ES2364152T3 - Secuencias de nucleótidos y polipéptidos codificados por ellas, útiles para la modificación de las características de eficacia de utilización del nitrógeno en plantas. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un ácido nucleico para mejorar las características de eficiencia en el uso del nitrógeno de una planta transgénica, en comparación con una planta de tipo natural cultivada en las mismas condiciones, en la que el ácido nucleico incluye una molécula aislada de ácido nucleico que comprende: (a) un ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifique una secuencia de aminoácido que presente al menos una identidad de secuencia del 80% con la ID SEC. Nº 2; (b) un ácido nucleico que sea un complemento de una secuencia de nucleótido de acuerdo con el párrafo (a); en el que la secuencia del nucleótido y/o la secuencia del aminoácido desempeñan una función en la eficiencia del uso del nitrógeno.
Description
Secuencias de nucleótidos y polipéptidos
codificados por ellas, útiles para la modificación de las
características de eficacia de utilización del nitrógeno en
plantas.
La presente invención se refiere a la
utilización de polinucleótidos aislados y los polipéptidos
codificados por ellos, para la obtención de plantas transgénicas con
una mayor eficacia de utilización del nitrógeno. La presente
invención se refiere asimismo a la utilización de dichas secuencias
de nucleótidos en el ámbito de la ingeniería genética de las
plantas, para la obtención de una mayor capacidad de asimilación y
de utilización del nitrógeno, a fin de que crezcan más, de forma más
eficaz o con mayor rapidez, y/o tengan un contenido de nitrógeno
enriquecido en partes de la planta vegetativas y/o reproductivas y/o
un aumento de la biomasa. Más concretamente, esta invención se
refiere a la fabricación de plantas transgénicas diseñadas de forma
que se altere la expresión de componentes clave en los mecanismos de
asimilación y utilización del nitrógeno. Las plantas sometidas al
proceso de ingeniería pueden cultivarse de forma productiva en
condiciones de bajo aporte de fertilizante nitrogenado o en terrenos
pobres en nitrógeno. Alternativamente, las plantas modificadas
mediante ingeniería pueden utilizarse para conseguir unos cultivos
que crezcan o maduren con mayor rapidez, unas cosechas más
abundantes y/o unos productos más nutritivos en condiciones de
cultivo ideales.
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El nitrógeno suele ser con frecuencia el
elemento que constituye el factor límite en el crecimiento de la
planta, y todos los cultivos agrícolas tienen una dependencia
fundamental de fuentes de nitrógeno exógenas. Los abonos
nitrogenados, que suelen suministrarse en forma de nitrato de
amonio, nitrato potásico, o urea, suelen representar un 40% de los
costes asociados a cultivos como el del maíz y el trigo en la
agricultura intensiva. Una mayor eficacia en la utilización del
nitrógeno por parte de las plantas debería permitir la consecución
de unos mayores rendimientos con los actuales aportes de
fertilizante y/o permitir la obtención de las cosechas actuales con
un menor aporte de fertilizante, o conseguir unos mayores
rendimientos en terrenos de baja calidad. También se pueden producir
de forma más rentable unas mayores cantidades de proteínas en los
cultivos.
Las plantas cuentan con diversos medios para
hacer frente a las deficiencias de nutrientes, como una reducida
disponibilidad de nitrógeno. Están constantemente tratando de
detectar el nitrógeno disponible en el suelo, y responden en
consecuencia, modulando la expresión del gen. Aunque se han
realizado muchos descubrimientos en torno al nitrógeno y a los
componentes que participan en la regulación de su absorción y
utilización, todavía se desconocen muchas cosas acerca de un gran
número de estas complejas interacciones. Por este motivo, resulta
interesante cuando se observa que un gen con una función conocida o
desconocida presenta una respuesta al nitrógeno, ya que abre nuevas
posibilidades y perspectivas sobre la utilización del nitrógeno y la
eficiencia de la utilización del nitrógeno en un entorno competitivo
(es decir, con niveles bajos y/o elevados de nitrógeno).
Las plantas cuentan con diversos medios para
hacer frente a las deficiencias de nutrientes. Uno de los mecanismos
más importantes para ello consiste en secuestrar o almacenar el
nitrógeno en épocas de abundancia para su posterior utilización. Los
transportadores de péptidos son una de las clases de proteínas que
es probable que participen en este proceso. Existen muy pocos
informes publicados en relación con los transportadores de péptidos
en plantas, lo que indica que su función en el crecimiento y
desarrollo de la planta está aún sin explorar. Los transportadores
de péptidos son transportadores mediados por portadores y
dependientes de la energía. Los péptidos, que se han internalizado
en la célula, se descomponen en aminoácidos, que a su vez se
utilizan como fuentes de nitrógeno y carbono. La sobreexpresión de
un transportador de péptidos puede proporcionar nitrógeno a una
planta de forma más adecuada, lo que constituye una ventaja en
entornos competitivos en nitrógeno (N). La utilización de un
inhibidor de asimilación del nitrógeno como representación de este
entorno competitivo proporciona un filtro muy útil para los
candidatos que tienen una mejor eficiencia en el uso del nitrógeno
(NUE). Este filtro proporciona un método bien definido para la
identificación de los candidatos N, ya que elimina el carácter
subjetivo de la limitación de los filtros de N en función de ligeros
incrementos en el tamaño y verdor.
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Por lo tanto, la presente invención se refiere a
la utilización de polinucleótidos aislados y los polipéptidos
codificados por ellos, para la creación de plantas transgénicas con
una NUE.
En el campo agrícola y forestal se realizan
constantes esfuerzos para producir plantas con un mayor potencial de
crecimiento, para alimentar a la siempre creciente población mundial
y garantizar el suministro de materias primas reproducibles.
Normalmente, esto se lleva a cabo mediante la cría y selección de
las plantas. No obstante, para el proceso de cría suele ser
necesario invertir mucho tiempo y trabajo. Además, deben llevarse a
cabo los adecuados programas de reproducción para cada especie
vegetal correspondiente.
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Se han logrado avances parciales mediante la
manipulación genética de las plantas, o lo que es lo mismo,
introduciendo y expresando moléculas de ácido nucleico recombinantes
en plantas. Estos métodos presentan la ventaja de que por lo general
no se limitan a una sola especie vegetal, sino que pueden
transferirse entre diversas especies de plantas. Por ejemplo, el
documento EP-A 0 511 979 describe la expresión de un
gen de la asparagina sintetasa procariota en células vegetales, que
implica el incremento de la producción de biomasa. Igualmente, el
documento WO96/21737 describe plantas con un mayor rendimiento
(potencial de crecimiento) como consecuencia de un aumento en la
tasa de fotosíntesis y de la expresión de
fructosa-1,6-bisfosfatasa
desregulada o no regulada.
Sorprendentemente, se observó que la expresión
de las proteínas utilizadas de acuerdo con la invención implica
específicamente un aumento del potencial de crecimiento.
El término "aumento del potencial de
crecimiento" se refiere preferiblemente a un continuo crecimiento
a bajos niveles de nitrógeno, con o sin elevadas cantidades de ácido
abscísico, una mejor recuperación del suelo tras la exposición a un
medio bajo en nitrógeno y abundante en ácido abscísico, y a una
mayor tolerancia a la variabilidad de las condiciones del nitrógeno.
Preferiblemente, dicho aumento del potencial de crecimiento conlleva
un incremento de la NUE.
La invención se refiere al uso de ácidos
nucleicos y polipéptidos para mejorar la eficiencia en el uso del
nitrógeno, de acuerdo con lo definido en las reivindicaciones.
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Las Tablas I-A-J
aportan información acerca de cada uno de los nucleótidos,
incluyendo la información relativa a la secuencia, la descripción de
la función de cada secuencia y los resultados experimentales. Dicha
información se presenta en los campos siguientes:
- A:
- Número de informe.
- B:
- Esta entrada indica la ID del cDNA de Ceres y la ID del Clon Ceres.
- C:
- Esta entrada identifica una función específica que se puede modular utilizando el gen.
- D:
- Esta entrada identifica qué rasgo genético modulan el gen, sus productos genéticos y sus homólogos/ortó-logos.
- E:
- Esta entrada identifica qué sub-rasgos genéticos pueden modular el gen, sus productos genéticos y sus homólogos/ortólogos.
- F:
- Esta entrada resume la función del gen, basada en los datos de expresión y el fenotipo observado.
- G:
- Esta entrada proporciona un comentario detallado del uso del gen, en función del análisis experimental y por ordenador.
- H:
- En esta entrada se comenta el uso del gen, sus productos genéticos y sus homólogos/ortólogos en especies diferentes de la Arabidopsis.
- I:
- Esta entrada proporciona la secuencia de ácido nucleico determinada a partir de los datos del Clon Ceres.
- J:
- Esta entrada proporciona la secuencia de ácido nucleico determinada a partir de las plantas transformadas.
- K:
- Esta entrada proporciona la secuencia proteínica traducida del cDNA.
- L:
- Esta entrada identifica las secuencias públicas que muestran similitudes con la proteína identificada en el campo "K".
- M:
- Esta entrada indica cualesquiera diferencias entre la secuencia proteínica identificada en el campo "K" y otras secuencias similares identificadas en el campo "L".
- N:
- Esta entrada identifica las secuencias proteínicas que desempeñan actividades similares a la secuencia proteínica identificada en el campo "K". Las secuencias que aparecen en este campo se identifican mediante la ID del Clon Ceres, la ID del cDNA de Ceres o un número "gi". Siempre que es posible, se incluye una secuencia de nucleótido que codifica la proteína. Obsérvese que una proteína específica se puede identificar por más de un número "gi". En estos casos, tan sólo se incluye una secuencia de nucleótido correspondiente a uno de los números "gi". Pueden encontrarse otras secuencias de nucleótidos correspondientes a los restantes números "gi" en Internet, en la página de NCBI.
- O:
- Este campo contiene información de secuencia para una secuencia de consenso obtenida a partir de las secuencias ortólogas indicadas en el campo "N". Esta secuencia de consenso indica qué aminoácidos aparecen en cada posición.
- P:
- Esta entrada identifica el promotor enlazado de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico del campo "J" en los experimentos que generaron los datos del fenotipo.
- Q:
- Esta entrada proporciona la ID de la línea de plantas o evento que demuestra un índice de segregación estadísticamente significativo con respecto al fenotipo observado.
- R:
- Esta entrada proporciona datos cualitativos y cuantitativos generados en los experimentos del fenotipo. Los datos se organizan en tablas discretas, y cada tabla proporciona resultados para una línea, ensayo, tratamiento y/o evento específicos.
- S:
- Este campo contiene dos tablas (Tabla S-1 y Tabla S-2). La Tabla S-1 de esta entrada proporciona la comparación de la transcripción de la secuencia de ácido nucleico del campo "J" en plantas sometidas a diversas condiciones experimentales. La Tabla 2 proporciona los parámetros de cada experimento indicado en la Tabla 1.
- T:
- Este campo describe los materiales y métodos utilizados para llevar a cabo los experimentos de filtrado y caracterización del fenotipo.
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La Tabla II proporciona los resultados del
análisis ortólogo de secuencias. La tabla se divide en cuatro partes
(A-D), y cada parte proporciona los resultados del
análisis para una secuencia. La primera secuencia indicada en cada
sección de la tabla describe la "Secuencia de Búsqueda" que se
utilizó como secuencia de búsqueda para determinar la existencia de
ortólogos. La siguiente lista de "Coincidencias" proporciona la
secuencia de aminoácidos correspondiente a cada proteína que se ha
determinado que es un ortólogo de la "Secuencia de Búsqueda".
Los aciertos se obtuvieron a partir de la base de datos propietaria
de los solicitantes (identificada como "Clon Ceres") o de la
base de datos pública GENBANK (identificada como "gi"). Cada
sección de la tabla concluye con una secuencia de consenso para
dicho grupo ortólogo. Los códigos correspondientes a la secuencia
son los mismos que los de la Tabla I.
Se observará que aunque los ortólogos se definen
en función de su secuencia de aminoácidos, también se describen
secuencias de nucleótidos que codifican cada una de las secuencias
proteínicas ortólogas.
Debido a la degeneración del código genético,
pueden utilizarse diferentes codones de nucleótidos para la
codificación de un aminoácido específico. Una célula huésped suele
mostrar un patrón preferido de utilización del codón.
Las secuencias de ácido nucleico suelen
construirse de forma que utilizan el patrón de uso del codón de la
célula huésped específica. Por lo general, esto mejora la expresión
de la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped
transformada. Cualquiera de las secuencias de ácido nucleico y
aminoácidos anteriormente descritas puede modificarse de forma que
refleje la utilización del codón preferido de una célula huésped u
organismo en el que actúan de contenedores. La modificación de una
secuencia de ácido nucleico para una utilización óptima del codón en
plantas se describe en la Patente estadounidense Nº 5.689.052. Las
variaciones adicionales de las secuencias de ácido nucleico pueden
codificar proteínas que tengan unas características equivalentes o
superiores en comparación con las proteínas a partir de las cuales
se han realizado.
Debe comprenderse que ciertos aminoácidos pueden
reemplazarse por otros aminoácidos en una estructura de proteína o
péptido (y la secuencia de ácido nucleico que la codifica) sin que
se produzca un cambio apreciable o pérdida de su utilidad o
actividad biológica. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos
se pueden llevar a cabo sin una pérdida apreciable de capacidad de
enlace interactiva en las regiones de enlace de antígeno de los
anticuerpos, o en los puntos de enlace de las moléculas substrato.
Las modificaciones pueden tener como resultado cambios conservadores
o no conservadores en la secuencia de aminoácido. Los cambios en el
aminoácido pueden lograrse mediante el cambio de los codones de la
secuencia de ácido nucleico, de acuerdo con los codones que se
facilitan en la Tabla A.
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Es bien conocido en la técnica que uno o más
aminoácidos de una secuencia nativa pueden sustituirse por otros
aminoácidos, cuya carga y polaridad sean similares a las del
aminoácido nativo, es decir, una sustitución conservadora del
aminoácido, con lo que se produce un cambio silencioso. Los
sustitutos conservadores de un aminoácido en la secuencia nativa de
polipéptidos se pueden seleccionar entre otros miembros de la clase
a la que pertenece el aminoácido. Los aminoácidos pueden dividirse
en los cuatro grupos siguientes: (1) aminoácidos acídicos (con carga
negativa), como el ácido aspártico y el ácido glutámico; (2)
aminoácidos básicos (con carga positiva), como la arginina, la
histidina y la lisina; (3) aminoácidos polares neutros, como la
glicina, serina, treonina, cisterna, cistina, tirosina, asparagina y
glutamina; y (4) aminoácidos neutros no polares (hidrófobos), como
la alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilamina,
triptófano y metionina.
