ES2468021T3 - Moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas - Google Patents

Moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas Download PDF

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Abstract

Composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia que pueden reaccionar con epítopos diferentes, no competitivos del virus de la rabia, en la que una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo que comprende los aminoácidos 226-231 de la proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo ubicado en el sitio antigénico III que comprende los aminoácidos 330-338 de la proteína G del virus de la rabia

Description

Moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas
Campo de la invención
La invención se refiere a la medicina. En particular, la invención se refiere a moléculas de unión que neutralizan el 5 virus de la rabia. Las moléculas de unión son útiles en la profilaxis tras la exposición de la rabia.
Antecedentes de la invención
La rabia es una infección viral con distribución casi mundial que afecta principalmente a animales salvajes y domésticos pero que también implica a seres humanos, dando como resultado una encefalitis devastadora, letal de manera casi invariable. Anualmente, se estiman más de 70.000 víctimas mortales humanas, y millones de otras
10 personas requieren tratamiento tras la exposición.
El virus de la rabia es un virus de ARN monocatenario, con envuelta, con forma de bala, clasificado en la familia de los Rhabdovirus y del género Lyssavirus. El genoma del virus de la rabia codifica para cinco proteínas virales: ARN polimerasa dependiente de ARN (L); una nucleoproteína (N); una proteína fosforilada (P); una proteína de matriz (M) ubicada en el lado interno de la envuelta proteica viral; y una glicoproteína de superficie externa (G).
15 La proteína G (62-67 KDa) es una glicoproteína de tipo I compuesta por 505 aminoácidos que tiene de dos a cuatro posibles sitios de N-glicosilación, de los cuales solamente uno o dos se glicosilan dependiendo de las cepas del virus. La proteína G forma los salientes que cubren la superficie externa de la envuelta del virión y se sabe que induce anticuerpos que neutralizan el virus.
La rabia puede tratarse o prevenirse mediante inmunizaciones tanto pasivas como activas. La profilaxis tras la
20 exposición a la rabia incluye el cuidado inmediato de la herida local y la administración de inmunizaciones tanto pasivas (inmunoglobulinas anti-rabia) como activas (vacunas).
Actualmente, las inmunoglobulinas anti-rabia (RIG) se preparan a partir de las muestras de suero de o bien seres humanos inmunizados contra el virus de la rabia (HRIG) o bien caballos inmunizados contra el virus de la rabia (ERIG). Una desventaja de ERIG así como de HRIG es que no están disponibles en cantidades suficientes y, en el 25 caso de HRIG, es demasiado cara. Además, el uso de ERIG puede conducir a reacciones adversas tales como choque anafiláctico. La posibilidad de contaminación por patógenos conocidos o desconocidos es un problema adicional asociado con HRIG. Para superar estas desventajas se ha sugerido usar anticuerpos monoclonales que pueden neutralizar el virus de la rabia en profilaxis tras la exposición. Los anticuerpos monoclonales murinos que neutralizan el virus de la rabia se conocen en la técnica (véase Schumacher et al., 1989). Sin embargo, el uso de
30 anticuerpos murinos in vivo está limitado debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, tales como vida media en suero corta, una incapacidad para provocar ciertas funciones efectoras humanas y producción de una respuesta inmunitaria drástica no deseada contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción de “anticuerpo humano anti-ratón” (HAMA)).
Recientemente, se han descrito anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia (véase
35 Dietzschold et al., 1990, Champion et al., 2000, y Hanlon et al., 2001). Para que los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia sean tan eficaces como HRIG en la profilaxis tras la exposición debe usarse una mezcla de anticuerpos monoclonales. En una mezcla de este tipo cada anticuerpo debe unirse a un epítopo o sitio diferente en el virus para prevenir el escape de variantes resistentes del virus.
Actualmente, todavía existe una necesidad significativa de nuevos anticuerpos monoclonales humanos que
40 neutralizan el virus de la rabia que tengan potencial profiláctico tras la exposición mejorado, particularmente anticuerpos que tengan diferentes especificidades de reconocimiento de epítopo. La presente invención proporciona tales anticuerpos monoclonales humanos que ofrecen la posibilidad de usarse en mezclas útiles en la profilaxis tras la exposición de una amplia variedad de virus de la rabia y variantes resistentes a la neutralización de los mismos.
Breve descripción de las figuras
45 La figura 1 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape E57. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 1A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia
50 incluyendo el péptido señal. La figura 1B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 1 también están representadas por las SEQ ID No: 130-141.
La figura 2 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape EJB. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 2A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia
5 incluyendo el péptido señal. La figura 2B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 2 también están representadas por las SEQ ID No: 142-151.
La figura 3 muestra el vector PDV-C06.
10 La figura 4 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo biotinilado anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con scFv respectivos antes de la adición de CR-57bio (0,5 !g/ml). Posteriormente, se monitorizó la unión de CR-57bio en ausencia y presencia de scFv.
La figura 5 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo anti-virus de la rabia
15 denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con CR-57 (1 !g/ml) antes de la adición de scFv en exceso. Posteriormente, se monitorizó la unión de svFv en ausencia y presencia de CR-57.
La figura 6 muestra un ensayo de ELISA de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubó proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el
20 eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a la proteína G antes de visualización por medio del estreptavidina-HRP. Las señales de ELISA se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.
La figura 7 muestra un ensayo de FACS de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubaron células PER.C6 que expresan proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a las
25 células que expresan la proteína G antes de visualización por medio de estreptavidina-PE. Las señales de FACS se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.
La figura 8 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de virus de escape E98 y CVS-11. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestra la región que contiene una mutación puntual y la mutación se indica en
30 negrita. La figura 8A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. El número por encima del nucleótido indica el nucleótido mutado (indicado en negrita) del marco de lectura abierto de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido señal. La figura 8B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. El número por encima del aminoácido indica el aminoácido mutado (indicado en negrita) de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido señal.
35 La figura 9 muestra un árbol filogenético de 123 virus naturales de la rabia (123 secuencias de glicoproteína G del virus de la rabia, método de Kimura con 2 parámetros de unión al vecino “neighbor joining”, 500 cebadores). La negrita indica los virus que alojan la mutación N>D tal como se observa en los virus de escape E98.
La figura 10 muestra epítopos neutralizantes sobre la glicoproteína de la rabia. Se muestra una representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia que representa los sitos antigénicos incluyendo el epítopo de
40 CR57 novedoso. El péptido señal (19 aminoácidos) y el dominio transmembrana se indican mediante recuadros negros. Se indican los puentes disulfuro. La numeración de los aminoácidos es desde la proteína madura menos la secuencia del péptido señal.
Descripción de la invención
A continuación en el presente documento siguen definiciones de términos tal como se usan en la invención.
45 DEFINICIONES
Molécula de unión
Tal como se usa en el presente documento la expresión “molécula de unión” se refiere a una inmunoglobulina intacta incluyendo anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite 50 con la inmunoglobulina intacta para la unión específica a la pareja de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo el virus de la rabia o un fragmento del mismo tal como por ejemplo la proteína G. Independientemente de la estructura el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que reconoce la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al 55 menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20
residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 35 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión.
La expresión “molécula de unión”, tal como se usa en el presente documento incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos monocatenarios de fagos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al (poli)péptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o pueden obtenerse genéticamente mediante técnicas de ADN recombinante. Los métodos de producción se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow y D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes.
La molécula de unión puede ser una molécula de unión desnuda o no conjugada, pero también puede formar parte de un inmunoconjugado. Una molécula de unión desnuda o no conjugada pretende referirse a una molécula de unión que no está conjugada, operativamente unida o asociada física o funcionalmente de otro modo con un marcador o resto efector, tal como, entre otros, una sustancia tóxica, una sustancia radiactiva, un liposoma, una enzima. Se entenderá que moléculas de unión desnudas o no conjugadas no excluyen moléculas de unión que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o manipulado de cualquier otra forma, distinto de mediante la unión de un marcador o resto efector. En consecuencia, en el presente documento están incluidas todas las moléculas de unión desnudas y no conjugadas modificadas tras la traducción, incluyendo cuando las modificaciones se realizan en el entorno de la célula que produce la molécula de unión natural, mediante una célula que produce la molécula de unión recombinante y se introducen manualmente tras la preparación de la molécula de unión inicial. Naturalmente, la expresión molécula de unión desnuda o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de unión para formar asociaciones funcionales con moléculas y/o células efectoras tras la administración al organismo, ya que algunas de tales interacciones son necesarias con el fin de ejercer un efecto biológico. Por tanto, la falta de marcador o grupo efector asociado se aplica en la definición a la molécula de unión desnuda o no conjugada in vitro, no in vivo.
Regiones determinantes de la complementariedad (CDR)
La expresión “regiones determinantes de la complementariedad” tal como se usa en el presente documento significa secuencias dentro de las regiones variables de las moléculas de unión, tales como las inmunoglobulinas, que habitualmente contribuyen en gran medida al sitio de unión al antígeno que es complementario en forma y distribución de carga al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas para epítopos lineales, epítopos discontinuos o epítopos conformaciones de proteínas o fragmentos de proteínas, o bien tal como se presentan en la proteína en su conformación nativa, o bien en algunos casos, tal como se presentan en las proteínas cuando se desnaturalizan, por ejemplo, mediante solubilización en SDS. Los epítopos también pueden consistir en modificaciones postraduccionales de las proteínas.
Variante funcional
La expresión “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de unión que comprende un nucleótido y/o secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más nucleótidos y/o aminoácidos en comparación con las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de la molécula de unión original y que todavía puede competir por la unión a la pareja de unión, por ejemplo el virus de la rabia o un fragmento del mismo, con la molécula de unión original. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la molécula de unión original no afectan ni alteran significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, la molécula de unión todavía puede reconocer y unirse a su diana. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencia conservativas incluyendo sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR aleatoria, y pueden comprender nucleótidos y aminoácidos naturales así como no naturales.
Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se sustituye con un residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas o estructurales similares. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por 5 ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano). Resultará claro para el experto que también pueden emplearse otras clasificaciones de familias de residuos de aminoácidos aparte de la usada anteriormente. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservativas, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas o estructurales diferentes. Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Puede encontrarse una orientación en la determinación de qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad inmunológica usando programas informáticos
15 bien conocidos en la técnica.
Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una única alteración realizada en un locus (una mutación puntual), tal como mutaciones por transición o transversión, o alternativamente, pueden insertarse, delecionarse o cambiarse múltiples nucleótidos en un único locus. Además, pueden realizarse una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica.
Huésped
El término “huésped”, tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un microorganismo o una célula en el que se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El microorganismo o célula puede ser procariota o eucariota. Debe entenderse que este término pretende referirse no
25 sólo al microorganismo o célula objeto particular, sino también a la progenie de tal microorganismo o célula. Puesto que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido o bien a mutación o bien a influencias medioambientales, puede que de hecho tal progenie no sea idéntica al microorganismo o célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance de la expresión “huésped” tal como se usa en el presente documento.
Humano
El término “humano”, cuando se aplica a moléculas de unión tal como se definen en el presente documento, se refiere a moléculas que o bien se derivan directamente de un ser humano o bien están basadas en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión se deriva de o está basada en una secuencia humana y posteriormente se modifica, todavía debe considerarse humana tal como se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva. En otras palabras, el término humano, cuando se aplica a moléculas de unión pretende incluir moléculas de unión que tienen
35 regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana basadas en regiones variables o constantes ya se produzcan o no en un ser humano o linfocito humano o en forma modificada. Por tanto, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, comprender sustituciones y/o deleciones (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante por ejemplo mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). “Basado en” tal como se usa en el presente documento se refiere a la situación en la que puede copiarse exactamente una secuencia de ácido nucleico a partir de un molde, o con mutaciones menores, tal como mediante métodos de PCR propensos a errores, u obtenerse sintéticamente apareando el molde exactamente o con modificaciones menores. Las moléculas semisintéticas basadas en secuencias humanas también se consideran humanas tal como se usa en el presente documento.
45 Anticuerpo monoclonal
La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única, es decir estructura primaria, es decir que tiene una secuencia de aminoácidos única. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad y afinidad de unión únicas por un epítopo particular. En consecuencia, la expresión “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo que presenta una especificidad de unión única que tiene regiones variables y constantes derivadas de o basadas en secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana o derivadas de secuencias completamente sintéticas. El método de preparación del anticuerpo monoclonal no es relevante.
Molécula de ácido nucleico
La expresión “molécula de ácido nucleico” tal como se usa en la presente invención se refiere a una forma
55 polimérica de nucleótidos e incluye tanto cadenas sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico, y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido
o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. La expresión también incluye formas mono y bicatenarias de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir cualquiera o tanto nucleótidos que se producen de manera natural
como modificados unidos entre sí mediante enlaces de nucleótidos que se producen de manera natural y/o que no se producen de manera natural. Las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse de manera química o bioquímica o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, tal como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de manera natural con un análogo, modificaciones entre nucleótidos tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), moléculas de intercalación (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). La expresión anterior también pretende incluir cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones monocatenarias, bicatenarias, de dúplex parcial, triples, de horquilla, circulares y de candado. También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada a través de puentes de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces fosfato se sustituyen por enlaces peptídicos en la estructura principal de la molécula. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico engloba a su complemento a menos que se especifique otra cosa. Por tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular engloba a su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. La cadena complementaria también es útil, por ejemplo, para terapia antisentido, sondas de hibridación y cebadores de PCR.
Excipiente farmacéuticamente aceptable
Por “excipiente farmacéuticamente aceptable” se quiere decir cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa tal como un fármaco, agente, o molécula de unión para preparar una forma farmacéutica adecuada
o conveniente. El “excipiente farmacéuticamente aceptable” es un excipiente que no es tóxico, o al menos cuya toxicidad es aceptable para su uso deseado, para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y que es compatible con otros componentes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de unión.
Profilaxis tras la exposición
La “profilaxis tras la exposición” (PEP) se indica para personas posiblemente expuestas a un animal con rabia. Las posibles exposiciones incluyen exposición a mordedura (es decir, cualquier penetración de la piel por los dientes) incluyendo mordeduras de animales, y exposición sin mordedura. Las exposiciones sin mordedura incluyen exposición a grandes cantidades de virus de la rabia pulverizado en laboratorios o cuevas y receptores quirúrgicos de córneas trasplantadas de pacientes que murieron por la rabia. La contaminación de heridas abiertas, abrasiones, membranas mucosas, o teóricamente, arañazos, con saliva u otro material potencialmente infeccioso (tal como tejido nervioso) de un animal con rabia también constituye una exposición sin mordedura. Otro contacto por sí mismo, tal como acariciar a un animal con rabia y el contacto con sangre, orina o heces de un animal con rabia, no constituye una exposición y no es una indicación para profilaxis. PEP debe comenzar lo antes posible tras una exposición. Si no se ha producido exposición, no es necesaria la profilaxis tras la exposición. En todos los regímenes de profilaxis tras la exposición, excepto para personas previamente inmunizadas, deben usarse simultáneamente inmunizaciones activas y pasivas.
Unión específica
La expresión “unión específica”, tal como se usa en el presente documento, en referencia a la interacción de una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, y su pareja de unión, por ejemplo un antígeno, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular, por ejemplo un determinante antigénico o epítopo, en la pareja de unión. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferiblemente la pareja de unión incluso cuando la pareja de unión está presente en una mezcla de otras moléculas o microorganismos. La unión puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o por una combinación de ambas. En otras palabras, la expresión “unión específica” significa unión inmunoespecífica a un antígeno o a un fragmento del mismo y unión no inmunoespecífica a otros antígenos. Una molécula de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con afinidad menor tal como se determina mediante, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno pueden reaccionar de manera cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no reaccionan de manera cruzada con otros antígenos.
Cantidad terapéuticamente eficaz
La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de la molécula de unión tal como se define en el presente documento que es eficaz para la profilaxis tras la exposición de la rabia.
Vector
El término “vector” indica una molécula de ácido nucleico en la que puede insertarse una segunda molécula de ácido
nucleico para su introducción en un huésped en el que se replicará, y en algunos casos se expresará. En otras palabras, un vector puede transportar una molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. El término “vector”, tal como se usa en el presente documento contempla vectores de clonación así como de expresión. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas 5 artificiales de levaduras (YAC) y vectores derivados de bacteriófagos o virus de plantas o animales (incluyendo del ser humano). Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el huésped propuesto y en caso de los vectores de expresión, un promotor y otras regiones reguladoras reconocidas por el huésped. Un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico se introduce en una célula por ejemplo mediante transformación, transfección, o haciendo uso de mecanismos de entrada bacterianos o virales. Se conocen otras formas de introducir ácido nucleico en las células, tales como electroporación o bombardeo con partículas a menudo usadas con células vegetales, y similares. El método de introducir ácido nucleico en las células depende entre otras cosas del tipo de células, etc. Esto no es crítico para la invención. Ciertos vectores pueden realizar replicación autónoma en un huésped en el que se introducen (por ejemplo, los vectores que tienen un origen de replicación bacteriano pueden replicarse en bacterias). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de un huésped al introducirse en el
15 huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped.
Sumario de la invención
La invención proporciona moléculas de unión que pueden unirse específicamente a, y neutralizar, virus de la rabia.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención engloba moléculas de unión que pueden unirse específicamente al virus de la rabia. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención también tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención son moléculas de unión humanas. Alternativamente, también pueden ser moléculas de unión de otros animales. El virus de la rabia pertenece al género Lyssavirus. En total, al género Lyssavirus incluye once genotipos: virus de la rabia (genotipo 1), virus del murciélago de Lagos (genotipo 2), virus Mokola (genotipo 3), virus Duvenhage (genotipo 4), Lyssavirus del murciélago europeo
25 1 (genotipo 5), Lyssavirus del murciélago europeo 2 (genotipo 6), Lyssavirus del murciélago australiano (genotipo 7), virus Aravan (genotipo 8), virus Khujand (genotipo 9), virus Irkut (genotipo 10) y virus caucásico del oeste (genotipo 11). Además de unirse al virus de la rabia, las moléculas de unión de la invención también pueden ser capaces de unirse a otros genotipos del género Lyssavirus. Preferiblemente, las moléculas de unión también pueden ser capaces de neutralizar otros genotipos del género Lyssavirus. Además, las moléculas de unión de la invención pueden incluso ser capaces de unirse a y/o neutralizar virus, distintos de Lyssavirus, de la familia de Rhabdovirus. Esta familia incluye los géneros cytorhabdovirus, ephemerovirus, lyssavirus, nucleorhabdovirus, rhabdovirus y vesiculovirus.
Las moléculas de unión pueden ser capaces de unirse específicamente al virus de la rabia en su forma natural o en su forma inactivada/atenuada. La inactivación del virus de la rabia puede realizarse mediante tratamiento con, entre
35 otros, beta-propiolactona (BPL) (White y Chappel, 1982), calentamiento a 56ºC durante más de 30 minutos, irradiación gamma, tratamiento con acetiletilenimina o etilenimina o tratamiento con ácido ascórbico y sulfato de cobre durante 72 horas (Madhusudana et al., 2004). También pueden usarse métodos de inactivación viral general conocidos por el experto tales como, entre otros, pasteurización (calentamiento en húmedo), tratamiento térmico en seco, tratamiento térmico por vapor, tratamiento con pH bajo, tratamiento con disolvente orgánico/detergente, nanofiltración; irradiación con luz UV. Preferiblemente, la inactivación se realiza mediante tratamiento con betapropiolactona (BPL). El experto en la técnica conoce bien métodos para someter a prueba si el virus de la rabia todavía es infectivo o está parcial o completamente inactivado y pueden encontrarse, entre otros, en Laboratory techniques in rabies, editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, Capítulo 36, Organización Mundial de la Salud, Ginebra.
45 Las moléculas de unión también pueden ser capaces de unirse específicamente a uno o más fragmentos del virus de la rabia tales como, entre otros, una preparación de una o más proteínas y/o (poli)péptidos derivados del virus de la rabia o una célula transfectada con una proteína y/o (poli)péptido del virus de la rabia. Para los métodos de tratamiento y/o prevención tales como métodos para la profilaxis tras la exposición del virus de la rabia, las moléculas de unión preferiblemente pueden unirse específicamente a proteínas accesibles de superficie del virus de la rabia tales como la proteína M (véase Ameyama et al. 2003) o G. Para fines de diagnóstico, las moléculas de unión humanas también pueden ser capaces de unirse específicamente a proteínas no presentes sobre la superficie del virus de la rabia. La secuencia de aminoácidos de las proteínas de superficie accesibles e internas de diversas cepas conocidas del virus de la rabia puede encontrarse en la base de datos EMBL y/o en otras bases de datos.
Preferiblemente, el fragmento comprende al menos un determinante antigénico reconocido por las moléculas de
55 unión humanas de la invención. Un “determinante antigénico” tal como se usa en el presente documento es un resto tal como un (poli)péptido, (glico)proteína, o análogo o fragmento de los mismos del virus de la rabia, que puede unirse a una molécula de unión humana de la invención con afinidad suficientemente alta para formar un complejo antígeno-molécula de unión detectable.
Las moléculas de unión según la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intacta tales como anticuerpos
monoclonales o policlonales, en particular anticuerpos monoclonales humanos, o las moléculas de unión pueden ser fragmentos de unión a antígeno incluyendo, pero sin limitarse a, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos monocatenarios de fagos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al virus de la rabia o fragmento del mismo. Las moléculas de unión de la invención pueden usarse de forma aislada o no aislada. Además, las moléculas de unión de la invención pueden usarse solas o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión humana (o variante o fragmento del mismo). En otras palabras, las moléculas de unión pueden usarse en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de unión, variantes o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, las moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia pueden combinarse en una terapia única para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado.
Los virus de ARN tales como el virus de la rabia hacen uso de su propia ARN polimerasa durante la replicación del virus. Estas ARN polimerasas tienden a ser propensas a cometer errores. Esto conduce a la formación de las denominadas cuasiespecies durante una infección viral. Cada cuasiespecie tiene un genoma de ARN único, que podría dar como resultado diferencias en la composición de aminoácidos de las proteínas virales. Si se producen tales mutaciones en las proteínas virales estructurales, el virus podría escapar potencialmente del sistema inmunitario del huésped debido a un cambio en los epítopos de las células T o B. La posibilidad de que esto ocurra es superior cuando los individuos se tratan con una mezcla de dos moléculas de unión, tales como anticuerpos monoclonales humanos, que cuando se tratan con una mezcla de anticuerpos policlonales (HRIG). Por tanto, un requisito previo para una mezcla de dos anticuerpos monoclonales humanos para el tratamiento de la rabia es que los dos anticuerpos reconozcan epítopos no solapantes, no competitivos en su antígeno diana, es decir, la glicoproteína del virus de la rabia. De este modo se minimiza la posibilidad de que se produzcan virus de escape de la rabia. Como consecuencia, las moléculas de unión de la invención pueden reaccionar preferiblemente con diferentes epítopos no solapantes, no competitivos del virus de la rabia, tales como epítopos en la proteína G del virus de la rabia. La mezcla de moléculas de unión puede comprender además al menos otro agente terapéutico tal como un medicamento adecuado para la profilaxis tras la exposición de la rabia.
Normalmente, las moléculas de unión según la invención pueden unirse a sus parejas de unión, es decir al virus de la rabia o a fragmentos del mismo tales como proteínas del virus de la rabia, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es inferior a 0,2*10-4 M, 1,0*10-5 M, 1,0*10-6 M, 1,0*10-7 M, preferiblemente inferior a 1,0*10-8 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-9 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-10 M, incluso más preferiblemente inferior a 1,0*10-11 M, y en particular inferior a 1,0*10*-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para los isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión con afinidad de un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1,0*10-7 M. Las constantes de afinidad pueden medirse por ejemplo usando resonancia de plasmón superficial, es decir, un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).
Las moléculas de unión según la invención pueden unirse al virus de la rabia en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada. Las moléculas de unión pueden unirse al virus de la rabia en forma soluble tal como por ejemplo en una muestra o pueden unirse al virus de la rabia unidas o asociadas a un portador o sustrato, por ejemplo, placas de microtitulación, membranas y perlas, etc. Los portadores o sustratos pueden estar compuestos por vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, o teflón, etc. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Alternativamente, las moléculas de unión también pueden unirse a fragmentos del virus de la rabia tales como proteínas o (poli)péptidos del virus de la rabia. En una realización, las moléculas de unión pueden unirse específicamente a la proteína G del virus de la rabia o a un fragmento de la misma. Las proteínas o (poli)péptidos del virus de la rabia o bien pueden estar en forma soluble o bien pueden unirse al virus de la rabia unido o asociado a un portador o sustrato tal como se describió anteriormente. En otra realización, pueden usarse células transfectadas con la proteína G como pareja de unión para las moléculas de unión.
Según la invención, las moléculas de unión de la invención neutralizan la infectividad del virus de la rabia. Esto puede lograrse evitando la unión del virus de la rabia a sus receptores en células huésped, tales como, entre otros, el receptor de neurotrofina p75 murino, la molécula de adhesión celular neuronal (CD56) y el receptor de acetilcolina,
o la inhibición de la liberación del ARN en el citoplasma de la célula o evitando la transcripción o traducción del ARN. En una realización específica, las moléculas de unión de la invención evitan que el virus de la rabia infecte las células huésped en al menos el 99%, al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 45%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 35%, al menos el 30%, al menos el 25%, al menos el 20%, o al menos el 10% con respecto a la infección de las células huésped por el virus de la rabia en ausencia de dichas moléculas de unión. La neutralización puede medirse por ejemplo tal como se describe en Laboratory techniques in rabies, editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, Capítulos 15-17, Organización Mundial de la Salud, Ginebra. Además, las moléculas de unión humanas de la invención pueden moléculas de unión de fijación al complemento que pueden ayudar en la lisis del virus de la rabia con envuelta. Las moléculas de unión humanas de la invención también podrían actuar como opsoninas y aumentar la fagocitosis del virus de la rabia o bien potenciando su captación a través de receptores de Fc o C3b o bien aglutinando el virus de la rabia para hacer que se fagocite más fácilmente.
Las moléculas de unión pueden comprender al menos una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ
5 ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. En una realización la región CDR3 es una región CDR3 de cadena pesada.
Las moléculas de unión según la invención pueden comprender una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 10 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49. En una realización preferida, las moléculas de unión según la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos que comprende los
15 aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 335.
Las moléculas de unión según la invención pueden comprender una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, una cadena 20 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, una cadena 25 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, una cadena 30 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, una cadena 35 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, una cadena 40 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, una cadena 45 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, una cadena 50 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, una cadena
55 pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En una realización preferida, las moléculas de unión humanas según la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 335 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 337.
60 En una realización preferida, las moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia de la invención se administran en formato de IgG, preferiblemente en formato de IgG1.
Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de moléculas de unión tal como se definen en el presente documento. Las moléculas se consideran variantes funcionales de una molécula de unión según la invención, si las variantes pueden competir por la unión específica al virus de la rabia o a un fragmento del mismo con las moléculas de unión originales. En otras palabras, cuando las variantes funcionales todavía pueden unirse al virus de la rabia o a un fragmento del mismo. Las variantes funcionales también deben tener todavía actividad neutralizante contra el
5 virus de la rabia. Las variantes funcionales incluyen, pero no se limitan a, derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural primaria, pero que contienen por ejemplo modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión original. Tales modificaciones incluyen entre otras, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gammacarboxilación, glicosilación, formación de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tales como arginilación, ubiquitinación, y similares.
15 Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión tal como se define en la presente invención que comprenden una secuencia de aminoácidos que contiene sustituciones, inserciones, deleciones o combinaciones de los mismos de uno o más aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión originales. Además, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera o ambos extremos amino o carboxilo terminales. Las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión iguales o diferentes, o bien superiores o bien inferiores, en comparación con la molécula de unión original pero que todavía pueden unirse al virus de la rabia o a un fragmento del mismo y que todavía pueden neutralizar el virus de la rabia. Por ejemplo, las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión aumentadas o disminuidas por el virus de la rabia o por un fragmento del mismo en comparación con las moléculas de unión originales o pueden tener una actividad neutralizante superior o inferior
25 contra el virus de la rabia. Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, incluyendo, pero sin limitarse a, regiones de entramado, regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3, están modificadas. En general, las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y regiones más conservadas, las denominadas regiones de entramado (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácidos de CDR y residuos de aminoácidos de bucles hipervariables. Las variantes funcionales que se pretende que se encuentren dentro del alcance de la presente invención tienen al menos de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 99%, preferiblemente al menos de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 99%, más preferiblemente al menos de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 99%, incluso más preferiblemente al menos de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 99%, lo más preferiblemente al menos de aproximadamente el 90% a aproximadamente
35 el 99%, en particular al menos de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99%, y en particular al menos de aproximadamente el 97% a aproximadamente el 99% de homología de secuencia de aminoácidos con las moléculas de unión originales tal como se definen en el presente documento. Pueden usarse algoritmos informáticos tales como, entre otros, Gap o Bestfit conocidos por un experto en la técnica para alinear de manera óptima las secuencias de aminoácidos que van a compararse y definir residuos de aminoácidos similares o idénticos.
En otra realización, pueden producirse variantes funcionales cuando la molécula de unión original comprende un sitio de glicosilación en si secuencia que da como resultado la glicosilación de la molécula de unión con la expresión en células eucariotas y por tanto podría detener la unión al antígeno. La variante funcional producida ya no contiene el sitio de glicosilación, pero puede unirse al virus de la rabia y todavía tiene actividad neutralizante.
Las variantes funcionales pueden obtenerse alterando las moléculas de unión originales o partes de las mismas
45 mediante métodos de biología molecular generales conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos y mutagénesis dirigida al sitio. Además, las variantes funcionales pueden tener actividad de fijación al complemento, poder ayudar en la lisis de virus de la rabia con envuelta y/o actuar como opsoninas y aumentar la fagocitosis del virus de la rabia o bien potenciando su captación a través de los receptores de Fc o C3b o bien aglutinando el virus de la rabia para hacer que se fagocite más fácilmente.
La presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula de unión o variante funcional de la misma según la invención. Tales moléculas de ácido nucleico pueden usarse como productos intermedios para fines de clonación, por ejemplo en el proceso de maduración por afinidad descrito anteriormente. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico se aíslan o se purifican.
55 El experto apreciará que también se pretende que las variantes funcionales de estas moléculas de ácido nucleico sean una parte de la presente descripción. Las variantes funcionales son secuencias de ácidos nucleico que pueden traducirse directamente, usando el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de las moléculas de ácido nucleico originales.
Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden una región CDR3, preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.
Incluso más preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión humanas que
5 comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49. En una realización
10 particularmente preferida, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 335.
Aún en otra realización, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera 15 variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la 20 secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, o codifican 25 para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que comprende la 30 secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 35 NO: 37 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o codifican para una cadena pesada variable que 40 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ 45 ID NO: 66, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera variable que 50 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de 55 aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, o codifican para una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión humanas que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-119 de
60 SEQ ID NO: 335 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1-107 de SEQ ID NO: 337.
En una realización específica de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena pesada variable de las moléculas de unión de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 97. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena pesada variable de las moléculas de unión de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1-357 de SEQ ID NO:
334.
Aún en otra realización específica de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena ligera variable de las moléculas de unión de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena ligera variable de las moléculas de unión humanas de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 1-321 de SEQ ID NO: 336.
La descripción también proporciona vectores, es decir, constructos de ácido nucleico, que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico según la presente invención. Los vectores pueden derivarse de plásmidos tales como, entre otros, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cósmidos; fagos tales como lambda, lambdoide, M13, Mu, P1, P22, Qβ, T-even, T-odd, T2, T4, T7, etc; virus de plantas tales como, entre otros, el virus del mosaico de la alfalfa,
bromovirus, capillovirus, carlavirus, carmovirus, caulivirus, clostervirus, comovirus, cryptovirus, cucumovirus, dianthovirus, fabavirus, fijivirus, furovirus, geminivirus, hordeivirus, ilarvirus, luteovirus, machlovirus, marafivirus, necrovirus, nepovirus, phytoreovirus, rhabdovirus de plantas, potexvirus, potyvirus, sobemovirus, tenuivirus, tobamovirus, tobravirus, virus del bronceado del tomate, tombusvirus, tymovirus, etc; o virus de animales tales como, entre otros, adenovirus, arenaviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, calciviridae, cardiovirus, coronaviridae, corticoviridae, cystoviridae, virus Epstein-Barr, enterovirus, filoviridae, flaviviridae, virus de la glosopeda, hepadnaviridae, virus de la hepatitis, herpesviridae, virus de inmunodeficiencia, virus influenza, inoviridae, iridoviridae, orthomyxoviridae, papovavirus, paramyxoviridae, parvoviridae, picornaviridae, poliovirus, polydnaviridae, poxviridae, reoviridae, retrovirus, rhabdoviridae, rhinovirus, virus del bosque Semliki, tetraviridae, togaviridae, toroviridae, virus vaccinia, virus de la estomatitis vesicular, etc. Los vectores pueden usarse para la clonación y/o para la expresión de las moléculas de unión humanas de la invención y pueden incluso usarse para fines de terapia génica. La presente invención también cubre vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico según la invención unidas operativamente a una o más moléculas de ácido nucleico que regulan la expresión. La elección del vector depende de los procedimientos recombinantes seguidos y del huésped usado. La introducción de vectores en células huésped puede realizarse, entre otros, mediante transfección con fosfato de calcio, infección con virus, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección con lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden replicarse de manera autónoma o pueden replicarse junto con el cromosoma en el que se han integrado. Preferiblemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células huésped de elección, aunque esto no es crítico para la invención tal como conocen bien los expertos en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), el gen de la dihidrofolato reductasa de ratón (dhfr). La invención también cubre vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente unidas operativamente a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas o péptidos que pueden usarse para aislar las moléculas de unión. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-Stransferasa, proteína de unión a maltosa, polihistidina de unión a metales, proteína fluorescente verde, luciferasa y beta-galactosidasa.
También se dan a conocer huéspedes que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente. Preferiblemente, los huéspedes son células huésped. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen mamífero, vegetal, de insecto, fúngico o bacteriano. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias Gram positivas tales como varias especies de los géneros Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus o células de bacterias Gram negativas tales como varias especies de los géneros Escherichia, tales como E. coli, y Pseudomonas. En el grupo de las células fúngicas, preferiblemente se usan células de levadura. La expresión en levaduras puede lograrse usando cepas de levadura tales como entre otras Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha. Además, pueden usarse como células huésped células de insecto tales como células de Drosophila y Sf9. Además de esto, las células huésped pueden ser células vegetales. Las plantas o células vegetales transformadas (transgénicas) se producen mediante métodos conocidos, por ejemplo, transferencia génica mediada por Agrobacterium, transformación de discos de las hojas, transformación de protoplastos mediante transferencia de ADN inducida por polietilenglicol, electroporación, sonicación, microinyección
o transferencia génica balística. Adicionalmente, un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus En la presente invención se prefieren sistemas de expresión que usan células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK o células de melanoma de Bowes. Las células de mamífero proporcionan proteínas expresadas con modificaciones tras la traducción que son muy similares a las moléculas naturales de origen mamífero. Puesto que la presente invención trata de moléculas que pueden tener que administrarse a seres humanos, un sistema de expresión completamente humano sería particularmente preferido. Por tanto, incluso más preferiblemente, las células huésped son células humanas. Ejemplos de células humanas son, entre otras, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. Células de mamífero preferidas son células de
5 retina humana tales como células 911 o la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de esta solicitud “PER.C6” se refiere a células depositadas con el número 96022940 o ancestros, pasos hacia delante o hacia atrás así como descendientes de ancestros de células depositadas, sí como derivados de cualquiera de los anteriores.
En realizaciones preferidas, las células productoras humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región E1 de adenovirus en formato que puede expresarse. En realizaciones incluso más preferidas, dichas células huésped se derivan de una retina humana y están inmortalizadas con ácidos nucleicos que comprenden secuencias E1 adenovirales, tales como la línea celular
15 depositada en la Colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). La producción de proteínas recombinantes en células huésped puede realizarse según métodos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas con la marca PER.C6® como plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en el documento WO 00/63403.
También se da a conocer un método de producción de una molécula de unión o una variante funcional según la invención. El método comprende las etapas de a) cultivar un huésped según la invención en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de unión o variante funcional de la misma, y b) opcionalmente recuperar la molécula de unión o variante funcional de la misma expresadas. Las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas expresadas pueden recuperarse del extracto libre de células, pero preferiblemente se recuperan del
25 medio de cultivo. El experto en la técnica conoce bien métodos para recuperar proteínas, tales como moléculas de unión, a partir de extractos libres de células o medio de cultivo. Las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas tal como pueden obtenerse mediante el método descrito anteriormente también son una parte de la presente invención.
Alternativamente, además de la expresión en huéspedes, tales como células huésped, las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas de la invención pueden producirse de manera sintética mediante sintetizadores peptídicos convencionales o en sistemas de traducción libres de células usando ácido nucleico de ARN derivado de moléculas de ADN según la invención. La molécula de unión o variantes funcionales de la misma tal como pueden obtenerse mediante los métodos de producción sintéticos o sistemas de traducción libres de células descritos anteriormente también son una parte de la presente invención
35 En otra realización, las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas según la presente invención pueden generarse mediante mamíferos no humanos transgénicos, tales como por ejemplo ratones o conejos transgénicos, que expresan genes de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, los mamíferos no humanos transgénicos tienen un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana que codifican para todas o una parte de las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente. Los mamíferos no humanos transgénicos pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida del virus de la rabia o un fragmento del mismo. Los protocolos para inmunizar mamíferos no humanos están bien establecidos en la técnica. Véase Using Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Current Protocols in Immunology, editado por: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nueva
45 York.
En un aspecto adicional, la descripción proporciona un método de identificación de moléculas de unión, tales como anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de los mismos según la invención o moléculas de ácido nucleico según la invención que pueden unirse específicamente al virus de la rabia y comprende las etapas de a) poner en contacto una colección de moléculas de unión sobre la superficie de paquetes genéticos replicables con el virus de la rabia o un fragmento del mismo en condiciones que conducen a la unión, b) seleccionar al menos una vez paquetes genéticos replicables que se unen al virus de la rabia o al fragmente del mismo y c) separar y recuperar los paquetes genéticos replicables que se unen al virus de la rabia o al fragmento del mismo.
La etapa de selección puede realizarse en presencia del virus de la rabia. El virus de la rabia puede estar aislado o no aislado, por ejemplo presente en suero y/o sangre de un individuo infectado. En otra realización el virus de la 55 rabia está inactivado. Alternativamente, la etapa de selección puede realizarse en presencia de un fragmento del virus de la rabia tal como una parte extracelular del virus de la rabia, uno o más (poli)péptidos derivados del virus de la rabia tal como la proteína G, proteínas de fusión que comprenden estas proteínas o (poli)péptidos, y similares. En otra realización, se usan células transfectadas con proteína G del virus de la rabia para procedimientos de selección.
Aún en un aspecto adicional, la invención proporciona un método de obtención de una molécula de unión o una molécula de ácido nucleico según la invención, en el que el método comprende las etapas de a) realizar el método
descrito anteriormente de identificación de moléculas de unión, tales como anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de los mismos según la invención, o moléculas de ácido nucleico según la invención, y b) aislar a partir de los paquetes genéticos replicables recuperados la molécula de unión y/o el ácido nucleico que codifica para la molécula de unión. Una vez que se ha establecido o identificado un nuevo anticuerpo monoclonal con el método mencionado anteriormente de identificación de moléculas de unión o moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de unión, puede aislarse el ADN que codifica para el scFv o Fab a partir de las bacterias o paquetes genéticos replicables y combinarse con técnicas de biología molecular habituales para preparar constructos que codifican para scFv bivalentes o inmunoglobulinas humanas completas de una especificidad deseada (por ejemplo IgG, IgA o IgM). Estos constructos pueden transfectarse en líneas celulares adecuadas y pueden producirse anticuerpos monoclonales humanos completos (véase Huls et al., 1999; Boel et al., 2000).
Un paquete genético replicable tal como se usa en el presente documento puede ser procariota o eucariota e incluye células, esporas, bacterias, virus, (bacterió)fagos y polisomas. Un paquete genético replicable preferido es un fago. Las moléculas de unión humanas, tales como por ejemplo Fv monocatenarios, se presentan en el paquete genético replicable, es decir están unidas a un grupo o molécula ubicada en una superficie exterior del paquete genético replicable. El paquete genético replicable es una unidad que puede examinarse que comprende una molécula de unión humana que va a examinarse unida a una molécula de ácido nucleico que codifica para la molécula de unión. La molécula de ácido nucleico debe replicarse o bien in vivo (por ejemplo como un vector) o bien in vitro (por ejemplo, mediante PCR, transcripción y traducción). La replicación in vivo puede ser autónoma (como para una célula) con la ayuda de factores del huésped (como para un virus) o con la ayuda tanto del huésped como del virus auxiliar (como para un fagémido). Se forman paquetes genéticos replicables que presentan una colección de moléculas de unión humanas introduciendo moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de unión exógenas que van a presentarse en los genomas de los paquetes genéticos replicables para formar proteínas de fusión con proteínas endógenas que se expresan normalmente a partir de la superficie externa de los paquetes genéticos replicables. La expresión de las proteínas de fusión, el transporte a la superficie externa y el ensamblaje dan como resultado la presentación de moléculas de unión exógenas a partir de la superficie externa de los paquetes genéticos replicables. En un aspecto adicional la invención se refiere a una molécula de unión humana que puede unirse al virus de la rabia o a un fragmento del mismo y que puede obtenerse mediante el método de identificación tal como se describió anteriormente.
La descripción también se refiere a un método de identificación de una molécula de unión que tiene posiblemente actividad neutralizante frente al virus de la rabia, en el que el método comprende las etapas de (a) poner en contacto una colección de moléculas de unión sobre la superficie de paquetes genéticos replicables con el virus de la rabia en condiciones que conducen a la unión, (b) separar y recuperar las moléculas de unión que se unen al virus de la rabia de las moléculas de unión que no se unen, (c) aislar al menos una molécula de unión recuperada, (d) verificar si la molécula de unión aislada tiene actividad neutralizante frente al virus de la rabia, caracterizado porque el virus de la rabia en la etapa a está inactivado. El virus de la rabia inactivado puede purificarse antes de inactivarse. La purificación puede realizarse por medio de métodos de purificación bien conocidos adecuados para virus tales como por ejemplo centrifugación a través de un colchón de glicerol. El virus de la rabia inactivado en la etapa a puede inmovilizarse en un material adecuado antes de su uso. Alternativamente, el virus de la rabia en la etapa a todavía puede estar activo. En otra realización alternativa se usa un fragmento del virus de la rabia, tal como un polipéptido de un virus de la rabia tal como la proteína G, en la etapa a. Aún en otra realización se usan células transfectadas con proteína G del virus de la rabia para seleccionar moléculas de unión que tienen posiblemente actividad neutralizante frente al virus de la rabia. Tal como se indica en el presente documento, cuando se incluyeron células que expresaban proteína G del virus de la rabia en el método de selección, el número de anticuerpos neutralizantes seleccionados era más alto en comparación con los métodos de selección en los que solo se usó proteína G del virus de la rabia purificada y/o virus de la rabia inactivado.
En una realización adicional el método de identificación de una molécula de unión que tiene posiblemente actividad neutralizante frente al virus de la rabia tal como se describió anteriormente comprende además la etapa de separar y recuperar, y opcionalmente aislar, moléculas de unión humanas que contienen un gen de línea germinal 3-30 de cadena pesada variable. Un experto en la técnica puede identificar el gen de línea germinal específico mediante métodos conocidos en la técnica tales como por ejemplo secuenciación de nucleótidos. La etapa de separar y recuperar moléculas de unión que contienen un gen de línea germinal 3-30 de cadena pesada variable puede realizarse antes o después de la etapa c. Tal como se indica a continuación la mayoría de anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia encontrados en la presente invención comprenden este gen de línea germinal VH específico.
Métodos de presentación en fagos para identificar y obtener (neutralizar) moléculas de unión, por ejemplo anticuerpos, son en la actualidad métodos bien establecidos y conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo se describen en la patente estadounidense número 5.696.108; Burton y Barbas, 1994; de Kruif et al., 1995; y Phage Display: A Laboratory Manual. Editado por: CF Barbas, DR Burton, JK Scott y GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.
Para la construcción de bibliotecas de presentación en fago, se expresan colecciones de genes de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos monoclonales humanos en la superficie de bacteriófagos, preferiblemente bacteriófagos filamentosos, partículas, en por ejemplo formato de Fv monocatenarios (scFv) o en Fab (véase de
Kruif et al., 1995b). Grandes bibliotecas de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos contienen normalmente más de 1,0*109 especificidades de anticuerpo y pueden ensamblarse a partir de las regiones de inmunoglobulina V expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. En una realización específica de la invención la biblioteca de fagos de moléculas de unión humanas, preferiblemente biblioteca de fagos scFv, se prepara a partir de ARN aislado a partir de células obtenidas de un sujeto que se ha vacunado contra la rabia o expuesto a un virus de la rabia. Puede aislarse ARN a partir de, entre otros, médula ósea o sangre periférica, preferiblemente linfocitos de sangre periférica. El sujeto puede ser un animal vacunado o expuesto al virus de la rabia, pero es preferiblemente un sujeto humano que se ha vacunado o se ha expuesto al virus de la rabia. Preferiblemente el sujeto humano se ha vacunado. Una colección de moléculas de unión humanas en la superficie de paquetes genéticos replicables, tales como una biblioteca de fagos scFv, tal como se describió anteriormente es otro aspecto de la invención.
Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de presentación en fagos a partir de regiones variables de inmunoglobulina que se han ensamblado parcialmente in vitro para introducir diversidad de anticuerpos adicional en la biblioteca (bibliotecas semisintéticas). Por ejemplo, las regiones variables ensambladas in vitro contienen tramos de ADN producido sintéticamente, aleatorizado o parcialmente aleatorizado en las regiones de las moléculas que son importantes para la especificidad del anticuerpo, por ejemplo regiones CDR. Pueden seleccionarse anticuerpos en fagos específicos para el virus de la rabia a partir de las bibliotecas inmovilizando antígenos diana tales como antígenos del virus de la rabia sobre una fase sólida y posteriormente exponiendo los antígenos diana a una biblioteca de fagos para permitir la unión de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos específicos para el/los antígeno(s) unido(s) a la fase sólida. Se eliminan los fagos no unidos lavando y se eluyen los fagos unidos de la fase sólida para la infección de bacterias Escherichia coli (E. coli) y posterior propagación. Habitualmente se requieren múltiples rondas de selección y propagación para enriquecer de manera suficiente los fagos que se unen específicamente al/a los antígeno(s) diana. Si se desea, antes de exponer la biblioteca de fagos a antígenos diana, puede restarse en primer lugar la biblioteca de fagos exponiendo la biblioteca de fagos a antígenos no diana unidos a una fase sólida. Los fagos también pueden seleccionarse para que se unan a antígenos complejos tales como mezclas complejas de proteínas del virus de la rabia o (poli)péptidos, células huésped que expresan una o más proteínas o (poli)péptidos del virus de la rabia, o el propio virus de la rabia (inactivado). Pueden seleccionarse anticuerpos en fagos específicos para el antígeno a partir de la biblioteca incubando una fase sólida con una preparación unida sobre la misma de virus de la rabia inactivado con la biblioteca de anticuerpos en fagos para dejar que por ejemplo la parte scFv o Fab del fago se una a las proteínas/polipéptidos de la preparación de virus de la rabia. Tras la incubación y varios lavados para eliminar fagos no unidos y unidos débilmente, se eluyen los fagos que se han unido con su parte scFv o Fab a la preparación y se usan para infectar Escherichia coli para permitir la amplificación de la nueva especificidad. Generalmente se requieren una o más rondas de selección para separar los fagos de interés del gran exceso de fagos que no se unen. Alternativamente, pueden expresarse proteínas o (poli)péptidos conocidos del virus de la rabia en células huésped y estas células pueden usarse para la selección de anticuerpos en fagos específicos para las proteínas o (poli)péptidos. Un método de presentación en fago usando estas células huésped puede extenderse y mejorarse restando compuestos de unión no relevantes durante la selección mediante la adición de un exceso de células huésped que no comprenden moléculas diana o moléculas no diana que son similares, pero no idénticas, a la diana, y de ese modo se potencia fuertemente la posibilidad de encontrar moléculas de unión relevantes (Este procedimiento se denomina procedimiento MAbstract®. MAbstract® es una marca comercial registrada de Crucell Holland B.V., véase también la patente estadounidense número 6.265.150).
La descripción proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de unión, al menos una variante funcional o un fragmento de la misma, al menos un inmunoconjugado según la invención o una combinación de los mismos. Las composiciones pueden comprender además, entre otros, moléculas de estabilización, tales como albúmina o polietilenglicol, o sales. Preferiblemente, las sales usadas son sales que conservan la actividad biológica deseada de las moléculas de unión humanas y no confieren ningún efecto toxicológico no deseado. Si es necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden recubrirse con un material para protegerlas de la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de unión.
La descripción también proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico tal como se define en la presente descripción. Las composiciones pueden comprender disoluciones acuosas tales como disoluciones acuosas que contienen sales (por ejemplo, NaCl o sales tal como se describió anteriormente), detergentes (por ejemplo, SDS) y/u otros componentes adecuados.
Además, la presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula de unión según la invención, al menos una variante funcional o fragmento de la misma, al menos un inmunoconjugado según la invención, al menos una composición según la invención, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica de la invención comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede comprender al menos una molécula de unión adicional, es decir la composición farmacéutica puede ser un cóctel/mezcla de moléculas de unión. La composición farmacéutica puede comprender al menos dos moléculas de unión según la invención o al menos una molécula de unión según la invención y al menos una molécula de de unión anti-virus de la rabia adicional. Dicha molécula de unión adicional comprende
preferiblemente una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. La molécula de unión que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 puede ser un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o un fragmento funcional del mismo, pero preferiblemente es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento funcional del mismo. En una realización, la molécula de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 273. En otra realización, la molécula de unión comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 275. Aún en otra realización, la molécula de unión comprende una cadena pesada y ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 125, respectivamente. Las moléculas de unión en la composición farmacéutica deben poder reaccionar con diferentes epítopos no competitivos del virus de la rabia. Los epítopos pueden estar presentes en la proteína G del virus de la rabia y pueden ser epítopos no solapantes diferentes. Las moléculas de unión deben ser de alta afinidad y deben tener una amplia especificidad. Preferiblemente, neutralizan tantas cepas fijas y naturales del virus de la rabia como sea posible. Incluso más preferiblemente, también muestran actividad neutralizante hacia otros genotipos del género Lyssavirus o incluso con otros virus de la familia de rhabdovirus, mientras que no muestran reactividad cruzada con otros virus o con proteínas celulares normales. Preferiblemente, la molécula de unión puede neutralizar variantes de escape de la otra molécula de unión en el cóctel.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia, preferiblemente moléculas de unión (humanas) según la invención, caracterizada porque las moléculas de unión pueden reaccionar con epítopos no competitivos diferentes del virus de la rabia. Según la invención, la composición farmacéutica comprende una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede reaccionar con un epítopo que comprende los aminoácidos 226-231 de la proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede reaccionar con un epítopo ubicado en el sitio antigénico III que comprende los aminoácidos 330-338 de la proteína G del virus de la rabia. La estructura antigénica de la glicoproteína de la rabia se definió inicialmente por Lafon et al. (1983). Los sitios antigénicos se identificaron usando un panel de Acm de ratón y sus respectivas variantes del virus resistentes a Acm. Desde entonces, los sitios antigénicos se han mapeado mediante la identificación de mutaciones de aminoácidos en la glicoproteína de variantes resistentes a Acm (véase Seif et al., 1985; Prehaud et al., 1988; y Benmansour et al., 1991). La mayoría de los Acm que neutralizan la rabia se dirigen contra el sitio antigénico II (véase Benmansour et al., 1991), que es un epítopo conformacional discontinuo que comprende los aminoácidos 3442 y los aminoácidos 198-200 (véase Prehaud et al., 1988). El sitio antigénico III es un epítopo conformacional continuo en los aminoácidos 330-338 y alberga dos residuos cargados, K330 y R333, que afectan a la patogenicidad viral (véase Seif et al., 1985; Coulon et al., 1998; y Dietzschold et al., 1983). El sitio antigénico conformacional I se definió mediante sólo un Acm, 509-6, y se ubicó en el aminoácido 231 (véase Benmansour et al., 1991; y Lafon et al., 1983). Se sabe que el sitio antigénico IV alberga epítopos lineales solapantes (véase Tordo, 1996; Bunschoten et al., 1989; Luo et al., 1997; y Ni et al., 1995). Benmansour et al. (1991) también describieron la presencia de un sitio menor ubicado en la posición 342-343, que es distinto del sitio antigénico III pese a su proximidad cercana. El alineamiento del epítopo CR-57 con los epítopos neutralizantes conformacionales y lineales conocidos en la actualidad en la glicoproteína de la rabia (figura 10) reveló que el epítopo CR-57 está ubicado en la misma región que el sitio antigénico conformacional I, definido mediante el Acm 509-6 único. Basándose en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la glicoproteína de los virus de escape de CR04-098, el epítopo reconocido por este anticuerpo parece estar ubicado en la misma región que el sitio antigénico conformacional continuo III.
En una realización preferida la composición farmacéutica comprende una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que comprende al menos una región CDR3, preferiblemente la región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que comprende al menos una región CDR3, preferiblemente la región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22. Más preferiblemente, la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende al menos una región CDR3, preferiblemente la región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Preferiblemente, la primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende una cadena pesada y ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 125, respectivamente, y la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende una cadena pesada y ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 335 y SEQ ID NO: 337, respectivamente. Preferiblemente, la cadena pesada y ligera de la primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia están codificadas por SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 124, respectivamente, y la cadena pesada y ligera de la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia están codificadas por SEQ ID NO: 334 y SEQ ID NO: 336, respectivamente.
