ES2362681T3

ES2362681T3 - Determinantes moleculares de la osteopatía por mieloma y uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2362681T3
Application number: ES07118621T
Authority: ES
Inventors: John D Shaughnessy
Original assignee: University of Arkansas at Fayetteville; University of Arkansas at Little Rock
Current assignee: University of Arkansas at Fayetteville; University of Arkansas at Little Rock
Priority date: 2002-12-05
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2011-07-11
Anticipated expiration: 2023-12-04
Also published as: EP1567663A2; JP2012046535A; CA2507496C; EP1913952A1; EP1913952B1; WO2004053063A3; AU2003302926A1; US7459437B2; PT1913952E; AU2003302926A8; MXPA05006033A; JP4874549B2; WO2004053063A2; US20040137489A1; CA2507496A1; DE60336356D1; JP2006512911A; JP5432966B2; EP1567663A4; ATE500837T1

Abstract

Método ex vivo para determinar el potencial de desarrollar una osteopatía lítica en un paciente con mieloma múltiple, comprendiendo el método la etapa de: examinar el nivel de expresión del homólogo humano de Dickkopf-1 (DKK1) en una muestra corporal ex vivo, caracterizada por que el aumento de la expresión de DKK1 en comparación con la del individuo normal indica que el paciente tiene el potencial de desarrollar una osteopatía lítica.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general al estudio del mieloma múltiple. Más específicamente, la presente invención se refiere a la identificación de determinantes moleculares de la osteopatía por mieloma a través del perfil comparativo de la expresión génica global.

Descripción de la técnica relacionada

El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia maligna rara, todavía incurable, de células plasmáticas (CP) diferenciadas a término que afecta aproximadamente a 15 000 personas al año en los Estados Unidos y representa la segunda neoplasia maligna hematopoyética más frecuente. El mieloma múltiple representa el 13% de las neoplasias malignas linfocíticas de la población blanca y el 31% de las neoplasias malignas linfocíticas de la población negra. Las células plasmáticas malignas se alojan en la médula ósea y se expanden en ella, ocasionando anemia e inmunodepresión debido a la pérdida de la hematopoyesis normal.

El mieloma múltiple también está asociado a la osteoporosis sistémica y a la destrucción local del hueso, lo que conduce a dolor óseo debilitante y a la propensión a fracturas, compresión de la médula espinal e hipercalciemia. El mieloma es la única neoplasia maligna hemática asociada coherentemente con la osteopatía lítica y la destrucción local del hueso se limita a las zonas adyacentes a las células plasmáticas, lo que sugiere que las células plasmáticas malignas secretan factores que potencian la función de los osteoclastos y/o la anergia de los osteoblastos. La prevalencia de la osteopatía varía con la presentación del mieloma, desde el mieloma latente, a menudo sin afectación ósea, al plasmacitoma solitario, hasta el mieloma múltiple difundido o focal, en el que se observa osteopenia sistémica o lesiones óseas líticas focales en aproximadamente el 80% de los pacientes.

En los últimos años se ha puesto de manifiesto que la osteopatía lítica no sólo es una consecuencia del mieloma, sino que está estrechamente implicada en favorecer la progresión de la enfermedad. El cambio en la velocidad del recambio óseo predice la progresión clínica desde la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) al mieloma manifiesto en unos 3 años. Mientras que la actividad de los osteoclastos y los osteoblastos está acoplada en el inicio, se pierde el acoplamiento cuando progresa la enfermedad. La actividad de los osteoclastos permanece elevada y la actividad de los osteoblastos disminuye, y como consecuencia se produce la osteopatía lítica. Los estudios en el mieloma murino 5T2 y el modelo ICDG-hu para el mieloma humano primario demostraron que la inhibición de la actividad de los osteoclastos está asociada a la inhibición del crecimiento del mieloma y la reducción de la carga tumoral del mieloma. Estos estudios apoyan los informes de que la inhibición de la resorción ósea con los bisfosfonatos tenía un efecto contra el mieloma.

Aunque la biología de los osteoclastos en la osteopatía lítica asociada al mieloma se ha investigado con intensidad, poco se sabe de los cambios asociados a la enfermedad que se producen en la actividad de los osteoblastos y los mecanismos que subyacen a los mismos. Se ha sugerido que en el mieloma está afectada la capacidad de las células troncales mesenquimatosas para diferenciarse en la estirpe osteogénica. Sin embargo, no se han descubierto los mecanismos responsables de tal deterioro.

Se ha demostrado que el perfil de la expresión génica (PEG) global comparativa de las células plasmáticas de la médula ósea de donantes sanos normales y de las células plasmáticas malignas de la médula ósea de mielomas múltiples recién diagnosticados constituye una técnica poderosa para identificar genes candidatos de la enfermedad y las vías alteradas implicadas en la transformación maligna del mieloma múltiple (Zhan et al., 2002).

La técnica anterior es deficiente en un análisis comparativo para la identificación de los genes que se expresan en las células plasmáticas malignas que pueden contribuir a la osteopatía por mieloma múltiple, así como los métodos para diagnosticar y tratar las osteopatías por mieloma múltiple.

Zhan et al (Blood, 2002, 100 11 Abstract 782) sugieren que los patrones de expresión génica pueden estar relacionados con la osteopatía.

La presente invención cubre esta antigua necesidad y deseo en la técnica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Para identificar los determinantes moleculares de la osteopatía lítica, los perfiles de expresión de unos 12 000 genes de células plasmáticas enriquecidas en CD138 de mieloma múltiple recién diagnosticado que no muestra ningún indicio radiológico de lesiones líticas (n = 28) se compararon con los de ≥ 3 lesiones líticas (n = 47). De modo coherente con una función decisiva de la señalización por WNT en la diferenciación de los osteoblastos, dos antagonistas secretados de la señalización de WNT, la proteína 3 soluble relacionada con Fizzled (SFRP-3/FRZB) y el homólogo humano de Dickkopf 1 (DKK-1), se expresaron en 40 de las 47 lesiones óseas líticas, pero sólo 16 de 28 carecían de lesiones óseas (p < 0,05). La inmunohistoquímica mostró una gran cantidad de DKK-1 y de FRZB en las células plasmáticas de casos con expresión génica elevada. Resulta importante señalar que DKK-1 y FRZB no se expresaron en las células plasmáticas de 45 donantes de médula ósea normales ni en 10 con macroglobulinemia de Waldenstrom, una neoplasia maligna de las células plasmáticas relacionada que carece de osteopatía.

El suero obtenido de pacientes con mieloma múltiple con una concentración elevada de DKK-1 bloqueó tanto la señalización de Wnt como la diferenciación de los osteoblastos in vitro. Es importante señalar que la preincubación del suero con anticuerpos contra DKK-1 y contra FRZB inhibió esta función. De modo coherente con una función clave de JUN a la hora de controlar la expresión de DKK-1 y, a su vez, la apoptosis, las células plasmáticas obtenidas de enfermedad extramedular, así como la enfermedad resistente primaria, expresaban poca cantidad de JUN y de DKK-1.

Las células plasmáticas del mieloma múltiple mostraron una inducción masiva de la expresión génica de DKK-1 y de FRZB después del tratamiento in vivo. DKK-1 y FRZB se pueden inducir en las células plasmáticas del mieloma múltiple después del tratamiento de los pacientes con los fármacos genotóxicos utilizados para tratar la enfermedad, lo que apunta a la intervención de DKK-1 en la apoptosis celular del mieloma múltiple. Las células del mieloma múltiple primario cocultivadas con osteoclastos (OC) obtenidos in vitro no entraban en apoptosis y esto estaba muy correlacionado con la menor expresión de JUN, FOS, FOSB y DKK-1.

Los resultados descritos en la presente invención indican que bloquear la producción y/o secreción de DKK-1 y FRZB puede prevenir o revertir la pérdida de hueso en los pacientes con mieloma múltiple. Otras aplicaciones pueden incluir la utilización de inhibidores de DKK-1 y FRZB para prevenir la pérdida de hueso en la población general. Adicionalmente, se ha demostrado recientemente que la señalización de Wnt es decisiva para la capacidad de autorrenovación de las células troncales hematopoyéticas. Además, un nicho de médula ósea requerido para la proliferación de las HSC lo forman los osteoblastos maduros. El bloqueo mediante DKK-1 y FRZB de la señalización de Wnt podría afectar directa e indirectamente la proliferación de las células estrelladas del hígado (HSC) y, por lo tanto, puede explicar parcialmente la inmunosupresión y la anemia observadas en el mieloma múltiple. Por lo tanto, bloquear DKK-1 y/o FRZB también puede prevenir o revertir el defecto de la hematopoyesis observado en la mayoría de los pacientes con mieloma.

