantes polipeptídicas de la Caja A de HMGB1 o de un fragmento biológicamente activo de la misma se obtienen usando un proceso de evolución dirigida, cuya tecnología se describe ampliamente en el documento WO 2004/022593 y en varias solicitudes de patentes adicionales (PCT/FR00/03503 PCT/FR01/01366, US 10/022.249, US 10/022.390, US 10/375.192, US 60/409.898, US 60/457.135, US 60/410.258 y US 60/410.263), todos a nombre de Nautilus Biotech S.A. (Paris, Francia).

Las variantes polipeptídicas de la presente invención obtenidas usando tecnología de evolución dirigida son proteínas mutantes que difieren de la secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje por la mutación de uno o más aminoácidos individuales. En una realización muy preferida de la presente invención, sólo se produce la sustitución de un aminoácido en la secuencia de la proteína nativa. Sin embargo, también está englobado por el objeto de la presente invención el hecho de que la proteína nativa se puede optimizar adicionalmente por sustitución de una pluralidad, por ejemplo dos o más, de sustituciones de aminoácidos. Por lo tanto, las variantes polipeptídicas modificadas pueden diferir de la secuencia de la proteína de tipo salvaje por sustituciones de aminoácidos en 1-10, preferiblemente 2, 3, 4, 5 y 6 posiciones diana de aminoácidos diferentes.

En particular, las variantes polipeptídicas muy preferidas de la Caja A de HMGB1 o de un fragmento biológicamente activo de la misma usadas como resto de la Caja A de HMGB1 de los conjugados polímeros de la invención son las descritas en la solicitud WO 2006/024547.

En consecuencia, en una realización preferida de la invención, el resto de la Caja A de HMGB1 del conjugado polímero deriva partiendo de la Caja A de HMGB1 humana. En particular, un grupo de variantes polipeptídicas deriva de mutaciones individuales introducidas en la secuencia de aminoácidos de longitud completa (84 aminoácidos) de la Caja A de HMGB1 humana (SEC ID NO: 1) (Fig. 1a). Estas variantes polipeptídicas preferidas se definen en las secuencias SEC ID NOS: 2-116 (Fig. 1b).

Otras variantes polipeptídicas preferidas se obtienen partiendo de fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 humana de 77 aminoácidos (SEC ID NO: 117) (Fig. 2a) y 54 aminoácidos (SEC ID NO: 223) (Fig. 3a), respectivamente. Las variantes polipeptídicas de la Caja A del fragmento de HMGB1 humano de 77 aminoácidos se definen en las secuencias SEC ID NOS: 118 a 222 (Fig. 2b). Las variantes polipeptídicas de la Caja A del fragmento de HMGB1 humano de 54 aminoácidos se definen en las secuencias SEC ID NOS: 224 a 300 (Fig. 3b).

En una realización preferida adicional de la invención, el resto de la Caja A de HMGB1 del conjugado polímero deriva partiendo de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia. En particular, un grupo de variantes polipeptídicas deriva de mutaciones individuales introducidas en la secuencia de aminoácidos de longitud completa (84 aminoácidos) de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia (SEC ID NO: 301) (Fig. 4a). Estas variantes polipeptídicas se identifican en las secuencias SEC ID NOS: 302 a 418 (Fig. 4b). Otras variantes polipeptídicas preferidas se generan partiendo de los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia de 77 aminoácidos (SEC ID NO: 419) (Fig. 5a) y 54 aminoácidos (SEC ID NO: 529) (Fig. 6a), respectivamente. Las variantes polipeptídicas de la Caja A del fragmento de HMGB1 de 77 aminoácidos se definen en las secuencias SEC ID NOS: 420 a 528 (Fig. 5b). Las variantes polipeptídicas de la Caja A del fragmento de HMGB1 de Anopheles gambia (XP_311154) de 54 aminoácidos se definen en las secuencias SEC ID NOS: 530 a 610 (Fig. 6b).

A fin de identificar las variantes polipeptídicas más preferidas de la Caja A de HMGB1 usadas como resto de la Caja A de HMGB1 de los conjugados polímeros de la invención, se han realizado estudios para determinar las variantes polipeptídicas que muestran tanto una actividad similar o incluso mejorada como una resistencia incrementada a proteasas en comparación con la proteína de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje. Para este fin, se determinó la actividad de variantes polipeptídicas de la Caja A de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO: 1 inhibiendo la migración de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 en ensayos de quimiotaxia, en comparación con la actividad antagonista del propio tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana (Ejemplo 1 y Figuras 7.1 a 7.9). Además, para esas variantes polipeptídicas, que muestran una actividad antagonista similar o incluso mayor que la proteína de la Caja A de HMGB1 nativa de SEC ID NO: 1, se determinó la resistencia in vitro a la digestión por proteasas mediante incubación de cada una de estas variantes polipeptídicas con una mezcla de tripsina, -quimiotripsina, endoproteinasa Asp-N y endoproteinasa Glu-C (Sigma). Este ensayo de resistencia a proteasas se describe en el Ejemplo 2, y los resultados del perfil de resistencia a proteasas de dichas variantes en comparación con la Caja A de HMGB1 nativa se muestran en las Figuras 9.1 a 9.67.

A partir de los resultados se puede suponer que las variantes polipeptídicas preferidas de la Caja A de HMGB1 útiles como resto de la Caja A de HMGB1 del conjugado polímero de la presente invención son aquellas variantes que muestran una actividad antagonista similar o superior junto con una resistencia incrementada a proteasas. En particular, las variantes polipeptídicas preferidas son los polipéptidos de SEC ID NOS: 33, 35, 37-39, 42-45, 47-49, 52, 55, 57, 59, 62, 64, 67, 69 y 104. Entre estas variantes polipeptídicas preferidas, las variantes más preferidas son las definidas en las SEC ID NOS: 45, 49, 52, 55, 59, 64 y 67. Estas variantes polipeptídicas muy preferidas muestran un perfil de resistencia a proteinasas enormemente mejorado en comparación con la Caja A de HMGB1 humana de tipo salvaje de SEC ID NO: 1 (véanse los resultados del Ejemplo 2).

Se observa que los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos que aparecen aquí se identifican según sus abreviaturas de código de una letra conocidas. Se debería observar además que todas las secuencias de los restos de aminoácidos representadas aquí por su código abreviado de una letra tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del término amino al término carboxilo.

En la presente invención, se encontró sorprendentemente que los conjugados polímeros descritos anteriormente muestran un comportamiento farmacocinético y toxicológico mejorado, conduciendo a una biodisponibilidad mejorada en comparación con el resto polipeptídico de la Caja A de HMGB1 no conjugado. Un efecto ventajoso particular de la conjugación polimérica de los polipéptidos de la Caja A de HMGB1 y sus variantes, y en particular de la pegilación de estos polipéptidos, en comparación con la forma no conjugada, es el incremento del volumen hidrodinámico de las proteínas. Esto conduce a una mejora significativa e inesperada de las propiedades farmacocinéticas de los compuestos conjugados, debido a que se evita el aclaramiento renal, es decir, la reducción de la filtración glomerular.

Además, los conjugados polímeros de la invención presentan una resistencia incrementada a la actividad proteolítica de proteasas y/o peptidasas, en particular presentan una resistencia incrementada a la actividad proteolítica de proteasas y/o peptidasas humanas, en particular de las proteasas séricas humanas y/o proteasas o peptidasas gastrointestinales humanas.

En particular, la resistencia a proteolisis es al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% o mayor en comparación con la Caja A de HMGB1 no conjugada. La resistencia a proteasas se midió a diferentes puntos de tiempo (entre 5 minutos y 8 horas) a 25ºC tras la incubación de 20 g de tipo salvaje de la Caja A o variantes con una mezcla de proteasas a 1% p/p de proteínas totales. La mezcla de las proteasas se preparó de forma reciente en cada ensayo a partir de disoluciones madre de endoproteinasa Glu-C (SIGMA) 200 g/ml; tripsina (SIGMA) 400 g/ml y -quimiotripsina (SIGMA) 400 g/ml. Tras la incubación con las proteasas, la reacción se detuvo añadiendo 10 l de disolución anti-proteasas (Roche), y las muestras se almacenaron a -20ºC para el ensayo de actividad biológica.

Como consecuencia del aumento de estabilidad debido a la mayor resistencia a la actividad de proteasas, los conjugados polímeros de la presente invención también presentan una semivida más prolongada en fluidos corporales en comparación con la Caja A de HMGB1 no conjugada. En particular, la semivida en suero y/o en sangre aumenta, con lo que se observa un incremento de al menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos

o incluso más, en comparación con la Caja A de HMGB1 no conjugada.