Las moléculas de unión presentes en la composición farmacéutica de la invención aumentan la actividad neutralizante unas de otras, es decir, actúan sinérgicamente cuando se combinan En otras palabras, las composiciones farmacéuticas pueden mostrar actividad neutralizante sinérgica contra virus de la rabia, e incluso contra lyssavirus. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “sinérgica” significa que el efecto combinado de las moléculas de unión cuando se usan en combinación es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan individualmente. Los intervalos y razones de los componentes de las composiciones farmacéuticas de la invención deben determinarse basándose en sus potencias individuales y deben someterse a prueba en ensayos de
neutralización in vitro o en modelos animales tales como hámsteres
Además, la composición farmacéutica según la invención puede comprender al menos otro agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico. Dichos agentes terapéuticos y/o profilácticos adicionales pueden ser agentes antivirales tales como ribavirina o interferón-alfa.
Las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención pueden someterse a prueba en sistemas de modelos animales adecuados antes de su uso en seres humanos. Tales sistemas de modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, hámsteres, monos, etc.
Normalmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de unión humanas, variantes o fragmentos de las mismas, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en forma de polvo para su reconstitución en el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el momento de la administración. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución que se ha sometido previamente a esterilización por filtración de la misma.
Alternativamente, las moléculas de unión, variantes o fragmentos de las mismas, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en disolución y puede añadirse y/o mezclarse el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el momento de la administración para proporcionar una forma farmacéutica inyectable unitaria. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es adecuado para una alta concentración de fármaco, puede mantener la fluidez apropiada y, si es necesario, puede retrasar la absorción.
La elección de la vía de administración óptima de las composiciones farmacéuticas estará influida por varios factores incluyendo las propiedades físico-químicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones plasmáticas de las moléculas activas con respecto al efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, si es necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden prepararse con vehículos que las protegerán frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse, entre otros, polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de unión humanas con, o coadministrar las moléculas de unión con, un material o compuesto que evita la inactivación de las moléculas de unión humanas. Por ejemplo, las moléculas de unión humanas pueden administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente.
Las vías de administración pueden dividirse en general en dos categorías principales, administración oral y parenteral. La administración preferida de las moléculas de unión humanas y las composiciones farmacéuticas de la invención es en y alrededor de la herida y por vía intramuscular en la región glútea. Las formulaciones de las moléculas de unión humanas y las composiciones farmacéuticas dependen de las vías de administración.
En un aspecto adicional, las moléculas de unión, variantes funcionales, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse como un medicamento. Por tanto, un método de tratamiento y/o prevención de una infección por lyssavirus que usa las moléculas de unión humanas, variantes funcionales, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención es otra parte de la presente invención. El lyssavirus puede ser un virus de cualquiera de los genotipos conocidos, pero preferiblemente es el virus de la rabia. Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden usarse en la profilaxis tal la exposición de la rabia.
Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden emplearse junto con otras moléculas útiles en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento del virus de la rabia. Pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las moléculas de unión humanas, variantes funcionales, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse conjuntamente con una vacuna frente a la rabia. Alternativamente, la vacuna también puede administrarse antes o después de la administración de las moléculas o composiciones de la invención. La administración de las moléculas o composiciones de la invención con una vacuna es adecuada para la profilaxis tras la exposición. Las vacunas de la rabia incluyen, pero no se limitan a, vacuna de células embrionarias de pollo purificadas (PCEC) (RabAvert), vacuna de células diploides humanas (HDCV; vacuna Imovax) o vacuna para la rabia adsorbida (RVA).
Las moléculas se formulan normalmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz o eficaz para diagnóstico. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Un intervalo de dosificación adecuado puede ser por ejemplo de 0,1-100 UI/kg de peso corporal, preferiblemente 1,0-50 UI/kg de peso corporal y más preferiblemente 10-30 UI/kg de peso corporal, tal como 20 UI/kg de peso corporal.
Preferiblemente, se administra un único bolo de las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la
invención. Las moléculas y composiciones farmacéuticas según la presente invención son preferiblemente estériles. En la técnica se conocen bien métodos para hacer que estas moléculas y composiciones sean estériles. El régimen de dosificación de profilaxis tras la exposición es la administración de cinco dosis de vacuna para la rabia por vía intramuscular en el músculo deltoides en los días 0, 3, 7, 14 y 28 tras la exposición en individuos no inmunizados previamente frente al virus de la rabia. Las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas según la invención deben administrarse en y alrededor de las heridas en el día 0 o de lo contrario lo antes posible tras la exposición, administrándose el resto del volumen por vía intramuscular en un sitio distante de la vacuna. Se aconseja a los individuos no vacunados que se administren moléculas de unión humanas anti-virus de la rabia, pero queda claro que también pueden administrarse moléculas de unión humanas anti-virus de la rabia al experto en la técnica que vacunó a los individuos que necesitaban tal tratamiento.
En otro aspecto, la descripción se refiere al uso de moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas, inmunoconjugados según la invención, moléculas de ácido nucleico según la invención, composiciones o composiciones farmacéuticas según la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, la profilaxis, el tratamiento, o combinación de los mismos, de un estado resultante de una infección por un lyssavirus. El lyssavirus puede ser un virus de cualquiera de los genotipos conocidos pero es preferiblemente virus de la rabia. Preferiblemente las moléculas mencionadas anteriormente se usan en la preparación de un medicamento para la profilaxis tras la exposición de la rabia.
A continuación, kits que comprenden al menos una molécula de unión según la invención, al menos una variante funcional de la misma, al menos un inmunoconjugado, al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una composición, al menos una composición farmacéutica según la invención, al menos un vector, al menos un huésped
o una combinación de los mismos también son parte de la presente descripción. Opcionalmente, los componentes descritos anteriormente de los kits de la invención se envasan en recipientes adecuados y se etiquetan para el diagnóstico, profilaxis y/o el tratamiento de los estados indicados. Los componentes mencionados anteriormente pueden almacenarse en recipientes unitarios o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas, viales, botellas, jeringuillas y tubos de ensayo, como disolución acuosa, preferiblemente estéril, o como formulación liofilizada, preferiblemente estéril, para la reconstitución. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico y pueden tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El kit puede comprender además más recipientes que comprenden un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, medio de cultivo para uno o más de los huéspedes adecuados. Asociadas con los kits, puede haber instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico, que contienen información sobre, por ejemplo, las indicaciones, uso, dosificación, fabricación, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.
Actualmente, se usan productos de HRIG para la profilaxis tras la exposición de la rabia. Una dosis de adulto de HRIG de 1500 UI (individuo de 75 kg, 20 UI/kg) sólo está disponible en un volumen de 10 ml. No son posibles productos de HRIG más concentrados ya que la dosis de 10 ml que puede obtenerse actualmente contiene 11,5 gramos de IgG total. A la vista de lo mismo, los productos de HRIG actuales tienen dos inconvenientes. En primer lugar, con frecuencia no resulta anatómicamente viable administrar la dosis completa recomendada en y alrededor de las heridas de mordedura, y en segundo lugar la administración de la dosis de volumen actual de HRIG está asociada con un dolor significativo. La presente invención proporciona una solución a estos inconvenientes ya que proporciona una composición farmacéutica que comprende una dosis de adulto completa en un volumen de aproximadamente 2 ml o inferior, si es deseable. Una composición farmacéutica de este tipo puede comprender por ejemplo dos moléculas de unión que pueden neutralizar al virus de la rabia, preferiblemente CR57 y CR04-098. La composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable y tiene un volumen de alrededor de 2 ml. También es posible más, pero es menos deseable a la vista del dolor asociado con la inyección de volúmenes mayores. También es posible menos de 2 ml. La composición farmacéutica comprende la dosis de adulto completa (en UI) necesaria para la profilaxis tras la exposición satisfactoria. En una realización la composición farmacéutica se almacena en un vial de 10 ml tal como por ejemplo un vial listo para su uso de 10 ml (vidrio de tipo I) con un tapón. Al proporcionar un vial de 10 ml se proporciona la opción de diluir la composición farmacéutica hacia un volumen superior en caso de que un individuo presente un área superficial de herida grande. La invención también proporciona un kit que comprende al menos un recipiente (tal como a vial) que comprende la composición farmacéutica. El kit puede comprender además un segundo recipiente que contiene un diluyente adecuado para diluir la composición farmacéutica hacia un volumen superior. Diluyentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, el excipiente farmacéuticamente aceptable de la composición farmacéutica y una solución salina. Además, el kit puede comprender instrucciones para diluir la composición farmacéutica y/o instrucciones para administrar la composición farmacéutica, diluida o no.
La descripción también proporciona un método de examen de una molécula de unión o una variante funcional de una molécula de unión para determinar la unión específica a un epítopo diferente, preferiblemente no solapante del virus de la rabia al unirse al epítopo una molécula de unión o variante funcional de la invención, en el que el método comprende las etapas de a) poner en contacto una molécula de unión o una variante funcional que va a examinarse,
una molécula de unión o una variante funcional de la invención y el virus de la rabia o un fragmento del mismo (tal como por ejemplo la proteína G del virus de la rabia), b) medir si la molécula de unión o variante funcional de la misma que va a examinarse puede competir por unirse específicamente al virus de la rabia o fragmento del mismo con la molécula de unión o variante funcional de la invención. Si no se mide competición, las moléculas de unión o variantes funcionales que van a examinarse se unen a un epítopo diferente. En una realización específica del método de examen anterior, pueden examinarse moléculas de unión humanas o variantes funcionales de las mismas para identificar moléculas de unión humanas o variantes funcionales que pueden unirse a un epítopo diferente del epítopo reconocido por la molécula de unión que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Preferiblemente, los epítopos son no solapantes o no competitivos. Queda claro para el experto en la técnica que el método de examen anterior también puede usarse para identificar moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas que pueden unirse al mismo epítopo. En una etapa adicional puede determinarse si las moléculas de unión examinadas que no pueden competir por unirse específicamente al virus de la rabia o fragmento del mismo tienen actividad neutralizante. También puede determinarse si las moléculas de unión examinadas que pueden competir por unirse específicamente al virus de la rabia o fragmento del mismo tienen actividad neutralizante. Las moléculas de unión anti-virus de la rabia neutralizantes o variantes funcionales de las mimas encontradas en el método de examen son otra parte de la presente invención. En el método de examen “que se unen específicamente al mismo epítopo” también contempla la unión específica a sustancial o esencialmente el mismo epítopo que el epítopo al que se unen las moléculas de unión humanas de la invención. La capacidad de bloquear, o competir con, la unión de las moléculas de unión humanas de la invención al virus de la rabia indica normalmente que una molécula de unión que va a examinarse se une a un epítopo o sitio de unión en el virus de la rabia que se solapa estructuralmente con el sitio de unión en el virus de la rabia que se reconoce inmunoespecíficamente por las moléculas de unión de la invención. Alternativamente, esto puede indicar que una molécula de unión que va a examinarse se une a un epítopo o sitio de unión que está suficientemente próximo al sitio de unión que se reconoce inmunoespecíficamente por las moléculas de unión de la invención para inhibir estéricamente o de otra manera la unión de las moléculas de unión de la invención al virus de la rabia o al fragmento del mismo.
En general, la inhibición competitiva se mide por medio de un ensayo, en el que una composición de antígeno, es decir una composición que comprende virus de la rabia o fragmentos (tales como proteínas G) del mismo, se mezcla con moléculas de unión de referencia y moléculas de unión que van a examinarse. En una realización la molécula de unión de referencia puede ser una de las moléculas de unión humanas de la invención y la molécula de unión que va a examinarse puede ser otra molécula de unión de la invención. En otra realización la molécula de unión de referencia puede ser la molécula de unión que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y la molécula de unión que va a examinarse puede ser una de las moléculas de unión humanas de la invención. Aún en otra realización la molécula de unión de referencia puede ser una de las moléculas de unión humanas de la invención y la molécula de unión que va examinarse puede ser la molécula de unión que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Habitualmente, las moléculas de unión que van a examinarse están en exceso. Protocolos basados en ELISA son adecuados para su uso en tales estudios de competición simple. En determinadas realizaciones, pueden premezclarse las moléculas de unión de referencia con cantidades variables de las moléculas de unión que van a examinarse (por ejemplo 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 ó 1:100) durante un periodo de tiempo antes de aplicar a la composición de antígeno. En otras realizaciones, las moléculas de unión de referencia y cantidades variables de moléculas de unión que van a examinarse simplemente pueden mezclarse durante la exposición a la composición de antígeno. En cualquier caso, usando especies o anticuerpos secundarios de isotipo, podrán detectarse sólo las moléculas de unión de referencia unidas, cuya unión se reducirá mediante la presencia de una molécula de unión que va a examinarse que reconoce sustancialmente el mismo epítopo. Al realizar un estudio de competición de moléculas de unión entre una molécula de unión de referencia y cualquier molécula de unión que va a examinarse (independientemente de la especie o el isotipo), en primer lugar puede marcarse la molécula de unión de referencia con un marcador detectable, tal como por ejemplo, biotina, un marcador enzimático, radiactivo u otro marcador para permitir su posterior identificación. En estos casos, pueden premezclarse o incubarse las moléculas de unión de referencia marcadas con las moléculas de unión que van a examinarse a diversas razones (por ejemplo 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 ó 1:100) y (opcionalmente tras un periodo de tiempo adecuado) entonces someter a ensayo la reactividad de las moléculas de unión de referencia marcadas y compararla con un valor control en el que no se incluyó ninguna molécula de unión que compita posiblemente en la incubación. De nuevo el ensayo puede ser uno cualquiera de una gama de ensayos inmunológicos basado en la hibridación de anticuerpos, y las moléculas de unión de referencia se detectarían por medio de detección de su marcador, por ejemplo, usando estreptavidina en el caso de moléculas de unión de referencia biotiniladas o usando un sustrato cromogénico con un marcador enzimático (tal como sustrato de 3,3’5,5’tetrametilbencidina (TMB) con enzima peroxidasa) o simplemente detectando un marcador radiactivo. Una molécula de unión que va a examinarse que se une al mismo epítopo que la molécula de unión de referencia podrá competir eficazmente por la unión y por tanto reducirá significativamente la unión de la molécula de unión de referencia, tal como se evidencia mediante una reducción en el marcador unido. Las moléculas de unión que se unen a diferentes epítopos no competitivos no mostrarán reducción. La reactividad de la molécula de unión de referencia (marcada) en ausencia de una molécula de unión completamente irrelevante sería el valor alto de control. El valor bajo de control se obtendrá incubando la molécula de unión de referencia marcada con moléculas de unión de referencia no marcadas de exactamente el mismo tipo, cuando la competición produciría y reduciría la unión de la molécula de
unión de referencia marcada. En un ensayo de prueba, una reducción significativa de la reactividad de la molécula de unión de referencia marcada en presencia de una molécula de unión que va a examinarse indica una molécula de unión que reconoce el mismo epítopo, es decir, uno que “reacciona de manera cruzada” con la molécula de unión de referencia marcada. Si no se muestra reducción, la molécula de unión puede unirse a un epítopo diferente no competitivo.
Las moléculas de unión identificadas mediante estos ensayos de competición (“moléculas de unión competitiva”) incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros agentes de unión que se unen a un epítopo o sitio de unión unido a la molécula de unión de referencia así como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros agentes de unión que se unen a un epítopo o sitio de unión lo suficientemente próximo a un epítopo unido a la molécula de unión de referencia como para que se produzca unión competitiva entre las moléculas de unión que van a examinarse y la molécula de unión de referencia. Preferiblemente, las moléculas de unión competitiva de la invención, cuando están presentes en exceso, inhibirán la unión específica de una molécula de unión de referencia a una especia diana seleccionada en al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50% y lo más preferiblemente al menos el 75%-90% o incluso mayor. La identificación de una o más moléculas de unión que se unen a aproximada, sustancial, esencialmente o en el mismo epítopo que las moléculas de unión de la invención es materia técnica sencilla. Como la identificación de moléculas de unión competitiva se determina en comparación con una molécula de unión de referencia, se entenderá que determinar realmente el epítopo al que se unen la molécula de unión de referencia y la molécula de unión competitiva no se requiere de ninguna manera con el fin de identificar una molécula de unión competitiva que se une al mismo o sustancialmente al mismo epítopo que la molécula de unión de referencia. Alternativamente, las moléculas de unión que se unen a diferentes epítopos no competitivos identificadas por estos ensayos de competición también pueden incluir, pero no se limitan a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros agentes de unión.
Ejemplos
Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Reconocimiento de epítopo de anticuerpos humanos CR-57 y CR-JB anti-rabia
Para tratar si los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR-JB reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, se generaron virus de escape de los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR-JB. CR-57 y CR-JB se generaron esencialmente tal como se describe (véase Jones et al., 2003), mediante introducción de las regiones codificantes de cadena ligera y pesada variable de los genes de anticuerpo correspondientes en un único vector de expresión de IgG1 humana denominado pcDNA3002(Neo). Se usaron los vectores resultantes pgSO57C11 y pgSOJBC1 para la expresión transitoria en células a partir de la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares(ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de estos anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 122 -129, respectivamente. Se incubaron diluciones en serie (0,5 ml) de la cepa CVS-11 del virus de la rabia (diluciones que oscilaban desde 10-1 -10-8) con una cantidad constante (~4 UI/ml) de anticuerpo CR-57 o CR-JB (0,5 ml) durante 1 hora a 37ºC/5% de CO2 antes de la adición a pocillos que contenían células de neuroblastoma de ratón (células MNA) o células BSR (línea celular similar a riñón de cría de hámster). Tras 3 días de selección en presencia de anticuerpo monoclonal humano o bien CR-57 o bien CR-JB, se recogió medio (1 ml) que contenía posibles virus de escape y se almacenó a 4ºC hasta su uso adicional. Posteriormente, se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante la noche a 37ºC/5% de CO2 con conjugado de anticuerpo anti-rabia con N-FITC (Centocor). Se puntuó el número de focos por pocillos mediante inmunofluorescencia y se eligió el medio de pocillos que contenían de uno a seis focos para la amplificación del virus. Todos los virus de escape E57 se generaron a partir de 1 único foco con la excepción de E57B1 (3 focos). Se aislaron los virus de escape EJB a partir de 1 foco (EJB3F), 3 focos (EJB2B), 4 focos (EJB2C), 5 focos (EJB2E, 2F), o 6 focos (EJB2D), respectivamente. Cada virus de escape se amplificó en cebador lugar a pequeña escala en células BSR o MNA dependiendo de sus características de crecimiento. Entonces se usaron estos pequeños lotes de virus para amplificar adicionalmente el virus a una gran escala en células MNA o BSR. Entonces se tituló el virus amplificado en células MNA para determinar el título de cada lote de virus de escape así como la dilución óptima del virus de escape (que proporciona un 80-100% de infección tras 24 horas) para su uso en un ensayo de neutralización de virus.
Se realizaron ensayos de RFFIT modificada (prueba de inhibición con foco fluorescente rápida) para examinar la protección cruzada de E57 (los virus de escape de CR-57) y EJB (los virus de escape de CR-JB) con CR-JB y CR57, respectivamente. Por tanto, se diluyó CR-57 o CR-JB mediante diluciones triples en serie comenzando con una dilución 1:5. Se añadió virus de la rabia (cepa CVS-11) a cada dilución a una concentración que proporciona un 80100% de infección. Se incubó una mezcla de virus/IgG durante 1 hora a 37ºC/ 5% de CO2 antes de la adición a células MNA. 24 horas tras la infección (a 34ºC/5% de CO2) se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante un mínimo de 3 horas con un conjugado de anticuerpo anti-virus de la rabia con N-FITC (Centocor). Entonces se analizaron los pocillos para detectar infección por virus de la rabia con un microscopio de fluorescencia para determinar la dilución de criterio de valoración del 50%. Esta es la dilución a la que la infección por virus se bloquea en un 50% en este ensayo. Para calcular la potencia, se incluyó un patrón internacional (lote de inmunoglobulina de la rabia R3, material de referencia del laboratorio de patrones y ensayos DMPQ/CBER/FDA) en cada RFFIT modificada. La dilución de criterio de valoración del 50% de este patrón corresponde a una potencia de 2 UI/ml. Se sometió a prueba la potencia neutralizante de los anticuerpos monoclonales humanos individuales CR
5 57 y CR-JB así como la combinación de estos anticuerpos.
Los virus EJB ya no se neutralizaban por CR-JB o CR-57 (véase la tabla 1), lo que sugiere que ambos anticuerpos se unen a, e inducen cambios de aminoácido en, regiones similares de la glicoproteína del virus de la rabia. Los virus E57 ya no se neutralizaban por CR-57, mientras que 4 de cada 6 virus E57 todavía se neutralizaban por CR-JB, aunque con una potencia inferior (véase la tabla 1). Una mezcla de los anticuerpos CR-57 y CR-JB (en una 10 razón de 1:1 UI/mg) dio resultados similares a los observados con los anticuerpos individuales (datos no mostrados).
Para identificar posibles mutaciones en la glicoproteína del virus de la rabia se determinó la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de la glicoproteína de cada uno de los virus de escape EJB y E57. Se aisló ARN viral de cada uno de los virus de escape y CVS-11 a partir de células MNA infectadas por virus y se convirtió en ADNc mediante RT-PCR convencional. Posteriormente, se usó ADNc para la secuenciación de
15 nucleótidos de ORF de la glicoproteína del virus de la rabia con el fin de identificar mutaciones.
Los virus de escape tanto E57 como EJB mostraron mutaciones en la misma región de la glicoproteína (véanse las figuras 1 y 2, respectivamente; véanse para todas las secuencias descritas en las figuras 1 y 2 SEQ ID NO: 130 151). Esto indica que ambos anticuerpos reconocen epítopos solapantes. A partir de lo anterior puede concluirse que la combinación de CR-57 y CRJB en un cóctel no previene el escape de variantes resistentes a la neutralización
20 y por tanto no es una preparación de inmunoglobulinas ideal para la profilaxis tras la exposición a la rabia.
Ejemplo 2
Construcción de una biblioteca de presentación en fagos de ScFv usando linfocitos de sangre periférica de donantes vacunados contra la rabia.
A partir de cuatro sujetos humanos vacunados contra la rabia se extrajeron 50 ml de sangre a partir de una vena una
25 semana tras el último refuerzo. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) a partir de estas muestras de sangre usando fraccionamiento por densidad celular en Ficoll. Se guardó el suero sanguíneo y se congeló a -20ºC. Se obtuvo un resultado positivo en la prueba para determinar la presencia de anticuerpos anti-rabia en los sueros usando una tinción de FACS con células 293T transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia. Se preparó ARN total a partir de los PBL usando separación de fase orgánica (TRIZOL™) y posterior precipitación con etanol. Se
30 disolvió el ARN obtenido en agua ultrapura tratada con DEPC y se determinó la concentración mediante medición de DO a 260 nm. Posteriormente, se diluyó el ARN hasta una concentración de 100 ng/!l. A continuación, se convirtió 1 !g de ARN en ADNc de la siguiente manera: a 10 !l de ARN total, se le añadieron 13 !l de agua ultrapura tratada con DEPC y 1 !l de hexámeros al azar (500 ng/!l) y se calentó la mezcla obtenida a 65ºC durante 5 minutos y se enfrió rápidamente en hielo húmedo. Después, se añadieron a la mezcla 8 !l de 5X tampón First-Strand, 2 !l de
35 dNTP (10 mM cada uno), 2 !l de DTT (0,1 M), 2 !l de inhibidor de ARNasa (40 U/ml) y 2 !l de transcriptasa inversa de MMLV Superscript™III (200 U/ml), se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubó durante 1 hora a 50ºC. Se terminó la reacción mediante inactivación por calor, es decir, incubando la mezcla durante 15 minutos a 75ºC.
Se diluyeron los productos de ADNc obtenidos hasta un volumen final de 200 !l con agua ultrapura tratada con
40 DEPC. La DO a 260 nm de una disolución diluida 50 veces (en tampón Tris 10 mM) de la dilución de los productos de ADNc obtenidos dio un valor de 0,1.
Para cada donante se usaron de 5 a 10 !l de los productos de ADNc diluidos como molde para la amplificación por PCR de las secuencias de cadena ligera lambda o kappa y la familia de cadena pesada de inmunoglobulina gamma usando cebadores oligonucleotídicos específicos (véanse las tablas 2-7). Las mezclas de reacción de PCR
45 contenían, además de los productos de ADNc diluidos, 25 pmol de cebador sentido y 25 pmol de cebador antisentido en un volumen final de 50 !l de Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dNTP 250 mM y 1,25 unidades de Taq polimerasa. En un ciclador térmico de tapa calentada que tenía una temperatura de 96ºC, se fundieron rápidamente las mezclas obtenidas durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 96ºC, 30 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC.
50 En una primera ronda de amplificación, se combinaron cada uno de diecisiete cebadores sentido de región variable de cadena ligera (once para la cadena ligera lambda (véase la tabla 2) y seis para la cadena ligera kappa (véase la tabla 3) con un cebador antisentido que reconocía la región constante de C-kappa denominado HuCk 5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’ (véase SEQ ID NO: 152) o de C-lambda HuC∀2 5’-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO: 153) y HuC∀7 5’-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3’
55 (véase SEQ ID NO: 154) (los cebadores antisentido HuC∀2 y HuC∀7 se mezclaron hasta equimolaridad antes de su uso), proporcionando 4 multiplicado por 17 productos de aproximadamente 600 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usó 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando
los mismos diecisiete cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena ligera lambda con uno de los tres cebadores antisentido específicos de región J-lambda y cada cebador sentido de cadena ligera kappa se combinó con uno de los cinco cebadores antisentido específicos de región J-kappa. Los cebadores usados en la segunda amplificación se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 4) para permitir la 5 clonación directa en el vector de presentación en fagos PDV-C06 (véase la figura 3 y SEQ ID NO: 155). Esto dio como resultado 4 multiplicado por 63 productos de aproximadamente 350 pares de bases que se combinaron para dar un total de 10 fracciones. Se eligió este número de fracciones para mantener la distribución natural de las diferentes familias de cadenas ligeras dentro de la biblioteca y no representar en exceso o en defecto determinadas familias. Se usó el número de alelos dentro de una familia para determinar el porcentaje de representación dentro de una biblioteca (véase la tabla 5). En la siguiente etapa, se digirieron 2,5 !g de fracción combinada y 100 !g de vector PDV-C06 con SalI y NotI y se purificaron a partir de gel. Posteriormente, se realizó la ligación durante la noche a 16ºC de la siguiente manera. A 500 ng de vector PDV-C06 se le añadieron 70 ng de fracción combinada en un volumen total de 50 !l de mezcla de ligación que contenían Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 25 !g/ml y ADN ligasa de T4 2,5 !l (400 U/!l). Se siguió este procedimiento para cada fracción
15 combinada. Se purificaron las mezclas de ligación mediante fenol/cloroformo, seguido por una extracción en cloroformo y precipitación en etanol, métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Se disolvió el ADN obtenido en 50 !l de agua ultrapura y se sometieron a electroporación dos alícuotas de 2,5 !l por mezcla de ligación en 40 !l de bacterias E. coli competentes para TG1 según el protocolo del fabricante (Stratagene). Se hicieron crecer los transformantes durante la noche a 37ºC en un total de 30 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 !g/ml y un 4,5% de glucosa. Se obtuvo una (sub)biblioteca de regiones de cadena ligera variables raspando los transformantes de las placas de agar. Esta (sub)biblioteca se usó directamente para la preparación de ADN de plásmido usando un kit de preparación QIAFilter MAXI de Qiagen™.
