ES2362578T3 - Composición que comprende la poliproteína ns3/ns4 y el polipéptido ns5b del vhc, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y utilización en terapéutica. - Google Patents
Composición que comprende la poliproteína ns3/ns4 y el polipéptido ns5b del vhc, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y utilización en terapéutica. Download PDFInfo
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Abstract
Composición peptídica, caracterizada porque consiste en una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C.
Description
La presente invención se refiere al campo de la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra el virus de la hepatitis C (VHC). Tiene asimismo por objeto una nueva composición que contiene una poliproteína que corresponde a las dos proteínas colineales NS3 y NS4 (denominadas a continuación poliproteína NS3/NS4) y un polipéptido constituido por NS5b, los vectores, tales como adenovirus o poxvirus, capaces de expresar esta composición y su utilización como vacuna.
La hepatitis C es la causa principal de las hepatitis adquiridas por transfusión. La hepatitis C se puede transmitir asimismo por otras vías percutáneas, por ejemplo por inyección de drogas por vía intravenosa. Por otra parte, el riesgo de contaminación de los profesionales de la salud no es despreciable. La transmisión sexual ya ha sido descrita.
La hepatitis C se distingue de las demás formas de enfermedades del hígado asociadas a virus, tales como la hepatitis A, B o D. Las infecciones por el virus de la hepatitis C (VHC o HCV) son mayoritariamente crónicas, dando como resultado enfermedades del hígado, tales como hepatitis, cirrosis y carcinoma en un gran número de casos (5 a 20%) y representan en los países desarrollados 30% de los transplantes hepáticos.
Aunque el riesgo de transmisión del virus por transfusión haya disminuido por el hecho del establecimiento de ensayos de cribado en los años 1990, la frecuencia de nuevas infecciones por la hepatitis C sigue siendo elevada. A título de ejemplo, un estudio reciente indica que habría todavía en la actualidad 10.000 a 15.000 nuevos casos de infección por año en Francia (S. Deuffic et al., Hepatology 1999; 29: 1596-1601). Actualmente, aproximadamente 170 millones de personas en el mundo están infectadas de manera crónica por el VHC (hepatitis C: Global prevalence (update)", 2000, Weekly Epidermiological Record, Vol. 75(3)). Las poblaciones con riesgo elevado son principalmente el personal hospitalario y los usuarios de drogas intravenosas, pero existen donantes de sangre asintomáticos que no pertenecen a estos grupos de riesgo elevado, y en los que se han encontrado anticuerpos anti-VHC circulantes. Para estos últimos, no se ha identificado todavía la vía de infección. Existen por lo tanto unas infecciones por VHC (estimación de entre 5 y 10%), denominadas infecciones esporádicas, cuya etiología no se conoce y que no pueden ser controladas.
El VHC ha sido el primer virus hepatótropo aislado por medio de técnicas de biología molecular. Las secuencias del genoma vírico han sido clonadas antes de que la partícula vírica haya sido visualizada.
El VHC pertenece a un nuevo género de la familia de las Flaviviridae, los hepacivirus. Es un virus con ARN monocatenario positivo, de 9,5 kb, que se replica mediante una copia de ARN complementario, y cuyo producto de traducción es un precursor poliproteico de aproximadamente 3.000 aminoácidos. El extremo 5’ del genoma del VHC corresponde a una región no traducida adyacente a los genes que codifican para las proteínas estructurales, la proteína core de la nucleocápside, las dos glicoproteínas de cubierta, E1 y E2, y una pequeña proteína denominada p7. La región no traducida 5’ y el gen core están relativamente bien conservados en los distintos genotipos. Las proteínas de cubierta E1 y E2 están codificadas por regiones más variables de un aislado a otro. La proteína p7 es una proteína extremadamente hidrófoba que constituiría un canal iónico. El extremo 3’ del genoma del VHC contiene los genes que codifican para las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4, NS5) y para una región 3’ no codificante que posee un dominio bien conservado (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, junio de 1997, 25(6):1527-1538).
En la actualidad, la terapia más eficaz para el tratamiento de la hepatitis C, asocia el interferón pegilado y la ribavirina (Manns MP et al., The Lancet, 22 de septiembre de 2001, Vol. 358, 958-965). Mientras que esta terapia es particularmente eficaz en el caso de pacientes infectados por cepas víricas que pertenecen a los genotipos 2 y 3, ésta tiene solamente un efecto limitado sobre los genotipos 1a, 1b y 4 (Manns MP, supra). Menos del 50% de los pacientes tratados se vuelven unos "respondedores a largo plazo". Por otra parte, esta terapia es una intervención costosa (10.000 a 15.000 euro/paciente/año) y está asociada a unos efectos tóxicos. En efecto, 5 a 10% de los pacientes están obligados a interrumpir el tratamiento antes del final.
Por lo tanto, es necesario desarrollar una composición vacunal que tiene como diana todos los genotipos.
Varios estudios muestran, en la actualidad, que el control de una infección debida al VHC, o bien naturalmente (”resolución espontánea”), o bien después del tratamiento (“resolución terapéutica”), está asociada a la inducción o la potencialización de respuestas inmunitarias con mediación celular, haciendo intervenir los linfocitos T-CD4+ y TCD8+ (tal como se describe, por ejemplo, en LECHNER, F. et al., Eur. J. Immunol., 30:2479-2487 (2000) y en Thimme R. et al., 2001, J. Exp. Med., 194(10): 1395-1406).
Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH o también denominado HLA en el ser humano) son denominadas de clase I o de clase II. Las moléculas de clase I están expresadas sobre la casi totalidad de las células nucleadas y son capaces de presentar unos epítopos o péptidos a los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Las moléculas de clase II son capaces de presentar unos epítopos a las células T CD4+, pero su expresión está restringida a las células presentadoras de antígeno.
Las vacunas contra el virus de la hepatitis C previstas actualmente se basan en la utilización de proteínas recombinantes adyuvantadas, de péptidos, de vectores de expresión entre los cuales se pueden citar los vectores de origen vírico o bacteriano o de ADN desnudo. En este caso, se utiliza una o varias proteínas víricas o uno o varios genes que codifican para estas proteínas víricas.
Cuando se seleccionan varias proteínas víricas o varios genes que codifican para estas proteínas víricas, están frecuentemente constituidas o bien por una parte o por el conjutno de las proteínas estructurales (Makimura et al., 1996, Vaccine, 14: 28-34; Fournillier A., et al, 1999, J. Virology, 73: 7497-7504), o bien por las proteínas no estructurales individuales o que comprenden por lo menos dos proteínas contiguas (Brinster et al., 2001, Hepatology, 34: 1206-1217), o bien por una mezcla de proteínas estructurales y no estructurales (Pancholi et al., 2003, J. Virology, 77:382-390).
La solicitud de patente WO 99/38880 describe la utilización de tres genes que codifican separadamente para las tres proteínas NS3, NS4 y NS5 (a y b) en una composición vacunal que comprende tres vacunas ADN que expresan cada una separadamente estas tres proteínas. Los autores muestran en el ratón la inducción de linfocitos T específicos de los tres antígenos. Sólo la vacuna que expresa NS5a y b ha sido ensayada in vivo en un ensayo de protección.
La solicitud de patente WO 01/30812 describe por su parte la utilización de una proteína de fusión constituida por las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5a, llegado el caso en asociación con la proteína no estructural NS5b. Los autores han indicado que esta asociación permitía activar las células T específicas de VHC. Esta solicitud de patente describe simplemente la capacidad de formulaciones vacunales (tipo ADN desnudo, adenovirus recombinante o virus de la vacuna recombinante) que expresan la proteína de fusión NS3, NS4 y NS5a o la proteína NS5a para inducir unas respuestas inmunitarias específicas y mediadas por unos linfocitos T específicos.
Cho et al (Vaccine. 1999 Mar. 5; 17(9-10):1136-44) describen un método de vacunación que utiliza un vector de expresión que contiene la mitad 3' del genoma del VHC (nucleótidos 3395 a 9391, tal como se indica en el capítulo "2.1 plasmid construction", página 1137), y que codifica para una poliproteína constituida por los 4 polipéptidos NS3, NS4, NS5a y NS5b, estando el polipéptido NS5a presente necesariamente.
El solicitante ha demostrado ahora, contra toda previsión, que la asociación particular de las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5b, siendo NS3 y NS4 expresadas de manera colineal, presentaba un mejor poder inmunógeno y protector superior al obtenido con una vacuna que incluye, además de estas proteínas no estructurales, asimismo la proteína NS5a y/u otras proteínas estructurales del VHC tal como core, E1 o E2, y tenía un efecto sobre la capacidad de las células que proceden de pacientes infectados por unas cepas víricas para inducir unas respuestas inmunitarias específicas.
Así, la presente invención tiene por objeto una composición peptídica constituida por una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como por un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C.
Tiene asimismo por objeto los vectores que incluyen las secuencias nucleotídicas que codifican para esta composición peptídica, tales como los adenovirus y los poxvirus, así como los microorganismos o células hospedantes transformados por estos vectores.
Tiene por último por objeto la utilización de la composición peptídica y de los vectores para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición o al control de una infección provocada por el virus de la hepatitis C, y en una composición vacunal.
La presente invención tal como se define en las reivindicaciones propone por lo tanto una nueva composición peptídica constituida por una poliproteína NS3/NS4 y por un polipéptido NS5b del VHC, composición que tiene la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria con mediación celular específica del VHC, de manera que es útil en el campo de la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra el virus de la hepatitis C.
La poliproteína NS3/NS4 de la composición peptídica de la invención está constituida por la proteína NS3 y por la proteína NS4a y b, sin interrupción en la secuencia peptídica, tal como en la poliproteína nativa. En efecto, tal como se ha indicado anteriormente, el genoma de VHC contiene un solo marco de lectura abierto que está transcrito en una poliproteína. Esta poliproteína del VHC puede ser escindida para producir por lo menos diez partes distintas, en el orden NH2-core-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH.