Debido al incremento del volumen hidrodinámico de las proteínas, y también debido a una mayor resistencia a la proteolisis y, de este modo, a la mayor estabilidad, los conjugados polímeros de la invención también muestran propiedades terapéuticas y biológicas y actividad mejoradas. De hecho, muestran un perfil farmacocinético y farmacológico más favorable que la proteína de la Caja A de HMGB1 no conjugada y variantes proteicas.

Por lo tanto, la invención se refiere al uso de los conjugados polímeros mencionados anteriormente de la Caja A de HMGB1 como agente activo en un medicamento.

Aún un aspecto adicional de la invención es por tanto el uso de los conjugados polímeros de la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de patologías asociadas con HMGB1 extracelular

o patologías asociadas con las proteínas homólogas a HMGB1. En particular, las patologías asociadas con HMGB1 son patologías que están mediadas por una cascada de múltiples citocinas inflamatorias.

El amplio espectro de afecciones patológicas inducidas por la quimiocina de HMGB1 y por la cascada de citocinas inflamatorias inducida por HMGB1 se agrupan en las categorías siguientes: enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, lesión por reperfusión después de trasplante de órganos, afecciones cardiovasculares, enfermedad obstétrica y ginecológica, enfermedad infecciosa (vírica y bacteriana), enfermedad alérgica y atópica, patologías de tumores sólidos y no sólidos, enfermedades de rechazo de trasplantes, enfermedades congénitas, enfermedades dermatológicas, enfermedades neurológicas, caquexia, enfermedades renales, condiciones de intoxicación iatrogénicas, enfermedades metabólicas e idiopáticas.

Las patologías asociadas a HMGB1 según la presente invención son preferiblemente afecciones patológicas mediadas por activación de la cascada de citocinas inflamatorias. Los ejemplos no limitantes de afecciones que se pueden tratar de forma útil usando la presente invención incluyen el amplio espectro de afecciones patológicas inducidas por la quimiocina de HMGB1 y por la cascada de citocinas inflamatorias inducida por HMGB1 agrupadas en las categorías siguientes: restenosis y otras enfermedades cardiovasculares, lesión por reperfusión, enfermedades inflamatorias tales como enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, por ejemplo septicemia, síndrome disneico del adulto, etc., enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide y osteoartritis, enfermedades obstétricas y ginecológicas, enfermedades infecciosas, enfermedades atópicas, tales como asma, eccema, etc., patologías tumorales, por ejemplo enfermedades de tumores sólidos y no sólidos asociadas con trasplantes de órganos o tejidos, tales como lesiones por reperfusión tras transplante de órganos, rechazo de órganos y enfermedad del injerto contra el hospedante, enfermedades congénitas, enfermedades dermatológicas tales como soriasis o alopecia, enfermedades neurológicas, enfermedades oftálmicas, enfermedades renales, metabólicas o idiopáticas y estados de intoxicación, por ejemplo toxicidad iatrogénica y enfermedad de BehÇet, en las que las enfermedades anteriores están causadas por, asociadas con y/o acompañadas por la liberación de la proteína HMGB1.

En particular, las patologías pertenecientes a enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias incluyen artritis reumatoide/artropatías seronegativas, osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, infarto intestinal, lupus eritematoso sistémico, iritis/uveítis, neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, orquitis/ procedimientos de inversión de la vasectomía, esclerosis sistémica y esclerodermia. La respuesta inflamatoria sistémica incluye síndrome septicémico (incluyendo septicemia gram-positiva, septicemia gram-negativa, septicemia negativa de cultivo, septicemia fúngica, fiebre neutropénica, urosepticemia, conjuntivitis séptica), meningococcemia, hemorragia traumática, zumbidos, exposición a radiaciones ionizantes, prostatitis aguda y crónica, pancreatitis aguda y crónica, apendicitis, úlceras péptica, gástrica y duodenal, peritonitis, colitis ulcerosa, seudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulitis, acalasia, colangitis, colecistitis, enteritis, síndrome disneico del adulto (ARDS). La lesión por reperfusión incluye síndrome post-bombeo y lesión por isquemia-reperfusión. La enfermedad cardiovascular incluye síndrome de aturdimiento cardíaco, infarto de miocardio e isquemia, aterosclerosis, tromboflebitis, endocarditis, pericarditis, insuficiencia cardíaca congestiva y restenosis. Las enfermedades obstétricas y ginecológicas incluyen parto prematuro, endometriosis, aborto, vaginitis e infertilidad. Las enfermedades infecciosas incluyen infección por HIV/neuropatía por HIV, meningitis, infección por virus de hepatitis B y C, infección por herpes simple, artritis séptica, peritonitis, E. coli 0157:H7, neumonía, epiglotitis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombolítica trombocitopénica, candidosis, filariosis, amebiosis, malaria, fiebre hemorrágica del Dengue, leishmaniosis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, tuberculosis por micobacteria, Micobacterium avium intracellulare, neumonía por Pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionella, enfermedad de Lyme, gripe A, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, síndrome hemiafagocítico asociado a virus, encefalitis viral/meningitis aséptica. La enfermedad alérgica y atópica incluye asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad del complejo inmune, fiebre del heno, rinitis alérgica, eccema, dermatitis alérgica de contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad. Los cánceres (patologías de tumores sólidos y líquidos) incluyen ALL, AML, CML, CLL, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna y síndrome paraneoplásico/hipercalcemia del cáncer. Las enfermedades de trasplante incluyen rechazos de trasplante de órganos y enfermedad de injerto contra hospedante. Las enfermedades congénitas incluyen fibrosis cística, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar y anemia de células falciformes. Enfermedades dermatológicas incluyen psoriasis, artritis psoriásica y alopecia. Enfermedades neurológicas incluyen enfermedades neurodegenerativas (esclerosis múltiple, migraña, cefalea, patologías asociadas a amiloide, enfermedades priónicas/enfermedad de Creutzfeld-Jacob, enfermedades de Alzheimer y de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis emilateral amiotrófica) y neuropatías periféricas, migraña, cefalea. Enfermedades renales incluyen síndrome nefrótico, hemodiálisis y uremia. Los estados de intoxicación iatrogénica incluyen terapia con OKT3, terapia anti-CD3, terapia con citocinas, quimioterapia, radioterapia e intoxicación crónica por salicilatos. Enfermedades metabólicas e idiopáticas incluyen enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia en antitripsina alfa-1, diabetes y complicaciones de la diabetes, pérdida de peso, anorexia, caquexia, obesidad, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal y cirrosis biliar primaria. Enfermedades oftalmológicas incluyen glaucoma, retinopatías y ojo seco. Una variedad de otras patologías incluyen: síndrome de disfunción orgánica múltiple, distrofia muscular, meningitis séptica, aterosclerosis, epiglotitis, enfermedad de Whipple, asma, alergia, rinitis alérgica, necrosis orgánica, fiebre, septicemia, choque endotóxico, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granulomatosis, sarcoidosis, aborto séptico, uretritis, enfisema, rinitis, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, disfunciones de la barrera epitelial, silicovolcanoconiosis neumoultramicroscópica, pleuresía, sinusitis, gripe, infección por virus respiratorio sincitial, bacteremia diseminada, quiste hidatídico, dermatomiositis, quemaduras, eritema solar, urticaria, verrugas, pápulas, vasculitis, angiítis, miocarditis, arteritis, periarteritis nudosa, fiebre reumática, celiaquía, encefalitis, embolia cerebral, síndrome de Guillaume-Barre, neuritis, neuralgia, complicaciones iatrogénicas/lesiones del nervio periférico, lesión de la médula espinal, parálisis, uveítis, artritis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, sinovitis, miastenia grave, síndrome de Goodpasture, síndrome de BehÇet, espondilitis anquilosante, enfermedad de Barger, síndrome de Retier, dermatitis bulosa (penfigoide buloso), pénfigo y pénfigo vulgar y alopecia.

En una realización preferida adicional, los compuestos polímeros de la invención se usan como agentes activos para la prevención, alivio y/o tratamiento de patologías relacionadas con RAGE. Las patologías relacionadas con RAGE se definen como estados patológicos asociados con una expresión incrementada de RAGE.

RAGE (receptor para productos finales de la glucosilación avanzada) es un miembro de múltiples ligandos de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de la superficie celular. Está compuesto de tres regiones del tipo de las inmunoglobulinas (un dominio inmunoglobulínico de tipo V, seguido de dos dominios inmunoglobulínicos de tipo C), un dominio transmembránico, y una cola citosólica corta muy cargada, que es esencial para la posterior señalización dependiente de RAGE. RAGE se identificó por primera vez en 1992 como diana de unión para las AGE, proteínas oxidadas y glucosiladas no enzimáticamente que se acumulan en el tejido vascular en el envejecimiento, y a gran velocidad en la diabetes. RAGE se expresa en un amplio conjunto de células, incluyendo células endoteliales, células del músculo liso, fagocitos mononucleares y neuronas. Aunque está presente en grandes cantidades durante el desarrollo, especialmente en el sistema nervioso central, sus niveles disminuyen durante la madurez.