Para cada donante se amplificaron las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada a partir de las mismas
25 preparaciones de ADNc en un procedimiento de PCR de dos rondas similar y parámetros de reacción idénticos a los descritos anteriormente para las regiones de cadena ligera con la condición de que se usaron los cebadores representados en las tablas 6 y 7. La primera amplificación se realizó usando un conjunto de nueve cebadores dirigidos sentido (véase la tabla 6; que cubre todas las familias de regiones variables de cadena pesada) cada uno combinado con un cebador antisentido de región constante específico de IgG denominado HuCIgG 5’-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3’ (SEQ ID NO: 156) proporcionando cuatro multiplicado por nueve productos de aproximadamente 650 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usaron 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando los mismos nueve cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena pesada con uno de los cuatro cebadores antisentido específicos de
35 región JH. Los cebadores usados en la segunda ronda se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 7) para permitir la clonación dirigida en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera. Esto dio como resultado por donante 36 productos de aproximadamente 350 pares de bases. Se combinaron estos productos para cada donante por cebador sentido (VH) usado en nueve fracciones. Se purificaron los productos obtenidos usando columnas de purificación de PCR de Qiagen. A continuación, se digirieron las fracciones con SfiI y XhoI y se ligaron en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes a los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. Alternativamente, se digirieron las fracciones con NcoI y XhoI y se ligaron en el vector de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes a los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. La ligación, purificación y posterior transformación de la
45 biblioteca definitiva resultante también se realizaron tal como se describió anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera y en este punto se combinaron las mezclas de ligación de cada donante por combinación de VH. Se hicieron crecer los transformantes en 27 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 !g/ml y un 4,5% de glucosa. Se recogieron todas las bacterias en medio de cultivo 2TY que contenía ampicilina 50 !g/ml y un 4,5% de glucosa, se mezclaron con glicerol hasta el 15% (v/v) y se congelaron en alícuotas de 1,5 ml a -80ºC. Se realizaron el rescate y la selección de cada biblioteca tal como se describe a continuación.
Ejemplo 3
Selección de fagos que llevan fragmentos Fv monocatenarios que reconocen específicamente glicoproteína del virus de la rabia
55 Se seleccionaron fragmentos de anticuerpo usando bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpo, tecnología de presentación en fagos general y tecnología MAbstract®, esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense n.º 6.265.150 y en el documento WO98/15833. Las bibliotecas de fagos de anticuerpo usadas fueron dos bibliotecas de fagos scFv semisintéticas diferentes (JK1994 y WT2000) y las bibliotecas de fago scFv inmunitario (RAB-03-G01 y RAB-04-G01) preparadas tal como se describió en el ejemplo 2 anterior. La primera biblioteca de fagos scFv semisintética (JK1994) se ha descrito en de Kruif et al. (1995b), la segunda (WT2000) se construyó esencialmente tal como se describe en de Kruif et al. (1995b). En resumen, la biblioteca tiene un formato semisintético mediante lo cual se incorporó variación en los genes V de cadena ligera y pesada usando
oligonucleótidos degenerados que incorporan variación dentro de las regiones CDR. Sólo se usaron genes de cadena pesada VH3, en combinación con genes de cadena ligera kappa y lambda. Se recrearon sintéticamente CDR1 y CDR3 de la cadena pesada y CDR3 de la cadena ligera en un enfoque basado en PCR similar al descrito en de Kruif et al. (1995b). Se clonaron secuencialmente los genes de región V así creados en un formato de scFv en un vector fagémido y se amplificaron para generar una biblioteca de fagos tal como se describió anteriormente. Además, se usaron los métodos y fagos cooperadores res descritos en el documento WO02/103012 en la presente invención. Para identificar anticuerpos de fagos que reconocían la glicoproteína del virus de la rabia, se realizaron experimentos de selección de fagos usando virus de la rabia completo (cepa Pitman-Moore del virus de la rabia) inactivado mediante tratamiento con beta-propiolactona, glicoproteína del virus de la rabia purificada (cepa ERA del virus de la rabia), y/o células transfectadas que expresaban proteína G del virus de la rabia (cepa ERA del virus de la rabia).
La proteína G se purificó a partir de la cepa ERA del virus de la rabia de la siguiente manera. A una disolución de virus, se le añadió 1/10 en volumen de octil-beta-glucopiranósido al 10% y se mezcló suavemente. Tras una incubación de 30 minutos a 4ºC se centrifugó la muestra de virus (36.000 rpm, 4ºC) en un rotor SW51. Se recogió el sobrenadante y se dializó durante la noche a 4ºC frente a Tris/EDTA 0,1 M. Posteriormente, se recogió la glicoproteína de la cámara de diálisis, se dividió en alícuotas, y se almacenó a -80ºC hasta su uso adicional. Se determinó la concentración de proteína mediante DO a 280 nm y se analizó la integridad de la proteína G mediante SDS-PAGE.
Se diluyeron virus de la rabia inactivado completo o proteína G del virus de la rabia en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se añadieron 2-3 ml a tubos MaxiSorp Nunc-Inmuno (Nunc) y se incubaron durante la noche a 4ºC en un agitador rotativo. Se bloqueó una alícuota de una biblioteca de fagos (500 !l, aproximadamente 1013 ufc, amplificado usando fago cooperador CT (véase el documento WO 02/103012)) en tampón de bloqueo (2% de Protifar en PBS) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Se añadió la biblioteca de fagos bloqueada al inmunotubo (preincubado o bien con o bien sin scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57), se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, y se lavó con tampón de lavado (0,1% de Tween-20 (Serva) en PBS) para eliminar fagos no unidos. Entonces se eluyeron los fagos unidos del antígeno mediante incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con 1 ml de glicina-HCl 50 mM, pH 2,2. Posteriormente, se mezclaron los fagos eluidos con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 para neutralizar el pH. Se usó esta mezcla para infectar 5 ml de cultivo de E. coli XL1-Blue que se había hecho crecer a 37ºC hasta una DO a 600 nm de aproximadamente 0,3. Se dejó que los fagos infectaran las bacterias XL1-Blue durante 30 minutos a 37ºC. Después se centrifugó la mezcla durante 10 minutos, a 3200*g a temperatura ambiente y se resuspendió el sedimento bacteriano en 0,5 ml de medio de extracto de levadura y 2-triptona (2TY). Se dividió la suspensión bacteriana obtenida en dos placas de agar 2TY complementadas con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Tras la incubación durante la noche de las placa a 37ºC, se rasparon las colonias de las placas y se usaron para preparar una biblioteca de fagos enriquecida, esencialmente tal como se describe por De Kruif et al. (1995a) y el documento WO 02/103012. En resumen, se usaron bacterias raspadas para inocular medio 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y glucosa y se hicieron crecer a una temperatura de 37ºC hasta una DO a 600 nm de ∼0,3. Se añadieron fagos cooperadores CT y se dejó que infectaran las bacterias tras lo cual se cambió el medio a 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Se continuó la incubación durante la noche a 30ºC. Al día siguiente, se retiraron las bacterias del medio 2TY mediante centrifugación tras lo cual se precipitaron los fagos en el medio usando polietilenglicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, se disolvieron los fagos en 2 ml de PBS con un 1% de albúmina sérica bovina (BSA), se esterilizaron por filtración y se usaron para la siguiente ronda de selección.
También se realizaron selecciones de fagos con células transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia. Las células usadas fueron células de la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares(ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. A continuación en el presente documento se denominan células PER.C6®. En este caso, en primer lugar se añadió la biblioteca de fagos bloqueada (2 ml) a 1*107 células sustractoras (en DMEM/10% de FBS) y se incubaron durante 1 hora a 4ºC en un agitador rotativo. Las células sustractoras fueron células PER.C6® que expresaban el ectodominio de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en su superficie fusionado con el dominio citoplásmico y transmembrana del virus de la rabia. Con esta etapa de sustracción se eliminaron de la biblioteca de fagos los fagos que reconocían o bien la glicoproteína de VSV o bien antígenos específicos para células PER.C6®. Se centrífugo la mezcla de fagos/células (5 minutos a 4ºC a 500xg) para eliminar fagos unidos a células, y se añadió el sobrenadante a un tubo nuevo que contenía 3 ml de 1*107 células sustractoras. Se repitió dos veces la etapa de sustracción con el sobrenadante respectivo. Posteriormente, se incubaron los fagos sustraídos durante 1,5 horas a 4ºC en un agitador rotativo con las células transfectadas que expresaban glicoproteína del virus de la rabia (células PER.C6® (3*106 células)). Antes de eso, se preincubaron las células transfectadas o bien con o bien sin scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57. Tras la incubación se lavaron las células cinco veces con 1 ml de DMEM/10% de FBS (para cada lavado, se resuspendieron las células y se transfirieron a un nuevo tubo), se eluyeron los fagos y se procesaron tal como se describió anteriormente.
Normalmente, se realizaron dos rondas de selecciones antes del aislamiento de anticuerpos de fagos individuales. Tras la segunda ronda de selección, se usaron colonias de E. coli individuales para preparar anticuerpos de fagos
monoclonales. Esencialmente, se hicieron crecer colonias individuales hasta la fase logarítmica en un formato de palcas de 96 pocillos y se infectaron con fagos cooperadores VCSM13 tras lo cual se permitió avanzar la producción de anticuerpos de fagos durante la noche. Los anticuerpos de fagos producidos se precipitaron mediante PBG/NaCl y se esterilizaron por filtración y se sometieron a prueba en ELISA para detectar la unión tanto a virus de la rabia 5 inactivado completo como a proteína G de virus de la rabia purificada. A partir de la selección se obtuvo un gran panel de anticuerpos de fagos que demuestra la unión tanto a virus de la rabia inactivado completo como a proteína G de virus de la rabia (véase el ejemplo a continuación). Se siguieron dos estrategias de selección con las bibliotecas inmunitarias descritas anteriormente. En la primera estrategia se seleccionaron 736 anticuerpos de fagos tras dos rondas de selección usando en la primera y la segunda ronda de selección virus inactivado o proteína G purificada. En la segunda estrategia se seleccionaron 736 anticuerpos de fagos tras dos rondas de selección usando en la primera ronda de selección proteína G recombinante expresada en la superficie celular y en la segunda ronda de selección virus inactivado o proteína G purificada. El número de anticuerpos de fagos únicos obtenidos mediante la primera estrategia fue 97, mientras que la segunda estrategia proporcionó 70 únicos. Los 97 anticuerpos de fagos únicos encontrados por medio de la primera estrategia dieron lugar a 18 anticuerpos neutralizantes y los 70 clones
15 únicos identificados por medio de la segunda estrategia proporcionaron 33 anticuerpos neutralizantes. Esto demuestra claramente que las selecciones que incluyeron células transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia, es decir proteína G recombinante expresada en la superficie celular, como antígeno parecieron proporcionar más anticuerpos neutralizantes en comparación con selecciones usando sólo proteína G purificada y/o virus inactivado.
Ejemplo 4
Validación de los anticuerpos de fagos monocatenarios específicos para glicoproteína del virus de la rabia.
Los anticuerpos de fagos monocatenarios seleccionados que se obtuvieron a partir de las selecciones descritas anteriormente, se validaron en ELISA para determinar la especificidad, es decir la unión a proteína G de virus de la rabia purificada tal como se describió anteriormente. Adicionalmente, también se sometieron a prueba los 25 anticuerpos de fagos monocatenarios para determinar la unión a FBS al 5%. Para ello, se recubrió la preparación de proteína G de virus de la rabia o FBS al 5% en placas de ELISA Maxisorp™. Tras el recubrimiento, se bloquearon las placas en PBS/1% de Protifar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incubaron los anticuerpos de fagos monocatenarios seleccionados durante 15 minutos en un volumen igual de PBS/1% de Protifar para obtener anticuerpos de fagos bloqueados. Se vaciaron las placas, y se añadieron los anticuerpos de fagos bloqueados a los pocillos. Se permitió que la incubación avanzara durante una hora, se lavaron las placas en PBS que contenía un 0,1% de Tween-20 y se detectaron los anticuerpos de fagos unidos (usando medición de DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-M 13 conjugado con peroxidasa. Como control, se realizó simultáneamente el procedimiento sin usar ningún anticuerpo de fago monocatenario, un anticuerpo de fago monocatenario de control negativo dirigido contra CD8 (SC02-007) o un anticuerpo de fago monocatenario de control positivo dirigido contra la glicoproteína del virus
35 de la rabia (scFv SO57). Tal como se muestra en la tabla 8, los anticuerpos de fagos seleccionados denominados SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 presentaron unión significativa a la proteína G de virus de la rabia purificada inmovilizada, mientras que no se observó ninguna unión a FBS. Se obtuvieron resultados idénticos en ELISA usando el virus de la rabia inactivado completo tal como se describió anteriormente (datos no mostrados).
Ejemplo 5
Caracterización de scFv específicos del virus de la rabia
A partir de los clones de anticuerpos de fagos monocatenarios específicos seleccionados (scFv) se obtuvo ADN de plásmido y se determinaron secuencias de nucleótidos según técnicas convencionales. Las secuencias de 45 nucleótidos de scFv (incluyendo sitios de restricción para la clonación) denominados SC04-001, SC04-004, SC04008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04146 y SC04-164 se muestran en SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los scFv denominados SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y
55 SC04-164 se muestran en SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 y SEQ ID NO: 204, respectivamente.
La identidad de genes de VH y VL (véase Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE
Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) y composiciones de CDR3 de cadena pesada de los scFv que se unen específicamente a la proteína G de virus de la rabia se representan en la tabla 9.
Ejemplo 6
Neutralización in vitro de virus de la rabia mediante scFv específicos de virus de la rabia (RFFIT modificada)
Con el fin de determinar si los scFv seleccionados podían bloquear la infección por virus de la rabia, se realizaron ensayos de neutralización in vitro (RFFIT modificada). Se diluyeron las preparaciones de scFv mediante diluciones triples en serie comenzando con una dilución 1:5. Se añadió virus de la rabia (cepa CVS-11) a cada dilución a una concentración que proporciona un 80-100% de infección. Se incubó una mezcla de virus/scFv durante 1 hora a 37ºC/5% de CO2 antes de la adición a células MNA. 24 horas tras la infección (a 34ºC/5% de CO2) se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante un mínimo de 3 horas con un conjugado de anticuerpo anti-rabia con N-FITC (Centocor). Entonces se analizaron las células para detectar infección por virus de la rabia con un microscopio de fluorescencia para determinar la dilución de criterio de valoración del 50%. Esta es la dilución a la que la infección por virus se bloquea en un 50% en este ensayo (véase el ejemplo 1). Se identificaron varios scFv que mostraron actividad neutralizante contra el virus de la rabia (véase la tabla 10).
Adicionalmente, se investigó por medio del ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificada) tal como se describió anteriormente, si los scFv seleccionados podían neutralizar los virus de escape E57 tal como se prepararon en el ejemplo 1 (E57A2, E57A3, E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3). Se identificaron varios scFv que mostraron actividad neutralizante contra a los virus de escape E57 (véanse las tablas 11A y 11B).
Ejemplo 7
ELISA de competición de proteína G de virus de la rabia con scFv
Para identificar anticuerpos que se unían a epítopos no solapantes, no competitivos, se realizó un ELISA de competición con glicoproteína de la rabia. Se recubrieron placas Maxisorp F96 de Nunc-Inmuno™ (Nunc) durante la noche a 4ºC con una dilución 1:1000 de glicoproteína del virus de la rabia purificada (1 mg/ml; cepa ERA del virus de la rabia) en PBS (50 !l). Se eliminó mediante lavado la proteína no recubierta antes de bloquear los pocillos con 100 !l de PBS/1% de Protifar durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se descartó la disolución de bloqueo y se añadieron 50 !l de los scFv anti-virus de la rabia no purificados en PBS/1% de Protifar (diluido dos veces). Se lavaron los pocillos cinco veces con 100 !l de PBS/0,05% de Tween-20. Después, se añadieron 50 !l de IgG competidora biotinilada anti-virus de la rabia, CR-57bio, a cada pocillo, se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron los pocillos cinco veces con 100 !l de PBS/0,05% de Tween-20. Para detectar la unión de CR-57bio, se añadieron 50 !l de una dilución 1:2000 de estreptavidina-anticuerpo con HRP (Becton Dickinson) a los pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Volvieron a lavarse los pocillos como anteriormente y se desarrolló adicionalmente el ELISA mediante adición de 100 !l de reactivos OPD (Sigma). Se detuvo la reacción añadiendo 50 !l de H2SO4 1 M antes de medir la DO a 492 nm.
La señal obtenida con CR-57bio solo podía reducirse a niveles basales cuando se coincubaba con scFv SO57, es decir la forma de scFv de CR-57 (para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de SO57 véanse SEQ ID NO: 205 y 206, respectivamente) o scFv SOJB, es decir la forma de scFv de CR-JB (para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de SOJB véanse SEQ ID NO: 312 y 313, respectivamente). Esto indica que los scFv SO57 y SOJB compiten con la interacción de CR-57bio con la glicoproteína del virus de la rabia uniéndose al mismo epítopo o a un epítopo solapante al de CR-57bio, respectivamente. En cambio, un scFv irrelevante denominado SC02-007, es decir un scFv que se une a CD8, no compitió por la unión. Los scFv anti-virus de la rabia denominados SC04-004, SC04-010, SC04-024, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-120, SC04-125, SC04-127, SC04-140, SC04-144 y SC04-146 tampoco compitieron con CR-57bio, lo que indica que estos scFv se unen a un epítopo diferente al epítopo reconocido por CR-57 (véase la figura 4).
Se obtuvieron resultados similares con el siguiente experimento. En primer lugar, se añadió el anticuerpo CR-57 frente al virus de la rabia a pocillos recubiertos con proteína G de virus de la rabia. A continuación, se añadieron los scFv de competición. En esta configuración los scFv anti-virus de la rabia se detectaron con anticuerpo anti-VSV conjugado con HRP en virtud de la presencia de una etiqueta de VSV en las secuencias de aminoácidos de scFv (véase la figura 5).
Ejemplo 8
Construcción de moléculas de inmunoglobulina completamente humanas (anticuerpos monoclonales humanos antivirus de la rabia) a partir de Fv monocatenarios seleccionados anti-virus de la rabia
Regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFv denominados SC04-001, SC04-008, SC04-018, SC04040 y SC04-126 se amplificaron mediante PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C03-HC#1 (véase SEQ ID NO: 277) y pSynC04-C∀ (véase SEQ ID NO: 278), respectivamente. Se amplificaron los genes de VH y VL usando los oligonucleótidos mostrados en las tablas 12 y 13, respectivamente, y se clonaron los productos de PCR en los vectores pSyn-C03-HC#1 y pSyn-C04-C∀, respectivamente.
Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFv denominados SC04-004, SC04-010, SC04-021, SC04
5 026, SC04-031, SC04-038, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04120, SC04-125, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 también se amplificaron mediante PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C03-HC#1 y pSyn-C05-C∃ (véase SEQ ID NO: 279), respectivamente. Se amplificaron los genes de VH y VL usando los oligonucleótidos facilitados en las tablas 12 y 13, respectivamente, y se clonaron los productos de
10 PCR en los vectores pSyn-C03-HC#1 y pSyn-C05-C∃, respectivamente. Los oligonucleótidos se diseñan de tal manera que corrigen cualquier desviación de la secuencia de la línea germinal que se haya introducido durante la construcción de la biblioteca, debido al conjunto limitado de oligonucleótidos que se han usado para amplificar el gran repertorio de genes de anticuerpos. Las secuencias de nucleótidos para todos los constructos se verificaron según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica.
15 Los constructos de expresión resultantes pgG104-001C03, pgG104-008C03, pgG104-018C03, pgG104-040C03 y pgG104-126C03 que codifican para las cadenas pesadas de IgG1 humana anti-virus de la rabia en combinación con el constructo pSyn-C04-V∀ relevante que codifica para la correspondiente cadena ligera, se expresaron de manera transitoria en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1. Los constructos de expresión pgG104-004C03, pgG104-010C03, pgG104-021C03, pgG104-026C03, pgG104-031C03, pgG104
20 038C03, pgG104-060C03, pgG104-073C03, pgG104-097C03, pgG104-098C03, pgG104-103C03, pgG104-104C03, pgG104-108C03, pgG104-120C03, pgG104-125C03, pgG104-140C03, pgG104-144C03, pgG104-146C03 y pgG104-164C03 que codifican para las cadenas pesadas de IgG1 humana anti-virus de la rabia en combinación con el constructo pSyn-C05-V∃ relevante que codifica para la correspondiente cadena ligera, se expresaron de manera transitoria en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1.
25 Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos denominados CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y CR04-164 se determinaron según técnicas convencionales. Posteriormente, se purificaron los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes en una columna de proteína A seguido por un
30 intercambio de tampón en una columna de desalación usando métodos de purificación convencionales usados generalmente para inmunoglobulinas (véase por ejemplo el documento WO 00/63403).
Adicionalmente, para CR04-098, se generó un único vector de expresión de IgG1 humana denominado pgG104098C10 tal como se describió anteriormente para los vectores pgSO57C11 y pgSOJBC11 que codifican para CR-57 y CR-JB, respectivamente (véase el ejemplo 1). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las cadenas 35 ligera y pesada de anticuerpo CR04-098 codificado por el vector pgG104-098C10 se muestran en SEQ ID NO: 334 337, respectivamente. Se usaron vectores pgSO57C11 (véase el ejemplo 1) y pgG104-098C10 para la expresión estable de CR-57 y CR04-098, respectivamente, en células a partir de la línea celular depositada en la colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. Los CR-57 y CR04-098 producidos de 40 manera estable tienen un punto isoeléctrico calculado de 8,22 y 8,46, respectivamente. Los puntos isoeléctricos observados de manera experimental son de entre 8,1-8,3 para CR-57 y 9,0-9,2 para CR04-098. Se purificaron los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes tal como se describió anteriormente. A menos que se indique lo contrario, para CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04
45 125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y CR04-164 se usaron anticuerpos monoclonales humanos recombinantes expresados de manera transitoria por el sistema de dos vectores tal como se describió anteriormente y para CR57 se usó anticuerpo monoclonal humano recombinante expresado de manera transitoria por el sistema de un vector tal como se describe en el ejemplo 1.
Ejemplo 9
50 ELISA de competición de proteína G de virus de la rabia con IgG
Para tratar si las IgG monoclonales humanas anti-proteína G de virus de la rabia se unen a epítopos no solapantes, no competitivos, se realizaron experimentos de competición. Se incuban pocillos con proteína G de virus de la rabia recubierta con concentraciones crecientes (0-50 !g/ml) de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se añaden 50 !l de una IgG biotinilada diferente anti-virus de la
55 rabia (1 !g/ml) a cada pocillo, se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lava inmediatamente cinco veces con 100 !l de PBS/0,05% de Tween-20. Posteriormente, se incuban los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente con 50 !l de una dilución 1:2000 de estreptavidina-HRP (Becton Dickinson), se lavan y se revelan tal como se describió anteriormente. Una disminución en la señal con el aumento de la concentración de IgG sin marcar indica que los dos anticuerpos están compitiendo entre sí y reconocen el mismo epítopo o epítopos solapantes.
Alternativamente, se incubaron pocillos recubiertos con proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) con 50 !g/ml de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se añadieron 50 !l de CR57 biotinilado (0,5-5 !g/ml; a niveles subsaturados) a cada pocillo. Las etapas adicionales se realizaron tal como anteriormente. Se compararon las señales obtenidas con la señal obtenida sólo con CR57 biotinilado
5 (véase la figura 6; sin competidor). A partir de la figura 6 puede deducirse que la señal no podía reducirse con el anticuerpo denominado CR02-428 que sirvió como control negativo. En cambio, la competición con CR57 sin marcar (control positivo) o CR-JB redujo la señal a niveles basales. A partir de la figura 6 puede deducirse adicionalmente que ninguna de las IgG anti-proteína G de virus de la rabia compitió significativamente con CR-57, lo que concuerda con los datos de competición de scFv tal como se describieron en el ejemplo 7.
10 Además, se realizaron experimentos de competición con células PER.C6 transfectadas con proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) por medio de citometría de flujo. Se incubaron células transfectadas con 20 !l de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar (50 !g/ml) durante 20 minutos a 4ºC. Tras lavar las células con PBS que contenía un 1% de BSA, se añadieron 20 !l de CR57 biotinilado (0,5-5 !g/ml; a nivel de sustrato) a cada pocillo, se incubó durante 5 minutos a 4ºC, y se lavó inmediatamente dos veces con 100 !l de PBS que contenía un 1% de BSA.
15 Posteriormente, se incubaron los pocillos durante 15 minutos a 4ºC con 20 !l de una dilución 1:200 de estreptavidina-PE (Caltag), se lavaron y se revelaron tal como se describió anteriormente. La señal obtenida con CR57 biotinilado no pudo reducirse significativamente con el anticuerpo CR02-428 de control negativo (véase la figura 7). En cambio, la competición con CR57 sin marcar (control positivo) o CR-JB redujo la señal hasta niveles basales. Ninguna de las IgG anti-proteína G de virus de la rabia compitió significativamente con CR-57, con la
20 excepción de CR04-126 que redujo la señal hasta aproximadamente un 30% (véase la figura 7). Este último no compitió en ELISA (véase la figura 6). Esto puede estar provocado por la diferencia en la manera en que la glicoproteína se presenta al anticuerpo en experimentos de FACS en comparación con experimentos de ELISA. La unión de CR04-126 podía depender más de la conformación de la glicoproteína, dando como resultado el efecto competitivo observado con CR04-126 en el ensayo de competición basado en FACS y no en el ensayo de
25 competición basado en ELISA. Adicionalmente, CR04-008 y CR04-010 redujeron la señal hasta aproximadamente un 50% (véase la figura 7) en el ensayo de competición basado en FACS lo que indica que podrían competir con CR57. Sin embargo, esto no se confirmó para CR04-010 mediante los datos de competición de scFv o el ensayo de competición basado en ELISA. Para las demás IgG, los datos de FACS correspondían con los datos de ELISA respectivos tanto de los scFv como de las IgG.