Otros aspectos, características y ventajas adicionales de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción siguiente de las realizaciones preferentes de la presente invención. Estas realizaciones se ofrecen con el propósito de descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para que el tema en el que las características, ventajas y objetivos de la invención citados anteriormente así como otros que se volverán evidentes se consigan y se puedan comprender en detalle, en los dibujos adjuntos se ilustra las descripciones más particulares y determinadas realizaciones de la invención resumidas brevemente más arriba. Estos dibujos forman un parte de la especificación. No obstante, se debe destacar que los dibujos adjuntos ilustran realizaciones preferentes de la invención y por lo tanto no se deben considerar que limiten su alcance.

Las figuras 1A y 1B muestran los patrones de expresión génica global que reflejan lesiones óseas en el mieloma. La figura 1A muestra una vista agrupada de los niveles de expresión normalizados de los 57 genes que se identificó mediante análisis de regresión logarítmica que se expresaban diferencialmente de forma significativa en las células plasmáticas malignas de pacientes sin ninguna lesión focal en la RMN (n = 36) y con más de una (1+) (n = 137) (p < 0,0001). Los 28 genes que mostraron una expresión elevada en las células plasmáticas de pacientes con 1+ lesiones en la RMN se ordenan de arriba a abajo según el rango de significación. Asimismo, los 30 genes que muestran un aumento significativo en los pacientes sin ninguna lesión en la RMN se ordenan de abajo a arriba según el rango de significación. Los símbolos de los genes (identificadores de conjuntos de sondas de Affymetrix cuando el gen no tiene nombre) se recogen hacia la izquierda. Las escalas de la expresión normalizada oscilan de –30 (azul) a +30 (rojo) como se indica debajo de la visualización de los datos. Los cuatro genes que siguen siendo significativos después del ajuste por permutación están subrayados.

La figura 1B muestra un gráfico de barras de la expresión del gen DKK1 en las células plasmáticas de médula ósea normal (CPMO), en los pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), con macroglobulinemia de Waldenström (MW) y con mieloma múltiple (MM) presentados en el eje x. Las muestras de MM se dividen en tres grupos de lesiones óseas: ninguna lesión en la RMN ni en los rayos X, 1+ lesiones en la RMN/ninguna lesión en los rayos X, y 1+ lesiones en la RMN y en los rayos X. La señal de Affymetrix, una medida cuantitativa de la expresión génica obtenida con MAS 5.01, se indica en el eje y. El nivel de la expresión del gen DKK1 en cada muestra se indica mediante una barra, en la que la altura de la barra es proporcional a la intensidad de la expresión génica. Las muestras se ordenan desde la expresión génica de DKK1 más baja a la más alta de izquierda a derecha en el eje x. El número de muestras en cada grupo se indica debajo del designador de cada grupo. La estadística para las comparaciones entre los subgrupos de MM se indican en el texto.

La figura 2 muestra que RHAMM estaba inducido en los pacientes con mieloma múltiple con lesiones óseas.

La figura 3 muestra que RHAMM raramente se presenta en las células plasmáticas normales y la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), pero que estaba presente en casi todas las estirpes de células de mieloma

humano. La figura 4 muestra que la securina estaba inducida en los pacientes con mieloma múltiple con osteopatía. La figura 5 muestra que MIP-1α y CCR1 eran genes «que aumentan mucho» en el mieloma múltiple pero que no

estaban correlacionados con las lesiones líticas. Barra negra: CCR1, barra gris: MIP-1α. La figura 6 muestra que MIP-1α se expresaba poco en las células plasmáticas (CP) normales. La figura 7 muestra la expresión génica de DKK-1, el antagonista de WNT, en el mieloma múltiple con lesiones óseas. La figura 8 muestra la expresión de FRZB, el receptor trampa de WNT en el mieloma múltiple con lesiones óseas

líticas.

La figura 9 muestra la expresión de DKK-1 y FRZB en el mieloma múltiple con lesiones óseas líticas. Barra negra: DKK1; barra gris: FRZB. La figura 10 muestra que FRZB se expresaba en las células plasmáticas de las amígdalas, PBC; LBA, linfocitos B de

las amígdalas; CPA, células plasmáticas de las amígdalas; CPMO, células plasmáticas de la médula ósea; WPC, WBC,

CLL. La figura 11 muestra que DKK-1 no se expresaba en los linfocitos B normales ni en las células plasmáticas. PBC, LBA, linfocitos B de las amígdalas; CPA, células plasmáticas de las amígdalas; CPMO, células plasmáticas de la médula ósea; WPC, WBC, CLL.

La figura 12 muestra que la expresión de DKK-1 en la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) era baja

respecto al mieloma múltiple latente (MML) y el mieloma múltiple (MM) recién diagnosticado. La figura 13 muestra que FRZB estaba elevado en la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) y que tenía una expresión más elevada en el mieloma múltiple latente (MML) y el mieloma múltiple (MM) recién diagnosticado.

La figura 14 muestra la expresión de DKK-1 y FRZB en la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) y en el mieloma múltiple latente (MML).

La figura 15 muestra una expresión baja de DKK-1 en la enfermedad extramedular. La figura 16 muestra que la expresión de DKK-1 y FRZB tiende a ser más elevada en las células plasmáticas de PCT medular que en las de la cresta ilíaca. PCT, FNA.

La figura 17 muestra la expresión de DKK-1 y FRZB en la biopsia por punción y aspiración con aguja fina de PCT medular. La figura 18 muestra una expresión elevada de DKK-1 y FRZB en el plasmacitoma medular. La figura 19 muestra una expresión más elevada de DKK-1 en el mieloma múltiple con osteopenia. La figura 20 muestra que DKK-1 no se expresaba en las células plasmáticas de la macroglobulinemia de Waldenström. La figura 21 muestra que WNT5A estaba elevado en el mieloma múltiple recién diagnosticado.

La figura 22 muestra que WNT5A tiende a expresarse más en el mieloma múltiple con lesiones líticas. La figura 23 muestra que WNT5A también era elevado en la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) y en el mieloma múltiple latente (MML).

La figura 24 muestra que WNT10B tiende a expresarse menos en el mieloma múltiple con lesiones líticas.

La figura 25 muestra que WNT5A y WNT10B tienden a estar inversamente correlacionados. Barra negra: WNT10B; barra gris: WNT5A. La figura 26 muestra que DKK-1 estaba presente en una estirpe celular SK-LMS. La figura 27 muestra la proteína DKK-1 sintetizada por el mieloma múltiple primario. La figura 28 muestra la baja expresión de DKK-1 en el mieloma múltiple resistente primario y recidivado. La figura 29 muestra que el receptor B de la endotelina era un gen «que aumenta mucho» en un tercio de los mielomas

múltiples recién diagnosticados. La figura 30 muestra la expresión del receptor B de la endotelina en la gammapatía monoclonal de significado incierto

(GMSI) y en el mieloma múltiple latente. Las células plasmáticas normales no expresan el receptor B de la endotelina.

La figura 31 muestra la implicación del receptor B de la endotelina en la formación de hueso.

La figura 32 muestra la expresión de DKK-1 después del tratamiento con PS-341.

La figura 33 muestra la expresión de DKK-1 después del tratamiento con talidomida en el mieloma múltiple recién diagnosticado.

La figura 34 muestra la expresión de DKK-1 después del tratamiento con IMiD.

La figura 35 muestra la expresión de DKK-1 después del tratamiento con dexametasona en el mieloma múltiple recién diagnosticado.

La figura 36 muestra la represión de JUN y FOS en las células de mieloma múltiple después del cocultivo con osteoclastos.

La figura 37 muestra la represión de JUN y DKK-1 en el cocultivo con osteoclastos.

La figura 38 muestra la señalización de WNT en la osteopatía por mieloma múltiple.

La figura 39 muestra la sobreexpresión de DKK-1 en el mieloma de bajo grado con la pérdida de la expresión con la progresión de la enfermedad. Se examinó la expresión de DKK-1 mediante inmunohistoquímica de las biopsias de la médula ósea de mieloma. Se presentan secciones seriadas (aumento de 550 veces) de biopsias de la médula ósea de pacientes con mieloma con una expresión del gen de DKK1 elevada (a-b) y baja (c-d). Se tiñen los portaobjetos con HE (a y c) o con anti-DKK1 y anticuerpo secundario (b y d). El uso del anticuerpo secundario solo no logró teñir las células (datos sin mostrar). Las imágenes aumentadas (aumento de 1200 veces) se localizan en el extremo izquierdo superior de cada imagen de HE. La imagen a muestra un mieloma con un patrón intersticial de afectación con células plasmáticas que muestran una morfología de bajo grado con abundante citoplasma y sin que se aprecie ningún nucléolo. La imagen b revela que la tinción positiva de las células plasmáticas en un patrón intersticial con anticuerpo anti-DKK1 era mayor cerca del hueso. La imagen c muestra un mieloma con un patrón nodular o aliterativo en el que las células plasmáticas muestran una morfología de alto grado con un núcleo de mayor tamaño y nucléolos prominentes. La imagen d no revela ninguna tinción positiva del plasma con los anticuerpos anti-DKK1.

