ES2362669T3 - Moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Molécula de unión que tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, caracterizada por que la molécula de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o una región variable de cadena pesada y ligera que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con las mismas y en la que uno o más aminoácidos están alterados en comparación con la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63 y que puede competir para unirse específicamente al virus de la rabia o a un fragmento del mismo con la molécula de unión que comprende la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63, y que todavía tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la medicina. En particular, la invención se refiere a moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia. Las moléculas de unión son útiles en la profilaxis tras la exposición de la rabia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rabia es una infección viral con distribución casi mundial que afecta principalmente a animales salvajes y domésticos pero que también implica a seres humanos, dando como resultado una encefalitis devastadora, letal de manera casi invariable. Anualmente, se estiman más de 70.000 víctimas mortales humanas, y millones de otras personas requieren tratamiento tras la exposición.

El virus de la rabia es un virus de ARN monocatenario, con envuelta, con forma de bala, clasificado en la familia de los Rhabdovirus y del género Lyssavirus. El genoma del virus de la rabia codifica para cinco proteínas virales: ARN polimerasa dependiente de ARN (L); una nucleoproteína (N); una proteína fosforilada (P); una proteína de matriz (M) ubicada en el lado interno de la envuelta proteica viral; y una glicoproteína de superficie externa (G).

La proteína G (62-67 KDa) es una glicoproteína de tipo I compuesta por 505 aminoácidos que tiene de dos a cuatro posibles sitios de N-glicosilación, de los cuales solamente uno o dos se glicosilan dependiendo de las cepas del virus. La proteína G forma los salientes que cubren la superficie externa de la envuelta del virión y se sabe que induce anticuerpos que neutralizan el virus.

La rabia puede tratarse o prevenirse mediante inmunizaciones tanto pasivas como activas. La profilaxis tras la exposición a la rabia incluye el cuidado inmediato de la herida local y la administración de inmunizaciones tanto pasivas (inmunoglobulinas anti-rabia) como activas (vacunas).

Actualmente, las inmunoglobulinas anti-rabia (RIG) se preparan a partir de las muestras de suero de o bien seres humanos inmunizados contra el virus de la rabia (HRIG) o bien caballos inmunizados contra el virus de la rabia (ERIG). Una desventaja de ERIG así como de HRIG es que no están disponibles en cantidades suficientes y, en el caso de HRIG, es demasiado cara. Además, el uso de ERIG puede conducir a reacciones adversas tales como choque anafiláctico. La posibilidad de contaminación por patógenos conocidos o desconocidos es un problema adicional asociado con HRIG. Para superar estas desventajas se ha sugerido usar anticuerpos monoclonales que pueden neutralizar el virus de la rabia en profilaxis tras la exposición. Los anticuerpos monoclonales murinos que neutralizan el virus de la rabia se conocen en la técnica (véase Schumacher et al., 1989). Sin embargo, el uso de anticuerpos murinos in vivo está limitado debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, tales como vida media en suero corta, una incapacidad para provocar ciertas funciones efectoras humanas y producción de una respuesta inmunitaria drástica no deseada contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción de “anticuerpo humano anti-ratón” (HAMA)).

Recientemente, se han descrito anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia (véase Dietzschold et al., 1990, Champion et al., 2000, y Hanlon et al., 2001). Para que los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia sean tan eficaces como HRIG en la profilaxis tras la exposición debe usarse una mezcla de anticuerpos monoclonales. En una mezcla de este tipo cada anticuerpo debe unirse a un epítopo o sitio diferente en el virus para prevenir el escape de variantes resistentes del virus.

Actualmente, todavía existe una necesidad significativa de nuevos anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia que tengan potencial profiláctico tras la exposición mejorado, particularmente anticuerpos que tengan diferentes especificidades de reconocimiento de epítopo. La presente invención proporciona tales anticuerpos monoclonales humanos que ofrecen la posibilidad de usarse en mezclas útiles en la profilaxis tras la exposición de una amplia variedad de virus de la rabia y variantes resistentes a la neutralización de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape E57. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 1A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia incluyendo el péptido señal. La figura 1B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 1 también están representadas por las SEQ ID No: 130-141.

La figura 2 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape EJB. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 2A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia incluyendo el péptido señal. La figura 2B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 2 también están representadas por las SEQ ID No: 142-151.

La figura 3 muestra el vector PDV-C06.

La figura 4 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo biotilinado anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con scFv respectivos antes de la adición de CR-57bio (0,5 g/ml). Posteriormente, se monitorizó la unión de CR-57bio en ausencia y presencia de scFv.

La figura 5 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con CR-57 (1 g/ml) antes de la adición de scFv en exceso. Posteriormente, se monitorizó la unión de svFv en ausencia y presencia de CR-57.

La figura 6 muestra un ensayo de ELISA de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubó proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a la proteína G antes de visualización por medio del estreptavidina-HRP. Las señales de ELISA se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 7 muestra un ensayo de FACS de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubaron células PER.C6 que expresan proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a las células que expresan la proteína G antes de visualización por medio de estreptavidina-PE. Las señales de FACS se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 8 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de virus de escape E98 y CVS-11. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestra la región que contiene una mutación puntual y la mutación se indica en negrita. La figura 8A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. El número por encima del nucleótido indica el nucleótido mutado (indicado en negrita) del marco de lectura abierto de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido señal. La figura 8B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. El número por encima del aminoácido indica el aminoácido mutado (indicado en negrita) de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido señal.

La figura 9 muestra un árbol filogenético de 123 virus naturales de la rabia (123 secuencias de glicoproteína G del virus de la rabia, método de Kimura con 2 parámetros de unión al vecino “neighbor joining”, 500 cebadores). La negrita indica los virus que alojan la mutación N>D tal como se observa en los virus de escape E98.

La figura 10 muestra epítopos neutralizantes sobre la glicoproteína de la rabia. Se muestra una representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia que representa los sitos antigénicos incluyendo el epítopo de CR57 novedoso. El péptido señal (19 aminoácidos) y el dominio transmembrana se indican mediante recuadros negros. Se indican los puentes disulfuro. La numeración de los aminoácidos es desde la proteína madura menos la secuencia del péptido señal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A continuación en el presente documento siguen definiciones de términos tal como se usan en la invención.

DEFINICIONES

Molécula de unión

Tal como se usa en el presente documento la expresión “molécula de unión” se refiere a una inmunoglobulina intacta incluyendo anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta para la unión específica a la pareja de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo el virus de la rabia o un fragmento del mismo tal como por ejemplo la proteína G. Independientemente de la estructura el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que reconoce la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 35 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión.

La expresión “molécula de unión”, tal como se usa en el presente documento incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos monocatenarios de fagos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al (poli)péptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o pueden obtenerse genéticamente mediante técnicas de ADN recombinante. Los métodos de producción se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow y D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes.

La molécula de unión puede ser una molécula de unión desnuda o no conjugada, pero también puede formar parte de un inmunoconjugado. Una molécula de unión desnuda o no conjugada pretende referirse a una molécula de unión que no está conjugada, operativamente unida o asociada física o funcionalmente de otro modo con un marcador o resto efector, tal como, entre otros, una sustancia tóxica, una sustancia radiactiva, un liposoma, una enzima. Se entenderá que moléculas de unión desnudas o no conjugadas no excluyen moléculas de unión que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o manipulado de cualquier otra forma, distinto de mediante la unión de un marcador o resto efector. En consecuencia, en el presente documento están incluidas todas las moléculas de unión desnudas y no conjugadas modificadas tras la traducción, incluyendo cuando las modificaciones se realizan en el entorno de la célula que produce la molécula de unión natural, mediante una célula que produce la molécula de unión recombinante y se introducen manualmente tras la preparación de la molécula de unión inicial. Naturalmente, la expresión molécula de unión desnuda o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de unión para formar asociaciones funcionales con moléculas y/o células efectoras tras la administración al organismo, ya que algunas de tales interacciones son necesarias con el fin de ejercer un efecto biológico. Por tanto, la falta de marcador o grupo efector asociado se aplica en la definición a la molécula de unión desnuda o no conjugada in vitro, no in vivo.

Regiones determinantes de la complementariedad (CDR)

La expresión “regiones determinantes de la complementariedad” tal como se usa en el presente documento significa secuencias dentro de las regiones variables de las moléculas de unión, tales como las inmunoglobulinas, que habitualmente contribuyen en gran medida al sitio de unión al antígeno que es complementario en forma y distribución de carga al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas para epítopos lineales, epítopos discontinuos o epítopos conformaciones de proteínas o fragmentos de proteínas, o bien tal como se presentan en la proteína en su conformación nativa, o bien en algunos casos, tal como se presentan en las proteínas cuando se desnaturalizan, por ejemplo, mediante solubilización en SDS. Los epítopos también pueden consistir en modificaciones postraduccionales de las proteínas.

Variante funcional

La expresión “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de unión que comprende un nucleótido y/o secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más nucleótidos y/o aminoácidos en comparación con las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de la molécula de unión original y que todavía puede competir por la unión a la pareja de unión, por ejemplo el virus de la rabia o un fragmento del mismo, con la molécula de unión original. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la molécula de unión original no afectan ni alteran significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, la molécula de unión todavía puede reconocer y unirse a su diana. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencia conservativas incluyendo sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR aleatoria, y pueden comprender nucleótidos y aminoácidos naturales así como no naturales.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se sustituye con un residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas o estructurales similares. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano). Resultará claro para el experto que también pueden emplearse otras clasificaciones de familias de residuos de aminoácidos aparte de la usada anteriormente. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservativas, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas o estructurales diferentes. Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Puede encontrarse una orientación en la determinación de qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad inmunológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica.

Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una única alteración realizada en un locus (una mutación puntual), tal como mutaciones por transición o transversión, o alternativamente, pueden insertarse, delecionarse o cambiarse múltiples nucleótidos en un único locus. Además, pueden realizarse una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica.

Huésped

El término “huésped”, tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un microorganismo o una célula en el que se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El microorganismo o célula puede ser procariota o eucariota. Debe entenderse que este término pretende referirse no sólo al microorganismo o célula objeto particular, sino también a la progenie de tal microorganismo o célula. Puesto que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido o bien a mutación o bien a influencias medioambientales, puede que de hecho tal progenie no sea idéntica al microorganismo o célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance de la expresión “huésped” tal como se usa en el presente documento.

Humano

El término “humano”, cuando se aplica a moléculas de unión tal como se definen en el presente documento, se refiere a moléculas que o bien se derivan directamente de un ser humano o bien están basadas en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión se deriva de o está basada en una secuencia humana y posteriormente se modifica, todavía debe considerarse humana tal como se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva. En otras palabras, el término humano, cuando se aplica a moléculas de unión pretende incluir moléculas de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana basadas en regiones variables o constantes ya se produzcan o no en un ser humano o linfocito humano o en forma modificada. Por tanto, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, comprender sustituciones y/o deleciones (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante por ejemplo mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). “Basado en” tal como se usa en el presente documento se refiere a la situación en la que puede copiarse exactamente una secuencia de ácido nucleico a partir de un molde, o con mutaciones menores, tal como mediante métodos de PCR propensos a errores, u obtenerse sintéticamente apareando el molde exactamente o con modificaciones menores. Las moléculas semisintéticas basadas en secuencias humanas también se consideran humanas tal como se usa en el presente documento.

Anticuerpo monoclonal

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única, es decir estructura primaria, es decir que tiene una secuencia de aminoácidos única. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad y afinidad de unión únicas por un epítopo particular. En consecuencia, la expresión “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo que presenta una especificidad de unión única que tiene regiones variables y constantes derivadas de o basadas en secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana o derivadas de secuencias completamente sintéticas. El método de preparación del anticuerpo monoclonal no es relevante.

Molécula de ácido nucleico

La expresión “molécula de ácido nucleico” tal como se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye tanto cadenas sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico, y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido

o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. La expresión también incluye formas mono y bicatenarias de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir cualquiera o tanto nucleótidos que se producen de manera natural como modificados unidos entre sí mediante enlaces de nucleótidos que se producen de manera natural y/o que no se producen de manera natural. Las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse de manera química o bioquímica o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, tal como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de manera natural con un análogo, modificaciones entre nucleótidos tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), moléculas de intercalación (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). La expresión anterior también pretende incluir cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones monocatenarias, bicatenarias, de dúplex parcial, triples, de horquilla, circulares y de candado. También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada a través de puentes de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces fosfato se sustituyen por enlaces peptídicos en la estructura principal de la molécula. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico engloba a su complemento a menos que se especifique otra cosa. Por tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular engloba a su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. La cadena complementaria también es útil, por ejemplo, para terapia antisentido, sondas de hibridación y cebadores de PCR.

Excipiente farmacéuticamente aceptable

Por “excipiente farmacéuticamente aceptable” se quiere decir cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa tal como un fármaco, agente, o molécula de unión para preparar una forma farmacéutica adecuada

o conveniente. El “excipiente farmacéuticamente aceptable” es un excipiente que no es tóxico, o al menos cuya toxicidad es aceptable para su uso deseado, para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y que es compatible con otros componentes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de unión.

Profilaxis tras la exposición

La “profilaxis tras la exposición” (PEP) se indica para personas posiblemente expuestas a un animal con rabia. Las posibles exposiciones incluyen exposición a mordedura (es decir, cualquier penetración de la piel por los dientes) incluyendo mordeduras de animales, y exposición sin mordedura. Las exposiciones sin mordedura incluyen exposición a grandes cantidades de virus de la rabia pulverizado en laboratorios o cuevas y receptores quirúrgicos de córneas trasplantadas de pacientes que murieron por la rabia. La contaminación de heridas abiertas, abrasiones, membranas mucosas, o teóricamente, arañazos, con saliva u otro material potencialmente infeccioso (tal como tejido nervioso) de un animal con rabia también constituye una exposición sin mordedura. Otro contacto por sí mismo, tal como acariciar a un animal con rabia y el contacto con sangre, orina o heces de un animal con rabia, no constituye una exposición y no es una indicación para profilaxis. PEP debe comenzar lo antes posible tras una exposición. Si no se ha producido exposición, no es necesaria la profilaxis tras la exposición. En todos los regímenes de profilaxis tras la exposición, excepto para personas previamente inmunizadas, deben usarse simultáneamente inmunizaciones activas y pasivas.

Unión específica

La expresión “unión específica”, tal como se usa en el presente documento, en referencia a la interacción de una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, y su pareja de unión, por ejemplo un antígeno, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular, por ejemplo un determinante antigénico o epítopo, en la pareja de unión. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferiblemente la pareja de unión incluso cuando la pareja de unión está presente en una mezcla de otras moléculas o microorganismos. La unión puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o por una combinación de ambas. En otras palabras, la expresión “unión específica” significa unión inmunoespecífica a un antígeno o a un fragmento del mismo y unión no inmunoespecífica a otros antígenos. Una molécula de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con afinidad menor tal como se determina mediante, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno pueden reaccionar de manera cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no reaccionan de manera cruzada con otros antígenos.

Cantidad terapéuticamente eficaz

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de la molécula de unión tal como se define en el presente documento que es eficaz para la profilaxis tras la exposición de la rabia.

Vector

El término “vector” indica una molécula de ácido nucleico en la que puede insertarse una segunda molécula de ácido nucleico para su introducción en un huésped en el que se replicará, y en algunos casos se expresará. En otras palabras, un vector puede transportar una molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. El término “vector”, tal como se usa en el presente documento contempla vectores de clonación así como de expresión. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levaduras (YAC) y vectores derivados de bacteriófagos o virus de plantas o animales (incluyendo del ser humano). Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el huésped propuesto y en caso de los vectores de expresión, un promotor y otras regiones reguladoras reconocidas por el huésped. Un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico se introduce en una célula por ejemplo mediante transformación, transfección, o haciendo uso de mecanismos de entrada bacterianos o virales. Se conocen otras formas de introducir ácido nucleico en las células, tales como electroporación o bombardeo con partículas a menudo usadas con células vegetales, y similares. El método de introducir ácido nucleico en las células depende entre otras cosas del tipo de células, etc. Esto no es crítico para la invención. Ciertos vectores pueden realizar replicación autónoma en un huésped en el que se introducen (por ejemplo, los vectores que tienen un origen de replicación bacteriano pueden replicarse en bacterias). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de un huésped al introducirse en el huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona moléculas de unión que pueden unirse específicamente a, y neutralizar, virus de la rabia. Además, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican para al menos la región de unión de esas moléculas de unión. La invención proporciona además el uso de las moléculas de unión de la invención en la profilaxis tras la exposición de un sujeto en riesgo de desarrollar una condición que resulta del virus de la rabia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención engloba moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia, comprendiendo la molécula de unión una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o una región variable de cadena pesada y ligera que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con las mismas y en la que uno o más aminoácidos están alterados en comparación con la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63 y que puede competir para unirse específicamente al virus de la rabia o a un fragmento del mismo con la molécula de unión que comprende la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63, y que todavía tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención también tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención son moléculas de unión humanas. Alternativamente, también pueden ser moléculas de unión de otros animales. El virus de la rabia pertenece al género Lyssavirus. En total, al género Lyssavirus incluye once genotipos: virus de la rabia (genotipo 1), virus del murciélago de Lagos (genotipo 2), virus Mokola (genotipo 3), virus Duvenhage (genotipo 4), Lyssavirus del murciélago europeo 1 (genotipo 5), Lyssavirus del murciélago europeo 2 (genotipo 6), Lyssavirus del murciélago australiano (genotipo 7), virus Aravan (genotipo 8), virus Khujand (genotipo 9), virus Irkut (genotipo 10) y virus caucásico del oeste (genotipo 11). Además de unirse al virus de la rabia, las moléculas de unión de la invención también pueden ser capaces de unirse a otros genotipos del género Lyssavirus. Preferiblemente, las moléculas de unión también pueden ser capaces de neutralizar otros genotipos del género Lyssavirus. Además, las moléculas de unión de la invención pueden incluso ser capaces de unirse a y/o neutralizar virus, distintos de Lyssavirus, de la familia de Rhabdovirus. Esta familia incluye los géneros cytorhabdovirus, ephemerovirus, lyssavirus, nucleorhabdovirus, rhabdovirus y vesiculovirus.

Las moléculas de unión pueden ser capaces de unirse específicamente al virus de la rabia en su forma natural o en su forma inactivada/atenuada. La inactivación del virus de la rabia puede realizarse mediante tratamiento con, entre otros, beta-propiolactona (BPL) (White y Chappel, 1982), calentamiento a 56ºC durante más de 30 minutos, irradiación gamma, tratamiento con acetiletilenimina o etilenimina o tratamiento con ácido ascórbico y sulfato de cobre durante 72 horas (Madhusudana et al., 2004). También pueden usarse métodos de inactivación viral general conocidos por el experto tales como, entre otros, pasteurización (calentamiento en húmedo), tratamiento térmico en seco, tratamiento térmico por vapor, tratamiento con pH bajo, tratamiento con disolvente orgánico/detergente, nanofiltración; irradiación con luz UV. Preferiblemente, la inactivación se realiza mediante tratamiento con betapropiolactona (BPL). El experto en la técnica conoce bien métodos para someter a prueba si el virus de la rabia todavía es infectivo o está parcial o completamente inactivado y pueden encontrarse, entre otros, en Laboratory techniques in rabies, editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, Capítulo 36, Organización Mundial de la Salud, Ginebra.

Las moléculas de unión también pueden ser capaces de unirse específicamente a uno o más fragmentos del virus de la rabia tales como, entre otros, una preparación de una o más proteínas y/o (poli)péptidos derivados del virus de la rabia o una célula transfectada con una proteína y/o (poli)péptido del virus de la rabia. Para los métodos de tratamiento y/o prevención tales como métodos para la profilaxis tras la exposición del virus de la rabia, las moléculas de unión preferiblemente pueden unirse específicamente a proteínas accesibles de superficie del virus de la rabia tales como la proteína M (véase Ameyama et al. 2003) o G. Para fines de diagnóstico, las moléculas de unión humanas también pueden ser capaces de unirse específicamente a proteínas no presentes sobre la superficie del virus de la rabia. La secuencia de aminoácidos de las proteínas de superficie accesibles e internas de diversas cepas conocidas del virus de la rabia puede encontrarse en la base de datos EMBL y/o en otras bases de datos.

Preferiblemente, el fragmento comprende al menos un determinante antigénico reconocido por las moléculas de unión humanas de la invención. Un “determinante antigénico” tal como se usa en el presente documento es un resto tal como un (poli)péptido, (glico)proteína, o análogo o fragmento de los mismos del virus de la rabia, que puede unirse a una molécula de unión humana de la invención con afinidad suficientemente alta para formar un complejo antígeno-molécula de unión detectable.

Las moléculas de unión según la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intacta tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, en particular anticuerpos monoclonales humanos, o las moléculas de unión pueden ser fragmentos de unión a antígeno incluyendo, pero sin limitarse a, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos monocatenarios de fagos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al virus de la rabia o fragmento del mismo. Las moléculas de unión de la invención pueden usarse de forma aislada o no aislada. Además, las moléculas de unión de la invención pueden usarse solas o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión humana (o variante o fragmento del mismo). En otras palabras, las moléculas de unión pueden usarse en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de unión, variantes o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, las moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia pueden combinarse en una terapia única para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado.

Los virus de ARN tales como el virus de la rabia hacen uso de su propia ARN polimerasa durante la replicación del virus. Estas ARN polimerasas tienden a ser propensas a cometer errores. Esto conduce a la formación de las denominadas cuasiespecies durante una infección viral. Cada cuasiespecie tiene un genoma de ARN único, que podría dar como resultado diferencias en la composición de aminoácidos de las proteínas virales. Si se producen tales mutaciones en las proteínas virales estructurales, el virus podría escapar potencialmente del sistema inmunitario del huésped debido a un cambio en los epítopos de las células T o B. La posibilidad de que esto ocurra es superior cuando los individuos se tratan con una mezcla de dos moléculas de unión, tales como anticuerpos monoclonales humanos, que cuando se tratan con una mezcla de anticuerpos policlonales (HRIG). Por tanto, un requisito previo para una mezcla de dos anticuerpos monoclonales humanos para el tratamiento de la rabia es que los dos anticuerpos reconozcan epítopos no solapantes, no competitivos en su antígeno diana, es decir, la glicoproteína del virus de la rabia. De este modo se minimiza la posibilidad de que se produzcan virus de escape de la rabia. Como consecuencia, las moléculas de unión de la invención pueden reaccionar preferiblemente con diferentes epítopos no solapantes, no competitivos del virus de la rabia, tales como epítopos en la proteína G del virus de la rabia. La mezcla de moléculas de unión puede comprender además al menos otro agente terapéutico tal como un medicamento adecuado para la profilaxis tras la exposición de la rabia.