La Tabla III proporciona los resultados de la
alineación de parejas de secuencias para cada uno de los grupos
ortólogos que se describen en la Tabla II, y específicamente, el
alineamiento de la "Secuencia de Búsqueda" de la Tabla II con
cada uno de sus ortólogos identificados. Los resultados que se
muestran en la Tabla III, al igual que los de la Tabla II, se
dividen en cuatro partes (A-D) correspondientes a
los resultados de una secuencia, y el código de letra de la subparte
corresponde al mismo código de letra de las subpartes de la Tabla
II.
La Tabla IV proporciona la alineación por
parejas de dos secuencias específicas.
La Tabla V proporciona un resumen de las
diversas tablas correspondientes a varias de las secuencias,
estableciendo una correlación para cada secuencia con los diversos
identificadores utilizados en las Tablas (es decir, el Número de
Informe. El cADN Ceres, la ID del clone y el nº de línea ME) así
como la ubicación de la información comunicada para cada
secuencia.
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Se utilizarán los siguientes términos a lo largo
de esta solicitud:
- Variante alélica: Una "variante alélica" es una forma alternativa del mismo SDF, que reside en el mismo locus cromosómico del organismo. Las variaciones alélicas se producen en cualquier porción de la secuencia del gen, incluyendo las regiones reguladoras. Las variantes alélicas pueden surgir por variación genética normal en una población. Las variantes alélicas también se pueden producir mediante métodos de ingeniería genética. Una variante alélica puede encontrarse de forma natural en una planta, incluyendo una variante cultivar o ecotipo. Una variante alélica puede dar lugar o no a un cambio fenotípico y puede o no estar expresada. Un alelo puede dar lugar a un cambio detectable en el fenotipo del rasgo genético representado por el locus. Un alelo fenotípicamente silente puede dar lugar a un producto.
\newpage
- Quimérico: El término "quimérico" se utiliza para describir genes, como se ha descrito anteriormente, o constructos en los que al menos dos de los elementos del gen o constructo, como el promotor o la secuencia de codificación y/u otras secuencias reguladoras y/o secuencias de relleno y/o los complementos de las mismas, son heterólogas entre sí.
- Promotor constitutivo: Los promotores que aquí se denominan "promotores constitutivos" promueven activamente la transcripción en la mayoría, pero no necesariamente en todas las condiciones medioambientales y fases de desarrollo o diferenciación celular. Entre los ejemplos de promotores constitutivos destacan la región de iniciación del transcripto 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el promotor 1' o 2' obtenido del T-ADN del Agrobacterium tumefaciens, y otras regiones de iniciación de la transcripción procedentes de diversos genes vegetales, como el promotor de la ubiquitina de maíz-1, conocido para cualquier persona versada en la materia.
- Expresado coordinadamente: El término "expresado coordinadamente", según se utiliza en la presente invención, se refiere a los genes expresados en el mismo momento o en un momento y/o fase similar, y/o en las mismas o similares condiciones medioambientales.
- Dominio: Los dominios son huellas dactilares o firmas que se pueden utilizar para caracterizar familias de proteínas y/o partes de proteínas. Dichas huellas dactilares o firmas pueden comprender de forma conservada (1), la secuencia primaria, (2), la estructura secundaria, y/o (3) la conformación tridimensional. Por lo general, cada dominio se encuentra asociado a una familia de proteínas o motivos. Normalmente, estas familias y/o motivos se han correlacionado con actividades específicas in Vitro y in Vivo. Un dominio puede tener cualquier longitud, incluyendo la totalidad de la secuencia de una proteína. Más adelante se describen detalladamente los dominios, familias asociadas y motivos, así como las actividades correlacionadas de los polipéptidos en el uso de la presente invención. Por lo general, los polipéptidos con dominios designados pueden presentar al menos una actividad que es exhibida por cualquier polipéptido que comprende el mismo dominio.
- Endógeno: El término "endógeno" dentro del contexto de la presente invención se refiere a cualquier polinucleótido, polipéptido o secuencia proteínica que es un componente natural de una célula o de organismos regenerados a partir de dicha célula.
- Exógeno: El término "exógeno", tal y como se hace referencia a él en este documento, es cualquier polinucleótido, polipéptido o secuencia proteínica, quimérica o no, que se introduce inicialmente o posteriormente en el genoma de una célula huésped individual o del organismo regenerado a partir de dicha célula a través de cualquier medio distinto de un cruce sexual. Más adelante se describen ejemplos de los medios a través de los cuales se puede llevar esto a cabo, entre ellos, la transformación mediada por Agrobacterium (de dicotiledóneas por ejemplo, Salomón et al. EMBO J. 3:141 (1984); Herrera-Estrella et al. EMBO J. 2:987 (1983); de monocotiledóneas, destacando los trabajos de Escudero et al., Plant J. 10:355 (1996), Ishida et al., Nature Biotechnology 14:745 (1996), May et al., Biol. Technology 13:486 (1995)), Biolistic methods (Armaleo et al., Current Genetics 17:97 1990)), electroporación, técnicas in planta y similares. En este documento, la planta que contiene el ácido nucleico exógeno se denominará T_{0} en el caso de la planta transgénica primaria y T_{1} en el de la primera generación. El término "exógeno", como se utiliza en el presente documento, también pretende incluir la inserción de un elemento encontrado de forma natural en un punto no encontrado de forma natural.
- Proteínas funcionalmente comparables: Este término describe aquellas proteínas que comparten al menos una característica en común. Dichas características incluyen la similitud de secuencias, la actividad bioquímica, la similitud del patrón de transcripción y la actividad fenotípica. Normalmente, las proteínas con una funcionalidad comparable comparten una cierta similitud de secuencia o al menos un "y" bioquímico. Dentro de esta definición, se considera que los homólogos, ortólogos y análogos son comparables desde el punto de vista funcional. Además, las proteínas con una funcionalidad comparable comparten en general al menos una actividad bioquímica y/o fenotípica.
- Gen: El término "gen", como se utiliza en el contexto de la actual invención, incluye todas las secuencias reguladoras y de codificación contiguamente asociadas a un sola unidad hereditaria con una función genética. Los genes pueden incluir secuencias de no codificación que modulan la función genética y que incluyen, sin limitación, las que especifican la poliadenilación, la regulación transcripcional, la conformación del ADN, la conformación de la cromatina, el alcance y la posición de la metilación básica y los centros de los enlaces de las proteínas que controlan todo el proceso. Los genes formados por "exones" (secuencias de codificación) que pueden ser interrumpidos por "intrones" (secuencias de no codificación) codifican proteínas. La función genética de un gen puede requerir únicamente la expresión del ARN o la producción de proteínas, o tan sólo puede requerir el enlace de proteínas y/o ácidos nucleicos sin expresión asociada. En determinados casos, los genes adyacentes pueden compartir secuencia de tal forma que un gen solape al otro. Puede encontrarse un gen dentro del genoma de un organismo, de un cromosoma artificial, plásmido, vector, etc., o como una entidad aislada independiente.
- Secuencias heterólogas: "Secuencias heterólogas" son aquellas que no están operativamente enlazadas o que no son contiguas entre sí. Por ejemplo, un promotor del maíz se considera heterólogo de una Arabidopsis que codifique secuencias de región. Asimismo, un promotor procedente de un gen que codifique un factor de crecimiento del maíz se considera heterólogo de una secuencia que codifique el receptor del maíz para el factor de crecimiento, y las secuencias reguladoras de elementos, como las UTRs o las secuencias de terminación del extremo 3' y que no tienen su origen en el mismo gen en el que tiene su origen la secuencia de codificación se consideran heterólogos de dicha secuencia de codificación. Los elementos conectados operativamente y contiguos entre sí no son heterólogos entre sí. Por otra parte, estos mismos elementos permanecen operativamente vinculados pero pasan a ser heterólogos si se sitúa entre ellos otra secuencia de relleno. De este modo, las secuencias promotora y de codificación de un gen del maíz que exprese un transportador de aminoácido no son heterólogas entre sí, pero el promotor y la secuencia de codificación de un gen del maíz operativamente vinculado de una forma nueva son heterólogos.
- Condiciones de elevado nivel de nitrógeno: Esta frase se refiere a una concentración total de nitrógeno de 240 nM (por ejemplo, KNO_{3} y NH_{4}NO_{3} combinados).
- Gen homólogo: En esta invención, "gen homólogo" se refiere a un gen que comparte una similitud de secuencia con el gen de interés. Esta similitud puede encontrarse tan sólo en un fragmento de la secuencia y representa a menudo un dominio funcional, como por ejemplo, sin limitación, un dominio de enlace de ADN con actividad de tirosina quinasa o similar. Las actividades funcionales de genes homólogos no son necesariamente iguales.
- Promotor inducible: Un "promotor inducible" en el contexto de la actual invención se refiere a un promotor que se regula en ciertas condiciones, como la luz, la concentración química, la concentración proteínica, las condiciones en un organismo, célula u orgánulo, etc. Un ejemplo típico de un promotor inducible, que puede utilizarse en la presente invención, es el PARSK1, el promotor del gen de la Arabidopsis que codifica una enzima quinasa de serina-treonina, induciéndose dicho promotor por deshidratación, ácido abscísico y cloruro sódico (Wang and Goodman, Plant J. 8:37 (1995)). Entre las condiciones medioambientales que pueden afectar a la transcripción por parte de promotores inducibles se incluyen las condiciones anaeróbicas, la temperatura elevada o la presencia de luz.
- Condiciones de bajo nivel de nitrógeno: La frase "Condiciones de bajo nivel de nitrógeno" se refiere a una concentración de 100 \muM de KNO_{3} o a una concentración total de nitrógeno de 100-300 \muM (por ejemplo, una combinación de KNO_{3} y NH_{4}NO_{3}).
- Grupo principal: El término "Grupo principal", como se utiliza en estos experimentos, consiste en un grupo de semillas procedentes de cinco plantas diferentes. Cada una de estas plantas se ha transformado con la misma combinación de promotor/cADN. Se utiliza el mismo número de semillas procedentes de cada planta para constituir el grupo.
- Expresión incorrecta: El término "expresión incorrecta" se refiere a un incremento o disminución en la transcripción de una región de codificación en una secuencia complementaria de ARN comparada con el estado natural. Este término también incluye la expresión de un gen o región de codificación para un período de tiempo diferente, en comparación con el estado natural y/o procedente de un emplazamiento no natural del genoma de la planta.
- Inhibidor de asimilación del nitrógeno: El término "inhibidor de asimilación del nitrógeno" se refiere a un compuesto, polipéptido o proteína que interfiere con la conversión del amonio en nitrógeno utilizable (por ejemplo, glutamina) o con la vía de inhibición de la realimentación que tiene como resultado el cese de la absorción del nitrógeno cuando se dan acumulaciones de nitrógeno. Entre los ejemplos de inhibidores de asimilación del nitrógeno se encuentran la sulfoximina de metionina (MSX; bloquea la conversión de amonio en glutamina), la azaserina (un inhibidor de la amidotransferasa de glutamina) y la Abizzina (un inhibidor de la glutamasa).
- Condiciones normales de nitrógeno: Esta frase se refiere al nitrógeno total presente en los medios MSO estándar, 60 mM.
- Gen ortólogo: "Gen ortólogo" se refiere a un segundo gen que codifica un producto genético que lleva a cabo una función similar a la del producto de un primer gen. El gen ortólogo puede también tener un grado de similitud de secuencias con respecto al primer gen. El gen ortólogo puede codificar un polipéptido que presente un grado de similitud de secuencia con respecto a un polipéptido correspondiente a un primer gen. La similitud de secuencia se puede encontrar dentro de un dominio funcional o a lo largo de toda la longitud de la secuencia de codificación de los genes y/o sus correspondientes polipéptidos.
- Porcentaje de identidad de secuencia: El "Porcentaje de identidad de secuencia", tal y como se utiliza en el presente documento, se determina mediante comparación de dos secuencias óptimamente alineadas con respecto a una ventana de comparación, donde el fragmento del polinucleótido o de la secuencia de aminoácido de la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (por ejemplo, déficits o excedentes) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que la base idéntica de ácido nucleico o el residuo de aminoácido se encuentran en ambas secuencias, para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones de la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede ser llevada cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación homológica de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, y TFASTA, en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección. Teniendo en cuanta que se han identificado dos secuencias paras su comparación, se utilizan preferiblemente GAP y BESTFIT para determinar su alineación óptima. Normalmente, se utilizan unos valores predeterminados de 5,00 para la ponderación del déficit y de 0,30 para la duración de la ponderación del déficit. El término "identidad sustancial de la secuencia" entre secuencias de polinucleótidos o polipéptidos se refiere a polinucleótidos o polipéptidos que comprenden una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencia del 80%, preferiblemente de al menos un 85%, más preferiblemente de al menos un 90% y comas más preferiblemente de al menos un 95%, e incluso más preferiblemente de al menos un 96%, 97%, 98% o 99% en comparación con una secuencia de referencia utilizando los programas.
- Promotor de la planta: Un "promotor de la planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de plantas y que puede controlar o facilitar la transcripción de un fragmento del SDF de la invención, o una secuencia de codificación del SDF de la invención. Dichos promotores no requieren tener un origen vegetal. Por ejemplo, los promotores obtenidos a partir de virus de plantas, como el promotor del CaMV35S, o a partir del Agrobacterium tumefaciens, como los promotores T-ADN pueden ser promotores de plantas. Un ejemplo típico de un promotor de planta con origen vegetal es el promotor de la ubiquitina del maíz-1 (ubi-1) conocido para las personas versadas en la materia.
- Promotor: El término "promotor", tal y como se utiliza en este documento, se refiere a una región de determinantes de secuencia situados antes del inicio de la transcripción de un gen y que participan en el reconocimiento o en el enlace de la polimerasa del ARN y otras proteínas, para iniciar y modular la transcripción. Un promotor basal es la secuencia mínima necesaria para el montaje de un complejo de transcripción necesario para iniciar la transcripción. Los promotores basales suelen incluir un elemento de caja TATA, situado normalmente entre 15 y 35 nucleótidos por encima del punto de inicio de la transcripción. Los promotores basales incluyen en ocasiones un elemento "caja CCAAT" (normalmente, una secuencia CCAAT) y/o una secuencia GGGCG, situada por lo general entre 40 y 200 nucleótidos, y preferiblemente de 60 a 120 nucleótidos por encima del punto de inicio de la transcripción.