30 Ejemplo 10
Efectos sinérgicos aditivos de IgG anti-rabia en la neutralización in vitro de virus de la rabia (RFFIT modificada)
Con el fin de determinar si las IgG anti-proteína G de virus de la rabia tenían efectos aditivos o sinérgicos en la neutralización de virus de la rabia, se sometieron a prueba diferentes combinaciones de las IgG. En primer lugar, se determina la potencia (en UI/mg) de cada anticuerpo individual en una RFFIT modificada (véase el ejemplo 1). 35 Después, se preparan combinaciones de anticuerpos basándose en cantidades iguales de UI/mg y se someten a prueba en la RFFIT modificada. Las potencias de cada combinación de anticuerpos pueden determinarse y compararse con las potencias esperadas. Si la potencia de la combinación de anticuerpos es igual a la suma de las potencias de cada anticuerpo individual presente en la combinación, los anticuerpos tienen un efecto aditivo. Si la potencia de la combinación de anticuerpos es superior, los anticuerpos tienen un efecto sinérgico en la
40 neutralización de virus de la rabia.
Alternativamente, pueden determinarse efectos aditivos o sinérgicos mediante el siguiente experimento. En primer lugar, se determina la potencia de los anticuerpos que van a someterse a prueba, por ejemplo CR-57 y CR04-098, en una RFFIT convencional (véase Laboratory techniques in rabies, editado por: F-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, capítulo 15, Organización Mundial de la Salud, Ginebra). Después, se mezclan los 45 anticuerpos en una razón 1:1 basándose en UI/ml. Se somete a prueba esta mezcla de anticuerpos, junto con los anticuerpos individuales a la misma concentración, en seis experimentos de RFFIT independientes para determinar el criterio de valoración de neutralización al 50%. Posteriormente, se determina el índice de combinación (CI) para la mezcla de anticuerpos usando la fórmula CI = (C1/Cx1) + (C2/Cx2) + (C1C2/Cx1Cx2) tal como se describe por Chou et al. (1984). C1 y C2 son la cantidad (en !g) de anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2 que conduce a
50 una neutralización del 50% cuando se usan en combinación y Cx1 y Cx2 son las cantidades (en !g) de anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2 que conducen a una neutralización del 50% cuando se usan solos. CI=1, indica un efecto aditivo, CI<1 indica un efecto sinérgico y CI>1 indica un efecto antagonista de los anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 11
55 Identificación de epítopos reconocidos por anticuerpos humanos recombinantes anti-virus de la rabia mediante PEPSCAN-ELISA
Se sintetizaron péptidos en bucle/cíclicos y lineales de 15 meros a partir del dominio extracelular de la proteína G de la cepa ERA del virus de la rabia (véase SEQ ID NO: 207 para la secuencia de aminoácidos completa de la glicoproteína G de la cepa ERA del virus de la rabia, el domino extracelular consiste en los aminoácidos 20-458; la
ID de proteína de la glicoproteína de la cepa ERA del virus de la rabia en la base de datos EMBL es J02293) y se examinaron usando tarjetas mini-PEPSCAN en formato de tarjeta de crédito (formatos/tarjeta de 455 péptidos) tal como se describió anteriormente (Slootstra et al., 1996; documento WO 93/09872). Se acetilaron todos los péptidos en el extremo amino-terminal. En todos los péptidos en bucle se sustituyeron la posición 2 y la posición 14 por una cisteína (acetil-XCXXXXXXXXXXXCX-minitarjeta). Si había presentes otras cisteínas además de las cisteínas en la posición 2 y la posición 14 en un péptido preparado, las otras cisteínas se sustituyeron por una alanina. Se sintetizaron los péptidos en bucle usando química de Fmoc convencional y se desprotegieron usando ácido trifluoroacético con eliminadores. Posteriormente, se hicieron reaccionar los péptidos desprotegidos en las tarjetas con una disolución 0,5 mM de 1,3-bis(bromometil)benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9/acetonitril (1:1 (v/v)). Se agitaron suavemente las tarjetas en la disolución durante 30-60 minutos, mientras estaban completamente cubiertas en la disolución. Finalmente, se lavaron ampliamente las tarjetas con un exceso de H2O y se sonicaron en tampón de alteración que contenía un 1% de SDS/0,1% de beta-mercaptoetanol en PBS (pH 7,2) a 70ºC durante 30 minutos, seguido por sonicación en H2O durante otros 45 minutos.
Se prepararon los anticuerpos monoclonales humanos tal como se describió anteriormente. Se sometió a prueba la unión de estos anticuerpos a cada péptido lineal y en bucle en un inmunoensayo ligado a enzimas basado en PEPSCAN (ELISA). Se incubaron las tarjetas de polipropileno en formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos, que contenían los péptidos covalentemente unidos, con los anticuerpos (10 !g/ml; diluidos en disolución de bloqueo, que contenía un 5% de suero de caballo (v/v) y un 5% de ovoalbúmina (p/v)) (4ºC, durante la noche). Tras el lavado, se incubaron los péptidos con anticuerpo anti-ser humano con peroxidasa (dilución 1/1000) (1 hora, 25ºC), y posteriormente, tras el lavado de la peroxidasa, se añadió sustrato sulfonato de 2,2’-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 !l/ml de H2O2 al 3%. Se incubaron controles (para lineal y en bucle) con anticuerpo anti-ser humano con peroxidasa únicamente. Tras 1 hora se midió el desarrollo del color. El desarrollo del color del ELISA se cuantificó con una cámara CCD y un sistema de procesamiento de imágenes. La configuración consistió en una cámara CCD y una lente de 55 mm (videocámara CCD de Sony XC-77RR, lente de Nikon micronikkor 55 mm f/2,8), un adaptador de cámara (adaptador de cámara de Sony DC-77RR) y el paquete de software de procesamiento de imágenes Optimas, versión 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, EE.UU.). Optimas se ejecutó en un sistema informático pentium II.
Se sometieron a prueba los anticuerpos monoclonales humanos anti-proteína G de virus de la rabia para determinar la unión a los péptidos en bucle/cíclicos y lineales de 15 meros sintetizados tal como se describió anteriormente. Se considera que un péptido se une de manera relevante a un anticuerpo cuando los valores de DO son iguales o superiores al doble del valor de DO promedio de todos los péptidos (por anticuerpo). Véase la tabla 14 para resultados de la unión de los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57, CRJB y CR04-010 a los péptidos lineales del dominio extracelular de glicoproteína G de cepa ERA del virus de la rabia. Las regiones que muestran unión significativa a los anticuerpos respectivos están destacadas en gris (véase la tabla 14).
El anticuerpo CR57 se unió a los péptidos lineales que tenían una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SLKGACKLKLCGVLG (SEQ ID NO: 314), LKGACKLKLCGVLGL (SEQ ID NO: 315), KGACKLKLCGVLGLR (SEQ ID NO: 316), GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318), CKLKLCGVLGLRLMD (SEQ ID NO: 319), KLKLCGVLGLRLMDG (SEQ ID NO: 320), LKLCGVLGLRLMDGT (SEQ ID NO: 321) y KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322) (véase la tabla 14). Los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318) tienen un valor de DO que es inferior al doble del valor promedio. No obstante, se reivindican estos péptidos porque están en la proximidad cercana a una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR57. La unión fue lo más prominente al péptido con la secuencia de aminoácidos KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322).
El anticuerpo CR04-010 se unió a los péptidos lineales que tenían una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GFGKAYTIFNKTLME (SEQ ID NO: 323), FGKAYTIFNKTLMEA (SEQ ID NO: 324), GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO: 325), KAYTIFNKTLMEADA (SEQ ID NO: 326), AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328), TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331). Los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328) tienen un valor de DO que es inferior al doble del valor promedio. No obstante, estos péptidos se reivindican porque están en la proximidad cercana a una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR04-010. La unión fue lo más prominente a los péptidos con la secuencia de aminoácidos TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331).
CRJB y los anticuerpos denominados CR04-040, CR04-098 y CR04-103 (datos no mostrados) no reconocieron una región de péptidos antigénicos lineales.
Cualquiera de los péptidos anteriores o partes de los mismos representa buenos candidatos de un epítopo neutralizante contra el virus de la rabia y podría formar la base para una vacuna o para preparar anticuerpos neutralizantes para tratar y/o prevenir una infección por virus de la rabia.
SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 332) y GFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 333) son regiones particularmente interesantes de la glicoproteína basándose en su alta reactividad en PEPSCAN.
A partir de los datos de PEPSCAN anteriores puede deducirse adicionalmente que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57 y CR04-010 se unen a diferentes regiones de la proteína G del virus de la rabia lo que indica que reconocen epítopos no competitivos.
5 Ejemplo 12
Determinación de potencia neutralizante de IgG anti-proteína G de la rabia usando un ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificada).
Se determinó la potencia neutralizante de cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos producidos en una RFFIT modificada tal como se describió en el ejemplo 1. Dieciséis IgG neutralizaron la cepa CVS-11 de la rabia con 10 una potencia superior a 1000 UI/mg, mientras que sólo dos IgG tenían una potencia inferior a 2 UI/mg (véase la tabla 15). Ocho de los dieciséis anticuerpos funcionaron mejor que CR-57 producido de manera transitoria con respecto a la potencia, lo que sugiere una eficacia superior en la profilaxis tras la exposición de virus de la rabia que CR-57. La potencia de CR-57 producido de manera transitoria fue de aproximadamente 3800 UI/mg de proteína (véanse las tablas 1 y 15), mientras que CR-57 producido de manera estable presentó una potencia de 5400 UI/mg de proteína
15 (datos no mostrados). De manera interesante, la mayoría de los anticuerpos neutralizantes monoclonales humanos identificados contenían un gen de línea germinal 3-30 pesado variable (véase la tabla 9).
Basándose en la afinidad de los anticuerpos por el virus de la rabia (datos no mostrados) y una dilución de criterio de valoración del 100% de los anticuerpos en un ensayo de RFFIT modificada (datos no mostrados), se eligió un panel de seis IgG únicas, es decir CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104, y CR04-144, para un
20 desarrollo posterior. Dentro de este panel, el anticuerpo CR04-098 fue particularmente interesante porque mostraba la mayor potencia, es decir aproximadamente 7300 UI/mg de proteína (véase la tabla 15). También se encontró una potencia similar para CR04-098 producido de manera estable (datos no mostrados).
Ejemplo 13
Neutralización in vitro de virus de escape E57 mediante IgG anti-virus de la rabia
25 Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia novedosos, se sometió a prueba la actividad neutralizante de las IgG frente a virus de escape E57 en una RFFIT modificada tal como se describió anteriormente. La mayoría de las IgG anti-virus de la rabia tenían buena actividad neutralizante frente a los seis virus de escape E57 (véase la tabla 16). En cambio, CR04-008, CR04-018 y CR04-126 no neutralizaron 6/6, 2/6 y 3/6 virus de escape E57, respectivamente. Ausencia de neutralización significa que no se alcanzó el criterio de
30 valoración del 50% a una dilución de anticuerpo de 1:100. CR04-021, CR04-108, CR04-120, CR04-125, y CR04-164 mostraron una disminución significativa en la actividad neutralizante frente a varios virus de escape. Esto sugiere que el epítopo de estos anticuerpos se ha incluido o bien directa o bien indirectamente en la glicoproteína de virus de escape E57. Basándose en lo anterior, varias IgG anti-virus de la rabia pueden ser compatibles con CR-57 en un cóctel anti-rabia para el tratamiento de profilaxis tras la exposición. En particular, el panel de seis IgG únicas tal
35 como se definió anteriormente, es decir anticuerpos CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104, y CR04-144, presentó buena potencia neutralizante frente a los virus de escape E57 lo que sugiere que ese/esos epítopo(s) reconocido(s) por esos anticuerpos no se veía(n) afectados por las mutaciones de aminoácidos inducidas por CR-57. El anticuerpo CR04-098 pareció el más prometedor ya que tenía una a potencia superior a 3000 UI/mg para cada uno de los virus de escape.
40 Ejemplo 14
Reconocimiento de epítopos de anticuerpos CR-57 y CR04-098 anti-rabia
Para confirmar que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, se generaron virus de escape del anticuerpo monoclonal humano denominado CR04098 esencialmente tal como se describió para los virus de escape de CR57 (véase el ejemplo 1). En resumen, se 45 puntuó el número de focos por pocillo mediante inmunofluorescencia y se eligió el medio de pocillos que contenían preferiblemente un foco para la amplificación del virus. Todos los virus de escape E98 se generaron a partir de 1 único foco con la excepción de E98-2 (2 focos) y E98-4 (4 focos). Un virus se definió como una variante de escape si el índice de neutralización era <2,5 log. El índice de neutralización se determinó restando el número de partículas de virus infecciosas/ml producido en cultivos de células BSR infectadas con virus más anticuerpo monoclonal (∼4 UI/ml)
50 del número de partículas de virus infecciosas/ml producido en cultivos de células BSR o MNA infectadas con virus solo virus ([log de unidades formadoras de focos/ml de virus en ausencia de anticuerpo monoclonal menos log de uff/ml de virus en presencia de anticuerpo monoclonal]). Se consideró que un índice inferior a 2,5 log era evidencia de escape.
Para investigar adicionalmente que CR04-098 se une a un epítopo no solapante, no competitivo, diferente en
55 comparación con CR-57, se sometió CR-57 a prueba frente a virus de escape E98 en un ensayo de RFFIT modificada tal como se describió anteriormente. Tal como se muestra en la tabla 17, CR-57 tenía buena actividad
neutralizante frente a los cinco virus de escape E98. Adicionalmente, se sometieron los anticuerpos CR04-010 y CR04-144 a prueba para determinar la actividad neutralizante frente a los virus de escape E98. Ninguno de los anticuerpos neutralizó los virus de escape E98 (datos no mostrados) lo que sugiere que el epítopo reconocido por ambos anticuerpos se ve afectado o bien directa o bien indirectamente por la mutación de aminoácidos inducida por el anticuerpo CR04-098. Se sometieron los anticuerpos CR04-018 y CR04-126 a prueba para determinar la actividad neutralizante frente a sólo uno de los virus de escape E98, es decir E98-4. CR04-018 podría neutralizar el virus de escape, mientras que CR04-126 sólo tenía una débil potencia neutralizante frente al virus de escape. Esto sugiere que el epítopo reconocido por CR04-018 no se ve afectado por la mutación inducida por el anticuerpo CR04-098. Adicionalmente, los anticuerpos CR04-010, CR04-038, CR04-040, CR04-073, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-164 no neutralizaron E98-4 lo que sugiere que reconocen el mismo epítopo que CR04098 (datos no mostrados).
Para identificar posibles mutaciones en la glicoproteína de la rabia de cada uno de los virus de escape E98, se determinó la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de la glicoproteína tal como se describió anteriormente para los virus de escape E57 y EJB. Todos los virus de escape E98 mostraron la mutación N a D en la posición de aminoácido 336 de la glicoproteína de la rabia (véase la figura 8). Esta región de la glicoproteína se ha definido como sitio antigénico III que consiste en los aminoácidos 330-338 (numeración sin péptido señal). En cambio, CR-57 reconoció un epítopo ubicado en los aminoácidos 226-231 (numeración sin péptido señal), que se solapa con el sitio antigénico I. Además de la mutación N336D el virus de escape E98 denominado E98-5 mostró la mutación H a Q en la posición de aminoácido 354 (cambio de codón de CAT a CAG) de la glicoproteína de la rabia (datos no mostrados).
Además, un análisis de Pepscan de la unión de CR57 a péptidos que alojan el epítopo de CR57 mutado (tal como se observa en los virus de escape E57) no mostró que se eliminará la interacción de CR57 (datos no mostrados). Sorprendentemente, CR04-098 todavía podía unirse a la glicoproteína mutada (que comprende la mutación N336D) expresada en células PER.C6®, según se mide mediante citometría de flujo (datos no mostrados), aunque los virus que contenían esta mutación ya no se neutralizaban.
Además, se realizaron estudios de mapeo de epítopo y estudios de clasificación de afinidad usando un análisis de resonancia de plasmón superficial usando un sistema analítico BIAcore3000™. Se inmovilizó la glicoproteína de la rabia purificada (cepa ERA) como ligando en un chip sensor de 4 canales de flujo CM5 de calidad para investigación (Fc) (Biacore AB, Suecia) usando acoplamiento con amina. La clasificación se realizó a 25ºC con HBS-EP (Biacore AB, Suecia) como tampón de ejecución. Se inyectaron 50 !l de cada anticuerpo a una velocidad de flujo constante de 20 !l/min. Después, se aplicó tampón de ejecución durante 750 segundos seguido por regeneración del chip CM5 con 5 !l de NaOH 2 M, 5 !l de HCl 45 mM y 5 !l de NaOH 2 mM. Se trazaron las señales de resonancia expresadas como unidades de resonancia (UR) como función del tiempo y se determinaron el aumento y la disminución de UR como una medida de la asociación y disociación, respectivamente, y se usaron para la clasificación de los anticuerpos. Los valores de KD reales para CR57 y CR04-098 según se determinaron mediante análisis de resonancia de plasmón superficial fueron de 2,4 nM y 4,5 nM, respectivamente. Los estudios de mapeo de epítopo confirmaron adicionalmente que CR57 y CR04-098 se unen a diferentes epítopos en la glicoproteína de la rabia. La inyección de CR57 dio como resultado una respuesta de 58 UR (datos no mostrados). Tras la inyección de CR04098 se obtuvo un aumento adicional del nivel de respuesta (24 UR), lo que sugiere que los sitios de unión para CR04-098 no estaban ocupados (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares cuando se aplicó el orden inverso lo que muestra que cada anticuerpo alcanzó niveles de UR similares independientemente del orden de inyección (datos no mostrados). Estos resultados demuestran adicionalmente que CR57 y CR04-098 pueden unirse simultáneamente y reconocer diferentes epítopos en la glicoproteína del virus de la rabia.
En general, los datos anteriores confirman adicionalmente que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes distintos epítopos, es decir epítopos en el sitio antigénico I y III, respectivamente. Los datos concuerdan bien con los datos de competición de ELISA/FACS que indican que CR-57 y CR04-098 no compiten por la unión a la proteína G de la cepa ERA y la buena actividad neutralizante del anticuerpo CR04-098 frente a todos los virus de escape E57. Basándose en estos resultados y el hecho de que la exposición in vitro de virus de la rabia a la combinación de CR57 y CR04-098 (selección en presencia de 4 UI/ml de cualquier anticuerpo) no proporcionó virus de escape (datos no mostrados), se concluyó que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, y pueden usarse ventajosamente en un cóctel de anticuerpos anti-virus de la rabia para el tratamiento de profilaxis tras la exposición.
Ejemplo 15
Evaluación de la conservación del epítopo reconocido por CR57 y CR04-098
Se alineó la región de unión mínima de CR-57 (aminoácidos KLCGVL dentro de SEQ ID NO: 332, la región de la glicoproteína de virus de la rabia reconocida por CR57 según se determina por medio de PEPSCAN y tecnología de exploración de alanina) con secuencias de nucleótidos de 229 aislados de virus de la rabia de genotipo 1 para evaluar la conservación del epítopo (véase la tabla 18). El conjunto de muestras contenía aislados humanos, aislados de murciélago y aislados de perros o de animales domésticos muy probablemente mordidos por perros con rabia. Un análisis de frecuencia de los aminoácidos en cada posición dentro de la región de unión mínima reveló que los residuos críticos que constituyen el epítopo estaban altamente conservados. La lisina en la posición uno se
conservó en un 99,6% de los aislados, mientras que sólo en 1/229 aislados se observó una mutación K>R
conservativa. Las posiciones dos y tres (L y C) se conservaron completamente. Se cree que el residuo de cisteína
central participa estructuralmente en el plegamiento de la glicoproteína y se conserva en todos los lyssavirus (véase
5 Badrane y Tordo, 2001). La glicina en la posición cuatro se conservó en un 98,7% de los aislados, mientras que en
3/229 aislados se observaron mutaciones hacia aminoácidos cargados (G>R en 1/229; G>E en 2/229). La quinta
posición también se conservó con la excepción de un aislado en el que se observó una mutación V>I conservativa.
En la sexta posición, que no es un residuo crítico según se determinó mediante exploración de sustitución con
alanina, se observó una heterogeneidad significativa en los aislados naturales: L en el 70,7%, P en el 26,7% y S en 10 el 2,6% de las cepas, respectivamente. En conjunto, se predice que aproximadamente el 99 por ciento de los virus
de la rabia que pueden encontrarse se reconocen por el anticuerpo CR-57.
Se analizaron 123 de estos 229 aislados de virus para determinar la presencia de mutaciones tanto en el epítopo de
CR-57 como en el CR04-098. Ninguno de estos 123 virus naturales contenía mutaciones en ambos epítopos. La
mutación N>D según se observó en los virus de escape E98 sólo estaba presente en cinco aislados de virus. Estos 15 virus eran geográficamente distintos y se aislaron de animales en África (véase la figura 9 para un árbol filogenético;
los cinco aislados de virus, es decir AF325483, AF325482, AF325481, AF325480 y AF325485, se indican en
negrita). El análisis filogenético de secuencias de glicoproteína reveló que los virus de la rabia con epítopos de CR57
mutados sólo están relacionados de manera distante con virus de la rabia que llevan un epítopo de CR04-098
mutado. Por tanto, la probabilidad de encontrar un virus de la rabia resistente a la neutralización mediante un cóctel 20 de CR-57 y CR04-098 es prácticamente inexistente.
Tabla 1: Potencia neutralizante de CR-57 y CR-JB frente a virus silvestre y de escape
Virus
Potencia CR-57 (UI/mg) Potencia CR-JB (UI/mg) Virus Potencia CR-57 (UI/mg) Potencia CR-JB (UI/mg)
CVS-11
3797 605 CVS-11 3797 605
E57A2
0 <0,2 EJB2B 0,004 0,6
E57A3
0 419 EJB2C <0,004 2
E57B1
0 93 EJB2D <0,004 3
E57B2
0 <0,3 EJB2E <0,2 <0,3
E57B3
0 419 EJB2F <0,06 3
E57C3
0 31 EJB3F <0,04 0,06
Tabla 2: Cebadores de región variable de cadena lambda humana (sentido). Tabla 3: Cebadores de región variable de cadena kappa humana (sentido).
Nombre del cebador
Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO
HuV∀1A
SEQ ID NO: 208
HuV∀1B
SEQ ID NO: 209
HuV∀1C
SEQ ID NO: 210
HuV∀2
SEQ ID NO: 211
HuV∀3A
SEQ ID NO: 212
HuV∀3
SEQ ID NO: 213
HuV∀4
SEQ ID NO: 214
HuV∀5
SEQ ID NO: 215
HuV∀6
SEQ ID NO: 216
HuV∀7/8
SEQ ID NO: 217
HuV∀9
SEQ ID NO: 218
Nombre del cebador
Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO
HuV∃1B
SEQ ID NO: 219
HuV∃2
SEQ ID NO: 220
HuV∃3
SEQ ID NO: 221
HuV∃4
SEQ ID NO: 222
HuV∃5
SEQ ID NO: 223
HuV∃6
SEQ ID NO: 224
Tabla 4: Cebadores de región variable de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido), cebadores de región J de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido), cebadores de región variable de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido) y cebadores de región J de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido).
Nombre del cebador
Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO
HuV∃1B-SalI
SEQ ID NO: 225
HuV∃2-SalI
SEQ ID NO: 226
HuV∃3B-SalI
SEQ ID NO: 227
HuV∃4B-SalI
SEQ ID NO: 228
HuV∃5-SalI
SEQ ID NO: 229
HuV∃6-SalI
SEQ ID NO: 230
HuV∃1-NotI
SEQ ID NO: 231
HuJ∃2-NotI
SEQ ID NO: 232
HuJ∃3-NotI
SEQ ID NO: 233
HuV∃4-NotI
SEQ ID NO: 234
HuV∃5-NotI
SEQ ID NO: 235
HuV∀1A-SalI
SEQ ID NO: 236
HuV∀1B-SalI
SEQ ID NO: 237
HuV∀1C-SalI
SEQ ID NO: 238
HuV∀2-SalI
SEQ ID NO: 239
HuV∀3A-SalI
SEQ ID NO: 240
HuV∀3B-SalI
SEQ ID NO: 241
HuV∀4-SalI
SEQ ID NO: 242
HuV∀5-SalI
SEQ ID NO: 243
HuV∀6-SalI
SEQ ID NO: 244
HuV∀7/8-SalI
SEQ ID NO: 245
HuV∀9-SalI
SEQ ID NO: 246
HuJ∀1-NotI
SEQ ID NO: 247
HuV∀2/3-NotI
SEQ ID NO: 248
HuJ∀4/5-NotI
SEQ ID NO: 249
Tabla 5: Distribución de los diferentes productos de cadena ligera a lo largo de las 10 fracciones. Tabla 6: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana (sentido).
Nombre del cebador
Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO
HuVH1B/7A
SEQ ID NO: 250
HuVH1C
SEQ ID NO: 251
HuVH2B
SEQ ID NO: 252
HuVH3B
SEQ ID NO: 253
HuVH3C
SEQ ID NO: 254
HuVH4B
SEQ ID NO: 255
HuVH4C
SEQ ID NO: 256
HuVH5B
SEQ ID NO: 257
HuVH6A
SEQ ID NO: 258
Tabla 7: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción SfiI/NcoI (sentido) y cebadores de región J de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción XhoI/BstEII (antisentido).
Nombre del cebador
Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO
HuVH1B/7A-SfiI
SEQ ID NO: 259
HuVH1C-SfiI
SEQ ID NO: 260
HuVH2B-SfiI
SEQ ID NO: 261
HuVH3B-SfiI
SEQ ID NO: 262
HuVH3C-SfiI
SEQ ID NO: 263
HuVH4B-SfiI
SEQ ID NO: 264
HuVH4C-SfiI
SEQ ID NO: 265
HuVH5B-SfiI
SEQ ID NO: 266
HuVH6A.SfiI
SEQ ID NO: 267
HuJH1/2-XhoI
SEQ ID NO: 268
HuJH3-XhoI
SEQ ID NO: 269
HuJH4/5-XhoI
SEQ ID NO: 270
HuJH6-XhoI
SEQ ID NO: 271
Tabla 8: Unión de anticuerpos de fagos monocatenarios (scFv) a proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) y a FBS según se mide mediante ELISA.
Nombre de anticuerpo de fagos
Proteína G de virus de la rabia (DO a 492 nm) FBS (DO a 492 nm)
SC04-001
0,828 0,053
SC04-004
0,550 0,054
SC04-008
0,582 0,058
SC04-010
0,915 0,043
SC04-018
0,247 0,052
SC04-021
0,278 0,052
SC04-026
0,212 0,054
SC04-031
0,721 0,065
SC04-038
0,653 0,061
SC04-040
0,740 0,053
SC04-060
0,923 0,056
SC04-073
0,657 0,054
SC04-097
0,835 0,056
SC04-098
0,798 0,060
SC04-103
0,606 0,059
SC04-104
0,566 0,063
SC04-108
0,363 0,052
SC04-120
0,571 0,052
SC04-125
0,735 0,049
SC04-126
0,232 0,051
SC04-140
0,865 0,057
SC04-144
0,775 0,054
SC04-146
0,484 0,057
SC04-164
0,547 0,057
Control (SO57)
0,650 0,055
Control (02-007)
0,063 0,052
Tabla 9: Datos de los Fv monocatenarios que pueden unirse a proteína G de virus de la rabia.
Nombre de scFv (bib.)
