ES2363700T3 - Composiciones y métodos para prolongar la supervivencia de plaquetas. - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas que comprende poner en contacto una población de plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano, CMP-ácido siálico, produciendo de esta manera una población de plaquetas modificadas que tienen residuos de glicano en superficie modificados en su extremo, en el que la población de plaquetas modificadas cuando se trasplantan en un mamífero puede circular en el mamífero durante al menos el mismo tiempo que las plaquetas no modificadas.

Description

Campo de la invención

Las invenciones se refieren a composiciones y métodos para reducir la eliminación de plaquetas transfundidas de la circulación en un mamífero, y prolongar la actividad biológica y supervivencia de las plaquetas transfundidas.

Antecedentes de la invención

Las plaquetas son células sanguíneas anucleadas derivadas de la médula ósea que evitan en mamíferos heridos pérdidas de sangre adhiriéndose a sitios de daño vascular y promoviendo la formación de coágulos de fibrina en el plasma. Los seres humanos con número reducido de plaquetas circulantes por fallo de la médula ósea padecen sangrados espontáneos que ponen en peligro su vida, y las deficiencias menos graves de plaquetas contribuyen a complicaciones de sangrado después de un traumatismo o una cirugía.

Una reducción en el número de plaquetas circulantes hasta por debajo de 70.000 por L supuestamente da como resultado una prolongación de una prueba de tiempo de sangrado cutáneo estandarizada, y el intervalo de sangrado se prolonga, extrapolando con tendencia a infinito, a medida que el recuento de plaquetas cae a cero. Se piensa que los pacientes con recuento de plaquetas de menos de 20.000 por L son altamente susceptibles a hemorragia espontánea de superficies mucosas, especialmente cuando la trombocitopenia está causada por fallo de la médula ósea y cuando los pacientes afectados sufren complicaciones con septicemia u otras agresiones. Las deficiencias plaquetarias asociadas con trastornos de la médula ósea tales como anemia aplásica, leucemias agudas y crónicas, cáncer metastásico pero especialmente que resultan de tratamientos para el cáncer con radiación ionizante y quimioterapia representan un importante problema de salud pública. La trombocitopenia asociada a cirugía mayor, daño y septicemia también deriva en administración de cantidades significativas de transfusiones de plaquetas.

Un avance principal en cuidados médicos hace medio siglo fue el desarrollo de transfusiones de plaquetas para corregir tales deficiencias plaquetarias, y más de 9 millones de transfusiones de plaquetas tuvieron lugar sólo en EE.UU. en 1999 (Jacobs y cols., 2001). Las plaquetas, sin embargo, a diferencia de todos los demás tejidos trasplantables, no toleran la refrigeración, debido a que desaparecen rápidamente de la circulación de los receptores si se someten incluso a periodos de enfriamiento muy cortos, y el efecto de refrigeración que acorta la supervivencia plaquetaria es irreversible (Becker y cols., 1973; Berger y cols., 1998).

La necesidad resultante de mantener estas células a temperatura ambiente antes de una transfusión ha impuesto un conjunto único de costosos y complejos requerimientos logísticos para el almacenamiento de plaquetas. Debido a que las plaquetas son metabólicamente activas a temperatura ambiente, se requiere una agitación constante en recipientes porosos para permitir la liberación del CO2 producido para evitar las consecuencias tóxicas de la acidosis metabólica. Las condiciones de almacenamiento a temperatura ambiente dan como resultado la degradación macromolecular y una reducción en las funciones hemostáticas de las plaquetas, un grupo de defectos conocidos como "la lesión del almacenamiento" (Chemoff y Snyder, 1992). Pero el problema principal con el almacenamiento a temperatura ambiente, que conduce a su limitación corta (5 días), es el alto riesgo de infección bacteriana. Actualmente, la contaminación bacteriana de los componentes de la sangre es la complicación infecciosa del uso de componentes de la sangre más frecuente, superando con mucho la producida por agentes virales (Engelfriet y cols., 2000). En EE.UU. se dan anualmente 3000-4500 casos de septicemia bacteriana debido a componentes sanguíneos contaminados por bacterias (Yomtovian y cols., 1993).

El mecanismo que subyace en la intolerancia única e irreversible al frío de plaquetas ha sido un misterio como lo ha sido su significado fisiológico. Las plaquetas circulantes son discos de superficie lisa que se convierten en formas complejas al reaccionar ante un daño vascular. Hace más de 40 años, los investigadores notificaron que las plaquetas discoidales también cambian de forma a temperaturas de refrigeración (Zucker y Borrelli, 1954). La subsiguiente prueba de que una forma discoidal era el mejor vaticinador de viabilidad para plaquetas almacenadas a temperatura ambiente (Schlichter y Harker, 1976) condujo a la conclusión de que el cambio de forma inducido por frío per se era responsable de la eliminación rápida de las plaquetas enfriadas. Presumiblemente las plaquetas con forma irregular deformadas por enfriamiento quedaban atrapadas en la microcirculación.

Basándose en los estudios que relacionaban la señalización con los mecanismos que conducen a los cambios en la forma de las plaquetas inducidos por ligandos, Hartwig y cols., 1995 predijeron que enfriar, inhibiendo la extrusión de calcio, podría elevar los niveles de calcio hasta un grado consistente con la activación de la proteína gelsolina, que corta los filamentos de actina y recubre los extremos positivos de los filamentos de actina. También argumentaron que una transición de fase de lípidos de membrana a temperaturas bajas agruparía los fosfoinosítidos. El agrupamiento de fosfoinosítidos elimina el recubrimiento de los extremos positivos de los filamentos de actina (Janmey y Stossel, 1989) para crear sitios de nucleación para el alargamiento de los filamentos. Aportaron pruebas experimentales para ambos mecanismos, documentando la activación de la gelsolina, la eliminación del recubrimiento de los extremos positivos de los filamentos de actina, y el ensamblaje de la actina en plaquetas enfriadas (Hoffmeister y cols., 2001; y Winokur y Hartwig, 1995). Otros habían informado de cambios espectroscópicos en plaquetas enfriadas consistentes con una transición de fase de membrana (Tablin y cols., 1996). Esta información sugirió un método para mantener la forma discoidal de las plaquetas enfriadas, usando un quelante de calcio permeable a las células para inhibir el aumento de calcio y citocalasina B para evitar el ensamblaje de la actina de extremos positivos. Aunque la adición de estos agentes mantuvo las plaquetas con forma discoidal a 4ºC (Winokur y Hartwig, 1995), tales plaquetas también se eliminan rápidamente de la circulación. Por lo tanto, permanece el problema de la eliminación rápida de las plaquetas enfriadas y son necesarios métodos para aumentar el tiempo de circulación así como el tiempo de almacenamiento para plaquetas.

El documento WO2004/043381 describe composiciones o métodos para reducir la eliminación de plaquetas, prolongar el tiempo de circulación y aumentar el tiempo de almacenamiento de las plaquetas poniéndolas en contacto con al menos un agente modificador de glicano. Mester y cols., Erythrocytes Thrombocytes, Leukocytes, INT. SYMP. 2ª fecha de reunión 1972, 257-62, EDITORS GERLACH, E. PUBLISHER: GEORG THIEME, GER. CODEN 27EEAB, 1973, describe estudios que evalúan el efecto de sialilación en la agregación de plaquetas inducida por serotonina y ADP.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona plaquetas con glicanos modificados que tienen una reducción en la incidencia de eliminación de plaquetas después de un trasplante y métodos para reducir la eliminación de plaquetas observada en un receptor de trasplante plaquetario heterólogo. También se proporcionan composiciones y métodos para la conservación y el almacenamiento de plaquetas, tales como plaquetas de mamíferos, particularmente plaquetas humanas.