- Secuencia reguladora: El término "secuencia reguladora", tal y como se utiliza en esta invención, se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que incluye en el inicio y la frecuencia de la transcripción o de la traslación, y en la estabilidad y/o movilidad del transcripto o del producto del polipéptido. Las secuencias reguladoras incluyen, sin limitación, promotores, elementos de control del promotor, secuencias de enlaces de proteínas UTRs 5' y 3', punto de inicio de la transcripción, secuencia de terminación, secuencia de poliadenilación, intrones, ciertas secuencias incluidas en una secuencia de codificación, etc.
- Péptido de señal: Un "Péptido de señal", en la forma utilizada en la presente invención, es una secuencia de aminoácidos que localiza la proteína para la secreción, para el transporte a un compartimento intracelular u orgánulo o para su incorporación a una membrana. Los péptidos de señal se indican en las tablas, y más adelante figura una descripción más detallada.
- Promotor específico: En el contexto de la presente invención, "promotores específicos" se refiere a un subconjunto de promotores inducibles que tienen una elevada preferencia por ser inducidos en un tejido o célula específicos y/o en un momento específico durante el desarrollo de un organismo. "elevada preferencia" significa al menos un aumento de 3 veces, preferiblemente de 5 veces, más preferiblemente al menos de 10 veces, y más preferiblemente al menos de 20 veces, 50 veces o 100 veces en la transcripción en el tejido respectivo con respecto a la transcripción en cualquier otro tejido. Entre los ejemplos típicos de promotores temporales y/o específicos del tejido con origen en plantas y que pueden utilizarse con los polinucleótidos de la presente invención se encuentran el PTA29, un promotor capaz de inducir la transcripción del gen específicamente en el tapetum y tan sólo durante otro desarrollo (Koltonow et al., Plant Cell 2:1201 (1990); los promotores RCc2 y RCc3, que dirigen la transcripción del gen específico de la raíz en el arroz (Xu et al., Plant Mol. Biol. 27:237 (1995); el TobRB27, un promotor específico de la raíz procedente del tabaco (Yamamoto et al., Plant Cell 3:371 (1991)). Entre los ejemplos de promotores específicos del tejido que se encuentran bajo control de desarrollo se incluyen los promotores que inician la transcripción únicamente en ciertos tejidos u órganos, como la raíz, el óvulo, el fruto, las semillas o las flores. Entre otros promotores adecuados se incluyen los procedentes de genes que codifican proteínas de almacenamiento o la proteína de la membrana del cuerpo lípido, la oleosina. Anteriormente se han indicado algunos promotores específicos de la raíz.
- Constricción: "Constricción", en la forma utilizada en este documento, es una función de la longitud de la sonda, de la composición de la sonda (contenido de G + C) y de la concentración de sal, de la concentración de disolvente orgánico y de la temperatura de hibridación o de las condiciones de lavado. La construcción suele compararse mediante el parámetro T_{m}, que es la temperatura a la que se hibrida un 50% de las moléculas complementarias de la hibridación, en términos de diferencial de temperatura con respecto a T_{m}. Unas condiciones de elevada constricción son aquellas que proporcionan unas condiciones de T_{m} -5ºC a T_{m} -10ºC. Unas condiciones de constricción media o moderada son aquellas que proporcionan de T_{m} -20ºC a T_{m} -29ºC. Unas condiciones de baja constricción son aquellas que aportan unas condiciones de T_{m} -40ºC a T_{m} -48ºC. La relación entre las condiciones de hibridación y T_{m} (en ºC) se expresa mediante la ecuación matemática
(1)T_{m} =
81.5 -16.6(log_{10}[Na^{+}]) + 0.41(%G+C) -
(600/N)
- Donde N es la longitud de la sonda. Esta ecuación funciona adecuadamente para sondas con una longitud de 14 a 70 nucleótidos que son idénticas a la secuencia objetivo. La siguiente ecuación, para T_{m} de los híbridos ADN-ADN resulta útil para las sondas de entre 50 y más de 500 nucleótidos, y para unas condiciones que incluyen un disolvente orgánico (formamida).
(2)T_{m} =
81.5+16.6 log {[Na^{+}]/(1+0.7[Na^{+}])}+
0.41(%G+C)-500/L
0.63(%formamida)
- Donde L es la longitud de la sonda en el híbrido. (P. Tijessen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes" en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P.C. vand der Vliet, ed., c. 1993 by Elsevier, Amsterdam.) El término T_{m} de la ecuación (2) se ve afectado por la naturaleza del híbrido; para los híbridos ADN-ARN, T_{m} es de 10-15ºC más alta que lo calculado, y para los híbridos ARN-ARN, T_{m} es de 20-25ºC más alta. Dado que T_{m} desciende alrededor de 1ºC por cada 1% de reducción de la homología cuando se utiliza una sonda larga (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81:123 (1973)), las condiciones de constricción se pueden ajustar para favorecer la detección de genes idénticos o de miembros de la familia relacionados.
- La ecuación (2) se obtiene asumiendo el equilibrio, y por tanto, las hibridaciones de acuerdo con la presente invención se efectúan preferiblemente en condiciones de exceso de sonda y durante un tiempo suficiente como para alcanzar el equilibrio. El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio puede acortarse mediante la inclusión de un acelerador de la hibridación, como el sulfato de dextrano u otro polímero de elevado volumen en la solución tampón de hibridación.
- La constricción puede controlarse durante la reacción de hibridación o una vez que se ha producido la hibridación mediante la alteración de las condiciones de salinidad y temperatura de las soluciones de lavado utilizadas. Las fórmulas que se muestran más arriba son igualmente válidas cuando se utilizan para calcular la constricción de una solución de lavado, Las constricciones preferidas de la solución de lavado se encuentran dentro de los intervalos indicados anteriormente; una elevada constricción está entre 5-8ºC por debajo de T_{m}, una constricción media o moderada es de 26-29ºC por debajo de T_{m} y una baja constricción está situada en 45-48ºC por debajo de T_{m}.
- Sustancialmente libre de: Una composición que contiene A se encuentra "sustancialmente libre" de B cuando al menos un 85% en peso del total de A+B de la composición es A. Preferiblemente, A comprende al menos en torno a un 90% en peso del total de A+B de la composición, y más preferiblemente es al menos de en torno al 95% o incluso un 99% en peso. Por ejemplo, un gen de una planta o una secuencia de ADN se pueden considerar sustancialmente libres de otros genes de plantas o secuencias de ADN.
- Superpool: Tal y como se utiliza en el contexto de la invención, un "superpool" se refiere a una mezcla de cantidades iguales de semillas de procedentes de 00 grupos principales diferentes. De este modo, el superpool contiene una cantidad equivalente de semillas procedentes de 500 plantas diferentes, pero tan sólo representa 100 cADN ya que cada masterpool está compuesto por semillas procedentes de 5 plantas diferentes transformadas conteniendo cada una de ellas el mismo cADN.
- T_{1}: Tal y como se utiliza en la presente solicitud, el Término T_{1} se refiere a la célula o planta que es el resultado directo de un experimento de transformación.
- T_{2}: Tal y como se utiliza en la presente solicitud, el Término T_{2} se refiere a la progenie de la célula o planta que es el resultado directo de un experimento de transformación.
- T_{3}: Tal y como se utiliza en la presente solicitud, el Término T_{3} se refiere a la progenie de segunda generación de la célula o planta que es el resultado directo de un experimento de transformación.
- Emplazamiento de inicio de la traslación: En el contexto de la actual invención, un "emplazamiento de inicio de la traslación" suele ser un ATG del transcripto cADN, y más concretamente, el primer ATG. No obstante, un cADN único puede tener múltiples emplazamientos de inicio de la traslación.
- Punto de inicio de la transcripción: "Punto de inicio de la transcripción" se utiliza en la presente invención para describir el punto en el cual se inicia la transcripción. Este punto suele estar situado a unos 25 nucleótidos después del punto del enlace TFIID, como una caja TATA. La transcripción puede iniciarse en uno o más puntos del interior del gen, y un solo gen puede tener múltiples emplazamientos de inicio de la transcripción, algunos de los cuales pueden ser específicos para la transcripción en un tipo de célula o tejido específico.
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- Región no trasladada (UTR): Una "UTR" es cualquier serie contigua de bases de nucleótido que se transcribe, pero que no se traslada. Estas regiones no trasladadas pueden estar asociadas a funciones específicas, como el incremento de la estabilidad del mensaje mARN. Entre los ejemplos de UTRs destacan, sin limitación, las señales de poliadenilación, secuencias de terminaciones, secuencias situadas entre el emplazamiento de inicio de la transcripción y el primer exón (5' UTR) y secuencias situadas entre el último exón y el final del mARN (3' UTR).
- Variante: El Término "variante" se utiliza en este documento para indicar un polipéptido o proteína o molécula de polinucleótido que se diferencia de algún modo de otras de sus mismo tipo. Por ejemplo, las variantes de polipéptido y proteína pueden consistir en cambios en la secuencia de aminoácidos y/o en cambios y/o modificaciones posteriores a la traslación (como la glicosilación, etc.).
- En condiciones de nitrógeno variables: En el contexto de la presente invención, la frase "en condiciones de nitrógeno variables" se refiere a unas condiciones de crecimiento en las que la concentración de nitrógeno disponible fluctúa. Esta frase incluye situaciones en las que la concentración de nitrógeno disponible es inicialmente baja, pero aumenta hasta unos niveles normales o elevados, así como otras situaciones en las que la concentración de nitrógeno disponible es inicialmente elevada, pero disminuye hasta unos niveles normales o bajos. Las situaciones que implican múltiples cambios en la concentración de nitrógeno disponible, como las fluctuaciones desde un nivel bajo a uno alto y de nuevo a uno bajo también están incluidas en esta frase. Estos cambios en la concentración de nitrógeno disponible pueden producirse de forma gradual o con carácter puntual.
- Condiciones de nitrógeno cero: Esta frase se refiere a una concentración total de nitrógeno de 0 mM.
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Los genes y polinucleótidos utilizados en la
presente invención resultan de interés debido a que están
incorrectamente expresados (es decir, cuando se expresan en un
centro no natural o en una cantidad creciente o decreciente)
producen plantas con un NUB modificado, como se comenta más
adelante, y como lo demuestran los resultados de experimentos con
expresiones diferenciales y expresiones incorrectas. Estos rasgos
pueden utilizarse para explotar o maximizar los productos de la
planta. Por ejemplo, los genes y polinucleótidos de la presente
invención se utilizan para aumentar la expresión de los productos de
genes de transporte de nitrato y amonio. Estos productos de genes de
transporte aumentan la absorción de nitrógeno y el transporte del
nitrógeno desde las raíces hasta las yemas, lo que produce un
aumento en la cantidad de nitrógeno disponible para su reducción a
amoniaco. Por todo ello, dichas plantas transgénicas requieren menos
fertilizante, lo que supone un menor coste para el agricultor y una
menor contaminación de la capa freática por nitrato.
Los ácidos nucleicos que responden al nitrógeno
y se utilizan en la invención también regulan por reducción el
número de genes que llevan a la inhibición por retroalimentación de
la absorción del nitrógeno y su reducción. Un ejemplo de estos genes
son aquellos que codifican las proteínas
14-3-3, las cuales reprimen la
nitrato reductasa (Swiedrych A et al., 2002, J Agric Food
Chem 27;50(7):2137-41. Repression of the
14-3-3 gene affects the amino acid
and mineral composition of potato tuber). Su expresión
antisentido en plantas transgénicas provoca un aumento del contenido
de aminoácidos y del contenido de proteínas de la semilla y/o las
hojas. Dichas plantas resultan especialmente útiles para alimentar
el ganado. Por ejemplo, un incremento en el contenido de aminoácidos
y/o proteínas de la alfalfa proporciona un incremento de la calidad
del forraje, y por ende, un mayor valor nutritivo.
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Las secuencias de la invención se han aislado a
partir de plantas, especialmente Arabidopsis thaliana, Glycine
max, Orgzasativa y Zeg mays.
La secuencia del nucleótido utilizada en la
presente invención modula la biomasa y la tasa de crecimiento de las
plantas transformadas. La expresión incorrecta de las secuencias
conduce a un incremento de la producción de aminoácidos, péptidos y
proteínas por parte de la planta, con el consiguiente incremento de
su valor nutricional. Las plantas transformadas que exhiben una
sobreexpresión de los genes de la invención crecen bien en
condiciones de baja concentración de nitrógeno, y presentan una
mayor tolerancia a la variación en las condiciones del nitrógeno,
requiriendo menos abono, lo que supone un menor coste para el
agricultor y una menor contaminación por nitrato de la capa
freática.
Se considera que las secuencias de nucleótidos
utilizadas en la invención codifican las proteínas de transporte.
Sin que ello esté vinculado a ninguna teoría, se cree que la
expresión del gen transportador ayuda a incrementar el transporte
desde el tejido de almacenamiento hasta el meristema, y el
desarrollo de hojas a partir de las semillas. Por lo tanto, estos
genes pueden hacer que las plantas sean insensibles al nitrógeno
ambiente, permitiendo cambios en las funciones de fertilidad.
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Puede simularse un entorno competitivo
utilizando un inhibidor de la asimilación de nitrógeno (N), lo que
proporciona un filtro útil para identificar los genes con una mayor
eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE). La selección consiguiente
proporciona un filtro muy útil para los genes N al eliminar el
carácter subjetivo de los experimentos que se basan en la limitación
de N y en la identificación de plantas con ligeros incrementos de
tamaño y
verdor.
verdor.
Los filtros del inhibidor de la asimilación del
nitrógeno se basan en el hecho de que en condiciones normales el
amonio se convierte en glutamina mediante la glutamina sintetasa
(Fig. 1). Cuando existen acumulaciones de N, la absorción del amonio
es desactivada mediante la regulación de retroalimentación. Pero un
inhibidor de la glutamina sintetasa, como la metionina sulfoximina
(MSX) bloquea la conversión del amonio en glutamina y afecta a la
biosíntesis de los principales compuestos que contienen nitrógeno,
como los aminoácidos, nucleótidos, clorofilas, poliaminas y
alcaloides (Fig. 1). De este modo, el cultivo de plantas en
presencia de un inhibidor de la asimilación de N permite la
identificación de las plantas con expresión errónea de un gen, y que
como consecuencia de ello, han mejorado su NOTE, independientemente
del N disponible en el terreno. Dichos "inductores de expresión
incorrecta" se identifican mediante un aumento en el verdor y
unas raíces más largas, en comparación con la planta en
estado
natural.
natural.
La invención resulta útil para mejorar unas
importantes características agronómicas de las plantas cultivadas.