La proteína NS3 es una proteína de 630 aminoácidos que aparece aproximadamente del aminoácido 1027 al aminoácido 1657 de la poliproteína. La proteína NS4, proteína de 314 aminoácidos, aparece aproximadamente del aminoácido 1658 al aminoácido 1972 (numeración con respecto al VHC-1) (Choo et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.,
vol. 88:2451-2455). La poliproteína NS3/NS4 aparece por lo tanto aproximadamente del aminoácido 1027 al aminoácido 1972.
Tratándose del polipéptido NS5b contenido asimismo en la composición de la invención, éste está constituido por 590 aminoácidos y aparece aproximadamente del aminoácido 2421 al aminoácido 3011 de la poliproteína (Choo et al., 1991, supra).
La proteína NS3 comprende dos dominios estructurales distintos, a saber un dominio N-terminal provisto de una actividad proteásica con serina activa que interviene en la maduración de la poliproteína vírica, y un dominio C-terminal que comprende una actividad helicasa asociada a una actividad NTPásica que desempeña un papel en la replicación del genoma viral.
Mediante las expresiones "poliproteína NS3/NS4" y "polipéptido NS5b" se entienden evidentemente las poliproteínas y los polipéptidos que tienen las secuencias en aminoácidos nativas, que proceden de cualquier cepa y aislado del VHC, así como sus análogos, muteínas y homólogos.
Por los términos "análogos" o "muteínas" de la poliproteína y del polipéptido, se entienden los derivados biológicamente activos de las moléculas de referencia que presentan la actividad deseada, a saber la capacidad para estimular una respuesta inmunitaria con mediación celular tal como se ha definido anteriormente.
De manera general, el término "análogo" se refiere a unos compuestos que tienen una secuencia y una estructura polipeptídica nativa que presenta una o varias adiciones, sustituciones (generalmente conservadoras en términos de naturaleza) y/o unas deleciones de aminoácido, con respecto a la molécula nativa, en la medida en la que las modificaciones no destruyen la actividad inmunógena. Por el término "muteína" se entienden los péptidos que presentan uno o varios elementos que imitan el péptido ("peptoides"), tales como los descritos en la solicitud de patente PCT WO 91/04282. Preferentemente, el análogo o la muteína tienen por lo menos la misma inmunoactividad que la molécula nativa. Unos procedimientos de preparación de análogos y de muteínas polipeptídicas son conocidos por el experto en la materia y se describen a continuación.
Los análogos particularmente preferidos incluyen las sustituciones conservadoras en naturaleza, es decir las sustituciones que tienen lugar en una familia de aminoácidos. Específicamente, los aminoácidos están generalmente divididos en 4 familias, a saber (1) los aminoácidos tales como el aspartato y el glutamato, (2) los aminoácidos básicos tales como la lisina, la arginina y la histidina, (3) los aminoácidos no polares tales como la alanina, la leucina, la isoleucina, la prolina, la fenilalanina, la metionina y el triptófano, y (4) los aminoácidos no cargados polares tales como la glicina, la asparagina, la glutamina, la cisteína, la serina, la treonina y la tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina están a veces clasificados en los aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, se puede predecir de manera razonable que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, de un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina, o una sustitución conservadora similar de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una relación estructural, no tendrá mayor efecto sobre la actividad biológica. El experto en la materia determinará fácilmente las regiones de la molécula peptídica de interés que pueden tolerar un cambio por referencia a las escalas Hopp/Woods y Kyte-Doolite, bien conocidas en la técnica.
Por la expresión "homología" se entiende el porcentaje de identidad entre dos moléculas peptídicas, tales como poliproteínas y polipéptidos. Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias presentan por lo menos 60%, preferentemente por lo menos 75%, más preferentemente por lo menos 80-85%, aún más preferentemente por lo menos 90%, y ventajosamente se prefiere por lo menos 95-98% o más de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas peptídicas.
De manera general, el término "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de aminoácido por aminoácido de dos secuencias peptídicas. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de desapareamientos entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100. El porcentaje de identidad se puede determinar asimismo con la ayuda de programas de ordenadores tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 1981, 5 Supl., 3: 482-489.
Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de un cierto número de cepas y de aislados del VHC, y en particular de la proteína NS3, de la proteína NS4 y del polipéptido NS5b, ya han sido determinadas.
Por ejemplo, el aislado HCV-J1 se describe en Okamoto H. et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20: 6410-6410. Las secuencias codificantes completas de dos aislados independientes del VHC, a saber los aislados HCV-J y -BK, han sido descritas respectivamente en Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acda., Sci., 87:9524-9528 y en Takamizawa et al., 1991, J. Virol., 65: 1105-1113. Tratándose del aislado HCV-1, se describe en Choo et al., 1990, Brit. Med. Bull., 46: 423-441 y en Choo et al., 1991, supra. El aislado HVC-H ha sido descrito en Inchauspé G. et al; 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10292-10296. El aislado HCV-G9 ha sido descrito en Okamoto H., et al., 1994, J. Gen. Virol., 45: 629
635. Los aislados HCV-J6 et -J8 han sido descritos respectivamente en Okamoto H., et al., 1991, J. Gen. Virol., 72: 2697-2704 y Okamoto H., et al., 1992, Virology, 188: 331-341. El aislado HVC-BEBE1 ha sido descrito en Nako H., et al., 1996, J. Gen. Virol., 141: 701-704 y el aislado HCV-NZL1 ha sido descrito en Sakamoto M., et al., 1994, J. Gen. Virol., 75: 1761-1768. Tratándose del aislado HCV-Tr, se ha descrito en Chayama K., et al., 1994, J. Gen. Virol., 75: 3623-3628. Los aislados HCV-ED43 et -EUH1480 han sido descritos respectivamente en Chamberlain R.W., et al., 1997, J. Gen. Virol., 78:1341-1347 y Chamberlain RW., et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
236: 44-49. El aislado HCV-EUHK2 ha sido descrito en Adams A., et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
234: 393-396. Los aislados HCV-VN235, -VN405 y -VN004 han sido descritos en Tokita H., et al, 1998, J. Gen. Virol., 79: 1847. Por último, tratándose de los aislados HCV-JK049 et -JKD46, han sido descritos en Tokita H. et al., 1996, J. Gen. Virol., 77: 293-301.
Las cepas y aislados del VHC, tal como se han ilustrado anteriormente, pueden presentar unos genotipos diferentes, a saber unos genotipos 1a (aislados HCV-1, -J1 y -H), 1b (aislados HCV-J y BK), 1c (aislado HCV-G9), 2a (aislado HCV-J6), 2b (aislado HCV-J8), 2c (aislado HCV-BEBE1), 3a (aislado HCV-NZL1), 3b (aislado HCV-Tr), 4a (aislado HCV-ED43), 5a (aislado HCV-EUH1480), 6a (aislado HCV-EUHK2), 7b (aislado HCV-VN235), 8b (aislado HCVVN405), 9a (aislado HCV-VN004), 10a (aislado HCV-JK049) y 11a (aislado HCV-JK046).
Según un modo de realización de la invención, NS3 y/o NS4 y/o NS5b proceden de virus de genotipos diferentes.
Según otro modo de realización, NS3 y/o NS4 y/o NS5b proceden de virus del mismo genotipo, preferentemente de genotipo 1b.
La poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b contenidos en la composición peptídica de la invención pueden ser o bien de origen nativo, o bien de origen recombinante.
La poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b de origen nativo se obtienen a partir de las cepas o de los aislados del VHC, a través de la utilización de cebadores oligonucleotídicos sintéticos que servirán para amplificar las secuencias víricas nativas, o bien a partir de sueros de pacientes infectados por el o los genotipos víricos diana, o bien a partir de ARN vírico ya purificado, que procede por ejemplo de sangre o de hígado de pacientes, o bien a partir de ADN complementario libre o clonado previamente en un vector de expresión, o también a partir de partículas víricas purificadas a partir de extracciones biológicas o de sistema de propagación in vitro.
La poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b de la invención de origen recombinante se pueden obtener asimismo mediante la técnica de ingeniería genética que comprende las etapas siguientes:
-cultivar un microorganismo o células eucariotas transformados con la ayuda de una secuencia nucleotídica que codifica para dicha poliproteína NS3/NS4 o para dicho polipéptido NS5b, y
-recuperar el péptido producido por dicho microorganismo o dichas células eucariotas.
Esta técnica es bien conocida por el experto en la materia. Para más detalles sobre ella, se podrá hacer referencia al trabajo siguiente: Recombinant DNA Technology I, Editores Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York Academy of Sciences, Volumen 646, 1991.
Las secuencias nucleotídicas que codifican para la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b se pueden preparar mediante síntesis química acoplada a un enfoque de ingeniería genética o mediante ingeniería genética sola, utilizando las técnicas bien conocidas por el experto en la materia y descritas por ejemplo en Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Las secuencias nucleotídicas que codifican para la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b se pueden insertar en unos vectores de expresión en un sistema de expresión adaptado, con el fin de obtener la composición peptídica de la invención.
Evidentemente, las secuencias nucleotídicas se pueden insertar en un solo vector de expresión o bien en dos vectores de expresión diferentes. En este último caso, la secuencia que codifica para la poliproteína NS3/NS4 se inserta en uno de los dos vectores y la secuencia que codifica para el polipéptido NS5b se inserta en el otro vector, pudiendo ser estos dos vectores de naturaleza idéntica o diferente.
Así, otro objeto de la invención consiste en los vectores de expresión para la expresión de secuencias nucleotídicas del virus de la hepatitis C, caracterizado porque dichas secuencias nucleotídicas del virus de la hepatitis C están constituidas por una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, así como los medios necesarios para su expresión, estando dicha secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y dicha secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b en un solo vector de expresión.
Se entiende por medio necesario para la expresión de un péptido, siendo el término péptido utilizado para cualquier molécula peptídica, tal como proteína, poliproteína, polipéptido, etc., cualquier medio que permite obtener el péptido, tal como en particular un promotor, un terminador de transcripción, un origen de replicación y preferentemente un marcador de selección.