Se ha descubierto ahora que el enfriamiento de plaquetas humanas causa la agrupación de complejos de subunidad  del complejo receptor (GP1b) del factor von Willebrand (vWf) en la superficie de las plaquetas. La agrupación de complejos de GP1b en la superficie de las plaquetas provoca el reconocimiento por receptores del complemento para macrófagos tipo tres (M2, CR3) in vitro e in vivo. Los receptores CR3 reconocen azúcares N-ligados con GlcNAc terminales en la superficie de las plaquetas, que han formado complejos GP1b, y fagocitan las plaquetas, eliminándolas de la circulación y dando como resultado una pérdida concomitante de la función hemostática.

Los solicitantes han descubierto que el tratamiento de plaquetas con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano CMP-ácido siálico o una mezcla de CMP-ácido siálico o UDP-galactosa conduce a la sialilación o glicación de los residuos de GlcNAc expuestos en GP1b, con el efecto de mejorar o reducir sustancialmente los defectos por daño por almacenamiento en las plaquetas tratadas. Las cantidades eficaces de un agente modificador de glicano varían de aproximadamente 1 micromolar a aproximadamente 10 milimolar, de aproximadamente 1 micromolar a aproximadamente 1 milimolar y, lo más preferentemente, de aproximadamente 200 micromolar a aproximadamente 600 micromolar del agente modificador de glicano. Esto tiene el efecto funcional de reducir los defectos por daño por almacenamiento, reducir la eliminación de plaquetas en un mamífero después de una transfusión, bloquear la fagocitosis plaquetaria, aumentar el tiempo de circulación de las plaquetas, y aumentar tanto el tiempo de almacenamiento de las plaquetas como la tolerancia a los cambios en la temperatura en las muestras recogidas para transfusión. Adicionalmente, las plaquetas tomadas de un mamífero para trasplante heterólogo o autólogo se puede almacenar en frío durante periodos prolongados, es decir, a 4 grados C durante 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, 12 días o 20 días o más, sin pérdida significativa de la función hemostática después del trasplante. El almacenamiento en frío proporciona una ventaja que inhibe el crecimiento de microorganismos contaminantes en la preparación de plaquetas, importante ya que las plaquetas se suministran típicamente a pacientes con cáncer y a otros pacientes inmunocomprometidos. Las plaquetas tratadas almacenadas a temperatura ambiente también demuestran una mejora o una reducción sustancial en los defectos por daño por almacenamiento durante un periodo de tiempo mayor en relación con plaquetas no tratadas. Las plaquetas tratadas mantienen su funcionalidad biológica durante periodos de tiempo más largos que las plaquetas no tratadas y son adecuadas para trasplantes autólogos o heterólogos, al menos un día, tres días, cinco días, o incluso siete días o más después de la recogida.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporcionan métodos para aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas, y comprenden poner en contacto una población de plaquetas aislada con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano de acuerdo con la reivindicación 1. En algunas realizaciones preferidas, una cantidad eficaz del agente modificador de glicano UDP-galactosa, también se pone en contacto con las plaquetas, ex vivo.

En algunas realizaciones, el método para aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas comprende adicionalmente enfriar la población de plaquetas antes, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el al menos un agente modificador de glicano.

En algunas realizaciones, la población de plaquetas retiene sustancialmente actividad hemostática normal.

En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto la población de plaquetas con al menos un agente modificador de glicano se lleva a cabo en una bolsa de plaquetas.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para aumentar el tiempo de almacenamiento de plaquetas, y comprende poner en contacto una población de plaquetas aislada con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano de acuerdo con la reivindicación 8. Las cantidades eficaces de un agente modificador de glicano varían de aproximadamente 1 micromolar a aproximadamente 1200 micromolar y, lo más preferentemente, de aproximadamente 200 micromolar a aproximadamente 600 micromolar del agente modificador de glicano. En ciertos aspectos la preparación de plaquetas se almacena a temperaturas bajas, es decir, congelado

o refrigerado.

En algunas realizaciones, el método comprende además enfriar la población de plaquetas antes, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el al menos un agente modificador de glicano.

En algunas realizaciones, la población de plaquetas mantiene sustancialmente la actividad hemostática normal cuando se trasplantaron en un mamífero. Así, en otras realizaciones, los glicanos añadidos a la preparación de plaquetas durante el almacenamiento se mantienen a una concentración alta, por ejemplo, 100-10000 micromolar, y se reducen antes del trasplante.

En ciertas realizaciones, la etapa de poner en contacto la población de plaquetas con al menos un agente modificador de glicano se lleva a cabo durante la recogida de sangre completa o la recogida de las plaquetas. En ciertas realizaciones, el agente modificador de glicano se introduce dentro de un bolsa de plaquetas antes, simultáneamente con, o después de la recogida de las plaquetas.

Las plaquetas se pueden almacenar a temperaturas reducidas, por ejemplo congeladas o enfriadas, y se pueden almacenar durante periodos de tiempo prolongados, tal como al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 21 días o al menos aproximadamente 28 días.

En diversas otras realizaciones, las plaquetas tratadas se almacenan a temperatura ambiente. El tratamiento con agentes modificadores de glicano conserva la población de plaquetas, es decir, mejora la función hemostática de la población de plaquetas después de un trasplante en un mamífero y reduce la incidencia de lesiones por almacenamiento en plaquetas almacenadas a temperatura ambiente, cuando se compara con muestras de plaquetas no tratadas durante un periodo de tiempo después del tratamiento. Las muestras del plaquetas tratadas almacenadas a temperatura ambiente son así adecuadas para trasplantes autólogos o heterólogos durante periodos de tiempo prolongados, tales como al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 21 días o al menos aproximadamente 28 días.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una plaqueta modificada de acuerdo con la reivindicación 15.

El azúcar nucleótido añadido es CMP-ácido siálico, o tanto CMP-ácido siálico como UDP-galactosa.

En algunas realizaciones, las moléculas de glicano terminales modificadas así, son moléculas GP 1b. Las plaquetas modificadas comprenden de este modo estructuras de glicano con moléculas GP1b terminales, que después del tratamiento tienen galactosa terminal o ácido siálico unido a las moléculas de GP1b. El azúcar añadido puede ser un azúcar natural o puede ser un azúcar no natural. Ejemplos de azúcares añadidos incluyen pero no se limitan a: azúcares nucleótidos tales como UDP-galactosa y precursores de UDP-galactosa. En una de las realizaciones preferidas, el azúcar nucleótido añadido es CMP-ácido siálico o UDP-galactosa.

Una composición de plaquetas puede comprender una pluralidad de plaquetas modificadas de la invención. La composición de plaquetas puede comprender además un medio de almacenamiento, o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la población de plaquetas demuestra una actividad hemostática sustancialmente normal, preferentemente después del trasplante en un mamífero.

En ciertas realizaciones, la etapa de poner en contacto la población de plaquetas con al menos un agente modificador de glicano se lleva a cabo durante el proceso de recogida en sangre completa o sangre fraccionada, tal como en plaquetas en una bolsa de plaquetas.

En algunas realizaciones, la preparación de plaquetas se almacenó a una temperatura de menos de aproximadamente 15ºC, preferentemente menos de 10ºC, y más preferentemente menos de 5ºC. En algunas otras realizaciones, la preparación de plaquetas se almacenó a temperatura ambiente. En otras realizaciones, las plaquetas se congelan, por ejemplo, a 0ºC, -20ºC, o -80ºC o a más frío.