Una de las mejoras consistiría en la capacidad de las plantas de
diseño para cultivarse de forma productiva con un menor aporte de
abonos nitrogenados y en terrenos pobres en nitrógeno. Entre las
mejoras adicionales destacan un crecimiento más vigoroso (es decir,
más rápido) y un mayor rendimiento vegetativo y reproductivo en
condiciones de cultivo normales (es decir, en condiciones que no se
de una limitación de los nutrientes). Para conseguir estas mismas
mejoras, los métodos tradicionales de cría de especies de cultivo
requerirían el filtrado de una enorme población. La presente
invención elimina la necesidad de dicho filtrado a gran escala
mediante la producción de plantas, muchas de los cuales, si no la
mayoría, presentarían las características deseadas.
De acuerdo con la presente invención, la
consecución de las mejoras deseadas en la planta puede requerir en
algunos casos la sobreexpresión ectópica de un solo gen o de
múltiples genes. La expresión modificada puede implicar la
ingeniería de la planta con uno o varios de los genes siguientes: a)
un transgen en el que la secuencia de codificación pueda asociarse
de forma operativa a un potente promotor constitutivo; b) copias
adicionales del gen nativo que codifica el componente deseado; c)
genes reguladores que activan la expresión del gen deseado para la
asimilación o utilización del nitrógeno; d) una copia del gen nativo
cuya región reguladora se ha modificado para mejorar la expresión; y
e) un transgen que exprese una versión mutada, alterada o quimérica
de una asimilación de nitrógeno o de un componente de
utilización.
En otros casos, la consecución de las mejoras
deseadas en la planta puede exigir la alteración del nivel de
expresión y/o del patrón de un componente de asimilación o
utilización de nitrógeno. El patrón de expresión alterada puede
implicar la ingeniería de la planta mediante uno o varios de los
genes siguientes: a) un transgen en el que la secuencia de
codificación pueda asociarse de forma operativa a un promotor con el
patrón de expresión deseado (dichos promotores pueden incluir
aquellos de los que se considera que tienen patrones de expresión
específicos de tejidos o de desarrollo); b) genes reguladores
modificados que activan la expresión del gen de codificación en el
patrón preferido; c) una copia nativa del gen de codificación de la
enzima cuya región reguladora se ha modificado para su expresión en
el patrón preferido.
En otros casos, la consecución de las mejoras
deseadas en la planta puede requerir la supresión del nivel de
expresión y/o del patrón de un componente de asimilación o
utilización del nitrógeno. La supresión de la expresión puede
implicar la ingeniería de la planta mediante genes que codifiquen
ARNs antisentido, ribozimas, constructos de
co-supresión o mutaciones "dominantes
negativas" (véase en Herskowitz, 1987, Nature
329:219-222 una explicación del mecanismo de
supresión del gen mediante mutaciones dominantes negativas).
Asimismo, la supresión del gen puede también conseguirse mediante el
diseño de la planta con un constructo de recombinación homólogo que
sustituye el gen nativo por una copia de un gen defectuoso o de una
secuencia de codificación de enzimas que se encuentre bajo el
control de un promotor con el nivel de expresión y/o el patrón
deseados.
En todos los casos, una planta que posea la
mejora deseada puede aislarse buscando en las plantas diseñadas un
patrón o nivel de expresión alterada del componente de asimilación o
utilización del nitrógeno, un patrón o nivel de expresión alterada
del mARN o proteína correspondientes, una alteración en las
capacidades de asimilación o utilización del nitrógeno, una mayor
tasa de crecimiento, un mejor rendimiento vegetativo o un mejor
rendimiento reproductor (por ejemplo, semillas o frutos más grandes
o más numerosas). El filtrado de las plantas de diseño puede
implicar ensayos e inmunoensayos para medir los niveles de
enzima/proteína; análisis Northern, protección de la RNasa,
prolongación del cebador, PCR Transcriptasa inversa, etc. para medir
los niveles de mARN; medición de la composición del aminoácido,
cantidad de aminoácidos libres o contenido total de nitrógeno de
diversos tejidos vegetales; medición de las tasas de crecimiento en
términos de aumento de peso a lo largo del tiempo; o medición del
rendimiento de la planta en términos de peso total en seco y/o peso
total de la semilla.
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Las propiedades de las secuencias de ácido
nucleico varían al igual que las estructuras genéticas de las
diversas posibles células vegetales huésped. Las realizaciones
preferidas describirán diversas características que cualquier
persona en la materia reconocerá como no absolutamente esenciales,
pero claramente ventajosas. Estas incluyen métodos de aislamiento,
síntesis o construcción de constructos genéticos, y determinadas
características de los vectores asociados a los constructos
genéticos, las manipulaciones de los constructos genéticos que han
de introducirse en las células vegetales, ciertas características de
los constructos genéticos y ciertas características de los vectores
asociados a los constructos genéticos.
Asimismo, los constructos genéticos utilizados
en la presente invención pueden codificarse en moléculas de ADN o
ARN. De acuerdo con la presente invención, se prefiere que el cambio
deseable, estable, genotípico de la planta objetivo se efectúa a
través de la integración genómica de constructos de ácido nucleico
introducidos de forma exógena, y especialmente, constructos de ADN
recombinante. No obstante, de acuerdo con la presente invención,
dichos cambios genotípicos también pueden efectuarse mediante la
introducción de episomas (ADN o ARN) que puedan replicarse de forma
autónoma y que sean somática y germinalmente estables. Cuando los
constructos de ácido nucleico que se han introducido incluyen ARN,
la transformación de la planta o la expresión del gen a partir de
dichos constructos puede efectuarse a través de un intermedio de ADN
obtenido por transcripción inversa.
Los constructos de ácido nucleico descritos en
este documento pueden producirse utilizando métodos bien conocidos
para cualquier persona versada en la materia. Los técnicos pueden
remitirse a fuentes como Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview, N.Y. en lo referente a métodos de ADN recombinante que se
pueden utilizar para aislar, caracterizar y manipular los
componentes de los constructos y para construir los propios
constructos. En determinados casos, cuando se conoce la secuencia de
ácido nucleico de un componente deseado, puede resultar ventajoso
sintetizarlo en lugar de aislarlo a partir de una fuente biológica.
En dichos casos, la persona versada en la materia puede hacer
referencia a lo enseñado por Caruthers et al., 1980, Nuc.
Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233, y por Chow and
Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9:2807-2817. En otros
casos, los componentes deseados pueden producirse ventajosamente
mediante la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). En lo que respecta a lo divulgado acerca de la PCR, cualquier
persona versada en la materia puede hacer referencia a Gelfand y
similares, 1989, PCR Technology, Principles and Applications for DNA
Amplification, H. A. Erlich, ed., Stockton Press, N.Y., Current
Protocols In Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 15, Ausubel et
al. eds., John Wiley & Sons, 1988.
De acuerdo con la presente invención, una planta
con sobreexpresión ectópica de un componente de asimilación o
utilización de nitrógeno puede someterse a un proceso de ingeniería
mediante la transformación de una célula de la planta con un
constructo genético que comprenda un promotor vegetal que esté
asociado operativamente a una secuencia que codifique el componente
deseado. (en este caso, asociado operativamente significa que la
transcripción controlada por el promotor "asociado" produciría
un ARN mensajero funcional, cuya traslación produciría el
componente). En una realización preferida de la presente invención,
el promotor asociado es un promotor vegetal potente y no específico
del tejido o del desarrollo (por ejemplo, un promotor que se exprese
con fuerza en muchos o en todos los tipos de tejido). Entre los
ejemplos de dichos promotores potentes y "constitutivos" se
encuentran, sin limitación, el promotor del CaMV 35S, el promotor de
la manopina sintetasa del T-ADN y sus diversos
derivados.
En otra realización de la presente invención,
puede resultar ventajoso someter a un proceso de ingeniería una
planta con un constructo genético que asocie operativamente un
promotor específico de tejido o de desarrollo a una secuencia que
codifique el componente deseado. Por ejemplo, cuando se desee la
expresión en tejidos y órganos fotosintéticos, pueden utilizarse
promotores como los de la ribulosa bisfosfato carboxilasa (RUBISCO)
o los genes de la proteína de enlace a/b de la clorofila (CAB);
cuando se desee la expresión en semillas, pueden utilizarse
promotores como los genes de la legehemoglobina o nodulina; cuando
se desea la expresión específica en la raíz, pueden utilizarse
promotores como los de los diversos genes de proteínas de
almacenamiento de la semilla; cuando se desea la expresión en
nódulos de fijación del nitrógeno, pueden utilizarse promotores como
los que codifican los genes de la sintetasa glutamina específicos de
la raíz (véase Tingey et al., 1987, EMBO J.
6:1-9; Edwards et al., 1990, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 87:3459-3463).
En una realización adicional de la presente
invención, puede resultar ventajoso transformar una planta con un
constructo genético que asocie operativamente un promotor inducible
a una secuencia que codifique el componente deseado. Los ejemplos de
dichos promotores son muchos y variados. Incluyen, sin limitación,
los de los genes de choque térmico, el gen de respuesta de defensa
(por ejemplo, los de la fenilalanina amonio liasa), los genes
inducidos por heridas (por ejemplo, los genes de proteínas de la
pared celular ricos en hidroxiprolina), genes químicamente
inducibles (por ejemplo, genes de nitrato reductasa, genes de
gluconasa, genes de chitinasa, etc.) o genes inducibles por la
oscuridad, por nombrar tan sólo algunos.
En otra realización de la presente invención,
puede resultar ventajoso transformar una planta con un constructo
genético que enlace operativamente un promotor modificado o
artificial a una secuencia que codifique el componente deseado.
Normalmente, dichos promotores, construidos mediante recombinación
de elementos estructurales de diferentes promotores, tienen patrones
de expresión únicos y/o niveles no encontrados en promotores
naturales. Véanse, por ejemplo, en Salina et al., 1992, Plant
Cell 4:1485-1493, ejemplos de promotores
artificiales construidos a partir de la combinación de elementos
cis-reguladores con un núcleo promotor.
En otra realización adicional de la presente
invención, la sobreexpresión ectópica de un componente de
asimilación o de utilización del nitrógeno puede diseñarse
incrementando el número de copias del gen que codifica el componente
deseado. Un método de producción de una célula de una planta con un
mayor número de copias del gen deseado consiste en transformar con
ácido nucleico constructos que contengan múltiples copias del gen.
Alternativamente, un gen que codifique el componente deseado se
puede situar en un constructo de ácido nucleico que contenga un gen
marcador seleccionable por amplificación (ASM) como el gen de la
glutamina sintetasa o la dihidrofolato reductasa. Las células
transformadas mediante dichos constructos se someten a regímenes de
cultivo que seleccionan líneas celulares con un número mayor de
copias del gen ASK. Véase en Donn et al., 1984, J. Mol. Appl.
Genet. 2:549-562, un protocolo de selección
utilizado para aislar una línea celular de plantas que contiene
copias amplificadas del gen GS. Debido a que el gen deseado está
estrechamente relacionado con el gen ASH, las líneas celulares que
amplifican el gen ASH también tendrían probablemente amplificado el
gen que codifica el componente deseado.
En otra realización de la presente invención, la
sobreexpresión ectópica de un componente de asimilación o
utilización del nitrógeno puede diseñarse mediante la transformación
de una célula vegetal con un constructo de ácido nucleico que
codifique un gen regulador que controle la expresión del gen
endógeno o un transgen que codifique el componente deseado, en el
que el gen regulador introducido se modifica para permitir una
expresión potente del componente en los tejidos y/o en las fases de
desarrollo deseados, el promotor de la sintetasa y sus diferentes
derivados.
\vskip1.000000\baselineskip
La planta deseada puede diseñarse mediante la
supresión de la actividad GS o las actividades de los demás
componentes que participan en la asimilación/metabolismo del
nitrógeno (Fig. 1). En una realización, la supresión puede diseñarse
mediante la transformación de una célula vegetal mediante un
constructo genético que codifique un ARN antisentido complementario
de un segmento o de todo el transcripto ARN objetivo huésped,
incluyendo el mARN objetivo maduro. En otra realización, la
supresión del gen objetivo (por ejemplo, el GS mARN) puede diseñarse
mediante la transformación de una célula vegetal con un constructo
celular que codifique una ribozima que divida un transcripto ARN
objetivo huésped (por ejemplo, un transcripto GS ARN, incluyendo el
GS mARN maduro).
En otra realización, la supresión del gen
objetivo puede diseñarse mediante la transformación de una célula de
una planta con un constructo genético que codifique el componente
objetivo que contiene una mutación "dominante negativa". Las
mutaciones preferidas son aquellas que afectan a la catálisis, a la
unión al sustrato, (por ejemplo, en el caso de GS, el punto de unión
del ión glutamato o amonio) o a la liberación del producto. Una
mutación útil puede consistir en el borrado o mutación puntual de
los residuos críticos que participan en los procesos anteriormente
mencionados. Un experto en la materia puede remitirse a lo descrito
en este documento y en Herskowitz (Nature,
329:219-222, 1987) en lo tocante a los métodos y
estrategias de obtención de mutaciones dominantes negativas.
Para todos los constructos de supresión
anteriormente mencionados, se prefiere que dichos constructos
genéticos se expresen con el mismo tejido y especificidad de
desarrollo que el gen objetivo. De este modo, se prefiere que estos
constructos de supresión estén operativamente asociados al promotor
del gen objetivo. Alternativamente, puede preferirse que los
constructos de supresión se expresen constitutivamente. De este
modo, también se puede utilizar un promotor constitutivo potente
como el promotor de la CaMV 35S para expresar los constructos de
supresión. Uno de los promotores preferidos de estos constructos de
supresión es un promotor modificado del gen objetivo, en el que las
modificaciones tienen como resultado una expresión mejorada del
promotor del gen objetivo sin cambios en las especificidades del
tejido o del desarrollo.
De acuerdo con la utilización de la presente
invención, las plantas deseadas con expresión del gen objetivo
suprimida pueden también diseñarse mediante la transformación de una
célula de la planta con un constructo de
co-supresión. Un constructo de
co-supresión comprende un promotor funcional
operativamente asociado a una secuencia de codificación parcial o
completa del gen objetivo. Se prefiere que el promotor asociado
operativamente sea un potente promotor constitutivo, como el
promotor CaMV35S. Alternativamente, el promotor del constructo de
cosupresión puede ser uno que se exprese con las mismas
especificidades de tejido y desarrollo que el gen objetivo. Dichos
promotores alternativos podrían incluir el promotor del propio gen
objetivo (por ejemplo, un promotor GS para orientar la expresión de
un constructo de co-supresión GS).
De acuerdo con la presente invención, se
prefiere que el constructo de co-supresión codifique
un mARN objetivo incompleto o una enzima objetivo defectuosa, aunque
un constructo que codifique un ARN o enzima objetivo plenamente
funcional también puede resultar útil a la hora de efectuar la
co-supresión.