Los medios necesarios para la expresión de un péptido están relacionados de manera operativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica para el péptido de interés. Mediante la expresión "relacionados de manera operativa" se entiende una yuxtaposición de dichos elementos necesarios para la expresión y del gen que codifica para el péptido de interés, los cuales están en una relación tal que esto les permite funcionar de manera esperada. Por ejemplo, pueden existir unas bases suplementarias entre el promotor y el gen de interés, mientras que su relación funcional esté preservada.
Los medios necesarios para la expresión de un péptido pueden ser unos medios homólogos, es decir incluidos en el genoma del vector utilizado, o bien ser heterólogos. En este último caso, dichos medios están clonados con el péptido de interés a expresar.
Unos ejemplos de promotores heterólogos que comprenden (i) los promotores víricos tales como el promotor SV40 (virus del simio 40), el promotor del gen de la timidina-quinasa del virus simplex del herpes (TK-HSV-1), el LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) y el promotor tardío mayor adenovírico (MLP), así como (ii), cualquier promotor celular que controla la transcripción de los genes que codifican para unos péptidos en unos eucariotas superiores, tal como el promotor del gen de fosfoglicerato-quinasa (PGK) constitutivo (Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74), el promotor de los genes específicos del hígado alfaantitripsina y FIX, y el promotor SM22 específico de las células del músculo liso (Moessler et al., 1996, Development,
122: 2415-2425).
Según un modo de realización de la invención, las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b proceden de genotipos diferentes.
Según otro modo de realización, las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína y dicho polipéptido proceden de un virus de igual genotipo, preferentemente el genotipo 1b.
En este caso también, se entiende por "secuencia nucleotídica" todas las secuencias que codifican para la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b nativos, así como para sus análogos, muteínas y homólogos, tal como los definidos anteriormente.
Dichas secuencias contenidas en el vector de expresión pueden estar relacionadas directamente entre sí bajo el control de un solo promotor y/o de un solo elemento regulador de la expresión, o bien pueden estar separadas estando cada una bajo la dependencia de los promotores y/o reguladores de la expresión independientes, idénticos
o diferentes.
A título de vector de expresión que conviene para los fines de la invención, se pueden citar por ejemplo los plásmidos, los vectores víricos de tipo adenovirus, poxvirus, virus de la vacuna, baculovirus, los vectores bacterianos de tipo salmonela, y BCG.
Los adenovirus han sido detectados en numerosas especies animales, no se integran y son poco patógenos. Son capaces de infectar una variedad de tipos celulares, las células en división y las células en reposo. Poseen un tropismo natural para los epitelios bronquiales. Además, se han utilizado como vacunas entéricas vivas durante numerosos años con un excelente perfil de seguridad. Por último, se les puede hacer crecer fácilmente y purificarlos en gran cantidad. Estas características han hecho que los adenovirus sean particularmente apropiados para una utilización como vectores de expresión y en particular como vectores de terapia génica con fines terapéuticos y vacunales.
Según un modo de realización preferido, el vector de la invención es un adenovirus.
Unos ejemplos de adenovirus que se utilizan en la presente invención pueden ser derivados de cualquier fuente de origen humano o animal, en particular de origen canino (por ejemplo CAV-1 o CAV-2; referencia Genbank CAV1GENOM y CAV77082, respectivamente), de origen aviar (referencia Genbank AAVEDSDNA), de origen bovino (tal como BAV3, Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol., 72: 1394-1402), de origen ovino, felino, porcino, de origen simio, o bien de uno de sus híbridos. Se puede utilizar cualquier serotipo. Sin embargo, se prefieren los adenovirus de origen humano y en particular el adenovirus 5 (AdlV).
De manera general, los virus citados están disponibles en las colecciones ATCC y han sido objeto de numerosas publicaciones que describen su secuencia, su organización y su biología, lo cual permite que el experto en la materia los aplique fácilmente. Por ejemplo, la secuencia del adenovirus de tipo 5 se describe en la base de datos Genbank (M73260 y M29978).
El genoma de los adenovirus está constituido por una molécula de ADN lineal bicatenario de aproximadamente 36 kb que contiene más de aproximadamente 30 genes necesarios para terminar el ciclo vírico. Los primeros genes están divididos en 4 regiones dispersadas en el genoma del adenovirus (E1 a E4). Las regiones E1, E2 y E4 son esenciales para la replicación vírica. La región E3 está considerada como una región no esencial en base a la observación de que los virus mutantes que aparecen naturalmente o los virus híbridos que han perdido esta región E3 continúan replicándose como los virus de tipo salvaje en las células cultivadas (Kelly y Lewis, 1973, J. Virol., 12:643-652). Los últimos genes (L1 a L5) codifican en su mayoría para las proteínas estructurales que constituyen la cápside vírica. Solapan por lo menos en parte los primeros motivos de transcripción y son trascritos a partir de un promotor único (MLP por "Major Late Promotor"). Además, el genoma adenovírico contiene en los dos extremos unas regiones de acción en cis esenciales para la replicación de ADN, respectivamente los motivos de repetición inversos 5' y 3' (ITR por "Inverted Terminal Repeats") y una secuencia de empaquetado.
Los adenovirus utilizados actualmente en los protocolos de terapia génica están desprovistos de la mayoría de la región E1, lo cual hace que los virus sean deficientes a nivel de su replicación para evitar su diseminación en el entorno y en el organismo hospedante. Además, la mayoría de los adenovirus están desprovistos asimismo de la región E3 con el fin de incrementar su capacidad de clonación. La factibilidad de la transferencia del gen utilizando estos vectores ha sido demostrada en una variedad de tejidos in vivo (véase por ejemplo Yei et al., 1994, Hum. Gene Ther., 5: 731-744; Dai et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92: 1401-1405; US nº 6.099.831; y US nº 6.013.638).
Preferentemente, los promotores utilizados en los adenovirus como vector de expresión son unos promotores heterólogos tales como los promotores CMV y SV40.
Más preferentemente, el promotor CMV es el promotor de la poliproteína NS3/NS4 y el vector de expresión comprende como secuencia nucleotídica que codifica para dicha poliproteína el casete de expresión CMV-NS3-NS4.
Mediante la expresión "casete de expresión" se entiende una secuencia de ADN que contiene un promotor y un marco de lectura abierto para la expresión del péptido de interés, para insertar en un vector.
Preferentemente, asimismo, el promotor SV40 es el promotor del polipéptido NS5b y el vector de expresión comprende como secuencia nucleotídica que codifica para dicho polipéptido el casete de expresión SV40-NS5b.
Según un modo de realización de la invención, el genoma del adenovirus está modificado de manera que se sustituye la región E1 por el casete de expresión CMV-NS3-NS4 y se sustituye la región E3 por el casete de expresión SV40-NS5b.
Los métodos de supresión y de inserción de secuencias de ADN en unos vectores de expresión son ampliamente conocidos por el experto en la materia y consisten en particular en unas etapas de digestión enzimática y ligadura.
Otro vector de expresión particularmente apropiado para los fines de la invención es un poxvirus, que constituye otro modo de realización de la invención.
Los poxvirus constituyen un grupo de virus complejo recubiertos, que se distinguen principalmente por su morfología inhabitual, su gran genoma de ADN y su sitio citoplásmico de replicación. El genoma de varios elementos de los poxviridae, que comprende la cepa vírica de la vacuna de Copenhagen (VV) (Goebel et al., 1990, Virol. 179: 247-266 y 517-563) y la cepa del virus de la vacuna modificada de Ankara (MVA) (Antoine et al, 1998, Virol., 244:635-396) ha sido cartografiado y secuenciado. La cepa VV posee un genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 192 kb que codifica para aproximadamente 200 proteínas de las cuales aproximadamente 100 están implicadas en el ensamblaje del virus. La cepa MVA es una cepa del virus de la vacuna altamente atenuada, generada por más de 500 pasajes en serie de la cepa de Ankara del virus de la vacuna (CVA) sobre unos fibroblastos de embriones de pollo (Mayr et al., 1975, Infection, 3: 6-16). El virus MVA ha sido depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) con el número I-721. La determinación de la secuencia completa del genoma del MVA y la comparación con el del VV permite la identificación precisa de las alteraciones que han aparecido en el genoma vírico y la definición de siete deleciones (I a VII) y numerosas mutaciones que conducen a unos marcos de lectura abiertos fragmentados (Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396).
Otros ejemplos de poxvirus apropiados para los fines de la invención comprenden el pox del canario, el pox de aves de corral, el pox de vaca, el entomopox, el pox de simio, el pox de cerdo y el pox de pingüino.
El poxvirus se encuentra en dos formas morfológicamente distintas, denominadas virus maduro intracelular (IMV) y virus extracelular recubierto (EEV).
El poxvirus utilizado como vector de expresión de la invención presenta por lo menos una de las características siguientes, consideradas solas o en asociación:
- (i)
- el poxvirus es un virus MVA,
- (ii)
- el poxvirus está en forma morfológica IMV, y
(iii) el genoma del poxvirus está modificado de manera que se inserta el casete de expresión NS3/NS4 y se inserta el casete de expresión NS5b.
Cuando el genoma del poxvirus está modificado de manera que se insertan los dos casetes de interés, los medios necesarios para su expresión son homólogos. Así, en el caso en el que se utiliza el virus MVA, la expresión de NS3/NS4 puede estar por ejemplo bajo el control del promotor ph5r de manera que el casete de expresión correspondiente es ph5r-NS3-NS4, y la expresión de NS5b puede estar por ejemplo bajo el control del promotor p7.5 de manera que el casete de expresión correspondiente es p7.5-NS5b, y viceversa.
Según un modo de realización particular, cuando el genoma del poxvirus está modificado de manera que se insertan los dos casetes de interés, dichos dos casetes de expresión están orientados en el mismo sentido.
Según otro modo de realización particular, éstos están orientados en sentido opuesto.
En este caso también, los casetes de expresión están insertados en el genoma del poxvirus de manera conocida por el experto en la materia, tal como se ha indicado anteriormente.
Los vectores de la invención pueden comprender asimismo unas secuencias necesarias para la detección de diana de los péptidos hacia unos compartimentos celulares particulares. Un ejemplo de detección de diana puede ser la detección de diana hacia el retículo endoplásmico obtenido utilizando unas secuencias de direccionamiento del tipo de la secuencia líder procedente de la proteína E3 del adenovirus (Ciernik I.F., et al., The Journal of Immunology, 1999, 162, 3915-3925).