SEQ ID NO de secuencia de nucl. SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos HCDR3 (SEQ ID NO:) Locus de VH Locus de VL
sc04-001 (JK1994)
157 158 GLYGELFDY (SEQ ID NO: 1) 3-20 (DP32) V13 (31 -V213)
sc04-004 (WT2000)
159 160 DYLYPTTDFDY (SEQ ID NO: 2) 3-23 (DP47) VkI (012/02-DPK9)
sc04-008 (RAB03-G01)
161 162 MGFTGTYFDY (SEQ ID NO: 3) 2-70 (DP28) V13 (3h -V214)
sc04-010 (RAB03-G01)
163 164 3-30 (DP49) VkI (L11 -DPK3)
sc04-018 (RAB03-G01)
165 166 VSVTTGAFNI (SEQ ID NO: 5) 4-04 (DP70) V11 (1c -V116)
sc04-021 (RAB03-G01)
167 168 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 6) 3-30 (DP49) VkI (L8)
sc04-026 (RAB03-G01)
169 170 TSNWNYLDRFDP (SEQ ID NO: 7) 5-51 (DP73) VkII (A 19/03 -DPK15)
sc04-031 (RAB03-G01)
171 172 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 8) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)
sc04-038 (RAB03-G01)
173 174 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 9) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)
sc04-040 (RAB03-G01)
175 176 GSKVGDFDY (SEQ ID NO: 10) 3-30 (DP49) V13 (3h -V214)
sc04-060 (RAB04-G01)
177 178 4-59 (DP71) VkI (O12/02 -DPK9)
sc04-073 (RAB04-G01)
179 180 3-30 (DP49) VkI (L12)
sc04-097 (RAB04-G01)
181 182 TASNLGRGGMDV (SEQ ID NO: 13) 3-23 (DP47) VkI (L8)
sc04-098 (RAB04-G01)
183 184 VAVAGTHFDY (SEQ ID NO: 14) 3-30 (DP49) VkI (A30)
sc04-103 04-G01)
(RAB 185 186 VAVAGESFDS (SEQ ID NO: 15) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)
sc04-104 04-G01)
(RAB 187 188 IVVVTALDAFDI (SEQ ID NO: 16) 3-30 (DP49) VkI (L12)
sc04-108 04-G01)
(RAB 189 190 FMIVADDAFDI (SEQ ID NO: 17) 3-30 (DP49) VkI (L1)
sc04-120 04-G01)
(RAB 191 192 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 18) 3-30 (DP49) VkI (L8)
sc04-125 04-G01)
(RAB 193 194 IATAGTGFDY (SEQ ID NO: 19) 3-30 (DP49) VkI (L8)
sc04-126 04-G01)
(RAB 195 196 MGFTGTYTDY (SEQ ID NO: 20) 2-70 (DP28) V13 (3h -V214)
sc04-140 04-G01)
(RAB 197 198 VTNPGDAFDI (SEQ ID NO: 21) 3-30 (DP49) VkI (L4/18a)
sc04-144 04-G01)
(RAB 199 200 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 22) 3-30 (DP49) VkI (L8)
sc04-146 04-G01)
(RAB 201 202 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 23) 3-30 (DP49) VkIII (L2 -DPK21)
sc04-164 04-G01)
(RAB 203 204 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 24) 3-30 (DP49) VkI (L19 -DPK6)
SO57
205 206 1-69 (DP10) V12 (2e -VI3)
SOJB
312 313 RQHISSFPWFDS (SEQ ID NO: 276) 2-05 V13 (3h -V214)

Tabla 10: Datos de ensayo para determinar la actividad neutralizante contra el virus de la rabia de scFv.
Nombre de scFv
Dilución de criterio de valoración del 50% Norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) Potencia (UI/ml)
SC04-001
270 405 1,3
SC04-004
3645 405 18
SC04-008
>10935 405 >54
SC04-010
810 405 4
SC04-018
15 405 0,1
SC04-021
270 405 1,3
SC04-026
45 270 0,3
SC04-031
90 270 0,7
SC04-038
270 270 2
SC04-040
45 270 0,3
SC04-060
30 270 0,2
SC04-073
405 270 3
SC04-097
30 270 0,2
SC04-098
1215 270 9
SC04-103
45 270 0,3
SC04-104
135 270 1
SC04-108
135 270 1
SC04-120
810 270 6
SC04-125
405 270 3
SC04-126
10 270 0,1
SC04-140
135 270 1
SC04-144
810 270 6
SC04-146
405 270 3
SC04-164
45 270 0,3
Tabla 11A: Datos de ensayo para medir la actividad neutralizante de scFv para virus de escape E57 E57A2, E57A3 y E57B1.
Nombre de scFv
E57A2 E57A3 E57B1
1*
2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3*
SC04-001
10 90 0,2 10 90 0,2 30 45 1,3
SC04-004
810 90 18,0 1215 90 27,0 810 45 36,0
SC04-008
10 90 0,2 15 90 0,3 270 45 12,0
SC04-010
270 90 6,0 270 90 6,0 270 45 12,0
SC04-018
5 90 0,1 15 90 0,3 15 45 0,7
SC04-021
10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2
SC04-026
<5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0
SC04-031
10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2
SC04-038
90 90 2,0 90 90 2,0 45 90 1,0
SC04-040
15 90 0,3 5 90 0,1 5 90 0,1
SC04-060
5 90 0,1 5 90 0,1 <5 90 0,0.
SC04-073
135 90 3,0 90 30 6,0 30 30 2,0
SC04-097
<5 90 0,0 <5 90 0,0 <5 90 0,0
SC04-098
810 90 18,0 270 30 18,0 270 30 18,0
SC04-103
<5 90 0,0 10 90 0,2 5 90 0,1
SC04-104
90 90 2,0 30 30 2,0 30 30 2,0
SC04-108
15 90 0,3 <5 90 0,0 <5 90 0,0
SC04-120
45 90 1,0 30 30 2,0 10 30 0,7
SC04-125
135 90 3,0 135 30 9,0 90 30 6,0
SC04-126
<5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0
SC04-140
30 45 1,3 90 30 6,0 45 90 1,0
SC04-144
270 45 12,0 270 30 18,0 135 90 3,0
SC04-146
90 45 4,0 90 30 6,0 90 90 2,0
SC04-164
15 45 0,7 30 30 2,0 15 90 0,3
1* es la dilución de criterio de valoración del 50% 2* es la norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) 3* es la potencia (UI/ml) Tabla 11 B: Datos de ensayo para medir la actividad neutralizante de scFv para virus de escape E57 E57B2, E57B3
y E57C3.
Nombre de scFv
E57B2 E57B3 E57C3
1*
2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3*
SC04-001
30 45 1,3 90 270 0,7 5 90 0,1
SC04-004
5 45 0,2 2430 270 18,0 270 90 6,0
SC04-008
5 45 0,2 45 270 0,3 10 90 0,2
SC04-010
45 45 2,0 405 270 3,0 270 90 6,0
SC04-018
15 45 0,7 15 270 0,1 30 90 0,7
SC04-021
10 90 0,2 30 270 0,2 10 90 0,2
SC04-026
<5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0
SC04-031
10 90 0,2 30 270 0,2 30 90 0,7
SC04-038
30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0
SC04-040
5 90 0,1 15 135 0,2 10 90 0,2
SC04-060
<5 90 0,0 10 135 0,1 5 90 0,1
SC04-073
30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0
SC04-097
<5 90 0,0 <5 135 0,0 <5 90 0,0
SC04-098
90 90 2,0 810 270 6,0 270 90 6,0
SC04-103
<5 90 0,0 10 135 0,1 10 90 0,2
SC04-104
45 90 1,0 45 270 0,3 90 90 2,0
SC04-108
10 90 0,2 <5 135 0,0 15 90 0,3
SC04-120
15 90 0,3 45 270 0,3 30 90 0,7
SC04-125
90 90 2,0 270 270 2,0 270 90 6,0
SC04-126
<5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0
SC04-140
30 90 0,7 90 90 2,0 270 90 6,0
SC04-144
90 90 2,0 270 90 6,0 405 90 9,0
SC04-146
30 90 0,7 90 90 2,0 90 90 2,0
SC04-164
15 90 0,3 15 90 0,3 30 90 0,7
1* es la dilución de criterio de valoración del 50% 2* es la norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) 3* es la potencia (UI/ml) Tabla 12: Oligonucleótidos usados para la amplificación mediante PCR de genes de VH.
Nombre y secuencia de nucleótidos
Gen de VH SEQ ID NO:
5H-B: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtggagtctg
SC04-001 280
5H-C: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgg
SC04-021 SC04-031 SC04-125 SC04-164 281
5H-C-largo: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgggg
SC04-010 SC04-038 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-120 SC04-140 SC04-144 SC04-146 282
5H-F: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctgcaggagtccggccc
SC04-018 SC04-060 283
5H-H: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtgcagtctgg
SC04-026 284
5H-I: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctgctggagtctgg
SC04-004 SC04-097 285
5H-M: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgaccttgaaggagtctgg
SC04-008 SC04-126 286
sy3H-A: gcccttggtgctagcgctggagacggtcaccagggtgccctggcccc
SC04-001 SC04-004 SC04-008 SC04-010 SC04-026 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-120 SC04-125 287
SC04-126 SC04-144 SC04-146
sy3H-C: gcccttggtgctagcgctggagacggtcacggtggtgccctggcccc
SC04-097 288
sy3H-C-largo:
SC04-060 289
sy3H-D: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccatggtgccctggcccc
SC04-018 SC04-021 SC04-031 SC04-038 SC04-104 SC04-108 SC04-140 SC04-164 290
sy3H-E: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccagggtgccccggcccc
SC04-103 291

Tabla 13: Oligonucleótidos usados para la amplificación mediante PCR de genes de VL.
Nombre y secuencia de nucleótidos
Gen de VL SEQ ID NO:
3L-B: ttttccttagcggccgcgactcacctaggacggtcagcttggtc
SC04-001 292
5K-B: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtc
SC04-031 SC04-060 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-164 293
5K-C: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtctccatcct ccc
SC04-004 294
5K-G: acctgtctcgagttttccatggctgacatcgtgatgacccagtctcc
SC04-026 295
5K-K: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagatgacccagtctcc
SC04-010 296
5K-M: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagctgacccagtc
SC04-021 SC04-097 SC04-120 SC04-125 SC04-144 297
5K-N: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgactcagtc
SC04-038 298
5K-O: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagctgacccagtc
SC04-140 299
5K-Q: acctgtctcgagttttccatggctgagatcgtgatgactcagtc
SC04-146 300
5L-E: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagccg
SC04-008 301
5L-F: acctgtctcgagttttccatggctcagtccgtgctgactcagcc
SC04-018 302
5L-G: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagcc
SC04-040 303
SC04-126
sy3K-F: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccaccttggtccc
SC04-004 SC04-010 SC04-021 SC04-031 SC04-098 SC04-104 SC04-125 SC04-140 SC04-144 SC04-164 304
sy3K-I: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagccgtgtccc
SC04-038 SC04-097 SC04-103 SC04-108 SC04-146 305
sy3K-J: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagcttggtccc
SC04-026 SC04-060 SC04-073 306
sy3K-K: gctgggggcggccacggtccgcttgatgtccaccttggtccc
SC04-120 307
sy3L-A: ccagcacggtaagcttcagcacggtcaccttggtgccagttcc
SC04-018 SC04-126 308
sy3L-C: ccagcacggtaagcttcagcacggtcagcttggtgcctccgcc
SC04-040 309
sy3L-D: ccagcacggtaagcttcaacacggtcagctgggtccc
SC04-008 310
sy5L-A:
SC04-001 311

Tabla 14: Unión de los anticuerpos monoclonales humanos CR57, CRJB y CR04-010 (10 !g/ml) a péptidos lineales del dominio extracelular de glicoproteína G de la cepa ERA del virus de la rabia.
Secuencia de aminoácidos de péptido lineal
CR57 CRJB CR04-010
KFPIYTILDKLGPWS
71 97 1
FPIYTILDKLGPWSP
42 105 39
PIYTILDKLGPWSPI
36 89 87
IYTILDKLGPWSPID
44 97 104
YTILDKLGPWSPIDI
48 114 91
TILDKLGPWSPIDIH
76 96 88
ILDKLGPWSPIDIHH
54 104 69
LDKLGPWSPIDIHHL
55 99 107
DKLGPWSPIDIHHLS
62 103 93
KLGPWSPIDIHHLSC
72 105 45
LGPWSPIDIHHLSCP
69 112 19
GPWSPIDIHHLSCPN
68 114 33
PWSPIDIHHLSCPNN
62 104 47
WSPIDIHHLSCPNNL
80 106 11
SPIDIHHLSCPNNLV
74 85 1
PIDIHHLSCPNNLVV
46 93 90
IDIHHLSCPNNLVVE
69 102 55
DIHHLSCPNNLVVED
38 96 78
IHHLSCPNNLVVEDE
37 85 113
HHLSCPNNLWEDEG
56 76 117
HLSCPNNLVVEDEGC
65 119 111
LSCPNNLVVEDEGCT
69 117 127
SCPNNLVVEDEGCTN
83 114 91
CPNNLVVEDEGCTNL
77 97 49
PNNLVVEDEGCTNLS
78 107 97
NNLVVEDEGCTNLSG
72 99 97
NLVVEDEGCTNLSGF
75 119 55
LVVEDEGCTNLSGFS
76 103 52
VVEDEGCTNLSGFSY
73 107 91
VEDEGCTNLSGFSYM
74 103 31
EDEGCTNLSGFSYME
54 90 7
DEGCTNLSGFSYMEL
1 23 1
EGCTNLSGFSYMELK
51 114 129
GCTNLSGFSYMELKV
55 114 118
CTNLSGFSYMELKVG
47 110 137
TNLSGFSYMELKVGY
43 106 161
NLSGFSYMELKVGYI
61 115 170
LSGFSYMELKVGYIL
71 132 169
SGFSYMELKVGYILA
79 132 161
GFSYMELKVGYILAI
65 111 141
FSYMELKVGYILAIK
89 112 192
SYMELKVGYILAIKM
65 123 152
YMELKVGYILAIKMN
78 114 150
MELKVGYILAIKMNG
76 141 107
ELKVGYILAIKMNGF
87 132 76
LKVGYILAIKMNGFT
78 112 118
KVGYILAIKMNGFTC
78 118 68
VGYILAIKMNGFTCT
77 93 1
GYILAIKMNGFTCTG
75 90 1
YILAIKMNGFTCTGV
47 107 107
ILAIKMNGFTCTGVV
79 103 104
LAIKMNGFTCTGVVT
68 130 159
AIKMNGFTCTGVVTE
47 103 152
IKMNGFTCTGVVTEA
68 108 138
KMNGFTCTGVVTEAE
76 104 133
MNGFTCTGVVTEAEN
69 99 148
NGFTCTGVVTEAENY
69 101 138
GFTCTGVVTEAENYT
71 86 129
FTCTGVVTEAENYTN
83 125 154
TCTGVVTEAENYTNF
92 112 129
CTGVVTEAENYTNFV
76 123 150
TGVVTEAENYTNFVG
85 110 154
GVVTEAENYTNFVGY
86 111 110
VVTEAENYTNFVGYV
87 106 114
VTEAENYTNFVGYVT
79 90 73
TEAENYTNFVGYVTT
68 84 8
EAENYTNFVGYVTTT
69 117 142
AENYTNFVGYVTTTF
66 106 110
ENYTNFVGYVTTTFK
44 112 183
NYTNFVGYVTTTFKR
49 114 174
YTNFVGYVTTTFKRK
51 104 138
TNFVGYVTTTFKRKH
71 125 165
NFVGYVTTTFKRKHF
65 107 154
FVGYVTTTFKRKHFR
70 111 152
VGYVTTTFKRKHFRP
75 113 155
GYVTTTFKRKHFRPT
70 123 160
YVTTTFKRKHFRPTP
85 106 160
VTTTFKRKHFRPTPD
79 105 119
TTTFKRKHFRPTPDA
80 108 137
TTFKRKHFRPTPDAC
74 99 110
TFKRKHFRPTPDACR
96 111 108
FKRKHFRPTPDACRA
64 92 62
KRKHFRPTPDACRAA
65 93 1
RKHFRPTPDACRAAY
64 107 99
KHFRPTPDACRAAYN
73 112 124
HFRPTPDACRAAYNW
46 113 118
FRPTPDACRAAYNWK
43 112 148
RPTPDACRAAYNWKM
77 101 129
PTPDACRAAYNWKMA
99 125 143
TPDACRAAYNWKMAG
92 132 160
PDACRAAYNWKMAGD
61 124 147
DACRAAYNWKMAGDP
84 113 136
ACRAAYNWKMAGDPR
82 116 138
CRAAYNWKMAGDPRY
87 118 137
RAAYNWKMAGDPRYE
90 130 120
AAYNWKMAGDPRYEE
68 106 120
AYNWKMAGDPRYEES
96 94 77
YNWKMAGDPRYEESL
83 118 116
NWKMAGDPRYEESLH
58 101 69
WKMAGDPRYEESLHN
69 101 1
KMAGDPRYEESLHNP
62 102 84
MAGDPRYEESLHNPY
64 116 112
AGDPRYEESLHNPYP
40 101 125
GDPRYEESLHNPYPD
36 98 123
DPRYEESLHNPYPDY
57 110 118
PRYEESLHNPYPDYR
73 115 129
RYEESLHNPYPDYRW
69 112 125
YEESLHNPYPDYRWL
58 106 120
EESLHNPYPDYRWLR
76 123 141
ESLHNPYPDYRWLRT
92 132 125
SLHNPYPDYRWLRTV
78 111 137
LHNPYPDYRWLRTVK
79 106 142
HNPYPDYRWLRTVKT
86 108 146
NPYPDYRWLRTVKTT
85 102 151
PYPDYRWLRTVKTTK
65 93 103
YPDYRWLRTVKTTKE
72 97 97
PDYRWLRTVKTTKES
76 85 27
DYRWLRTVKTTKESL
54 111 105
YRWLRTVKTTKESLV
46 117 125
RWLRTVKTTKESLVI
40 110 120
WLRTVKTTKESLVII
41 104 125
LRTVKTTKESLVIIS
65 104 161
RTVKTTKESLVIISP
82 120 150
TVKTTKESLVIISPS
76 116 150
VKTTKESLVIISPSV
71 120 154
KTTKESLVIISPSVA
101 112 147
TTKESLVIISPSVAD
78 121 141
TKESLVIISPSVADL
86 112 132
KESLVIISPSVADLD
86 117 111
ESLVIISPSVADLDP
88 125 143
SLVIISPSVADLDPY
68 105 125
LVIISPSVADLDPYD
85 107 93
VIISPSVADLDPYDR
59 98 50
IISPSVADLDPYDRS
83 125 14
ISPSVADLDPYDRSL
50 119 91
SPSVADLDPYDRSLH
59 114 118
PSVADLDPYDRSLHS
44 114 118
SVADLDPYDRSLHSR
49 106 129
VADLDPYDRSLHSRV
71 113 141
ADLDPYDRSLHSRVF
70 121 141
DLDPYDRSLHSRVFP
111 152 127
LDPYDRSLHSRVFPS
99 142 106
DPYDRSLHSRVFPSG
90 120 134
PYDRSLHSRVFPSGK
86 120 130
YDRSLHSRVFPSGKC
364 818 127
DRSLHSRVFPSGKCS
98 142 141
RSLHSRVFPSGKCSG
87 141 156
SLHSRVFPSGKCSGV
69 111 141
LHSRVFPSGKCSGVA
78 114 129
HSRVFPSGKCSGVAV
97 118 111
SRVFPSGKCSGVAVS
100 125 24
RVFPSGKCSGVAVSS
69 110 106
VFPSGKCSGVAVSST
74 114 142
FPSGKCSGVAVSSTY
64 134 146
PSGKCSGVAVSSTYC
56 112 132
SGKCSGVAVSSTYCS
64 121 120
GKCSGVAVSSTYCST
92 143 145
KCSGVAVSSTYCSTN
88 130 130
CSGVAVSSTYCSTNH
110 165 143
SGVAVSSTYCSTNHD
79 110 115
GVAVSSTYCSTNHDY
79 114 108
VAVSSTYCSTNHDYT
85 114 118
AVSSTYCSTNHDYTI
71 105 102
VSSTYCSTNHDYTIW
78 107 121
SSTYCSTNHDYTIWM
76 107 121
STYCSTNHDYTIWMP
86 99 119
TYCSTNHDYTIWMPE
96 107 74
YCSTNHDYTIWMPEN
47 92 29
CSTNHDYTIWMPENP
52 106 86
STNHDYTIWMPENPR
60 112 107
TNHDYTIWMPENPRL
69 129 119
NHDYTIWMPENPRLG
71 119 130
HDYTIWMPENPRLGM
82 125 123
DYTIWMPENPRLGMS
93 127 123
YTIWMPENPRLGMSC
97 132 143
TIWMPENPRLGMSCD
69 106 134
IWMPENPRLGMSCDI
98 110 101
WMPENPRLGMSCDIF
88 113 120
MPENPRLGMSCDIFT
105 121 143
PENPRLGMSCDIFTN
83 111 104
ENPRLGMSCDIFTNS
71 118 111
NPRLGMSCDIFTNSR
90 113 138
PRLGMSCDIFTNSRG
72 112 105
RLGMSCDIFTNSRGK
88 106 113
LGMSCDIFTNSRGKR
76 110 114
GMSCDIFTNSRGKRA
54 120 101
MSCDIFTNSRGKRAS
46 110 106
SCDIFTNSRGKRASK
44 111 98
CDIFTNSRGKRASKG
42 104 117
DIFTNSRGKRASKGS
70 107 111
IFTNSRGKRASKGSE
77 125 87
FTNSRGKRASKGSET
83 111 119
TNSRGKRASKGSETC
68 108 110
NSRGKRASKGSETCG
92 100 119
SRGKRASKGSETCGF
64 93 90
RGKRASKGSETCGFV
75 104 115
GKRASKGSETCGFVD
92 124 118
KRASKGSETCGFVDE
92 106 129
RASKGSETCGFVDER
86 110 134
ASKGSETCGFVDERG
97 108 103
SKGSETCGFVDERGL
92 102 76
KGSETCGFVDERGLY
90 97 44
GSETCGFVDERGLYK
57 115 92
SETCGFVDERGLYKS
33 116 86
ETCGFVDERGLYKSL
64 120 138
TCGFVDERGLYKSLK
47 120 125
CGFVDERGLYKSLKG
72 115 120
GFVDERGLYKSLKGA
84 120 129
FVDERGLYKSLKGAC
86 121 124
VDERGLYKSLKGACK
50 108 110
DERGLYKSLKGACKL
90 119 54
ERGLYKSLKGACKLK
90 118 106
RGLYKSLKGACKLKL
90 121 121
GLYKSLKGACKLKLC
94 129 92
LYKSLKGACKLKLCG
93 136 141
YKSLKGACKLKLCGV
80 112 110
KSLKGACKLKLCGVL
129 113 110
SLKGACKLKLCGVLG
200 111 124
LKGACKLKLCGVLGL
340 90 23
KGACKLKLCGVLGLR
181 111 100
GACKLKLCGVLGLRL
123 134 129
ACKLKLCGVLGLRLM
148 117 142
CKLKLCGVLGLRLMD
410 111 147
KLKLCGVLGLRLMDG
273 120 114
LKLCGVLGLRLMDGT
918 145 148
KLCGVLGLRLMDGTW
3152 132 86
LCGVLGLRLMDGTWV
83 138 129
CGVLGLRLMDGTWVA
99 117 104
GVLGLRLMDGTWVAM
89 148 117
VLGLRLMDGTWVAMQ
90 141 127
LGLRLMDGTWVAMQT
102 115 97
GLRLMDGTWVAMQTS
104 138 120
LRLMDGTWVAMQTSN
103 114 118
RLMDGTWVAMQTSNE
100 113 130
LMDGTWVAMQTSNET
96 106 106
MDGTWVAMQTSNETK
97 97 110
DGTWVAMQTSNETKW
69 114 92
GTWVAMQTSNETKWC
58 113 82
TWVAMQTSNETKWCP
78 118 107
WVAMQTSNETKWCPP
50 114 116
VAMQTSNETKWCPPD
86 104 151
AMQTSNETKWCPPDQ
104 114 128
MQTSNETKWCPPDQL
104 132 125
QTSNETKWCPPDQLV
92 120 155
TSNETKWCPPDQLVN
97 111 90
SNETKWCPPDQLVNL
99 129 110
NETKWCPPDQLVNLH
90 128 107
ETKWCPPDQLVNLHD
105 120 118
TKWCPPDQLVNLHDF
85 125 125
KWCPPDQLVNLHDFR
89 113 121
WCPPDQLVNLHDFRS
101 119 99
CPPDQLVNLHDFRSD
93 137 127
PPDQLVNLHDFRSDE
107 120 56
PDQLVNLHDFRSDEI
35 106 63
DQLVNLHDFRSDEIE
54 117 97
QLVNLHDFRSDEIEH
60 113 106
LVNLHDFRSDEIEHL
47 104 100
VNLHDFRSDEIEHLV
83 129 98
NLHDFRSDEIEHLVV
83 113 110
LHDFRSDEIEHLVVE
93 115 121
HDFRSDEIEHLVVEE
69 107 150
DFRSDEIEHLVVEEL
99 103 110
FRSDEIEHLVVEELV
86 114 116
RSDEIEHLVVEELVR
100 138 104
SDEIEHLVVEELVRK
101 117 118
DEIEHLVVEELVRKR
94 123 143
EIEHLWEELVRKRE
82 113 121
IEHLVVEELVRKREE
90 129 118
EHLVVEELVRKREEC
82 114 106
HLVVEELVRKREECL
82 123 46
LVVEELVRKREECLD
64 100 79
VVEELVRKREECLDA
62 108 97
VEELVRKREECLDAL
58 111 101
EELVRKREECLDALE
69 112 123
ELVRKREECLDALES
82 113 117
LVRKREECLDALESI
86 130 124
VRKREECLDALESIM
58 181 151
RKREECLDALESIMT
73 110 137
KREECLDALESIMTT
102 113 97
REECLDALESIMTTK
94 110 106
EECLDALESIMTTKS
82 120 133
ECLDALESIMTTKSV
91 112 125
CLDALESIMTTKSVS
101 146 155
LDALESIMTTKSVSF
97 116 152
DALESIMTTKSVSFR
104 120 188
ALESIMTTKSVSFRR
97 132 137
LESIMTTKSVSFRRL
48 114 130
ESIMTTKSVSFRRLS
62 111 114
SIMTTKSVSFRRLSH
54 130 97
IMTTKSVSFRRLSHL
43 101 111
MTTKSVSFRRLSHLR
59 116 125
TTKSVSFRRLSHLRK
66 118 111
TKSVSFRRLSHLRKL
83 125 123
KSVSFRRLSHLRKLV
108 124 129
SVSFRRLSHLRKLVP
64 123 117
VSFRRLSHLRKLVPG
90 111 105
SFRRLSHLRKLVPGF
92 110 96
FRRLSHLRKLVPGFG
90 108 111
RRLSHLRKLVPGFGK
92 143 118
RLSHLRKLVPGFGKA
93 123 148
LSHLRKLVPGFGKAY
96 139 150
SHLRKLVPGFGKAYT
113 132 132
HLRKLVPGFGKAYTI
99 111 102
LRKLVPGFGKAYTIF
83 118 82
RKLVPGFGKAYTIFN
47 115 86
KLVPGFGKAYTIFNK
47 114 123
LVPGFGKAYTIFNKT
54 112 139
VPGFGKAYTIFNKTL
58 114 138
PGFGKAYTIFNKTLM
78 113 157
GFGKAYTIFNKTLME
78 123 320
FGKAYTIFNKTLMEA
90 151 356
GKAYTIFNKTLMEAD
76 127 418
KAYT1FNKTLMEADA
101 123 554
AYTIFNKTLMEADAH
86 121 197
YTIFNKTLMEADAHY
104 147 161
TIFNKTLMEADAHYK
107 123 1405
IFNKTLMEADAHYKS
100 118 1828
FNKTLMEADAHYKSV
111 141 2736
NKTLMEADAHYKSVR
104 116 141
KTLMEADAHYKSVRT
91 98 123
TLMEADAHYKSVRTW
100 114 90
LMEADAHYKSVRTWN
73 107 97
MEADAHYKSVRTWNE
62 129 83
EADAHYKSVRTWNEI
58 97 106
ADAHYKSVRTWNEIL
56 100 100
DAHYKSVRTWNEILP
59 121 112
AHYKSVRTWNEILPS
112 160 125
HYKSVRTWNEILPSK
80 130 123
YKSVRTWNEILPSKG
66 137 116
KSVRTWNEILPSKGC
115 125 114
SVRTWNEILPSKGCL
106 138 118
VRTWNEILPSKGCLR
90 124 133
RTWNEILPSKGCLRV
120 127 120
TWNEILPSKGCLRVG
97 146 127
WNEILPSKGCLRVGG
102 136 117
NEILPSKGCLRVGGR
104 130 163
EILPSKGCLRVGGRC
104 112 128
ILPSKGCLRVGGRCH
79 113 107
LPSKGCLRVGGRCHP
77 119 100
PSKGCLRVGGRCHPH
69 138 91
SKGCLRVGGRCHPHV
72 121 103
KGCLRVGGRCHPHVN
68 130 115
GCLRVGGRCHPHVNG
85 125 123
CLRVGGRCHPHVNGV
102 132 134
LRVGGRCHPHVNGVF
104 143 133
RVGGRCHPHVNGVFF
86 143 99
VGGRCHPHVNGVFFN
120 136 120
GGRCHPHVNGVFFNG
86 119 119
GRCHPHVNGVFFNGI
117 113 117
RCHPHVNGVFFNGII
98 141 143
CHPHVNGVFFNGIIL
97 150 151
HPHVNGVFFNGIILG
104 138 164
PHVNGVFFNGIILGP
93 173 146
HVNGVFFNGIILGPD
97 123 114
VNGVFFNGIILGPDG
68 116 85
NGVFFNGIILGPDGN
66 117 97
GVFFNGIILGPDGNV
58 116 100
VFFNGIILGPDGNVL
55 132 108
FFNGIILGPDGNVLI
92 143 105
FNGIILGPDGNVLIP
61 139 130
NGIILGPDGNVLIPE
102 146 141
GIILGPDGNVLIPEM
107 132 123
IILGPDGNVLIPEMQ
85 118 93
ILGPDGNVLIPEMQS
125 134 119
LGPDGNVLIPEMQSS
100 134 150
GPDGNVLIPEMQSSL
86 154 157
PDGNVLIPEMQSSLL
87 129 139
DGNVLIPEMQSSLLQ
123 134 169
GNVLIPEMQSSLLQQ
96 120 168
NVLIPEMQSSLLQQH
72 120 150
VLIPEMQSSLLQQHM
92 104 142
LIPEMQSSLLQQHME
89 111 85
IPEMQSSLLQQHMEL
89 128 129
PEMQSSLLQQHMELL
62 133 93
EMQSSLLQQHMELLE
58 129 142
MQSSLLQQHMELLES
65 113 117
QSSLLQQHMELLESS
82 114 132
SSLLQQHMELLESSV
90 128 132
SLLQQHMELLESSVI
124 163 133
LLQQHMELLESSVIP
78 111 121
LQQHMELLESSVIPL
106 134 128
QQHMELLESSVIPLV
103 134 133
QHMELLESSVIPLVH
98 146 139
HMELLESSVIPLVHP
110 129 134
MELLESSVIPLVHPL
90 125 152
ELLESSVIPLVHPLA
90 133 155
LLESSVIPLVHPLAD
72 117 118
LESSVIPLVHPLADP
90 128 128
ESSVIPLVHPLADPS
104 138 143
SSVIPLVHPLADPST
73 104 93
SVIPLVHPLADPSTV
72 137 107
VIPLVHPLADPSTVF
69 141 123
IPLVHPLADPSTVFK
96 156 188
PLVHPLADPSTVFKD
93 112 138
LVHPLADPSTVFKDG
164 174 188
VHPLADPSTVFKDGD
98 138 125
HPLADPSTVFKDGDE
74 141 117
PLADPSTVFKDGDEA
99 125 90
LADPSTVFKDGDEAE
68 116 113
ADPSTVFKDGDEAED
147 152 110
DPSTVFKDGDEAEDF
98 147 137
PSTVFKDGDEAEDFV
104 143 141
STVFKDGDEAEDFVE
104 120 125
TVFKDGDEAEDFVEV
107 124 96
VFKDGDEAEDFVEVH
100 106 93
FKDGDEAEDFVEVHL
65 76 119
KDGDEAEDFVEVHLP
72 93 76
DGDEAEDFVEVHLPD
85 123 91
GDEAEDFVEVHLPDV
46 124 113
DEAEDFVEVHLPDVH
68 136 123
EAEDFVEVHLPDVHN
76 117 114
AEDFVEVHLPDVHNQ
123 138 123
EDFVEVHLPDVHNQV
90 141 123
DFVEVHLPDVHNQVS
96 141 118
FVEVHLPDVHNQVSG
92 143 102
VEVHLPDVHNQVSGV
106 141 123
EVHLPDVHNQVSGVD
91 150 139
VHLPDVHNQVSGVDL
110 114 137
HLPDVHNQVSGVDLG
104 150 129
LPDVHNQVSGVDLGL
104 154 154
PDVHNQVSGVDLGLP
106 129 115
DVHNQVSGVDLGLPN
117 133 113
VHNQVSGVDLGLPNW
100 119 38
HNQVSGVDLGLPNWG
76 106 38
NQVSGVDLGLPNWGK
78 138 98
Promedio
91,9 119,5 130,9
D.E.