Las figuras 40A y 40B muestran que la proteína DKK1 en el plasma de la médula ósea está muy correlacionada con la expresión del gen DKK1 y la presencia de lesiones óseas. La figura 40A muestra que la expresión del ARNm de DKK1 se detectó mediante una micromatriz y que la proteína DKK1 se detectó mediante ELISA en 107 casos en total de mieloma recién diagnosticado. Los resultados de ambos ensayos se transformaron mediante el logaritmo en base 2 y se normalizaron para dar una media de 0 y una varianza de 1. Cada barra indica la relación relativa de la expresión génica y la expresión de la proteína en cada muestra. Había una correlación significativa entre el ARNm de DKK1 en las células plasmáticas de mieloma y la proteína en el plasma de la médula ósea (r = 0,65, p < 0,001). La figura 40B muestra una vista de barras de los niveles de la proteína DKK1 en las células plasmáticas del plasma de la médula ósea de donantes normales (CPMO), en los pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), en la macroglobulinemia de Waldenström (MW) y en mieloma múltiple (MM) presentados en el eje x. Las muestras de MM se dividen en tres grupos de lesiones óseas: ninguna lesión en la RMN ni en los rayos X, 1+ lesiones en la RMN/ninguna en los rayos X y 1+ lesiones en la RMN y en los rayos X. La concentración de la proteína DKK1 (ng/ml) se indica en el eje y. Para permitir comparaciones de los niveles de la proteína DKK1 en los intervalos más bajos, se hizo que 200 ng/ml fuera el valor máximo. Esto dio lugar al truncamiento de un única muestra con una concentración de DKK1 de 476 ng/ml. El nivel de la proteína de DKK1 en cada muestra está indicado mediante una barra, en la que la altura de la barra es proporcional a la concentración de la proteína DKK1. Las muestras se ordenan de la concentración de proteína DKK1 más baja a la más alta de izquierda a derecha en el eje x. El número de muestras de cada grupo se indica debajo de cada grupo.

Las figuras 41A y 41B muestran que la DKK1 recombinante y el plasma del MM pueden bloquear la producción de fosfatasa alcalina en las células C2C12 tratadas con BMP-2 de un modo dependiente de DKK-1. La figura 41A muestra los niveles de la fosfatasa alcalina, un marcador de la diferenciación de los osteoblastos (eje y), que se midieron en las células C2C12 después de 5 días de cultivo en presencia de suero de ternera fetal al 5% solo o con BMP2, BMP2 + DKK1, BMP2 + DKK1 + anti-DKK1, o BMP-2 + DKK1 + IgG policlonal. Cada barra representa la media (± SEM) de los experimentos por triplicado. Obsérvese que la actividad de la fosfatasa alcalina aumentó en presencia de BMP-2 y se redujo significativamente esta proteína mediante la coincubación con DKK1 recombinante. Obsérvese también que el anticuerpo anti-DKK1, pero no la IgG policlonal, puede bloquear la actividad represora de DKK1. La figura 41B muestra que los niveles de la fosfatasa alcalina (eje y) se analizaron en las células C2C12 después de cultivar estas células durante 5 días en suero de ternera fetal al 5% solo o con 50 ng/ml de BMP-2 + plasma de la médula ósea normal al 10% (NS) o BMP-2 + plasma de la médula ósea con mieloma al 10% de 10 pacientes con mieloma recién diagnosticado (se proporcionó una muestra identificada), o BMP2 + plasma de paciente con mieloma al 10% + anti-DKK1 o IgG policlonal de cabra. Cada barra representa la media (± SEM) de los experimentos por triplicado. La concentración de DKK1 de cada muestra de plasma de médula ósea se determinó mediante ELISA y las concentraciones finales en el cultivo después de la dilución 1:10 se indican en el eje x. Obsérvese que las muestras con DKK1 a > 12 ng/ml afectaron a la producción de la fosfatasa alcalina. Un asterisco indica p < 0,05 en comparación con la fosfatasa alcalina en BMP2 + plasma de la médula ósea humana normal al 10%.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención demuestra que DKK-1 y FRZB, los antagonistas secretados de la señalización de WNT, intervienen en la destrucción ósea observada en el mieloma múltiple. Junto con la aparición de que existe un requisito absoluto de la señalización de Wnt para el crecimiento de los osteoblastos y su diferenciación, estos datos sugieren fuertemente que estos factores ocasionan la anergia de los osteoblastos y contribuyen a la osteopatía por mieloma múltiple al suprimir la producción ósea compensatoria normal que sigue a la pérdida de hueso.

La función de las células plasmáticas de mieloma múltiple en la estimulación de la actividad de los osteoclastos se ha investigado intensamente y se han establecido varias conexiones clave. Los datos presentados en la presente memoria proporcionan por primera vez pruebas de una posible explicación mecanicista de la disfunción de los osteoblastos en el mieloma múltiple. Se trata de observaciones significativas porque los estudios recientes han demostrado que la inhibición de la señalización de WNT ocasiona defectos en la función de los osteoblastos. Las DKK-1 y FRZB secretadas podrían explicar tanto la osteoporosis sistémica observada en el mieloma múltiple como la destrucción local excesiva de hueso próxima a los focos de las células plasmáticas.

Es importante señalar que DKK-1 y FRZB actúan inhibiendo la señalización de WNT a través de mecanismos independientes, lo que indica que su coexpresión puede tener efectos sinérgicos. Por lo tanto, estos genes se podrían utilizar para predecir la extensión de la osteopatía y el futuro riesgo de padecer la osteopatía. Además, los inhibidores de estas proteínas se podrían utilizar para bloquear la osteopatía. También es posible que estos factores intervengan en la osteoporosis de la población general.

Vía de señalización de WNT

Los genes de Wnt comprenden una gran familia de polipéptidos secretados que se expresan con patrones espaciales y limitados a ciertos tejidos durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. El análisis mutacional en los ratones ha demostrado la importancia de las Wnts a la hora de controlar los diversos procesos de desarrollo, tal como la generación del patrón del eje del cuerpo, del sistema nervioso central y las extremidades, y de la regulación de los acontecimientos inductores durante la organogénesis. La familia Wnt de factores de crecimiento secretados inicia la señalización a través del receptor Frizzled (Fz) y su correceptor, la proteína 5 o 6 relacionada con el receptor de LDL (LPR5 o LRP6), presuntamente a través de la formación del complejo Fz-LPR5/LPR6 inducido por Wnt.

Los antagonistas secretados de Wnt incluyen las proteínas relacionadas con Frizzled (Fz) (las FRP), Cerberus, el factor inhibidor de Wnt (WIF) y Dickkopf (DKK). Se ha demostrado que las proteínas relacionadas con Frizzled (Fz), Cerberus y el factor inhibidor de Wnt actúan uniendo y secuestrando a Wnt. A diferencia de los antagonistas de Wnt que ejercen sus efectos mediante imitación molecular de Fz o el secuestro de Wnt a través de otros mecanismos, Dickkopf-1 (DKK1) inhibe específicamente la señalización canónica de Wnt al unirse al componente LPR5/LPR6 del complejo receptor.

DKK-1 es un inductor de la cabeza secretado desde el organizador de la cabeza de los vertebrados e induce el desarrollo anterior al antagonizar con la señalización de Wnt. DKK-1 es un ligando de gran afinidad por LPR6 e inhibe la señalización de Wnt al impedir la formación del complejo Fz-LRP6 inducida por Wnt. DKK-1 no se une a Wnt ni a Fz, ni afecta a la interacción entre Wnt y Fz. La función de DKK-1 en la inducción de la cabeza y la inhibición de la señalización de Wnt se correlaciona estrictamente con su capacidad para unirse a LPR5/LPR6 y para romper la asociación Fz-LPR5/LPR6. La función de LPR5/LPR6 y la inhibición de DKK-1 son específicas de la vía de la β-catenina de Wnt/Fz. Estos hallazgos revelan, por lo tanto, un mecanismo nuevo para la modulación de la señal de Wnt.

Señalización de WNT y diferenciación de los osteoblastos

Los estudios recientes han demostrado que la vía de señalización de Wnt es decisiva para la diferenciación de los osteoblastos y su función. Los ratones con una desactivación dirigida en el gen para la proteína 5 relacionada con el receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LRP5) desarrollaron un fenotipo de baja masa ósea. LRP5 se expresa en los osteoblastos y es necesario para la señalización óptima de Wnt en los osteoblastos. Los análisis in vivo e in vitro indicaron que este fenotipo se hace evidente tras el nacimiento, y que era posterior a la disminución de la proliferación de los osteoblastos y su funcionamiento de un modo independiente de Cbfa1.

En los humanos, las mutaciones en LRP5 ocasionan el trastorno recesivo autosómico llamado síndrome de osteoporosis-pseudoglioma (OPPG). Los portadores del síndrome de osteoporosis-pseudoglioma tienen menos masa ósea cuando se comparan con controles emparejados por edad y género.