La invención incluye un kit que tiene un recipiente estéril que puede recibir y contener una población de plaquetas, recipiente que está sustancialmente cerrado al ambiente, y una cantidad estéril de al menos un agente modificador de glicano CMP-ácido siálico suficiente para modificar un volumen de plaquetas recogido y almacenado en el recipiente, el kit incluye además materiales de envasado adecuados e instrucciones de uso. El recipiente es adecuado para almacenamiento de plaquetas en frío.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra una realización de la invención en la que se describe un bioproceso para recolectar, tratar y almacenar plaquetas. Las plaquetas derivan de una diversidad de fuentes de sangre, incluyendo IRDP (plaquetas de donantes aleatorios individuales), PRDP (plaquetas de un conjunto de donantes aleatorios) y SDP (plaquetas de un único donante). El recipiente que tiene el agente modificador de glicano, por ejemplo una solución de UDP-Gal y/o CMP-NeuAc, está acoplado de forma estéril a la bolsa que contiene las plaquetas. Un acoplamiento estéril también se denomina dispositivo de conexión estéril (SCD) o dispositivo de contención total (TCD). El acoplamiento estéril permite la conexión de dos piezas de conducto manteniendo mientras la esterilidad del sistema. El agente modificador de glicano se mezcla con las plaquetas y después las plaquetas modificadas se transfirieren a una bolsa no transpirable a través de un filtro de leucocitos. Los métodos de separación por lana de vidrio o por afinidad para retirar fracciones de leucocitos de la sangre completa son conocidos en la técnica, y proporcionan ejemplos de medios para filtrar los leucocitos de las plaquetas.

La figura 2 ilustra una realización 2 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 3 ilustra una realización 3 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 4 ilustra una realización 4 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 5 ilustra una realización 5 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 6 ilustra una realización 6 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 7 ilustra una realización 7 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 8 ilustra una realización 8 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 9 ilustra una realización 9 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 10 ilustra una realización 10 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 11 ilustra una realización 11 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 12 ilustra una realización 12 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 13 ilustra una realización 13 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 14 ilustra una realización 14 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 15 ilustra una realización 15 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 16 ilustra una realización 16 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 17 ilustra una realización 17 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 18 ilustra una realización 18 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 19 ilustra una realización 19 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 20 ilustra una realización 20 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 21 ilustra una realización 21 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 22 ilustra una realización 22 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 23 ilustra una realización 23 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 24 ilustra una realización 24 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 25 ilustra una realización 25 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 26 ilustra una realización 26 no limitante de la invención en la que se describe un bioproceso para recoger, tratar y almacenar plaquetas.

La figura 27 ilustra que las plaquetas contienen una sialiltransferasa endógena intracelular y extracelular.

La figura 28 ilustra que la actividad sialiltransferasa plaquetaria endógena cataliza la elongación de -galactosa expuesta en plaquetas por la adición única del sustrato donante CMP-ácido siálico.

La figura 29 ilustra que las plaquetas con ácido siálico reducido se eliminan rápidamente in vivo como se demuestra por la eliminación de plaquetas ST3GalIV -/- en ratones ts.

La figura 30 ilustra que la glicosilación mejora la circulación de plaquetas no enfriadas.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona una población de plaquetas modificadas que tienen propiedades de circulación mejoradas y que mantienen una actividad hemostática sustancialmente normal in vivo. La actividad hemostática se refiere de forma general a la capacidad de una población de plaquetas para mediar el cese del sangrado. Diversos ensayos están disponibles para determinar la actividad hemostática plaquetaria (Bennett, J. S. y Shattil, S. J., 1990, "Platelet function", Hematology, Williams, W. J., y cols., Eds. McGraw Hill, páginas 1233-12250). Sin embargo, la demostración de "hemostasis" o "actividad hemostática" requiere en última instancia una demostración de que las plaquetas infundidas en un ser humano o un animal trombocitopénico o trombopático (es decir, plaquetas no funcionales) circulan y paran el sangrado natural o inducido experimentalmente.

Para llevar a cabo dicha demostración, los laboratorios usan pruebas in vitro como sustitutos para determinar la actividad hemostática. Estas pruebas, que incluyen ensayos de agregación, secreción, morfología plaquetaria y cambios metabólicos, miden una amplia diversidad de respuestas funcionales plaquetarias a la activación. Se acepta generalmente en la técnica que las pruebas in vitro son indicadores razonables de función hemostática in vivo.

La actividad hemostática sustancialmente normal se refiere a una cantidad de actividad hemostática observada en las plaquetas modificadas, que es funcionalmente equivalente o sustancialmente similar a la actividad hemostática de plaquetas no tratadas in vivo, en un individuo sano (mamífero no trombocitopénico o no trombopático) o funcionalmente equivalente o sustancialmente similar a la actividad hemostática de una población de plaquetas recién aislada in vitro.

La presente invención proporciona métodos para almacenamiento a temperatura reducida de plaquetas que aumenta el tiempo de almacenamiento de las plaquetas, así como métodos para reducir la eliminación de o aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas en un mamífero. También se proporcionan métodos para composiciones de plaquetas y composiciones para la conservación de plaquetas con actividad hemostática conservada, así como métodos para fabricar una composición farmacéutica que contiene las plaquetas conservadas y para administrar la composición farmacéutica a un mamífero para mediar la hemostasis. También se proporcionan kits para tratar una preparación de plaquetas para su almacenamiento y recipientes para almacenar la misma.

En un aspecto de la invención, el método para aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas aislada implica poner en contacto una población de plaquetas aislada con al menos un agente modificador de glicano en una cantidad eficaz para reducir la eliminación de la población de plaquetas. Como se usa en el presente documento, una población de plaquetas se refiere a una muestra que tiene una o más plaquetas. Una población de plaquetas incluye un concentrado de plaquetas. El término “aislado” quiere decir separado de su ambiente nativo y presente en cantidad suficiente para permitir su identificación o uso. Como se usa en el presente documento con respecto a una población de plaquetas, aislado quiere decir retirado o eliminado de la circulación sanguínea de un mamífero. El tiempo de circulación de una población de plaquetas se define como el tiempo en el que una mitad de las plaquetas de esa población deja de circular en un mamífero después del trasplante en ese mamífero. Como se usa en el presente documento, "eliminación" quiere decir la retirada de las plaquetas modificadas de la circulación sanguínea de un mamífero (tal como, pero sin limitarse a fagocitosis por macrófagos). Como se usa en el presente documento, la eliminación de una población de plaquetas se refiere a la retirada de una población de plaquetas a partir de una unidad de volumen de sangre o suero por unidad de tiempo. Reducir la eliminación de una población de plaquetas se refiere a evitar, retardar o reducir la eliminación de la población de plaquetas. Reducir la eliminación de plaquetas también puede querer decir reducir la velocidad de eliminación de plaquetas.

Un agente modificador de glicano se refiere a un agente que modifica residuos de glicano en la plaqueta. Como se usa en el presente documento, un "glicano" o "residuo de glicano" es un resto polisacárido en la superficie de la plaqueta, ejemplificado mediante el polisacárido GP1b. Un residuo de glicano o glicano "terminal" es el glicano en el extremo distal del polisacárido, que típicamente está unido a polipéptidos en la superficie de la plaqueta. Preferentemente, el agente modificador de glicano altera GP1b sobre la superficie de la plaqueta.

El agente modificador de glicano es CMP-ácido siálico.

Opcionalmente, mezclado con UDP galactosa.

UDP-galactosa es un intermedio del metabolismo de la galactosa, formado por la enzima UDP-glucosa--Dgalactosa-1-fosfato uridililtransferasa que cataliza la liberación de glucosa-1-fosfato de UDP-glucosa en intercambio por galactosa-1-fosfato para fabricar UDP-galactosa. La UDP-galactosa y el ácido siálico están ampliamente disponibles a partir de varios suministradores comerciales tales como Sigma. Además, los métodos para la síntesis y producción de UDP-galactosa se conocen bien en la técnica y se describen en la bibliografía (véase por ejemplo, Liu y cols., ChemBioChem 3, 348-355, 2002; Heidlas y cols., J. Org. Chem. 57, 152-157; Butler y cols., Nat. Biotechnol. 8, 281-284, 2000; Koizumi y cols., Carbohydr. Res. 316, 179-183, 1999 ; Endo y cols., Appl. Microbiol., Biotechnol. 53, 257-261, 2000). Los precursores de UDP-galactosa son moléculas, compuestos o compuestos intermedios que se pueden convertir (por ejemplo, enzimática o bioquímicamente) en UDP-galactosa. Un ejemplo no limitante de un precursor de UDP-galactosa es UDP-glucosa. En ciertas realizaciones, una enzima que convierte un precursor de UDP-galactosa en UDP-galactosa se añade a una mezcla de reacción (por ejemplo en un recipiente de plaquetas).