Pueden comprender asimismo unas secuencias necesarias para la detección de diana hacia las células dendríticas y a la detección de diana a la membrana de las células.
La invención tiene asimismo por objeto los microorganismos y las células eucariotas transformados por un vector de expresión de la invención.
A título de ejemplos de microorganismos que convienen para los fines de la invención, se pueden citar las levaduras, tales como las de las familias siguientes: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis y Kluveromyces lactis siendo preferidos; y las bacterias, tales como E. coli y las de las familias siguientes: Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus y Streptomyces.
A título de ejemplo de células eucariotas, se pueden citar las células que proceden de animales tales como los mamíferos, los reptiles, los insectos y equivalentes. Las células eucariotas preferidas son las células que proceden del hámster chino (células CHO), del mono (células COS y Vero), del riñón de hámster enano (células BHK), del riñón de cerdo (células PK 15) y del riñón de conejo (células RK13), las líneas celulares humanas del osteosarcoma (células 143 B), las líneas celulares humanas HeLa y las líneas celulares humanas del hepatoma (del tipo células Hep G2), así como las líneas celulares de insecto (por ejemplo de Spodoptera frugiperda).
Las células hospedantes pueden ser suministradas en unos cultivos en suspensión o en frasco, en unos cultivos de tejidos, unos cultivos de órgano y equivalentes. Las células hospedantes pueden asimismo ser unos animales transgénicos.
La presente descripción se refiere asimismo a unos anticuerpos dirigidos contra una de las composiciones peptídicas de la invención tales como las definidas anteriormente o bien contra uno de los vectores de expresión de la invención tales como los definidos anteriormente.
Los anticuerpos son o bien unos anticuerpos policlonales, o bien monoclonales.
Los anticuerpos policlonales mencionados anteriormente se pueden obtener mediante la inmunización de un animal con la composición peptídica de la invención o bien con el vector de la invención a título de "antígeno de interés", seguida de la recuperación de los anticuerpos buscados en forma purificada, mediante la extracción del suero de dicho animal, y la separación de dichos anticuerpos de los demás constituyentes del suero, en particular mediante cromatografía de afinidad sobre una columna en la que se fija un antígeno específicamente reconocido por los anticuerpos, en particular un antígeno vírico de interés.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante la técnica de los hibridomas cuyo principio general se recuerda a continuación.
En un primer tiempo, se inmuniza un animal, generalmente un ratón (o unas células en cultivo en el marco de inmunizaciones in vitro) con la composición peptídica de la invención o bien con el vector de la invención a título de "antígeno de interés", cuyos linfocitos B son entonces capaces de producir unos anticuerpos contra dicho antígeno.
Estos linfocitos productores de anticuerpos son fusionados a continuación con unas células mielomatosas "inmortales" (murinas en el ejemplo) para dar lugar a unos hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células así obtenida, se efectúa entonces una selección de las células capaces de producir un anticuerpo particular y de multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma se multiplica en forma de clon, conduciendo cada uno a la producción de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de reconocimiento frente al antígeno de interés podrán ser ensayadas por ejemplo en ELISA, mediante inmunotransferencia en una o dos dimensiones, en inmunofluorescencia, o con la ayuda de un biosensor. Los anticuerpos monoclonales así seleccionados son purificados a continuación en particular según la técnica de cromatografía de afinidad descrita anteriormente.
Las composiciones peptídicas, los vectores de expresión, las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b, así como los anticuerpos son particularmente eficaces para la inhibición, la prevención y el control de la infección de los pacientes portadores del virus del VHC, de manera que su utilización para la preparación de un medicamento constituye otro objeto de la invención.
La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica, en particular vacuna, que contiene a título de sustancia activa la composición peptídica de la invención, o bien un vector de expresión de la invención, o un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, o bien las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b, correspondiendo dichas secuencias nucleotídicas a las secuencias contenidas en los vectores de expresión de la invención, dispuestas bajo el control de elementos necesarios para una expresión constitutiva y/o inducible de dichos péptidos,
o bien uno por lo menos de los anticuerpos antes mencionados.
Por elementos necesarios para una expresión constitutiva de los péptidos, se entiende un promotor ubiquitario o específico de las células eucariotas.
A título de elementos necesarios para una expresión inducible de los péptidos, se pueden citar los elementos de regulación del operón de E. coli para la resistencia a la tetraciclina (Gossen M. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89:5547-5551 (1992).
Según un modo de realización particular de la invención, la composición farmacéutica contiene asimismo un vehículo farmacéuticamente apropiado. Evidentemente, el experto en la materia determinará fácilmente la naturaleza del vehículo farmacéuticamente apropiado y la cantidad de polipéptidos a utilizar en función de los constituyentes de la composición farmacéutica.
La cantidad y la naturaleza del vehículo farmacéuticamente apropiado pueden ser fácilmente determinadas por el experto en la materia. Éstas se seleccionan según la forma farmacéutica y el modo de administración deseados.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son apropiadas para la administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica, local, intratraqueal, intranasal, transdérmica, rectal, intraocular, intraauricular, pudiendo dicho principio activo ser administrado en forma unitaria de administración.
Las formas unitarias de administración pueden ser, por ejemplo, unos comprimidos, unas cápsulas blandas, unos gránulos, unos polvos, unas disoluciones o suspensiones orales inyectables, unos sellos transdérmicos ("parche"), unas formas de administración sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, intra-auricular, por inhalación, unas formas de administración tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa, unas formas de administración rectal o unos implantes. Para la administración tópica, se pueden prever cremas, geles, pomadas, lociones o colirios.
Estas formas galénicas se preparan según los métodos habituales de los campos considerados.
Dichas formas unitarias se dosifican para permitir una administración diaria de 0,001 a 10 mg de sustancia activa por kg de peso corporal, según la forma galénica.
Puede haber casos particulares en los que son apropiadas unas dosis más elevadas o más bajas; dichas dosificaciones no se apartan del marco de la invención. Según la práctica habitual, la dosificación apropiada para cada paciente se determina por el médico según el modo de administración, el peso y la respuesta del paciente.
Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen preferentemente a título de sustancia activa uno de los vectores de la invención o bien un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, de manera que son útiles en vacunación profiláctica y terapéutica.
La vacunación profiláctica y terapéutica se puede realizar mediante la inyección de una vacuna a base de uno o varios vectores de expresión de la invención, en la medida en la que el o los vectores de expresión codifican al final para la poliproteína NS3/NS4 y para el polipéptido NS5b a título de sustancia activa, inyección seguida de recuerdos o no. Se puede realizar asimismo inyectando dos tipos de vectores de expresión de la invención diferentes, en primer lugar un adenovirus y después un poxvirus, de manera simultánea o diferida en el tiempo, y viceversa.
Estos vectores pueden estar contenidos en un kit farmacéutico.
Asimismo, otro objeto de la invención consiste en unos kits farmacéuticos, en particular vacunales, que comprenden por lo menos un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y por lo menos un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b.
Otro objeto de la invención consiste en unos kits farmacéuticos, en particular vacunales, que comprenden por lo menos un vector de expresión de tipo adenovirus tal como el definido anteriormente y/o por lo menos un vector de expresión de tipo poxvirus tal como el definido anteriormente.
La vacunación profiláctica y terapéutica se puede realizar asimismo mediante la inyección de una vacuna a base de por lo menos un vector de expresión de la invención, o bien un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, y de por lo menos una composición farmacéutica de la invención constituida por la composición peptídica de la invención o por los anticuerpos de la invención. Se puede realizar asimismo mediante la inyección de una vacuna a base de por lo menos un vector de expresión de la invención, o bien un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, y de por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y para el polipéptido NS5b.
Asimismo, otro objeto de la invención consiste en unos kits farmacéuticos, en particular vacunales, que comprenden por lo menos un vector de expresión de la invención, o bien un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, y por lo menos una composición farmacéutica de la invención o por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y para el polipéptido NS5b.
La presente invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos siguientes dados únicamente a título ilustrativo y no limitativo, así como con la ayuda de las figuras 1 a 7 adjuntas, en las que:
-la figura 1A a 1K representa los mapas de los diferentes plásmidos utilizados para la obtención de un adenovirus AdNS3NS4NS5b según la invención, en los que se indican los sitios de las diferentes enzimas de restricción y el emplazamiento de los fragmentos de secuencia que codifican para NS3/NS4 y para NS5b,
-la figura 2A a 2H representa los mapas de los diferentes plásmidos utilizados para la obtención de un poxvirus MVA NS3NS4NS5b según la invención, en los que se indican los sitios de las diferentes enzimas de restricción y el emplazamiento de los fragmentos de secuencia que codifican para NS3/NS4 y para NS5b,
-la figura 3 proporciona la respuesta celular inducida por el adenovirus AdNS3NS4, es decir según el ensayo CTL (figura 3A) en el que se ha utilizado el epítopo GLL para estimular los esplenocitos en cultivo y para cargar las dianas del CTL y cuyo resultado se expresa en porcentaje de lisis específica en función de la relación efector/diana, es decir según el ensayo ELISPOT (figura 3B), específico para el epítopo GLL, en el que el resultado se proporciona en número de puntos/106 células,
-la figura 4 proporciona la respuesta celular inducida por el adenovirus AdNS5b según el ensayo ELISPOT, específico de los epítopos ALY y KLP,
-la figura 5 proporciona la respuesta celular inducida por el adenovirus adCE1E2 según el ensayo CTL en el que se ha utilizado el epítopo DLM para estimular los esplenocitos en cultivo y para cargar las dianas del CTL y cuyo resultado se expresa en porcentaje de lisis específica en función de la relación efector/diana,
-la figura 6 proporciona el título de virus recombinante de la vacuna, que resulta del ensayo de prueba, en pfu/ml/mg ovario, para los 4 grupos de 8 ratones inmunizados por las diferentes combinaciones de adenovirus: AdNS3NS4 + AdNS5b (1er grupo), los adenovirus AdNS3NS4 + AdNS5b + AdNS5a (2º grupo), los adenovirus AdNS3NS4 + AdNS5b +AdCE1E2 (3er grupo) y el adenovirus AdβGa1 (4º grupo), y
-la figura 7 proporciona el título de virus recombinante de la vacuna, que resulta del ensayo de prueba, en pfu/ml/mg ovario, para los 3 grupos de 8 ratones inmunizados por las diferentes combinaciones de adenovirus siguientes: AdNS3NS4NS5b (1er grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b (2º grupo) y AdβGa1 (3er grupo).