Normalmente, las moléculas de unión según la invención pueden unirse a sus parejas de unión, es decir al virus de la rabia o a fragmentos del mismo tales como proteínas del virus de la rabia, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es inferior a 0,2*10-4 M, 1,0*10-5 M, 1,0*10-6 M, 1,0*10-7 M, preferiblemente inferior a 1,0*10-8 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-9 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-10 M, incluso más preferiblemente inferior a 1,0*10-11 M, y en particular inferior a 1,0*10*-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para los isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión con afinidad de un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1,0*10-7 M. Las constantes de afinidad pueden medirse por ejemplo usando resonancia de plasmón superficial, es decir, un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).

Las moléculas de unión según la invención pueden unirse al virus de la rabia en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada. Las moléculas de unión pueden unirse al virus de la rabia en forma soluble tal como por ejemplo en una muestra o pueden unirse al virus de la rabia unidas o asociadas a un portador o sustrato, por ejemplo, placas de microtitulación, membranas y perlas, etc. Los portadores o sustratos pueden estar compuestos por vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, o teflón, etc. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Alternativamente, las moléculas de unión también pueden unirse a fragmentos del virus de la rabia tales como proteínas o (poli)péptidos del virus de la rabia. En una realización, las moléculas de unión pueden unirse específicamente a la proteína G del virus de la rabia o a un fragmento de la misma. Las proteínas o (poli)péptidos del virus de la rabia o bien pueden estar en forma soluble o bien pueden unirse al virus de la rabia unido o asociado a un portador o sustrato tal como se describió anteriormente. En otra realización, pueden usarse células transfectadas con la proteína G como pareja de unión para las moléculas de unión.

Según la invención, las moléculas de unión de la invención neutralizan la infectividad del virus de la rabia. Esto puede lograrse evitando la unión del virus de la rabia a sus receptores en células huésped, tales como, entre otros, el receptor de neurotrofina p75 murino, la molécula de adhesión celular neuronal (CD56) y el receptor de acetilcolina,

o la inhibición de la liberación del ARN en el citoplasma de la célula o evitando la transcripción o traducción del ARN. En una realización específica, las moléculas de unión de la invención evitan que el virus de la rabia infecte las células huésped en al menos el 99%, al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 45%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 35%, al menos el 30%, al menos el 25%, al menos el 20%, o al menos el 10% con respecto a la infección de las células huésped por el virus de la rabia en ausencia de dichas moléculas de unión. La neutralización puede medirse por ejemplo tal como se describe en Laboratory techniques in rabies, editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, Capítulos 15-17, Organización Mundial de la Salud, Ginebra. Además, las moléculas de unión humanas de la invención pueden moléculas de unión de fijación al complemento que pueden ayudar en la lisis del virus de la rabia con envuelta. Las moléculas de unión humanas de la invención también podrían actuar como opsoninas y aumentar la fagocitosis del virus de la rabia o bien potenciando su captación a través de receptores de Fc o C3b o bien aglutinando el virus de la rabia para hacer que se fagocite más fácilmente.

Se dan a conocer moléculas de unión que comprenden al menos una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. En una realización la región CDR3 es una región CDR3 de cadena pesada.

También se dan a conocer moléculas de unión que comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49. En una realización preferida, las moléculas de unión según la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 335.

También se dan a conocer moléculas de unión que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En una realización preferida, las moléculas de unión humanas según la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 335 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 337.

En una realización preferida, las moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia de la invención se administran en formato de IgG, preferiblemente en formato de IgG1.

Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de moléculas de unión tal como se definen en el presente documento. Las moléculas se consideran variantes funcionales de una molécula de unión según la invención, si las variantes pueden competir por la unión específica al virus de la rabia o a un fragmento del mismo con las moléculas de unión originales. En otras palabras, cuando las variantes funcionales todavía pueden unirse al virus de la rabia o a un fragmento del mismo. Las variantes funcionales también deben tener todavía actividad neutralizante contra el virus de la rabia. Las variantes funcionales incluyen, pero no se limitan a, derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural primaria, pero que contienen por ejemplo modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión original. Tales modificaciones incluyen entre otras, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gammacarboxilación, glicosilación, formación de GPI, hidroxilación, yodación, mutilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tales como arginilación, ubiquitinación, y similares.

Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión tal como se define en la presente invención que comprenden una secuencia de aminoácidos que contiene sustituciones, inserciones, deleciones o combinaciones de los mismos de uno o más aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión originales. Además, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera o ambos extremos amino o carboxilo terminales. Las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión iguales o diferentes, o bien superiores o bien inferiores, en comparación con la molécula de unión original pero que todavía pueden unirse al virus de la rabia o a un fragmento del mismo y que todavía pueden neutralizar el virus de la rabia. Por ejemplo, las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión aumentadas o disminuidas por el virus de la rabia o por un fragmento del mismo en comparación con las moléculas de unión originales o pueden tener una actividad neutralizante superior o inferior contra el virus de la rabia. Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, incluyendo, pero sin limitarse a, regiones de entramado, regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3, están modificadas. En general, las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y regiones más conservadas, las denominadas regiones de entramado (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácidos de CDR y residuos de aminoácidos de bucles hipervariables. Las variantes funcionales que se pretende que se encuentren dentro del alcance de la presente invención tienen al menos de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 99%, preferiblemente al menos de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 99%, más preferiblemente al menos de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 99%, incluso más preferiblemente al menos de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 99%, lo más preferiblemente al menos de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 99%, en particular al menos de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99%, y en particular al menos de aproximadamente el 97% a aproximadamente el 99% de homología de secuencia de aminoácidos con las moléculas de unión originales tal como se definen en el presente documento. Pueden usarse algoritmos informáticos tales como, entre otros, Gap o Bestfit conocidos por un experto en la técnica para alinear de manera óptima las secuencias de aminoácidos que van a compararse y definir residuos de aminoácidos similares o idénticos.

En otra realización, pueden producirse variantes funcionales cuando la molécula de unión original comprende un sitio de glicosilación en si secuencia que da como resultado la glicosilación de la molécula de unión con la expresión en células eucariotas y por tanto podría detener la unión al antígeno. La variante funcional producida ya no contiene el sitio de glicosilación, pero puede unirse al virus de la rabia y todavía tiene actividad neutralizante.

Las variantes funcionales pueden obtenerse alterando las moléculas de unión originales o partes de las mismas mediante métodos de biología molecular generales conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos y mutagénesis dirigida al sitio. Además, las variantes funcionales pueden tener actividad de fijación al complemento, poder ayudar en la lisis de virus de la rabia con envuelta y/o actuar como opsoninas y aumentar la fagocitosis del virus de la rabia o bien potenciando su captación a través de los receptores de Fc o C3b o bien aglutinando el virus de la rabia para hacer que se fagocite más fácilmente.

Todavía en un aspecto adicional, la invención incluye inmunoconjugados, es decir moléculas que comprenden al menos una molécula de unión o variante funcional de la misma tal como se define en el presente documento y que comprende además al menos un marcador, tal como, entre otros, un resto/agente detectable. También se contemplan en la presente invención mezclas de inmunoconjugados según la invención o mezclas de al menos un inmunoconjugado según la invención y otra molécula, tal como un agente terapéutico u otra molécula de unión o inmunoconjugado. En una realización adicional, los inmunoconjugados de la invención pueden comprender uno o más marcadores. Estos marcadores pueden ser iguales o distintos entre sí y pueden unirse/conjugarse de manera no covalente a las moléculas de unión. El/los marcador(es) también puede(n) unirse/conjugarse directamente a las moléculas de unión mediante unión covalente, incluyendo, pero sin limitarse a, puentes disulfuro, puentes de hidrógeno, unión electrostática, fusión recombinante y unión conformacional. Alternativamente, el/los marcador(es) puede(n) unirse/conjugarse a las moléculas de unión por medio de uno o más compuestos de unión. El experto conoce bien las técnicas para conjugar marcadores a moléculas de unión.

Los marcadores de los inmunoconjugados de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, pero preferiblemente son restos/agentes detectables. Los Inmunoconjugados que comprenden un agente detectable pueden usarse en diagnóstico para, por ejemplo, evaluar si un sujeto se ha infectado con el virus de la rabia o para monitorizar el desarrollo o la evolución de una infección por el virus de la rabia como parte de un procedimiento de pruebas clínicas para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Sin embargo, también pueden usarse para otros fines de detección y/o analíticos y/o diagnósticos. Los restos/agentes detectables incluyen, pero no se limitan a, enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.

Los marcadores usados para marcar las moléculas de unión para fines de detección y/o analíticos y/o diagnósticos dependen de las técnicas de detección/análisis/diagnóstico específicas y/o de los métodos usados tales como, entre otros, tinción inmunohistoquímica de muestras (titulares), detección por citometría de flujo, detección citométrica con láser de barrido, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), bioensayos (por ejemplo, ensayos de neutralización), aplicaciones de inmunotransferencia de tipo Western, etc. Para la tinción inmunohistoquímica de muestras titulares los marcadores preferidos son enzimas que catalizan la producción y la deposición local de un producto detectable. Se conocen bien las enzimas normalmente conjugadas con moléculas de unión para permitir su visualización inmunohistoquímica e incluyen, pero no se limitan a, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano, y ureasa. El experto en la técnica también conoce bien los sustratos típicos para la producción y deposición de productos visualmente detectables. Además de eso, los inmunoconjugados de la invención pueden marcarse usando oro coloidal o pueden marcarse con radioisótopos, tales como 33P, 32P, 35S, 3H, e 125I. Las moléculas de unión de la invención pueden unirse a radionúclidos directa o indirectamente a través de un agente quelante mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Cuando las moléculas de unión de la presente invención se usan para detecciones por citometría de flujo, detecciones citométricas con láser de barrido, o inmunoensayos fluorescentes, pueden marcarse de manera útil con fluoróforos. El experto conoce una amplia variedad de fluoróforos útiles para marcar de manera fluorescente las moléculas de unión de la presente invención. Cuando las moléculas de unión de la presente invención se usan para detección secundaria usando avidina, estreptavidina, captavidina o neutravidina marcadas, las moléculas de unión pueden marcarse con biotina para formar complejos de grupo protésico adecuados.

Cuando los inmunoconjugados de la invención se usan para uso diagnóstico in vivo, las moléculas de unión también pueden hacerse detectables mediante conjugación con por ejemplo agentes de contraste para obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), tales como gadolinio-ácido dietilentriaminopentaacético, con agentes de contraste para ultrasonidos o con agentes de contraste para rayos X, o para marcaje radioisotópico.

Además, las moléculas de unión, variantes funcionales de las mismas o inmunoconjugados de la invención también pueden unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos in vitro o para la purificación del virus de la rabia o de un fragmento del mismo. Tales soportes sólidos podrían ser porosos o no porosos, planos y no planos e incluyen, pero no se limitan a, soportes de vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Las moléculas de unión humanas también pueden conjugarse, por ejemplo, de manera útil con medios de filtración, tales como Sepharose activada por NHS o Sepharose activada por CNB para fines de cromatografía de inmunoafinidad. También pueden unirse de manera útil a microesferas paramagnéticas, normalmente mediante la interacción biotina-estreptavidina. Las microesferas pueden usarse para el aislamiento del virus de la rabia o de un fragmento del mismo de una muestra que contiene el virus de la rabia o un fragmento del mismo. Como otro ejemplo, las moléculas de unión humanas de la presente invención pueden unirse de manera útil a la superficie de una placa de microtitulación para ELISA.

Las moléculas de unión de la presente invención o variantes funcionales de las mismas pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el marcador de hexa-histidina, el marcador de hemaglutinina (HA), el marcador myc o el marcador flag.

Alternativamente, un anticuerpo pueden conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo. En otro aspecto, las moléculas de unión humanas de la invención pueden conjugarse/unirse a uno o más antígenos. Preferiblemente, estos antígenos son antígenos que se reconocen por el sistema inmunitario de un sujeto al que se administra el conjugado de molécula de unión-antígeno. Los antígenos pueden ser idénticos pero también pueden diferir entre sí. Los métodos de conjugación para unir los antígenos y las moléculas de unión se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de reticulación. Las moléculas de unión humanas se unirán al virus de la rabia y los antígenos unidos a las moléculas de unión humanas iniciarán un ataque de células T potente sobre el conjugado que finalmente conducirá a la destrucción del virus de la rabia.

Además de la producción de inmunoconjugados de manera química mediante conjugación, directa o directamente a través de por ejemplo un ligador, los inmunoconjugados pueden producirse como proteínas de fusión que comprenden las moléculas de unión humanas de la invención y un marcador adecuado. Las proteínas de fusión pueden producirse mediante métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, de manera recombinante construyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas de unión humanas en marco con secuencias de nucleótidos que codifican para el/los marcador(es) adecuado(s) y luego expresando las moléculas de ácido nucleico.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula de unión o variante funcional de la misma según la invención. Tales moléculas de ácido nucleico pueden usarse como productos intermedios para fines de clonación, por ejemplo en el proceso de maduración por afinidad descrito anteriormente. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico se aíslan o se purifican.

El experto apreciará que también se pretende que las variantes funcionales de estas moléculas de ácido nucleico sean una parte de la presente invención. Las variantes funcionales son secuencias de ácidos nucleico que pueden traducirse directamente, usando el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de las moléculas de ácido nucleico originales.

Se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de unión que comprenden una región CDR3, preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de unión humanas que comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49. En una realización particularmente preferida, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 335.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión humanas que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 335 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 337.

Se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena pesada variable de las moléculas de unión de la invención que comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 97. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena pesada variable de las moléculas de unión de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1-357 de SEQ ID NO: 334.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena ligera variable de las moléculas de unión de la invención que comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena ligera variable de las moléculas de unión humanas de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1-321 de SEQ ID NO: 336.

Otro aspecto de la invención es proporcionar vectores, es decir, constructos de ácido nucleico, que comprenden una

o más moléculas de ácido nucleico según la presente invención. Los vectores pueden derivarse de plásmidos tales como, entre otros, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cósmidos; fagos tales como lambda, lambdoide, M13, Mu, P1, P22, Qβ, T-even, T-odd, T2, T4, T7, etc; virus de plantas tales como, entre otros, el virus del mosaico de la alfalfa, bromovirus, capillovirus, carlavirus, carmovirus, caulivirus, clostervirus, comovirus, cryptovirus, cucumovirus, dianthovirus, fabavirus, fijivirus, furovirus, geminivirus, hordeivirus, ilarvirus, luteovirus, machlovirus, marafivirus, necrovirus, nepovirus, phytoreovirus, rhabdovirus de plantas, potexvirus, potyvirus, sobemovirus, tenuivirus, tobamovirus, tobravirus, virus del bronceado del tomate, tombusvirus, tymovirus, etc; o virus de animales tales como, entre otros, adenovirus, arenaviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, calciviridae, cardiovirus, coronaviridae, corticoviridae, cystoviridae, virus Epstein-Barr, enterovirus, filoviridae, flaviviridae, virus de la glosopeda, hepadnaviridae, virus de la hepatitis, herpesviridae, virus de inmunodeficiencia, virus influenza, inoviridae, iridoviridae, orthomyxoviridae, papovavirus, paramyxoviridae, parvoviridae, picornaviridae, poliovirus, polydnaviridae, poxviridae, reoviridae, retrovirus, rhabdoviridae, rhinovirus, virus del bosque Semliki, tetraviridae, togaviridae, toroviridae, virus vaccinia, virus de la estomatitis vesicular, etc. Los vectores pueden usarse para la clonación y/o para la expresión de las moléculas de unión humanas de la invención y pueden incluso usarse para fines de terapia génica. La presente invención también cubre vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico según la invención unidas operativamente a una o más moléculas de ácido nucleico que regulan la expresión. La elección del vector depende de los procedimientos recombinantes seguidos y del huésped usado. La introducción de vectores en células huésped puede realizarse, entre otros, mediante transfección con fosfato de calcio, infección con virus, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección con lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden replicarse de manera autónoma o pueden replicarse junto con el cromosoma en el que se han integrado. Preferiblemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células huésped de elección, aunque esto no es crítico para la invención tal como conocen bien los expertos en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), el gen de la dihidrofolato reductasa de ratón (dhfr). La invención también cubre vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente unidas operativamente a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas o péptidos que pueden usarse para aislar las moléculas de unión. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-Stransferasa, proteína de unión a maltosa, polihistidina de unión a metales, proteína fluorescente verde, luciferasa y beta-galactosidasa.

Un objeto adicional de la presente invención son huéspedes que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente. Preferiblemente, los huéspedes son células huésped. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen mamífero, vegetal, de insecto, fúngico o bacteriano. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias Gram positivas tales como varias especies de los géneros Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus o células de bacterias Gram negativas tales como varias especies de los géneros Escherichia, tales como E. coli, y Pseudomonas. En el grupo de las células fúngicas, preferiblemente se usan células de levadura. La expresión en levaduras puede lograrse usando cepas de levadura tales como entre otras Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha. Además, pueden usarse como células huésped células de insecto tales como células de Drosophila y Sf9. Además de esto, las células huésped pueden ser células vegetales. Las plantas o células vegetales transformadas (transgénicas) se producen mediante métodos conocidos, por ejemplo, transferencia génica mediada por Agrobacterium, transformación de discos de las hojas, transformación de protoplastos mediante transferencia de ADN inducida por polietilenglicol, electroporación, sonicación, microinyección o transferencia génica balística. Adicionalmente, un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus En la presente invención se prefieren sistemas de expresión que usan células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK o células de melanoma de Bowes. Las células de mamífero proporcionan proteínas expresadas con modificaciones tras la traducción que son muy similares a las moléculas naturales de origen mamífero. Puesto que la presente invención trata de moléculas que pueden tener que administrarse a seres humanos, un sistema de expresión completamente humano sería particularmente preferido. Por tanto, incluso más preferiblemente, las células huésped son células humanas. Ejemplos de células humanas son, entre otras, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. Células de mamífero preferidas son células de retina humana tales como células 911 o la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de esta solicitud “PER.C6” se refiere a células depositadas con el número 96022940 o ancestros, pasos hacia delante o hacia atrás así como descendientes de ancestros de células depositadas, sí como derivados de cualquiera de los anteriores.

En realizaciones preferidas, las células productoras humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región E1 de adenovirus en formato que puede expresarse. En realizaciones incluso más preferidas, dichas células huésped se derivan de una retina humana y están inmortalizadas con ácidos nucleicos que comprenden secuencias E1 adenovirales, tales como la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). La producción de proteínas recombinantes en células huésped puede realizarse según métodos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas con la marca PER.C6® como plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en el documento WO 00/63403.

Un método de producción de una molécula de unión o una variante funcional según la invención es una parte adicional de la invención. El método comprende las etapas de a) cultivar un huésped según la invención en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de unión o variante funcional de la misma, y b) opcionalmente recuperar la molécula de unión o variante funcional de la misma expresadas. Las moléculas de unión

o variantes funcionales de las mismas expresadas pueden recuperarse del extracto libre de células, pero preferiblemente se recuperan del medio de cultivo. El experto en la técnica conoce bien métodos para recuperar proteínas, tales como moléculas de unión, a partir de extractos libres de células o medio de cultivo. Las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas tal como pueden obtenerse mediante el método descrito anteriormente también son una parte de la presente invención.

Alternativamente, además de la expresión en huéspedes, tales como células huésped, las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas de la invención pueden producirse de manera sintética mediante sintetizadores peptídicos convencionales o en sistemas de traducción libres de células usando ácido nucleico de ARN derivado de moléculas de ADN según la invención. La molécula de unión o variantes funcionales de la misma tal como pueden obtenerse mediante los métodos de producción sintéticos o sistemas de traducción libres de células descritos anteriormente también son una parte de la presente invención

En otra realización, las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas según la presente invención pueden generarse mediante mamíferos no humanos transgénicos, tales como por ejemplo ratones o conejos transgénicos, que expresan genes de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, los mamíferos no humanos transgénicos tienen un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana que codifican para todas o una parte de las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente. Los mamíferos no humanos transgénicos pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida del virus de la rabia o un fragmento del mismo. Los protocolos para inmunizar mamíferos no humanos están bien establecidos en la técnica. Véase Using Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Current Protocols in Immunology, editado por: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nueva York.

En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de unión, al menos una variante funcional o un fragmento de la misma, al menos un inmunoconjugado según la invención o una combinación de los mismos. Las composiciones pueden comprender además, entre otros, moléculas de estabilización, tales como albúmina o polietilenglicol, o sales. Preferiblemente, las sales usadas son sales que conservan la actividad biológica deseada de las moléculas de unión humanas y no confieren ningún efecto toxicológico no deseado. Si es necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden recubrirse con un material para protegerlas de la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de unión.

Todavía en un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprende al menos una molécula de ácido nucleico tal como se define en la presente invención. Las composiciones pueden comprender disoluciones acuosas tales como disoluciones acuosas que contienen sales (por ejemplo, NaCl o sales tal como se describió anteriormente), detergentes (por ejemplo, SDS) y/u otros componentes adecuados.

Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula de unión según la invención, al menos una variante funcional o fragmento de la misma, al menos un inmunoconjugado según la invención, al menos una composición según la invención, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica de la invención comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización preferida, la composición farmacéutica según la invención comprende al menos una molécula de unión adicional, es decir la composición farmacéutica puede ser un cóctel/mezcla de moléculas de unión. La composición farmacéutica puede comprender al menos dos moléculas de unión según la invención o al menos una molécula de unión según la invención y al menos una molécula de de unión anti-virus de la rabia adicional. Dicha molécula de unión adicional comprende preferiblemente una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. La molécula de unión que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 puede ser un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o un fragmento funcional del mismo, pero preferiblemente es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento funcional del mismo. En una realización, la molécula de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 273. En otra realización, la molécula de unión comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 275. Aún en otra realización, la molécula de unión comprende una cadena pesada y ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 125, respectivamente. Las moléculas de unión en la composición farmacéutica deben poder reaccionar con diferentes epítopos no competitivos del virus de la rabia. Los epítopos pueden estar presentes en la proteína G del virus de la rabia y pueden ser epítopos no solapantes diferentes. Las moléculas de unión deben ser de alta afinidad y deben tener una amplia especificidad. Preferiblemente, neutralizan tantas cepas fijas y naturales del virus de la rabia como sea posible. Incluso más preferiblemente, también muestran actividad neutralizante hacia otros genotipos del género Lyssavirus o incluso con otros virus de la familia de rhabdovirus, mientras que no muestran reactividad cruzada con otros virus o con proteínas celulares normales. Preferiblemente, la molécula de unión puede neutralizar variantes de escape de la otra molécula de unión en el cóctel.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia, preferiblemente moléculas de unión (humanas) según la invención, caracterizada porque las moléculas de unión pueden reaccionar con epítopos no competitivos diferentes del virus de la rabia. En una realización, la composición farmacéutica comprende una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede reaccionar con un epítopo ubicado en el sitio antigénico I del proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede reaccionar con un epítopo ubicado en el sitio antigénico III de la proteína G del virus de la rabia. La estructura antigénica de la glicoproteína de la rabia se definió inicialmente por Lafon et al. (1983). Los sitios antigénicos se identificaron usando un panel de Acm de ratón y sus respectivas variantes del virus resistentes a Acm. Desde entonces, los sitios antigénicos se han mapeado mediante la identificación de mutaciones de aminoácidos en la glicoproteína de variantes resistentes a Acm (véase Seif et al., 1985; Prehaud et al., 1988; y Benmansour et al., 1991). La mayoría de los Acm que neutralizan la rabia se dirigen contra el sitio antigénico II (véase Benmansour et al., 1991), que es un epítopo conformacional discontinuo que comprende los aminoácidos 34-42 y los aminoácidos 198-200 (véase Prehaud et al., 1988). El sitio antigénico III es un epítopo conformacional continuo en los aminoácidos 330-338 y alberga dos residuos cargados, K330 y R333, que afectan a la patogenicidad viral (véase Seif et al., 1985; Coulon et al., 1998; y Dietzschold et al., 1983). El sitio antigénico conformacional I se definió mediante sólo un Acm, 509-6, y se ubicó en el aminoácido 231 (véase Benmansour et al., 1991; y Lafon et al., 1983). Se sabe que el sitio antigénico IV alberga epítopos lineales solapantes (véase Tordo, 1996; Bunschoten et al., 1989; Luo et al., 1997; y Ni et al.,

1995). Benmansour et al. (1991) también describieron la presencia de un sitio menor ubicado en la posición 342343, que es distinto del sitio antigénico III pese a su proximidad cercana. El alineamiento del epítopo CR-57 con los epítopos neutralizantes conformacionales y lineales conocidos en la actualidad en la glicoproteína de la rabia (figura 10) reveló que el epítopo CR-57 está ubicado en la misma región que el sitio antigénico conformacional I, definido mediante el Acm 509-6 único. Basándose en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la glicoproteína de los virus de escape de CR04-098, el epítopo reconocido por este anticuerpo parece estar ubicado en la misma región que el sitio antigénico conformacional continuo III.

Se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que comprende al menos una región CDR3, preferiblemente la región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que comprende al menos una región CDR3, preferiblemente la región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22. Preferiblemente, la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende al menos una región CDR3, preferiblemente la región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Preferiblemente, la primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende una cadena pesada y ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 125, respectivamente, y la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende una cadena pesada y ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 335 y SEQ ID NO: 337, respectivamente. Preferiblemente, la cadena pesada y ligera de la primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia están codificadas por SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 124, respectivamente, y la cadena pesada y ligera de la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia están codificadas por SEQ ID NO: 334 y SEQ ID NO: 336, respectivamente.

Una composición farmacéutica que comprende dos moléculas de unión, en la que el pI de las moléculas de unión es divergente puede representar un problema cuando se escoge un tampón adecuado que estabilice de manera óptima ambas moléculas de unión. Cuando se ajusta el pH del tampón de la composición de manera que aumenta la estabilidad de una molécula de unión, esto podría disminuir la estabilidad de la otra molécula de unión. La disminución de la estabilidad o incluso la inestabilidad de una molécula de unión puede conducir a su precipitación o agregación o a su degradación espontánea dando como resultado la pérdida de la funcionalidad de la molécula de unión. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de unión, preferiblemente moléculas de unión humanas, caracterizada porque las moléculas de unión tienen puntos isoeléctricos (pI) que difieren en menos de aproximadamente 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, preferiblemente en menos de (e incluyendo) 0,25 unidades de pI entre sí. El pI puede medirse de manera experimental, por ejemplo por medio de enfoque isoeléctrico, o puede calcularse basándose en la secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión. En una realización, las moléculas de unión son moléculas de unión según la presente invención y la composición farmacéutica es una composición farmacéutica según la invención. Preferiblemente, las moléculas de unión son anticuerpos monoclonales, por ejemplo anticuerpos monoclonales humanos tales como anticuerpos IgG1. Preferiblemente, las moléculas de unión pueden unirse a y/o neutralizar un agente infeccioso, por ejemplo un virus, una bacteria, una levadura, un hongo o un parásito. En una realización, las moléculas de unión pueden unirse a y/o neutralizar un lyssavirus, por ejemplo el virus de la rabia. En una realización específica ambas moléculas de unión tienen un pI calculado que está en el intervalo de entre 8,0-9,5, preferiblemente 8,1-9,2, más preferiblemente 8,2-8,5. Preferiblemente, las moléculas de unión tienen la región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 25, respectivamente.

En otra realización, la invención proporciona un cóctel de dos o más moléculas de unión humanas o de otros animales, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, en el que al menos una molécula de unión se deriva de un anticuerpo de fagos u otra técnica de presentación en paquetes replicables y al menos una molécula de unión puede obtenerse mediante una técnica de hibridoma. Cuando se usan técnicas divergentes, la selección de las moléculas de unión que tienen un pI compatible también es muy útil para obtener una composición en la que cada molécula de unión es suficientemente estable para el almacenamiento, manejo y posterior uso.

En otra realización, las moléculas de unión presentes en la composición farmacéutica de la invención aumentan la actividad neutralizante unas de otras, es decir, actúan sinérgicamente cuando se combinan En otras palabras, las composiciones farmacéuticas pueden mostrar actividad neutralizante sinérgica contra virus de la rabia, e incluso contra lyssavirus. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “sinérgica” significa que el efecto combinado de las moléculas de unión cuando se usan en combinación es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan individualmente. Los intervalos y razones de los componentes de las composiciones farmacéuticas de la invención deben determinarse basándose en sus potencias individuales y deben someterse a prueba en ensayos de neutralización in vitro o en modelos animales tales como hámsteres

Además, la composición farmacéutica según la invención puede comprender al menos otro agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico. Dichos agentes terapéuticos y/o profilácticos adicionales pueden ser agentes antivirales tales como ribavirina o interferón-alfa.

Las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención pueden someterse a prueba en sistemas de modelos animales adecuados antes de su uso en seres humanos. Tales sistemas de modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, hámsteres, monos, etc.

Normalmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de unión humanas, variantes o fragmentos de las mismas, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en forma de polvo para su reconstitución en el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el momento de la administración. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución que se ha sometido previamente a esterilización por filtración de la misma.

Alternativamente, las moléculas de unión, variantes o fragmentos de las mismas, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en disolución y puede añadirse y/o mezclarse el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el momento de la administración para proporcionar una forma farmacéutica inyectable unitaria. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es adecuado para una alta concentración de fármaco, puede mantener la fluidez apropiada y, si es necesario, puede retrasar la absorción.

La elección de la vía de administración óptima de las composiciones farmacéuticas estará influida por varios factores incluyendo las propiedades físico-químicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones plasmáticas de las moléculas activas con respecto al efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, si es necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden prepararse con vehículos que las protegerán frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse, entre otros, polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de unión humanas con, o coadministrar las moléculas de unión con, un material o compuesto que evita la inactivación de las moléculas de unión humanas. Por ejemplo, las moléculas de unión humanas pueden administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente.

Las vías de administración pueden dividirse en general en dos categorías principales, administración oral y parenteral. La administración preferida de las moléculas de unión humanas y las composiciones farmacéuticas de la invención es en y alrededor de la herida y por vía intramuscular en la región glútea. Las formulaciones de las moléculas de unión humanas y las composiciones farmacéuticas dependen de las vías de administración.

En un aspecto adicional, las moléculas de unión, variantes funcionales, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse como un medicamento. Por tanto, un método de tratamiento y/o prevención de una infección por lyssavirus que usa las moléculas de unión humanas, variantes funcionales, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención es otra parte de la presente invención. El lyssavirus puede ser un virus de cualquiera de los genotipos conocidos, pero preferiblemente es el virus de la rabia. Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden usarse en la profilaxis tal la exposición de la rabia.

Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden emplearse junto con otras moléculas útiles en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento del virus de la rabia. Pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las moléculas de unión humanas, variantes funcionales, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse conjuntamente con una vacuna frente a la rabia. Alternativamente, la vacuna también puede administrarse antes o después de la administración de las moléculas o composiciones de la invención. La administración de las moléculas o composiciones de la invención con una vacuna es adecuada para la profilaxis tras la exposición. Las vacunas de la rabia incluyen, pero no se limitan a, vacuna de células embrionarias de pollo purificadas (PCEC) (RabAvert), vacuna de células diploides humanas (HDCV; vacuna Imovax) o vacuna para la rabia adsorbida (RVA).

Las moléculas se formulan normalmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz o eficaz para diagnóstico. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Un intervalo de dosificación adecuado puede ser por ejemplo de 0,1-100 UI/kg de peso corporal, preferiblemente 1,0-50 UI/kg de peso corporal y más preferiblemente 10-30 UI/kg de peso corporal, tal como 20 UI/kg de peso corporal.

Preferiblemente, se administra un único bolo de las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención. Las moléculas y composiciones farmacéuticas según la presente invención son preferiblemente estériles. En la técnica se conocen bien métodos para hacer que estas moléculas y composiciones sean estériles. El régimen de dosificación de profilaxis tras la exposición es la administración de cinco dosis de vacuna para la rabia por vía intramuscular en el músculo deltoides en los días 0, 3, 7, 14 y 28 tras la exposición en individuos no inmunizados previamente frente al virus de la rabia. Las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas según la invención deben administrarse en y alrededor de las heridas en el día 0 o de lo contrario lo antes posible tras la exposición, administrándose el resto del volumen por vía intramuscular en un sitio distante de la vacuna. Se aconseja a los individuos no vacunados que se administren moléculas de unión humanas anti-virus de la rabia, pero queda claro que también pueden administrarse moléculas de unión humanas anti-virus de la rabia al experto en la técnica que vacunó a los individuos que necesitaban tal tratamiento.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas, inmunoconjugados según la invención, moléculas de ácido nucleico según la invención, composiciones o composiciones farmacéuticas según la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, la profilaxis, el tratamiento, o combinación de los mismos, de un estado resultante de una infección por un lyssavirus. El lyssavirus puede ser un virus de cualquiera de los genotipos conocidos pero es preferiblemente virus de la rabia. Preferiblemente las moléculas mencionadas anteriormente se usan en la preparación de un medicamento para la profilaxis tras la exposición de la rabia.

A continuación, kits que comprenden al menos una molécula de unión según la invención, al menos una variante funcional de la misma según la invención, al menos un inmunoconjugado según la invención, al menos una molécula de ácido nucleico según la invención, al menos una composición según la invención, al menos una composición farmacéutica según la invención, al menos un vector según la invención, al menos un huésped según la invención o una combinación de los mismos también son parte de la presente invención. Opcionalmente, los componentes descritos anteriormente de los kits de la invención se envasan en recipientes adecuados y se etiquetan para el diagnóstico, profilaxis y/o el tratamiento de los estados indicados. Los componentes mencionados anteriormente pueden almacenarse en recipientes unitarios o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas, viales, botellas, jeringuillas y tubos de ensayo, como disolución acuosa, preferiblemente estéril, o como formulación liofilizada, preferiblemente estéril, para la reconstitución. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico y pueden tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El kit puede comprender además más recipientes que comprenden un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, medio de cultivo para uno o más de los huéspedes adecuados. Asociadas con los kits, puede haber instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico, que contienen información sobre, por ejemplo, las indicaciones, uso, dosificación, fabricación, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.

Actualmente, se usan productos de HRIG para la profilaxis tras la exposición de la rabia. Una dosis de adulto de HRIG de 1500 UI (individuo de 75 kg, 20 UI/kg) sólo está disponible en un volumen de 10 ml. No son posibles productos de HRIG más concentrados ya que la dosis de 10 ml que puede obtenerse actualmente contiene 11,5 gramos de IgG total. A la vista de lo mismo, los productos de HRIG actuales tienen dos inconvenientes. En primer lugar, con frecuencia no resulta anatómicamente viable administrar la dosis completa recomendada en y alrededor de las heridas de mordedura, y en segundo lugar la administración de la dosis de volumen actual de HRIG está asociada con un dolor significativo. La presente invención proporciona una solución a estos inconvenientes ya que proporciona una composición farmacéutica que comprende una dosis de adulto completa en un volumen de aproximadamente 2 ml o inferior, si es deseable. Una composición farmacéutica de este tipo puede comprender por ejemplo dos moléculas de unión que pueden neutralizar al virus de la rabia, preferiblemente CR57 y CR04-098. La composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable y tiene un volumen de alrededor de 2 ml. También es posible más, pero es menos deseable a la vista del dolor asociado con la inyección de volúmenes mayores. También es posible menos de 2 ml. La composición farmacéutica comprende la dosis de adulto completa (en UI) necesaria para la profilaxis tras la exposición satisfactoria. En una realización la composición farmacéutica se almacena en un vial de 10 ml tal como por ejemplo un vial listo para su uso de 10 ml (vidrio de tipo I) con un tapón. Al proporcionar un vial de 10 ml se proporciona la opción de diluir la composición farmacéutica hacia un volumen superior en caso de que un individuo presente un área superficial de herida grande. La invención también proporciona un kit que comprende al menos un recipiente (tal como a vial) que comprende la composición farmacéutica. El kit puede comprender además un segundo recipiente que contiene un diluyente adecuado para diluir la composición farmacéutica hacia un volumen superior. Diluyentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, el excipiente farmacéuticamente aceptable de la composición farmacéutica y una solución salina. Además, el kit puede comprender instrucciones para diluir la composición farmacéutica y/o instrucciones para administrar la composición farmacéutica, diluida o no.

Las moléculas de unión de la invención pueden usarse para identificar epítopos de proteínas de virus de la rabia tales como la proteína G. Los epítopos pueden ser lineales, pero también estructurales y/o conformacionales. En una realización, la unión de moléculas de unión de la invención a una serie de péptidos solapantes, tales como péptidos de 15 meros, de una proteína de virus de la rabia tales como la proteína G de virus de la rabia puede analizarse por medio de análisis de PEPSCAN (véase entre otros los documentos WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al. 1996). Puede someterse a prueba la unión de moléculas de unión humanas a cada péptido en un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) basado en PEPSCAN. En otra realización, puede examinarse una biblioteca de péptidos al azar que comprende péptidos de proteínas de virus de la rabia para seleccionar péptidos que pueden unirse a las moléculas de unión humanas de la invención. En los ensayos anteriores, el uso de moléculas de unión humanas neutralizantes del virus de la rabia puede identificar uno o más epítopos neutralizantes.

Los péptidos/epítopos encontrados pueden usarse como vacunas y para el diagnóstico de la rabia.

Además se da a conocer una molécula de unión tal como se define en el presente documento que tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, caracterizada porque la molécula de unión humana comprende al menos una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 25 y caracterizada además porque la molécula de unión humana tiene una actividad neutralizante contra el virus de la rabia de al menos 2500 UI/mg de proteína. Más preferiblemente, dicha molécula de unión humana tiene una actividad neutralizante contra el virus de la rabia de al menos 2800 UI/mg de proteína, al menos 3000 UI/mg de proteína, al menos 3200 UI/mg de proteína, al menos 3400 UI/mg de proteína, al menos 3600 UI/mg de proteína, al menos 3800 UI/mg de proteína, al menos 4000 UI/mg de proteína, al menos 4200 UI/mg de proteína, al menos 4400 UI/mg de proteína, al menos 4600 UI/mg de proteína, al menos 4800 UI/mg de proteína, al menos 5000 UI/mg de proteína, al menos 5200 UI/mg de proteína, al menos 5400 UI/mg de proteína. La actividad neutralizante de la molécula de unión se midió mediante un ensayo de neutralización in vitro (RFFIT (prueba de inhibición con foco fluorescente rápida) modificada). El ensayo se describe en detalle en la sección de ejemplos a continuación.

En una realización la molécula de unión comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 273. En otra realización la molécula de unión comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 123. La cadena ligera variable de la molécula de unión puede comprender la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 275. La cadena ligera de la molécula de unión puede comprender la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 125.

También se da a conocer una molécula de ácido nucleico que codifica para las moléculas de unión tal como se describieron anteriormente. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 122. Además la molécula de ácido nucleico también puede comprender la secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 124. En el presente documento también se proporcionan un vector que comprende las moléculas de ácido nucleico y una célula huésped que comprende un vector de este tipo. Preferiblemente, la célula huésped es una célula de mamífero tal como una célula humana. Ejemplos de células adecuadas para la producción de moléculas de unión humanas son, entre otras, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. Células de mamífero preferidas son células de retina humanas tales como células 911 o la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de esta solicitud, “PER.C6” se refiere a células depositadas con el número 96022940 o ancestros, pasos hacia delante o hacia atrás así como descendientes de ancestros de células depositadas, así como derivados de cualquiera de los anteriores.

EJEMPLOS

Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos. No se pretende que los ejemplos limiten el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1

Reconocimiento de epítopo de anticuerpos humanos CR-57 y CR-JB anti-rabia

Para tratar si los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR-JB reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, se generaron virus de escape de los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR-JB. CR-57 y CR-JB se generaron esencialmente tal como se describe (véase Jones et al., 2003), mediante introducción de las regiones codificantes de cadena ligera y pesada variable de los genes de anticuerpo correspondientes en un único vector de expresión de IgG1 humana denominado pcDNA3002(Neo). Se usaron los vectores resultantes pgSO57C11 y pgSOJBC1 para la expresión transitoria en células a partir de la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares(ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de estos anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 122

- 129, respectivamente. Se incubaron diluciones en serie (0,5 ml) de la cepa CVS-11 del virus de la rabia (diluciones que oscilaban desde 10-1 -10-8) con una cantidad constante (~4 UI/ml) de anticuerpo CR-57 o CR-JB (0,5 ml) durante 1 hora a 37ºC/5% de CO2 antes de la adición a pocillos que contenían células de neuroblastoma de ratón (células MNA) o células BSR (línea celular similar a riñón de cría de hámster). Tras 3 días de selección en presencia de anticuerpo monoclonal humano o bien CR-57 o bien CR-JB, se recogió medio (1 ml) que contenía posibles virus de escape y se almacenó a 4ºC hasta su uso adicional. Posteriormente, se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante la noche a 37ºC/5% de CO2 con conjugado de anticuerpo anti-rabia con N-FITC (Centocor). Se puntuó el número de focos por pocillos mediante inmunofluorescencia y se eligió el medio de pocillos que contenían de uno a seis focos para la amplificación del virus. Todos los virus de escape E57 se generaron a partir de 1 único foco con la excepción de E57B1 (3 focos). Se aislaron los virus de escape EJB a partir de 1 foco (EJB3F), 3 focos (EJB2B), 4 focos (EJB2C), 5 focos (EJB2E, 2F), o 6 focos (EJB2D), respectivamente. Cada virus de escape se amplificó en cebador lugar a pequeña escala en células BSR o MNA dependiendo de sus características de crecimiento. Entonces se usaron estos pequeños lotes de virus para amplificar adicionalmente el virus a una gran escala en células MNA o BSR. Entonces se tituló el virus amplificado en células MNA para determinar el título de cada lote de virus de escape así como la dilución óptima del virus de escape (que proporciona un 80-100% de infección tras 24 horas) para su uso en un ensayo de neutralización de virus.

Se realizaron ensayos de RFFIT modificada (prueba de inhibición con foco fluorescente rápida) para examinar la protección cruzada de E57 (los virus de escape de CR-57) y EJB (los virus de escape de CR-JB) con CR-JB y CR57, respectivamente. Por tanto, se diluyó CR-57 o CR-JB mediante diluciones triples en serie comenzando con una dilución 1:5. Se añadió virus de la rabia (cepa CVS-11) a cada dilución a una concentración que proporciona un 80100% de infección. Se incubó una mezcla de virus/IgG durante 1 hora a 37ºC/ 5% de CO2 antes de la adición a células MNA. 24 horas tras la infección (a 34ºC/5% de CO2) se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante un mínimo de 3 horas con un conjugado de anticuerpo anti-virus de la rabia con N-FITC (Centocor). Entonces se analizaron los pocillos para detectar infección por virus de la rabia con un microscopio de fluorescencia para determinar la dilución de criterio de valoración del 50%. Esta es la dilución a la que la infección por virus se bloquea en un 50% en este ensayo. Para calcular la potencia, se incluyó un patrón internacional (lote de inmunoglobulina de la rabia R3, material de referencia del laboratorio de patrones y ensayos DMPQ/CBER/FDA) en cada RFFIT modificada. La dilución de criterio de valoración del 50% de este patrón corresponde a una potencia de 2 UI/ml. Se sometió a prueba la potencia neutralizante de los anticuerpos monoclonales humanos individuales CR57 y CR-JB así como la combinación de estos anticuerpos.

Los virus EJB ya no se neutralizaban por CR-JB o CR-57 (véase la tabla 1), lo que sugiere que ambos anticuerpos se unen a, e inducen cambios de aminoácido en, regiones similares de la glicoproteína del virus de la rabia. Los virus E57 ya no se neutralizaban por CR-57, mientras que 4 de cada 6 virus E57 todavía se neutralizaban por CRJB, aunque con una potencia inferior (véase la tabla 1). Una mezcla de los anticuerpos CR-57 y CR-JB (en una razón de 1:1 UI/mg) dio resultados similares a los observados con los anticuerpos individuales (datos no mostrados).

Para identificar posibles mutaciones en la glicoproteína del virus de la rabia se determinó la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de la glicoproteína de cada uno de los virus de escape EJB y E57. Se aisló ARN viral de cada uno de los virus de escape y CVS-11 a partir de células MNA infectadas por virus y se convirtió en ADNc mediante RT-PCR convencional. Posteriormente, se usó ADNc para la secuenciación de nucleótidos de ORF de la glicoproteína del virus de la rabia con el fin de identificar mutaciones.

Los virus de escape tanto E57 como EJB mostraron mutaciones en la misma región de la glicoproteína (véanse las figuras 1 y 2, respectivamente; véanse para todas las secuencias descritas en las figuras 1 y 2 SEQ ID NO: 130 151). Esto indica que ambos anticuerpos reconocen epítopos solapantes. A partir de lo anterior puede concluirse que la combinación de CR-57 y CRJB en un cóctel no previene el escape de variantes resistentes a la neutralización y por tanto no es una preparación de inmunoglobulinas ideal para la profilaxis tras la exposición a la rabia.

Ejemplo 2

Construcción de una biblioteca de presentación en fagos de ScFv usando linfocitos de sangre periférica de donantes vacunados contra la rabia.