Una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano es la cantidad del agente modificador de glicano que altera un número suficiente de residuos de glicano sobre la superficie de las plaquetas, que cuando se introduce en una población de plaquetas, aumenta el tiempo de circulación y/o reduce la eliminación de la población de plaquetas en un mamífero después del trasplante de las plaquetas en el mamífero. Una cantidad efectiva de un agente modificador de glicano es una concentración de aproximadamente 1 micromolar a aproximadamente 1200 micromolar, preferentemente de aproximadamente 10 micromolar a aproximadamente 1000 micromolar, más preferentemente de aproximadamente 100 micromolar a aproximadamente 750 micromolar, y lo más preferentemente de aproximadamente 200 micromolar a aproximadamente 600 micromolar.

La modificación de plaquetas con agentes modificadores de glicano se puede llevar a cabo como sigue. La población de plaquetas se incuba con el agente modificador de glicano seleccionado (concentraciones de 1-1200 M) durante al menos 1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 120, 180, 240 o 300 min. a 22ºC-37ºC. Múltiples agentes modificadores de glicano (es decir, dos, tres cuatro o más) se pueden usar simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, 0,1-500 mU/ml de galactosa transferasa o sialil transferasa se añaden a la población de plaquetas. La transferencia de galactosa se puede monitorizar funcionalmente usando una unión a FITC-WGA (aglutinina de germen de trigo). El objetivo de la reacción de modificación de glicano es reducir la unión a WGA hasta niveles de unión a WGA en reposo a temperatura ambiente. La transferencia de galactosa se puede cuantificar usando 14CUDP-galactosa. La UDP-galactosa no radiactiva se mezcla con 14C-UDP-galactosa para obtener la transferencia adecuada de galactosa. Las plaquetas se lavan abundantemente, y la radiactividad incorporada se mide usando un contador γ. La cpm medida permite el cálculo de la galactosa incorporada. Técnicas similares son aplicables para monitorizar la transferencia de ácido siálico.

Reducir la eliminación de una plaqueta comprende reducir la eliminación de plaquetas después del almacenamiento a temperatura ambiente, o después del enfriamiento, así como la "activación plaquetaria inducida por frío". La activación plaquetaria inducida por frío es una expresión que tiene un significado concreto para un experto en la técnica. La activación plaquetaria inducida por frío puede manifestarse por cambios en la morfología de las plaquetas, algunos de los cuales son similares a los cambios que se producen después de la activación plaquetaria mediante, por ejemplo, contacto con vidrio. Los cambios estructurales que indican la activación plaquetaria inducida por frío se identifican más fácilmente usando técnicas tales como microscopía óptica o electrónica. En una escala molecular, la activación plaquetaria inducida por frío da como resultado la formación de haces de actina y un subsiguiente aumento en la concentración de calcio intracelular. La formación de haces de actina se detecta usando, por ejemplo, microscopía electrónica. Un aumento en la concentración de calcio intracelular se determina, por ejemplo, empleando quelantes de calcio fluorescentes en el medio intracelular. Muchos de los quelantes anteriormente descritos para inhibir el corte de filamentos de actina también son útiles para determinar la concentración de calcio intracelular (Tsien, R, 1980, supra). De acuerdo con ello, diversas técnicas están disponibles para determinar si las plaquetas han experimentado activación inducida por frío o no.

El efecto de la adición de ácido siálico o de ácido siálico/galactosa a los restos de glicano en plaquetas, dando como resultado la eliminación disminuida de plaquetas modificadas, puede medirse por ejemplo usando bien un sistema in vitro empleando células THP-1 diferenciadas o macrófagos murinos, aislados a partir de la cavidad peritoneal después de estimulación por inyección de tioglicolato. Se determina la velocidad de eliminación de plaquetas modificadas en comparación con plaquetas no modificadas. Para someter a prueba las velocidades de eliminación, las plaquetas modificadas se suministran a los macrófagos y se monitoriza la ingestión de las plaquetas por los macrófagos. La ingestión reducida de plaquetas modificadas en relación con plaquetas no modificadas (el doble o más) indica una modificación exitosa del resto glicano para los propósitos descritos en el presente documento.

De acuerdo con la invención, la población de plaquetas modificadas se puede enfriar sin los efectos perjudiciales (activación plaquetaria inducida por frío) experimentados normalmente en el enfriamiento de plaquetas no tratadas. La población de plaquetas modificadas se puede enfriar antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el al menos un agente modificador de glicano. La modificación selectiva de restos de glicano reduce la eliminación después del enfriamiento (también si no se enfrían), permitiendo así un almacenamiento a más largo plazo que el que es posible actualmente. Como se usa en el presente documento, enfriar se refiere a disminuir la temperatura de la población de plaquetas hasta una temperatura que es menor de aproximadamente 37ºC. En algunas realizaciones, las plaquetas se enfrían a una temperatura que es menor de aproximadamente 15ºC. En algunas realizaciones preferidas, las plaquetas se enfrían hasta una temperatura que varía desde entre aproximadamente 0ºC a aproximadamente 4ºC. Enfriar también engloba congelar la preparación de plaquetas, es decir, hasta temperaturas menores de 0ºC, -20ºC, -50ºC y -80ºC o más frías. Los procesos para la criopreservación de células son bien conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, la población de plaquetas se almacena enfriada durante al menos 3 días. En algunas realizaciones, la población de plaquetas se almacena enfriada durante al menos 5, 7, 10, 14, 21 y 28 días o más.

En algunas realizaciones de la invención, el tiempo de circulación de la población de plaquetas se aumenta en al menos aproximadamente un 10%. En algunas otras realizaciones, el tiempo de circulación de la población de plaquetas se aumenta en al menos aproximadamente un 25%. En algunas otras realizaciones más, el tiempo de circulación de la población de plaquetas se aumenta en al menos de aproximadamente un 50% a aproximadamente un 100%. En otras realizaciones más, el tiempo de circulación de la población de plaquetas se aumenta en aproximadamente un 150% o más.

La invención también abarca un método para aumentar el tiempo de almacenamiento de plaquetas. Tal como se usa en el presente documento, el tiempo de almacenamiento de plaquetas se define como el tiempo que las plaquetas se pueden almacenar sin pérdida sustancial de la función plaquetaria o actividad hemostática tal como la pérdida de la capacidad para circular o el aumento en la eliminación de plaquetas.

Las plaquetas se recogen de sangre periférica mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo por aislamiento a partir de sangre completa o mediante procesos de aféresis. En algunas realizaciones, las plaquetas están contenidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable antes del tratamiento con un agente modificador de glicano.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una plaqueta o población de plaquetas modificadas. La plaqueta modificada comprende una pluralidad de moléculas de glicano modificadas sobre la superficie de la plaqueta. En algunas realizaciones, los restos de glicano modificados son moléculas de GP1b. La invención también comprende una composición plaquetaria en un medio de almacenamiento. En algunas realizaciones, el medio de almacenamiento comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" quiere decir un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de las plaquetas y que es un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizadores, solubilizantes y otros materiales que se conocen bien en la técnica, por ejemplo, un tampón que estabiliza la preparación de plaquetas a un pH de 7,4, el pH fisiológico de sangre, es una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para usar con la presente invención.