En las realizaciones, cuando se desea la
supresión de la mayoría, si no de todas las isozimas, se prefiere
que el constructo de co-supresión codifique una
copia total o parcial del mARN GS cloroplástico (por ejemplo, el
mARN pea GS2). Como se describe en el presente documento (sección
6.2.2), dichos constructos resultan especialmente útiles a la hora
de suprimir la expresión del gen objetivo.
\newpage
Las plantas deseadas con expresión suprimida del
gen objetivo también se pueden diseñar mediante la transformación de
la célula de una planta con un constructo que pueda efectuar una
mutagénesis dirigida al punto, del gen objetivo endógeno (Véanse en
Offringa et al., 1990, EMBO J. 9:3077-84; y
Kanevskii et al., 1990, Dokl. Akad. Nauk. SSSR
312:1505-1507 las discusiones relativas a
constructos nucleicos para llevar a cabo mutagénesis dirigidas al
punto de genes objetivo en plantas). Se prefiere que dichos
constructos lleven a cabo la supresión del gen objetivo mediante la
sustitución de la secuencia del gen objetivo endógena mediante la
recombinación homóloga con ninguna secuencia o con una secuencia de
codificación inactiva.
\vskip1.000000\baselineskip
El Constructo recombinante utilizado en la
presente invención puede incluir un marcador seleccionable para la
propagación del constructo. Por ejemplo, un constructo que ha de
propagarse en bacterias contiene preferiblemente un gen de
resistencia antibiótica, como el que confiere resistencia frente a
la canamicina, tetraciclina, estreptomicina, o cloranfenicol. Los
vectores adecuados para la propagación del constructo incluyen los
plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o virus, por nombrar tan sólo
unos pocos.
Además, los constructos recombinantes pueden
incluir genes marcadores expresables en plantas, seleccionables o
filtrables, para aislar, identificar o efectuar el seguimiento de
las células de plantas transformadas por estos constructos. Los
marcadores seleccionables incluyen, sin llimitación, los genes que
codifican las resistencias a los antibióticos (por ejemplo,
resistencia a la canamicina o la higromicina) o la resistencia a los
herbicidas (por ejemplo, resistencia a la sulfonilurea, a la
fosfonitrotricina, o al glifosato). Entre los marcadores filtrables
se incluyen, sin limitación, los genes que codifican la
beta-glucoronidasa (Jefferson, 1987, Plant Molec
Biol. Rep 5:387-405), la luciferasa (Ow et
al., 1986, Science 234:856-859), productos
genéticos B y C1 que regulan la producción del pigmento antocianina
(Goff et al., 1990, EMBO J 9:2517-2522).
En las realizaciones utilizadas en la presente
invención y que recurren al sistema Agrobacterium para transformar
las plantas (véase más adelante) los constructos de ADN recombinante
comprenden adicionalmente al menos la secuencia frontera de
T-ADN derecha que flanquea las secuencias de ADN que
van a transformarse en células de planta. En las realizaciones
preferidas, las secuencias que se han de transferir están
flanqueadas por las secuencias fronteras de T-ADN
derecha e izquierda. El diseño y la construcción adecuados de dichos
vectores de transformación basados en T-ADN son
perfectamente conocidos por las personas versadas en la materia.
Para utilizar las secuencias de la presente
invención, o una combinación de las mismas o partes y/o mutantes y/o
fusiones y/o variantes de las mismas, se preparan constructos de ADN
recombinante que comprenden las secuencias de polinucleótidos de la
invención, insertadas en un vector, y que son adecuadas para la
transformación de las células de la planta. El constructo puede
obtenerse utilizando técnicas estándar de ADN recombinante (Sambrook
et al), 1989 y puede introducirse en las especies de interés
mediante una transformación mediada por Agrobacterium o por
cualquier otro de los medios de transformación que se indican más
adelante.
El núcleo del vector puede ser cualquiera de los
más comunes en la técnica, como plásmidos, virus, cromosomas
artificiales, BACs, YACs y PACs y vectores del tipo descrito
por:
- (a)
- BAC: Shizuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8794-8797 (1992); Hamilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9975-9979 (1996);
- (b)
- YAC: Burke et al., Science 236:806-812 (1987);
- (c)
- PAC: Stemberg N. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Jan;87(1):103-7 (1990);
- (d)
- Bacteria-Yeast Shuttle Vectors: Bradshaw et al., Nucl Acids Res 23: 4850-4856 (1995);
- (e)
- Lambda Phage Vectors: Replacement Vector, e.g., Frischauf et al., J. Mol Biol 170: 827-842 (1983); or Insertion vector, e.g., Huynh et al., In: Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Approach, Vol. 1 Oxford: IRL Press (1985); T-DNA gene fusion vectors :Walden et al., Mol Cell Biol 1: 175-194 (1990); y
- (g)
- Plasmid vectors: Sambrook et al., infra.
\vskip1.000000\baselineskip
Normalmente, el constructo comprende un vector
que contiene una secuencia de la presente invención con cualquier
secuencia reguladora transcripcional y traslacional deseada, como
promotores, UTRs y secuencias de terminación del extremo 3'. Los
vectores también pueden incluir los orígenes de la replicación,
regiones de unión al armazón (SARs), marcadores, secuencias
homólogas, intrones, etc. El vector puede comprender un gen marcador
que confiere un fenotipo seleccionable en células de plantas.
Normalmente, el marcador codifica la resistencia a los biocidas,
especialmente la resistencia a los antibióticos, como la resistencia
a la canamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a los
herbicidas, como la resistencia al clorsulfurón o a la
fosfonitrotricina.
Se utiliza un fragmento promotor de la planta
que dirige la transcripción del gen en todos los tejidos de una
planta regenerada y que puede ser un promotor constitutivo, como el
355. Alternativamente, el promotor de la planta dirige la
transcripción de una secuencia de la invención en un tejido
específico (promotores específicos del tejido) o se encuentra de
otro modo bajo un control medioambiental más preciso (promotores
inducibles).
Si se desea producir el polipéptido adecuado, se
incluye normalmente una región de poliadenilación en el extremo 3'-
de la región de codificación, La región de poliadenilación puede
obtenerse a partir del gen natural, de otros genes de plantas o del
T-ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión ectópica de las secuencias
utilizadas en la invención también se lleva a cabo utilizando el
método "knockin". En este caso, el primer componente, una
"línea activadora" es una planta transgénica que comprende un
activador transcripcional operativamente unido a un promotor. El
segundo componente comprende la secuencia de cADN deseada unida
operativamente a la secuencia/región de unión objetivo del activador
transcripcional. El segundo componente se transforma en la "línea
activadora" o se utiliza para transformar una planta huésped a
fin de producir una línea "objetivo" que se cruza con la
"línea activadora" mediante métodos de reproducción ordinarios.
En cualquiera de los casos, el resultado es el mismo. Es decir, el
promotor impulsa la producción de la proteína de activación
transcripcional que a su vez se una a la región de unión objetivo
para facilitar la expresión del cADN deseado.
Cualquier promotor que funcione en plantas puede
ser utilizado en el primer componente, como el promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor o un promotor de tejidos u órganos
específicos. Entre los polipéptidos activadores transcripcionales
adecuados se encuentran, sin limitación, los que codifican HAP1 y
GAL4. La secuencia de unión reconocida y seleccionada por la
proteína de activación transcripcional seleccionada se utilizará en
el segundo componente.
\vskip1.000000\baselineskip
Son bien conocidas las técnicas de
transformación de una amplia variedad de especies de plantas
superiores, y se encuentran descritas en la literatura técnica, como
por ejemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421 (1988);
y Christou, Euphytica, v. 85, n.1-3:
13-27, (1995).
El experto en la materia conoce procesos para la
transformación de planta monocotiledóneas y dicotiledóneas. Se
dispone de diversas técnicas para la introducción del ADN en una
célula de la planta huésped. Estas técnicas comprenden la
transformación de las células de la planta mediante inyección de
ADN, electroporación de ADN, métodos balísticos, fusión de
protoplastos y mediante el T-ADN utilizando
Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes,
así como otras posibilidades.
Los constructos de ADN utilizados en la
invención se introducen en el genoma de la planta huésped deseada
mediante diversas técnicas convencionales. Por ejemplo, el
constructo de ADN se introduce directamente en el ADN genómico de la
célula de la planta utilizando técnicas como la electroporación, la
microinyección y la precipitación de glicol de polietileno
procedente de los protoplastos de la célula o de la fusión de
protoplastos. Las técnicas de electroporación se describen en Fromm
et al. Proc. Natl Acad Sci. USA 82:5824 (1985). Las técnicas
de microinyección se conocen en la técnica y están perfectamente
descritas en la literatura científica y de patentes. Los plásmidos
no tienen que cumplir unos requisitos específicos para su
utilización en la electroporación del ADN o en la inyección del ADN
en células de la planta. Pueden utilizarse plásmidos simples, como
los derivados de tipo pUC.
La introducción de los constructos de ADN
utilizando la fusión de protoplastos se describe en Paszkowski et
al. EMBO J. 3:2717 (1984). Introduction of foreign DNA using
protoplast fusion is described by Willmitzer (Willmitzer, L., 1993
Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume
Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler,
eds.), Vol. 2, 627-659, VCH
Weinheim-New
York-Basel-Cambridge).
Alternativamente, los constructos de ADN
utilizados en la invención se introducen directamente en el tejido
de la planta utilizando métodos balísticos, como el bombardeo de
partículas de ADN. Las técnicas de transformación balística son
descritas por Klein et al. Nature 327:773 (1987). La
introducción de ADN ajeno utilizando la balística es descrita por
Willmitzer (Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. En:
Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise
(H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2,
627-659, VCH Weinheim-New
York-Basel-Cambridge).
Los constructos de ADN también se introducen con
la ayuda de las Agrobacterias. La utilización de las agrobacterias
para la transformación celular de la planta se ha examinado
ampliamente y se describe de forma suficiente en la especificación
de EP-A 120 516, así como por Hoekema (En: The
Binary Plant Vector System Offsetdrulckerij Kanters B.V.,
Alblasserdam (1985), Chapter V), Fraley et al. (Crit. Rev.
Plant. Sci. 4, 1-46) y por An et al. (EMBO J.
4 (1985), 277-287). Mediante esta técnica, los
constructos de ADN de la invención recombinan con unas regiones
adecuadas de flanqueo del T-ADN y se introducen en
un vector huésped convencional de Agrobacterium tumefaciens.
Las funciones de virulencia del huésped del Agrobacterium
tumefaciens dirigen la inserción del constructo y de los
marcadores adyacente en el ADN celular de la planta cuando la célula
se infecta con la bacteria (McCormac et al., 1997, Mol.
Biotechnol. 8: 199; Hamilton, 1997, Gene 200:107; Salomon et
al., 1984 EMBO J. 3:141; Herrera-Estrella et
al., 1983 EMBO J. 2:987). Las técnicas de transformación mediada
por el Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarmado y
la utilización de vectores binarios o cointegrados, se encuentra
bien descrita en la literatura científica. Véase, por ejemplo,
Hamilton, CM., Gene 200:107 (1997); Müller et al. Mol. Gen.
Genet. 207:171 (1987); Komari et al. Plant J. 10:165 (1996);
Venkateswarlu et al. Biotechnology 9:1103 (1991) y Gleave,
AP., Plant Mol. Biol. 20:1203 (1992); Graves and Goldman, Plant Mol.
Biol. 7:34 (1986) y Gould et al., Plant Physiology 95:426
(1991).
Para la transferencia de ADN al
T-ADN de la célula de la planta, los explantes de
plantas, o células de la planta que se han cultivado en suspensión o
protoplastos, se cultivan conjuntamente con Agrobacterium
tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Las plantas
completas se regeneran a partir del material vegetal infectado
utilizando un medio adecuado que contenga antibióticos o biocidas
para la selección de las células transformadas. Las plantas
obtenidas de esta forma se examinan a continuación para detectar la
presencia del ADN introducido. La transformación de las plantas
dicotiledóneas mediante sistemas de vector del Plásmido Ti y
Agrobacterium tumefaciens está perfectamente documentada.
Las plantas monocotiledóneas también se
transforman mediante vectores basados en Agrobacterium. (Véase Chan
et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506;
Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Deng
et al., Science in China 33 (1990), 28-34;
Wilmink et al., Plant Cell Reports 11 (1992),
76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995),
486-492; Conner and Domisse; Int. J. Plant Sci. 153
(1992), 550-555; Ritchie et al., Transgenic
Res. 2 (1993), 252-265). Concretamente, en la
literatura se ha descrito la transformación del maíz (véase, por
ejemplo, WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et
al., Biotechnology 8 (1990), 833-844;
Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990),
603-618; Koziel et al., Biotechnology 11
(1993), 194-200). En EP 292 435, así como en
Shillito et al. (1989, Bio/Technology 7, 581) se obtienen
plantas fértiles a partir de un callo de maíz blando (friable) libre
de mucosidad. Prioli y Söndahl (1989, Bio/Technology 7, 589) también
informan acerca de la regeneración de plantas fértiles a partir de
protoplastos de líneas puras del maíz Cateto, Cat
100-1.
Otras especies de cereales también se han
transformado con éxito, como la cebada (Wan y Lemaux, véase más
arriba; Ritala et al., véase más arriba) y el trigo (Nehra
et al., 1994, Plant J. 5, 285-297).
Las alternativas a la transformación mediante
Agrobacterium en el caso de las plantas monocotiledóneas las
constituyen la balística, fusión de protoplastos, electroporación de
células parcialmente permeabilizadas y el uso de fibras de vidrio
(Véase Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994),
37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11
(1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol.
Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al.,
Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631)).
El ADN introducido suele ser estable tras su
integración en el genoma de la planta y se transmite a la progenie
de la célula o planta transformada. Por lo general, la célula
transformada de la planta contiene un marcador seleccionable que
hace a las células transformadas resistentes a un biocida o
antibiótico, como la canamicina, el G 418, la bleomicina, la
higromicina, la fosfonitricina u otras. Por lo tanto, el marcador
seleccionado individualmente debería permitir la selección de
células transformadas a partir de células que carezcan del ADN
introducido.
Las células transformadas crecen en el interior
de la planta de la forma habitual (McCormick et al., 1986,
Plant Cell Reports 5, 81-84) y las plantas
resultantes se cultivan normalmente. Las células de plantas
transformadas obtenidas mediante cualquiera de las anteriores
técnicas de transformación se cultivan para regenerar una planta
completa que posea el genotipo transformado y por tanto el genotipo
deseado. Dichas técnicas de regeneración se basan en la manipulación
de una serie de fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo
de tejidos basándose normalmente en un marcador de biocida y/o
herbicida que se ha introducido conjuntamente con las secuencias de
nucleótido deseadas.