Es importante señalar que las mutaciones independientes y diferentes en LRP dan lugar a un fenotipo de masa ósea elevada. A diferencia de las mutaciones de osteoporosis-pseudoglioma, los rasgos de masa ósea elevada corresponden a mutaciones de ganancia de función. Los marcadores de la resorción ósea eran normales en los sujetos afectados, mientras que los marcadores de la formación ósea, tales como la osteocalcina, estaban notablemente elevados. La cantidad de fibronectina, una diana conocida de señalización mediante Wnt, también era alta. Los estudios in vitro demostraron que la inhibición normal de la señalización de Wnt mediante Dickkopf-1 (DKK-1) era defectuosa en presencia de la mutación y que esto daba lugar a un aumento de señalización debido a una actividad de Wnt sin oposición. Estos resultados demostraron la importancia de la alteración de la función de LRP5 en una masa ósea elevada y apuntan a que DKK sea una posible diana para la prevención o el tratamiento de la osteoporosis.

Señalización de WNT y osteopatía en el mieloma múltiple

Las pruebas indirectas de la importancia de DKK-1 en la función de los osteoblastos han surgido por la identificación de mutaciones de ganancia de función en LRP-5 que están ligadas a un fenotipo de masa ósea elevada. Además, la inactivación dirigida de la proteína secretada relacionada con Frizzled (SFRP-1), un homólogo de FRZB (SFRP-3), conduce a una disminución de la apoptosis de los osteoblastos y de los osteocitos, y a un aumento de la formación de hueso esponjoso.

En la región de LRP-5 se ha localizado un locus de rasgos cuantitativos (QTL por su nombre en inglés) que influye en la masa ósea, lo que sugiere que la población a la larga corre un riesgo diferente de desarrollar osteoporosis. Se puede concebir que la osteopatía por mieloma múltiple puede estar influida por los efectos combinados de la expresión de DKK-1/FRZB con una predisposición hereditaria a una masa ósea baja conferida por los alelos de LRP-5 heredados. Los casos de mieloma múltiple pueden ser genotipados por las variaciones alélicas de LRP-5 y se puede correlacionar esta información con la osteopatía y la expresión de DKK-1 y FRZB.

La gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), una discrasia de las células plasmáticas que está predispuesta a desarrollarse en mieloma múltiple, se diferencia del mieloma múltiple por la ausencia de una osteopatía obvia. La importancia de descubrir la expresión de DKK-1 y/o FRZB en un tercio de gammapatías monoclonales de significado incierto no está clara, pero podría sugerir que estos casos pueden encontrarse a un mayor riesgo de desarrollar mieloma múltiple. Como con el mieloma múltiple, esta predisposición también puede estar relacionada con los alelos heredados de LRP5. Alternativamente, estos casos de gammapatía monoclonal de significado incierto podrían tener una osteopatía preclínica subyacente que aún no resulte evidente mediante radiografías.

Los datos presentados en la presente memoria sugieren un modelo de cómo la expresión de DKK-1 mediante las células plasmáticas del mieloma múltiple puede estar ligada al control del crecimiento de la enfermedad por mieloma múltiple y la destrucción ósea, y cómo estos dos fenómenos se pueden integrar mediante una molécula. En el modelo, el mieloma múltiple primario expresa una gran cantidad de DKK y esta cantidad pueden aumentarse con los tratamientos farmacológicos utilizados para tratar la enfermedad. La gran cantidad de DKK-1 probablemente induzca la apoptosis de las células del mieloma múltiple y podrían explicar la progresión relativamente lenta de la enfermedad en su fase temprana, ya que el crecimiento celular se atenúa por la gran velocidad de la apoptosis inducida por DKK-1. No obstante, a medida que la enfermedad progresa, hay una reducción inducida por los osteoclastos de JUN y de DKK-1 que finalmente se convierte en una pérdida constitutiva de la expresión de JUN y de DKK-1 como se observa en la enfermedad extramedular.

Por lo tanto, si se tuviera que observar la expresión de DKK-1 desde la perspectiva de las células plasmáticas del mieloma múltiple, se podrían observar niveles elevados de la expresión de DKK-1 como un rasgo positivo de la enfermedad. Sin embargo, con la estirpe de las células mesenquimatosas siendo extremadamente sensible a la apoptosis inducida por la DKK-1, la elevada concentración de este producto secretado probablemente tiene un doble filo por el hecho de que también induce la muerte celular programada masiva de los precursores de los osteoblastos y posiblemente incluso las células troncales mesenquimatosas. Se espera que una gran cantidad de la DKK-1 al comienzo de la enfermedad podría conducir a una pérdida permanente de células troncales mesenquimatosas, una idea apoyada por la observada falta de reparación ósea después de inducir la remisión o durante la progresión de la enfermedad, cuando los osteoclastos probablemente suprimen la secreción de la DKK-1 mediante las células plasmáticas del mieloma múltiple. Por lo tanto, la explotación de este conocimiento podría conducir al desarrollo de nuevos tratamientos para el mieloma múltiple que acentúen los efectos de DKK-1 sobre las células plasmáticas del mieloma múltiple, pero al mismo tiempo prevengan los efectos dañinos de DKK en el hueso sobre los osteoblastos o sus precursores.

En una realización de la presente invención, se da a conocer un método para determinar la posibilidad de sufrir una osteopatía en un paciente con mieloma múltiple con el examen del nivel de expresión del antagonista de señalización de WNT. El aumento de la expresión del antagonista en comparación con el de un individuo normal indicaría que el paciente tiene potencial para desarrollar la osteopatía. El antagonista de la señalización de WNT es el homólogo humano de Dickkopf-1 (DKK1). En general, el nivel de expresión de estas proteínas se puede determinar a nivel del ácido nucleico o de las proteínas.

En otra realización se da a conocer un método para tratar la osteopatía en un paciente con mieloma múltiple al inhibir la expresión del antagonista de la señalización de WNT. El antagonista de la señalización de WNT es la proteína 3 soluble relacionada con Frizzled (SFRP-3/FRZB) o el homólogo humano de Dickkopf-1 (DKK1). En general, la expresión de estos antagonistas se puede inhibir a nivel del ácido nucleico o de la proteína.

Aún en otra realización se da a conocer un método para prevenir la pérdida de hueso en un individuo al inhibir la expresión del antagonista de la señalización de WNT. El antagonista de la señalización de WNT es la proteína 3 soluble relacionada con Frizzled (SFRP-3/FRZB) o el homólogo humano de Dickkopf 1 (DKK1). Por lo general, la expresión de

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estos antagonistas se puede inhibir a nivel del ácido nucleico o de la proteína.

Aún en otra realización se da a conocer un método para controlar la pérdida de hueso en un individuo, que comprende la etapa de inhibir la expresión del gen DKK1 (número de acceso NM012242) o la actividad de la proteína expresada por el gen DKK1. La expresión del gen DKK1 es inhibida por oligonucleótidos antisentido o por anticuerpos anti-DKK1 o receptores LRP solubles.

Aún en otra realización se da a conocer un método para controlar la osteólisis en un individuo, que comprende la etapa de administrar a dicho individuo un inhibidor farmacológico de la proteína DKK1. Por lo general, este método sería útil cuando el individuo tiene una enfermedad tal como el mieloma múltiple o pérdida de hueso relacionada con una neoplasia maligna. Por lo general, la osteólisis relacionada con una neoplasia maligna está ocasionada por la metástasis del cáncer de mama en el hueso o la metástasis del cáncer de próstata en el hueso.

Los ejemplos siguientes se ofrecen con el propósito de ilustrar las diferentes realizaciones de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ningún modo. El experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y las ventajas mencionadas, así como estos objetivos, fines y ventajas inherentes a la presente memoria. Ocurrirá que el experto en la técnica introducirá cambios en la presente memoria y otros usos que ya están englobados dentro de la invención como se define por el alcance de las reivindicaciones.

EJEMPLO 1

Pacientes

Se estudiaron 174 pacientes con un mieloma múltiple recién diagnosticado, 16 pacientes con gammapatía monoclonal de significado incierto, 9 con macroglobulinemia de Waldenström y 45 personas normales. El Institutional Review Board of the University of Arkansas for Medical Sciences aprobó los estudios de investigación y todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito. La tabla 1 muestra las características de los pacientes con mieloma múltiple.