La invención además proporciona un método para mediar la hemostasis en un mamífero. El método incluye administrar la preparación farmacéutica anteriormente descrita al mamífero. La administración de las plaquetas modificadas puede ser de acuerdo con métodos estándar conocidos en la técnica. De acuerdo con una realización, un paciente humano es transfundido con glóbulos rojos antes de, después de o durante la administración de las plaquetas modificadas. La transfusión de glóbulos rojos sirve para diluir las plaquetas modificadas administradas, neutralizando de esta forma el/los agente(s) modificador(es) de glicano y la(s) enzima(s) que catalizan la modificación del resto glicano.

El régimen de dosificación para mediar la hemostasis usando las plaquetas modificadas se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores, incluyendo el tipo, edad, peso, sexo y estado médico del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la vía y frecuencia de administración. Un médico o médico práctico puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de plaquetas modificadas requerida para mediar la hemostasis.

El régimen de dosificación puede determinarse, por ejemplo, siguiendo la respuesta al tratamiento en términos de signos clínicos y ensayos de laboratorio. Ejemplos de tales signos clínicos y ensayos de laboratorio se conocen bien en la técnica y se describen, véase, Harrison's Principles of Internal Medicine, 15ª ed., Fauci AS y cols., eds., McGraw-Hill, Nueva York, 2001.

En una realización, el/los agente(s) modificador(es) de glicano se pone(n) en contacto con las plaquetas en un sistema cerrado, por ejemplo un envase de plaquetas estéril sellado, para evitar contaminación microbiana. Típicamente, un conducto para venopunción es la única abertura del envase durante el aporte o transfusión de plaquetas. De acuerdo con ello, para mantener un sistema cerrado durante el tratamiento de las plaquetas con el/los agente(s) modificador(es) de glicano, el/los agente(s) se sitúa(n) en un recipiente estéril relativamente pequeño que está unido al envase de plaquetas a través de un tubo de conexión estéril (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.412.835, cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia). El tubo de conexión puede estar sellado reversiblemente, o tener un sellado rompible, como se conocerá por los expertos en la técnica. Después de que las plaquetas se concentren, por ejemplo permitiendo que las plaquetas se asienten y sacando el plasma fuera del envase primario y metiéndolo en una segunda bolsa de acuerdo con la práctica estándar, el sellado del/de los recipiente(s) que incluye(n) el/los agente(s) modificador(es) se abre y los agentes se introducen dentro del envase de plaquetas. En una realización, los agentes modificadores de glicano están contenidos en recipientes separados que tienen tubos de conexión resellables separados para permitir la adición secuencial de los agentes modificadores de glicano al concentrado de plaquetas.

Después del contacto con el/los agente(s) modificador(es) de glicano, las plaquetas tratadas se enfrían. En contraste con las plaquetas almacenadas a, por ejemplo, 22ºC, las plaquetas almacenadas a temperaturas de criopreservación tienen una actividad metabólica sustancialmente reducida. Así, las plaquetas almacenadas a 4ºC son metabólicamente menos activas y por lo tanto no generan grandes cantidades de CO2 en comparación con plaquetas almacenadas a, por ejemplo, 22ºC. (Slichter, S. J., 1981, Vox Sang 40 (Supl. 1), págs. 72-86, Clinical Testing and Laboratoy-Clinical correlations.). La disolución de CO2 en la matriz plaquetaria da como resultado una reducción del pH y una reducción concomitante en la viabilidad plaquetaria (Slichter, S., 1981, supra). Esto puede resolverse añadiendo tampones a la población de plaquetas, los tampones seleccionados para mantener la población de plaquetas al pH fisiológico de la sangre o cerca de él. Asimismo, los envases de plaquetas convencionales se hacen de materiales que están diseñados y construidos de un material suficientemente permeable para maximizar el transporte de gas al interior y al exterior del envase (O2 hacia el interior y CO2 al exterior). Las limitaciones de la técnica previa en el diseño y construcción de envases de plaquetas son obviados por la presente invención, que permite el almacenamiento de plaquetas a temperaturas de criopreservación, reduciendo así sustancialmente el metabolismo plaquetario y disminuyendo la cantidad de CO2 generada por las plaquetas durante el almacenamiento. De acuerdo con ello, la invención proporciona además recipientes de plaquetas que son sustancialmente no permeables a CO2 y/o O2, recipientes que son útiles en particular para el almacenamiento de plaquetas en frío. Tanto en las realizaciones permeables a gases como en las no permeables, la invención proporciona un recipiente de almacenamiento de sangre que contiene, una cantidad de agente modificador de glicano suficiente para modificar sustancialmente los carbohidratos de las plaquetas introducidas en él, de tal forma que las plaquetas se hacen aptas para el almacenamiento en frío y la subsiguiente circulación in vivo.

La presente invención también proporciona kits que se usan para la recogida, procesamiento y almacenamiento de plaquetas, incluyendo además materiales de envasado adecuados e instrucciones para usar el contenido del kit. Se prefiere que todos los reactivos y suministros del kit sean estériles, de acuerdo con las prácticas médicas estándar que implican el manejo y almacenamiento de sangre y productos sanguíneos. Los métodos para esterilizar el contenido del kit se conocen en la técnica, por ejemplo, etileno gaseoso, irradiación y similares. En ciertas realizaciones, el kit puede incluir suministros para venopunción y/o suministros de recogida de sangre, por ejemplo un set de aguja, solución para esterilizar la piel de un donante de plaquetas y la bolsa o recipiente para la recogida de sangre. Preferentemente, el recipiente está "cerrado", es decir, sustancialmente sellado respecto del entorno. Tales recipientes cerrados para recogida de sangre se conocen bien en la técnica, y proporcionan un medio para evitar la contaminación microbiana de la preparación de plaquetas contenida en ellos. Otras realizaciones incluyen kits que contienen suministros para la recogida de sangre y aféresis plaquetaria. Los kits pueden incluir además una cantidad del agente modificador de glicano, suficiente para modificar el volumen de plaquetas recogido y almacenado en el recipiente. En ciertas realizaciones, el kit incluye reactivos por modificar el glicano terminal de plaquetas con un segundo o tercer resto químico, por ejemplo para PEGilar las plaquetas recogidas. En otras realizaciones, el kit incluye un sistema de recogida de sangre que tiene un recipiente de almacenamiento de sangre en el que se proporciona el agente modificador de glicano dentro del recipiente en una cantidad suficiente para tratar el volumen de sangre o plaquetas alojadas por el recipiente. La cantidad de agente modificador de glicano dependerá del volumen del recipiente. Se prefiere que se proporcione el agente modificador de glicano en forma de una solución estéril no piógena, pero también puede suministrarse en forma de polvo liofilizado. Por ejemplo, se proporciona una bolsa de sangre que tiene una capacidad de 250 ml. Contenida en la bolsa de sangre hay una cantidad de UDP-Gal de forma que cuando se añaden 250 ml de sangre, la concentración final de UDP-Gal es aproximadamente 200 micromolar. Otras realizaciones contienen diferentes concentraciones de agentes modificadores de glicano, por ejemplo, pero no limitado a, cantidades que dan como resultado concentraciones finales de 10 micromolar a 10 milimolar, y preferentemente de 100 micromolar a 1 milimolar de los agentes modificadores de glicano. Otras realizaciones emplean combinaciones de agentes modificadores de glicano, por ejemplo, para provocar la sililación o galactosilación de glicoproteínas N-ligadas en productos sanguíneos introducidos en el interior del recipiente.