Como se da a conocer anteriormente, RAGE fue el primer receptor identificado para HMGB1 extracelular. La unión a HMGB1 sobre la superficie celular induce el aumento transcripcional de RAGE. Los ejemplos de patologías relacionadas con RAGE son diabetes y trastornos asociados con diabetes, tales como vasculopatía, neuropatía y retinopatía diabéticas y otros trastornos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y reacciones inmunitarias/inflamatorias de las paredes de los vasos. Un ejemplo muy preferido de patologías relacionadas con RAGE en este contexto es la diabetes de tipo I y/o de tipo II.

En un aspecto adicional de la invención, el uso de los conjugados polímeros de la Caja A de HMGB1 descritos anteriormente se hace en combinación con un agente activo adicional.

El agente adicional es preferiblemente un agente capaz de inhibir un mediador precoz de la cascada de citocinas inflamatorias. Preferiblemente, este agente adicional es un antagonista o inhibidor de una citocina seleccionada del grupo constituido por TNF, IL-1, IL-1, IL-Ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, IFN-, MIP-1, MIF-1, MIP-2, MIF y PAF.

El agente adicional usado en combinación con el conjugado polímero puede ser también un inhibidor de RAGE, v.g. un anticuerpo dirigido contra RAGE, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de RAGE, v.g. una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia con ARN, o una molécula sintética pequeña antagonista de la interacción de HMGB1 con RAGE, preferiblemente de la interacción de la forma no acetilada y/o acetilada de HMGB1 con RAGE, o RAGE soluble (sRAGE). El anticuerpo dirigido contra RAGE es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente un anticuerpo quimérico o humanizado o un anticuerpo recombinante, tal como un anticuerpo monocatenario o un fragmento de unión a antígeno de tal anticuerpo. El análogo de RAGE soluble puede estar presente opcionalmente como una proteína de fusión, v.g. con el dominio Fc de un anticuerpo humano. El antagonista molecular sintético pequeño de la interacción de HMGB1 con RAGE tiene preferiblemente un peso molecular inferior a 1000 Dalton. El antagonista molecular sintético pequeño inhibe preferiblemente la interacción de RAGE con la forma no acetilada o/y con la forma acetilada de HMGB1, y con la forma no acetilada o/y con la forma acetilada de proteínas homólogas a HMGB1, en particular HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L o/y SP100-HMG.

El agente adicional usado en combinación con el conjugado polímero puede ser también un inhibidor de la interacción de un receptor de tipo Toll (TLR), v.g. de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 o/y TLR9, con HMGB1, inhibidor el cual es preferiblemente un anticuerpo monoclonal o policlonal, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, v.g. una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia con ARN,

o una molécula sintética que tiene preferiblemente un tamaño menor que 1000 Dalton. El inhibidor puede ser un inhibidor conocido de un receptor de tipo Toll, en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 o/y TLR9. El inhibidor inhibe preferiblemente la interacción del receptor de tipo Toll con la forma no acetilada o/y la forma acetilada de HMGB1. En todavía otra realización, el agente adicional es el dominio semejante a lectina N-terminal funcional (D1) de trombomodulina. El dominio D1 de trombomodulina es capaz de interceptar la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1 liberada y de proteínas homólogas a HMGB1 liberadas, en particular HMGB2, HMGB3, HMG1L10, HMG-4L o/y SP100-HMG, evitando de este modo su interacción con RAGE y receptores de tipo Toll. El dominio D1 de trombomodulina puede ser nativo o puede estar mutado, a fin de hacerlo resistente a proteasas.

El agente adicional puede ser también una molécula sintética de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico bicatenario con una estructura con forma plegada, particularmente un ADN plegado bicatenario, un PNA o una quimera o híbrido de ADN/PNA o una estructura de ADN bicatenario cruciforme, PNA o quimera o híbrido deADN/PNA, capaz de unirse a la proteína MHGB1. Ácidos nucleicos y moléculas de análogos de ácido nucleico preferidos se describen en la solicitud de patente internacional de los mismos propietarios y pendiente también de tramitación nº WO2006/002971 presentada el 4 de julio de 2005 (que reivindica la prioridad de la solicitud provisional de los EE.UU. nº 60/584.678 presentada el 2 de julio de 2004). El ácido nucleico sintético bicatenario o molécula de análogo de ácido nucleico con una estructura con forma plegada es preferiblemente capaz de unirse a la forma no acetilada o/y a la forma acetilada de HMGB1 y a la forma no acetilada o/y a la forma acetilada de proteínas homólogas a HMGB1, en particular HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L o/y SP100-HMG.

En todavía otra realización, el agente adicional usado en combinación con el conjugado polímero es K-252a o/y una sal o derivado del mismo, o un conjugado polímero de K-252a o/y de un derivado del mismo. El uso de K-252a o conjugados polímeros de K-252a y sus derivados se describe en una solicitud de patente internacional de los mismos propietarios y pendiente también de tramitación WO2007/02299, presentada el 25 de agosto de 2005.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de al menos uno de los conjugados polímeros del polipéptido o variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1 o un fragmento biológicamente activo del mismo, como ingrediente activo para el tratamiento de patologías asociadas a HMGB1, y vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica de la presente invención es preferiblemente adecuada para el tratamiento de patologías asociadas con la forma no acetilada o/y la forma acetilada de HMGB1 y/o de proteínas homólogas a HMGB1. En una realización preferida adicional, la composición farmacéutica de la presente invención que comprende el al menos un conjugado polímero también comprende un agente adicional como se define anteriormente. La composición farmacéutica de la presente invención se puede usar para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas.

La formulación, la ruta de administración y la dosificación exactas se pueden seleccionar por el médico individual teniendo en cuenta las condiciones del paciente. La administración se puede realizar en una sola dosis o en dosis repetidas a intervalos. La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente a fin de proporcionar el efecto terapéutico que dé como resultado una mejora de los síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La cantidad real de composición administrada dependerá, por supuesto, del individuo que se esté tratando, del peso del individuo, de la gravedad de la aflicción, del modo de administración y del criterio del médico que prescribe el tratamiento. Una dosis diaria adecuada estará comprendida entre 0,001 y 10 mg/kg, particularmente entre 0,1 y 5 mg/kg.

La administración se puede llevar a cabo por métodos conocidos, v.g. por inyección, en particular por inyección intravenosa, intramuscular, transmucosal, subcutánea o intraperitoneal, y/o por aplicación oral, tópica, nasal, inhalación, aerosol y/o rectal, etc. La administración puede ser local o sistémica.

Adicionalmente, los conjugados polímeros del resto de la Caja A de HMGB1 objeto de esta invención pueden estar inmovilizados reversiblemente y/o adsorbidos sobre la superficie y/o dentro de dispositivos médicos o sistemas de liberación/transporte de fármacos (microesferas). Los dispositivos médicos y microesferas pueden estar cargados reversiblemente con los conjugados polímeros de esta invención, a través de su unión, impregnación, y/o adsorción sobre la superficie del dispositivo médico o de la microesfera, o sobre una capa que reviste su superficie. Cuando el dispositivo médico o la microesfera entra en contacto con fluidos corporales, los conjugados polímeros inmovilizados reversiblemente se liberan. Por lo tanto, el dispositivo médico y la microesfera actúan como herramientas de liberación de fármaco que eluyen la molécula objeto de esta invención de tal manera que su cinética de liberación se puede controlar, asegurando una liberación controlada o sostenida, según lo requiera el tratamiento. Los métodos para revestir/impregnar los dispositivos médicos y para cargar las microesferas son bien conocidas por las personas expertas en la técnica.

De este modo, un aspecto adicional de la presente invención es el uso de los conjugados polímeros de la Caja A de HMGB1, en el que las moléculas conjugadas están inmovilizadas reversiblemente sobre la superficie de dispositivos médicos o de microesferas, o están adsorbidas sobre ella. Preferiblemente, estos instrumentos médicos son herramientas quirúrgicas, implantes, catéteres o endoprótesis vasculares, v.g. endoprótesis vasculares para angioplastia y, en particular, endoprótesis vasculares que eluyen el fármaco medicado.

Otro aspecto de la invención se refiere a un dispositivo médico revestido reversiblemente con al menos un conjugado polímero de la invención. Tal dispositivo se puede seleccionar de instrumentos quirúrgicos, implantes, catéteres o endoprótesis vasculares. Tal dispositivo puede ser útil para angioplastia.

La invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras:

Fig. 1a presenta la secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1 humana nativa formada por 84 restos de aminoácidos (SEC ID NO:1).

Fig. 1b muestra el tipo de sustituir aminoácidos en las posiciones diana respectivas seleccionadas para generar la variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1 humana de longitud completa. Además, en SEC ID NOS:2 a 116 se presentan las secuencias de aminoácidos específicas de la variante polipeptídica generada.

Fig. 2a presenta la secuencia de aminoácidos del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 humana formada por 77 restos de aminoácidos (SEC ID NO:117).

Fig. 2b muestra el tipo de sustituir aminoácidos en las posiciones diana respectivas seleccionadas para generar la variante polipeptídica del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 humana formada por 77 restos de aminoácidos. Además, en SEC ID NOS:118 a 222 se presentan las secuencias de aminoácidos específicas de la variante polipeptídica generada.

Fig. 3a presenta la secuencia de aminoácidos del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 humana formada por 54 restos de aminoácidos (SEC ID NO:223).

Fig. 3b muestra el tipo de sustituir aminoácidos en las posiciones diana respectivas seleccionadas para generar la variante polipeptídica del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 humana formada por 54 restos de aminoácidos. Además, en SEC ID NOS:224 a 300 se presentan las secuencias de aminoácidos específicas de la variante polipeptídica generada.

Fig. 4a presenta la secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia nativa formada por 84 restos de aminoácidos (SEC ID NO:301).

Fig. 4b muestra el tipo de sustituir aminoácidos en las posiciones diana respectivas seleccionadas para generar la variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia de longitud completa. Además, en SEC ID NOS:302 a 418 se presentan las secuencias de aminoácidos específicas de la variante polipeptídica generada.

Fig. 5a presenta la secuencia de aminoácidos del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia formada por 77 restos de aminoácidos (SEC ID NO:419).

Fig. 5b muestra el tipo de sustituir aminoácidos en las posiciones diana respectivas seleccionadas para generar la variante polipeptídica del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia formada por 77 restos de aminoácidos. Además, en SEC ID NOS:420 a 528 se presentan las secuencias de aminoácidos específicas de la variante polipeptídica generada.

Fig. 6a presenta la secuencia de aminoácidos del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia formada por 54 restos de aminoácidos (SEC ID NO:529).

Fig. 6b muestra el tipo de sustituir aminoácidos en las posiciones diana respectivas seleccionadas para generar la variante polipeptídica del fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia formada por 54 restos de aminoácidos. Además, en SEC ID NOS:530 a 610 se presentan las secuencias de aminoácidos específicas de la variante polipeptídica generada.

Las Figuras y Tablas 7.1 a 7.9 muestran los resultados del ensayo de quimiotaxia descrito en el Ejemplo 1 llevado a cabo sobre variantes polipeptídicas de la Caja A de HMGB1 de SEC ID NO:2 a SEC ID NO:116 usadas como resto de la Caja A de HMGB1 de los conjugados polímeros de la presente invención. En cada figura se ensayó la actividad de un conjunto de variantes polipeptídicas en la inhibición de la migración de células NIH/3T3 inducida por HMGB1, en comparación con la actividad del fragmento de longitud completa de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humana de SEC ID NO:1. Cada figura muestra una tabla que da los datos numéricos del análisis estadístico, y una gráfica de barras en columnas que muestra los resultados del ensayo de quimiotaxia.

La Figura 7.1 y la Tabla 7.1 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NO:2 a 15 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT501, CT568, CT569, CT570, CT571, CT502, CT572, CT503, CT573, CT504, CT574, CT575, CT576 y CT505, respectivamente).

La Figura 7.2 y la Tabla 7.2 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NOS:16-23 y 25-29 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT577, CT578, CT506, CT579, CT580, CT581, CT507, CT582, CT584, CT508, CT509, CT510 y CT585, respectivamente).

La Figura 7.3 y la Tabla 7.3 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NOS:30-35 y 37-43 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT511, CT512, CT513, CT514, CT586, CT515, CT516, CT517, CT518, CT519, CT520, CT521 y CT522, respectivamente).

La Figura 7.4 y la Tabla 7.4 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja

5 A de HMGB1 humana de SEC ID NOS:44-57 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT523, CT524, CT525, CT526, CT527, CT528, CT588, CT529, CT530, CT589, CT590, CT531, CT591 y CT532, respectivamente).

La Figura 7.5 y la Tabla 7.5 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NOS:58-67 y 69-71 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT592, CT533, CT593, CT534, CT535, CT536, CT537, CT594, CT538, CT539, CT540, CT541 y CT542, respectivamente).

La Figura 7.6 y la Tabla 7.6 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja

15 A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NOS:72-85 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT596, CT597, CT598, CT599, CT600, CT601, CT602, CT603, CT543, CT544, CT545, CT546, CT547 y CT604, respectivamente).

La Figura 7.7 y la Tabla 7.7 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NOS:86-99 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT548, CT549, CT605, CT606, CT607, CT608, CT609, CT610, CT550, CT551, CT611, CT552, CT553 y CT554, respectivamente).

La Figura 7.8 y la Tabla 7.8 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja

25 A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NOS:100-113 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT555, CT556, CT557, CT558, CT559, CT612, CT560, CT561, CT613, CT562, CT563, CT564, CT565 y CT566, respectivamente).

La Figura 7.9 y la Tabla 7.9 muestran la gráfica de barras y los datos estadísticos de los resultados del ensayo de migración quimiotáctica en la inhibición de células NIH/3T3 inducida por HMGB1 por el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO:1 (CT500) y variantes polipeptídicas de SEC ID NOS:114-116 (identificadas en la Tabla y Figura con el código CT567, CT614 y CT615, respectivamente).

La Fig. 8 muestra la imagen del gel de Tricina SDS-PAGE cargado con el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO: 1 (CT500) en diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas del ensayo de resistencia a proteasas descrito en el Ejemplo 2. La proteína del tipo salvaje de la Caja A ensayada para

35 determinar la resistencia a proteasas es un proteína marcada con His. Después de 5 minutos de digestión, CT500 muestra dos bandas principales: una que corresponde a la proteína original en la muestra, y la segunda que corresponde a la proteína de 84 aminoácidos sin el marcador de His del término N (indicada en la figura con una flecha). El perfil de esta segunda banda muestra resistencia a proteasas durante 30 minutos. Las bandas pequeñas presentes en este y otros geles de la Fig. 9.1 a Fig. 9.67 corresponden a fragmentos digeridos de la Caja A.

La Fig. 9.1 a Fig. 9.67 muestra la imagen del gel de Tricina SDS-PAGE cargado con las variantes polipeptídicas del resto de la Caja A de HMGB1 de los conjugados polímeros de la presente invención en diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas del ensayo de resistencia a proteasas descrito en el Ejemplo 2. Las variantes polipeptídicas de la Caja A ensayadas para determinar la resistencia a proteasas son proteínas

45 marcadas con His. Después de 5 minutos de digestión, la imagen del gel de SDS-PAGE de las variantes polipeptídicas muestra dos bandas principales: una que corresponde a la variante proteica original en la muestra, y la segunda que corresponde a la variante proteica de 84 aminoácidos de la Caja A sin el marcador de His del término N.

La Figura 9.1 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:2 (CT501) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.2 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:7 (CT502) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.3 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:9 (CT503) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.4 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:11 (CT504) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.5 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:15 (CT505) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.6 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:18 (CT506) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.7: gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:22 (CT507) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.8 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:26 (CT508) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.9 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:27 (CT509) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.10 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:28 (CT510) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.11 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:30 (CT511) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.12 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:31 (CT512) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.13 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:32 (CT513) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.14 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:33 (CT514) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.15 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:35 (CT515) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.16 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:37 (CT516) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.17 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:38 (CT517) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.18 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:39 (CT518) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.19 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:40 (CT519) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.20 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:41 (CT520) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.21 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:42 (CT521) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.22 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:43 (CT522) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.23 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:44 (CT523) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.24 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:45 (CT524) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.25 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:46 (CT525) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.26 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:47 (CT526) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.27 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:48 (CT527) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.28 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:49 (CT528) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.29 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:51 (CT529) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.30 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:52 (CT530) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.31 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:55 (CT531) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.32 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:57 (CT532) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.33 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:59 (CT533) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.34 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:61 (CT534) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.35 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:62 (CT535) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.36 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:63 (CT536) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.37 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:64 (CT537) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.38 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:66 (CT538) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.39 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:67 (CT539) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.40 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:69 (CT540) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.41 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:70 (CT541) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.42 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:71 (CT542) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.43 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:80 (CT543) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.44 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:81 (CT544) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.45 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:82 (CT545) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.46 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:83 (CT546) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.47 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:84 (CT547) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.48 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:86 (CT548) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.49 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:87 (CT549) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.50 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:94 (CT550) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.51 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:95 (CT551) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.52 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:97 (CT552) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.53 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:98 (CT553) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.54 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO:99 (CT554) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.55 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 100 (CT555) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.56 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 101 (CT556) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.57 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 102 (CT557) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.58 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 103 (CT558) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.59 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 104 (CT559) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.60 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 106 (CT560) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.61 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 107 (CT561) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas. ID NO:106 (CT560) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.61 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 107 (CT561) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.62 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 109 (CT562) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.63 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 110 (CT563) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.64 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 111 (CT564) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.65 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 112 (CT565) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.66 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 113 (CT566) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Figura 9.67 muestra el gel de Tricina SDS-PAGE de la variante polipeptídica de SEC ID NO: 19 (CT567) a diferentes puntos de tiempo tras la digestión con proteasas.