1. Adenovirus
Los adenovirus recombinantes se generan por transfección (CaPO3) de la línea de complementación 293 (Graham, Smiley, et al. 1977) después de la linealización de los genomas por Pacl. Los virus recombinantes se propagan y se amplifican en esta misma línea, y su purificación se realiza a partir de las células infectadas. Las células se recuperan por centrifugación (1.500 rpm, (revoluciones por minuto), 10 min.) y se lisan mediante 3 ciclos de congelación/descongelación. El lisado celular se clarifica mediante dos centrifugaciones (2.000 rpm, 10 min.;
8.000 rpm, 15 min.), y después se purifica mediante dos ultracentrifugaciones sucesivas. La primera se realiza en un gradiente de cloruro de cesio (densidad 1,4 y 1,25) a 30.000 rpm durante 1 hora. La segunda se realiza en un cojín de cloruro de cesio (densidad 1,34) a 35.000 rpm durante 18 horas. Las fases que contienen los viriones se extraen y se diluyen a la mitad en un tampón de sacarosa al 60%. Las suspensiones víricas se dializan entonces contra un tampón de formulación (para 10 litros: 3.423 g de sacarosa; 12,11 g de Tris; 2,033 g de MgCl2; 87,7 g de NaCl), y después se alicuotan. Su titulación se realiza mediante inmunofluorescencia indirecta sobre células 293 infectadas por diferentes diluciones víricas y marcadas por un anticuerpo específico de la DNA-Binding Protein adenovirale (α72K B6-8) (Reich, Sarnow, et al., 1983).
2. Preparación del adenovirus AdNS3NS4
Este adenovirus permite la expresión del gen que codifica para la poliproteína NS3/NS4 (SEC ID nº 1 y 2) bajo el control del promotor CMV.
2.1 Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4
Para ello, se han utilizado los oligonucleótidos siguientes:
oIV166: 5’-GGG GGG GCT ATG GCG CCT ATC ACG GCC TA-3’ (SEC ID nº 9)
oIV171: 5’-GGG GGG ACG CGT TTA GCA TGG CGT GGA GCA GT-3’ (SEC ID nº 10)
así como los agentes reactivos siguientes:
Taq DNA polimerasa, tampón PCR, MgCb 1,5 mM y dNTP 10 mM (Invitrogen).
Las condiciones de PCR han sido las siguientes:
5 minutos a 94ºC, y después
30 ciclos de la serie: 45 s a 94ºC, 45 s a 62ºC y 1 minuto a 72ºC, y después 10 minutos a 72ºC.
2.2 Inserción del fragmento de PCR NS3/NS4 en el plásmido de transferencia pTG13387 Se han realizado las etapas siguientes: -Digestión enzimática del plásmido pTG13387 (figura 1A, Transgène) por Nhel/Mlul (NheI, Invitrogen en React 4
Buffer y MluI, Invitrogen en React 3 Buffer) -Digestión enzimática del fragmento NS3/NS4 por NheI/MluI -Ligadura (T4 DNA Ligase (Invitrogen) en Reaction Buffer (Invitrogen)), -Transformación bacteriana (cepa 5K, Transgène) -Selección de los clones bacterianos en medio LB (Difco) + ampicilina (100 µg/ml, Duchefa) -Maxi-preparación plasmídica (Qiagen, según el protocolo del proveedor) de un clon positivo después del análisis
de restricción -Análisis de restricción: digestión mediante SmaI (Invitrogen en React 4 Buffer) y obtención de fragmentos de: 5450, 2164, 909, 214 y 180 pb -Obtención del plásmido pIV315 delecionado de su región E1 y que contiene la secuencia NS3/NS4 bajo el control del promotor CMV (figura 1B).
2.3 Recombinación homóloga con el genoma adenovírico completo delecionado de su región E3 contenida en el plásmido pTG6624 Se han realizado las etapas siguientes:
-Digestión enzimática del plásmido obtenido anteriormente pIV315 por PacI/PvuI(PacI en tampón NEB1, Biolabs y PvuI en React 7 Buffer, Invitrogen); aislamiento sobre gel de agarosa del fragmento que contiene el casete pCMV-NS3-NS4
- Digestión enzimática del plásmido pTG6624 (figura 1C) por ClaI (en React 1 Buffer, Invitrogen)
- Transformación bacteriana (cepa BJ, Transgène) para realizar la recombinación homóloga entre los dos
fragmentos plasmídicos
- Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 µg/ml)
- Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción
- Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 2263, 621, 3814, 214, 2164, 909, 180,
2463, 6480, 1398, 4456, 1455, 3540, 3386, 230 y 3685 pb -Obtención del genoma adenovírico completo Adenovirus AdNS3NS4, delecionado de sus regiones E3 y E1, habiendo sido esta última sustituida por el casete de expresión pCMV-NS3-NS4 (pIV317, figura 1D).
3. Preparación del adenovirus AdNS3NS4NS5b
Este adenovirus permite la expresión del gen que codifica para la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor CMV y la expresión del gen que codifica para el polipéptido NS5b bajo el control del promotor SV40.
3.1 Construcción del plásmido de transferencia que permite la clonación en la región E3 de adenovirus de una secuencia codificante bajo el control del promotor CMV Se han realizado las etapas siguientes: -Digestión enzimática del plásmido pTG4664 (figura 1E, Transgène) por BglII (en React 3 Buffer, Invitrogen) -Digestión enzimática del plásmido pTG13074 (figura 1F, Transgène) por BamHI/BglII (en React 3 Buffer, Invitrogen) -Ligadura (T4 DNA Ligase), transformación bacteriana (cepa 5K) -Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 µg/ml) -Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción -Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 4940, 1305 y 230 pb -Obtención del plásmido pIV267 (figura 1G) -Digestión del plásmido así obtenido pIV267 por Clal/MunI (en React 1 Buffer, Invitrogen) -Tratamiento por la DNA Polimerase I, Large (Klenow) Fragment (en React 2 Buffer, Invitrogen) -Ligadura (T4 DNA Ligase) -Transformación bacteriana (cepa 5K) -Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 µg/ml) -Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) -Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 4692, 1305 y 230 pb
- Obtención del plásmido pIV270, plásmido de transferencia que permite la clonación en la región E3 del adenovirus de una secuencia codificante bajo el control del promotor CMV (figura 1H).
3.2 Sustitución del promotor CMV por el promotor SV40 en plV270 Se han realizado las etapas siguientes: -Amplificación mediante PCR del fragmento nucleotídico que corresponde al promotor SV40, a partir del plásmido
comercial pcDNAHygro (Clonetech) gracias a los oligonucleótidos siguientes:
-oIV232: 5’-GGG GGG AGA TCT CCA GCA GGC AGA AGT ATG-3’ (SEC ID nº 11)
-oIV233: 5’-GGG GGG GTC GAC CGA AAA GGG ATA TAC AAG CTC-3’ (SEC ID nº 12)
y según el modo de realización descrito en el punto 2.1 anterior, excepto que se ha utilizado una temperatura de
58ºC en lugar de 62ºC. -Digestión enzimática de pIV270 por BglII/SalI (en React 10 Buffer, Invitrogen) -Digestión enzimática del fragmento de PCR por BglII/SalI -Ligadura (T4 DNA Ligase), transformación bacteriana (sepa 5K) -Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 µg/ml) -Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción -Análisis de restricción: digestión por SmaI y obtención de fragmentos de: 4692, 719, 80 y 230 pb -Obtención del plásmido pIV330, plásmido de transferencia que permite la clonación en la región E3 del
adenovirus de una secuencia codificante bajo el control del promotor SV40 (figura 1I).
3.3 Inserción del fragmento de PCR NS5b en el plásmido de transferencia plV330 Se han realizado las etapas siguientes: -Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína NS5b (SEC ID nº 3 y 4) gracias
a los oligonucleótidos siguientes:
-oIV212: 5’-GGG GGG TCT AGA ATG TCA ATG TCC TAC ACA TGG AC-3’ (SEC ID nº 13)
-oIV218: 5’-GGG GGG TCT AGA TTA CCG GTT GGG GAG CAG GT-3’ (SEC ID nº 14)
y según el modo de realización descrito en el punto 2.1 anterior, excepto que se ha utilizado una temperatura de
60ºC en lugar de 62ºC -Digestión enzimática del plásmido oIV330 obtenido anteriormente por XbaI (en React 2 Buffer, Invitrogen) -Digestión enzimática del fragmento de PCR por XbaI -Ligadura (T4 DNA Ligase), transformación bacteriana (cepa 5K) -Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 µg/ml) -Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción -Análisis de restricción: digestión por Smal y obtención de fragmentos de: 4692, 1505, 760, 719 y 230 pb -Obtención del plásmido pIV336, plásmido de transferencia en la deleción E3 que contiene la secuencia NS5b
bajo el control del promotor SV40 (figura 1J)
3.4 Recombinación homóloga con el genoma adenovírico recombinante plV317 para obtener el adenovirus del título
Se han realizado las etapas siguientes:
-Digestión del plásmido pIV317 obtenido en el punto 2.3 anterior por SrfI (en Universal Buffer, Stratagene)
-Digestión del plásmido pIV336 obtenido en el punto 3.3 por NheI/SacII (en BufferT, Amersham Pharmacia
Biotech) y aislamiento sobre gel de agarosa del fragmento que contiene el casete pSV40-NS5b -Transformación bacteriana (cepa BJ) para realizar la recombinación homóloga entre los dos fragmentos plasmídicos
-Selección de los clones bacterianos en medio LB + ampicilina (100 µg/ml)
-Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción
-Análisis de restricción: digestión por Smal y obtención de fragmentos de: 6480, 4456, 3814, 3540, 3386, 2739,
2463, 2263, 2164, 1455, 1398, 1105, 909, 760, 719, 621, 230, 214 y 180 pb
-Obtención del genoma adenovírico completo deseado, delecionado de la región E1, habiendo sido esta sustituida por el casete de expresión pCMV-NS3-NS4, y delecionado de la región E3, habiendo sido ésta sustituida por el casete de expresión pSV40-NS5B (plásmido pIV342, figura 1K)
4. Confirmación de la expresión de los antígenos insertados en los diferentes adenovirus
La expresión de los antígenos del VHC codificados por los adenovirus AdNS3NS4, AdNS5b y AdNS3NS4NS5b ha sido verificada mediante transferencia Western después de la infección de células Huh7. Tal como se esperaba, todos los antígenos han sido expresados.