La regeneración de la planta a partir de los
protoplastos cultivados se describe en Evans et al.,
Protoplasts Isolation and Culture in "Handbook of Plant Cell
Culture", pp. 124-176, MacMillan Publishing
Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant
Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1988.
La regeneración también se produce a partir de callos, explantes,
órganos o partes de los mismos. Dichas técnicas de regeneración se
han descrito en términos generales en Klee et al. Ann. Rev.
of Plant Phys. 38:467 (1987). La regeneración de las
monocotiledóneas (arroz) es descrita por Hosoyama et al.
(Biosci. Biotechnol. Biochem. 58:1500 (1994)) y por Ghosh et
al. (J. Biotechnol. 32:1 (1994)).
Las semillas se obtienen a partir de las plantas
y se utilizan para verificar la estabilidad y la herencia. Por lo
general, se cultivan dos o más generaciones para asegurarse de que
la característica fenotípica se mantiene y transmite de forma
estable.
Un experto reconocerá que una vez que el casete
de expresión se haya incorporado de forma estable a las plantas
transgénicas y se haya confirmado su operatividad, podrá
introducirse en otras plantas mediante cruce sexual. Puede
utilizarse cualquiera de las técnicas de cultivo estándar, en
función de la especie que vaya a cruzarse.
Los ácidos nucleicos utilizados en la invención
se utilizan para conferir el rasgo genético de una mayor eficiencia
en el uso del nitrógeno, sin reducir la fertilidad, esencialmente en
cualquier planta.
\newpage
Las secuencias de nucleótidos utilizadas de
acuerdo con la invención codifican generalmente una proteína
adecuada a partir de cualquier organismo, especialmente a partir de
plantas, hongos, bacterias o animales. Preferiblemente, las
secuencias codifican proteínas procedentes de plantas u hongos.
Preferiblemente, las plantas son plantas evolucionadas, y
especialmente, plantas útiles que almacenan almidón o aceites, como
las patatas o los cereales como el arroz, el maíz, el trigo, la
cebada, el triticale, la avena, el mijo, etc., así como las
espinacas, el tabaco, la remolacha azucarera, la soja, el algodón,
etc.
En principio, la utilización de acuerdo con la
invención puede aplicarse a cualquier planta. Por lo tanto, resultan
especialmente adecuadas especies de plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas. El proceso se utiliza preferiblemente con plantas
que resultan interesantes para la agricultura, la horticultura y la
silvicultura. Entre los diversos ejemplos se encuentran verduras
como el pepino, el melón, la calabaza, la remolacha, el calabacín,
el tomate, las espinacas, diversas especies de repollos, guisantes,
judías, etc., así como con frutas como las peras, manzanas, etc.
De este modo, la invención puede utilizarse con
una amplia gama de plantas, incluyendo especies procedentes de los
géneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica,
Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis,
Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus,
Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Loliwn,Lupinus,
Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea,
Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum,
Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum,
Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna,
y Zea.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, puede
obtenerse una planta deseable mediante la transformación de la
célula de una planta con los constructos de ácido nucleico descritos
en este documento. En ciertos casos, podría resultar deseable
diseñar una planta o célula de una planta con diversos constructos
genéticos diferentes. Dicho diseño puede llevarse a cabo mediante la
transformación de una planta o de una célula de una planta
simultáneamente con todos los constructos genéticos deseados.
Alternativamente, la ingeniería puede llevarse a cabo de forma
secuencial. Es decir, la transformación con un constructo genético,
la obtención del transformante deseado tras la selección y el
filtrado, la transformación del transformante con un segundo
constructo genético, y así sucesivamente. En las realizaciones
preferidas, todos los constructos genéticos estarían vinculados a un
diferente gen marcador seleccionable o filtrable, para facilitar la
identificación de transformantes de plantas que contienen múltiples
inserciones de genes. En otra realización, pueden incorporarse
diferentes tipos de genes a una planta mediante el cruce de líneas
parentales transformadas para cada gen.
En una realización de la presente invención, se
utiliza el Agrobacterium para introducir los constructos genéticos
en las plantas. Preferiblemente, dichas transformaciones utilizan
vectores de T-ADN binarios de Agrobacterium (Bevan,
1984, Nuc. Acid Res. 12: 8711-8721), y el
procedimiento de co-cultivo (Horsch et al.,
1985, Science 227:1229-1231). En general, el sistema
de transformación por Agrobacterium se utiliza para la
transformación de plantas dicotiledóneas (Bevan et al., 1982,
Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al.,
1986, Methods Enzymol. 118:627-641). La
transformación mediante el sistema del Agrobacterium también puede
utilizarse para transformar y transferir ADN a plantas
monocotiledóneas y células de plantas. (Véase Hernalsteen et
al., 1984, EMBO J 3:3039-3041;
Hooykass-Van Slogteren et al., 1984, Nature
311:763-764; Grimsley et al., 1987, Nature
325:1677-179; Boulton et al., 1989, Plant
Mol. Biol. 12:31-40.; Gould et al., 1991,
Plant Physiol. 95:426-434).
En otras realizaciones, también se pueden
utilizar diversos métodos alternativos para la introducción de
constructos de ácido nucleico recombinantes en plantas y células de
plantas. Estos otros métodos resultan especialmente útiles cuando el
objetivo es una planta o célula de planta monocotiledónea. Los
métodos alternativos de transferencia y transformación de genes
incluyen, sin limitación, la transformación de protoplastos mediante
la absorción de ADN desnudo mediada por calcio, glicol de
polietileno (PEG) o electroporación (véase Paszkowski et al.,
1984, EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al.
1985, Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et
al., 1985, Proc. Nat Acad. Sci. USA
82:5824-5828; Shimamoto, 1989, Nature
338:274-276) y la electroporación de tejidos de
plantas (D'Halluin et al., 1992, Plant Cell
4:1495-1505). Entre los métodos adicionales para la
transformación de las células de las plantas incluyen la
microinyección, la absorción de ADN mediada por carburo de silicio
(Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Reporter
9:415-418), y el bombardeo con microproyectiles
(véase Klein et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA
85:4305-4309; Gordon-Kamm et
al., 1990, Plant Cell 2:603-618).
De acuerdo con la utilización de la presente
invención, puede diseñarse una amplia variedad de plantas y de
sistemas de células de plantas para las características fisiológicas
y agronómicas deseadas que se describen en el presente documento
utilizando los constructos de ácido nucleico de la presente
invención y los diversos métodos de transformación que se han
mencionado anteriormente. En las realizaciones preferidas, las
plantas objetivo y las células de plantas para ser sometidas a
ingeniería incluyen, sin limitación, las del maíz, trigo, arroz,
soja, tomate, tabaco, zanahorias, patatas, remolachas azucareras,
girasol, batata, Arabidopsis, colza y petunia.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el uso de la presente invención,
las plantas deseadas se pueden obtener sometiendo a un proceso de
ingeniería los constructos genéticos descritos con una serie de
tipos de células de plantas, incluyendo, sin limitación,
protoplastos, células de cultivos de tejidos, explantes de tejidos y
órganos, pólenes, embriones y plantas enteras. En una realización de
la presente invención, el material de la planta se selecciona o
filtra para detectar transformantes (los que incorporan o integran
el constructo genético introducido) de acuerdo con los métodos
descritos más adelante. A continuación, un transformante aislado
puede regenerarse en una planta. Alternativamente, el material de la
planta sometido a un proceso de transformación mediante ingeniería
puede regenerarse para formar una planta o plántula antes de someter
la planta o plántula obtenida a selección o filtrado de los rasgos
genéticos del marcador. Los procedimientos de regeneración de
plantas a partir de células de plantas, tejidos u órganos, bien
antes o después de seleccionar o filtrar los genes marcadores son
bien conocidos para las personas versadas en la materia.
Una célula de planta transformada, un callo,
tejido o planta puede identificarse y aislarse mediante la selección
o filtrado del material de la planta sometido a un proceso de
ingeniería para detectar los rasgos genéticos codificados por los
genes marcadores presentes en el ADN de transformación. Por ejemplo,
la selección puede llevarse a cabo cultivando el material de la
planta sometido al proceso de ingeniería en un medio que contenga
una cantidad inhibitoria del antibiótico o herbicida frente al que
confiere resistencia el constructo genético de la transformación.
Asimismo, las plantas transformadas y las células de plantas pueden
también identificarse mediante filtrado de las actividades de
cualquier gen marcador visible (por ejemplo, los genes
.beta.-glucuronidasa, luciferasa, B o C1) que pueden estar presentes
en los constructos de ácido nucleico recombinante de la presente
invención. Dichas metodologías de selección y filtrado son bien
conocidas para las personas versadas en la materia.
También pueden utilizarse métodos físicos y
bioquímicos para identificar los transformantes de la planta o de
las células de la planta que contienen los constructos genéticos de
la presente invención. Estos métodos incluyen, sin limitación: 1)
análisis de Southern o amplificación de PCR para la detección y
determinación de la estructura del inserto de ADN recombinante. 2)
Método de Northern blot, protección de la S1 RNasa, prolongación del
cebador, o amplificación de la PCR Transcriptasa inversa, etc. para
detectar y examinar los transcriptos de ARN de los constructos
genéticos; 3) ensayos enzimáticos para detectar la actividad de las
enzimas o ribozimas, cuando dichos productos genéticos son
modificados por el constructo genético; 4) electroforesis de
proteínas en gel, técnicas de Western blot, inmunoprecipitación o
inmunoensayos enlazados por enzimas, cuando los productos del
constructo genético son proteínas. También pueden utilizarse
técnicas adicionales, como la hibridación in situ, la tinción
por enzimas, y la inmunotinción, para detectar la presencia o
expresión del constructo recombinante en órganos y tejidos
específicos de la planta. Los métodos de realización de todos estos
ensayos son bien conocidos para las personas versadas en la
materia.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la utilización de la presente
invención, para la obtención de plantas con unas características
agronómicas mejoradas, las plantas transformadas pueden filtrarse
para detectar aquellas que presenten la alteración fisiológica
deseada. Por ejemplo, cuando las plantas se han sometido a un
proceso de ingeniería para detectar la sobreexpresión ectópica de
una enzima GS, se examinan las plantas transformadas para detectar
aquellas que expresan la enzima GS al nivel deseado y en los tejidos
y fases de desarrollo deseadas. Cuando se han diseñado las plantas
para la supresión de un gen objetivo, se examinan las plantas
transformadas para detectar aquellas que expresan el producto
genético objetivo (por ejemplo, ARN o proteína) a niveles reducidos
en diversos tejidos. Las plantas que presentan los cambios
fisiológicos deseados, por ejemplo, sobreexpresión de la GS ectópica
o supresión de la enzima GS, pueden filtrarse posteriormente para
detectar aquellas plantas que presentan los cambios agronómicos
deseados.
Alternativamente, las plantas transformadas
pueden filtrarse para detectar las que exhiben los cambios
agronómicos deseados. En una realización, dicho filtrado puede
referirse al crecimiento productivo de las plantas transformadas en
condiciones de deficiencia de nutrientes nitrogenados. Esto consiste
en detectar el crecimiento de las plantas transformadas en unas
condiciones, con respecto a los nutrientes nitrogenados disponibles,
que causen el cese o la disminución del crecimiento de la planta
natural y reduzcan significativamente el tamaño o la calidad de la
planta natural. Un ejemplo de unas condiciones de deficiencia de los
nutrientes nitrogenados del tabaco y las plantas con unas
necesidades de nutrientes nitrogenados similares es que cuando el
único nutriente nitrogenado del suelo o del medio sintético es (a)
nitrato suministrado o aplicado periódicamente a una concentración
de 0,5 mM o inferior, o (b) los equivalentes fisiológicos del
nitrato (por ejemplo, amonio o una mezcla de nitrato y amonio)
suministrados o periódicamente aplicados a una concentración que sea
fisiológicamente equivalente a 0,5 mM de nitrato o inferiores (Véase
Eckes et al., 1988, documento no.
AU-A-17321/88 de la oficina
australiana de patentes). Otro ejemplo de una condición deficiente
de nutrientes nitrogenados es cuando el nivel en fase estable del
nutriente nitrogenado disponible en el suelo o medio sintético es de
menos de 0,02 mN de nitrato o equivalentes fisiológicos del mismo.
El término nitrato, tal y como se utiliza en este documento,
significa una de las sales de nitrato, normalmente utilizadas como
fertilizante nitrogenado para plantas, o cualquier mezcla de las
mismas, como por ejemplo, nitrato potásico, nitrato cálcico, nitrato
sódico, nitrato de amonio, etc. El término amonio, tal y como se
utiliza en este documento, significa una de las sales de amonio,
normalmente utilizadas como fertilizante nitrogenado para plantas, o
cualquier mezcla de las mismas, como por ejemplo, nitrato de amonio,
cloruro de amonio, sulfato de amonio, etc.
En otras realizaciones, el filtrado de las
plantas transformadas puede llevarse a cabo para detectar mejoras en
las características agronómicas (por ejemplo, un crecimiento más
rápido, un mayor rendimiento vegetativo o reproductivo, un mayor
contenido en proteínas, etc.) en comparación con las plantas
progenitoras no modificadas, cuando se cultivan en unas condiciones
de crecimiento no limitadoras del nitrógeno (es decir, cultivadas
utilizando terrenos o medios que contengan o reciban suficientes
cantidades de nutrientes nitrogenados que respalden el crecimiento
saludable de la planta). Un ejemplo de condiciones no limitadoras de
tabaco y plantas con unas similares necesidades de nutrientes
nitrogenados es aquel en el que el único nutriente nitrogenado del
suelo o del medio sintético es (a) nitrato suministrado o aplicado
periódicamente a una concentración de 10 mM o superior, o (b) los
equivalentes fisiológicos del nitrato suministrados o periódicamente
aplicados a una concentración que sea fisiológicamente equivalente a
10 mM de nitrato o superior. Otro ejemplo de condiciones en las que
no se limita el nitrógeno sería cuando el nivel en fase estable del
nutriente nitrogenado disponible en el suelo o medio sintético es de
al menos 1,0 mM de nitrato potásico o equivalentes fisiológicos del
mismo. Pueden encontrarse en la técnica orientaciones adicionales
con respecto a lo que son unas condiciones deficientes o "no
limitativas" en relación con los nutrientes nitrogenados. Véase,
por ejemplo, Hewitt, E. J., Sand and Water Culture Methods Used in
the Study of Plant Nutrition, 2nd ed., Farnham Royal (Bucks),
Commonwealth Agricultural Bureaux, 1966; y Hewitt, E. J., Plant
Mineral Nutrition, London, English University. Press, 1975.