La invención será entendida con mayor profundidad mediante referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos, sin embargo, son meramente un intento de ilustrar las realizaciones de la invención y no deben interpretarse para limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Demostración de transferencia enzimática de ácidos siálicos de CMP-ácido siálico, a -galactosa expuesta en glicoconjugados plaquetarios catalizada por actividad sialiltransferasa plaquetaria endógena

Este ejemplo proporciona pruebas de que las plaquetas humanas contienen actividad sialiltransferasa endógena, que puede catalizar la transferencia de ácido siálico del CMP-ácido siálico a sustratos exógenos de peso molecular alto con residuos de -Galactosa expuestos así como a glicoconjugados endógenos en plaquetas. La modificación enzimática se puede lograr sin adición de sialiltransferasa exógena y mediante adición simple del sustrato donante CMP-ácido siálico solo.

Los estudios iniciales demostraron la presencia de actividad sialiltransferasa en lisados de plaquetas con detergente así como en la superficie de plaquetas no lisadas intactas. La actividad sialiltransferasa se estimó por medida in vitro de la transferencia de ácido siálico del sustrato donante CMP-[14]C-ácido siálico al sustrato aceptor de glicoproteínas de gran tamaño e impermeable asialofetuina.

Los autores de la presente invención sometieron a prueba la presencia de una actividad sialiltransferasa tanto en extractos de plaquetas como sobre la superficie de plaquetas no lisadas intactas. La actividad sialiltransferasa se estimó in vitro por la medida de la transferencia de ácido siálico del sustrato donante de carbohidratos CMP-ácido siálico, al sustrato aceptor de glicoproteínas de gran tamaño asialofetuina. La medida de la cantidad total de actividad sialiltransferasa se llevó a cabo usando un lisado de plaquetas con detergente como fuente de enzimas, mientras que la actividad sialiltransferasa localizada en la superficie se midió usando plaquetas no lisadas. Brevemente, las plaquetas recogidas mediante aféresis se separaron del plasma por centrifugación a 1200 x g durante 5 minutos y se lavaron dos veces en una solución de NaCl 140 mM, KCl 5 mM, citrato trisódico 12 mM, glucosa 10 mM, prostaglandina E y sacarosa 12,5 mM, pH 6,0. Las plaquetas lavadas se resuspendieron a una concentración de 5 x 108/ml en NaCl 140 mM, KCl 3 mM, MgCl2 0,5 mM, NaHCO3 5 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4. La lisis plaquetaria se hizo por lisis de 5X10e9 plaquetas en tampón de lisis (HEPES 25 mM-KOH (pH 7,4), MgCl2 10 mM, Tritón X-100 al 1% (Sigma), y 1 comprimido de EDTA-cóctel inhibidor libre de proteasa (Roche). La actividad en la lisis plaquetaria se analizó mediante ensayo enzimático estándar realizado en 100 L de mezclas de reacción que contienen HEPES-KOH 25 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, Triton X-100 al 0,25% (Sigma), y CMP-[14C]ácido siálico 250 M (14.000 cpm/nmol) (Amersham), y concentraciones variables del sustrato aceptor asialofetuina (0-3 mg/ml) (Sigma). Se usaron 2-10 L de lisis plaquetaria como fuente de enzimas. La mezcla de reacción total se incubó durante 1 hora a 37ºC. La cantidad de actividad de CMP-[14C] incorporada a la asialofetuina se evaluó después de la precipitación ácida mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio Whatman GF/C (Schwientek y cols., 1998, 4GAlT4). Como se vio, tanto las plaquetas lisadas (Panel A) como las plaquetas intactas (Panel B) catalizan la incorporación de ácido siálico en el sustrato aceptor asialofetuina en una forma dependiente de la concentración.

Tal como se muestra en la figura 27 tanto los extractos de plaquetas como las plaquetas intactas catalizan la transferencia de ácido siálico marcado con 14C en el sustrato aceptor asialofetuina de forma dependiente de la concentración. Esto demuestra que la actividad sialiltransferasa se encuentra en plaquetas y que esta actividad está disponible en plaquetas intactas para sustratos aceptores exógenos de gran tamaño, tales como asialofetuina, que no pueden atravesar la membrana de la plaqueta. Los resultados indican que al menos parte de la actividad sialiltransferasa detectada en plaquetas está asociada con la membrana celular y que es funcional en la superficie de la plaqueta intacta.

Con el sorprendente hallazgo de que las plaquetas contienen actividad sialiltransferasa activa en la membrana de superficie, los autores de la presente invención sometieron a prueba después si esta actividad podría actuar sobre las glicoproteínas de membrana endógenas que expresan potencialmente glicanos sialilados incompletos. La transferencia de ácidos siálicos a glicoproteínas endógenas por actividad sialiltransferasa plaquetaria se analizó de dos maneras. Los lisados de plaquetas se usaron para someter a prueba la capacidad de la actividad sialiltransferasa total en plaquetas para transferir a las glicoproteínas totales que se encuentran en plaquetas. Las plaquetas intactas suspendidas en el tampón (NaCl 140 mM, KCl 3 mM, MgCl2 0,5 mM, NaHCO3 5 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4) se usaron para evaluar la capacidad de la actividad sialiltransferasa expuesta en superficie para transferir a glicoproteínas de membrana plaquetaria. Los experimentos se diseñaron también para determinar si la galactosilación previa de residuos GlcNAc expuestos sería necesaria para formar los glicanos terminales de galactosa apropiados que sirven como sustratos para la actividad sialitransferasa identificada. Previamente, se demostró que las plaquetas, especialmente después de ser enfriadas, expresaron cantidades significativas de GlcNAc (Hoffmeister y cols., Science 2003). Así, fue posible utilizar tres estrategias de modificación de glicano diferentes: adición de 1) UDP-[14C]-galactosa, 2) UDP-[14C]-galactosa y CMP[14C]-ácido siálico, y 3) CMP[14C]-ácido siálico solo. La incorporación de nucleótidos azúcares radiactivos se monitorizó mediante cromatografía en SDSPAGE seguida por autorradiografía.

La incorporación de ácido siálico con carbohidrato radiactivo en proteínas aceptoras de plaquetas endógenas se evaluó incubando plaquetas lisadas con detergente o bien plaquetas no lisadas con CMP-[14C]-siálico. La incorporación de 14C-ácido siálico se monitorizó mediante cromatografía en SDS-PAGE de la mezcla de glicosilación seguida por autorradiografía. Brevemente, las plaquetas de aféresis humana se lavaron y se resuspendieron en tampón de resuspensión (NaCl 40 mM, KCl 3 mM, MgCl2 0,5 mM, NaHCO3 5 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4) y se dividen en dos fracciones. Una fracción se incubó con adición de CMP-[14C]-ácido siálico a 37ºC durante 60 minutos. La otra fracción se lisó (como se describe anteriormente en la figura 67) y se incubó en tampón de glicosilación (como se describe anteriormente en la figura 67) y CMP[14C]-ácido siálico durante 60 minutos. Los productos de la incubación se disolvieron en tampón Laemlli y se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de PVDF (Millipore. Bedford. MA. EE.UU.) seguido por autorradiografía (Autoradiography film. Denville Inc.). Como se vio, el ácido siálico marcado con 14C se incorporó en proteínas de superficie en plaquetas intactas. La incubación con CMP-[14C]-ácido siálico solo o en combinación con UDP-[14C]-galactosa produjo un grado similar de incorporación, indicando que principalmente la galactosa está expuesta en la superficie de plaquetas. En los lisados de plaquetas los autores de la presente invención encontraron un claro efecto aditivo sobre la incorporación de azúcares radiactivos con la incubación tanto con UDP-[14C]-galactosa como de CMP-[14C]-ácido siálico. Esto indica que las proteínas intracelulares plaquetarias tienen expuestos tanto galactosa como GlcNAc.