La Fig.10 muestra una tabla en la que se resumen los resultados del gel de Tricina SDS-PAGE. Una cruz indica la presencia en el gel de la banda correspondiente al fragmento proteico largo de 84 aminoácidos del tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 o de la variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1.

La Fig. 11 muestra la concentración plasmática media/tiempo después de una única administración subcutánea del tipo salvaje (WT) de la Caja A y de la variante número 64 (64) de la Caja A a una dosis de 1 mg/kg.

Representación de los datos: Media  SEM.

La Fig. 12 muestra la concentración plasmática media/tiempo después de una única administración subcutánea del tipo salvaje (WT) de la Caja A y de la variante número 64 (64) de la Caja A a una dosis de 1 mg/kg, y del tipo salvaje de la Caja A PEGilado (PEG-WT) y de la variante número 64 (PEG-64) de la Caja A PEGilada a una dosis de 5 mg/kg. Representación de los datos: Media  SEM.

EJEMPLOS

1. Ensayo de actividad in vitro: ensayo de migración de células NIH/3T3

El fin del presente estudio fue evaluar la actividad de cada una de las variantes polipeptídicas de la Caja A de HMGB1 como se definen en las SEC ID NOS: 2-116 y comparar su actividad con la del fragmento de longitud completa de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humano de SEC ID NO: 1 a fin de seleccionar todas las variantes con actividad similar o mejor que el tipo salvaje.

La actividad de la Caja A de HMGB1 se evalúa in vitro como inhibición de la migración de células NIH/3T3 inducida por HMGB1.

1.1 Materiales  Tipo salvaje y variantes de la Caja A de HMGB1 (Nautilus Biotech)  Células NIH/3T3 (ATCC n. CRL-1658)  Medio DMEM (GIBCO; número de catálogo. 31966-021)  Suero fetal bovino (GIBCO; número de catálogo 10270-106)  Penicilina-estreptomicina 10.000 U/ml (GIBCO; número de catálogo 15140-122)  L-glutamina 200 mM (GIBCO; número de catálogo 25030-024)  TrypLE Select (GIBCO; número de catálogo 12563-011)  Disolución salina tamponada con fosfato (NaCl 0,138 M, KCl 0,0027 M, fosfato 0,01 M, pH 7,4)  Filtros libres de PVP (tamaños de poros de 8 m; diámetro total 13 mm) (Neuro Probe; número de catálogo

PFA8)  Fibronectina humana (Roche; número de catálogo 1080938)  Blind Well Chemotaxis Chambers (Neuro Probe; número de catálogo BW25)  GIEMSA Stain Modified (Sigma; número de catálogo GS1 L)

1.2 Preparación de los filtros

Los filtros libres de PVP de membranas de policarbonato (tamaño de poros de 8 m, diámetro total de 13 mm) se prepararon alrededor de una hora antes de llevar a cabo el experimento revistiéndolos con 30 l/filtro de una disolución 50 g/ml de fibronectina dispensada en el lado opaco del filtro. La disolución madre de fibronectina se prepara diluyendo la fibronectina liofilizada en ddH2O hasta una concentración final de 1 mg/ml, y manteniendo la disolución alrededor de 1 hora a 37ºC para la disolución total. Esta disolución madre se puede almacenar a -20ºC.

Los filtros se dejan secar entonces bajo el flujo laminar de la campana (alrededor de una hora).

1.3 Preparación de las células

El día antes del experimento (aproximadamente 22-24 horas antes de llevar a cabo el experimento), las células NIH/3T3 se sembraron a 106 células/placa.

Cuando los filtros estuvieron listos para ser usados, las células se despegaron con tripsina, se contaron y se resuspendieron a 106 células/ml en medio de cultivo libre de suero.

1.4 Ensayo de quimiotaxia

En cada experimento de quimiotaxia, se ensayaron 14 variantes polipeptídicas diferentes del fragmento de longitud completa de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO: 1. Como control negativo, que representa la migración espontánea, se usó medio celular de crecimiento sin adición de suero (sin FBS).

Como control positivo se usó 1 nM de HMGB1. El tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 o las variantes polipeptídicas ensayadas 0,5/1 nM se añadieron a 1 mM de HMGB1 para inhibir la migración de células NIH/3T3 inducida por HMGB1.

El control negativo (sin FBS) y el control positivo (1 nM de HMGB1) se ensayaron por triplicado en cada experimento.

La actividad del tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 (SEC ID NO: 1) inhibiendo la migración celular inducida por HMGB1 se ensayó por triplicado en cada experimento.

Cada una de las variantes polipeptídicas de la Caja A de HMGB1 (SEC ID NOS: 2 a 116) se ensayó por duplicado.

Se usaron cámaras de quimiotaxia Blind Well Chemotaxis Chambers. El pocillo inferior seco, limpio, de cada cámara se llenó con 50 l de DMEM sin FBS añadido con el agente quimiotáctico apropiado y los inhibidores. Se debería formar un menisco ligeramente positivo cuando el pocillo está lleno; esto ayuda a evitar que burbujas de aire queden atrapadas cuando se aplica el filtro. Con un pequeño fórceps, el filtro se coloca sobre el pocillo lleno (la cara que mira hacia arriba se trata con fibronectina), teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire y de no tocar el filtro con los dedos. El retenedor del filtro se atornilla manualmente. Se pipetea una suspensión celular (50000 células/50 l) en el pocillo superior, y se añaden 150 l de medio libre de suero para llenar el pocillo superior de la cámara. La cámara llena se incuba durante 3 horas (37ºC, 5% de CO2) para permitir la migración celular. Tras la incubación, el fluido se elimina del filtro. El retenedor se desatornilla y se sumerge en agua destilada fría. El filtro se levanta con un fórceps, se coloca sobre una superficie limpia (parafina sólida) (con las células que han migrado colocadas en la cara superior) y se fija con una aguja (colocada en el área fronteriza).

1.5 Tinción con GIEMSA de las células migradas

Los filtros se fijaron con etanol una vez, y después se lavaron tres veces en agua corriente. Se preparó una disolución de trabajo de GIEMSA Stain Modified que se diluyó 1:10 en ddH2O justo antes del uso. Tras lavar los filtros, se añadió la tinción y se dejó incubar durante 20 minutos. El lavado de la tinción se llevó a cabo bajo agua corriente. Los filtros se colocaron entonces sobre portaobjetos, con las células migradas colocadas en la cara inferior, y el lado con las células que no migraron se limpió suavemente con un tarugo de algodón húmedo (se limpia dos veces, usando dos tarugos o ambos extremos de un tarugo con punta doble), teniendo cuidado de no mover el filtro. Después de la limpieza, se colocó un cubreobjetos sobre el filtro y las células se contaron en un microscopio a 40X en 10 campos aleatorios/filtro.

1.6 Representación de datos y análisis estadístico

En las tablas y gráficas de barras mostradas en la Figura y Tabla 7.1 a la Figura y Tabla 7.9 se dan a conocer los resultados del ensayo de migración de NIH/3T3 llevado a cabo.

Los datos se representan en columnas de barras como MEDIA ± 95% de intervalo de confianza (CI).

El ANOVA de una vía, seguido del post-test de Dunnett (datos de la columna de control: muestra de HMGB1 1 nM + muestra de WT de la Caja A de HMGB1), es el análisis estadístico llevado a cabo.

Cuando se evalúan los datos de los resultados, los datos de las variantes de la Caja A de HMGB1 que tienen un valor p de post-test < 0,05 se consideran significativamente diferentes del tipo salvaje de la Caja A de HMGB1. Si la media de la variante polipeptídica de la Caja A es mayor que la del tipo salvaje de la Caja A, la columna se colorea en rojo en la gráfica del experimento mostrada en las Figuras 7.1 a 7.9. Esas columnas en rojo representan variantes polipeptídicas de la Caja A de HMGB1 que muestran una actividad menor que la del tipo salvaje a la hora de inhibir la migración celular inducida por HMGB1.