A partir de cuatro sujetos humanos vacunados contra la rabia se extrajeron 50 ml de sangre a partir de una vena una semana tras el último refuerzo. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) a partir de estas muestras de sangre usando fraccionamiento por densidad celular en Ficoll. Se guardó el suero sanguíneo y se congeló a - 20ºC. Se obtuvo un resultado positivo en la prueba para determinar la presencia de anticuerpos anti-rabia en los sueros usando una tinción de FACS con células 293T transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia. Se preparó ARN total a partir de los PBL usando separación de fase orgánica (TRIZOL™) y posterior precipitación con etanol. Se disolvió el ARN obtenido en agua ultrapura tratada con DEPC y se determinó la concentración mediante medición de DO a 260 nm. Posteriormente, se diluyó el ARN hasta una concentración de 100 ng/l. A continuación, se convirtió 1 g de ARN en ADNc de la siguiente manera: a 10 l de ARN total, se le añadieron 13 l de agua ultrapura tratada con DEPC y 1 l de hexámeros al azar (500 ng/l) y se calentó la mezcla obtenida a 65ºC durante 5 minutos y se enfrió rápidamente en hielo húmedo. Después, se añadieron a la mezcla 8 l de 5X tampón First-Strand, 2 l de dNTP (10 mM cada uno), 2 l de DTT (0,1 M), 2 l de inhibidor de ARNasa (40 U/ml) y 2 l de transcriptasa inversa de MMLV Superscript™III (200 U/ml), se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubó durante 1 hora a 50ºC. Se terminó la reacción mediante inactivación por calor, es decir, incubando la mezcla durante 15 minutos a 75ºC.

Se diluyeron los productos de ADNc obtenidos hasta un volumen final de 200 l con agua ultrapura tratada con DEPC. La DO a 260 nm de una disolución diluida 50 veces (en tampón Tris 10 mM) de la dilución de los productos de ADNc obtenidos dio un valor de 0,1.

Para cada donante se usaron de 5 a 10 l de los productos de ADNc diluidos como molde para la amplificación por PCR de las secuencias de cadena ligera lambda o kappa y la familia de cadena pesada de inmunoglobulina gamma usando cebadores oligonucleotídicos específicos (véanse las tablas 2-7). Las mezclas de reacción de PCR contenían, además de los productos de ADNc diluidos, 25 pmol de cebador sentido y 25 pmol de cebador antisentido en un volumen final de 50 l de Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dNTP 250 mM y 1,25 unidades de Taq polimerasa. En un ciclador térmico de tapa calentada que tenía una temperatura de 96ºC, se fundieron rápidamente las mezclas obtenidas durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 96ºC, 30 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC.

En una primera ronda de amplificación, se combinaron cada uno de diecisiete cebadores sentido de región variable de cadena ligera (once para la cadena ligera lambda (véase la tabla 2) y seis para la cadena ligera kappa (véase la tabla 3) con un cebador antisentido que reconocía la región constante de C-kappa denominado HuCk 5’ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’ (véase SEQ ID NO: 152) o de C-lambda HuC2 5’TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO: 153) y HuC7 5’-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG- 3’ (véase SEQ ID NO: 154) (los cebadores antisentido HuC2 y HuC7 se mezclaron hasta equimolaridad antes de su uso), proporcionando 4 multiplicado por 17 productos de aproximadamente 600 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usó 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando los mismos diecisiete cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena ligera lambda con uno de los tres cebadores antisentido específicos de región J-lambda y cada cebador sentido de cadena ligera kappa se combinó con uno de los cinco cebadores antisentido específicos de región J-kappa. Los cebadores usados en la segunda amplificación se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 4) para permitir la clonación directa en el vector de presentación en fagos PDV-C06 (véase la figura 3 y SEQ ID NO: 155). Esto dio como resultado 4 multiplicado por 63 productos de aproximadamente 350 pares de bases que se combinaron para dar un total de 10 fracciones. Se eligió este número de fracciones para mantener la distribución natural de las diferentes familias de cadenas ligeras dentro de la biblioteca y no representar en exceso o en defecto determinadas familias. Se usó el número de alelos dentro de una familia para determinar el porcentaje de representación dentro de una biblioteca (véase la tabla 5). En la siguiente etapa, se digirieron 2,5 g de fracción combinada y 100 g de vector PDV-C06 con SalI y NotI y se purificaron a partir de gel. Posteriormente, se realizó la ligación durante la noche a 16ºC de la siguiente manera. A 500 ng de vector PDV-C06 se le añadieron 70 ng de fracción combinada en un volumen total de 50 l de mezcla de ligación que contenían Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 25 g/ml y ADN ligasa de T4 2,5 l (400 U/l). Se siguió este procedimiento para cada fracción combinada. Se purificaron las mezclas de ligación mediante fenol/cloroformo, seguido por una extracción en cloroformo y precipitación en etanol, métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Se disolvió el ADN obtenido en 50 l de agua ultrapura y se sometieron a electroporación dos alícuotas de 2,5 l por mezcla de ligación en 40 l de bacterias E. coli competentes para TG1 según el protocolo del fabricante (Stratagene). Se hicieron crecer los transformantes durante la noche a 37ºC en un total de 30 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 g/ml y un 4,5% de glucosa. Se obtuvo una (sub)biblioteca de regiones de cadena ligera variables raspando los transformantes de las placas de agar. Esta (sub)biblioteca se usó directamente para la preparación de ADN de plásmido usando un kit de preparación QIAFilter MAXI de Qiagen™.

Para cada donante se amplificaron las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada a partir de las mismas preparaciones de ADNc en un procedimiento de PCR de dos rondas similar y parámetros de reacción idénticos a los descritos anteriormente para las regiones de cadena ligera con la condición de que se usaron los cebadores representados en las tablas 6 y 7. La primera amplificación se realizó usando un conjunto de nueve cebadores dirigidos sentido (véase la tabla 6; que cubre todas las familias de regiones variables de cadena pesada) cada uno combinado con un cebador antisentido de región constante específico de IgG denominado HuCIgG 5’-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3’ (SEQ ID NO: 156) proporcionando cuatro multiplicado por nueve productos de aproximadamente 650 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usaron 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando los mismos nueve cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena pesada con uno de los cuatro cebadores antisentido específicos de región JH. Los cebadores usados en la segunda ronda se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 7) para permitir la clonación dirigida en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera. Esto dio como resultado por donante 36 productos de aproximadamente 350 pares de bases. Se combinaron estos productos para cada donante por cebador sentido (VH) usado en nueve fracciones. Se purificaron los productos obtenidos usando columnas de purificación de PCR de Qiagen. A continuación, se digirieron las fracciones con SfiI y XhoI y se ligaron en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes a los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. Alternativamente, se digirieron las fracciones con NcoI y XhoI y se ligaron en el vector de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes a los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. La ligación, purificación y posterior transformación de la biblioteca definitiva resultante también se realizaron tal como se describió anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera y en este punto se combinaron las mezclas de ligación de cada donante por combinación de VH. Se hicieron crecer los transformantes en 27 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 g/ml y un 4,5% de glucosa. Se recogieron todas las bacterias en medio de cultivo 2TY que contenía ampicilina 50 g/ml y un 4,5% de glucosa, se mezclaron con glicerol hasta el 15% (v/v) y se congelaron en alícuotas de 1,5 ml a -80ºC. Se realizaron el rescate y la selección de cada biblioteca tal como se describe a continuación.

Ejemplo 3

Selección de fagos que llevan fragmentos Fv monocatenarios que reconocen específicamente glicoproteína del virus de la rabia

Se seleccionaron fragmentos de anticuerpo usando bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpo, tecnología de presentación en fagos general y tecnología MAbstract®, esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense n.º 6.265.150 y en el documento WO98/15833. Las bibliotecas de fagos de anticuerpo usadas fueron dos bibliotecas de fagos scFv semisintéticas diferentes (JK1994 y WT2000) y las bibliotecas de fago scFv inmunitario (RAB-03-G01 y RAB-04-G01) preparadas tal como se describió en el ejemplo 2 anterior. La primera biblioteca de fagos scFv semisintética (JK1994) se ha descrito en de Kruif et al. (1995b), la segunda (WT2000) se construyó esencialmente tal como se describe en de Kruif et al. (1995b). En resumen, la biblioteca tiene un formato semisintético mediante lo cual se incorporó variación en los genes V de cadena ligera y pesada usando oligonucleótidos degenerados que incorporan variación dentro de las regiones CDR. Sólo se usaron genes de cadena pesada VH3, en combinación con genes de cadena ligera kappa y lambda. Se recrearon sintéticamente CDR1 y CDR3 de la cadena pesada y CDR3 de la cadena ligera en un enfoque basado en PCR similar al descrito en de Kruif et al. (1995b). Se clonaron secuencialmente los genes de región V así creados en un formato de scFv en un vector fagémido y se amplificaron para generar una biblioteca de fagos tal como se describió anteriormente. Además, se usaron los métodos y fagos cooperadores res descritos en el documento WO02/103012 (incorporado como referencia al presente documento) en la presente invención. Para identificar anticuerpos de fagos que reconocían la glicoproteína del virus de la rabia, se realizaron experimentos de selección de fagos usando virus de la rabia completo (cepa Pitman-Moore del virus de la rabia) inactivado mediante tratamiento con beta-propiolactona, glicoproteína del virus de la rabia purificada (cepa ERA del virus de la rabia), y/o células transfectadas que expresaban proteína G del virus de la rabia (cepa ERA del virus de la rabia).

La proteína G se purificó a partir de la cepa ERA del virus de la rabia de la siguiente manera. A una disolución de virus, se le añadió 1/10 en volumen de octil-beta-glucopiranósido al 10% y se mezcló suavemente. Tras una incubación de 30 minutos a 4ºC se centrifugó la muestra de virus (36.000 rpm, 4ºC) en un rotor SW51. Se recogió el sobrenadante y se dializó durante la noche a 4ºC frente a Tris/EDTA 0,1 M. Posteriormente, se recogió la glicoproteína de la cámara de diálisis, se dividió en alícuotas, y se almacenó a -80ºC hasta su uso adicional. Se determinó la concentración de proteína mediante DO a 280 nm y se analizó la integridad de la proteína G mediante SDS-PAGE.

Se diluyeron virus de la rabia inactivado completo o proteína G del virus de la rabia en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se añadieron 2-3 ml a tubos MaxiSorp Nunc-Inmuno (Nunc) y se incubaron durante la noche a 4ºC en un agitador rotativo. Se bloqueó una alícuota de una biblioteca de fagos (500 l, aproximadamente 1013 ufc, amplificado usando fago cooperador CT (véase el documento WO 02/103012)) en tampón de bloqueo (2% de Protifar en PBS) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Se añadió la biblioteca de fagos bloqueada al inmunotubo (preincubado o bien con o bien sin scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57), se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, y se lavó con tampón de lavado (0,1% de Tween-20 (Serva) en PBS) para eliminar fagos no unidos. Entonces se eluyeron los fagos unidos del antígeno mediante incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con 1 ml de glicina-HCl 50 mM, pH 2,2. Posteriormente, se mezclaron los fagos eluidos con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 para neutralizar el pH. Se usó esta mezcla para infectar 5 ml de cultivo de E. coli XL1-Blue que se había hecho crecer a 37ºC hasta una DO a 600 nm de aproximadamente 0,3. Se dejó que los fagos infectaran las bacterias XL1-Blue durante 30 minutos a 37ºC. Después se centrifugó la mezcla durante 10 minutos, a 3200*g a temperatura ambiente y se resuspendió el sedimento bacteriano en 0,5 ml de medio de extracto de levadura y 2-triptona (2TY). Se dividió la suspensión bacteriana obtenida en dos placas de agar 2TY complementadas con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Tras la incubación durante la noche de las placa a 37ºC, se rasparon las colonias de las placas y se usaron para preparar una biblioteca de fagos enriquecida, esencialmente tal

como se describe por De Kruif et al. (1995a) y el documento WO 02/103012. En resumen, se usaron bacterias raspadas para inocular medio 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y glucosa y se hicieron crecer a una

Se añadieron fagos cooperadores CT yse dejó que 0,3.
׽ temperatura de 37ºC hasta una DO a 600 nm de

infectaran las bacterias tras lo cual se cambió el medio a 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Se continuó la incubación durante la noche a 30ºC. Al día siguiente, se retiraron las bacterias del medio 2TY mediante centrifugación tras lo cual se precipitaron los fagos en el medio usando polietilenglicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, se disolvieron los fagos en 2 ml de PBS con un 1% de albúmina sérica bovina (BSA), se esterilizaron por filtración y se usaron para la siguiente ronda de selección.

También se realizaron selecciones de fagos con células transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia. Las células usadas fueron células de la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares(ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. A continuación en el presente documento se denominan células PER.C6®. En este caso, en primer lugar se añadió la biblioteca de fagos bloqueada (2 ml) a 1*107 células sustractoras (en DMEM/10% de FBS) y se incubaron durante 1 hora a 4ºC en un agitador rotativo. Las células sustractoras fueron células PER.C6® que expresaban el ectodominio de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en su superficie fusionado con el dominio citoplásmico y transmembrana del virus de la rabia. Con esta etapa de sustracción se eliminaron de la biblioteca de fagos los fagos que reconocían o bien la glicoproteína de VSV o bien antígenos específicos para células PER.C6®. Se centrífugo la mezcla de fagos/células (5 minutos a 4ºC a 500xg) para eliminar fagos unidos a células, y se añadió el sobrenadante a un tubo nuevo que contenía 3 ml de 1*107 células sustractoras. Se repitió dos veces la etapa de sustracción con el sobrenadante respectivo. Posteriormente, se incubaron los fagos sustraídos durante 1,5 horas a 4ºC en un agitador rotativo con las células transfectadas que expresaban glicoproteína del virus de la rabia (células PER.C6® (3*106 células)). Antes de eso, se preincubaron las células transfectadas o bien con o bien sin scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57. Tras la incubación se lavaron las células cinco veces con 1 ml de DMEM/10% de FBS (para cada lavado, se resuspendieron las células y se transfirieron a un nuevo tubo), se eluyeron los fagos y se procesaron tal como se describió anteriormente.

Normalmente, se realizaron dos rondas de selecciones antes del aislamiento de anticuerpos de fagos individuales. Tras la segunda ronda de selección, se usaron colonias de E. coli individuales para preparar anticuerpos de fagos monoclonales. Esencialmente, se hicieron crecer colonias individuales hasta la fase logarítmica en un formato de palcas de 96 pocillos y se infectaron con fagos cooperadores VCSM13 tras lo cual se permitió avanzar la producción de anticuerpos de fagos durante la noche. Los anticuerpos de fagos producidos se precipitaron mediante PBG/NaCl y se esterilizaron por filtración y se sometieron a prueba en ELISA para detectar la unión tanto a virus de la rabia inactivado completo como a proteína G de virus de la rabia purificada. A partir de la selección se obtuvo un gran panel de anticuerpos de fagos que demuestra la unión tanto a virus de la rabia inactivado completo como a proteína G de virus de la rabia (véase el ejemplo a continuación). Se siguieron dos estrategias de selección con las bibliotecas inmunitarias descritas anteriormente. En la primera estrategia se seleccionaron 736 anticuerpos de fagos tras dos rondas de selección usando en la primera y la segunda ronda de selección virus inactivado o proteína G purificada. En la segunda estrategia se seleccionaron 736 anticuerpos de fagos tras dos rondas de selección usando en la primera ronda de selección proteína G recombinante expresada en la superficie celular y en la segunda ronda de selección virus inactivado o proteína G purificada. El número de anticuerpos de fagos únicos obtenidos mediante la primera estrategia fue 97, mientras que la segunda estrategia proporcionó 70 únicos. Los 97 anticuerpos de fagos únicos encontrados por medio de la primera estrategia dieron lugar a 18 anticuerpos neutralizantes y los 70 clones únicos identificados por medio de la segunda estrategia proporcionaron 33 anticuerpos neutralizantes. Esto demuestra claramente que las selecciones que incluyeron células transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia, es decir proteína G recombinante expresada en la superficie celular, como antígeno parecieron proporcionar más anticuerpos neutralizantes en comparación con selecciones usando sólo proteína G purificada y/o virus inactivado.

Ejemplo 4

Validación de los anticuerpos de fagos monocatenarios específicos para glicoproteína del virus de la rabia.

Los anticuerpos de fagos monocatenarios seleccionados que se obtuvieron a partir de las selecciones descritas anteriormente, se validaron en ELISA para determinar la especificidad, es decir la unión a proteína G de virus de la rabia purificada tal como se describió anteriormente. Adicionalmente, también se sometieron a prueba los anticuerpos de fagos monocatenarios para determinar la unión a FBS al 5%. Para ello, se recubrió la preparación de proteína G de virus de la rabia o FBS al 5% en placas de ELISA Maxisorp™. Tras el recubrimiento, se bloquearon las placas en PBS/1% de Protifar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incubaron los anticuerpos de fagos monocatenarios seleccionados durante 15 minutos en un volumen igual de PBS/1% de Protifar para obtener anticuerpos de fagos bloqueados. Se vaciaron las placas, y se añadieron los anticuerpos de fagos bloqueados a los pocillos. Se permitió que la incubación avanzara durante una hora, se lavaron las placas en PBS que contenía un 0,1% de Tween-20 y se detectaron los anticuerpos de fagos unidos (usando medición de DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-M 13 conjugado con peroxidasa. Como control, se realizó simultáneamente el procedimiento sin usar ningún anticuerpo de fago monocatenario, un anticuerpo de fago monocatenario de control negativo dirigido contra CD8 (SC02-007) o un anticuerpo de fago monocatenario de control positivo dirigido contra la glicoproteína del virus de la rabia (scFv SO57). Tal como se muestra en la tabla 8, los anticuerpos de fagos seleccionados denominados SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 presentaron unión significativa a la proteína G de virus de la rabia purificada inmovilizada, mientras que no se observó ninguna unión a FBS. Se obtuvieron resultados idénticos en ELISA usando el virus de la rabia inactivado completo tal como se describió anteriormente (datos no mostrados).

Ejemplo 5

Caracterización de scFv específicos del virus de la rabia

A partir de los clones de anticuerpos de fagos monocatenarios específicos seleccionados (scFv) se obtuvo ADN de plásmido y se determinaron secuencias de nucleótidos según técnicas convencionales. Las secuencias de nucleótidos de scFv (incluyendo sitios de restricción para la clonación) denominados SC04-001, SC04-004, SC04008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04146 y SC04-164 se muestran en SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los scFv denominados SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 se muestran en SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 y SEQ ID NO: 204, respectivamente.

La identidad de genes de VH y VL (véase Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) y composiciones de CDR3 de cadena pesada de los scFv que se unen específicamente a la proteína G de virus de la rabia se representan en la tabla 9.

Ejemplo 6

Neutralización in vitro de virus de la rabia mediante scFv específicos de virus de la rabia (RFFIT modificada)

Con el fin de determinar si los scFv seleccionados podían bloquear la infección por virus de la rabia, se realizaron ensayos de neutralización in vitro (RFFIT modificada). Se diluyeron las preparaciones de scFv mediante diluciones triples en serie comenzando con una dilución 1:5. Se añadió virus de la rabia (cepa CVS-11) a cada dilución a una concentración que proporciona un 80-100% de infección. Se incubó una mezcla de virus/scFv durante 1 hora a 37ºC/5% de CO2 antes de la adición a células MNA. 24 horas tras la infección (a 34ºC/5% de CO2) se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante un mínimo de 3 horas con un conjugado de anticuerpo anti-rabia con N-FITC (Centocor). Entonces se analizaron las células para detectar infección por virus de la rabia con un microscopio de fluorescencia para determinar la dilución de criterio de valoración del 50%. Esta es la dilución a la que la infección por virus se bloquea en un 50% en este ensayo (véase el ejemplo 1). Se identificaron varios scFv que mostraron actividad neutralizante contra el virus de la rabia (véase la tabla 10).

Adicionalmente, se investigó por medio del ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificada) tal como se describió anteriormente, si los scFv seleccionados podían neutralizar los virus de escape E57 tal como se prepararon en el ejemplo 1 (E57A2, E57A3, E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3). Se identificaron varios scFv que mostraron actividad neutralizante contra a los virus de escape E57 (véanse las tablas 11A y 11B).

Ejemplo 7

ELISA de competición de proteína G de virus de la rabia con scFv

Para identificar anticuerpos que se unían a epítopos no solapantes, no competitivos, se realizó un ELISA de competición con glicoproteína de la rabia. Se recubrieron placas Maxisorp F96 de Nunc-Inmuno™ (Nunc) durante la noche a 4ºC con una dilución 1:1000 de glicoproteína del virus de la rabia purificada (1 mg/ml; cepa ERA del virus de la rabia) en PBS (50 l). Se eliminó mediante lavado la proteína no recubierta antes de bloquear los pocillos con 100 l de PBS/1% de Protifar durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se descartó la disolución de bloqueo y se añadieron 50 l de los scFv anti-virus de la rabia no purificados en PBS/1% de Protifar (diluido dos veces). Se lavaron los pocillos cinco veces con 100 l de PBS/0,05% de Tween-20. Después, se añadieron 50 l de IgG competidora biotinilada anti-virus de la rabia, CR-57bio, a cada pocillo, se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron los pocillos cinco veces con 100 l de PBS/0,05% de Tween-20. Para detectar la unión de CR-57bio, se añadieron 50 l de una dilución 1:2000 de estreptavidina-anticuerpo con HRP (Becton Dickinson) a los pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Volvieron a lavarse los pocillos como anteriormente y se desarrolló adicionalmente el ELISA mediante adición de 100 l de reactivos OPD (Sigma). Se detuvo la reacción añadiendo 50 l de H2SO4 1 M antes de medir la DO a 492 nm.

La señal obtenida con CR-57bio solo podía reducirse a niveles basales cuando se coincubaba con scFv SO57, es decir la forma de scFv de CR-57 (para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de SO57 véanse SEQ ID NO: 205 y 206, respectivamente) o scFv SOJB, es decir la forma de scFv de CR-JB (para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de SOJB véanse SEQ ID NO: 312 y 313, respectivamente). Esto indica que los scFv SO57 y SOJB compiten con la interacción de CR-57bio con la glicoproteína del virus de la rabia uniéndose al mismo epítopo o a un epítopo solapante al de CR-57bio, respectivamente. En cambio, un scFv irrelevante denominado SC02-007, es decir un scFv que se une a CD8, no compitió por la unión. Los scFv anti-virus de la rabia denominados SC04-004, SC04-010, SC04-024, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-120, SC04-125, SC04-127, SC04-140, SC04-144 y SC04-146 tampoco compitieron con CR-57bio, lo que indica que estos scFv se unen a un epítopo diferente al epítopo reconocido por CR-57 (véase la figura 4).