- 1.
- Poxvirus MVA La cepa Modified Virus Ankara MVATG N33 ha sido suministrada por TRANSGENE S.A. (Estrasburgo, Francia).
- 2.
- Preparación del plásmido de transferencia que permite la expresión del gen NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r
2.1 Construcción del vector plV250 que contiene los brazos de recombinación BRG2 y BRD2 del MVA, así como el gen de selección GPT bajo el control del promotor ph5r (MVA) seguido de un segundo promotor ph5r para permitir la expresión del gen de interés
En este punto, se desea la inserción del fragmento ph5r-GPT-BRG3-ph5r (que procede del plásmido pTG9997, Transgène) en el plásmido pTG6018 (Transgène) que contiene los brazos de recombinación BRG2 y BRD2. Para ello, se han realizado las etapas siguientes: -Digestión enzimática por BamHI/SacI (en React 2 Buffer, Invitrogen) del vector pTG6018 (figura 2A) -Digestión enzimática por BamHI, y después digestión parcial por SacI del plásmido pTG9997 (figura 2B) -Purificación según el protocolo de QIAGEN del fragmento de restricción de 1047 pb que contiene la secuencia que codifica para el ph5r-GPT-BRG3-ph5r -Ligadura (T4 DNA Ligase), transformación bacteriana (cepa TG1, Statagene) -Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 µg/ml) -Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción (EcoRV+HindIII (en React 2 Buffer, Invitrogen): fragmentos de 246, 439, 476, 826 y 2789 pb; SacI: fragmentos de 915 y 3861 pb) -Obtención del plásmido previsto (pIV250, figura 2C).
2.2 Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4
Se han utilizado los oligonucleótidos siguientes:
oIV225: 5’-GGG GGG CTG CAG ATG GCG CCT ATC ACG GCC TA -3’ (SEC ID nº 15)
oIV226: 5’-GGG GGG TCT AGA TTA GCA TGG CGT GGA GCA GT -3’ (SEC ID nº 16) y según el modo de realización descrito en el ejemplo 1, punto 2.1 anterior, excepto que se ha utilizado una temperatura de 52ºC en lugar de 62ºC
2.3 Inserción del fragmento de PCR NS3-NS4 en el plásmido pIV250
Para ello, se han realizado las etapas siguientes:
-Digestión enzimática del plásmido pIV250 obtenido en el punto 2.1 anterior por PstI (en React 2 Buffer,
Invitrogen)/XbaI
-Digestión enzimática del fragmento PCR NS3/NS4 por PstI/XbaI
-Ligadura (T4 DNA Ligase), transformación bacteriana (cepa TG1)
-Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 µg/ml)
-Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción -(HindIII (en React 2
Buffer, Invitrogen): fragmentos de 4763 y 2789 pb; SphI (en React 6 Buffer, Invitrogen): 1534 y 5991 pb; NcoI (en React 3 Buffer, Invitrogen): 2764 y 4761 pb) -Obtención del plásmido de transferencia que contiene la secuencia que codifica para la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r (pIV327, figura 2D). 3 Preparación del plásmido pIV328 que permite la expresión de la proteína NS5b bajo el control del promotor p7,5
3.1 Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína NS5b
Se han utilizado los oligonucleótidos siguientes:
oIV227: 5’-GGG GGG GTC GAC ATG TCA ATG TCC TAC ACA TGG AC -3’ (SEC ID nº 17)
oIV228: 5’-GGG GGG GCA TGC TTA CCG GTT GGG GAG CAG GT -3’ (SEC ID nº 18)
y según el modo de realización descrito en el ejemplo 1, punto 2.1 anterior, excepto que se ha utilizado una
temperatura de 52ºC en lugar de 62ºC.
3.2 Obtención del plásmido
Se han realizado las etapas siguientes:
-Digestión enzimática del fragmento PCR que codifica para NS5b por SalI/SphI
-Digestión enzimática de pTG186 (figura 2E, Transgène) por SalI/SphI
-Desfosforilación del vector pTG186 (fosfatasa alcalina ROCHE)
-Ligadura (T4 DNA Ligase), transformación bacteriana (cepa TG1)
-Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 µg/ml)
-Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de un clon positivo después del análisis de restricción: (HindIII: fragmentos
de 1984, 2627 y 4437 pb; BglII: fragmentos de 321, 557, 1361, 1451, 2237 y 3121 pb; KpnI (en React 4 Buffer, Invitrogen): fragmentos de: 2787 y 6261 pb)
-Obtención del plásmido de transferencia que contiene la secuencia que codifica para el polipéptido NS5b bajo el
control del promotor p7.5 (pIV328, figura 2F)
4 Preparación de los plásmidos de transferencia pIV329 y pIV344 que permiten la expresión del gen que codifica
para la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r y del gen que codifica para la proteína NS5b bajo el
control del promotor p7.5
Para eso, se han realizado las etapas siguientes:
-Amplificación por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína NS5b a partir del plásmido pIV328 obtenido en el punto 3.2 anterior utilizando los oligonucleótidos siguientes: oIV229: 5’-GGG GGG TCT AGA CCG GTA GTT CGC ATA TAC ATA -3’ (SEC ID nº 19)
oIV218: 5’-GGG GGG TCT AGA TTA CCG GTT GGG GAG CAG GT-3’ (SEC ID nº 14)
y según el modo de realización descrito en el ejemplo 1, punto 2.1 anterior, excepto que se ha utilizado una
temperatura de 50ºC en lugar de 62ºC
-Digestión enzimática del fragmento de PCR por XbaI
-Digestión enzimática del plásmido pIV327 obtenido en el punto 2.3 anterior por XbaI
-Ligadura (T4 DNA Ligase), transformación bacteriana (cepa TG1)
-Selección de los clones bacterianos sobre ampicilina (100 µg/ml)
-Maxi-preparación plasmídica (Qiagen) de 2 clones positivos después del análisis de restricción: (PstI: pIV329: fragmentos de 3033 y 6466 pb, pIV344: 4641 y 4858 pb; ApaI (en React 4 Buffer, Invitrogen): pN329: 454, 960 y 8085 pb, pIV344: 454, 1418 y 7627 pb; NcoI: pIV329: 4269, 469 y 4761 pb, pIV344: 3053, 1685 y 4761 pb; SmaI: pIV329: 214, 2164, 1444 y 5677 pb, pIV344: 214, 2164, 928 y 6193 pb)
-Obtención o bien del plásmido de transferencia que permite la expresión de la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r y de la proteína NS5b bajo el control del promotor p75, estando los 2 casetes de expresión orientados en el mismo sentido (pIV329, figura 2G), o bien del plásmido de transferencia que permite la expresión de la poliproteína NS3/NS4 bajo el control del promotor ph5r y de la proteína NS5b bajo el control del promotor p7.5, estando los 2 casetes de expresión orientados en sentidos opuestos (pN344, figura 2H).
5. Confirmación de la expresión de los antígenos insertados en los diferentes poxvirus
Se ha verificado mediante transferencia Western, después de la infección de células Huh7 con los poxvirus en cuestión, que los poxvirus pIV329 y pIV344, que contienen las secuencias que codifican para la poliproteína NS3NS4 y el polipéptido NS5b, expresaban dichos antígenos del VHC.
1. Inmunización de los ratones
Se han inmunizado unos ratones transgénicos HLA-A2.1, una vez, mediante inyección intramuscular de por lo menos un adenovirus seleccionado de entre los adenovirus siguientes:
-AdNS3NS4 preparado en el ejemplo 1 anterior (punto 2.3),
-AdNS5b preparado en el ejemplo 1 anterior (punto 3.3),
-AdNS5a preparado según el modo de realización del ejemplo 1, punto 2, excepto que se han utilizado los cebadores nucleotídicos siguientes para amplificar la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5a (SEC ID nº 5 y 6):
oIV172: 5’-GGG GGG GGT ACC ATG TCC GGC TCG TGG CTA AGG-3’ (SEC ID nº 20),
oIV173: 5’-GGG GGG TCT AGA TTA GCA GCA GAC GAT GTC GTC-3’ (SEC ID nº 21),
que se ha sustituido en la PCR la temperatura de 62ºC por 56ºC, que la digestión enzimática de pTG13387 y del fragmento NS5a ha sido realizada por KpnI/XbaI, el análisis de restricción por digestión por SmaI de pTG13387 dando los fragmentos de 180 et 7251 pb y de pTG6624 dando los fragmentos de 2263, 621, 5615, 180, 2463, 6480, 1398, 4456, 1455, 3540, 3386, 230 y 3685 pb.