Tal como se muestra en la figura 28, los lisados de plaquetas mostraron incorporación de azúcares radiactivos en un número de glicoproteínas en presencia de cualquiera de las combinaciones de azúcares nucleótidos ensayadas. Esto demuestra que los lisados de plaquetas con detergente contienen glicoproteínas con suficiente exposición de GlcNAc así como de Gal para servir como sustratos aceptores para actividades galactosiltransferasa y sialiltransferasa. De forma importante, las reacciones combinadas tanto con UDP-Gal como con CMP-ácido siálico dieron como resultado niveles más altos de incorporación que el CMP-ácido siálico solo, sugiriendo que la galactosilación aumentó la cantidad o posiblemente la calidad de los aceptores. Sorprendentemente, la incubación de plaquetas intactas con las combinaciones de azúcares nucleótidos dio como resultado un patrón diferente. En las condiciones usadas, la incorporación de 14C-Gal observada fue nula o muy escasa. En sorprendente contraste, la adición de CMP-ácido siálico dio como resultado un alto nivel de incorporación de ácido siálico radiactivo en glicoproteínas de membrana plaquetarias (figura 28, panel B). De forma interesante, la incorporación fue principalmente en una proteína con un peso aproximado de135 kD con formación de una banda de menor intensidad a aproximadamente 130 kD. La incorporación detectable de azúcares radiactivos en plaquetas no lisadas se encontró sólo con la adición de bien CMP-ácido siálico o bien CMP-ácido siálico y UDP-galactosa. No se vio incorporación en plaquetas no lisadas incubadas con UDP-[C14]-galactosa sola. Estos resultados sorprendentemente sugieren que las glicoproteínas de membrana de plaquetas humanas expresan cantidades significativas de cadenas de oligosacáridos terminales de -galactosa no sialiladas, mientras que la cantidad de cadenas de oligosacáridos terminales GlcNAc es menor en comparación.

En conclusión, este ejemplo proporciona pruebas experimentales que demuestran la existencia de actividad sialiltransferasa en plaquetas humanas que pueden sialilar los residuos de -galactosa expuestos sobre la superficie de plaquetas después de la única adición de CMP-ácido siálico en preparaciones aisladas tamponadas de plaquetas.

Ejemplo 2

Las plaquetas con ácido siálico reducido en superficie se eliminan rápidamente in vivo

Este ejemplo demuestra que una reducción del ácido siálico en superficie y como consecuencia un exposición de galactosa, da como resultado un aumento en la retirada de plaquetas de la circulación después de un trasplante autólogo o heterólogo en un mamífero. Las sialiltransferasas son una familia de 18 enzimas que catalizan la transferencia de ácido siálico a diversos glicanos en enlaces 2-3, 2-6 o bien 2-8. La mayoría de ácidos siálicos unidos a componentes del plasma se unen en 2-3, sintetizados mediante una de las seis diferentes ST3Gal transferasas (ST3Gal I-VI). Estudios de ratones deficientes en diferentes sialiltransferasas han sugerido que ST3GalIV es el modulador más importante de la función plaquetaria y la hemostasis (véase, Ellies, LG, y cols., PNAS 99: 10042-10047). Ellies y cols. demuestran que la falta de 2,3Sialiltransferasa IV en ratones conduce a bajos números de plaquetas y que las plaquetas de los ratones KO carecen de ácido 2,3siálico unido a Gal4GlcNAc-R. Se sugirió que el bajo número de plaquetas es el resultado de la inhibición de formación de plaquetas y/o disminución de la supervivencia de las plaquetas. Los autores sugieren que la razón principal para el bajo número de plaquetas es el aumento en la captación de plaquetas por el receptor asialoglicoproteína. Esto se sugiere por el hecho de que la administración de la proteína de inhibidor competitivo asialofetuina corrige el recuento de plaquetas. Aunque esto es un fuerte indicador del mecanismo propuesto, Ellies y cols. no muestran que las plaquetas KO (con sialilación disminuida) tienen la supervivencia disminuida, lo cual se ilustra por el presente ejemplo. Además, se aprecia por varias realizaciones de la invención, que la resialilación de las plaquetas KO recupera su supervivencia.

La 2,3sialiltransferasa IV cataliza la transferencia de ácido siálico del CMP-ácido siálico, a cadenas de tipo 2 (Gal4GlcNAc3-R) en glicanos N-ligados de tipo complejo. Los ratones que carecen de 2,3sialiltransferasa IV tienen un número reducido de plaquetas. Sin embargo, no se ha conocido si el bajo recuento de plaquetas en los ratones knock-out se debe a la baja producción de plaquetas o al aumento en la eliminación. Los autores de la presente invención propusieron como hipótesis que el aumento en la cantidad de galactosa en la superficie de las plaquetas de los ratones con ST3Gal-IV inactivado dio como resultado el reconocimiento por receptores asialoglicoproteína que conducen al aumento de la eliminación. Antes de probar esta hipótesis mediante experimentos de transfusión en ratones, los autores de la presente invención confirmaron los hallazgos anteriores de que las plaquetas de los ratones knock-out tienen un aumento en la cantidad de galactosa presente en su superficie. Esto se efectuó marcando las plaquetas con una proteína de unión de carbohidratos ECA marcada con FITCH como se demuestra en la figura 29 panel A. Los autores de la presente invención comprobaron entonces si el aumento en la presentación de galactosa daba como resultado una disminución en la supervivencia de las plaquetas transfundidas.

Se realizaron estudios de transfusión para determinar la eliminación in vivo de plaquetas ST3GalIV -/- en ratones ts. Se encontró que el tiempo de vida de las plaquetas ST3GalIV -/- (cuadrados vacíos) se reducía significativamente en comparación con el tiempo de vida de plaquetas heterocigóticas y de tipo salvaje (cuadrados negros). Las plaquetas obtenidas a partir de ratones ST3GalIV -/- se marcaron con CMFDA y se transfundieron en el plexo venoso retroorbital de ratones ts. La sangre se recogió en diferentes puntos temporales, y la supervivencia plaquetaria se siguió por citometría de flujo. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitonal de Avertina al 2,5% (Fluka Chemie, Steinham, Alemania) y la sangre se obtuvo mediante sangrado ocular retroorbital en 0,1 volúmenes de anticoagulante Aster-Jandyl (como se discute en el Ejemplo 8). La sangre completa se centrifugó a 300 x g durante 8 minutos y el plasma rico en plaquetas (PRP) se aisló. Las plaquetas se separaron del plasma por centrifugación a 1200 x g durante 5 minutos y se lavaron dos veces en una solución de NaCl 140 mM, KCl 5 mM, citrato trisódico 12 mM, glucosa 10 mM y sacarosa 12,5 mM, pH 6,0. Las plaquetas lavadas se resuspendieron a una concentración de 5 x 108/ml en NaCl 140 mM, KCl 3 mM, MgCl2 0,5 mM, NaHCO3 5 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4. Las plaquetas se marcaron con CMFDA (diluido 1:100 en DMSO) durante 15 minutos a 37ºC. 300 L de plaquetas marcadas se transfundieron al plexo venoso retroorbital de ratones de tipo salvaje. La sangre se recogió de tiempo cero a 48 horas, y la supervivencia plaquetaria se siguió por citometría de flujo. La sangre de ratones heterocigotos y de tipo salvaje se examinaron en paralelo para su comparación. Marcaje de lectina: Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitonal de Avertina al 2,5% (Fluka Chemie, Steinham, Alemania) y la sangre se obtuvo mediante sangrado ocular retroorbital en 0,1 volúmenes de anticoagulante Aster-Jandyl. Las plaquetas se lavaron como se describe anteriormente. Las plaquetas lavadas se resuspendieron a una concentración de 1 x 106/ml en NaCl 140 mM, KCl 3 mM, MgCl2 0,5 mM, NaHCO3 5 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4 y se incubaron con la proteínas de unión de carbohidratos RCA-1 conjugada con FITCH a una concentración 0,1 g/ml durante 20 minutos a TA. El marcaje se siguió mediante citometría de flujo.