Se obtuvieron resultados similares con el siguiente experimento. En primer lugar, se añadió el anticuerpo CR-57 frente al virus de la rabia a pocillos recubiertos con proteína G de virus de la rabia. A continuación, se añadieron los scFv de competición. En esta configuración los scFv anti-virus de la rabia se detectaron con anticuerpo anti-VSV conjugado con HRP en virtud de la presencia de una etiqueta de VSV en las secuencias de aminoácidos de scFv (véase la figura 5).

Ejemplo 8

Construcción de moléculas de inmunoglobulina completamente humanas (anticuerpos monoclonales humanos antivirus de la rabia) a partir de Fv monocatenarios seleccionados anti-virus de la rabia

Regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFv denominados SC04-001, SC04-008, SC04-018, SC04040 y SC04-126 se amplificaron mediante PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C03-HC1 (véase SEQ ID NO: 277) y pSynC04-C (véase SEQ ID NO: 278), respectivamente. Se amplificaron los genes de VH y VL usando los oligonucleótidos mostrados en las tablas 12 y 13, respectivamente, y se clonaron los productos de PCR en los vectores pSyn-C03-HC1 y pSyn-C04-C, respectivamente.

Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFv denominados SC04-004, SC04-010, SC04-021, SC04026, SC04-031, SC04-038, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04120, SC04-125, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 también se amplificaron mediante PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C03-HC1 y pSyn-C05-C (véase SEQ ID NO: 279), respectivamente. Se amplificaron los genes de VH y VL usando los oligonucleótidos facilitados en las tablas 12 y 13, respectivamente, y se clonaron los productos de PCR en los vectores pSyn-C03-HC1 y pSyn-C05-C, respectivamente. Los oligonucleótidos se diseñan de tal manera que corrigen cualquier desviación de la secuencia de la línea germinal que se haya introducido durante la construcción de la biblioteca, debido al conjunto limitado de oligonucleótidos que se han usado para amplificar el gran repertorio de genes de anticuerpos. Las secuencias de nucleótidos para todos los constructos se verificaron según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica.

Los constructos de expresión resultantes pgG104-001C03, pgG104-008C03, pgG104-018C03, pgG104-040C03 y pgG104-126C03 que codifican para las cadenas pesadas de IgG1 humana anti-virus de la rabia en combinación con el constructo pSyn-C04-V relevante que codifica para la correspondiente cadena ligera, se expresaron de manera transitoria en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1. Los constructos de expresión pgG104-004C03, pgG104-010C03, pgG104-021C03, pgG104-026C03, pgG104-031C03, pgG104038C03, pgG104-060C03, pgG104-073C03, pgG104-097C03, pgG104-098C03, pgG104-103C03, pgG104-104C03, pgG104-108C03, pgG104-120C03, pgG104-125C03, pgG104-140C03, pgG104-144C03, pgG104-146C03 y pgG104-164C03 que codifican para las cadenas pesadas de IgG1 humana anti-virus de la rabia en combinación con el constructo pSyn-C05-V relevante que codifica para la correspondiente cadena ligera, se expresaron de manera transitoria en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos denominados CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y CR04-164 se determinaron según técnicas convencionales. Posteriormente, se purificaron los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes en una columna de proteína A seguido por un intercambio de tampón en una columna de desalación usando métodos de purificación convencionales usados generalmente para inmunoglobulinas (véase por ejemplo el documento WO 00/63403).

Adicionalmente, para CR04-098, se generó un único vector de expresión de IgG1 humana denominado pgG104098C10 tal como se describió anteriormente para los vectores pgSO57C11 y pgSOJBC11 que codifican para CR-57 y CR-JB, respectivamente (véase el ejemplo 1). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo CR04-098 codificado por el vector pgG104-098C10 se muestran en SEQ ID NO: 334 337, respectivamente. Se usaron vectores pgSO57C11 (véase el ejemplo 1) y pgG104-098C10 para la expresión estable de CR-57 y CR04-098, respectivamente, en células a partir de la línea celular depositada en la colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. Los CR-57 y CR04-098 producidos de manera estable tienen un punto isoeléctrico calculado de 8,22 y 8,46, respectivamente. Los puntos isoeléctricos observados de manera experimental son de entre 8,1-8,3 para CR-57 y 9,0-9,2 para CR04-098. Se purificaron los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes tal como se describió anteriormente. A menos que se indique lo contrario, para CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y CR04-164 se usaron anticuerpos monoclonales humanos recombinantes expresados de manera transitoria por el sistema de dos vectores tal como se describió anteriormente y para CR57 se usó anticuerpo monoclonal humano recombinante expresado de manera transitoria por el sistema de un vector tal como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 9

ELISA de competición de proteína G de virus de la rabia con IgG

Para tratar si las IgG monoclonales humanas anti-proteína G de virus de la rabia se unen a epítopos no solapantes, no competitivos, se realizaron experimentos de competición. Se incuban pocillos con proteína G de virus de la rabia recubierta con concentraciones crecientes (0-50 g/ml) de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se añaden 50 l de una IgG biotinilada diferente anti-virus de la rabia (1 g/ml) a cada pocillo, se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lava inmediatamente cinco veces con 100 l de PBS/0,05% de Tween-20. Posteriormente, se incuban los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente con 50 l de una dilución 1:2000 de estreptavidina-HRP (Becton Dickinson), se lavan y se revelan tal como se describió anteriormente. Una disminución en la señal con el aumento de la concentración de IgG sin marcar indica que los dos anticuerpos están compitiendo entre sí y reconocen el mismo epítopo o epítopos solapantes.

Alternativamente, se incubaron pocillos recubiertos con proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) con 50 g/ml de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se añadieron 50 l de CR57 biotinilado (0,5-5 g/ml; a niveles subsaturados) a cada pocillo. Las etapas adicionales se realizaron tal como anteriormente. Se compararon las señales obtenidas con la señal obtenida sólo con CR57 biotinilado (véase la figura 6; sin competidor). A partir de la figura 6 puede deducirse que la señal no podía reducirse con el anticuerpo denominado CR02-428 que sirvió como control negativo. En cambio, la competición con CR57 sin marcar (control positivo) o CR-JB redujo la señal a niveles basales. A partir de la figura 6 puede deducirse adicionalmente que ninguna de las IgG anti-proteína G de virus de la rabia compitió significativamente con CR-57, lo que concuerda con los datos de competición de scFv tal como se describieron en el ejemplo 7.

Además, se realizaron experimentos de competición con células PER.C6 transfectadas con proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) por medio de citometría de flujo. Se incubaron células transfectadas con 20 l de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar (50 g/ml) durante 20 minutos a 4ºC. Tras lavar las células con PBS que contenía un 1% de BSA, se añadieron 20 l de CR57 biotinilado (0,5-5 g/ml; a nivel de sustrato) a cada pocillo, se incubó durante 5 minutos a 4ºC, y se lavó inmediatamente dos veces con 100 l de PBS que contenía un 1% de BSA. Posteriormente, se incubaron los pocillos durante 15 minutos a 4ºC con 20 l de una dilución 1:200 de estreptavidina-PE (Caltag), se lavaron y se revelaron tal como se describió anteriormente. La señal obtenida con CR57 biotinilado no pudo reducirse significativamente con el anticuerpo CR02-428 de control negativo (véase la figura 7). En cambio, la competición con CR57 sin marcar (control positivo) o CR-JB redujo la señal hasta niveles basales. Ninguna de las IgG anti-proteína G de virus de la rabia compitió significativamente con CR-57, con la excepción de CR04-126 que redujo la señal hasta aproximadamente un 30% (véase la figura 7). Este último no compitió en ELISA (véase la figura 6). Esto puede estar provocado por la diferencia en la manera en que la glicoproteína se presenta al anticuerpo en experimentos de FACS en comparación con experimentos de ELISA. La unión de CR04-126 podía depender más de la conformación de la glicoproteína, dando como resultado el efecto competitivo observado con CR04-126 en el ensayo de competición basado en FACS y no en el ensayo de competición basado en ELISA. Adicionalmente, CR04-008 y CR04-010 redujeron la señal hasta aproximadamente un 50% (véase la figura 7) en el ensayo de competición basado en FACS lo que indica que podrían competir con CR57. Sin embargo, esto no se confirmó para CR04-010 mediante los datos de competición de scFv o el ensayo de competición basado en ELISA. Para las demás IgG, los datos de FACS correspondían con los datos de ELISA respectivos tanto de los scFv como de las IgG.

Ejemplo 10

Efectos sinérgicos aditivos de IgG anti-rabia en la neutralización in vitro de virus de la rabia (RFFIT modificada)

Con el fin de determinar si las IgG anti-proteína G de virus de la rabia tenían efectos aditivos o sinérgicos en la neutralización de virus de la rabia, se sometieron a prueba diferentes combinaciones de las IgG. En primer lugar, se determina la potencia (en UI/mg) de cada anticuerpo individual en una RFFIT modificada (véase el ejemplo 1). Después, se preparan combinaciones de anticuerpos basándose en cantidades iguales de UI/mg y se someten a prueba en la RFFIT modificada. Las potencias de cada combinación de anticuerpos pueden determinarse y compararse con las potencias esperadas. Si la potencia de la combinación de anticuerpos es igual a la suma de las potencias de cada anticuerpo individual presente en la combinación, los anticuerpos tienen un efecto aditivo. Si la potencia de la combinación de anticuerpos es superior, los anticuerpos tienen un efecto sinérgico en la neutralización de virus de la rabia.

Alternativamente, pueden determinarse efectos aditivos o sinérgicos mediante el siguiente experimento. En primer lugar, se determina la potencia de los anticuerpos que van a someterse a prueba, por ejemplo CR-57 y CR04-098, en una RFFIT convencional (véase Laboratory techniques in rabies, editado por: F-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, capítulo 15, Organización Mundial de la Salud, Ginebra). Después, se mezclan los anticuerpos en una razón 1:1 basándose en UI/ml. Se somete a prueba esta mezcla de anticuerpos, junto con los anticuerpos individuales a la misma concentración, en seis experimentos de RFFIT independientes para determinar el criterio de valoración de neutralización al 50%. Posteriormente, se determina el índice de combinación (CI) para la mezcla de anticuerpos usando la fórmula CI = (C1/Cx1) + (C2/Cx2) + (C1C2/Cx1Cx2) tal como se describe por Chou et al. (1984). C1 y C2 son la cantidad (en g) de anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2 que conduce a una neutralización del 50% cuando se usan en combinación y Cx1 y Cx2 son las cantidades (en g) de anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2 que conducen a una neutralización del 50% cuando se usan solos. CI=1, indica un efecto aditivo, CI<1 indica un efecto sinérgico y CI>1 indica un efecto antagonista de los anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 11
Identificación de epítopos reconocidos por anticuerpos humanos recombinantes anti-virus de la rabia mediante PEPSCAN-ELISA
Se sintetizaron péptidos en bucle/cíclicos y lineales de 15 meros a partir del dominio extracelular de la proteína G de la cepa ERA del virus de la rabia (véase SEQ ID NO: 207 para la secuencia de aminoácidos completa de la glicoproteína G de la cepa ERA del virus de la rabia, el domino extracelular consiste en los aminoácidos 20-458; la ID de proteína de la glicoproteína de la cepa ERA del virus de la rabia en la base de datos EMBL es J02293) y se examinaron usando tarjetas mini-PEPSCAN en formato de tarjeta de crédito (formatos/tarjeta de 455 péptidos) tal como se describió anteriormente (Slootstra et al., 1996; documento WO 93/09872). Se acetilaron todos los péptidos en el extremo amino-terminal. En todos los péptidos en bucle se sustituyeron la posición 2 y la posición 14 por una cisteína (acetil-XCXXXXXXXXXXXCX-minitarjeta). Si había presentes otras cisteínas además de las cisteínas en la posición 2 y la posición 14 en un péptido preparado, las otras cisteínas se sustituyeron por una alanina. Se sintetizaron los péptidos en bucle usando química de Fmoc convencional y se desprotegieron usando ácido trifluoroacético con eliminadores. Posteriormente, se hicieron reaccionar los péptidos desprotegidos en las tarjetas con una disolución 0,5 mM de 1,3-bis(bromometil)benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9/acetonitril (1:1 (v/v)). Se agitaron suavemente las tarjetas en la disolución durante 30-60 minutos, mientras estaban completamente cubiertas en la disolución. Finalmente, se lavaron ampliamente las tarjetas con un exceso de H2O y se sonicaron en tampón de alteración que contenía un 1% de SDS/0,1% de beta-mercaptoetanol en PBS (pH 7,2) a 70ºC durante 30 minutos, seguido por sonicación en H2O durante otros 45 minutos.
Se prepararon los anticuerpos monoclonales humanos tal como se describió anteriormente. Se sometió a prueba la unión de estos anticuerpos a cada péptido lineal y en bucle en un inmunoensayo ligado a enzimas basado en PEPSCAN (ELISA). Se incubaron las tarjetas de polipropileno en formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos, que contenían los péptidos covalentemente unidos, con los anticuerpos (10 g/ml; diluidos en disolución de bloqueo, que contenía un 5% de suero de caballo (v/v) y un 5% de ovoalbúmina (p/v)) (4ºC, durante la noche). Tras el lavado, se incubaron los péptidos con anticuerpo anti-ser humano con peroxidasa (dilución 1/1000) (1 hora, 25ºC), y posteriormente, tras el lavado de la peroxidasa, se añadió sustrato sulfonato de 2,2’-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 l/ml de H2O2 al 3%. Se incubaron controles (para lineal y en bucle) con anticuerpo anti-ser humano con peroxidasa únicamente. Tras 1 hora se midió el desarrollo del color. El desarrollo del color del ELISA se cuantificó con una cámara CCD y un sistema de procesamiento de imágenes. La configuración consistió en una cámara CCD y una lente de 55 mm (videocámara CCD de Sony XC-77RR, lente de Nikon micronikkor 55 mm f/2,8), un adaptador de cámara (adaptador de cámara de Sony DC-77RR) y el paquete de software de procesamiento de imágenes Optimas, versión 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, EE.UU.). Optimas se ejecutó en un sistema informático pentium II.
Se sometieron a prueba los anticuerpos monoclonales humanos anti-proteína G de virus de la rabia para determinar la unión a los péptidos en bucle/cíclicos y lineales de 15 meros sintetizados tal como se describió anteriormente. Se considera que un péptido se une de manera relevante a un anticuerpo cuando los valores de DO son iguales o superiores al doble del valor de DO promedio de todos los péptidos (por anticuerpo). Véase la tabla 14 para resultados de la unión de los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57, CRJB y CR04-010 a los péptidos lineales del dominio extracelular de glicoproteína G de cepa ERA del virus de la rabia. Las regiones que muestran unión significativa a los anticuerpos respectivos están destacadas en gris (véase la tabla 14).
El anticuerpo CR57 se unió a los péptidos lineales que tenían una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SLKGACKLKLCGVLG (SEQ ID NO: 314), LKGACKLKLCGVLGL (SEQ ID NO: 315), KGACKLKLCGVLGLR (SEQ ID NO: 316), GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318), CKLKLCGVLGLRLMD (SEQ ID NO: 319), KLKLCGVLGLRLMDG (SEQ ID NO: 320), LKLCGVLGLRLMDGT (SEQ ID NO: 321) y KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322) (véase la tabla 14). Los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318) tienen un valor de DO que es inferior al doble del valor promedio. No obstante, se reivindican estos péptidos porque están en la proximidad cercana a una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR57. La unión fue lo más prominente al péptido con la secuencia de aminoácidos KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322).
El anticuerpo CR04-010 se unió a los péptidos lineales que tenían una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GFGKAYTIFNKTLME (SEQ ID NO: 323), FGKAYTIFNKTLMEA (SEQ ID NO: 324), GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO: 325), KAYTIFNKTLMEADA (SEQ ID NO: 326), AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328), TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331). Los péptidos que tienen las secuencias de
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aminoácidos AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328) tienen un valor de DO que es inferior al doble del valor promedio. No obstante, estos péptidos se reivindican porque están en la proximidad cercana a una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR04-010. La unión fue lo más prominente a los péptidos con la secuencia de aminoácidos TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331).
CRJB y los anticuerpos denominados CR04-040, CR04-098 y CR04-103 (datos no mostrados) no reconocieron una región de péptidos antigénicos lineales.
Cualquiera de los péptidos anteriores o partes de los mismos representa buenos candidatos de un epítopo neutralizante contra el virus de la rabia y podría formar la base para una vacuna o para preparar anticuerpos neutralizantes para tratar y/o prevenir una infección por virus de la rabia.
SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 332) y GFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 333) son regiones particularmente interesantes de la glicoproteína basándose en su alta reactividad en PEPSCAN.
A partir de los datos de PEPSCAN anteriores puede deducirse adicionalmente que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57 y CR04-010 se unen a diferentes regiones de la proteína G del virus de la rabia lo que indica que reconocen epítopos no competitivos.
Ejemplo 12
Determinación de potencia neutralizante de IgG anti-proteína G de la rabia usando un ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificada).
Se determinó la potencia neutralizante de cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos producidos en una RFFIT modificada tal como se describió en el ejemplo 1. Dieciséis IgG neutralizaron la cepa CVS-11 de la rabia con una potencia superior a 1000 UI/mg, mientras que sólo dos IgG tenían una potencia inferior a 2 UI/mg (véase la tabla 15). Ocho de los dieciséis anticuerpos funcionaron mejor que CR-57 producido de manera transitoria con respecto a la potencia, lo que sugiere una eficacia superior en la profilaxis tras la exposición de virus de la rabia que CR-57. La potencia de CR-57 producido de manera transitoria fue de aproximadamente 3800 UI/mg de proteína (véanse las tablas 1 y 15), mientras que CR-57 producido de manera estable presentó una potencia de 5400 UI/mg de proteína (datos no mostrados). De manera interesante, la mayoría de los anticuerpos neutralizantes monoclonales humanos identificados contenían un gen de línea germinal 3-30 pesado variable (véase la tabla 9).
Basándose en la afinidad de los anticuerpos por el virus de la rabia (datos no mostrados) y una dilución de criterio de valoración del 100% de los anticuerpos en un ensayo de RFFIT modificada (datos no mostrados), se eligió un panel de seis IgG únicas, es decir CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104, y CR04-144, para un desarrollo posterior. Dentro de este panel, el anticuerpo CR04-098 fue particularmente interesante porque mostraba la mayor potencia, es decir aproximadamente 7300 UI/mg de proteína (véase la tabla 15). También se encontró una potencia similar para CR04-098 producido de manera estable (datos no mostrados).
Ejemplo 13
Neutralización in vitro de virus de escape E57 mediante IgG anti-virus de la rabia
Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia novedosos, se sometió a prueba la actividad neutralizante de las IgG frente a virus de escape E57 en una RFFIT modificada tal como se describió anteriormente. La mayoría de las IgG anti-virus de la rabia tenían buena actividad neutralizante frente a los seis virus de escape E57 (véase la tabla 16). En cambio, CR04-008, CR04-018 y CR04-126 no neutralizaron 6/6, 2/6 y 3/6 virus de escape E57, respectivamente. Ausencia de neutralización significa que no se alcanzó el criterio de valoración del 50% a una dilución de anticuerpo de 1:100. CR04-021, CR04-108, CR04-120, CR04-125, y CR04-164 mostraron una disminución significativa en la actividad neutralizante frente a varios virus de escape. Esto sugiere que el epítopo de estos anticuerpos se ha incluido o bien directa o bien indirectamente en la glicoproteína de virus de escape E57. Basándose en lo anterior, varias IgG anti-virus de la rabia pueden ser compatibles con CR-57 en un cóctel anti-rabia para el tratamiento de profilaxis tras la exposición. En particular, el panel de seis IgG únicas tal como se definió anteriormente, es decir anticuerpos CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104, y CR04-144, presentó buena potencia neutralizante frente a los virus de escape E57 lo que sugiere que ese/esos epítopo(s) reconocido(s) por esos anticuerpos no se veía(n) afectados por las mutaciones de aminoácidos inducidas por CR-57. El anticuerpo CR04-098 pareció el más prometedor ya que tenía una a potencia superior a 3000 UI/mg para cada uno de los virus de escape.
Ejemplo 14
Reconocimiento de epítopos de anticuerpos CR-57 y CR04-098 anti-rabia
Para confirmar que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, se generaron virus de escape del anticuerpo monoclonal humano denominado CR04098 esencialmente tal como se describió para los virus de escape de CR57 (véase el ejemplo 1). En resumen, se puntuó el número de focos por pocillo mediante inmunofluorescencia y se eligió el medio de pocillos que contenían preferiblemente un foco para la amplificación del virus. Todos los virus de escape E98 se generaron a partir de 1
único foco con la excepción de E98-2 (2 focos) y E98-4 (4 focos). Un virus se definió como una variante de escape si el índice de neutralización era <2,5 log. El índice de neutralización se determinó restando el número de partículas de
4 UI/ml)
׽ virus infecciosas/ml producido en cultivos de células BSR infectadas con virus más anticuerpo monoclonal (
del número de partículas de virus infecciosas/ml producido en cultivos de células BSR o MNA infectadas con virus solo virus ([log de unidades formadoras de focos/ml de virus en ausencia de anticuerpo monoclonal menos log de uff/ml de virus en presencia de anticuerpo monoclonal]). Se consideró que un índice inferior a 2,5 log era evidencia de escape.
Para investigar adicionalmente que CR04-098 se une a un epítopo no solapante, no competitivo, diferente en comparación con CR-57, se sometió CR-57 a prueba frente a virus de escape E98 en un ensayo de RFFIT modificada tal como se describió anteriormente. Tal como se muestra en la tabla 17, CR-57 tenía buena actividad neutralizante frente a los cinco virus de escape E98. Adicionalmente, se sometieron los anticuerpos CR04-010 y CR04-144 a prueba para determinar la actividad neutralizante frente a los virus de escape E98. Ninguno de los anticuerpos neutralizó los virus de escape E98 (datos no mostrados) lo que sugiere que el epítopo reconocido por ambos anticuerpos se ve afectado o bien directa o bien indirectamente por la mutación de aminoácidos inducida por el anticuerpo CR04-098. Se sometieron los anticuerpos CR04-018 y CR04-126 a prueba para determinar la actividad neutralizante frente a sólo uno de los virus de escape E98, es decir E98-4. CR04-018 podría neutralizar el virus de escape, mientras que CR04-126 sólo tenía una débil potencia neutralizante frente al virus de escape. Esto sugiere que el epítopo reconocido por CR04-018 no se ve afectado por la mutación inducida por el anticuerpo CR04-098. Adicionalmente, los anticuerpos CR04-010, CR04-038, CR04-040, CR04-073, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-164 no neutralizaron E98-4 lo que sugiere que reconocen el mismo epítopo que CR04098 (datos no mostrados).
Para identificar posibles mutaciones en la glicoproteína de la rabia de cada uno de los virus de escape E98, se determinó la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de la glicoproteína tal como se describió anteriormente para los virus de escape E57 y EJB. Todos los virus de escape E98 mostraron la mutación N a D en la posición de aminoácido 336 de la glicoproteína de la rabia (véase la figura 8). Esta región de la glicoproteína se ha definido como sitio antigénico III que consiste en los aminoácidos 330-338 (numeración sin péptido señal). En cambio, CR-57 reconoció un epítopo ubicado en los aminoácidos 226-231 (numeración sin péptido señal), que se solapa con el sitio antigénico I. Además de la mutación N336D el virus de escape E98 denominado E98-5 mostró la mutación H a Q en la posición de aminoácido 354 (cambio de codón de CAT a CAG) de la glicoproteína de la rabia (datos no mostrados).
Además, un análisis de Pepscan de la unión de CR57 a péptidos que alojan el epítopo de CR57 mutado (tal como se observa en los virus de escape E57) no mostró que se eliminará la interacción de CR57 (datos no mostrados). Sorprendentemente, CR04-098 todavía podía unirse a la glicoproteína mutada (que comprende la mutación N336D) expresada en células PER.C6®, según se mide mediante citometría de flujo (datos no mostrados), aunque los virus que contenían esta mutación ya no se neutralizaban.
Además, se realizaron estudios de mapeo de epítopo y estudios de clasificación de afinidad usando un análisis de resonancia de plasmón superficial usando un sistema analítico BIAcore3000™. Se inmovilizó la glicoproteína de la rabia purificada (cepa ERA) como ligando en un chip sensor de 4 canales de flujo CM5 de calidad para investigación (Fc) (Biacore AB, Suecia) usando acoplamiento con amina. La clasificación se realizó a 25ºC con HBS-EP (Biacore AB, Suecia) como tampón de ejecución. Se inyectaron 50 l de cada anticuerpo a una velocidad de flujo constante de 20 l/min. Después, se aplicó tampón de ejecución durante 750 segundos seguido por regeneración del chip CM5 con 5 l de NaOH 2 M, 5 l de HCl 45 mM y 5 l de NaOH 2 mM. Se trazaron las señales de resonancia expresadas como unidades de resonancia (UR) como función del tiempo y se determinaron el aumento y la disminución de UR como una medida de la asociación y disociación, respectivamente, y se usaron para la clasificación de los anticuerpos. Los valores de KD reales para CR57 y CR04-098 según se determinaron mediante análisis de resonancia de plasmón superficial fueron de 2,4 nM y 4,5 nM, respectivamente. Los estudios de mapeo de epítopo confirmaron adicionalmente que CR57 y CR04-098 se unen a diferentes epítopos en la glicoproteína de la rabia. La inyección de CR57 dio como resultado una respuesta de 58 UR (datos no mostrados). Tras la inyección de CR04098 se obtuvo un aumento adicional del nivel de respuesta (24 UR), lo que sugiere que los sitios de unión para CR04-098 no estaban ocupados (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares cuando se aplicó el orden inverso lo que muestra que cada anticuerpo alcanzó niveles de UR similares independientemente del orden de inyección (datos no mostrados). Estos resultados demuestran adicionalmente que CR57 y CR04-098 pueden unirse simultáneamente y reconocer diferentes epítopos en la glicoproteína del virus de la rabia.
En general, los datos anteriores confirman adicionalmente que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes distintos epítopos, es decir epítopos en el sitio antigénico I y III, respectivamente. Los datos concuerdan bien con los datos de competición de ELISA/FACS que indican que CR-57 y CR04-098 no compiten por la unión a la proteína G de la cepa ERA y la buena actividad neutralizante del anticuerpo CR04-098 frente a todos los virus de escape E57. Basándose en estos resultados y el hecho de que la exposición in vitro de virus de la rabia a la combinación de CR57 y CR04-098 (selección en presencia de 4 UI/ml de cualquier anticuerpo) no proporcionó
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virus de escape (datos no mostrados), se concluyó que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, y pueden usarse ventajosamente en un cóctel de anticuerpos anti-virus de la rabia para el tratamiento de profilaxis tras la exposición.
Ejemplo 15
Evaluación de la conservación del epítopo reconocido por CR57 y CR04-098
Se alineó la región de unión mínima de CR-57 (aminoácidos KLCGVL dentro de SEQ ID NO: 332, la región de la glicoproteína de virus de la rabia reconocida por CR57 según se determina por medio de PEPSCAN y tecnología de exploración de alanina) con secuencias de nucleótidos de 229 aislados de virus de la rabia de genotipo 1 para evaluar la conservación del epítopo (véase la tabla 18). El conjunto de muestras contenía aislados humanos, aislados de murciélago y aislados de perros o de animales domésticos muy probablemente mordidos por perros con rabia. Un análisis de frecuencia de los aminoácidos en cada posición dentro de la región de unión mínima reveló que los residuos críticos que constituyen el epítopo estaban altamente conservados. La lisina en la posición uno se conservó en un 99,6% de los aislados, mientras que sólo en 1/229 aislados se observó una mutación K>R conservativa. Las posiciones dos y tres (L y C) se conservaron completamente. Se cree que el residuo de cisteína central participa estructuralmente en el plegamiento de la glicoproteína y se conserva en todos los lyssavirus (véase Badrane y Tordo, 2001). La glicina en la posición cuatro se conservó en un 98,7% de los aislados, mientras que en 3/229 aislados se observaron mutaciones hacia aminoácidos cargados (G>R en 1/229; G>E en 2/229). La quinta posición también se conservó con la excepción de un aislado en el que se observó una mutación V>I conservativa. En la sexta posición, que no es un residuo crítico según se determinó mediante exploración de sustitución con alanina, se observó una heterogeneidad significativa en los aislados naturales: L en el 70,7%, P en el 26,7% y S en el 2,6% de las cepas, respectivamente. En conjunto, se predice que aproximadamente el 99 por ciento de los virus de la rabia que pueden encontrarse se reconocen por el anticuerpo CR-57.
Se analizaron 123 de estos 229 aislados de virus para determinar la presencia de mutaciones tanto en el epítopo de CR-57 como en el CR04-098. Ninguno de estos 123 virus naturales contenía mutaciones en ambos epítopos. La mutación N>D según se observó en los virus de escape E98 sólo estaba presente en cinco aislados de virus. Estos virus eran geográficamente distintos y se aislaron de animales en África (véase la figura 9 para un árbol filogenético; los cinco aislados de virus, es decir AF325483, AF325482, AF325481, AF325480 y AF325485, se indican en negrita). El análisis filogenético de secuencias de glicoproteína reveló que los virus de la rabia con epítopos de CR57 mutados sólo están relacionados de manera distante con virus de la rabia que llevan un epítopo de CR04-098 mutado. Por tanto, la probabilidad de encontrar un virus de la rabia resistente a la neutralización mediante un cóctel de CR-57 y CR04-098 es prácticamente inexistente.
Tabla 1: Potencia neutralizante de CR-57 y CR-JB frente a virus de tipo natural y de escape