TABLA 1

Características de los pacientes con mieloma y su relación con las lesiones en la RMN

Variable n/N % RMN = 1+ RMN = 0 Valor de P

Edad ≥ 65 años 23/169 14 17/132 6/36 0,59* (12,9%) (16,7%)

Caucasiano 147/169 87 113/132 33/36 0,42* (85,6%) (91,7%)

Mujer 68/169 40 55/132 13/36 0,55 (41,7%) (36,1%)

Cadena ligera κ 104/165 63 79/128 24/36 0,59 (61,7%) (66,7%)

Cadena ligera 61/165 37 49/128 (38,3%) 12/36 0,59 λ (33,3%)

Subtipo IgA 39/169 23 25/132 14/36 0,012 (18,9%) (38,9%)

B2M ≥ 4 mg/l 60/169 36 47/132 13/36 0,96 (35,6%) (36,1%)

CRP ≥ 4 mg/l 12/166 7 11/129 (8,5%) 1/36 0,47* (2,8%)

Creatinina ≥ 2 19/169 11 16/132 (12,1%) 3/36 0,77* mg/dl (8,3%)

LDH ≥ 190 UI/l 52/169 31 44/132 (33,3%) 8/36 0,20 (22,2%)

Albúmina < 3,5 23/169 14 19/132 (14,4%) 4/36 0,79* g/dl (11,1%)

Hgb < 10 g/dl 40/169 24 31/132 (23,5%) 8/36 0,87 (22,2%)

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PCLI ≥ 1% 23/150 15 18/119 (15,1%) 4/30 1,00* (13,3%)

ASPC ≥ 33% 109/166 66 82/129 26/36 (72,2%) 0,33 (63,6%)

BMPC ≥ 33% 104/166 63 79/129 24/36 0,55 (61,2%) (66,7%)

Anomalías 52/156 33 45/121 (37,2%) 6/34 0,032 citogenéticas (17,6%)

CA13 o 33/52 63 31/121 (25,6%) 3/34 0,037 hipodiploide (8,8%)

Otro CA 19/52 37 53/103 (51,5%) 16/32 (50,0%) 0,89

FISH13 69/136 51 103/136 28/36 (77,8%) 0,80 (75,7%)

Osteopenia 131/173 76

1+ lesiones por 137/173 79 RMN

3+ lesiones por 108/173 62 RMN

1 + lesiones por 105/174 60 rayos X

3+ lesiones por 69/174 40 rayos X

* Prueba exacta de Fisher, y si no, prueba de χ2.

EJEMPLO 2

Imágenes óseas

Se revisaron las imágenes, sin el conocimiento previo de los datos de expresión génica, utilizando un PACS (Picture Archiving and Cataloging System) de Canon. Se realizaron exploraciones por RMN en escáneres SignaTM de GE de 1,5 teslas. Se digitalizaron los rayos X a partir de la película de acuerdo con los estándares del Colegio Estadounidense de Radiólogos (ACR, por su nombre en inglés). Se conectaron las imágenes de exploración por RMN y por rayos X al sistema PACS de Canon utilizando el estándar DICOM (imágenes digitales y comunicaciones en medicina) del ACR. Se realizaron las imágenes según las especificaciones de los fabricantes. Se crearon las imágenes de RMN antes y después del potenciado en T1 con gadolinio y potenciado de STIR (recuperación de inversión de τ corto).

EJEMPLO 3

Aislamiento de las células plasmáticas y perfil de expresión génica

Después de la centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque, se aislaron las células plasmáticas obtenidas de la médula ósea de la fracción celular mononuclear mediante selección con perlas inmunomagnéticas utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD138 humano (Miltenyi-Biotec, Auburn, CA). Más del 90% de las células utilizadas para el perfil de expresión génica eran células plasmáticas, tal y como se muestra mediante citometría de flujo de dos colores utilizando los marcadores CD138+/CD45– y CD38+/CD45–, la presencia de las cadenas ligeras de inmunoglobulinas en el citoplasma mediante inmunocitoquímica, y la morfología mediante la tinción de Wright-Giemsa. Se aisló el ARN total con el kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA). La preparación del ARNc marcado y la hibridación de las micromatrices U95Av2 que contienen aproximadamente 10 000 genes (Affymetrix, Santa Clara, CA) se realizó como se describió previamente (Zhan et al., 2002; Zhan et al., 2003). No fue necesaria la amplificación del ARN.

EJEMPLO 4

Inmunohistoquímica

Un anticuerpo de una cabra que se inmunizó contra toda la proteína DKK1 humana (R&D Systems, Minneapolis, MN) se diluyó 1:200 en tampón Tris y se añadió a secciones de biopsia de médula ósea embebidas en parafina y fijadas con formol durante 2 horas a temperatura ambiente. Las secciones adyacentes se tiñeron con HE. Se revelaron las reacciones entre anticuerpo y antígeno con DAB (después de teñir con el anticuerpo anticabra biotinilado [Vector Laboratories, Burlingame, CA] [dilución 1:4000] y la peroxidasa de rábano picante-estreptavidina [Dako]) y la tinción de contraste con hematoxilina 2.

EJEMPLO 5

Inmunoensayo enzimático (ELISA)

La superficie de las placas de microtitulación MaxiSorp de Nunc-Inmuno se recubrieron con 50 ml de anticuerpo antiDKK1 a 1 mg/ml en disolución salina 1X tamponada con fosfato, pH 7,2 a 4ºC durante una noche, y se bloqueó con seroalbúmina bovina al 4%. Se diluyó el plasma de médula ósea 1:50 en tampón de dilución (disolución salina 1X tamponada con fosfato + 0,1 Tween-20 + seroalbúmina bovina al 1%). Se cargaron 50 µl por pocillo y se incubaron durante una noche a 4ºC, se lavaron y se incubaron con IgG de cabra biotinilada anti-DKK1 humano (R&D Systems) diluida a 0,2 mg/ml en tampón de dilución, seguido de la adición de 50 µl de una dilución 1:10 000 de peroxidasa de rábano picante-estreptavidina (Vector Laboratories), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se consiguió el revelado del color con el sistema de sustrato OPD (Dako) según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron diluciones seriadas de DKK1 humano recombinante (R&D Systems) para establecer una curva estándar. Sara validar el ensayo de ELISA se utilizaron las estirpes celulares T293 que no expresa el DKK1 endógeno y la T293 que lleva el DKK1 transfectado establemente (Fedi et al., 1999).

EJEMPLO 6

Ensayos de diferenciación de osteoblastos

Se cultivaron células precursoras mesenquimatosas C2C12 (American Type Tissue Culture, Reston, VA) en DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con suero de ternera fetal inactivado al calor al 10%. Se midió la actividad de la fosfatasa alcalina en las células C2C12 tal y como se ha descrito (Gallea et al., 2001; Spinella-Jaegle et al., 2001). Se analizó el contenido de proteínas de los lisados celulares utilizando el kit de ensayo micro-BCA (Pierce, Rockford, IL). Cada experimento se hizo por triplicado.

EJEMPLO 7

Análisis estadísticos

Se modeló la osteopatía en los pacientes con mieloma múltiple utilizando la regresión logarítmica. Las variables independientes consideradas fueron los valores de intensidad de expresión génica (lmedia de las diferencias entre las lecturas) de unos 10 000 genes (12 625 conjuntos de sondas) medidos con la versión 5.01 de MAS (Affymetrix, Santa Clara, CA) de 174 casos de mieloma múltiple recién diagnosticado. La «señal», una medida cuantitativa de la expresión génica, de cada grupo de sondas se transformó en el log2 antes de la entrada en el modelo de regresión logarítmica y el análisis de ajuste por permutación. No hubo una hipótesis previa con respecto a los genes que podrían asociarse a la osteopatía en el mieloma. Como resultado, se utilizó un modelo monofactorial de osteopatía para cada uno de los 12 625 conjuntos de sondas. Los genes candidatos se refinaron utilizando pruebas de t de Student con unos niveles de significación ajustados por permutación (Westfall y Young, 1993). Se utilizó el análisis de Westfall y Young para ajustar las numerosas comprobaciones de hipótesis monofactoriales. Se comprobaron las diferencias de grupo en la señal de DKK1 y la cantidad de la proteína de DKK1 utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se analizaron las diferencias significativas en las características de los pacientes según el estado de la osteopatía utilizando o bien la prueba exacta de Fisher o la prueba de la χ2. La intensidad de expresión de los genes identificados mediante la regresión logarítmica se visualizaron con Clusterview (Golub et al., 1999). Se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman para medir la correlación de la expresión del gen y la cantidad de proteína. Se comprobaron las diferencias significativas, en la diferenciación del osteoblasto, entre el control y cada situación experimental mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon; se hicieron comparaciones por separado para cada experimento único con C2C12. Se consideraba que los valores de p de dos colas de menos de 0,05 eran significativos y que los valores de p de dos colas de menos de 0,10 era marginalmente significativos.