La figura 29, panel B demuestra que las plaquetas de los ratones con ST3GalT-IV inactivado tienen una disminución en el tiempo de supervivencia cuando se transfunden en animales de tipo salvaje en comparación con las plaquetas control. Esto demuestra que la reducción de ácido 2,3-siálico es esencial para la protección de las plaquetas en circulación de la eliminación. Los datos destacan además la potencial importancia del ácido siálico en la protección de residuos de galactosa que subyacen del reconocimiento y la fagocitosis mediada por el receptor de asialoglicoproteína.

Ejemplo 3

La sialilación mejora la supervivencia de las plaquetas de ratón no enfriadas

Este ejemplo demuestra que la glicosilación de plaquetas de ratón con UDP-galactosa y CMP-ácido siálico da como resultado un aumento en la supervivencia y una disminución en las lesiones de almacenamiento, cuando la preparación de plaquetas se mantiene a temperatura ambiente (aproximadamente de 18 grados C a 25 grados C).Se ha demostrado previamente que el complejo receptor Von Willenbrandt (VWF) está reconocida por la integrina M2 en macrófagos hepáticos, que a través su dominio lectina, se une a residuos expuestos de Nacetilglucosamina (GlcNAc) en la subunidad GPi1b del receptor VWF. El recubrimiento del GlcNAc expuesto por galactosilación evita el reconocimiento y la eliminación de plaquetas enfriadas. Además, se sabe que las plaquetas pierden ácido siálico de superficie con el tiempo, en circulación o bien cuando se almacenan. Sin que esté restringido a la teoría, esto podría surgir a partir de un intercambio de glicanos en la superficie de la membrana, así como en parte debido a la naturaleza fluida de la membrana. Esta pérdida de ácido siálico conduce al descubrimiento de la penúltima galactosa que podría ser reconocida por los asialorreceptores. Con el fin de someter a prueba si la regalactosilación y la resialilación de plaquetas no enfriadas aumentaría la supervivencia plaquetaria, los autores de la presente invención llevaron a cabo experimentos de transfusión comparando la supervivencia de plaquetas glicosiladas y no glicosiladas. Como se vio en la figura 30, una fracción de mayor tamaño de plaquetas sialiladas y galactosiladas (cuadrados cerrados) se puede recuperar en los diferentes puntos de tiempo en comparación con el control no tratado (cuadrados abiertos), demostrando que la glicosilación aumenta la supervivencia de plaquetas no enfriadas modificadas con glicano transfundidas de forma heteróloga en relación con plaquetas no tratadas.

Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitonal de Avertina al 2,5% (Fluka Chemie, Steinham, Alemania) y la sangre se obtuvo mediante sangrado ocular retroorbital en 0,1 volúmenes de anticoagulante Aster-Jandyl (citrato de sodio 85 mM, ácido cítrico 69 mM, 20 mg/ml de glucosa, pH = 4,6). La sangre completa se centrifugó a 300 x g durante 8 minutos y el plasma rico en plaquetas (PRP) se aisló. Las plaquetas se glicosilaron por incubación a 37ºC durante 60 minutos con UDP-galactosa 1,2 mM y CMP-ácido siálico añadidos directamente al PRP. Después de la incubación las plaquetas se separaron del plasma por centrifugación a 1200 x g durante 5 minutos y se lavaron dos veces en una solución de NaCl 140 mM, KCl 5 mM, citrato trisódico 12 mM, glucosa 10 mM, sacarosa 12,5 mM y pH 6,0. Las plaquetas lavadas se resuspendieron a una concentración de 5 x 108/ml en NaCl 140 mM, KCl 3 mM, MgCl2 0,5 mM, NaHCO3 5 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4 y se incubaron con CMFDA (diluido

1:100 en DMSO) durante 15 minutos a 37ºC. 300 L de plaquetas marcadas se transfundieron al plexo venoso retroorbital de ratones de tipo salvaje. La sangre se recogió de tiempo cero a 48 horas, y la supervivencia plaquetaria se determinó mediante citometría de flujo. La sangre de ratones heterocigotos y de tipo salvaje se examinó en paralelo para su comparación. Como se vio, una fracción de mayor tamaño de plaquetas incubadas con CMP-ácido siálico y UDP-galactosa circulan a los diferentes puntos de tiempo en comparación con el control sin tratar, demostrando que la modificación de glicano, por ejemplo, glicosilación/sialilación aumenta la supervivencia de plaquetas no enfriadas cuando se transfunden en animales de tipo salvaje en comparación con las plaquetas de control.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para aumentar el tiempo de circulación de una población de plaquetas que comprende poner en contacto una población de plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano, CMP-ácido siálico, produciendo de esta manera una población de plaquetas modificadas que tienen residuos de glicano en superficie modificados en su extremo, en el que la población de plaquetas modificadas cuando se trasplantan en un mamífero puede circular en el mamífero durante al menos el mismo tiempo que las plaquetas no modificadas.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto las plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de UDP-galactosa.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, que comprende además enfriar la población de plaquetas antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, que comprende además almacenar la población de plaquetas a temperatura ambiente antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

5. 5.

   El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la población de plaquetas mantiene una actividad hemostática sustancialmente normal cuando se trasplanta en un mamífero.

6. 6.

   El método de la reivindicación 3 ó 4, en el que la población de plaquetas cuando se trasplanta en un mamífero, tiene una semivida de circulación de aproximadamente un 5% o más que la semivida de circulación de plaquetas no modificadas.

7. 7.

   El método de la reivindicación 1, en el que la población de plaquetas modificada es adecuada para el trasplante en un ser humano.

8. 8.

   Un método para aumentar el tiempo de almacenamiento de las plaquetas aisladas, que comprende poner en contacto una población de plaquetas aislada ex vivo con una cantidad eficaz de un agente modificador de glicano, CMP-ácido siálico, produciendo de esta manera una población de plaquetas modificadas que tienen residuos de glicano en superficie modificados en su extremo y enfriar las plaquetas para reducir el crecimiento de microorganismos en la población de plaquetas, aumentando de esta manera el tiempo de almacenamiento de la población de plaquetas.

9. 9.

   El método de la reivindicación 8, que comprende además poner en contacto las plaquetas ex vivo con una cantidad eficaz de UDP-galactosa.

10. 10.

    El método de la reivindicación 8, que comprende además enfriar la población de plaquetas antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

11. 11.

    El método de la reivindicación 8, que comprende además almacenar la población de plaquetas a temperatura ambiente antes de, simultáneamente con, o después de poner en contacto las plaquetas con el agente modificador de glicano.

12. 12.

    El método de la reivindicación 10 u 11, en el que la población de plaquetas mantiene una actividad hemostática sustancialmente normal cuando se trasplanta en un mamífero.

13. 13.

    El método de la reivindicación 10 u 11, en el que la población de plaquetas cuando se trasplanta en un mamífero, tiene una semivida de circulación de aproximadamente un 5% o más que la semivida de circulación de plaquetas no modificadas.

14. 14.

    El método de la reivindicación 8, en el que la población de plaquetas modificada es adecuada para el trasplante en un ser humano.

15. 15.

    Una plaqueta aislada modificada para comprender una pluralidad de moléculas de glicano modificadas por sialilación terminal y moléculas de glicano modificadas por galactosilación terminal sobre la superficie de la plaqueta, en la que las plaquetas modificadas tienen una supervivencia mayor después de un trasplante en mamíferos en relación con plaquetas no modificadas.

16. 16.

    Un kit que comprende un recipiente estéril que puede recibir y contener una población de plaquetas, recipiente que está sustancialmente cerrado al entorno, y una cantidad estéril de al menos un agente modificador de glicano suficiente para modificar un volumen de plaquetas recogido y almacenado en el recipiente, en el que el al menos un agente modificador de glicano es CMP-ácido siálico, kit que comprende además materiales de envasado adecuados e instrucciones de uso.

17. 17.

    El kit de la reivindicación 16, en el que el recipiente es adecuado para el almacenamiento de plaquetas en frío.