Virus

Potencia Potencia Virus Potencia Potencia

CR-57 (UI/mg)

CR-JB (UI/mg) CR-57 (UI/mg) CR-JB (UI/mg)

CVS-11

3797 605 CVS-11 3797 605

E57A2

0 <0,2 EJB2B 0,004 0,6

E57A3

0 419 EJB2C <0,004 2

E57B1

0 93 EJB2D <0,004 3

E57B2

0 <0,3 EJB2E <0,2 <0,3

E57B3

0 419 EJB2F <0,06 3

E57C3

0 31 EJB3F <0,04 0,06

Tabla 2: Cebadores de región variable de cadena lambda humana (sentido). Tabla 3: Cebadores de región variable de cadena kappa humana (sentido).

Nombre del cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuV1A

SEQ ID NO: 208

HuV1B

SEQ ID NO: 209

HuV1C

SEQ ID NO: 210

HuV2

SEQ ID NO: 211

HuV3A

SEQ ID NO: 212

HuV3

SEQ ID NO: 213

HuV4

SEQ ID NO: 214

HuV5

SEQ ID NO: 215

HuV6

imagen1 SEQ ID NO: 216

HuV7/8

SEQ ID NO: 217

HuV9

SEQ ID NO: 218

Nombre del cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuV1B

SEQ ID NO: 219

HuV2

SEQ ID NO: 220

HuV3

SEQ ID NO: 221

HuV4

SEQ ID NO: 222

HuV5

SEQ ID NO: 223

HuV6

SEQ ID NO: 224

Tabla 4: Cebadores de región variable de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido), cebadores de región J de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido), cebadores de región variable de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido) y cebadores de región J de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido).

Nombre del cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuVB-SalI

SEQ ID NO: 225

HuV2-SalI

SEQ ID NO: 226

HuV3B-SalI

SEQ ID NO: 227

HuV4B-SalI

SEQ ID NO: 228

HuV5-SalI

SEQ ID NO: 229

HuV6-SalI

SEQ ID NO: 230

HuV1-NotI

imagen1 SEQ ID NO: 231

HuJ2-NotI

SEQ ID NO: 232

HuJ3-NotI

imagen1 SEQ ID NO: 233

HuV4-NotI

imagen1 SEQ ID NO: 234

HuV5-NotI

SEQ ID NO: 235

HuV1A-SalI

SEQ ID NO: 236

HuV1B-SalI

SEQ ID NO: 237

HuV1C-SalI

SEQ ID NO: 238

HuV2-SalI

SEQ ID NO: 239

HuV3A-SalI

SEQ ID NO: 240

HuV3B-SalI

SEQ ID NO: 241

HuV4-SalI

SEQ ID NO: 242

HuV5-SalI

SEQ ID NO: 243

HuV6-SalI

imagen1 SEQ ID NO: 244

HuV7/8-SalI

SEQ ID NO: 245

HuV9-SalI

SEQ ID NO: 246

HuJ-NotI

imagen1 SEQ ID NO: 247

HuV2/3-NotI

SEQ ID NO: 248

HuJ4/5-NotI

imagen1 SEQ ID NO: 249

Tabla 5: Distribución de los diferentes productos de cadena ligera a lo largo de las 10 fracciones. imagen1
Tabla 6: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana (sentido).

Nombre del cebador

Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuVH1B/7A

SEQ ID NO: 250

HuVH1C

SEQ ID NO: 251

HuVH2B

SEQ ID NO: 252

HuVH3B

SEQ ID NO: 253

HuVH3C

SEQ ID NO: 254

HuVH4B

imagen1 SEQ ID NO: 255

HuVH4C

SEQ ID NO: 256

HuVH5B

SEQ ID NO: 257

HuVH6A

SEQ ID NO: 258

Tabla 7: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción SfiI/NcoI (sentido) y cebadores de región J de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción XhoI/BstEII (antisentido). imagen2

HuVH1B/7A-SfiI

SEQ ID NO: 259

HuVHIC-SfiI

imagen1 SEQ ID NO: 260

HuVH2B-SfiI

SEQ ID NO: 261

HuVH3B-SfiI

SEQ ID NO: 262

HuVH3C-SfiI

SEQ ID NO: 263

HuVH4B-SfiI

SEQ ID NO: 264

HuVH4C-SfiI

SEQ ID NO: 265

HuVH5B-SfiI

imagen1 SEQ ID NO: 266

HuVH6A.SfiI

imagen1 SEQ ID NO: 267

HuJH1/2-XhoI

SEQ ID NO: 268

HuJH3-XhoI

SEQ ID NO: 269

HuJH4/5-XhoI

imagen1 SEQ ID NO: 270

HuJH6-XhoI

imagen1 SEQ ID NO: 271

Tabla 8: Unión de anticuerpos de fagos monocatenarios (scFv) a proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) y a FBS según se mide mediante ELISA.

Nombre de anticuerpo de fagos

Proteína G de virus de la rabia (DO a 492 nm) FBS (DO a 492 nm)

SC04-001

0,828 0,053

SC04-004

0,550 0,054

SC04-008

0,582 0,058

SC04-010

0,915 0,043

SC04-018

0,247 0,052

SC04-021

0,278 0,052

SC04-026

0,212 0,054

SC04-031

0,721 0,065

SC04-038

0,653 0,061

SC04-040

0,740 0,053

SC04-060

0,923 0,056

SC04-073

0,657 0,054

SC04-097

0,835 0,056

SC04-098

0,798 0,060

SC04-103

0,606 0,059

SC04-104

0,566 0,063

SC04-108

0,363 0,052

SC04-120

0,571 0,052

SC04-125

0,735 0,049

SC04-126

0,232 0,051

SC04-140

0,865 0,057

SC04-144

0,775 0,054

SC04-146

0,484 0,057

SC04-164

0,547 0,057

Control (SO57)

0,650 0,055

Control (02-007)

0,063 0,052

Tabla 9: Datos de los Fv monocatenarios que pueden unirse a proteína G de virus de la rabia.

Nombre de scFv (bib.)

SEQ ID NO de secuencia de nucl. SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos HCDR3 (SEQ ID NO:) Locus de VH Locus de VL

sc04-001 (JK1994)

157 158 GLYGELFDY (SEQ ID NO: 1) 3-20 (DP32) V13 (31 -V213)

sc04-004 (WT2000)

159 160 DYLYPTTDFDY (SEQ ID NO: 2) 3-23 (DP47) VkI (012/02DPK9)

sc04-008 (RAB03- G01)

161 162 MGFTGTYFDY (SEQ ID NO: 3) 2-70 (DP28) V13 (3h -V214)

sc04-010 (RAB03- G01)

163 164 3-30 (DP49) VkI (L11 DPK3)

sc04-018 (RAB03- G01)

165 166 VSVTTGAFNI (SEQ ID NO: 5) 4-04 (DP70) V11 (1c -V116)

sc04-021 (RAB03- G01)

167 168 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 6) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-026 (RAB03- G01)

169 170 TSNWNYLDRFDP (SEQ ID NO: 7) 5-51 (DP73) VkII (A 19/03 -DPK15)

sc04-031 (RAB03- G01)

171 172 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 8) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)

sc04-038 (RAB03- G01)

173 174 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 9) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)

sc04-040 (RAB03- G01)

175 176 GSKVGDFDY (SEQ ID NO: 10) 3-30 (DP49) V13 (3h -V214)

sc04-060 (RAB04- G01)

177 178 4-59 (DP71) VkI (O12/02 DPK9)

sc04-073 (RAB04- G01)

179 180 imagen1 3-30 (DP49) VkI (L12)

sc04-097 (RAB04- G01)

181 182 TASNLGRGGMDV (SEQ ID NO: 13) 3-23 (DP47) VkI (L8)

sc04-098 (RAB04- G01)

183 184 VAVAGTHFDY (SEQ ID NO: 14) 3-30 (DP49) VkI (A30)

sc04-103 (RAB04- G01)

185 186 VAVAGESFDS (SEQ ID NO: 15) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)

sc04-104 (RAB04- G01)

187 188 IVVVTALDAFDI (SEQ ID NO: 16) 3-30 (DP49) VkI (L12)

sc04-108 (RAB

189 190 FMIVADDAFDI 3-30 (DP49) VkI (L1)

04- G01)

(SEQ ID NO: 17)

sc04-120 04- G01)

(RAB 191 192 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 18) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-125 04- G01)

(RAB 193 194 IATAGTGFDY (SEQ ID NO: 19) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-126 04- G01)

(RAB 195 196 MGFTGTYTDY (SEQ ID NO: 20) 2-70 (DP28) V13 (3h -V214)

sc04-140 04- G01)

(RAB 197 198 VTNPGDAFDI (SEQ ID NO: 21) 3-30 (DP49) VkI (L4/18a)

sc04-144 04- G01)

(RAB 199 200 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 22) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-146 04- G01)

(RAB 201 202 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 23) 3-30 (DP49) VkIII (L2 -DPK21)

sc04-164 04- G01)

(RAB 203 204 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 24) 3-30 (DP49) VkI (L19 DPK6)

SO57

205 206 1-69 (DP10) V12 (2e -VI3)

SOJB

312 313 RQHISSFPWFDS (SEQ ID NO: 276) 2-05 V13 (3h -V214)

Tabla 10: Datos de ensayo para determinar la actividad neutralizante contra el virus de la rabia de scFv.

Nombre de scFv

Dilución de criterio de valoración del 50% Norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) Potencia (UI/ml)

SC04-001

270 405 1,3

SC04-004

3645 405 18

SC04-008

>10935 405 >54

SC04-010

810 405 4

SC04-018

15 405 0,1

SC04-021

270 405 1,3

SC04-026

45 270 0,3

SC04-031

90 270 0,7

SC04-038

270 270 2

SC04-040

45 270 0,3

SC04-060

30 270 0,2

SC04-073

405 270 3

SC04-097

30 270 0,2

SC04-098

1215 270 9

SC04-103

45 270 0,3

SC04-104

135 270 1

SC04-108

135 270 1

SC04-120

810 270 6

SC04-125

405 270 3

SC04-126

10 270 0,1

SC04-140

135 270 1

SC04-144

810 270 6

SC04-146

405 270 3

SC04-164

45 270 0,3

Tabla 11A: Datos de ensayo para medir la actividad neutralizante de scFv para virus de escape E57 E57A2, E57A3 y E57B1.

Nombre de scFv

E57A2 E57A3 E57B1

1*

2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3*

SC04-001

10 90 0,2 10 90 0,2 30 45 1,3

SC04-004

810 90 18,0 1215 90 27,0 810 45 36,0

SC04-008

10 90 0,2 15 90 0,3 270 45 12,0

SC04-010

270 90 6,0 270 90 6,0 270 45 12,0

SC04-018

5 90 0,1 15 90 0,3 15 45 0,7

SC04-021

10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2

SC04-026

<5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0

SC04-031

10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2

SC04-038

90 90 2,0 90 90 2,0 45 90 1,0

SC04-040

15 90 0,3 5 90 0,1 5 90 0,1

SC04-060

5 90 0,1 5 90 0,1 <5 90 0,0.

SC04-073

135 90 3,0 90 30 6,0 30 30 2,0

SC04-097

<5 90 0,0 <5 90 0,0 <5 90 0,0

SC04-098

810 90 18,0 270 30 18,0 270 30 18,0

SC04-103

<5 90 0,0 10 90 0,2 5 90 0,1

SC04-104

90 90 2,0 30 30 2,0 30 30 2,0

SC04-108

15 90 0,3 <5 90 0,0 <5 90 0,0

SC04-120

45 90 1,0 30 30 2,0 10 30 0,7

SC04-125

135 90 3,0 135 30 9,0 90 30 6,0

SC04-126

<5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0

SC04-140

30 45 1,3 90 30 6,0 45 90 1,0

SC04-144

270 45 12,0 270 30 18,0 135 90 3,0

SC04-146

90 45 4,0 90 30 6,0 90 90 2,0

SC04-164

15 45 0,7 30 30 2,0 15 90 0,3

1* es la dilución de criterio de valoración del 50% 2* es la norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) 3* es la potencia (UI/ml)
Tabla 11 B: Data de ensayo para medir la actividad neutralizante de scFv para virus de escape E57 E57B2, E57B3 y E57C3.

Nombre de scFv

E57B2 E57B3 E57C3

1*

2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3*

SC04-001

30 45 1,3 90 270 0,7 5 90 0,1

SC04-004

5 45 0,2 2430 270 18,0 270 90 6,0

SC04-008

5 45 0,2 45 270 0,3 10 90 0,2

SC04-010

45 45 2,0 405 270 3,0 270 90 6,0

SC04-018

15 45 0,7 15 270 0,1 30 90 0,7

SC04-021

10 90 0,2 30 270 0,2 10 90 0,2

SC04-026

<5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0

SC04-031

10 90 0,2 30 270 0,2 30 90 0,7

SC04-038

30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0

SC04-040

5 90 0,1 15 135 0,2 10 90 0,2

SC04-060

<5 90 0,0 10 135 0,1 5 90 0,1

SC04-073

30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0

SC04-097

<5 90 0,0 <5 135 0,0 <5 90 0,0

SC04-098

90 90 2,0 810 270 6,0 270 90 6,0

SC04-103

<5 90 0,0 10 135 0,1 10 90 0,2

SC04-104

45 90 1,0 45 270 0,3 90 90 2,0

SC04-108

10 90 0,2 <5 135 0,0 15 90 0,3

SC04-120

15 90 0,3 45 270 0,3 30 90 0,7

SC04-125

90 90 2,0 270 270 2,0 270 90 6,0

SC04-126

<5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0

SC04-140

30 90 0,7 90 90 2,0 270 90 6,0

SC04-144

90 90 2,0 270 90 6,0 405 90 9,0

SC04-146

30 90 0,7 90 90 2,0 90 90 2,0

SC04-164

15 90 0,3 15 90 0,3 30 90 0,7

1* es la dilución de criterio de valoración del 50% 2* es la norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) 3* es la potencia (UI/ml)
Tabla 12: Oligonucleótidos usados para la amplificación mediante PCR de genes de VH.

Nombre y secuencia de nucleótidos

Gen de VH SEQ ID NO:

5H-B:

SC04-001 280

acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtggagtctg

5H-C: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgg

SC04-021 SC04-031 SC04-125 SC04-164 281

5H-C-largo: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgggg

SC04-010 SC04-038 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-120 SC04-140 SC04-144 SC04-146 282

5H-F: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctgcaggagtccggccc

SC04-018 SC04-060 283

5H-H: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtgcagtctgg

SC04-026 284

5H-I: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctgctggagtctgg

SC04-004 SC04-097 285

5H-M: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgaccttgaaggagtctgg

SC04-008 SC04-126 286

sy3H-A: gcccttggtgctagcgctggagacggtcaccagggtgccctggcccc

SC04-001 SC04-004 SC04-008 SC04-010 SC04-026 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-120 SC04-125 SC04-126 SC04-144 SC04-146 287

sy3H-C: gcccttggtgctagcgctggagacggtcacggtggtgccctggcccc

SC04-097 288

sy3H-C-largo:

SC04-060 289

sy3H-D: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccatggtgccctggcccc

SC04-018 SC04-021 SC04-031 SC04-038 SC04-104 SC04-108 SC04-140 SC04-164 290

sy3H-E: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccagggtgccccggcccc

SC04-103 291

Tabla 13: Oligonucleótidos usados para la amplificación mediante PCR de genes de VL.