Si la media de la variante polipeptídica resulta menor que la de la Caja A de tipo salvaje, entonces la columna se colorea en azul claro en la gráfica del experimento mostrada en las Figuras 7.1 a 7.9. Esas variantes representan variantes de la Caja A de HMGB1 que muestran una actividad mayor que la del tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 a la hora de inhibir la migración celular inducida por HMGB1.

Los datos de las variantes de la Caja A de HMGB1 que tienen un valor p de post-test > 0,05 no se consideran significativamente diferentes del tipo salvaje de la Caja A de HMGB1. Las columnas de barras de esas variantes están coloreadas en verde. Esas variantes representan variantes de la Caja A de HMGB1 que muestran la misma actividad que el tipo salvaje a la hora de inhibir la migración celular inducida por HMGB1.

1.7 Resultados

La actividad de las variantes polipeptídicas del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NOS: 2 a 116 se evaluó en comparación con el tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de SEC ID NO: 1 como inhibición de la migración celular inducida por HMGB1, a fin de determinar las variantes polipeptídicas preferidas útiles como resto de la Caja A de HMGB1 del conjugado polímero preferido de la presente invención.

Los resultados de los ensayos de quimiotaxia revelaron (Figuras 7.1 a 7.9) que, para 26 variantes polipeptídicas, la

5 mutación según la presente invención podría conducir a una mayor actividad en la inhibición de la migración celular en comparación con la actividad de la Caja A de HMGB1 humana de tipo salvaje. En particular, se mostró una mayor actividad en la inhibición de la migración celular para las variantes polipeptídicas de SEC ID NOS: 30-32, 35, 38, 4041, 43, 48, 51, 57, 63-64, 69, 70, 94, 95, 100, 103-104, 106-107, 109-111 y 113.

Además, los resultados de los ensayos de quimiotaxia revelaron (Figuras 7.1 a 7.9) que 41 variantes polipeptídicas

10 no mostraron cambios en su actividad a la hora de inhibir la migración celular inducida por HMGB1 en comparación con la actividad del polipéptido de tipo salvaje de la Caja A. En particular, este es el caso para las variantes polipeptídicas de SEC ID NOS: 2, 7, 9, 11, 15, 18, 22, 26-28, 33, 37, 39, 42, 44-47, 49, 52, 55, 59, 61, 62, 66-67, 71, 80-84, 86-87, 97-99, 101-102, 112 y 114.

Todas estas variantes polipeptídicas de la Caja A que muestran una actividad similar o mayor que la del tipo salvaje

15 de la Caja A se ensayaron para determinar la resistencia a proteasas in vitro, a fin de escoger las más resistentes que son al menos tan activas como el tipo salvaje de la Caja A (véase el ensayo de resistencia a proteasas en el Ejemplo 2).

2. Ensayo de resistencia a proteasas in vitro

El objeto del presente estudio fue evaluar la resistencia a proteasas in vitro de las variantes de la Caja A de HMGB1 20 mostradas en el Ejemplo 1, y compararla con la de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje de SEC ID NO: 1 a fin de identificar las variantes con resistencia mejorada a proteasas con respecto al polipéptido de tipo salvaje.

2.1 Materiales  Tipo salvaje de la Caja A marcada con His de HMGB1 y variantes seleccionadas (Nautilus biotech)  Tripsina (Sigma; número de catálogo T8658 ; número de lote 045K5113)

25 -quimiotripsina (Sigma; número de catálogo C6423; número de lote 109H74858),  Endoproteinasa Asp-N (Sigma; número de catálogo P3303; número de lote 046K1049)  Endoproteinasa Glu-C (Sigma; número de catálogo P6181; número de lote 075K5100)  Cóctel de inhibidor de proteasas libre de EDTA, Complete Mini (Roche; número de catálogo 11836170 001)  Trizma base (Sigma; número de catálogo T6066)

30  Disolución de acrilamida/bis al 40% en agua (Sigma; número de catálogo 01709)  SDS (Sigma; número de catálogo 71729)  Glicerol al 99% (Sigma; número de catálogo G9012)  Temed (Sigma; número de catálogo 87689)  APS (Sigma; número de catálogo A 3678)

35  Patrones de peso molecular para SDS-PAGE polipeptídicos (Bio-Rad; número de catálogo 161-0326)  Tampón premezclado 10x de Tris/tricina/SDS (Bio-Rad; número de catálogo 161-0744) -Mercaptoetanol (Sigma; número de catálogo M7154)  Metanol (VWR; número de catálogo 20864.320)  Ácido acético (VWR; número de catálogo 20104.323)

40  Azul Brillante R (Sigma; número de catálogo B0149)  Azul de bromofenol (Sigma; número de catálogo B0126)

 Ácido clorhídrico (Merck; número de catálogo 1.00319.2511)

 Tampón de carga de muestras 3X para geles de Tricina (composición: 150 mM de Tris-HCl, pH 6,8; 12% de SDS; 36% de glicerol; 6% de -mercaptoetanol; 0,04% de azul de bromofenol)

2.2 Preparación de la mezcla de proteasas

Se usó una mezcla de proteasas que contiene tripsina, -quimiotripsina, endoproteinasa Asp-N y endoproteinasa Glu-C. La Tabla 1 da la especificidad de cada una de las proteasas usadas en este estudio.

Tabla 1: Especificidad de las proteasas.

Proteasa: Especificidad

Tripsina: Término C de K, R (no si P está en el término C del sitio de corte; digestión más lenta si el resto ácido en cualquiera de los lados del sitio de corte)

-quimiotripsina: Término C de T, P, W, L (hidrólisis secundaria: término C de M, I, S, T, V, H, G, A)

Endoproteinasa Asp-N: Término N de D, C

Endoproteinasa Glu: Término C de E, D (no si P está en el término C del sitio de corte)

10 Cada proteasa liofilizada se disolvió según las recomendaciones del fabricante para obtener una disolución madre que se dividió en alícuotas y se almacenó a -80ºC.

Se disolvieron 100 g de tripsina en 100 l de dH2O para obtener una disolución madre de 1 g/l. Se disolvieron 25 g de -quimiotripsina en 50 l de una disolución de 1 mM de HCl, 2 mM de CaCl2 para obtener una disolución madre 0,5 g/l. Se disolvieron 2 g de endoproteinasa Asp-N en 50 l de dH2O para obtener una disolución madre

15 0,04 g/l. Se disolvieron 25 g de endoproteinasa Asp-N en 50 l de dH2O para obtener una disolución madre de 0,5 g/l.

Antes de llevar a cabo el experimento, una alícuota de cada disolución madre de proteasa se dejó descongelar en hielo.

Alícuotas de la disolución madre de tripsina y de endoproteinasa Glu-C se diluyeron en dH2O para obtener una

20 disolución de trabajo final de 0,1 g/l. La alícuota madre de -quimiotripsina se diluyó en una disolución 1 mM de HCl, 2 mM de CaCl2 para obtener una disolución de trabajo final de 0,1 g/l. La alícuota de endoproteinasa Asp-N se usó sin dilución.

Justo antes de llevar a cabo el experimento, se preparó de forma reciente una mezcla de proteasas que contiene 1% (en peso/peso de la Caja A total contenida en la muestra) de cada proteasa, y se añadió inmediatamente a la Caja A

25 de HMGB1 a digerir.

2.3 Digestión con proteasas del tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 y variantes

En cada experimento se digirieron 18 g en total de cada Caja A de HMGB1 (tipo salvaje o variantes).

La Caja A de HMGB1 a ensayar se dejó descongelar en hielo, y se tomó el volumen que corresponde a 18 g. El volumen de esta disolución se llevó entonces con dH2O hasta un volumen final de 90 l a fin de obtener el mismo

30 volumen final para cada Caja A de HMGB1 a ensayar. Se toman 10 l de esta disolución (que corresponden a 2 g de Caja A de HMGB1) antes de añadir la mezcla de proteasas. Esta muestra corresponde a muestra no digerida de “tiempo 0”.

Se añade la muestra que queda (16 g de Caja A de HMGB1) con 8,8 l (que corresponden a 0,16 g de cada proteasa de la mezcla preparada recientemente; véase 2.2) de la mezcla de proteasas para la digestión.

35 La digestión con proteasas se lleva a cabo a 25ºC, y se muestrea a diferentes puntos de tiempo un volumen que corresponde a 2 g de Caja A de HMGB1 (presente originalmente en la mezcla). La digestión se detiene añadiendo 4 l de una disolución de cóctel de inhibidor de proteasas libre de EDTA Complete Mini (un comprimido disuelto en 10 ml de dH2O). Los puntos de tiempo para la toma de muestras son: 0, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas y 4 horas.