-AdCE1E2 según el modo de realización del ejemplo 1, punto 2, excepto que se han utilizado los cebadores nucleotídicos siguientes para amplificar la secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína Core-E1-E2 (también denominada CE1E2) (SEC ID nº 7 y 8):
oIV62: 5’-GGG GGG GCT AGC ATG AGC ACA AAT CCT AAA CCT-3’ (SEC ID nº 22)
oIV68: 5’-GGG GGG TCT AGA TCA GGC CTC AGC CTG GGC TAT-3’ (SEC ID nº 23),
que se ha sustituido en la PCR la temperatura de 62ºC por 56ºC, que la digestión enzimática de pTG13387 y del fragmento CE1E2 se ha realizado por NheI/XbaI, el análisis de restricción por digestión por SmaI de pTG13387 dando los fragmentos de 163, 435, 2270, 180 y 5254 pb y de pTG6624 dando los fragmentos de 2263, 621, 3618, 163, 435, 2270, 180, 2463, 6480, 1398, 4456, 1455, 3540, 3386, 230 y 3685 pb,
-AdNS3NS4NS5b preparado en el ejemplo 1 anterior (punto 3) y
-AdβGal (Transgène), según el protocolo siguiente:
-109 pfu de AdNS3NS4 o -109 pfu de AdNS5b o -109 pfu de AdCE1E2 o -109 pfu de AdNS3NS4 y 109 pfu de AdNS5b o -109 pfu de AdNS3NS4, 109 pfu de AdNS5b y 109 pfu de AdNS5a -109 pfu de AdNS3NS4, 109 pfu de AdNS5b y 109 pfu de AdCE1E2 -109 pfu AdNS3NS4NS5b o -109 pfu de Adβ-Gal a título de control.
Antes de la inmunización, se ha verificado, mediante transferencia Western, la expresión de los antígenos del VHC y de β-Gal por los diferentes adenovirus utilizados para la inmunización.
2. Ensayos CTL y ELISPOT
Quince días después de la inyección, se ha analizado la respuesta celular aislando las células del bazo (esplenocitos) de los ratones, y se ha realizado un ensayo CTL y un ensayo ELISPOT de esta forma:
Para el ensayo CTL, se han cultivado estos esplenocitos en placas de 24 pocillos en presencia de:
-5 µM del epítopo GLL (GLLGCIITSL, SEC ID nº 24) en el caso de los esplenocitos que proceden de ratones que han recibido AdNS3NS4, 5 µM del epítopo ALY (ALYDVVSTL, SEC ID nº 25) o 5 µM del epítopo KLQ (KLQDCTMLV, SEC ID nº 26) en el caso de los esplenocitos que proceden de ratones que han recibido AdNS5b
o de 5 µM del epítopo DLM (DLMGYIPLV, SEC ID nº 27) en el caso de los esplenocitos que proceden de ratones que han recibido AdCE1E2, estando estos epítopos en forma de péptido sintético (Eurogentex), y
-10 U de interleucina 2 recombinante murina (Brinster et al., Hepatology 2001) por ml en un medio mínimo esencial alfa (αMEM) durante 5 días. El 5º día, se ha realizado la etapa de reestimulación que consiste en añadir a los esplenocitos en cultivo unos esplenocitos de ratones sin tratamiento previo en presencia de dichos epítopos durante 2 días. El 7º día, se ha realizado el ensayo CTL en sí que consiste en poner en presencia los esplenocitos de ratones inmunizados después de los 7 días de cultivo (células efectoras) y unas células EL4 S3Rob HDD cargadas con 10 µM de dichos epítopos y marcadas con Cr51 (células diana). Se ha determinado la actividad citotóxica específica de las células efectoras mediante la medición, después de 4h de incubación con las células diana, del Cr51 liberado tras la lisis de las células dianas utilizando un aparato de recuento γ-Cobra II (Packard, Rungis, Francia). Se ha determinado la liberación espontánea y máxima a partir de pocillos que contienen un medio solo, o bien un tampón de lisis (HCl 1N). Se ha calculado el porcentaje específico de citotoxicidad mediante la fórmula:
(liberación en el ensayo -liberación espontánea)/(liberación máxima -liberación espontánea) X 100. Se ha determinado la lisis específica de epítopo por la diferencia entre el porcentaje de lisis específica obtenido en presencia o en ausencia de dichos epítopos.
Se ha realizado el ensayo ELISPOT cultivando los esplenocitos durante 48h en unas placas de 96 pocillos Multiscreen (Millipore) previamente "recubiertas" con un anticuerpo anti-interferón gamma (IFNγ) (10 µg/ml final). Se han cultivado los esplenocitos en presencia de 10 µM de los epítopos apropiados, tal como se ha indicado anteriormente, y de 10 U de interleucina 2 recombinante murina por ml en αMEM. Para el control positivo, se han cultivado los esplenocitos o bien en presencia de concanavalina A (5 µg/ml). Para el control negativo, se han cultivado los esplenocitos en presencia de un péptido no específico que pertenece a la proteína de cápside del VHC, de secuencia DLMGYIPLV (asimismo denominado péptido irrelevante), o bien en medio solo sin epítopo. Se han lavado los pocillos tres veces, respectivamente con PBS-Tween 0,05% y después PBS, operación seguida de una incubación de 2h con unos anticuerpos anti-IFNγ de ratón biotinilados. Después del lavado, se han incubado los pocillos durante 1h con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y se ha revelado la actividad enzimática mediante degradación del sustrato AEC (aminoetilcarbazol). Los puntos obtenidos han sido contados gracias a un lector ELISpot Zeiss (microscopio Zeiss acoplado al programa KS-ELISpot).
Los resultados están indicados en las figuras 3 a 5 en las que S corresponde a ratón y ratón neg corresponde al ratón control.
Estos resultados demuestran que
-el AdNS3NS4 induce realmente una respuesta con mediación celular específica de los antígenos expresados, tal como se ha ilustrado en las figuras 3A y 3B, mediante la detección de linfocitos T específicos del epítopo GLL contenido en NS3.
-El AdNS5b induce realmente una respuesta con mediación celular específica de los antígenos expresados, tal como se ha ilustrado en la figura 4, mediante la detección de linfocitos T específicos del epítopo ALY y KLQ contenidos en NS5b.
-El AdCE1E2 induce realmente una respuesta con mediación celular específica de los antígenos expresados, tal
como se ha ilustrado en la figura 5, mediante la detección de linfocitos T específicos del epítopo DLM contenidos
en la proteína Core.
3. Ensayo de prueba in vivo con la ayuda de un virus de vacuna recombinante
Con el fin de evaluar si las respuestas inmunes específicas inducidas por los diferentes adenovirus eran capaces de inducir una protección contra una prueba infecciosa ("protección in vivo"), se han sometido los ratones vacunados a dicha prueba.
Como el ratón no se puede infectar directamente por el VHC, se ha utilizado por lo tanto, para unir la inducción de una respuesta inmunitaria específica y la resistencia a una infección, un virus de vacuna recombinante (cepa WR) que codifica para las proteínas no estructurales del VHC (NS2 a NS5b) para realizar esta prueba. Este virus recombinante de la vacuna, después de una inyección intra-peritoneal de 107 pfu al ratón, se replicará en el animal. La replicación de este virus induce una respuesta inmunitaria al mismo tiempo específica de los antígenos de la vacuna y específica de los antígenos del VHC, tal como expresa asimismo las proteínas NS del VHC. Esta respuesta específica de los antígenos del VHC será aún más eficaz y vigorosa por cuanto que los ratones habrán recibido ya una vacuna que expresa los antígenos del VHC. En otras palabras, cuanto más eficaz (es decir que el sistema inmune de los ratones habrá sido "premiado" eficazmente por la vacuna) haya sido la vacunación (en el presente caso realizada con los adenovirus recombinantes), más fuerte será la respuesta anti-VHC generada después de la prueba por el virus recombinante de la vacuna y, en consecuencia, más "protegidos" estarán los ratones contra esta prueba. En la práctica, cuanto más bajo sea el porcentaje residual de virus de la vacuna en los ratones, más eficaz habrá sido la protección o la neutralización debida a la vacunación.
La neutralización del virus de la vacuna refleja al mismo tiempo la respuesta celular inducida por las proteínas del VHC y por las proteínas de la vacuna. La neutralización se evalúa mediante titulación del virus de vacuna residual a partir de los ovarios de los animales como sigue: los ovarios son extraídos 4 días después de la prueba, se sonican, se congelan-descongelan 3 veces y, después de la centrifugación, se titulan unas diluciones sucesivas de sobrenadante según la técnica de las zonas de lisis (Murata et al., PNAS, vol. 100, p. 6753-6758) sobre células Hutk-. Los títulos víricos son determinados en pfu/ml/mg de ovario.
4. Demostración de una protección superior de una vacunación que combina la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b
Se ha determinado el título de virus recombinante de la vacuna para 4 grupos de 8 ratones inmunizadas por las combinaciones de adenovirus siguientes: AdNS3NS4 + AdNS5b (1er grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b + AdNS5a (2º grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b +AdCE1E2 (3er grupo) y AdβGal (4º grupo).
Los resultados, indicados en la figura 6, son tratados de manera estadística basándose en el ensayo no paramétrico de Mann Whitney Wilcoxon (métodos estadísticos para uso de los médicos y de los biólogos, Collection Statistique en Biologie et en Médecine, Flammarion Medecine Sciences, (D. Schwartz), 1977) que se basa en una comparación de las medias, y permite la comparación de los valores de dos muestras x e y independientes.
Este ensayo se realiza como sigue: el conjunto de los valores de los dos grupos x e y a comparar se clasifica de manera creciente. Después, se atribuye un rango a cada valor, y se efectúa la suma de los rangos. Se obtiene entonces Wx y Wy. Se calcula entonces un valor de referencia denominado (Wx)t (valor teórico en la hipótesis nula en la que Wx no es diferente de Wy) y relacionado por la relación: n(N+1)/2, siendo n = número de ratones ensayados en el grupo x y N = número de ratones ensayados en los grupos x e y.
Si Wx es inferior a (Wx)t (porcentaje residual de virus de la vacuna en los ratones bajo) entonces se puede concluir que la neutralización debida a la vacunación es significativamente eficaz.
Si se considera el ejemplo del grupo AdNS3NS4S5b anotado x comparado con el grupo AdβGal anotado y, se obtienen los valores siguientes:
Wx = 1+2+4+6+8+11+13+14= 59 (8 ratones ensayados) Wy = 3+5+7+9+10+12+15+16= 77 (8 ratones ensayados)
Bajo la hipótesis nula, Wx no es diferente de Wy, y el valor esperado es: (Wx)t = (1/2)*8*17= 68.