En las realizaciones en las que las plantas
transformadas son legumbres, puede efectuarse un filtrado directo
para la detección de plantas transformadas con los cambios
agronómicos y mejoras deseadas en la forma descrita más arriba, pero
en unas condiciones en las que se suprime la formación de nódulos de
o la fijación del nitrógeno.
De acuerdo con el uso de la presente invención,
las plantas diseñadas con las alteraciones en la asimilación del
nitrógeno o los procesos de utilización pueden presentar un mejor
contenido de nitrógeno, composiciones de proteínas o aminoácidos
alterados, características de crecimiento vigoroso, mayores
rendimientos vegetativos o un mayor rendimiento y calidad de las
semillas. Las plantas modificadas y las líneas de plantas que
presentan dichas características agronómicas mejoradas pueden
identificarse mediante el examen de cualquiera de los siguientes
parámetros: 1) la tasa de crecimiento, medida en términos de tasa de
aumento en el peso fresco o en seco; 2) rendimiento vegetativo de la
planta madura, en términos de peso fresco o en seco; 3) el
rendimiento de las semillas o frutos; 4) el peso de las semillas o
frutos; 5) el contenido total de nitrógeno de la planta; 6) el
contenido total de nitrógeno del fruto o semilla; 7) el contenido de
aminoácidos libres de la planta; 8) el contenido de aminoácidos
libres de la semilla o el fruto; 9) el contenido total de proteínas
de la planta; y 10) el contenido total de proteínas del fruto o la
semilla. Los procedimientos y métodos de examen de dichos parámetros
son bien conocidos para un experto en la materia.
De acuerdo con el uso de la presente invención,
una planta deseada es una que presenta mejoras con respecto a la
planta de control (es decir, la planta progenitora) en uno o más de
los parámetros anteriormente mencionados. En una realización, una
planta deseada es una que presenta al menos un aumento del 5% con
respecto a la planta de control en al menos un parámetro. En una
realización preferida, una planta deseada es aquella que presenta al
menos un aumento del 20% con respecto la planta de control al menos
en un parámetro. La planta preferida es una planta que presenta al
menos un aumento del 50% con respecto la planta de control al menos
en un parámetro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la eficiencia en el uso del nitrógeno
por parte de las secuencias de nucleótidos de la invención mediante
diversos ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una serie de semillas procedentes de las líneas
T_{1}, T_{2} y T_{3} que contenían el gen de interés se
situaron en placas de cultivo en un medio MS que contenía MSX (0,1
nM). También se plantaron semillas de control naturales tipo WS y
transgénicas (vector 750). Las placas de cultivo se sometieron a
evaluación al cabo de nueve días tras su plantación. Las plantas mas
verdes se transfirieron a un medio MS para que se recuperasen
durante una semana y después se transfirieron a un medio sólido para
prestar atención a las semillas selfed y someterlas a pruebas en la
generación
T_{3}.
T_{3}.
Se asignó una resistencia al Basta^{TM} en las
generaciones T_{2} y T_{3}.
Finalidad: La sulfoximina de metionina inhibe la
enzima GS/GOGAT, lo que afecta a la biosíntesis de los principales
compuestos que contienen nitrógeno (aminoácidos, nucleótido,
clorofila, poliamina y biosíntesis de alcaloides). La ventaja de
esta determinación es que encontrará
sobre-expresores con una mejor absorción del
nitrógeno y/o utilización independiente del nitrógeno disponible en
el suelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se toma una muestra alícuota de 1200 semillas
para T2 o 1700 semillas para T3, introduciéndolas en un tubo
eppendorf de 1.5 mL.
- \bullet
- Trasvasar mediante un pipeta 1,5 mL de solución de lejía al tubo (15 mL de lejía Clorox de uso industrial, añadiendo agua hasta alcanzar 50 mL). Incubar la semillas en la solución de lejía durante 5 minutos, invirtiendo el tubo periódicamente. Hacer girar en la centrifugadora Eppendorf hasta obtener la velocidad máxima (aproximadamente 14-15K) y detenerla. Eliminar la solución de lejía utilizando una punta de pipeta nueva P1000.
- \bullet
- Trasvasar mediante un pipeta 1,5 mL de agua esterilizada en el tubo. Invertir el tubo para suspender las semillas (2X). hacer girar el tubo en la centrifugadora Eppendorf hasta que se obtenga la velocidad máxima. Eliminar el agua utilizando una punta de pipeta nueva P1000, evitando absorber las semillas. No importa si queda un poco de agua. Repetir este paso dos veces más.
- \bullet
- Trasvasar mediante un pipeta 1 mL de Phytagar esterilizado al 0,2% al tubo.
- \bullet
- Tapar los tubos con film de aluminio y estratificar en un refrigerador a 4ºC durante 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Disolver 27,03 mg de sulfoximina de metionina en 1.5 mL de agua. Utilizar 1.3 mL de agua para la disolución y añadir posteriormente agua hasta obtener 1.5 mL.
- \bullet
- Esterilizar el filtro utilizando 0.20 mm de filtro no pirogénico Super Membrane.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Llenar un cubo de Nalgeno de 2 L con 900 mL de agua. Colocar la varilla agitadora en el tubo y comenzar a agitar el agua.
- \bullet
- Disolver 4,3 g de medio MS, 0,5 g de hidrato de MES, y 5 g de sucrosa en agua. Agitar hasta que se hayan disuelto todos los componentes.
- \bullet
- Verter el medio en un matraz graduado de 1 L y añadir agua hasta completar 1 L. Devolver el medio al cubo de Nalgeno de 2 L y removerlo durante unos minutos.
- \bullet
- Utilizar una solución 10N de KOH para que el pH del medio alcance 5,7.
- \bullet
- Verter el medio en una botella de Pyrex de 2 L. Añadir 10 g of de Agar-Agar granulado para microbiología a la botella. Colocar una barra de agitación magnética en la botella.
- \bullet
- Someter a autoclave el medio en las condiciones siguientes: 35 min de tiempo de esterilización a 121ºC.
- \bullet
- Cuando el medio se haya terminado de someter a autoclave, retirar el medio del autoclave y dejar que se enfríe en un baño de agua a 55ºC durante aproximadamente una hora.
- \bullet
- Introducir las placas de cultivo en la Campana de flujo laminar estéril y etiquetarlas.
- \bullet
- Cuando el medio se haya enfriado a aproximadamente 55ºC, colocarlo en la placa de agitación hasta que el agar se haya mezclado correctamente con el medio.
- \bullet
- Añadir 1000 \mul de Metionina Sulfoximina esterilizada en filtro de 100 mM. Agitar hasta que se mezcle. Utilizar una pipeta desechable de 50 mL para trasvasar 45 mL del medio a las placas de cultivo.
- \bullet
- Dejar que se solidifique toda la noche en la campana de flujo laminar, asegurándose de que la campana se desconecta por la noche para garantizar que el medio no se seque.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Retirar aproximadamente 1.5 mL de tubo eppendorf conteniendo aproximadamente 1200 semillas a 4ºC y retirar la lámina que las cubre.
- \bullet
- Utilizando una pipeta P1000, trasvasar todo el contenido del tubo eppendorf a la placa colocando uniformemente gotitas de líquido alrededor de la placa.
- \bullet
- Utilizando la punta del esparcidor, distribuir uniformemente las semillas por la placa.
- \bullet
- Colocar en una cámara de crecimiento a 22ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Proceder a la evaluación de las placas a los 9 días de su plantación en placas de cultivo.
- \bullet
- Transferir las plantas que presenten una respuesta positiva al stress (es decir, las verdes) a placas de cultivo con un medio MS para su recuperación.
- \bullet
- Al cabo de una semana de recuperación, extraer el ADN de una muestra de la hoja y amplificarlo mediante PCR de acuerdo con el protocolo Ceres-HTP para el control de calidad de las plantas, etapas 2-13.
- \bullet
- Transplantar las plantas al suelo para obtener semillas T3.
- \bullet
- Comprobar las semillas T3 como se ha indicado anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias primarias: Moran and Porath (1980)
Chlorophyll determination in intact tissues using
N,N-dimethylformamide. Plant Physiol.
65:478-479.
Moran (1982) Formulae for determination of
chlorophyllous pigments extracted with
N,N-dimethylformamide. Plant Physiol. 69:
1376-1381.
En el caso del Arabidopsis cultivado en placas,
pueden utilizarse brotes o plantas enteras. (Suele ser muy difícil
recuperar raíces en agar sin el agar pegado, y las raíces suelen
quebrarse.
Se recomienda limitar la recolección de tejidos
a tejidos de los brotes, si la masa es suficiente.
Las plantas individuales o los tejidos
procedentes de las plantas se retiran de la placa con unas tijeras
finas, y se colocan en una balanza que sea capaz de determinar masas
de un solo miligramo. El material de la planta se sumerge en una
solución al 10% (W/v) de N,N-dimetilformamina acorde
con la masa de la planta (por ejemplo, 5,0 mg de tejido se sumergen
en 500 \mul de N,N-DMF).
También se pueden utilizar puntas de 200 \mul
utilizando la "otra punta" para perforar un orificio de tamaño
consistente (para At).
Peso de la hoja perforada= \sim0.0043
(0.0258/6) o 4.3 mg
radio = 2.5 mm
Circunferencia = 15.7 mm
Área = 19.625 mm
Sumergida en 400 ul de
N,N-DMF
\vskip1.000000\baselineskip
Perforadora (para maíz)
Peso de la hoja= \sim0.0032 (0.0228/7) o 3.2
mg
radio= 4 mm
Circunferencia = 25.12 mm
Área = 50.24 mm
Sumergida en 300 ul of
N,N-DMF
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras se mantienen en un sitio oscuro a 4
grados centígrados durante una noche. De acuerdo con las
referencias, la clorofila de las muestras permanece bastante estable
en este estado durante algunos días. Antes de medirlas, se hacen
girar las muestras durante 5 minutos a la máxima velocidad en una
microcentrifugadora para empaquetar el tejido y facilitar la
extracción de la muestra de N,N-DMF para la
espectrofotometría.
Retirar 100 \mul de la muestra y colocarla en
una microcubeta en el esctrofotómetro. Leer el OD_{664} y el
OD_{647} de cada muestra. Existe un protocolo en la
especificación Lab3 titulado "Ed_CHL".
La cantidad de clorofila A, de clorofila B, y de
clorofila total se calcula mediante la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
Confirmar los principales candidatos para la MSX
mediante pruebas cuantitativas con 3 diferentes condiciones de
nitrógeno en el terreno.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Distribuir en partes alícuotas el número de semillas que va a necesitar, introduciéndolas en un tubo corning de 15 ml.
- \bullet
- Teniendo en cuenta que van a sembrarse aproximadamente cinco semillas por recipiente, necesitará unas 540 semillas para cada evento transgénico y aproximadamente 540 semillas para las semillas de segregación naturales. En caso de la variedad natural WS y el Col se necesitará alrededor de la mitad (270) de semillas.
- \bullet
- Añadir a cada tubo 10 ml de una solución de agar-agar al 0,2%. Suspender las semillas volteando el tubo varias veces.
- \bullet
- Colocar los tubos en un lugar oscuro a 4ºC durante 4 días, para que se produzca la estratificación. De este modo se garantizará una germinación uniforme.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Preparar 36 bandejas de cultivo de disolución del suelo 3:2 para cada una de las líneas que van a verificarse. Se utilizarán nueve bandejas para un tratamiento (o una concentración 1 N). La mezcladora de cemento puede contener bastante terreno para 9 bandejas.
En la mezcladora de cemento, mezclar 3 partes de
Metromix 200 con 2 partes de Thermorock vermiculite. Para 9
bandejas de cultivo, esto equivale a 54 L de Metromix 200 y 36 L de
Thermorock vermiculite.
- \bullet
- Para mantener el suelo consistente durante todo el experimento es preferible preparar suelo de sobra a preparar dos lotes, y tomar suelo del mismo lote cada vez.
- \bullet
- Desechar el exceso de suelo.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Rellenar 36 bandejas de 24 pacs colmadas con el material del suelo ya preparado.
- \bullet
- Nivelar el suelo con un borde recto.
- \bullet
- Colocar el recipiente relleno en una bandeja sin orificios.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Introducir 3 L de agua por bandeja de cultivo en la bandeja auxiliar sin orificios.
- \bullet
- Dejar que se sature durante algunas horas. No verter el exceso de líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Cada bandeja contendrá 6 recipientes del evento uno, 6 recipientes del segundo evento y 6 recipientes de cada una de las semillas de control de segregación natural (2 eventos y 2 segregantes naturales = 24 recipientes = 1 bandeja de cultivo). Normalmente hay 2 eventos para cada candidato principal a la MSX que va a comprobarse.
- \bullet
- Colocar una bandeja en el banco.
- \bullet
- Separar etiquetas de 5/8'' x 5'' y colocar una en cada recipiente.
- \circ
- Las etiquetas contendrán solamente la información del número único de planta y las condiciones de nitrógeno.
- \circ
- Se necesitará llevar una hoja Excel que informe de las líneas de semillas que se encuentran en cada recipiente en las condiciones de nitrógeno especificadas.
- \bullet
- Seleccionar la correspondiente semilla que coincida con el recipiente/bandeja de cultivo etiquetados.
- \bullet
- Verter con la pipeta el agar al 0,2% que contiene 5 semillas en los 6 recipientes situados aleatoriamente en la bandeja (obsérvese que la pipeta puede reutilizarse para cada tipo de semilla, pero no debe contaminarse). Si se colocan 5 semillas en cada recipiente se asegura que cada recipiente tendrá una planta superviviente.
- \bullet
- Repetir las fases de plantación en todas las condiciones de nitrógeno.
- \bullet
- Una vez finalizado el proceso, cubrir cada bandeja con un domo de propagación y cerrar la tapa.
- \bullet
- Colocar las bandejas de cultivo en el invernadero (fotoperíodo de 16 horas).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Retirar el domo de propagación al cabo de una semana de la siembra.
- \bullet
- Añadir aproximadamente 1 L de agua al día siguiente a cada una de las bandejas.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
6. Eliminar el exceso de plántulas. En este
experimento, las plantas de segregación natural se utilizarán
también como controles internos para su análisis cuantitativo. Por
lo tanto, NO se utilizará la pulverización final.
- \bullet
- Utilizando unos fórceps, eliminar cuidadosamente el exceso de plántulas de forma que quede una planta en cada uno de los recipientes de la bandeja.
- \bullet
- Esto suele llevarse a cabo cuando parece que va a sobrevivir al menos una de las plantas (es decir, están comenzando a formarse auténticas hojas).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- El tratamiento con nitrógeno se lleva a cabo durante la segunda semana de plantación, una vez que las plantas están bien asentadas.