EJEMPLO 8

Perfil de expresión génica de las células de mieloma

Para identificar los genes que se sobreexpresaban y estuvieran asociados a la presencia de las lesiones óseas, se compararon los datos de micromatrices de pacientes con o sin lesiones óseas. Como las lesiones óseas focales definidas por la RMN se pueden producir antes que las lesiones líticas identificables en una radiografía, se utilizaron imágenes potenciadas en T1 y potenciadas de STIR para evaluar las lesiones óseas. Se construyó un modelo mediante análisis de regresión logarítmica con los patrones de expresión génica de unos 10 000 genes en células plasmáticas purificadas de la médula ósea de pacientes sin ninguna lesión ósea (n = 36) y los que tenían 1 o más (1+) lesiones focales definidas en la RMN (n = 137). El modelo identificó 57 genes que se expresaban diferentemente (p < 0,0001) en los dos grupos de pacientes (figura 1A). Estos 57 genes se analizaron adicionalmente mediante pruebas de t de Student con la significación ajustada por permutación (Westfall y Young, 1993). Estas pruebas estadísticas demostraron que 4 de los 57 genes se sobreexpresaban en los pacientes con 1+ lesiones en la RMN: dihidrofolato reductasa (DHFR), subunidad del activador del proteasoma (PSME2), cinasa 2 de la proteína CDC28 (CSK2) y el homólogo 1 de Dickkopf (DKK1). Dado que el gen para el antagonista DKK1 de la señalización de Wnt/β-catenina es el único de los cuatro que codifican un factor secretado y que la señalización de Wnt/β-catenina está implicada en la biología del hueso, se realizaron más pruebas sobre DKK1. Un análisis de los resultados de los 173 pacientes con mieloma mostró que la señal de DKK1 de los pacientes con 1+ RMN y ninguna lesión en los rayos X difiere significativamente con respecto a los pacientes sin ninguna lesión en la RMN ni en los rayos X (mediana de la señal: 2,220 frente a 285; p < 0,001), pero

5 no difiere significativamente con respecto a los pacientes con 1+ RMN y 1+ rayos X (mediana de la señal: 2,220 frente a 1,865; p = 0,63) (figura 1B, tabla 2).

La gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) es una discrasia de las células plasmáticas sin lesiones óseas líticas y puede preceder al mieloma múltiple. En 15 de los 16 casos de GMSI, el DKK1 se expresaba en las células plasmáticas de la médula ósea a un nivel comparable al del mieloma múltiple sin ninguna lesión ósea en la RMN

10 ni en los rayos X (figura 1B). El DKK1 era indetectable en las células plasmáticas de 45 donantes normales y 9 pacientes con macroglobulinemia de Waldenström, una neoplasia maligna de las células plasmáticas del hueso que carece de lesiones óseas (figura 1B).

TABLA 2

ARNm de DKK1 y concentración de la proteína en los subgrupos de MM definidos por lesión en la RMN/rayos X

Ninguna lesión enRMN ni en los rayos X: 1+ RMN/ninguna lesión enlos rayos X 1+ RMN/1+ rayos X

N: 36 33 104

DKK1 (Señal) (ARNm): Media (DE) 536,1 (720,7) 3146,5 (3079,9) 3415,1 (4870,8)

DKK1 (Señal) (proteína): Min, Mediana, Máx 19,2, 284,9, 3810,2 16,4, 2220,2, 10828,4 9,4, 1864,7, 28859,1

N: 18 9 41

DKK1 (ng/ml) (ARNm): Media (DE) 9,0 (4,7) 24,0 (17,7) 34,3 (75,3)

DKK1 (ng/ml) (proteína): Min, Mediana, Máx 1,8, 8,7 19,7 7,4, 20,4 61,8 2,5, 13,5 475,8

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EJEMPLO 9

La expresión génica global revela que DKK-1 y FRZB están ligados a la lesión ósea lítica en el mieloma múltiple

Para identificar adicionalmente los determinantes moleculares de la osteopatía lítica, los perfiles de expresión de unos 12 000 genes en las células plasmáticas enriquecidas en CD138 de los pacientes con mieloma múltiple recién 20 diagnosticado que no muestran ningún indicio radiológico de lesiones líticas en los reconocimientos de huesos (n = 28) se compararon con los que tenían ≥ 3 lesiones líticas (n = 47). La prueba de χ2 de las lecturas absolutas (una medida cualitativa de la expresión génica) se utilizó para identificar 30 genes que diferenciaban las dos formas de enfermedad (p < 0,05). La prueba de suma de rangos de Wilconxon (SRW) de la lectura de la señal (una medida cuantitativa de la expresión génica) reveló que 104 genes (49 inducidos y 55 reprimidos) diferenciaban los dos subtipos de enfermedad (p

25 < 0,001).

La prueba de χ2 identificó que el protooncogén RHAMM era el discriminador más significativo entre los dos grupos. Se expresaba sólo en 7 de los 28 pacientes sin ninguna enfermedad ósea en comparación con 34 de los 47 pacientes con osteopatía (figura 2). Como se esperaba, las células plasmáticas de sólo 1 de las 11 gammapatías monoclonales de significado incierto expresaban RHAMM (figura 3). La SRW clasificó la RHAMM como el 14.º discriminador más 30 significativo entre el grupo con lesión lítica y el grupo sin lesión lítica. NCALD, una proteína de unión al calcio implicada en la transducción de señales neuronales, estaba presente en 11/28 (40%) en el grupo sin lesión lítica, pero sólo en 2/47 (4%) en el grupo con lesión lítica. Otros genes importantes que se han identificado mediante la prueba de χ2 incluyeron FRZB, un antagonista de la señalización de Wnt, que estaba presente en 40/47 (85%) en el grupo con lesión lítica y 15/28 (53%) en el grupo sin lesión lítica, CBFA2/AML1B se ha ligado a la expresión de MIP1α y estaba presente

35 en el 50% del grupo sin lesión lítica y en el 79% del grupo con lesión lítica.

PTTG1 (securina) implicado en la segregación de los cromosomas fue identificado por la SRW como el gen discriminador más significativo (p = 4 X 10–6). Estaba presente en el 11% del grupo sin lesión lítica, pero presente en el 50% del grupo con lesión lítica (figura 4). Otros genes notables en la prueba de SRW incluyeron a DSIPI, homólogo de

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TSC-22, que se expresaba a niveles más bajos en el grupo con lesión lítica (p = 3 X 10–5). DSIPI también disminuyó en las células plasmáticas de 12 de los 12 mielomas múltiples después del cocultivo ex vivo con osteoclastos.

Además, 4 de los llamados genes «que aumentan mucho» se identificó que se encontraban con más frecuencia en el grupo con lesión lítica que en el grupo sin lesión lítica (p < 0,05): IL6 muestra aumentos importantes en 0/28 en el grupo sin lesión lítica y 7/47 en el grupo con lesión lítica (p = 0,032); Osteonidogen (NID2) muestra aumentos importantes en 0/28 en el grupo sin lesión lítica y 7/47 en el grupo con lesión lítica (p = 0,032); el regulador de la señalización por proteína G (RGS13) muestra aumentos importantes en 1/28 en el grupo sin ninguna expresión lítica y en 11/47 en el grupo con lesión lítica (p = 0,023); y el receptor piromidinérgico P2Y (P2RY6) muestra aumentos importantes en 1/28 en el grupo sin lesión lítica y en 1/47 en el grupo con lesión lítica (p = 0,023).

Por lo tanto, estos datos sugieren que puede haber patrones de expresión génica ligados a la osteopatía. Además de ser potencialmente útiles como predictores de la aparición de la osteopatía lítica y la conversión de la gammapatía monoclonal de significado incierto en mieloma múltiple manifiesto, también pueden identificar dianas sobre las que se podría intervenir.

EJEMPLO 10

DKK1 y FRZB tienden a expresarse a niveles más elevados en las células plasmáticas de lesiones focales que en las de la médula ósea al azar

Dada la relación de DKK1 y FRZB con las lesiones líticas, la expresión de DKK-1 y FRZB en las células plasmáticas obtenidas de aspirados de médula ósea al azar de la cresta ilíaca se comparó con la de las obtenidas mediante aspiración con una aguja fina guiada mediante TAC de lesiones focales de la médula espinal. Estos resultados mostraron un nivel de expresión significativamente más elevado en las células plasmáticas de las lesiones focales.

EJEMPLO 11

DKK1 y FRZB no se expresan en las células plasmáticas de la macroglobulinemia de Waldenström

La macroglobulinemia de Waldenström es una discrasia rara de las células plasmáticas que se caracteriza por una paraproteinemia de IgM monoclonal y una infiltración linfoplasmacítica de la médula ósea, los ganglios linfáticos y el bazo. Su presentación clínica es bastante variable, al igual que la evolución clínica, y al contrario que el mieloma múltiple, las lesiones óseas son raras. Aunque el perfil de expresión génica global de las células plasmáticas de la médula ósea enriquecidas en CD138 de 10 casos de macroglobulinemia de Waldenström reveló anomalías macroscópicas (Zhan et al., 2002), estas células, al igual que las células plasmáticas de la médula ósea normal, no expresan FRZB ni DKK (figura 20).

EJEMPLO 12

FRZB y el receptor B de la endotelina se correlacionan con DKK-1

La endotelina 1 es un vasoconstrictor de 21 aminoácidos. Se han identificado dos receptores para la endotelina: los receptores A y B. Las células del cáncer de mama y del cáncer de próstata son capaces de producir endotelina 1, y se ha encontrado un aumento de la concentración de endotelina 1 y del receptor A de la endotelina en el cáncer de próstata avanzado con metástasis óseas. Las células del cáncer de mama que produjeron endotelina 1 ocasionaron metástasis osteoblásicas en las ratonas. Los medios acondicionados y la endotelina 1 exógena estimularon la proliferación de los osteoblastos y la formación de hueso nuevo en los cultivos de bóvedas craneales de ratón (figura 31). Estos resultados sugieren que la endotelina está ligada a la formación ósea.