Muy poco después de la inhibición de las proteasas, las muestras se añaden con la cantidad apropiada de tampón de carga de muestras 3X y se incuban a 95ºC durante alrededor de 3 minutos.

2.4 Tricina SDS-PAGE de tipo salvaje y variantes de la Caja A de HMGB1 digeridos

Tras la digestión con proteasas y la preparación de las muestras, las muestras de los puntos de tiempo de cada Caja A de HMGB1 se cargan sobre gel de tricina SDS-PAGE (véase para referencias: Schägger y von Jagow, “Tricinesodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa”, Anal. Biochem. 166, 368-379, 1987). Para referencia en cada gel, se cargaron 5 l de patrones de pesos moleculares polipeptídicos para SDS-PAGE (Bio-Rad).

Cada pocillo del gel se carga con 10 l de muestra (volumen que corresponde a 1 g de Caja A de HMGB1 antes de la digestión).

La electroforesis se lleva a cabo a 30 V hasta que el azul de bromofenol ha entrado en la porción separadora del gel, y entonces se lleva a cabo a 120 V (Mini Protean 3 System; Bio-Rad) hasta el final del experimento.

Los geles se tiñen empapándolos en disolución de tinción Azul Brillante R de Coomassie (0,1% p/v en metanol al 50%, ácido acético al 10%) durante 1 hora, y se destiñeron toda la noche en disolución desteñidora (metanol al 30%, ácido acético al 10%).

Las imágenes del gel se adquieren con un sistema formador de imágenes Gel Documento 2000 (Bio-Rad).

2.5 Resultados

En las condiciones de ensayo dadas a conocer anteriormente, la proteína de tipo salvaje de HGMB1 resistió aproximadamente 30 minutos hasta la digestión completa con proteasas. En la Figura 8, la banda que corresponde al fragmento de longitud completa de 84 aminoácidos del tipo salvaje de la Caja A de HMGB1 humana de la proteína de SEC ID NO: 1 es visible hasta 30 minutos de la digestión con proteasas.

Las 21 variantes polipeptídicas de la Caja A ensayadas mostraron una resistencia incrementada a proteasa (Figura 10). En las condiciones de ensayo dadas a conocer, estas variantes resisten de 1 hora a 2 horas a la digestión con proteasas. Las variantes polipeptídicas de SEC ID NOS: 33, 35, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 47, 48, 57, 62, 69 y 104 mostraron una resistencia de 1 hora a la digestión con proteasas. Las Figuras 9.14, 9.15, 9.16, 9.17, 9.18, 9.21, 9.22, 9.23, 9.26, 9.27, 9.32, 9.35, 9.40 y 9.59 muestran una banda que corresponde a la proteína no marcada con His de 84 aminoácidos, que es visible hasta 1 hora de digestión con proteasas.

Las variantes polipeptídicas de SEC ID NOS: 45, 49, 52, 55 y 67 mostraron una resistencia de 1,5 horas a la digestión con proteasas. Las Figuras 9.24, 9.28, 9.30, 9.31 y 9.39 muestran una banda que corresponde a la proteína no marcada con His de 84 aminoácidos que es claramente visible 1 hora y media después de la digestión con proteasas. Las variantes polipeptídicas de SEC ID NOS: 59 y 64 muestran incluso una resistencia de hasta 2 horas a la digestión con proteasas. Las Figuras 9.33 y 9.37 muestran una banda de la proteína no marcada con His de 84 aminoácidos que es claramente visible hasta 2 horas después de la digestión con proteasas.

3. Estudio farmacocinético de la Caja A (tipo salvaje y variantes) y Caja A PEGilada (tipo salvaje y variantes) después de una única administración subcutánea en ratones,

3.1 Objeto del estudio

El fin del estudio fue evaluar y comparar el perfil farmacocinético de la Caja A (tipo salvaje y variantes) y de la Caja A PEGilada (tipo salvaje y variantes) tras una única administración subcutánea de los compuestos en ratones.

3.2 Materiales y métodos

 Artículos de ensayo: Tipo salvaje y variantes de la Caja A y las moléculas PEGiladas correspondientes. Las

moléculas PEGiladas se obtuvieron haciendo reaccionar mPEG-aldehído lineal (40 kDa) con el término N de

la molécula de la Caja A respectiva mediante aminación reductora.

3.3 Experimento in vivo

 Animales: ratones (ratones Balb/c, machos, 7-9 semanas, suministrados por Charles River Laboratories Italia

SpA, Calco, una semana antes del experimento) con un peso ponderal medio de 22,2-22,4 g en el momento

del experimento.

 Granja animal: los animales se enjaularon en un contenedor termostático ventilado, ajustado para mantener la

temperatura y humedad relativa a 22ºC ± 2ºC y 55 ± 15%, respectivamente, con un ciclo de 12 horas de

luz/oscuridad. Los animales se enjaularon en una cantidad de hasta 10 en una jaula, en jaulas de policarbonato transparentes (Techniplast, Buguggiate, Italia); se suministró a voluntad agua para beber vía botellas de agua, y una dieta para roedores de laboratorio comercialmente disponible (4RF21, Mucedola s.r.I., Settimo Milanese, Italia).

 Grupos experimentales: 4 (cuatro artículos de ensayo), 20 animales/grupo, agrupados al azar.

 Dosis administrada: el tipo salvaje y las variantes de la Caja A se suministraron subcutáneamente a 1 mg/kg.

El tipo salvaje y las variantes de la Caja A PEGilada se administraron subcutáneamente a 5 mg/kg. Estas

dosis aseguraron la equimolaridad de los compuestos de ensayo.

 Administración de los artículos de ensayo: los artículos de ensayo se administraron subcutáneamente usando

una jeringuilla de insulina con una aguja de 0,45 x 12 mm (26G x ½”) a un volumen de 0,25 ml/ratón (10 ml/kg

de peso corporal).

 Formulación del artículo de ensayo: disolución salina tamponada con fosfato.

 Sacrificio de los animales y recogida de sangre:

Las muestras de sangre se recogieron en los siguientes puntos de tiempo después del tratamiento:

 tipo salvaje y variantes de la Caja A: 5, 20 y 40 minutos, 1,5 y 2,5 horas después de la administración de los compuestos de ensayo;

 tipo salvaje y variantes de la Caja A PEGilada: 5, 40 minutos, 1,5, 5 y 10 horas después de la administración de los compuestos de ensayo.

Se decidieron diferentes puntos de tiempo para la recogida de muestras de sangre entre los compuestos de ensayo basándose en la mayor permanencia esperada de las moléculas PEGiladas en el torrente sanguíneo.

En cada tiempo de toma de muestras, se recogieron aproximadamente 0,4 ml de muestras de sangre de la aorta ventral de cada animal usando una jeringuilla de insulina, bajo profunda anestesia con éter, y se transfirieron a tubos Eppendorf de polietileno que contienen 5 l de heparina (5000 UI/ml) para evitar la coagulación de la sangre. Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo hasta la centrifugación a 1400 g durante 5 minutos en una centrífuga refrigerada (2-4ºC). Las muestras de plasma procedentes de cada tubo se recuperaron entonces, se pusieron en nuevos tubos Eppendorf, y se congelaron a -80ºC hasta el análisis.

3.4 Determinación analítica

Las concentraciones plasmáticas de la Caja A (tipo salvaje y variantes) y de la Caja A PEGilada (tipo salvaje y variantes) se determinaron en plasma de ratón mediante un método de ELISA.

De forma breve, se preparó una disolución de revestimiento diluyendo un anticuerpo monoclonal frente al N-terminal de la Caja A hasta 10 ng/ml en tampón de revestimiento de carbonato-bicarbonato 100 mM. Se aplicaron 100 l en alícuotas a cada pocillo de una placa de ELISA Nunc Maxisorp, que se incubó toda la noche a 4ºC. La placa se lavó con PBS 0,05% Tween 6 veces, y se añadieron a cada pocillo 300 l de 5% de leche en PBS 1% Tween para bloquear los sitios de unión que quedan en la placa. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente a 300 rpm. Las muestras se diluyeron 1:20 en PBS 1% Tween.