Nombre y secuencia de nucleótidos

Gen de VL SEQ ID NO:

3L-B:

SC04-001 292

ttttccttagcggccgcgactcacctaggacggtcagcttggtc

5K-B: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtc

SC04-031 SC04-060 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-164 293

5K-C: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtctccatcct ccc

SC04-004 294

5K-G: acctgtctcgagttttccatggctgacatcgtgatgacccagtctcc

SC04-026 295

5K-K: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagatgacccagtctcc

SC04-010 296

5K-M: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagctgacccagtc

SC04-021 SC04-097 SC04-120 SC04-125 SC04-144 297

5K-N: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgactcagtc

SC04-038 298

5K-O: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagctgacccagtc

SC04-140 299

5K-Q: acctgtctcgagttttccatggctgagatcgtgatgactcagtc

SC04-146 300

5L-E: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagccg

SC04-008 301

5L-F: acctgtctcgagttttccatggctcagtccgtgctgactcagcc

SC04-018 302

5L-G: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagcc

SC04-040 303

SC04-126

sy3K-F: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccaccttggtccc

SC04-004 SC04-010 SC04-021 SC04-031 SC04-098 SC04-104 SC04-125 SC04-140 SC04-144 SC04-164 304

sy3K-I: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagccgtgtccc

SC04-038 SC04-097 SC04-103 SC04-108 SC04-146 305

sy3K-J: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagcttggtccc

SC04-026 SC04-060 SC04-073 306

sy3K-K: gctgggggcggccacggtccgcttgatgtccaccttggtccc

SC04-120 307

sy3L-A: ccagcacggtaagcttcagcacggtcaccttggtgccagttcc

SC04-018 SC04-126 308

sy3L-C: ccagcacggtaagcttcagcacggtcagcttggtgcctccgcc

SC04-040 309

sy3L-D: ccagcacggtaagcttcaacacggtcagctgggtccc

SC04-008 310

sy5L-A:

SC04-001 311

Tabla 14: Unión de los anticuerpos monoclonales humanos CR57, CRJB y CR04-010 (10 g/ml) a péptidos lineales del dominio extracelular de glicoproteína G de la cepa ERA del virus de la rabia.

Secuencia de aminoácidos de péptido lineal

CR57 CRJB CR04-010

KFPIYTILDKLGPWS

71 97 1

FPIYTILDKLGPWSP

42 105 39

PIYTILDKLGPWSPI

36 89 87

IYTILDKLGPWSPID

44 97 104

YTILDKLGPWSPIDI

48 114 91

TILDKLGPWSPIDIH

76 96 88

ILDKLGPWSPIDIHH

54 104 69

LDKLGPWSPIDIHHL

55 99 107

DKLGPWSPIDIHHLS

62 103 93

KLGPWSPIDIHHLSC

72 105 45

LGPWSPIDIHHLSCP

69 112 19

GPWSPIDIHHLSCPN

68 114 33

PWSPIDIHHLSCPNN

62 104 47

WSPIDIHHLSCPNNL

80 106 11

SPIDIHHLSCPNNLV

74 85 1

PIDIHHLSCPNNLVV

46 93 90

IDIHHLSCPNNLVVE

69 102 55

DIHHLSCPNNLVVED

38 96 78

IHHLSCPNNLVVEDE

37 85 113

HHLSCPNNLWEDEG

56 76 117

HLSCPNNLVVEDEGC

65 119 111

LSCPNNLVVEDEGCT

69 117 127

SCPNNLVVEDEGCTN

83 114 91

CPNNLVVEDEGCTNL

77 97 49

PNNLVVEDEGCTNLS

78 107 97

NNLVVEDEGCTNLSG

72 99 97

NLVVEDEGCTNLSGF

75 119 55

LVVEDEGCTNLSGFS

76 103 52

VVEDEGCTNLSGFSY

73 107 91

VEDEGCTNLSGFSYM

74 103 31

EDEGCTNLSGFSYME

54 90 7

DEGCTNLSGFSYMEL

1 23 1

EGCTNLSGFSYMELK

51 114 129

GCTNLSGFSYMELKV

55 114 118

CTNLSGFSYMELKVG

47 110 137

TNLSGFSYMELKVGY

43 106 161

NLSGFSYMELKVGYI

61 115 170

LSGFSYMELKVGYIL

71 132 169

SGFSYMELKVGYILA

79 132 161

GFSYMELKVGYILAI

65 111 141

FSYMELKVGYILAIK

89 112 192

SYMELKVGYILAIKM

65 123 152

YMELKVGYILAIKMN

78 114 150

MELKVGYILAIKMNG

76 141 107

ELKVGYILAIKMNGF

87 132 76

LKVGYILAIKMNGFT

78 112 118

KVGYILAIKMNGFTC

78 118 68

VGYILAIKMNGFTCT

77 93 1

GYILAIKMNGFTCTG

75 90 1

YILAIKMNGFTCTGV

47 107 107

ILAIKMNGFTCTGVV

79 103 104

LAIKMNGFTCTGVVT

68 130 159

AIKMNGFTCTGVVTE

47 103 152

IKMNGFTCTGVVTEA

68 108 138

KMNGFTCTGVVTEAE

76 104 133

MNGFTCTGVVTEAEN

69 99 148

NGFTCTGVVTEAENY

69 101 138

GFTCTGVVTEAENYT

71 86 129

FTCTGVVTEAENYTN

83 125 154

TCTGVVTEAENYTNF

92 112 129

CTGVVTEAENYTNFV

76 123 150

TGVVTEAENYTNFVG

85 110 154

GVVTEAENYTNFVGY

86 111 110

VVTEAENYTNFVGYV

87 106 114

VTEAENYTNFVGYVT

79 90 73

TEAENYTNFVGYVTT

68 84 8

EAENYTNFVGYVTTT

69 117 142

AENYTNFVGYVTTTF

66 106 110

ENYTNFVGYVTTTFK

44 112 183

NYTNFVGYVTTTFKR

49 114 174

YTNFVGYVTTTFKRK

51 104 138

TNFVGYVTTTFKRKH

71 125 165

NFVGYVTTTFKRKHF

65 107 154

FVGYVTTTFKRKHFR

70 111 152

VGYVTTTFKRKHFRP

75 113 155

GYVTTTFKRKHFRPT

70 123 160

YVTTTFKRKHFRPTP

85 106 160

VTTTFKRKHFRPTPD

79 105 119

TTTFKRKHFRPTPDA

80 108 137

TTFKRKHFRPTPDAC

74 99 110

TFKRKHFRPTPDACR

96 111 108

FKRKHFRPTPDACRA

64 92 62

KRKHFRPTPDACRAA

65 93 1

RKHFRPTPDACRAAY

64 107 99

KHFRPTPDACRAAYN

73 112 124

HFRPTPDACRAAYNW

46 113 118

FRPTPDACRAAYNWK

43 112 148

RPTPDACRAAYNWKM

77 101 129

PTPDACRAAYNWKMA

99 125 143

TPDACRAAYNWKMAG

92 132 160

PDACRAAYNWKMAGD

61 124 147

DACRAAYNWKMAGDP

84 113 136

ACRAAYNWKMAGDPR

82 116 138

CRAAYNWKMAGDPRY

87 118 137

RAAYNWKMAGDPRYE

90 130 120

AAYNWKMAGDPRYEE

68 106 120

AYNWKMAGDPRYEES

96 94 77

YNWKMAGDPRYEESL

83 118 116

NWKMAGDPRYEESLH

58 101 69

WKMAGDPRYEESLHN

69 101 1

KMAGDPRYEESLHNP

62 102 84

MAGDPRYEESLHNPY

64 116 112

AGDPRYEESLHNPYP

40 101 125

GDPRYEESLHNPYPD

36 98 123

DPRYEESLHNPYPDY

57 110 118

PRYEESLHNPYPDYR

73 115 129

RYEESLHNPYPDYRW

69 112 125

YEESLHNPYPDYRWL

58 106 120

EESLHNPYPDYRWLR

76 123 141

ESLHNPYPDYRWLRT

92 132 125

SLHNPYPDYRWLRTV

78 111 137

LHNPYPDYRWLRTVK

79 106 142

HNPYPDYRWLRTVKT

86 108 146

NPYPDYRWLRTVKTT

85 102 151

PYPDYRWLRTVKTTK

65 93 103

YPDYRWLRTVKTTKE

72 97 97

PDYRWLRTVKTTKES

76 85 27

DYRWLRTVKTTKESL

54 111 105

YRWLRTVKTTKESLV

46 117 125

RWLRTVKTTKESLVI

40 110 120

WLRTVKTTKESLVII

41 104 125

LRTVKTTKESLVIIS

65 104 161

RTVKTTKESLVIISP

82 120 150

TVKTTKESLVIISPS

76 116 150

VKTTKESLVIISPSV

71 120 154

KTTKESLVIISPSVA

101 112 147

TTKESLVIISPSVAD

78 121 141

TKESLVIISPSVADL

86 112 132

KESLVIISPSVADLD

86 117 111

ESLVIISPSVADLDP

88 125 143

SLVIISPSVADLDPY

68 105 125

LVIISPSVADLDPYD

85 107 93

VIISPSVADLDPYDR

59 98 50

IISPSVADLDPYDRS

83 125 14

ISPSVADLDPYDRSL

50 119 91

SPSVADLDPYDRSLH

59 114 118

PSVADLDPYDRSLHS

44 114 118

SVADLDPYDRSLHSR

49 106 129

VADLDPYDRSLHSRV

71 113 141

ADLDPYDRSLHSRVF

70 121 141

DLDPYDRSLHSRVFP

111 152 127

LDPYDRSLHSRVFPS

99 142 106

DPYDRSLHSRVFPSG

90 120 134

PYDRSLHSRVFPSGK

86 120 130

YDRSLHSRVFPSGKC

364 818 127

DRSLHSRVFPSGKCS

98 142 141

RSLHSRVFPSGKCSG

87 141 156

SLHSRVFPSGKCSGV

69 111 141

LHSRVFPSGKCSGVA

78 114 129

HSRVFPSGKCSGVAV

97 118 111

SRVFPSGKCSGVAVS

100 125 24

RVFPSGKCSGVAVSS

69 110 106

VFPSGKCSGVAVSST

74 114 142

FPSGKCSGVAVSSTY

64 134 146

PSGKCSGVAVSSTYC

56 112 132

SGKCSGVAVSSTYCS

64 121 120

GKCSGVAVSSTYCST

92 143 145

KCSGVAVSSTYCSTN

88 130 130

CSGVAVSSTYCSTNH

110 165 143

SGVAVSSTYCSTNHD

79 110 115

GVAVSSTYCSTNHDY

79 114 108

VAVSSTYCSTNHDYT

85 114 118

AVSSTYCSTNHDYTI

71 105 102

VSSTYCSTNHDYTIW

78 107 121

SSTYCSTNHDYTIWM

76 107 121

STYCSTNHDYTIWMP

86 99 119

TYCSTNHDYTIWMPE

96 107 74

YCSTNHDYTIWMPEN

47 92 29

CSTNHDYTIWMPENP

52 106 86

STNHDYTIWMPENPR

60 112 107

TNHDYTIWMPENPRL

69 129 119

NHDYTIWMPENPRLG

71 119 130

HDYTIWMPENPRLGM

82 125 123

DYTIWMPENPRLGMS

93 127 123

YTIWMPENPRLGMSC

97 132 143

TIWMPENPRLGMSCD

69 106 134

IWMPENPRLGMSCDI

98 110 101

WMPENPRLGMSCDIF

88 113 120

MPENPRLGMSCDIFT

105 121 143

PENPRLGMSCDIFTN

83 111 104

ENPRLGMSCDIFTNS

71 118 111

NPRLGMSCDIFTNSR

90 113 138

PRLGMSCDIFTNSRG

72 112 105

RLGMSCDIFTNSRGK

88 106 113

LGMSCDIFTNSRGKR

76 110 114

GMSCDIFTNSRGKRA

54 120 101

MSCDIFTNSRGKRAS

46 110 106

SCDIFTNSRGKRASK

44 111 98

CDIFTNSRGKRASKG

42 104 117

DIFTNSRGKRASKGS

70 107 111

IFTNSRGKRASKGSE

77 125 87

FTNSRGKRASKGSET

83 111 119

TNSRGKRASKGSETC

68 108 110

NSRGKRASKGSETCG

92 100 119

SRGKRASKGSETCGF

64 93 90

RGKRASKGSETCGFV

75 104 115

GKRASKGSETCGFVD

92 124 118

KRASKGSETCGFVDE

92 106 129

RASKGSETCGFVDER

86 110 134

ASKGSETCGFVDERG

97 108 103

SKGSETCGFVDERGL

92 102 76

KGSETCGFVDERGLY

90 97 44

GSETCGFVDERGLYK

57 115 92

SETCGFVDERGLYKS

33 116 86

ETCGFVDERGLYKSL

64 120 138

TCGFVDERGLYKSLK

47 120 125

CGFVDERGLYKSLKG

72 115 120

GFVDERGLYKSLKGA

84 120 129

FVDERGLYKSLKGAC

86 121 124

VDERGLYKSLKGACK

50 108 110

DERGLYKSLKGACKL

90 119 54

ERGLYKSLKGACKLK

90 118 106

RGLYKSLKGACKLKL

90 121 121

GLYKSLKGACKLKLC

94 129 92

LYKSLKGACKLKLCG

93 136 141

YKSLKGACKLKLCGV

80 112 110

KSLKGACKLKLCGVL

129 113 110

SLKGACKLKLCGVLG

200 111 124

LKGACKLKLCGVLGL

340 90 23

KGACKLKLCGVLGLR

181 111 100

GACKLKLCGVLGLRL

123 134 129

ACKLKLCGVLGLRLM

148 117 142

CKLKLCGVLGLRLMD

410 111 147

KLKLCGVLGLRLMDG

273 120 114

LKLCGVLGLRLMDGT

918 145 148

KLCGVLGLRLMDGTW

3152 132 86

LCGVLGLRLMDGTWV

83 138 129

CGVLGLRLMDGTWVA

99 117 104

GVLGLRLMDGTWVAM

89 148 117

VLGLRLMDGTWVAMQ

90 141 127

LGLRLMDGTWVAMQT

102 115 97

GLRLMDGTWVAMQTS

104 138 120

LRLMDGTWVAMQTSN

103 114 118

RLMDGTWVAMQTSNE

100 113 130

LMDGTWVAMQTSNET

96 106 106

MDGTWVAMQTSNETK

97 97 110

DGTWVAMQTSNETKW

69 114 92

GTWVAMQTSNETKWC

58 113 82

TWVAMQTSNETKWCP

78 118 107

WVAMQTSNETKWCPP

50 114 116

VAMQTSNETKWCPPD

86 104 151

AMQTSNETKWCPPDQ

104 114 128

MQTSNETKWCPPDQL

104 132 125

QTSNETKWCPPDQLV

92 120 155

TSNETKWCPPDQLVN

97 111 90

SNETKWCPPDQLVNL

99 129 110

NETKWCPPDQLVNLH

90 128 107

ETKWCPPDQLVNLHD

105 120 118

TKWCPPDQLVNLHDF

85 125 125

KWCPPDQLVNLHDFR

89 113 121

WCPPDQLVNLHDFRS

101 119 99

CPPDQLVNLHDFRSD

93 137 127

PPDQLVNLHDFRSDE

107 120 56

PDQLVNLHDFRSDEI

35 106 63

DQLVNLHDFRSDEIE

54 117 97

QLVNLHDFRSDEIEH

60 113 106

LVNLHDFRSDEIEHL

47 104 100

VNLHDFRSDEIEHLV

83 129 98

NLHDFRSDEIEHLVV

83 113 110

LHDFRSDEIEHLVVE

93 115 121

HDFRSDEIEHLVVEE

69 107 150

DFRSDEIEHLVVEEL

99 103 110

FRSDEIEHLVVEELV

86 114 116

RSDEIEHLVVEELVR

100 138 104

SDEIEHLVVEELVRK

101 117 118

DEIEHLVVEELVRKR

94 123 143

EIEHLWEELVRKRE

82 113 121

IEHLVVEELVRKREE

90 129 118

EHLVVEELVRKREEC

82 114 106

HLVVEELVRKREECL

82 123 46

LVVEELVRKREECLD

64 100 79

VVEELVRKREECLDA

62 108 97

VEELVRKREECLDAL

58 111 101

EELVRKREECLDALE

69 112 123

ELVRKREECLDALES

82 113 117

LVRKREECLDALESI

86 130 124

VRKREECLDALESIM

58 181 151

RKREECLDALESIMT

73 110 137

KREECLDALESIMTT

102 113 97

REECLDALESIMTTK

94 110 106

EECLDALESIMTTKS

82 120 133

ECLDALESIMTTKSV

91 112 125

CLDALESIMTTKSVS

101 146 155

LDALESIMTTKSVSF

97 116 152

DALESIMTTKSVSFR

104 120 188

ALESIMTTKSVSFRR

97 132 137

LESIMTTKSVSFRRL

48 114 130

ESIMTTKSVSFRRLS

62 111 114

SIMTTKSVSFRRLSH

54 130 97

IMTTKSVSFRRLSHL

43 101 111

MTTKSVSFRRLSHLR

59 116 125

TTKSVSFRRLSHLRK

66 118 111

TKSVSFRRLSHLRKL

83 125 123

KSVSFRRLSHLRKLV

108 124 129

SVSFRRLSHLRKLVP

64 123 117

VSFRRLSHLRKLVPG

90 111 105

SFRRLSHLRKLVPGF

92 110 96

FRRLSHLRKLVPGFG

90 108 111

RRLSHLRKLVPGFGK

92 143 118

RLSHLRKLVPGFGKA

93 123 148

LSHLRKLVPGFGKAY

96 139 150

SHLRKLVPGFGKAYT

113 132 132

HLRKLVPGFGKAYTI

99 111 102

LRKLVPGFGKAYTIF

83 118 82

RKLVPGFGKAYTIFN

47 115 86

KLVPGFGKAYTIFNK

47 114 123

LVPGFGKAYTIFNKT

54 112 139

VPGFGKAYTIFNKTL

58 114 138

PGFGKAYTIFNKTLM

78 113 157

GFGKAYTIFNKTLME

78 123 320

FGKAYTIFNKTLMEA

90 151 356

GKAYTIFNKTLMEAD

76 127 418

KAYT1FNKTLMEADA

101 123 554

AYTIFNKTLMEADAH

86 121 197

YTIFNKTLMEADAHY

104 147 161

TIFNKTLMEADAHYK

107 123 1405

IFNKTLMEADAHYKS

100 118 1828

FNKTLMEADAHYKSV

111 141 2736

NKTLMEADAHYKSVR

104 116 141

KTLMEADAHYKSVRT

91 98 123

TLMEADAHYKSVRTW

100 114 90

LMEADAHYKSVRTWN

73 107 97

MEADAHYKSVRTWNE

62 129 83

EADAHYKSVRTWNEI

58 97 106

ADAHYKSVRTWNEIL

56 100 100

DAHYKSVRTWNEILP

59 121 112

AHYKSVRTWNEILPS

112 160 125

HYKSVRTWNEILPSK

80 130 123

YKSVRTWNEILPSKG

66 137 116

KSVRTWNEILPSKGC

115 125 114

SVRTWNEILPSKGCL

106 138 118

VRTWNEILPSKGCLR

90 124 133

RTWNEILPSKGCLRV

120 127 120

TWNEILPSKGCLRVG

97 146 127

WNEILPSKGCLRVGG

102 136 117

NEILPSKGCLRVGGR

104 130 163

EILPSKGCLRVGGRC

104 112 128

ILPSKGCLRVGGRCH

79 113 107

LPSKGCLRVGGRCHP

77 119 100

PSKGCLRVGGRCHPH

69 138 91

SKGCLRVGGRCHPHV

72 121 103

KGCLRVGGRCHPHVN

68 130 115

GCLRVGGRCHPHVNG

85 125 123

CLRVGGRCHPHVNGV

102 132 134

LRVGGRCHPHVNGVF

104 143 133

RVGGRCHPHVNGVFF

86 143 99

VGGRCHPHVNGVFFN

120 136 120

GGRCHPHVNGVFFNG

86 119 119

GRCHPHVNGVFFNGI

117 113 117

RCHPHVNGVFFNGII

98 141 143

CHPHVNGVFFNGIIL

97 150 151

HPHVNGVFFNGIILG

104 138 164

PHVNGVFFNGIILGP

93 173 146

HVNGVFFNGIILGPD

97 123 114

VNGVFFNGIILGPDG

68 116 85

NGVFFNGIILGPDGN

66 117 97

GVFFNGIILGPDGNV

58 116 100

VFFNGIILGPDGNVL

55 132 108

FFNGIILGPDGNVLI

92 143 105

FNGIILGPDGNVLIP

61 139 130

NGIILGPDGNVLIPE

102 146 141

GIILGPDGNVLIPEM

107 132 123

IILGPDGNVLIPEMQ

85 118 93

ILGPDGNVLIPEMQS

125 134 119

LGPDGNVLIPEMQSS

100 134 150

GPDGNVLIPEMQSSL

86 154 157

PDGNVLIPEMQSSLL

87 129 139

DGNVLIPEMQSSLLQ

123 134 169

GNVLIPEMQSSLLQQ

96 120 168

NVLIPEMQSSLLQQH

72 120 150

VLIPEMQSSLLQQHM

92 104 142

LIPEMQSSLLQQHME

89 111 85

IPEMQSSLLQQHMEL

89 128 129

PEMQSSLLQQHMELL

62 133 93

EMQSSLLQQHMELLE

58 129 142

MQSSLLQQHMELLES

65 113 117

QSSLLQQHMELLESS

82 114 132

SSLLQQHMELLESSV

90 128 132

SLLQQHMELLESSVI

124 163 133

LLQQHMELLESSVIP

78 111 121

LQQHMELLESSVIPL

106 134 128

QQHMELLESSVIPLV

103 134 133

QHMELLESSVIPLVH

98 146 139

HMELLESSVIPLVHP

110 129 134

MELLESSVIPLVHPL

90 125 152

ELLESSVIPLVHPLA

90 133 155

LLESSVIPLVHPLAD

72 117 118

LESSVIPLVHPLADP

90 128 128

ESSVIPLVHPLADPS

104 138 143

SSVIPLVHPLADPST

73 104 93

SVIPLVHPLADPSTV

72 137 107

VIPLVHPLADPSTVF

69 141 123

IPLVHPLADPSTVFK

96 156 188

PLVHPLADPSTVFKD

93 112 138

LVHPLADPSTVFKDG

164 174 188

VHPLADPSTVFKDGD

98 138 125

HPLADPSTVFKDGDE

74 141 117

PLADPSTVFKDGDEA

99 125 90

LADPSTVFKDGDEAE

68 116 113

ADPSTVFKDGDEAED

147 152 110

DPSTVFKDGDEAEDF

98 147 137

PSTVFKDGDEAEDFV

104 143 141

STVFKDGDEAEDFVE

104 120 125

TVFKDGDEAEDFVEV

107 124 96

VFKDGDEAEDFVEVH

100 106 93

FKDGDEAEDFVEVHL

65 76 119

KDGDEAEDFVEVHLP

72 93 76

DGDEAEDFVEVHLPD

85 123 91

GDEAEDFVEVHLPDV

46 124 113

DEAEDFVEVHLPDVH

68 136 123

EAEDFVEVHLPDVHN

76 117 114

AEDFVEVHLPDVHNQ

123 138 123

EDFVEVHLPDVHNQV

90 141 123

DFVEVHLPDVHNQVS

96 141 118

FVEVHLPDVHNQVSG

92 143 102

VEVHLPDVHNQVSGV

106 141 123

EVHLPDVHNQVSGVD

91 150 139

VHLPDVHNQVSGVDL

110 114 137

HLPDVHNQVSGVDLG

104 150 129

LPDVHNQVSGVDLGL

104 154 154

PDVHNQVSGVDLGLP

106 129 115

DVHNQVSGVDLGLPN

117 133 113

VHNQVSGVDLGLPNW

100 119 38

HNQVSGVDLGLPNWG

76 106 38

NQVSGVDLGLPNWGK

78 138 98

Promedio

91,9 119,5 130,9

D.E.