La tabla 3 muestra que la expresión del receptor B de la endotelina (ENDRB) se correlacionaba con la de DKK-1. El gen receptor B de la endotelina aumentaba significativamente en un tercio de los mielomas múltiples recién diagnosticados (figura 29). El receptor B de la endotelina también se expresaba en subconjuntos de gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI) y en el mieloma múltiple latente, pero no en las células plasmáticas normales (figura 30).

TABLA 3

Correlación entre el receptor B de la endotelina (ENDRB) y DKK-1

Símbolo del gen: Significación asimp. (dos colas)

DKK-1: 6,35 x 10-14

FRZB: 6,59 x 10–8

EDNRB: 0,00014

DKFZP564G202: 4,83 x 10-11

IFI27: 1,43 x 10-6

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SLC13A3 0,00011

CCND1 0,00010

SYN47 4,27 x 10-10

PCDH9 0,00029

EJEMPLO 13

El tratamiento farmacológico in vivo induce a DKK-1

Se ha demostrado que la expresión de DKK-1 está inducida masivamente por la radiación UV y otros muchos estímulos genotóxicos. Para ver si las células plasmáticas del mieloma múltiple también inducen los genes en respuesta a los fármacos utilizados para tratar esta enfermedad, se realizó el perfil de expresión génica de las células plasmáticas del mieloma múltiple antes y después de 48 horas de tratamiento in vivo con talidomida (figura 33), ImiD (figura 34), PS-341 (figura 32) o dexametasona (figura 35). Estos datos mostraron que la expresión de DKK-1 y FRZB podría estar inducida masivamente en muchos casos y, por lo tanto, apoya la importancia directa de DKK-1 a la hora de desencadenar la apoptosis de las células plasmáticas del mieloma múltiple. Es interesante observar que un paciente recién diagnosticado que era resistente primario a todos los fármacos probados mostró unos niveles bajos de DKK-1 en las pruebas de preestudio iniciales y que nunca mostró un aumento de la expresión de DKK-1 o FRZB después del tratamiento farmacológico, lo que apoya la importancia de la expresión de DKK-1 a la hora de promover la apoptosis de las células plasmáticas del mieloma múltiple. Como apoyo a esta idea, DKK-1 y FRZB se expresaron a un nivel de bajo a indetectable en 30 HMCL y varios casos de enfermedad extramedular (figura 15).

EJEMPLO 14

El cocultivo del mieloma múltiple con osteoclastos da lugar a una represión masiva de JUN, FOS y DKK-1

La relación próxima entre las células del mieloma y los osteoclastos se expresa clínicamente mediante la asociación de la destrucción ósea lítica debilitante con el mieloma múltiple. El desarrollo de las lesiones óseas líticas está ocasionado por la activación de los osteoclastos a través de las interacciones directas e indirectas con las células plasmáticas del mieloma. Ha quedado recabada clínicamente la importancia decisiva de los osteoclastos en la supervivencia y el crecimiento de las células del mieloma y a la hora de mantener el proceso de enfermedad, y se demostró en modelos experimentales in vivo tales como el modelo SCID-hu para el mieloma humano primario.

Para investigar las consecuencias moleculares del las interacciones entre las células plasmáticas del mieloma múltiple y los osteoclastos, se desarrolló un sistema ex vivo en el que las células plasmáticas del mieloma múltiple enriquecidas en CD138 se cocultivaron con osteoclastos obtenidos de células troncales de sangre periférica del mieloma múltiple o los PBSC y MNC de donantes sanos. Las células plasmáticas del mieloma múltiple enriquecidas en CD138 cocultivadas con los osteoclastos humanos obtenidos de células troncales de sangre periférica de donantes normales o de pacientes con mieloma múltiple mantuvieron su viabilidad y la actividad proliferativa como se indicó por citometría de flujo de la anexina V, el índice de marcación con BrdU y la incorporación de [3H]TdR durante hasta 50 días. El nivel de pureza de las células plasmáticas antes y después de los cocultivos fue mayor del 95%, según se determinó mediante citometría de flujo de CD38/CD45.

Los análisis en micromatrices de la expresión de unos 12 000 genes en 12 células plasmáticas de mieloma múltiple se realizaron antes y después de 4 días de cocultivo. El análisis de agrupamiento jerárquico de las 12 pares de células plasmáticas de mieloma múltiple y las 150 células plasmáticas de mieloma múltiple recién diagnosticado utilizando 7913 conjuntos de sondas (genes) reveló que mientras que las muestras antes del cocultivo se distribuían entre 3 agrupamientos principales, las muestras posteriores al cocultivo se agruparon estrechamente en 2 de las ramas principales. Un análisis de los cambios de expresión génica significativa después del cocultivo demostró que 95 conjuntos de sondas (genes) cambiaron de 2 a 50 veces (77 inducidos y 18 reprimidos) en al menos 8 de las 12 células plasmáticas de mieloma múltiple después del cocultivo. Las células plasmáticas enriquecidas en CD138 de 5 donantes sanos mostraron unos cambios idénticos en muchos de los mismos genes, lo que sugiere que las células plasmáticas de mieloma múltiple no muestran una alteración de la respuesta a los osteoclastos. No obstante, las células plasmáticas normales, a diferencia de sus homólogas malignas, no sobrevivieron en cocultivos a largo plazo con los osteoclastos.

Los cambios más sorprendentes fueron la inducción de las quimiocinas GRO1, GRO2, GRO3, SCYA2, SCYA8, SCYA18 e IL8. Otros genes notables incluían el receptor de quimiocinas CCR1, la osteopontina (SPP1), las integrinas ITGB2 e ITGB5, la metaloproteinasa 9 de la matriz (MMP9), la catepsina K (CTSK) y la catepsina L (CTSL). Sorprendentemente, un gran número de genes relacionados con los osteoclastos estaban entre los 77 genes inducidos. Los genes reprimidos incluían la ciclina B (CCNB1), UBE2C, que es la ubicuitina ligasa específica de la ciclina B, DSIPI, que es el homólogo de TSC-22, y JUN, JUND, FOS y FOSB.

Los cambios en la expresión génica también se comprobaron en 10 osteoclastos cultivados solos y después del cocultivo con células plasmáticas de mieloma múltiple. Después del cocultivo, 24 genes (14 inducidos y 10 reprimidos) cambiaron de 2 a 10 veces en al menos 7 de los 10 osteoclastos. No hubo diferencias significativas en la expresión génica entre las células plasmáticas del mieloma múltiple cultivadas con osteoclastos obtenidos de pacientes con mieloma múltiple o de donantes sanos, lo que sugiere que los osteoclastos del mieloma múltiple no son cualitativamente diferentes de los obtenidos de donantes normales.

No se observaron cambios significativos en la expresión génica cuando las células plasmáticas de mieloma múltiple se cultivaron en medios obtenidos de un experimento de cocultivo, lo que sugiere que el contacto es importante. Dada la baja proporción de las células plasmáticas de mieloma múltiple por osteoclastos en los experimentos de cocultivo (1000:1), es poco probable que todas las células plasmáticas puedan estar en contacto con los osteoclastos simultáneamente. Por lo tanto, es probable que se produzca alguna comunicación intercelular entre las células plasmáticas del mieloma múltiple en contacto con los osteoclastos y las otras células plasmáticas de mieloma múltiple.

Se sabe que los osteoclastos desempeñan una función importante en la osteopatía por mieloma múltiple, así como en proporcionar señales antiapoptósicas al mieloma múltiple. Los estudios recientes han demostrado que JUN regula directamente la expresión de DKK-1 y que JUN y DKK-1 controlan la apoptosis.

Para determinar si los osteoclastos podrían prevenir la apoptosis de las células plasmáticas de mieloma múltiple al modular a JUN y a DKK-1, se realizó el perfil de expresión génica en las células plasmáticas purificadas de 12 casos de mieloma múltiple primario antes y después de 48 horas del cocultivo con los osteoclastos obtenidos in vitro. Las células plasmáticas de mieloma múltiple en el cocultivo tenían una viabilidad a largo plazo significativamente mayor que las células cultivadas solas. El perfil de expresión génica de las células plasmáticas de mieloma múltiple antes y después del cocultivo con osteoclastos reveló que JUN, FOS y FOSB eran 3 de los 40 genes reprimidos más de 2 veces en todos los casos (n = 12/12). El análisis de agrupamiento jerárquico de HMCL y de células de mieloma múltiple primario con 95 genes modulados significativamente en las células plasmáticas de mieloma múltiple después del cocultivo reveló una similitud sorprendente entre HMCL, el mieloma múltiple primario cocultivado con los osteoclastos y un subconjunto de mieloma múltiple recién diagnosticado en que estos tipos de células tenían unos niveles relativamente bajos de c-JUN y c-FOS.