La placa se lavó 6 veces, y se transfirieron 100 l de patrones y de muestras diluidas a los pocillos designados de la placa revestida, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora a 300 rpm. La placa se lavó 6 veces de nuevo antes de la adición del anticuerpo secundario frente al C-terminal de la Caja A (1:200). Después de 1 hora de incubación y 6 lavados, se añadió a cada pocillo (100 l/pocillo) la disolución de conjugado de biotina-anti-conejo de cabra 1:20000. Después de 1 hora de incubación (a temperatura ambiente, 300 rpm) y seis lavados, la placa se incubó con 100 l/pocillo de la disolución de estreptavidina-HRP 1:100000 durante 25 minutos a 300 rpm. La placa se lavó 6 veces, y se añadieron a cada pocillo 100 l de sustrato TMB precalentado. La señal se desarrolló a temperatura ambiente en la mesa de trabajo, y, después de 30 minutos, se añadieron 100 l/pocillo de Stop Solution, y la placa se leyó inmediatamente a 450 nm.

3.5 Resultados

Se calcularon las concentraciones plasmáticas medias de la Caja A (tipo salvaje y variantes) y de la Caja A PEGilada (tipo salvaje y variantes) para cada una de las muestras de PK descritas anteriormente, y se determinó el perfil farmacocinético. Los resultados se muestran en la Fig. 11 y 12.

Como ejemplo, aquí más abajo se dan a conocer los perfiles PK del tipo salvaje y de la variante nº 64 (M511) de la Caja A, y de la Caja A PEGilada y de la variante número 64 de la Caja A PEGilada (M511). Los resultados se dan como valores medios ± error (SEM) (4 ratones para cada punto de tiempo, análisis por duplicado).

En la siguiente tabla, se da a conocer el AUCúltima calculada (Área Bajo la Curva, calculada en el último punto experimental) para las curvas del tipo salvaje de la Caja A, de la variante número 64 de la Caja A, del tipo salvaje de la Caja A PEGilada y de la variante número 64 de la Caja A PEGilada.

Tabla 2. Datos de la AUCúltima calculada para las curvas del tipo salvaje de la Caja A (WT), de la variante número 64 de la Caja A (64), del tipo salvaje de la Caja A PEGilada (PEG-WT) y de la variante número 64 de la Caja A PEGilada (PEG-64).

AUCúltima

(M*min)

WT: 8,899

64: 14,97

PEG-WT: 275,5

PEG-64: 332,5

3.6 Discusión

La ganancia relativa en AUCúltima conferida a WT por la mutación es 1,68X (WT frente a 64), muy probablemente

10 debido a la mayor resistencia a proteasas en el compartimiento sub agudo. La ganancia relativa en AUCúltima conferida a WT por la PEGilación es 31X (WT frente a PEG-WT), principalmente debido a una filtración renal alterada del conjugado de PEG, pero también a la protección frente a la acción de las proteasas. Poniendo juntos la mutación y la PEGilación se obtiene una ganancia relativa en AUCúltima de 37X (WT frente a PEG-64). Inesperadamente, las dos modificaciones juntas tienen un efecto positivo sobre la exposición del animal a la proteína

15 que es superior a la suma de las contribuciones de las modificaciones individuales (es decir, 37X > 1,68X + 31X). De este modo, la mutación de un solo punto y la PEGilación tienen un efecto cooperativo sinérgico sobre el perfil farmacocinético de la proteína nativa. Una posible explicación de este fenómeno podría ser que las proteínas PEGiladas no están completamente protegidas de la proteolisis en el compartimiento sub agudo. La introducción de una mutación de un solo punto da un refuerzo a la resistencia en este compartimiento, permitiendo que entren en la

20 circulación sanguínea mayores cantidades de proteína y que entonces sean protegidas de la filtración renal por la cadena de PEG voluminosa.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Conjugado polímero del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humano y/o no humano (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1.
2.

Conjugado polímero de una variante polipeptídica del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 humano y/o no humano (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1, por el que la secuencia de aminoácidos de dicha variante polipeptídica difiere de la secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje por la mutación de uno o más aminoácidos individuales.
3.

El conjugado polímero de la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero es un resto polimérico lineal o ramificado del grupo que consiste en polialquilenglicol, poli(óxido de alquileno), poli(ácido acrílico), poliacrilato, poliacrilamida o sus derivados N-alquílicos, poli(ácido metacrílico), polimetacrilato, poli(ácido etilacrílico), polietilacrilato, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), dextrano, quitosano opoliaminoácido.
4.

El conjugado polímero de la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero es un resto polimérico lineal o ramificado seleccionado de polietilenglicol (PEG) o metoxi-polietilenglicol (m-PEG), preferiblemente con un peso molecular medio de 20.000 o un peso molecular medio de 40.000 Da.
5.

El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto polimérico está enlazado covalentemente al polipéptido de la Caja A de HMGB1, a la variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1 o a un fragmento biológicamente activo de los mismos.
6.

El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el sitio de conjugación en el polipéptido, variante polipeptídica o fragmento biológicamente activo de los mismos de la Caja A de HMGB1 se selecciona de un resto de lisina, cisteína, histidina, arginina, tirosina, serina, treonina, aspartato, y glutamato, o el grupo amino N-terminal.
7.

El conjugado polímero de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la variante polipeptídica difiere de la secuencia de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje en la mutación de 1 a 10 aminoácidos individuales, preferiblemente en sólo un único aminoácido.
8.

El conjugado polímero de la reivindicación 7, en el que la mutación es una sustitución, una supresión o una adición de aminoácidos individuales.
9.

El conjugado polímero de la reivindicación 8, en el que la sustitución es una sustitución conservativa o una sustitución no conservativa obtenida mediante un aminoácido diferente codificado genéticamente o mediante aminoácidos no codificados genéticamente.
10.

El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1 humana se selecciona del grupo que consiste en las secuencia de aminoácidos como se definen en cualquiera de las SEC ID NO: 2 a 116.
11.

El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humana es un fragmento de al menos 77 o al menos 54 aminoácidos respectivamente, y comprenden las secuencias de aminoácidos como se definen en SEC ID NO: 117 ó 223 respectivamente, y en el que la variante polipeptídica de dichos fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 humana se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las SEC ID NO: 118 a 222 ó 224 a 300.
12.

El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la Caja A de HMGB1 no humana es la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia (SEC ID NO: 301), y en el que la variante polipeptídica no humana de dicha Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de SEC ID NO: 302 a 418.
13.

El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12, en el que los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje de Anopheles gambia es un fragmento de al menos 77 o al menos 54 aminoácidos respectivamente y comprende las secuencias de aminoácidos como se definen en SEC ID NO: 419 ó 529 respectivamente, y en el que la variante polipeptídica de dichos fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las SEC ID NO: 420 a 528 ó 530 a 610.
14.

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones anteriores como agente activo, y opcionalmente junto con vehículos, adyuvantes, diluyentes o/y aditivos farmacéuticamente aceptables.
15.

La composición de la reivindicación 14 para aplicaciones de diagnóstico o para aplicaciones terapéuticas.
16.

Uso de un conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento para la prevención, alivio o tratamiento de patologías asociadas con HMGB1 o patologías asociadas con las proteínas homólogas a HMGB1, particularmente seleccionadas de estados patológicos mediados por la activación de la cascada de citocinas inflamatorias.
17.

El uso de la reivindicación 16, en el que los estados patológicos se seleccionan del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, lesión por reperfusión después de transplante de órganos, afecciones cardiovasculares, enfermedad obstétrica y ginecológica, enfermedad infecciosa (vírica y bacteriana), enfermedad alérgica y atópica, patologías de tumores sólidos y líquidos, enfermedades de rechazo de transplantes, enfermedades congénitas, enfermedades dermatológicas, enfermedades neurológicas, caquexia, enfermedades renales, condiciones de intoxicación iatrogénica, enfermedades metabólicas e idiopáticas, y enfermedades oftalmológicas.
18.

Uso de un conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento para la prevención, alivio o tratamiento de patologías relacionadas con RAGE, en particular diabetes de tipo I y/o tipo II.
19.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en combinación con un agente adicional capaz de inhibir un mediador precoz de la cascada de citocinas inflamatorias, en el que el agente adicional se selecciona particularmente de

(i)

un antagonista o inhibidor de una citocina seleccionada del grupo que consiste en TNF, IL-1, IL-1, IL-Ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, IFN-, MIP-1, MIF-1, MIP-2, MIF y PAF;

(ii)

un anticuerpo contra RAGE, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de RAGE, por ejemplo una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN, o una molécula sintética pequeña antagonista de la interacción de HMGB1 con RAGE o RAGE soluble (sRAGE);

(iii) un inhibidor de la interacción de un receptor de tipo Toll (TLR), en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 o/y TLR9, con HMGB1, preferiblemente un anticuerpo monoclonal o policlonal, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, por ejemplo una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN, o una molécula sintética que tiene un tamaño menor que 1000 Dalton.
20.

La composición de la reivindicación 14, en la que el al menos un conjugado polímero está en combinación con el al menos un agente adicional como se define en la reivindicación 19.
21.

Dispositivo médico revestido de forma reversible con al menos un conjugado polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.