157,9 37,6 169,8

Tabla 15: Potencias neutralizantes de IgG anti-proteína G de virus de la rabia.

Nombre de IgG

UI/mg

CR04-001

89

CR04-004

5

CR04-008

1176

CR04-010

3000

CR04-018

1604

CR04-021

1500

CR04-026

<2

CR04-031

272

CR04-038

2330

CR04-040

3041

CR04-060

89

CR04-073

6116

CR04-097

<1

CR04-098

7317

CR04-103

3303

CR04-104

4871

CR04-108

4871

CR04-120

4938

CR04-125

4718

CR04-126

2655

CR04-140

478

CR04-144

6250

CR04-146

ND

CR04-164

4724

CR57

3800

CRJB

605

ND = no determinado
Tabla 16: Potencias neutralizantes de IgG anti-proteína G de virus de la rabia frente a virus de escape E57.

Nombre

E57A2 E57A3 E57B1 E57B2 E57B3 E57C3

de IgG

(UI/mg) (UI/mg) (UI/mg) (UI/mg) (UI/mg) (UI/mg)

CR04-008

0* 0 0 0 0 0

CR04-010

8127 1355 5418 1355 2709 4064

CR04-018

1604 0 1604 0 59 535

CR04-021

450 2 150 8 50 50

CR04-038

9437 1573 9437 1049 6291 1573

CR04-040

8209 2736 24628 1368 5473 912

CR04-073

8256 1835 11008 1835 3669 1835

CR04-098

9878 3293 9878 3293 3293 3293

CR04-103

8917 2972 17835 2972 5945 2972

CR04-104

3288 2192 6576 2192 4384 1096

CR04-108

3288 731 4384 731 2192 731

CR04-120

1111 14 741 82 247 41

CR04-125

708 39 236 79 157 79

CR04-126

88 0 18 0 18 0

CR04-144

5625 2813 11250 2813 5625 1875

CR04-164

4252 472 4252 472 945 709

* 0 indica ausencia de criterio de valoración del 50% a una dilución de 1:100 del anticuerpo
Tabla 17. Potencia neutralizante de CR-57 frente a virus de escape E98.

E98-2 (UI/mg)

E98-4 (UI/mg) E98-5 (UI/mg) E98-6 (UI/mg) E98-7 (UI/mg)

CR-57

2813 8438 4219 2813 8438

CR04-098

0* 0 0 0 0

* Cero indica ausencia de criterio de valoración del 50% a una dilución de 1:1000 del anticuerpo.
Tabla 18: Aparición de residuos de aminoácido en la región de unión mínima de CR57 dentro de virus de la rabia de 10 genotipo 1.

Tipo natural

K L C G V L

K (99,6%)*

L (100%) C (100%) G (98,7%) V (99,6%) L (70,7%)

R (0,4%)

E (0,9%) I (0,4%) P (26,7%)

R (0,4%)

S (2,6%)

* Se muestra el porcentaje de aparición de cada aminoácido se muestra dentro de 229 aislados de virus de la rabia.
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<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3, E57B1 y E57B3
<400> 140 imagen1
<210> 141
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57B2 y E57C3
<400> 141 imagen1

<210> 142

<211> 15

<212> ADN

<213> Virus de la rabia

<220>

<221> misc_feature

<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11

<400> 142

cccgagaatc cgaga

15

<210> 143

<211> 15

<212> ADN

<213> Virus de la rabia

<220>

<221> misc_feature

<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C, EJB2D, EJB2E, EJB2F y EJB3F

<400> 143

cccgaggatc cgaga

15

<210> 144

<211> 15

<212> ADN

<213> Virus de la rabia

<220>

<221> misc_feature

<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11

<400> 144

tgtggagttc ttgga

15

<210> 145

<211> 15

<212> ADN

<213> Virus de la rabia

<220>

<221> misc_feature

<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C y EJB2F

<400> 145

tgtgaagttc ctgga

15

<210> 146

<211> 15

<212> ADN

<213> Virus de la rabia

<220>

<221> misc_feature

<223> Parte de la glicoproteína de EJB2D, EJB2E y EJB3F

<400> 146

tgtggagttc ctgga

15

<210> 147

<211> 13

<212> PRT

<213> Virus de la rabia

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11

<400> 147

imagen1
<210> 148
<211> 13
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C, EJB2D, EJB2E, EJB2F y EJB3F
<400> 148 imagen1
<210> 149
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 149 imagen1
<210> 150
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C y EJB2F
<400> 150 imagen1
<210> 151
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2D, EJB2E y EJB3F
<400> 151 imagen1
<210> 152
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido HuCkappa

<400> 152

acactctccc ctgttgaagc tctt

24

<210> 153

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido HuClambda2

<400> 153

tgaacattct gtaggggcca ctg

23

<210> 154

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido HuClambda7

<400> 154

agagcattct gcaggggcca ctg

23

<210> 155

<211> 4941

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector PDV-C06

<400> 155

imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 156
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuCIgG
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<212> ADN
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<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 157 imagen1 imagen1
<210> 158
<211> 247
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-001
<400> 158 <210> 159 imagen1
<211> 741
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 159 <210> 160 imagen1 imagen1
<211> 247
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-004
<400> 160 <210> 161 imagen1 imagen1
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 161 <210> 162 imagen1 imagen1
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-008
<400> 162 <210> 163 imagen1 imagen1
<211> 759
<212> ADN.
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-010
<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 163 <210> 164 imagen1 imagen1
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-010
<400> 164 imagen1
<210> 165
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<220>
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<223>
<400> 165 <210> 166 imagen1 imagen1
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
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<212> ADN
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<220>
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<223>
<400> 167 <210> 168 imagen1 imagen1
<211> 249
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<213> Secuencia artificial
<220>
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<223>
<400> 169 <210> 170 imagen1
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
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<212> ADN
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<220>
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<220>
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<223>
<400> 171 <210> 172 imagen1 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-031
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<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-038
<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 173 <210> 174 imagen1 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-038
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<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 175 <210> 176 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-040
<400> 176 <210> 177 imagen1 imagen1
<211> 774
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-060
<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 177 <210> 178 imagen1 imagen1
<211> 258
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-060
<400> 178 imagen1 imagen1
<210> 179
<211> 759
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-073
<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 179 <210> 180 imagen1

imagen1
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-073
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<211> 753
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 181 <210> 182 imagen1 imagen1
<211> 251
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-097
<400> 182 <210> 183 imagen1 imagen1
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 183 <210> 184 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-098
<400> 184 <210> 185 imagen1 imagen1
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-103
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(747)
<223>
<400> 185 <210> 186 imagen1 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-103
<400> 186 <210> 187 imagen1
<211> 759
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-104
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (759)
<223>
<400> 187 <210> 188 imagen1 imagen1
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-104
<400> 188 <210> 189 imagen1 imagen1
<211> 750
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-108
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(750)
<223>
<400> 189 imagen1
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-108
<400> 190 <210> 191 imagen1 imagen1
<211> 744
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-120
<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 191 <210> 192 imagen1 imagen1
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-120
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<210> 193
<211> 747 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-125
<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 193 <210> 194 imagen1 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-125
<400> 194 <210> 195 imagen1 imagen1
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-126
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (756)
<223>
<400> 195 <210> 196 imagen1 imagen1
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-126
<400> 196 <210> 197 imagen1 imagen1
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-140
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(747)
<223>
<400> 197 <210> 198 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-140
<400> 198 <210> 199 imagen1 imagen1
<211> 744
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-144
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(744)
<223>
<400> 199 <210> 200 imagen1 imagen1
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-144
<400> 200 <210> 201 imagen1 imagen1
<211> 744
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-146
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(744)
<223>
<400> 201 <210> 202 imagen1 imagen1
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-146
<400> 202 <210> 203 imagen1 imagen1
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-164
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(747)
<223>
<400> 203 <210> 204 imagen1
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-164
<400> 204 <210> 205 imagen1 imagen1
<211> 786
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SO57
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(786)
<223>
<400> 205 <210> 206 imagen1 imagen1
<211> 262
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SO57
<400> 206 imagen1
<210> 207
<211> 524
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Proteína G de la cepa ERA del virus de la rabia
<400> 207 imagen1 imagen1 imagen1

<210> 208

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda1A

<400> 208

cagtctgtgc tgactcagcc acc

23

<210> 209

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda1B

<400> 209

cagtctgtgy tgacgcagcc gcc

23

<210> 210 <223> Cebador HuVlambda4 <212> ADN

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda1C

<400> 210

cagtctgtcg tgacgcagcc gcc

23

<210> 211

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda2

<400> 211

cartctgccc tgactcagcc t

21

<210> 212

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador BuVlambda3A

<400> 212

tcctatgwgc tgactcagcc acc

23

<210> 213

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda3B

<400> 213

tcttctgagc tgactcagga ccc

23

<210> 214

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 214

cacgttatac tgactcaacc gcc

23

<210> 215

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda5

<400> 215

caggctgtgc tgactcagcc gtc

23

<210> 216

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador RuVlambda6

<400> 216

aattttatgc tgactcagcc cca

23

<210> 217

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda7/8

<400> 217

cagrctgtgg tgacycagga gcc

23

<210> 218

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda9

<400> 218

cwgcctgtgc tgactcagcc mcc

23

<210> 219

<211> 23

<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa1B
<400> 219 gacatccagw tgacccagtc tcc 23
<210> 220
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa2
<400> 220 gatgttgtga tgactcagtc tcc 23
<210> 221
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa3
<400> 221 gaaattgtgw tgacrcagtc tcc 23
<210> 222
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa4
<400> 222 gatattgtga tgacccacac tcc 23
<210> 223
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa5
<400> 223

gaaacgacac tcacgcagtc tcc

23

<210> 224

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVkappa6

<400> 224

gaaattgtgc tgactcagtc tcc

23

<210> 225

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVkappa1B-SalI

<400> 225

tgagcacaca ggtcgacgga catccagwtg acccagtctc c

41

<210> 226

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVkappa2-SalI

<400> 226

tgagcacaca ggtcgacgga tgttgtgatg actcagtctc c

41

<210> 227

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVkappa3B-SalI

<400> 227

tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgwtg acrcagtctc c

41

<210> 228

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <211> 48 <400> 237 <213> Secuencia artificial <210> 247

<223> Cebador HuVkappa4B-SalI

<400> 228

tgagcacaca ggtcgacgga tattgtgatg acccacactc c

41

<210> 229

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVkappa5-SalI

<400> 229

tgagcacaca ggtcgacgga aacgacactc acgcagtctc c

41

<210> 230

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVkappa6-SalI

<400> 230

tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgctg actcagtctc c

41

<210> 231

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJkappa1-NotI

<400> 231

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc

48

<210> 232

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJkappa2-NotI

<400> 232

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc

48

<210> 233

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJkappa3-NotI

<400> 233

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc

48

<210> 234

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJkappa4-NotI

<400> 234

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc

48

<210> 235

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJkappa5-NotI

<400> 235

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc

48

<210> 236

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda1A-SalI

<400> 236

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgctg actcagccac c

41

<210> 237

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador BuVlambda1B-SalI

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgytg acgcagccgc c

41

<210> 238

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda1C-SalI

<400> 238

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtcgtg acgcagccgc c

41

<210> 239

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda2-SalI

<400> 239

tgagcacaca ggtcgacgca rtctgccctg actcagcct

39

<210> 240

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda3A-SalI

<400> 240

tgagcacaca ggtcgacgtc ctatgwgctg actcagccac c

41

<210> 241

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda3B-SalI

<400> 241

tgagcacaca ggtcgacgtc ttctgagctg actcaggacc c

41

<210> 242

<211> 41

<212> ADN

<220>

<223> Cebador HuVlambda4B-SalI

<400> 242

tgagcacaca ggtcgacgca cgttatactg actcaaccgc c

41

<210> 243

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda5B-SalI

<400> 243

tgagcacaca ggtcgacgca ggctgtgctg actcagccgt c

41

<210> 244

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda6-SalI

<400> 244

tgagcacaca ggtcgacgaa ttttatgctg actcagcccc a

41

<210> 245

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda7/8-SalI

<400> 245

tgagcacaca ggtcgacgca grctgtggtg acycaggagc c

41

<210> 246

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVlambda9-SalI

<400> 246

tgagcacaca ggtcgacgcw gcctgtgctg actcagccmc c

41

<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJlambda1-NotI
<400> 247 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtgacc ttggtccc 48
<210> 248
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador RuJlambda2/3-NotI
<400> 248 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc 48
<210> 249
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJlambda4/5-NotI
<400> 249 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacytaa aacggtgagc tgggtccc 48
<210> 250
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1B/7A
<400> 250 cagrtgcagc tggtgcartc tgg 23
<210> 251
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1C <212> ADN

<400> 251

saggtccagc tggtrcagtc tgg

23

<210> 252

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH2B

<400> 252

saggtgcagc tggtggagtc tgg

23

<210> 253

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH3B

<400> 253

saggtgcagc tggtggagtc tgg

23

<210> 254

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH3C

<400> 254

gaggtgcagc tggtggagwc ygg

23

<210> 255

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH4B

<400> 255

caggtgcagc tacagcagtg ggg

23

<210> 256

<211> 23

<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4C
<400> 256 cagstgcagc tgcaggagtc sgg 23
<210> 257
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH5B
<400> 257 gargtgcagc tggtgcagtc tgg 23
<210> 258
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH6A
<400> 258 caggtacagc tgcagcagtc agg 23
<210> 259
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1B/7A-SfiI
<400> 259 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtgc agctggtgca rtctgg 56
<210> 260
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1C-SfiI
<400> 260

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtcc agctggtrca gtctgg

56

<210> 261

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH2B-SfiI

<400> 261

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtctgg

56

<210> 262

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH3B-SfiI

<400> 262

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtgc agctggtgga gtctgg

56

<210> 263

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH3C-SfiI

<400> 263

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga gwcygg

56

<210> 264

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH4B-SfiI

<400> 264

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctacagca gtgggg

56

<210> 265

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <211> 36

<223> Cebador HuVH4C-SfiI

<400> 265

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagstgc agctgcagga gtcsgg

56

<210> 266

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH5B-SfiI

<400> 266

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgargtgc agctggtgca gtctgg 56

<210> 267

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuVH6A-SfiI

<400> 267

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcagca gtcagg

56

<210> 268

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJH1/2-XhoI

<400> 268

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggtgcc

36

<210> 269

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJH3-XhoI

<400> 269

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccat tgtccc

36

<210> 270

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJH4/5-XhoI

<400> 270

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggttcc

36

<210> 271

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador HuJH6-XhoI

<400> 271

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccgt ggtccc

36

<210> 272

<211> 381

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada de CR57

<400> 272

imagen1
<210> 273
<211> 127
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de CR57
<400> 273 <210> 274 imagen1
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de CR57
<400> 274 imagen1
<210> 275
<211> 112
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de CR57
<400> 275 imagen1
<210> 276
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de CRJB
<400> 276 imagen1
<210> 277
<211> 6778
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> vector pSyn-C03-HCgamma1
<400> 277 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 278
<211> 6283
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector pSyn-C04-Clambda
<400> 278 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 279
<211> 6267
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector pSyn-C05-Ckappa
<400> 279 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 280
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-B
<400> 280 acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgg agtctg
<210> 281
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-C
<400> 281

acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgg

47

<210> 282

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5H-C-long

<400> 282

acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgggg

49

<210> 283

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5H-F

<400> 283

acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctgcagg agtccggccc

50

<210> 284

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5H-H

<400> 284

acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgc agtctgg

47

<210> 285

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5H-I

<400> 285

acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctgctgg agtctgg

47

<210> 286

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <211> 47 <400> 295 <213> Secuencia artificial <210> 305

<223> Oligonucleótido 5H-M

<400> 286

acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg accttgaagg agtctgg

47

<210> 287

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3H-A

<400> 287

gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac cagggtgccc tggcccc

47

<210> 288

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3H-C

<400> 288

gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc tggcccc

47

<210> 289

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3H-C-long

<400> 289

gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc ttgccccaga cgtc

54

<210> 290

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3H-D

<400> 290

gcccttggtg ctagcgctgg acacggtcac catggtgccc tggcccc

47

<210> 291

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido sy3H-E

<400> 291

gcccttggtg ctagcgctgg acacggtcac cagggtgccc cggcccc

47

<210> 292

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 3L-B

<400> 292

ttttccttag cggccgcgac tcacctagga cggtcagctt ggtc

44

<210> 293

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-B

<400> 293

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtc

44

<210> 294

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-C

<400> 294

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtctccatc ctccc

55

<210> 295

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-G

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc gtgatgaccc agtctcc

47

<210> 296

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-K

<400> 296

acctgtctcg agttttccat ggctgccatc cagatgaccc agtctcc

47

<210> 297

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-M

<400> 297

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagctgaccc agtc

44

<210> 298

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-N

<400> 298

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgactc agtc

44

<210> 299

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-O

<400> 299

acctgtctcg agttttccat ggctgccatc cagctgaccc agtc

44

<210> 300

<211> 44

<212> ADN

<220>

<223> Oligonucleótido 5K-Q

<400> 300

acctgtctcg agttttccat ggctgagatc gtgatgactc agtc

44

<210> 301

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5L-E

<400> 301

acctgtctcg agttttccat ggcttcctac gtgctgactc agccg

45

<210> 302

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5L-F

<400> 302

acctgtctcg agttttccat ggctcagtcc gtgctgactc agcc

44

<210> 303

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5L-G

<400> 303

acctgtctcg agttttccat ggcttcctac gtgctgactc agcc

44

<210> 304

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3K-F

<400> 304

gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc caccttggtc cc

42

<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-I
<400> 305 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc cagccgtgtc cc 42
<210> 306
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-J
<400> 306 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc cagcttggtc cc 42
<210> 307
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-K
<400> 307 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatgtc caccttggtc cc 42
<210> 308
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3L-A
<400> 308 ccagcacggt aagcttcagc acggtcacct tggtgccagt tcc 43
<210> 309
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>

<223> Oligonucleótido sy3L-C

<400> 309

ccagcacggt aagcttcagc acggtcagct tggtgcctcc gcc

43

<210> 310

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy3L-D

<400> 310

ccagcacggt aagcttcaac acggtcagct gggtccc

37

<210> 311

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sy5L-A

<400> 311

acctgtctcg agttttccat ggcttcctcc gagctgaccc aggaccctgc tg

52

<210> 312

<211> 756

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> scFv SOJB

<400> 312

imagen1
<210> 313
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> scFv SOJB
<400> 313 <210> 314 imagen1 imagen1
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 314 imagen1
<210> 315
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 315 imagen1
<210> 316
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 316 imagen1
<210> 317
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 317 imagen1
<210> 318
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 318 imagen1
<210> 319
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 319 imagen1
<210> 320
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 320 imagen1
<210> 321
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 321 imagen1
<210> 322
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
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<210> 323
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 323 imagen1
<210> 324
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 324 imagen1
<210> 325
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 325 imagen1
<210> 326
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 326 imagen1
<210> 327
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 327 imagen1
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 328 imagen1
<210> 329
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 329 imagen1
<210> 330
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 330 imagen1
<210> 331
<211> 15
<212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 331 imagen1
<210> 332
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 332 imagen1
<210> 333
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 333 imagen1
<210> 334
<211> 2083
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR04-098
<220>
<221> Intrón
<222> (358)..(484)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (779)..(1169)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1215)..(1332)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1663)..(1759)
<223>
<400> 334 imagen1 imagen1
<210> 335
<211> 449
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR04-098
<400> 335 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 336
<211> 847
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR04-098
<220>
<221> Intrón
<222> (322)..(526)
<223>
<400> 336 <210> 337 imagen1 imagen1
<211> 213
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR04-098
<400> 337 imagen1 imagen1

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Molécula de unión que tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, caracterizada por que la molécula de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o una región variable de cadena pesada y ligera que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con las mismas y en la que uno o más aminoácidos están alterados en comparación con la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63 y que puede competir para unirse específicamente al virus de la rabia o a un fragmento del mismo con la molécula de unión que comprende la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63, y que todavía tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia.

2. 2.

   Molécula de unión según la reivindicación 1, caracterizada por que la molécula de unión es humana.

3. 3.

   Molécula de unión según la reivindicación 1 ó 2, siendo la molécula de unión una IgG.

4. 4.

   Inmunoconjugado que comprende una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo el inmunoconjugado además al menos un agente terapéutico y/o agente detectable.

5. 5.

   Molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula de unión de según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. 6.

   Vector que comprende al menos una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. 7.

   Célula huésped que comprende al menos un vector según la reivindicación 6.

8. 8.

   Célula huésped según la reivindicación 7, que es una célula humana.

9. 9.

   Método de producción de una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo el método las etapas de:

   a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 7 u 8 en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de unión, y opcionalmente,

   b) recuperar la molécula de unión expresada.

10. 10.

    Composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo además la composición farmacéutica al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. 11.

    Composición farmacéutica según la reivindicación 10, que comprende al menos una molécula de unión adicional, que tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia y que se une a un epítopo diferente, no competitivo del virus de la rabia.

12. 12.

    Composición farmacéutica según la reivindicación 11, caracterizada por que la molécula de unión adicional comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 273 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 275.

13. 13.

    Molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, inmunoconjugado según la reivindicación 4, o composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12 para su uso como un medicamento.

14. 14.

    Molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, inmunoconjugado según la reivindicación 4, o composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, para su uso en la profilaxis o para su uso en el tratamiento, o combinación de los mismos, de la rabia.

15. 15.

    Kit que comprende al menos una molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, un inmunoconjugado según la reivindicación 4, o una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, o una combinación de los mismos.