157,9 37,6 169,8
Tabla 15: Potencias neutralizantes de IgG anti-proteína G de virus de la rabia.
Nombre de IgG
UI/mg
CR04-001
89
CR04-004
5
CR04-008
1176
CR04-010
3000
CR04-018
1604
CR04-021
1500
CR04-026
<2
CR04-031
272
CR04-038
2330
CR04-040
3041
CR04-060
89
CR04-073
6116
CR04-097
<1
CR04-098
7317
CR04-103
3303
CR04-104
4871
CR04-108
4871
CR04-120
4938
CR04-125
4718
CR04-126
2655
CR04-140
478
CR04-144
6250
CR04-146
ND
CR04-164
4724
CR57
3800
CRJB
605
ND = no determinado Tabla 16: Potencias neutralizantes de IgG anti-proteína G de virus de la rabia frente a virus de escape E57.
Nombre de IgG
E57A2 (UI/mg) E57A3 (UI/mg) E57B1 (UI/mg) E57B2 (UI/mg) E57B3 (UI/mg) E57C3 (UI/mg)
CR04-008
0* 0 0 0 0 0
CR04-010
8127 1355 5418 1355 2709 4064
CR04-018
1604 0 1604 0 59 535
CR04-021
450 2 150 8 50 50
CR04-038
9437 1573 9437 1049 6291 1573
CR04-040
8209 2736 24628 1368 5473 912
CR04-073
8256 1835 11008 1835 3669 1835
CR04-098
9878 3293 9878 3293 3293 3293
CR04-103
8917 2972 17835 2972 5945 2972
CR04-104
3288 2192 6576 2192 4384 1096
CR04-108
3288 731 4384 731 2192 731
CR04-120
1111 14 741 82 247 41
CR04-125
708 39 236 79 157 79
CR04-126
88 0 18 0 18 0
CR04-144
5625 2813 11250 2813 5625 1875
CR04-164
4252 472 4252 472 945 709
*
0 indica ausencia de criterio de valoración del 50% a una dilución de 1:100 del anticuerpo Tabla 17. Potencia neutralizante de CR-57 frente a virus de escape E98.
*
Cero indica ausencia de criterio de valoración del 50% a una dilución de 1:1000 del anticuerpo.
E98-2 (UI/mg)
E98-4 (UI/mg) E98-5 (UI/mg) E98-6 (UI/mg) E98-7 (UI/mg)
CR-57
2813 8438 4219 2813 8438
CR04-098
0* 0 0 0 0
Tabla 18: Aparición de residuos de aminoácido en la región de unión mínima de CR57 dentro de virus de la rabia de genotipo 1.
Silvestre
K L C G V L
K (99,6%)*
L (100%) C (100%) G (98,7%) V (99,6%) L (70,7%)
R (0,4%)
E (0,9%) I (0,4%) P (26,7%)
R (0,4%)
S (2,6%)
*Se muestra el porcentaje de aparición de cada aminoácido dentro de 229 aislados de virus de la rabia.
Lista de secuencias
<110> Crucell Holland B.V. Bakker, Alexander B.H. Marissen, Willem E. Kramer, Robert A. De Kruif, Cornelis A.
<120> Moléculas de unión humanas que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas
<130> 0110 WO 00 ORD
<160> 337
<170> Patent In versión 3.1
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-001
<400> 1
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-004
<400> 2
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-008
<400> 3
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-010
<400> 4
10 <210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> CDR3 de SC04-018
<400> 5
<210> 6
<211> 10 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-021
<400> 6
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213>
Secuencia artificial 30 <220>
<223> CDR3 de SC04-026
<400> 7
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-031
<400> 8
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213>
Secuencia artificial 15 <220>
<223> CDR3 de SC04-038
<400> 9
<210> 10 20 <211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-040 25 <400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-060
<400> 11
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-073
<400> 12
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> CDR3 de SC04-097
<400> 13
<210> 14 20 <211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-098 25 <400> 14
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-103
<400> 15
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> CDR3 de SC04-104
<400> 16
<210> 17 15 <211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-108 20 <400> 17
<210> 18
<211> 9
<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-120
<400> 18
30 <210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-125
<400> 19
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> CDR3 de SC04-126
<400> 20
<210> 21 15 <211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-140 20 <400> 21
<210> 22
<211> 9
<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-144
<400> 22
30 <210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-146
<400> 23
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-164
<400> 24
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SO57
<400> 25
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-001
<400> 26 <210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-004
<400> 27 <210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-008
<400> 28
10 <210> 29
<211> 123
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-010
<400> 29
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-018
<400> 30 <210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-021
<400> 31 <210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-026
<400> 32
10 <210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-031
<400> 33
5 <210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-038
<400> 34
<210> 35
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-040
<400> 35 <210> 36
<211> 128
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-060
<400> 36
<210> 37
<211> 123
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-073
<400> 37
<210> 38
<211>
121 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-097
<400> 38
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-098
<400> 39
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-103
<400> 40
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-104
<400> 41
<210> 42
<211>
120 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-108
<400> 42
<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-120
<400> 43
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-125
<400> 44
<210> 45 10 <211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-126 15 <400> 45
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-140
<400> 46 <210> 47
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-144
<400> 47 <210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-146
<400> 48
10 <210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-164
<400> 49
<210> 50
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-001
<400> 50 <210> 51
<211> 103
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-004
<400> 51
10 <210> 52
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-008
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-010
<400> 53 <210> 54
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>Región variable de cadena ligera de SC04-018 <400>54
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-021
<400> 55 <210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-026
<400> 56
10 <210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-031
<400> 57
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-038
<400> 58 <210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-040
<400> 59
10 <210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-060
<400> 60
5 <210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-073
<400> 61
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-097
<400> 62
<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-098
<400> 63
<210> 64
<211> 107 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-103
<400> 64 <210> 65
<211> 109 ’
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-104
<400> 65
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-108
<400> 66
10 <210> 67
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-120
<400> 67
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-125
<400> 68 <210> 69
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-126
<400> 69
10 <210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-140
<400> 70
<210> 71 5 <211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-144 10 <400> 71
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-146
<400> 72
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-164
<400> 73
<210> 74
<211> 351
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-001
<400> 74
15 <210> 75
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-004
<400> 75
5 <210> 76
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-008
<400> 76
<210> 77 15 <211> 369
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-010 20 <400> 77
<210> 78
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-018
<400> 78
<210> 79
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-021
<400> 79
<210> 80
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-026
<400> 80
<210> 81
<211> 357 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-031
<400> 81
<210> 82
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-038
<400> 82
<210> 83
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-040
<400> 83
10 <210> 84
<211> 384
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-060
<400> 84
<210> 85
<211> 369
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-073
<400> 85
<210> 86
<211> 369
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-097
<400> 86
15 <210> 87
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-098
<400> 87
<210> 88
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-103
<400> 88
10 <210> 89
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-104
<400> 89
<210> 90
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-108
<400> 90
<210> 91
<211> 354 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-120
<400> 91
<210> 92
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-125
<400> 92
<210> 93
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-126
<400> 93
10 <210> 94
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-140
<400> 94
<210> 95
<211> 354 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-144
<400> 95
<210> 96
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-146
<400> 96
<210> 97 15 <211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-164 20 <400> 97
<210> 98
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-001
<400> 98
<210> 99
<211> 309
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-004
<400> 99
<210> 100 20 <211> 327
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-008
<400> 100
<210> 101
<211> 321
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-010
<400> 101
15 <210> 102
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-018
<400> 102
<210> 103
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-021
<400> 103
10 <210> 104
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-026
<400> 104
<210> 105
<211> 321 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-031
<400> 105
<210> 106
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-038
<400> 106
<210> 107 15 <211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-040 20 <400> 107
<210> 108
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-060
<400> 108
10 <210> 109
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-073
<400> 109
<210> 110
<211> 321 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-097
<400> 110
<210> 111 5 <211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-098 10 <400> 111
<210> 112
<211> 321
<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-103
<400> 112
20 <210> 113
<211> 327
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-104
<400> 113
<210> 114
<211> 321
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-108
<400> 114
15 <210> 115
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-120
<400> 115
<210> 116
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-125
<400> 116
<210> 117
<211> 327
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-126
<400> 117
<210> 118 20 <211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-140
<400> 118
<210> 119
<211> 321
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-144
<400> 119
15 <210> 120
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-146
<400> 120
<210> 121
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-164
<400> 121
10 <210> 122
<211> 2107
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Cadena pesada de CR57
<220>
<221> Intrón
<222> (382)..(508)
<223> 20 <220>
<221> Intrón
<222> (803)..(1193)
<223>
<220> 25 <221> Intrón
<222> (1239)..(1356)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1687)..(1783)
<223>
<400> 122
<210> 123
<211> 457
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR57
<400> 123
<210> 124
<211> 859
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR57
<220>
<221> Intrón 10 <222> (337)..(538)
<223>
<400> 124
<210> 125
<211> 218
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR57
<400> 125
<210> 126
<211> 2089
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CRJB
<400> 126
<210> 127
<211> 452
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CRJB
<400> 127
<210> 128
<211> 841
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CRJB
<400> 128
<210> 129
<211> 213
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CRJB
<400> 129
<210> 130
<211> 12
<212> ADN
5
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11, E57A2, E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3
<400> 130
10
atacaccatc tc 12
<210> 131
<211> 12
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3
<400> 131
atacaacatc tc
12
<210> 132
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 132
ctcaagttat gtggagtt
18
<210> 133
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57A2
<400> 133
ctcaagttat gtgaagtt
18
<210> 134
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3, E57B1 y E57B3
<400> 134
ctcgagttat gtggagtt
18
<210> 135
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57B2 y E57C3
<400> 135 ctcaatttat gtggagtt
<210> 136
<211> 16
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11, E57A2, E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3
<400> 136
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3
<400> 137
<210> 138
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 138 <210> 139
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57A2
<400> 139
<210> 140
<211> 23
<212> PRT
<213>
Virus de la rabia 15 <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3, E57B1 y E57B3
<400> 140
<210> 141
<211> 23
<212> PRT
<213>
Virus de la rabia 25 <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57B2 y E57C3
<400> 141
<210> 142
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 142
cccgagaatc cgaga
15
<210> 143
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C, EJB2D, EJB2E, EJB2F y EJB3F
<400> 143
cccgaggatc cgaga
15
<210> 144
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 144
tgtggagttc ttgga
15
<210> 145
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C y EJB2F
<400> 145
tgtgaagttc ctgga
15
<210> 146
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2D, EJB2E y EJB3F
<400> 146
tgtggagttc ctgga
15
<210> 147
<211> 13
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 147
<210> 148
<211> 13
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C, EJB2D, EJB2E, EJB2F y EJB3F
<400> 148
<210> 149
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 149
<210> 150
<211> 23
<212> PRT 10 <213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C y EJB2F
<400> 150
<210> 151
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia 20 <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2D, EJB2E y EJB3F
<400> 151
25 <210> 152
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuCkappa
<400> 152 acactctccc ctgttgaagc tctt
<210> 153
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuClambda2
<400> 153 tgaacattct gtaggggcca ctg
<210> 154
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuClambda7
<400> 154 agagcattct gcaggggcca ctg
<210> 155
<211> 4941
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector PDV-C06
<400> 155
<210> 156
<211> 24
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuCIgG
<400> 156
gtccaccttg gtgttgctgg gctt
24
10
<210> 157
<211> 741
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> SC04-001
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(741)
<223>
20
<400> 157
<210> 158
<211> 247
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-001
<400> 158
<210> 159
<211> 741
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-004
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(741)
<223>
<400> 159
<210> 160
<211> 247
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-004
<400> 160
<210> 161
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-008
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (756)
<223>
<400> 161
<210> 162
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-008
<400> 162
<210> 163
<211> 759
<212> ADN. 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-010
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (759)
<223>
<400> 163
<210> 164
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-010
<400> 164 <210> 165
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 5 <220>
<223> SC04-018
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(756) 10 <223>
<400> 165
<210> 166
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-018
<400> 166
<210> 167
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-021
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (747)
<223>
<400> 167
<210> 168
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-021
<400> 168
<210> 169
<211> 768
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-026
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (768)
<223>
<400> 169
<210> 170
<211> 256
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-026
<400> 170
<210> 171
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-031
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (747)
<223>
<400> 171
<210> 172
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-031
<400> 172
<210> 173
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-038
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (747)
<223>
<400> 173
<210> 174
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-038
<400> 174
<210> 175
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-040
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 175
<210> 176
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-040
<400> 176 <210> 177
<211> 774
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-060
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (774)
<223>
<400> 177
<210> 178
<211> 258
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-060
<400> 178
<210> 179
<211> 759
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-073
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(759)
<223>
<400> 179
<210> 180
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-073
<400> 180
<210> 181
<211> 753
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-097
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(753)
<223>
<400> 181
<210> 182
<211> 251
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-097
<400> 182
<210> 183
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-098
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (747)
<223>
<400> 183
<210> 184
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-098
<400> 184
<210> 185
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-103
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 185
<210> 186
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-103
<400> 186
<210> 187
<211> 759
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-104
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (759)
<223>
<400> 187
<210> 188
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-104
<400> 188
<210> 189
<211> 750
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-108
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(750)
<223>
<400> 189
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<211> 250
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-108
<400> 190
<210> 191
<211> 744
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-120
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (744)
<223>
<400> 191
<210> 192
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-120
<400> 192
<210> 193
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-125
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (747)
<223>
<400> 193
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<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-125
<400> 194
<210> 195
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-126
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (756)
<223>
<400> 195
<210> 196
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-126
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<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-140
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 197
<210> 198
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-140
<400> 198 <210> 199
<211> 744
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-144
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(744)
<223>
<400> 199
<210> 200
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-144
<400> 200
<210> 201
<211> 744
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-146
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(744)
<223>
<400> 201
<210> 202
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-146
<400> 202
<210> 203
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-164
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 203
<210> 204
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-164
<400> 204
<210> 205
<211> 786
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SO57
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(786)
<223>
<400> 205
<210> 206
<211> 262
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SO57
<400> 206
<210> 207
<211> 524
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Proteína G de la cepa ERA del virus de la rabia
<400> 207
<210> 208
<211> 23
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1A
<400> 208
cagtctgtgc tgactcagcc acc
23
10
<210> 209
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> Cebador HuVlambda1B
<400> 209
cagtctgtgy tgacgcagcc gcc
23
<210> 210
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1C
<400> 210 cagtctgtcg tgacgcagcc gcc
<210> 211
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda2
<400> 211 cartctgccc tgactcagcc t
<210> 212
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3A
<400> 212 tcctatgwgc tgactcagcc acc
<210> 213
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3B
<400> 213 tcttctgagc tgactcagga ccc
<210> 214
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda4
<400> 214
cacgttatac tgactcaacc gcc
23
<210> 215
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda5
<400> 215
caggctgtgc tgactcagcc gtc
23
<210> 216
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador RuVlambda6
<400> 216
aattttatgc tgactcagcc cca
23
<210> 217
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda7/8
<400> 217
cagrctgtgg tgacycagga gcc
23
<210> 218
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda9
<400> 218
cwgcctgtgc tgactcagcc mcc
23
<210> 219
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa1B
<400> 219 gacatccagw tgacccagtc tcc
<210> 220
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa2
<400> 220 gatgttgtga tgactcagtc tcc
<210> 221
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa3
<400> 221 gaaattgtgw tgacrcagtc tcc
<210> 222
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa4
<400> 222 gatattgtga tgacccacac tcc
<210> 223
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa5
<400> 223
gaaacgacac tcacgcagtc tcc
23
<210> 224
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa6
<400> 224
gaaattgtgc tgactcagtc tcc
23
<210> 225
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa1B-SalI
<400> 225
tgagcacaca ggtcgacgga catccagwtg acccagtctc c
41
<210> 226
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa2-SalI
<400> 226
tgagcacaca ggtcgacgga tgttgtgatg actcagtctc c
41
<210> 227
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa3B-SalI
<400> 227
tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgwtg acrcagtctc c
41
<210> 228
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa4B-SalI
<400> 228
tgagcacaca ggtcgacgga tattgtgatg acccacactc c
41
<210> 229
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa5-SalI
<400> 229
tgagcacaca ggtcgacgga aacgacactc acgcagtctc c
41
<210> 230
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa6-SalI
<400> 230
tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgctg actcagtctc c
41
<210> 231
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa1-NotI
<400> 231
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc
48
<210> 232
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa2-NotI
<400> 232
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc
48
<210> 233
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa3-NotI
<400> 233
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc
48
<210> 234
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa4-NotI
<400> 234
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc
48
<210> 235
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa5-NotI
<400> 235
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc
48
<210> 236
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1A-SalI
<400> 236
tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgctg actcagccac c
41
<210> 237
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador BuVlambda1B-SalI
<400> 237
tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgytg acgcagccgc c
41
<210> 238
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1C-SalI
<400> 238
tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtcgtg acgcagccgc c
41
<210> 239
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda2-SalI
<400> 239
tgagcacaca ggtcgacgca rtctgccctg actcagcct
39
<210> 240
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3A-SalI
<400> 240
tgagcacaca ggtcgacgtc ctatgwgctg actcagccac c
41
<210> 241
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3B-SalI
<400> 241
tgagcacaca ggtcgacgtc ttctgagctg actcaggacc c
41
<210> 242
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda4B-SalI
<400> 242
tgagcacaca ggtcgacgca cgttatactg actcaaccgc c
41
<210> 243
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda5B-SalI
<400> 243
tgagcacaca ggtcgacgca ggctgtgctg actcagccgt c
41
<210> 244
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda6-SalI
<400> 244
tgagcacaca ggtcgacgaa ttttatgctg actcagcccc a
41
<210> 245
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda7/8-SalI
<400> 245
tgagcacaca ggtcgacgca grctgtggtg acycaggagc c
41
<210> 246
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda9-SalI
<400> 246
tgagcacaca ggtcgacgcw gcctgtgctg actcagccmc c
41
<210> 247
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJlambda1-NotI
<400> 247 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtgacc ttggtccc 48
<210> 248
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador RuJlambda2/3-NotI
<400> 248 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc 48
<210> 249
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJlambda4/5-NotI
<400> 249 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacytaa aacggtgagc tgggtccc 48
<210> 250
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1B/7A
<400> 250 cagrtgcagc tggtgcartc tgg 23
<210> 251
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1C
<400> 251
saggtccagc tggtrcagtc tgg
23
<210> 252
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH2B
<400> 252
saggtgcagc tggtggagtc tgg
23
<210> 253
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3B
<400> 253
saggtgcagc tggtggagtc tgg
23
<210> 254
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3C
<400> 254
gaggtgcagc tggtggagwc ygg
23
<210> 255
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4B
<400> 255
caggtgcagc tacagcagtg ggg
23
<210> 256
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4C
<400> 256 cagstgcagc tgcaggagtc sgg 23
<210> 257
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH5B
<400> 257 gargtgcagc tggtgcagtc tgg 23
<210> 258
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH6A
<400> 258 caggtacagc tgcagcagtc agg 23
<210> 259
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1B/7A-SfiI
<400> 259 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtgc agctggtgca rtctgg 56
<210> 260
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1C-SfiI
<400> 260
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtcc agctggtrca gtctgg
56
<210> 261
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH2B-SfiI
<400> 261
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtctgg
56
<210> 262
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3B-SfiI
<400> 262
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtgc agctggtgga gtctgg
56
<210> 263
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3C-SfiI
<400> 263
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga gwcygg
56
<210> 264
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4B-SfiI
<400> 264
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctacagca gtgggg
56
<210> 265
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4C-SfiI
<400> 265
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagstgc agctgcagga gtcsgg
56
<210> 266
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH5B-SfiI
<400> 266
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgargtgc agctggtgca gtctgg
56
<210> 267
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH6A-SfiI
<400> 267
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcagca gtcagg
56
<210> 268
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJH1/2-XhoI
<400> 268
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggtgcc
36
<210> 269
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJH3-XhoI
<400> 269
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccat tgtccc
36
<210> 270
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
5
<223> Cebador HuJH4/5-XhoI
<400> 270
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggttcc
36
<210> 271
<211> 36
10
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJH6-XhoI
<400> 271
15
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccgt ggtccc 36
<210> 272
<211> 381
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de CR57
<400> 272
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de CR57 30 <400> 273
<210> 274
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de CR57
<400> 274
<210> 275
<211> 112
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de CR57
<400> 275
<210> 276
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> CDR3 de CRJB
<400> 276
<210> 277 15 <211> 6778
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> vector pSyn-C03-HCgamma1 20 <400> 277
<210> 278
<211> 6283
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector pSyn-C04-Clambda
<400> 278
<210> 279
<211> 6267
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector pSyn-C05-Ckappa
<400> 279
<210> 280
<211> 46
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-B
<400> 280
acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgg agtctg
46
10
<210> 281
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> Oligonucleótido 5H-C
<400> 281
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgg
47
<210> 282
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-C-long
<400> 282
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgggg
49
<210> 283
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-F
<400> 283
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctgcagg agtccggccc
50
<210> 284
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-H
<400> 284
acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgc agtctgg
47
<210> 285
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-I
<400> 285
acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctgctgg agtctgg
47
<210> 286
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-M
<400> 286
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg accttgaagg agtctgg
47
<210> 287
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-A
<400> 287
gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac cagggtgccc tggcccc
47
<210> 288
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-C
<400> 288
gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc tggcccc
47
<210> 289
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-C-long
<400> 289
gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc ttgccccaga cgtc
54
<210> 290
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-D
<400> 290
gcccttggtg ctagcgctgg acacggtcac catggtgccc tggcccc
47
<210> 291
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sy3H-E
<400> 291
gcccttggtg ctagcgctgg acacggtcac cagggtgccc cggcccc
47
<210> 292
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 3L-B
<400> 292
ttttccttag cggccgcgac tcacctagga cggtcagctt ggtc
44
<210> 293
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-B
<400> 293
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtc
44
<210> 294
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-C
<400> 294
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtctccatc ctccc
55
<210> 295
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-G
<400> 295
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc gtgatgaccc agtctcc
47
<210> 296
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-K
<400> 296
acctgtctcg agttttccat ggctgccatc cagatgaccc agtctcc
47
<210> 297
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-M
<400> 297
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagctgaccc agtc
44
<210> 298
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-N
<400> 298
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgactc agtc
44
<210> 299
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-O
<400> 299
acctgtctcg agttttccat ggctgccatc cagctgaccc agtc
44
<210> 300
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-Q
<400> 300
acctgtctcg agttttccat ggctgagatc gtgatgactc agtc
44
<210> 301
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5L-E
<400> 301
acctgtctcg agttttccat ggcttcctac gtgctgactc agccg
45
<210> 302
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5L-F
<400> 302
acctgtctcg agttttccat ggctcagtcc gtgctgactc agcc
44
<210> 303
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5L-G
<400> 303
acctgtctcg agttttccat ggcttcctac gtgctgactc agcc
44
<210> 304
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-F
<400> 304
gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc caccttggtc cc
42
<210> 305
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-I
<400> 305 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc cagccgtgtc cc 42
<210> 306
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-J
<400> 306 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc cagcttggtc cc 42
<210> 307
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-K
<400> 307 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatgtc caccttggtc cc 42
<210> 308
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3L-A
<400> 308 ccagcacggt aagcttcagc acggtcacct tggtgccagt tcc 43
<210> 309
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3L-C
<400> 309
ccagcacggt aagcttcagc acggtcagct tggtgcctcc gcc
43
<210> 310
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3L-D
<400> 310
ccagcacggt aagcttcaac acggtcagct gggtccc
37
<210> 311
<211> 52
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy5L-A
<400> 311
acctgtctcg agttttccat ggcttcctcc gagctgaccc aggaccctgc tg
52
<210> 312
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> scFv SOJB
<400> 312
<210> 313
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> scFv SOJB
<400> 313
<210> 314
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 314
10 <210> 315
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 315
<210> 316
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 316
<210> 317
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 317
<210> 318
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 318
<210> 319
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 319
<210> 320
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 320
<210> 321
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 321
<210> 322
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 322
<210> 323
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 323
<210> 324
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 324
<210> 325
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 325
<210> 326
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 326
<210> 327
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 327
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 328
<210> 329
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 329
<210> 330
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 330
<210> 331
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 331
<210> 332
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Péptido
<400> 332
<210> 333 15 <211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido 20 <400> 333
<210> 334
<211> 2083
<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR04-098
<220>
<221> Intrón
<222> (358)..(484)
<223>
<220>
<221> Intrón 5 <222> (779)..(1169)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1215)..(1332) 10 <223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1663)..(1759)
<223> 15 <400> 334
<210> 335
<211> 449
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR04-098
<400> 335
<210> 336
<211> 847