Es importante destacar que mientras las células de mieloma múltiple primario muestran un grado elevado de apoptosis espontánea cuando se cultivan solas, las células plasmáticas de mieloma múltiple cultivadas en presencia de osteoclastos pueden sobrevivir indefinidamente. Estos datos respaldan una conexión entre JUN y DKK-1 y también sugieren que la pérdida de la expresión de JUN y DKK en el mieloma múltiple se puede asociar a la progresión de la enfermedad, ya que enfermedad extramedular y HMCL, que se derivan invariablemente de la enfermedad extramedular, carecen de JUN y DKK. Es interesante especular que una de las principales influencias de los osteoclastos sobre el crecimiento del mieloma múltiple y el comportamiento es disminuir a JUN y a DKK-1, lo que afecta directamente a la apoptosis de las células plasmáticas. El tratamiento de HMCL y los cocultivos de mieloma múltiple primario y osteoclastos con DKK-1 se espera que dé lugar a la apoptosis de las células plasmáticas de mieloma múltiple. DKK-1 no afectará probablemente a los osteoclastos, porque estas células no expresan LRP-5, el correceptor de Wnt. Las células plasmáticas obtenidas de la médula ósea normal no expresan tampoco DKK-1 y pueden ayudar a explicar la naturaleza de su prolongada supervivencia.

EJEMPLO 15

Síntesis de la proteína DKK1 en las células plasmáticas

Se tiñeron secciones seriadas de biopsias de médula ósea de 65 casos de mieloma múltiple para detectar la presencia de DKK1. Las células plasmáticas en estos casos contenían DKK1 de un modo coherente con los datos de expresión génica (figura 39). En los experimentos similares con biopsias de 5 donantes normales no se logró identificar a DKK1 en ninguna célula. Hubo una fuerte tendencia a que los mielomas positivos para DKK1 tuvieran una morfología de grado bajo (abundante citoplasma sin nucléolos evidentes) con un patrón de crecimiento intersticial. Esta tinción se encontró que era mayor en las células plasmáticas adyacentes al hueso. Los mielomas negativos para DKK1 tienden a llevar una morfología de alto grado (aumento de los núcleos y nucléolos prominentes) con un patrón de crecimiento nodular o destructivo. En las biopsias con un patrón de crecimiento intersticial, DKK1 estaba o bien presente (en distintos porcentajes de células) o bien ausente. Por el contrario, en los mielomas con los patrones de crecimiento nodular más agresivo, DKK1 estaba uniformemente ausente. Es importante destacar que en los casos con un crecimiento intersticial y nodular, las células intersticiales eran positivas y las células nodulares negativas.

EJEMPLO 16

Proteína DKK1 en el plasma de la médula ósea

Un inmunoensayo enzimático (ELISA) mostró que la concentración de la proteína DKK1 en el plasma de médula ósea de 107 de los 173 pacientes con mieloma múltiple recién diagnosticado para los cuales los datos de expresión génica también estaban disponibles era de 24,02 ng/ml (D.E. 49,58). Por el contrario, DKK1 era de 8,9 ng/ml (D.E. 4,2) en 14 donantes sanos normales, 7,5 ng/ml (D.E. 4,5) en 14 casos de GMSI, y 5,5 ng/ml (D.E. 2,4) en 9 casos de macroglobulinemia de Waldenström. La expresión del gen DKK1 y la cantidad de DKK1 en el plasma de la médula ósea estaban correlacionados positivamente (r = 0,65, p < 0,001) en los 107 casos de mieloma (figura 40A). También hubo una fuerte correlación entre la cantidad de proteína DKK1 en el plasma de la médula ósea y en el plasma de la sangre

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periférica en 41 casos de mieloma en los que ambas muestras se tomaron simultáneamente (r = 0,57, p < 0,001).

En 68 pacientes en los que se determinó la conentración de la proteína DKK1 en el plasma de la médula ósea y la presencia de lesiones óseas, la proteína DKK1 en los pacientes con 1+ lesiones en la RMN y ninguna lesión en los rayos X difiere significativamente de la observada en los pacientes sin ninguna lesión en la RMN ni en los rayos X (mediana de la concentración: 20 ng/ml frente a 9 ng/ml; p = 0,002), pero no difiere significativamente de la observada en los pacientes con 1+ lesiones en la RMN y 1+ lesiones en los rayos X (mediana de la concentración: 20 ng/ml frente a 14 ng/ml; p = 0,36) (figura 40B, tabla 2).

EJEMPLO 17

Efecto del suero de la médula ósea sobre la diferenciación de los osteoblastos in vitro

La proteína 2 morfogénica del hueso puede inducir la diferenciación de la estirpe de células progenitoras mesenquimatosas no comprometida C2C12 (Katagiri et al., 1994) en osteoblastos a través de un mecanismo que implica la señalización de Wnt/β-catenina (Bain et al., 2003; Roman-Roman et al., 2002). La fosfatasa alcalina, un marcador específico de la diferenciación de los osteoblastos, era indetectable en las células C2C12 cultivadas en suero de ternera fetal al 5% durante 5 días (figura 41A). El tratamiento de las células C2C12 con 50 ng/ml de BMP-2 durante 5 días las indujo a producir fosfatasa alcalina, mientras que la fosfatasa alcalina no se produjo en las células C2C12 que se cultivaron a la vez con BMP-2 y 50 ng/ml de DKK1 humana recombinante. Este efecto in vitro sobre la producción de la fosfatasa alcalina fue neutralizado por un anticuerpo policlonal anti-DKK1, pero no por una IgG de cabra policlonal inespecífica. El suero de médula ósea con una concentración de DKK1 > 12 ng/ml de cinco pacientes con mieloma inhibió la producción de la fosfatasa alcalina en las células C2C12 tratadas con BMP-2, y este efecto se revirtió con el anticuerpo anti-DKK1, pero no por la IgG inespecífica (figura 41B). Por el contrario, en las células C2C12 tratadas con 50 ng/ml de BMP-2 y suero al 10% de la médula ósea de un donante normal se indujo la producción de la fosfatasa alcalina (figura 41B).

Las siguientes referencias se citaron en la presente memoria:

Zhan et al., «Global gene expression profiling of multiple myeloma, monoclonal gammopathy of undetermined significance, and normal bone marrow plasma cells». Blood 99: 1745-1757 (2002).

Zhan et al, «Gene expression profiling of human plasma cell differentiation and classification of multiple myeloma based on simillarities to distinct stages of late-stage B-cell development». Blood 101: 1128-1140 (2003).

Fedi et al.«Isolation and biochemical characterization of the human Dkk-1 homologue, a novel inhibitor of mammalian Wnt signaling». J, Biol. Chem. 274: 19465-72 (1999).

Gallea et al., Bone 28: 491-8 (2001).

Spinella-Jaegle et al., Bone 29: 323-30 (2001).

Westfall y Young. «Resampling-based multiple testing: Examples and methods for p-value adjustment.» Hoboken, NJ: Wiley-Interscience, 360 (1993).

Golub et al. Science 286: 531-7 (1999)

Katagiri et al. J. Cell. Biol. 127: 1755-66 (1994).

Bain et al. Biochem Biophys Res Commun 301: 84-91 (2003).

Roman-Roman et al. American Society of Bone Mineral Research, 2002.

Cualquiera de las patentes o publicaciones mencionadas en esta memoria son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica al que pertenece la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Método ex vivo para determinar el potencial de desarrollar una osteopatía lítica en un paciente con mieloma múltiple, comprendiendo el método la etapa de:

examinar el nivel de expresión del homólogo humano de Dickkopf-1 (DKK1) en una muestra corporal ex vivo,5 caracterizada por que el aumento de la expresión de DKK1 en comparación con la del individuo normal indica que el paciente tiene el potencial de desarrollar una osteopatía lítica.
2.- Método según la reivindicación 1, caracterizado por que el nivel de expresión se determina a nivel de ácido nucleico

o a nivel de proteína.
3.- Inhibidor de la expresión de la proteína 3 soluble relacionada con Frizzled (SFRP-3/FRZB) o del homólogo humano

10 de Dickkopf-1 (DKK1) para usar en el tratamiento de la osteopatía lítica en un paciente con mieloma múltiple, caracterizado por que el inhibidor se selecciona entre oligonucleótidos antisentido de DKK1, anticuerpos anti-DKK1 o receptores solubles de la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas (LRP).
4.- Inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que la expresión de SFRP-3/FRZB o de DKK1 se inhibe a nivel de ácido nucleico o nivel de proteína.

15 5.- Inhibidor para uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado por que está inhibida la expresión del gen DKK1 con número de acceso NM_012242.
6.- Inhibidor farmacológico de la proteína DKK1 para uso en el tratamiento de una pérdida de hueso relacionada con neoplasia maligna en un paciente con cáncer de mama o con cáncer de próstata, caracterizado por que el inhibidor es un anticuerpo anti-DKK1 o receptor soluble de LRP.

20 7.- Inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que la pérdida de hueso relacionada con la neoplasia maligna se debe a la metástasis del cáncer de mama o del cáncer de próstata en el hueso.