Wx < (Wx)t, lo cual significa que los valores obtenidos en el grupo AdNS3NS4NS5b son menores que los obtenidos en el grupo AdβGal, y que la neutralización debida a la vacunación es significativamente eficaz.
Los valores estadísticos para los demás grupos de ratones se indican en la tabla 1 siguiente: Tabla 1
- Grupo/AdβGal
- Wx (Wx)t
- AdNS3NS4 + NS5b
- 52 68
- AdNS3NS4 + NS5b + NS5a
- 68 68
- AdNS3NS4 + NS5b + CE1E2
- 74 68
5 Los valores en la tabla 1 anterior muestran que sólo una vacunación de los ratones por la combinación de los adenovirus NS3NS4 y adenovirus NS5b es capaz de inducir una neutralización significativa de la replicación del virus de la vacuna utilizado en la prueba con respecto al grupo de ratones control vacunado por AdβGal. Las vacunaciones realizadas utilizando las combinaciones que comprenden (AdNS3NS4 + AdNS5b + AdNS5a) o
10 (AdNS3/NS4 + AdNS5b + AdCE1E2), no llegan a una diferencia significativa con respecto al grupo de ratones control inmunizado por AdβGal.
Estos resultados permiten por lo tanto demostrar, de manera inesperada, la protección superior de una vacunación que combina la poliproteína NS3NS4 y el polipéptido NS5b. 15
5. Confirmación de la protección de una vacunación que combina la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b expresados conjuntamente por un mismo vector
Se ha determinado el título de virus recombinante de la vacuna para 3 grupos de 8 ratones inmunizados por las 20 combinaciones de adenovirus siguientes: AdNS3NS4NS5b (1º grupo), AdNS3NS4 + AdNS5b (2º grupo) y AdβGal (3º grupo).
Los resultados, indicados en la figura 7, son tratados de manera estadística basándose en el ensayo no paramétrico de Mann Whitney Wilcoxon, tal como se ha descrito en el experimento anterior.
25 Los valores estadísticos para los grupos 1 y 2 comparados con el grupo control AdβGal se indican en la tabla 2 siguiente:
Tabla 2 30
- Grupo/AdβGal
- Wx (Wx)t
- AdNS3NS4NS5b
- 49 68
- AdNS3NS4 + NS5b
- 53 68
Los valores en la tabla 2 anterior muestran que la vacunación de los ratones por un adenovirus que codifica al mismo tiempo para los tres antígenos NS3, NS4 y NS5b, así como la combinación de los adenovirus NS3NS4 y adenovirus NS5b, es capaz de inducir una neutralización significativa de la replicación del virus de la vacuna
35 utilizado en la prueba con respecto al grupo de ratones control por el AdenoβGal. Este resultado confirma la protección de una vacunación que combina la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b expresados conjuntamente por un mismo vector.
<110> BIOMERIEUX INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE
<120> Composición que comprende la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias correspondientes y su uso en terapéutica
<130> ADENOVIR
<160> 27
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 2844
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica NS3NS4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2844)
<223>
<400> 1
<210> 2
<213> Secuencia artificial
<220>
- <223>
- secuencia que codifica NS3NS4 10
<400> 2
<210> 4
<213> Secuencia artificial
<220>
- <223>
- secuencia que codifica NS5b 10
<400> 4
<210> 6
<213> Secuencia artificial
<220>
- <223>
- secuencia que codifica NS5a 10
- <210> 3
- <211> 1779
- 5
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> secuencia que codifica NS5b
- 10
- <220>
- <221> CDS
- <222> (1)..(1779)
- <223>
- 15
- <400> 3
- <210> 5
- <211> 1344
- 5
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> secuencia que codifica NS5a
- 10
- <220>
- <221> CDS
- <222> (1)..(1344)
- <223>
- 15
- <400> 5
<400> 6
<210> 7
<211> 2241
<212> ADN
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica CE1E2
10 <220>
<221> CDS
<222> (1)..(2241)
<223>
15 <400> 7
<210> 8
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica CE1E2 10
<400> 8
<210> 9
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador oIV166
<400> 9 gggggggcta tggcgcctat cacggccta
<210> 10
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV171
<400> 10 ggggggacgc gtttagcatg gcgtggagca gt
<210> 11
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV232
<400> 11 ggggggagat ctccagcagg cagaagtatg
<210> 12
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV233
<400> 12 gggggggtcg accgaaaatg gatatacaag ctc
<210> 13
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV212
<400> 13 ggggggtcta gaatgtcaat gtcctacaca tggac
<210> 14
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV218
<400> 14 ggggggtcta gattaccggt tggggagcag gt
29
32
30
33
35
32
<210> 15
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV225
<400> 15
ggggggctgc agatggcgcc tatcacggcc ta
<210> 16
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV226
<400> 16
ggggggtcta gattagcatg gcgtggagca gt
<210> 17
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV227
<400> 17
gggggggtcg acatgtcaat gtcctacaca tggac
<210> 18
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV228
<400> 18
gggggggcat gcttaccggt tggggagcag gt
<210> 19
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador oIV229
<400> 19
ggggggtcta gaccggtagt tcgcatatac ata
<210> 20
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
32
32
35
32
33
- <220> <223> cebador oIV172
- <400> 20
- ggggggggta ccatgtccgg ctcgtggcta agg
- 33
- <210> 21 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> cebador oIV173
- <400> 21
- ggggggtcta gattagcagc agacgatgtc gtc
- 33
- <210> 22 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> cebador oIV62
- <400> 22
- gggggggcta gcatgagcac aaatcctaaa cct
- 33
- <210> 23 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> cebador oIV68
- <400> 23
- ggggggtcta gatcaggcct cagcctgggc tat
- 33
- <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial
- <220> <223> epítopo GLL
- <400> 24
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> epítopo ALY
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> epítopo KLQ
<400> 26
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> epítopo DLM
<400> 27
Claims (24)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Composición peptídica, caracterizada porque consiste en una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C.
-
- 2.
- Composición peptídica según la reivindicación 1, caracterizada porque NS3 y/o NS4 y/o NS5b proceden de virus de genotipos diferentes.
-
- 3.
- Composición peptídica según la reivindicación 1, caracterizada porque NS3, NS4 y NS5b proceden de un virus de igual genotipo, preferentemente de genotipo 1b.
-
- 4.
- Vector de expresión para la expresión de secuencias nucleotídicas del virus de la hepatitis C, caracterizado porque dichas secuencias nucleotídicas del virus de la hepatitis C están constituidas por una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, así como los medios necesarios para su expresión, estando dicha secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y dicha secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b en un único vector de expresión.
-
- 5.
- Vector de expresión según la reivindicación 4, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b proceden de virus de genotipos diferentes.
-
- 6.
- Vector de expresión según la reivindicación 4, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b proceden de un virus de igual genotipo, preferentemente el genotipo 1b.
-
- 7.
- Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque este vector es un plásmido, un vector vírico de tipo adenovirus, poxvirus, baculovirus, o un vector bacteriano de tipo salmonela, o BCG.
-
- 8.
- Vector de expresión según la reivindicación 7, caracterizado porque este vector es un adenovirus.
-
- 9.
- Vector de expresión según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho vector es un adenovirus humano, preferentemente el adenovirus 5.
-
- 10.
- Vector de expresión según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el genoma del adenovirus está modificado de manera que se sustituye la región E1 por el casete de expresión CMV-NS3-NS4 y se sustituye la región E3 por el casete de expresión SV40-NS5b.
-
- 11.
- Vector de expresión según la reivindicación 7, caracterizado porque este vector es un poxvirus.
-
- 12.
- Vector de expresión según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho poxvirus es un virus de la vacuna de la cepa Copenhagen o un virus de la vacuna modificado de Ankara.
-
- 13.
- Vector de expresión según la reivindicación 12, caracterizado porque presenta por lo menos una de las características siguientes, consideradas solas o en asociación:
i) el poxvirus es un virus MVAii) el poxvirus está en forma morfológica IMViii) el genoma del poxvirus está modificado de manera que se inserta el casete de expresión NS3/NS4 y se inserta el casete de expresión NS5b. -
- 14.
- Vector de expresión según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque el genoma del poxvirus está modificado de manera que se inserta el casete de expresión ph5r-NS3-NS4 y se inserta el casete de expresión p7.5-NS5b.
-
- 15.
- Microorganismo o célula hospedante transformados por un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14.
-
- 16.
- Utilización
- de una composición peptídica tal como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o bien- de un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, o bien-de un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC con un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, o bien- de las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b,correspondiendo dichas secuencias nucleotídicas a las secuencias contenidas en los vectores de expresión tales como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, dispuestas bajo el control de elementos necesarios para una expresión constitutiva y/o inducible de dichos péptidos,para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición, la prevención o el control de una infección provocada por el virus de la hepatitis C en un animal. -
- 17.
- Utilización según la reivindicación 16, caracterizada porque el medicamento está destinado a la inhibición, la prevención o el control de una infección provocada por el virus de la hepatitis C en el ser humano.
-
- 18.
- Composición farmacéutica, que comprende a título de sustancia activa la composición peptídica tal como la definida en las reivindicaciones 1 a 3, o bien un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, o bien un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC con un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, así como los medios necesarios para su expresión.
-
- 19.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque comprende asimismo un vehículo farmacéuticamente apropiado.
-
- 20.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque es apropiada para una administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica o transdérmica.
-
- 21.
- Kit farmacéutico, caracterizado porque comprende por lo menos un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC y por lo menos un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, así como los medios necesarios para su expresión.
-
- 22.
- Kit farmacéutico, caracterizado porque comprende un vector de expresión tal como el definido en una de las reivindicaciones 7 a 10, y un vector de expresión tal como el definido en una de las reivindicaciones 11 a 14.
-
- 23.
- Kit farmacéutico, que comprende un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, o bien un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC con un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, así como los medios necesarios para su expresión, y
- a.
- por lo menos una composición peptídica tal como la definida en las reivindicaciones 1 a 3, o
- b.
- por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC y para el polipéptido NS5b del VHC.
- 24. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o kit farmacéutico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizados porque se trata de una vacuna.
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