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR04-098
<220>
<221> Intrón 10 <222> (322)..(526)
<223>
<400> 336
<210> 337
<211> 213
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-001
<400> 1
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-004
<400> 2
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-008
<400> 3 <210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-010
<400> 4
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-018
<400> 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-021
<400> 6
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-026
<400> 7
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-031
<400> 8
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-038
<400> 9
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-040
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<210> 13
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<212> PRT
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<220>
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<210> 14
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> CDR3 de SC04-104
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<400> 19
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<212> PRT
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<223> CDR3 de SC04-126
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<210> 21 15 <211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-140 20 <400> 21
<210> 22
<211> 9
<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-144
<400> 22
30 <210> 23
<211> 9
<212> PRT
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<220>
<223> CDR3 de SC04-146
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<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SC04-164
<400> 24
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR3 de SO57
<400> 25
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-001
<400> 26 <210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-004
<400> 27 <210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-008
<400> 28
10 <210> 29
<211> 123
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-010
<400> 29
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-018
<400> 30 <210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-021
<400> 31 <210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-026
<400> 32
10 <210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-031
<400> 33
5 <210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-038
<400> 34
<210> 35
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-040
<400> 35 <210> 36
<211> 128
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
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<210> 37
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-073
<400> 37
<210> 38
<211>
121 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-097
<400> 38
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-098
<400> 39
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-103
<400> 40
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-104
<400> 41
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<211>
120 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-108
<400> 42
<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-120
<400> 43
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-125
<400> 44
<210> 45 10 <211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-126 15 <400> 45
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-140
<400> 46 <210> 47
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-144
<400> 47 <210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-146
<400> 48
10 <210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-164
<400> 49
<210> 50
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-001
<400> 50 <210> 51
<211> 103
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-004
<400> 51
10 <210> 52
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-008
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-010
<400> 53 <210> 54
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>Región variable de cadena ligera de SC04-018 <400>54
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-021
<400> 55 <210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-026
<400> 56
10 <210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-031
<400> 57
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-038
<400> 58 <210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-040
<400> 59
10 <210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-060
<400> 60
5 <210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-073
<400> 61
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-097
<400> 62
<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-098
<400> 63
<210> 64
<211> 107 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-103
<400> 64 <210> 65
<211> 109 ’
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-104
<400> 65
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-108
<400> 66
10 <210> 67
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-120
<400> 67
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-125
<400> 68 <210> 69
<211> 109
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-126
<400> 69
10 <210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-140
<400> 70
<210> 71 5 <211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-144 10 <400> 71
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-146
<400> 72
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-164
<400> 73
<210> 74
<211> 351
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-001
<400> 74
15 <210> 75
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-004
<400> 75
5 <210> 76
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-008
<400> 76
<210> 77 15 <211> 369
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-010 20 <400> 77
<210> 78
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-018
<400> 78
<210> 79
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-021
<400> 79
<210> 80
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-026
<400> 80
<210> 81
<211> 357 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-031
<400> 81
<210> 82
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-038
<400> 82
<210> 83
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-040
<400> 83
10 <210> 84
<211> 384
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-060
<400> 84
<210> 85
<211> 369
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-073
<400> 85
<210> 86
<211> 369
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-097
<400> 86
15 <210> 87
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-098
<400> 87
<210> 88
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-103
<400> 88
10 <210> 89
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-104
<400> 89
<210> 90
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-108
<400> 90
<210> 91
<211> 354 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-120
<400> 91
<210> 92
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-125
<400> 92
<210> 93
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-126
<400> 93
10 <210> 94
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena pesada de SC04-140
<400> 94
<210> 95
<211> 354 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-144
<400> 95
<210> 96
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-146
<400> 96
<210> 97 15 <211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de SC04-164 20 <400> 97
<210> 98
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-001
<400> 98
<210> 99
<211> 309
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-004
<400> 99
<210> 100 20 <211> 327
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-008
<400> 100
<210> 101
<211> 321
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-010
<400> 101
15 <210> 102
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-018
<400> 102
<210> 103
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-021
<400> 103
10 <210> 104
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-026
<400> 104
<210> 105
<211> 321 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-031
<400> 105
<210> 106
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-038
<400> 106
<210> 107 15 <211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-040 20 <400> 107
<210> 108
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-060
<400> 108
10 <210> 109
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-073
<400> 109
<210> 110
<211> 321 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-097
<400> 110
<210> 111 5 <211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-098 10 <400> 111
<210> 112
<211> 321
<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-103
<400> 112
20 <210> 113
<211> 327
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-104
<400> 113
<210> 114
<211> 321
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-108
<400> 114
15 <210> 115
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-120
<400> 115
<210> 116
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-125
<400> 116
<210> 117
<211> 327
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-126
<400> 117
<210> 118 20 <211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-140
<400> 118
<210> 119
<211> 321
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-144
<400> 119
15 <210> 120
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Región variable de cadena ligera de SC04-146
<400> 120
<210> 121
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de SC04-164
<400> 121
10 <210> 122
<211> 2107
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Cadena pesada de CR57
<220>
<221> Intrón
<222> (382)..(508)
<223> 20 <220>
<221> Intrón
<222> (803)..(1193)
<223>
<220> 25 <221> Intrón
<222> (1239)..(1356)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1687)..(1783)
<223>
<400> 122
<210> 123
<211> 457
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR57
<400> 123
<210> 124
<211> 859
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR57
<220>
<221> Intrón 10 <222> (337)..(538)
<223>
<400> 124
<210> 125
<211> 218
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR57
<400> 125
<210> 126
<211> 2089
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CRJB
<400> 126
<210> 127
<211> 452
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CRJB
<400> 127
<210> 128
<211> 841
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CRJB
<400> 128
<210> 129
<211> 213
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CRJB
<400> 129
<210> 130
<211> 12
<212> ADN
5
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11, E57A2, E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3
<400> 130
10
atacaccatc tc 12
<210> 131
<211> 12
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3
<400> 131
atacaacatc tc
12
<210> 132
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 132
ctcaagttat gtggagtt
18
<210> 133
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57A2
<400> 133
ctcaagttat gtgaagtt
18
<210> 134
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3, E57B1 y E57B3
<400> 134
ctcgagttat gtggagtt
18
<210> 135
<211> 18
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de E57B2 y E57C3
<400> 135 ctcaatttat gtggagtt
<210> 136
<211> 16
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11, E57A2, E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3
<400> 136
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3
<400> 137
<210> 138
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 138 <210> 139
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57A2
<400> 139
<210> 140
<211> 23
<212> PRT
<213>
Virus de la rabia 15 <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57A3, E57B1 y E57B3
<400> 140
<210> 141
<211> 23
<212> PRT
<213>
Virus de la rabia 25 <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de E57B2 y E57C3
<400> 141
<210> 142
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 142
cccgagaatc cgaga
15
<210> 143
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C, EJB2D, EJB2E, EJB2F y EJB3F
<400> 143
cccgaggatc cgaga
15
<210> 144
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 144
tgtggagttc ttgga
15
<210> 145
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C y EJB2F
<400> 145
tgtgaagttc ctgga
15
<210> 146
<211> 15
<212> ADN
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> misc_feature
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2D, EJB2E y EJB3F
<400> 146
tgtggagttc ctgga
15
<210> 147
<211> 13
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 147
<210> 148
<211> 13
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C, EJB2D, EJB2E, EJB2F y EJB3F
<400> 148
<210> 149
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de CVS-11
<400> 149
<210> 150
<211> 23
<212> PRT 10 <213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2B, EJB2C y EJB2F
<400> 150
<210> 151
<211> 23
<212> PRT
<213> Virus de la rabia 20 <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Parte de la glicoproteína de EJB2D, EJB2E y EJB3F
<400> 151
25 <210> 152
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuCkappa
<400> 152 acactctccc ctgttgaagc tctt
<210> 153
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuClambda2
<400> 153 tgaacattct gtaggggcca ctg
<210> 154
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuClambda7
<400> 154 agagcattct gcaggggcca ctg
<210> 155
<211> 4941
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector PDV-C06
<400> 155
<210> 156
<211> 24
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido HuCIgG
<400> 156
gtccaccttg gtgttgctgg gctt
24
10
<210> 157
<211> 741
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> SC04-001
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(741)
<223>
20
<400> 157
<210> 158
<211> 247
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 158
<210> 159
<211> 741
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-004
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(741)
<223>
<400> 159
<210> 160
<211> 247
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 160
<210> 161
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-008
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (756)
<223>
<400> 161
<210> 162
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 162
<210> 163
<211> 759
<212> ADN. 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-010
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (759)
<223>
<400> 163
<210> 164
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 164 <210> 165
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 5 <220>
<223> SC04-018
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(756) 10 <223>
<400> 165
<210> 166
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 166
<210> 167
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-021
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (747)
<223>
<400> 167
<210> 168
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 168
<210> 169
<211> 768
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-026
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (768)
<223>
<400> 169
<210> 170
<211> 256
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 170
<210> 171
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-031
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (747)
<223>
<400> 171
<210> 172
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 172
<210> 173
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-038
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (747)
<223>
<400> 173
<210> 174
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 174
<210> 175
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-040
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 175
<210> 176
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 176 <210> 177
<211> 774
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-060
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (774)
<223>
<400> 177
<210> 178
<211> 258
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 178
<210> 179
<211> 759
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-073
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(759)
<223>
<400> 179
<210> 180
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 180
<210> 181
<211> 753
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-097
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(753)
<223>
<400> 181
<210> 182
<211> 251
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 182
<210> 183
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-098
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (747)
<223>
<400> 183
<210> 184
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 184
<210> 185
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-103
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 185
<210> 186
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 186
<210> 187
<211> 759
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-104
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (759)
<223>
<400> 187
<210> 188
<211> 253
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 188
<210> 189
<211> 750
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-108
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(750)
<223>
<400> 189
<210> 190
<211> 250
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 190
<210> 191
<211> 744
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-120
<220>
<221> CDS 10 <222> (1) .. (744)
<223>
<400> 191
<210> 192
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 192
<210> 193
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-125
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (747)
<223>
<400> 193
<210> 194
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 194
<210> 195
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-126
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (756)
<223>
<400> 195
<210> 196
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 196
<210> 197
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-140
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 197
<210> 198
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 198 <210> 199
<211> 744
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-144
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(744)
<223>
<400> 199
<210> 200
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 200
<210> 201
<211> 744
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-146
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(744)
<223>
<400> 201
<210> 202
<211> 248
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 202
<210> 203
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SC04-164
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(747)
<223>
<400> 203
<210> 204
<211> 249
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 204
<210> 205
<211> 786
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> SO57
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(786)
<223>
<400> 205
<210> 206
<211> 262
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 206
<210> 207
<211> 524
<212> PRT
<213> Virus de la rabia
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Proteína G de la cepa ERA del virus de la rabia
<400> 207
<210> 208
<211> 23
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1A
<400> 208
cagtctgtgc tgactcagcc acc
23
10
<210> 209
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> Cebador HuVlambda1B
<400> 209
cagtctgtgy tgacgcagcc gcc
23
<210> 210
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1C
<400> 210 cagtctgtcg tgacgcagcc gcc
<210> 211
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda2
<400> 211 cartctgccc tgactcagcc t
<210> 212
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3A
<400> 212 tcctatgwgc tgactcagcc acc
<210> 213
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3B
<400> 213 tcttctgagc tgactcagga ccc
<210> 214
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda4
<400> 214
cacgttatac tgactcaacc gcc
23
<210> 215
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda5
<400> 215
caggctgtgc tgactcagcc gtc
23
<210> 216
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador RuVlambda6
<400> 216
aattttatgc tgactcagcc cca
23
<210> 217
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda7/8
<400> 217
cagrctgtgg tgacycagga gcc
23
<210> 218
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda9
<400> 218
cwgcctgtgc tgactcagcc mcc
23
<210> 219
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa1B
<400> 219 gacatccagw tgacccagtc tcc
<210> 220
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa2
<400> 220 gatgttgtga tgactcagtc tcc
<210> 221
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa3
<400> 221 gaaattgtgw tgacrcagtc tcc
<210> 222
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa4
<400> 222 gatattgtga tgacccacac tcc
<210> 223
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa5
<400> 223
gaaacgacac tcacgcagtc tcc
23
<210> 224
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa6
<400> 224
gaaattgtgc tgactcagtc tcc
23
<210> 225
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa1B-SalI
<400> 225
tgagcacaca ggtcgacgga catccagwtg acccagtctc c
41
<210> 226
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa2-SalI
<400> 226
tgagcacaca ggtcgacgga tgttgtgatg actcagtctc c
41
<210> 227
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa3B-SalI
<400> 227
tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgwtg acrcagtctc c
41
<210> 228
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa4B-SalI
<400> 228
tgagcacaca ggtcgacgga tattgtgatg acccacactc c
41
<210> 229
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa5-SalI
<400> 229
tgagcacaca ggtcgacgga aacgacactc acgcagtctc c
41
<210> 230
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVkappa6-SalI
<400> 230
tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgctg actcagtctc c
41
<210> 231
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa1-NotI
<400> 231
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc
48
<210> 232
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa2-NotI
<400> 232
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc
48
<210> 233
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa3-NotI
<400> 233
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc
48
<210> 234
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa4-NotI
<400> 234
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc
48
<210> 235
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJkappa5-NotI
<400> 235
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc
48
<210> 236
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1A-SalI
<400> 236
tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgctg actcagccac c
41
<210> 237
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador BuVlambda1B-SalI
<400> 237
tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgytg acgcagccgc c
41
<210> 238
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda1C-SalI
<400> 238
tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtcgtg acgcagccgc c
41
<210> 239
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda2-SalI
<400> 239
tgagcacaca ggtcgacgca rtctgccctg actcagcct
39
<210> 240
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3A-SalI
<400> 240
tgagcacaca ggtcgacgtc ctatgwgctg actcagccac c
41
<210> 241
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda3B-SalI
<400> 241
tgagcacaca ggtcgacgtc ttctgagctg actcaggacc c
41
<210> 242
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda4B-SalI
<400> 242
tgagcacaca ggtcgacgca cgttatactg actcaaccgc c
41
<210> 243
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda5B-SalI
<400> 243
tgagcacaca ggtcgacgca ggctgtgctg actcagccgt c
41
<210> 244
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda6-SalI
<400> 244
tgagcacaca ggtcgacgaa ttttatgctg actcagcccc a
41
<210> 245
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda7/8-SalI
<400> 245
tgagcacaca ggtcgacgca grctgtggtg acycaggagc c
41
<210> 246
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVlambda9-SalI
<400> 246
tgagcacaca ggtcgacgcw gcctgtgctg actcagccmc c
41
<210> 247
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJlambda1-NotI
<400> 247 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtgacc ttggtccc 48
<210> 248
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador RuJlambda2/3-NotI
<400> 248 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc 48
<210> 249
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJlambda4/5-NotI
<400> 249 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacytaa aacggtgagc tgggtccc 48
<210> 250
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1B/7A
<400> 250 cagrtgcagc tggtgcartc tgg 23
<210> 251
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1C
<400> 251
saggtccagc tggtrcagtc tgg
23
<210> 252
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH2B
<400> 252
saggtgcagc tggtggagtc tgg
23
<210> 253
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3B
<400> 253
saggtgcagc tggtggagtc tgg
23
<210> 254
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3C
<400> 254
gaggtgcagc tggtggagwc ygg
23
<210> 255
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4B
<400> 255
caggtgcagc tacagcagtg ggg
23
<210> 256
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4C
<400> 256 cagstgcagc tgcaggagtc sgg 23
<210> 257
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH5B
<400> 257 gargtgcagc tggtgcagtc tgg 23
<210> 258
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH6A
<400> 258 caggtacagc tgcagcagtc agg 23
<210> 259
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1B/7A-SfiI
<400> 259 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtgc agctggtgca rtctgg 56
<210> 260
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH1C-SfiI
<400> 260
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtcc agctggtrca gtctgg
56
<210> 261
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH2B-SfiI
<400> 261
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtctgg
56
<210> 262
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3B-SfiI
<400> 262
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtgc agctggtgga gtctgg
56
<210> 263
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH3C-SfiI
<400> 263
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga gwcygg
56
<210> 264
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4B-SfiI
<400> 264
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctacagca gtgggg
56
<210> 265
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH4C-SfiI
<400> 265
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagstgc agctgcagga gtcsgg
56
<210> 266
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH5B-SfiI
<400> 266
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgargtgc agctggtgca gtctgg 56
<210> 267
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuVH6A-SfiI
<400> 267
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcagca gtcagg
56
<210> 268
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJH1/2-XhoI
<400> 268
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggtgcc
36
<210> 269
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJH3-XhoI
<400> 269
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccat tgtccc
36
<210> 270
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
5
<223> Cebador HuJH4/5-XhoI
<400> 270
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggttcc
36
<210> 271
<211> 36
10
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador HuJH6-XhoI
<400> 271
15
gagtcattct cgactcgaga cggtgaccgt ggtccc 36
<210> 272
<211> 381
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de CR57
<400> 272
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de CR57 30 <400> 273
<210> 274
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de CR57
<400> 274
<210> 275
<211> 112
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera de CR57
<400> 275
<210> 276
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> CDR3 de CRJB
<400> 276
<210> 277 15 <211> 6778
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> vector pSyn-C03-HCgamma1 20 <400> 277
<210> 278
<211> 6283
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector pSyn-C04-Clambda
<400> 278
<210> 279
<211> 6267
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector pSyn-C05-Ckappa
<400> 279
<210> 280
<211> 46
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-B
<400> 280
acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgg agtctg
46
10
<210> 281
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> Oligonucleótido 5H-C
<400> 281
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgg
47
<210> 282
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-C-long
<400> 282
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctggtgg agtctgggg
49
<210> 283
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-F
<400> 283
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg cagctgcagg agtccggccc
50
<210> 284
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-H
<400> 284
acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgc agtctgg
47
<210> 285
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-I
<400> 285
acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctgctgg agtctgg
47
<210> 286
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5H-M
<400> 286
acctgtcttg aattctccat ggcccaggtg accttgaagg agtctgg
47
<210> 287
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-A
<400> 287
gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac cagggtgccc tggcccc
47
<210> 288
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-C
<400> 288
gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc tggcccc
47
<210> 289
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-C-long
<400> 289
gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc ttgccccaga cgtc
54
<210> 290
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3H-D
<400> 290
gcccttggtg ctagcgctgg acacggtcac catggtgccc tggcccc
47
<210> 291
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido sy3H-E
<400> 291
gcccttggtg ctagcgctgg acacggtcac cagggtgccc cggcccc
47
<210> 292
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 3L-B
<400> 292
ttttccttag cggccgcgac tcacctagga cggtcagctt ggtc
44
<210> 293
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-B
<400> 293
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtc
44
<210> 294
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-C
<400> 294
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtctccatc ctccc
55
<210> 295
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-G
<400> 295
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc gtgatgaccc agtctcc
47
<210> 296
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-K
<400> 296
acctgtctcg agttttccat ggctgccatc cagatgaccc agtctcc
47
<210> 297
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-M
<400> 297
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagctgaccc agtc
44
<210> 298
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-N
<400> 298
acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgactc agtc
44
<210> 299
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-O
<400> 299
acctgtctcg agttttccat ggctgccatc cagctgaccc agtc
44
<210> 300
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5K-Q
<400> 300
acctgtctcg agttttccat ggctgagatc gtgatgactc agtc
44
<210> 301
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5L-E
<400> 301
acctgtctcg agttttccat ggcttcctac gtgctgactc agccg
45
<210> 302
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5L-F
<400> 302
acctgtctcg agttttccat ggctcagtcc gtgctgactc agcc
44
<210> 303
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido 5L-G
<400> 303
acctgtctcg agttttccat ggcttcctac gtgctgactc agcc
44
<210> 304
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-F
<400> 304
gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc caccttggtc cc
42
<210> 305
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-I
<400> 305 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc cagccgtgtc cc 42
<210> 306
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-J
<400> 306 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc cagcttggtc cc 42
<210> 307
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3K-K
<400> 307 gctgggggcg gccacggtcc gcttgatgtc caccttggtc cc 42
<210> 308
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3L-A
<400> 308 ccagcacggt aagcttcagc acggtcacct tggtgccagt tcc 43
<210> 309
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3L-C
<400> 309
ccagcacggt aagcttcagc acggtcagct tggtgcctcc gcc
43
<210> 310
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy3L-D
<400> 310
ccagcacggt aagcttcaac acggtcagct gggtccc
37
<210> 311
<211> 52
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sy5L-A
<400> 311
acctgtctcg agttttccat ggcttcctcc gagctgaccc aggaccctgc tg
52
<210> 312
<211> 756
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> scFv SOJB
<400> 312
<210> 313
<211> 252
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> scFv SOJB
<400> 313
<210> 314
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 314
10 <210> 315
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 315
<210> 316
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 316
<210> 317
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 317
<210> 318
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 318
<210> 319
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 319
<210> 320
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 320
<210> 321
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 321
<210> 322
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 322
<210> 323
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 323
<210> 324
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 324
<210> 325
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 325
<210> 326
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 326
<210> 327
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 327
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 328
<210> 329
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 329
<210> 330
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 330
<210> 331
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido
<400> 331
<210> 332
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Péptido
<400> 332
<210> 333 15 <211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido 20 <400> 333
<210> 334
<211> 2083
<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR04-098
<220>
<221> Intrón
<222> (358)..(484)
<223>
<220>
<221> Intrón 5 <222> (779)..(1169)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1215)..(1332) 10 <223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1663)..(1759)
<223> 15 <400> 334
<210> 335
<211> 449
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena pesada de CR04-098
<400> 335
<210> 336
<211> 847
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR04-098
<220>
<221> Intrón 10 <222> (322)..(526)
<223>
<400> 336
<210> 337
<211> 213
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena ligera de CR04-098
<400> 337

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia que pueden reaccionar con epítopos diferentes, no competitivos del virus de la rabia, en la que una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo que comprende los aminoácidos 226-231 de la proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo ubicado en el sitio antigénico III que comprende los aminoácidos 330-338 de la proteína G del virus de la rabia.
  2. 2.
    Composición farmacéutica que comprende dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia que pueden unirse a epítopos diferentes, no competitivos del virus de la rabia, comprendiendo la composición:
    una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos 226-231 de la proteína G del virus de la rabia, comprendiendo dicho primer anticuerpo que neutraliza el virus de la rabia:
    una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 273, y
    una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 275, y
    una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede unirse a un epítopo ubicado en el sitio antigénico III que comprende los aminoácidos 330-338 de la proteína G del virus de la rabia.
  3. 3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende:
    una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 29 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 53, o
    una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 59, o
    una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 63, o
    una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 64, o
    una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 65, o
    una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 47 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 71.
  4. 4. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la primera molécula de unión al virus de la rabia es una IgG y la segunda molécula de unión al virus de la rabia es una IgG.
    SeñaldeELISA
    FIGURA 7
ES10180398.9T 2004-05-27 2005-05-26 Moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas Expired - Lifetime ES2468021T3 (es)

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