- \bullet
- Preparar ¼ X de solución de Hoagland (sin nitrógeno) a partir de una solución madre 2X (2.5 L de la solución 2X de Hoagland disuelta con agua hasta 20 litros).
- \bullet
- Añadir la cantidad de nitrógeno necesaria para obtener 25, 250 y 1500 ppm de NO_{3} como única fuente de nitrógeno. Véanse más abajo los cálculos de la muestra.
- \bullet
- Regar las bandejas correspondientes con 2 L de la concentración de nitrógeno requerida. Esta operación se lleva a cabo una vez durante la 2ª semana.
- \bullet
- En la 3ª semana (exactamente una semana después) se riega una vez más con una concentración de 750 ppm, y el resto de las bandejas se regarán SOLAMENTE con una solución de Hoagland ¼ X (sin nitrógeno).
- \bullet
- Utilizar solamente agua en el resto de las ocasiones, hasta la finalización del experimento.
*Nota: Este calendario puede variar en función
de la humedad del suelo en el invernadero durante la realización del
experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Tomar nota de los fenotipos cualitativos inesperados (es decir, retrasos en la maduración de la planta, atrofia del crecimiento y/o cualquier síntoma de stress, etc.).
- \bullet
- En el momento de la maduración (cuando aproximadamente un 80% de las plantas ha madurado).
- \circ
- Medir la longitud y la anchura de la roseta para obtener la superficie de la roseta y el diámetro medio.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Tomar toda la parte aérea de la planta cortando por la base de la planta, bajo las hojas de la roseta, e introducirla en los sobres etiquetados.
- \bullet
- Colocar los sobres en el horno de secado durante 1-2 días.
- \bullet
- Extraer las plantas del horno del horno de secado y dejar que se enfríen durante un par de horas.
- \bullet
- Pesar las plantas en la balanza.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Este ensayo proporciona una herramienta para la
determinación de las plantas que son más capaces de desarrollarse
y/o recuperarse bajo las limitaciones nutricionales impuestas por
unas elevadas condiciones de pH. Se evaluó el verdor y el tamaño de
las plantas transformadas con el gen de interés en un medio con un
pH elevado. Las semillas se esterilizan y se plantan en bandejas de
cultivo en un medio con un pH elevado (pH 9,0). El pH se ajusta a
8,5 en lugar de 9,0 en el caso de los ensayos de eventos
individuales. Cuando se efectúa el ensayo de eventos individuales en
los que sólo se plantan 36 semillas (en lugar de las aproximadamente
1700 semillas de los supergrupos) se precisa un pH más bajo, de 8,5,
para evaluar el crecimiento con mayor precisión. Las bandejas se
evaluaron al cabo de 7 y 12 días tras su plantación en las bandejas.
La semilla natural de control Wassilewskija (Ws) se esteriliza y
estratifica en paralelo con ME00175-01, -02, y
-03.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinación de aquellos mutantes que puedan
desarrollarse más adecuadamente en las condiciones de deficiencia
nutricional (fosfato, manganeso, hierro, boro) impuestas por las
condiciones alcalinas.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- GRUPO PRINCIPAL: Se agruparon en un tubo aproximadamente 200 semillas para cada uno de los 5 cADNs independientes. A esta agrupación se le denominó "Grupo Principal". Se adoptaron las precauciones necesarias para tomar aproximadamente el mismo número de semillas de cada una de las cinco líneas.
- \bullet
- SUPERGRUPO: Se agruparon aproximadamente 200 semillas de los 500 "Grupos principales" en un tubo. A esta agrupación se le denominó "Supergrupo". Se adoptaron las precauciones necesarias para tomar el mismo número de semillas de cada uno de los Grupos Principales.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Distribuir en partes alícuotas 50 semillas de cada Grupo Principal en tubos de 1,5 mL para su esterilización.
- \bullet
- Distribuir 1200 semillas agrupadas de cada supergrupo en un tubo de 2 mL para su esterilización.
- \bullet
- Añadir 600 \mul de solución de lejía fresca al 50%. Invertir el tubo para suspender las semillas. Agitar durante 5 minutos invirtiendo los tubos en estantes de microtubos de plástico. Dejar que se asienten las semillas y eliminar la solución de lejía.
- \bullet
- Aplicar 600 \mul de agua destilada esterilizada. Invertir el tubo para suspender las semillas (2X). Dejar que se asienten las semillas y eliminar el agua con una pipeta. Repetir 3 veces. Tras el último lavado, volver a suspender las semillas en 500 \mul de agua destilada esterilizada. Invertir para suspender las semillas.
- \bullet
- Estratificar a 4ºC durante 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Preparar MS + Sucrosa al 0,5% (S0389, Sigma), 0.5 g/L hidrato de MES (M8250, Sigma) y 7.0 g/L de agar-agar. Ajustar el pH con KOH 10 N.
- \bullet
- Los ensayos iniciales se realizaron con un abanico de valores de pH: pH 5.7 (CONTROL), pH 7.03, pH 8.02, pH 9.01, pH 10.18.
- \bullet
- Esterilizar durante 20 minutos a 122ºC.
- \bullet
- Verter 45 mL de medio por cada placa de cultivo cuadrada. Comprobar que se agita el medio cada vez que se vierte el producto para asegurarse de que la precipitación que se produce como resultado de los ajustes del pH se distribuye homogéneamente por todas las placas y se distribuye homogéneamente en cada placa de cultivo.
- \bullet
- Comprobar de nuevo el pH del medio frío pasado por autoclave para verificar el pH final del cultivo. Esto se lleva a cabo fabricando un fango con el medio solidificado mediante una espátula.
Los resultados iniciales demostraron que los
valores del pH descendieron tras el paso por el autoclave, como se
ha demostrado más arriba. Por consiguiente, el pH del medio debe
verificarse tras el paso por el autoclave en todos los experimentos.
El análisis de los resultados demostró que un pH 9.01 (pH 8.91) es
el más eficaz para un ensayo con pH elevado, ya que permite la
germinación pero no el crecimiento por encima de los 2 a 5 mm. A un
pH de 9 tampoco se observó ningún crecimiento de las raíces. Un pH
más elevado tuvo como resultado la ausencia de germinación (pH
10,18). Nuestro objetivo consiste en percibir una gran diferencia
de vigor y verdor entre los grupos no resistentes de tipo natural
(WS) y los de los grupos putativos resistentes. Por consiguiente se
utilizará un pH de 9.0 para filtrar todos los Grupos principales y
un pH de 9.5 para filtrar los supergrupos. Se utilizará un pH más
elevado para filtrar todos los Supergrupos, ya que la mayor densidad
de semillas por placa de cultivo provoca un rápido cambio en el pH
de la placa al cabo de tan sólo 2 días después de sembrar las
semillas.
Por consiguiente, se precisa un pH inicial más
elevado para conseguir los mismos resultados de determinación
utilizados para la determinación del Grupo principal con un pH de
9.0.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- GRUPOS PRINCIPALES: Sembrar en bandeja de cultivo 12 semillas (de líneas de Grupos Principales en línea recta en dos placas con MS con un pH de 9.0 (24 plántulas) y 2 placas con MS con un pH de 5.7 (MEDIO DE CONTROL) verticalmente orientadas. Las plántulas sembradas en MS con un pH de 5.7 Se utilizaron como medio de determinación visual para el control del crecimiento de brotes y raíces. Se sembraron 10 bandejas de WS natural, utilizadas como control, en un medio MS con un pH de 9.0 para asegurarse de que no se produjesen escapes en cada uno de los experimentos.
- \bullet
- SUPERGRUPOS. Sembrar 1200 semillas en bandejas cuadradas de gran tamaño, de 22.5 x 22.5 cm. Se incluyeron en la misma bandeja aproximadamente 100 semillas de WS naturales y de WS transgénico (Vector 35S-YFP) para asegurar que los cambios en el pH se ajusten al método de identificación descrito.
- \bullet
- Envolver las bandejas con cinta porosa Micropore y apilarlas verticalmente en un estante (Sólo los grupos principales). Las placas de los supergrupos están orientadas horizontalmente.
- \bullet
- Colocar las placas en una cámara de crecimiento refrigerada a 22ºC. Tomar medidas de la iluminación en unidades LUX para asegurarse de que todas las pilas de placas recibían suficiente luz.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Al cabo de 7 y 14 días, puntuar el crecimiento de raíces y brotes de acuerdo con los métodos de determinación visual (MS pH 5,7) y de pH elevado (solución MS con un pH 9,0).
- \circ
- Un pH elevado del suelo o del medio (el pH del suelo normal es de 6.0 a 6.5) no permite que las plantas absorban suficiente hierro, boro y manganeso. El hierro es uno de los componentes de la clorofila, por lo que las plantas resultantes carecen de color verde y no se desarrollan. En este ensayo estamos buscando plántulas que puedan superar esta deficiencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inició un segundo ensayo en el suelo para
comprobar el efecto de una amplia gama de concentraciones de
nitrógeno en las raíces. Se obtuvo un auténtico segregante natural
del evento ME03118-01, utilizándose en este
experimento. El experimento se llevó a cabo en dos entornos de
invernadero, uno en Thousand Oaks, CA y el segundo en Malibú, CA. El
diseño del experimento modificado se describe en la sección de
métodos y materiales "Suelo-Ensayo de
rendimiento del nitrato II". Las principales diferencias con
respecto al ensayo de suelo anterior fueron el uso de nitrato como
fuente única de N, y el uso de una gama más amplia de
concentraciones de nitrato, variables entre 25 y 1500 ppm de
nitrato. Se incluyó como control una línea segregada de un transgen
de UDP-Glucosa epimerasa, para efectuar la
comparación.
Los resultados del experimento del invernadero
de Thousand Oaks indican que el ME3118-04 muestra en
todo momento una tendencia a un mejor rendimiento a unas
concentraciones de N medias y altas en al menos 2 replicas de la
biomasa y en 3 reps en la superficie de la roseta. La mejora de la
biomasa tiene una importancia estadística a P \leq 0.05 en una de
las réplicas de 1500 ppm, y también es importante cuando se agrupan
los datos replicados. En segundo evento de ME3118,
ME3118-01 no mostró una mejora del rendimiento en
comparación con su segregante de control natural. Además, las líneas
ME3228 no mostraron un aumento del rendimiento a ninguna
concentración de nitrógeno.
El experimento del invernadero de Malibú mostró
unos resultados en cierta medida similares a los del experimento de
Thousand Oaks. Una vez más, el ME3118-04 muestra en
todo momento un mejor rendimiento que su variedad de control a las
tres concentraciones de N en todas las réplicas, en la biomasa y en
la superficie de la roseta. No obstante, la mejora en la biomasa y
la superficie de la roseta es menos pronunciada que en el caso del
experimento realizado en el invernadero de Thousand Oaks y no
resultan estadísticamente significativos al nivel de P \leq 0.05
en cualquier condición de medida. La línea transgénica de control
que expresa erróneamente el gen de la UDP-glucosa
epimerasa no mostró mejoras significativas en la superficie de la
roseta o la producción de biomasa en ninguno de los experimentos
realizados en invernadero.
En general, los resultados indican que el ME3118
puede conllevar una mejora en las características de uso del
nitrógeno en la Arabidopsis transgénica, pero las mejoras pueden
verse significativamente afectadas por las condiciones
medioambientales en las que se cultivan las plantas. Otro factor lo
constituyen los antecedentes genéticos del germoplasma. Se observa
una sorprendente diferencia entre los ecotipos Columbia y WS en lo
tocante a la superficie de su roseta y acumulación de biomasa en
función del nitrógeno suministrado. Columbia continúa respondiendo
positivamente a la adición de nitrógeno hasta 1500 ppm mientras que
el crecimiento de la variedad WS se inhibe a 1500 ppm. Esto indica
que será importante examinar el candidato principal 32 en otros
entornos genéticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los ensayos se recogen en las
secciones individuales de la Tabla I, es decir, las Tablas
I-A-J. Los resultados demuestran la
actividad de los nucleótidos de la invención, y su utilidad para
obtener plantas genéticamente modificadas con unas mejores
características en lo tocante a la eficiencia en el uso del
nitrógeno. Dichas plantas genéticamente modificadas pueden
fabricarse utilizando una de las secuencias descritas en la Tabla I,
así como uno o más de sus ortólogos descritos en la Tabla II.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Masucci JD and Schiefelbein JW.
(1996) Hormones act downstream of TTG and GL2 to promote root
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outgrowth during epidermis development in the Arabidopsis root. Plant Cell 8: 1505-1517.
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La lista de referencias citada por el
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parte de los documentos de patente europeos. Aún cuando las
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errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(496)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia obtenida in planta
utilizando el clon Ceres 15650 y el Ceres cDNA 12422368
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)..(1535)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(519)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon Ceres 121073 y Ceres cDNA ID
12578718
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)..(301)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 989
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(989)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon Ceres 6288 y Ceres cDNA ID
12335951
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (95)..(802)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1195)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon Ceres 38286 y Ceres cDNA ID
13487831
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)..(789)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1638
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1638)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ceres cDNA ID 2702830
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 545
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 545
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 586
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus dulcis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (46)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de de forma natural.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (205)..(205)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (212)..(212)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 584
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 580
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lycopersicon esculentum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nepenthes alata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 584
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (114)..(115)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (131)..(131)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 570
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 455
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 593
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 566
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 601
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 569
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 577
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 593
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 593
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 575
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 571
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 617
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1857
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1857)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon Ceres 3086056 y Ceres cDNA ID
13575971
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (56)..(415)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1677
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1677)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ceres in planta sequence
from 60.1NB42-35S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 555
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1551)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ceres cDNA 2997404
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1886
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1886)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia en planta del clon Ceres
2997404
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2106)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ceres cDNA ID 13649807
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(564)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1773)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clon Ceres 1816383
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 589
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus persica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana
plumbaginifolia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (135)..(135)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (158)..(158)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Narcissus
pseudonarcissus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\hskip1.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1566
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1563)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1566)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ceres cDNA ID 2706693
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 521
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1812
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1812)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ceres cDNA ID 12711144
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<212> PRT
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<213> Glicina max
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<211> 594
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<212> PRT
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<211> 566
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<222> (21)..(21)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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que se de en la naturaleza
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<221> carac_divers
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<221> carac_divers
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<211> 159
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<212> PRT
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<213> Plantago major
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<211> 138
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<212> PRT
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<213> Glicina max
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<221> carac_divers
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<222> (92)..(92)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
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<221> carac_divers
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<222> (130)..(130)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<212> PRT
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<211> 110
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<222> (62)..(62)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Populus tremula x Populus
tremuloides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Plantago major
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mirabilis jalapa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Populus tremula x Populus
tremuloides
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\hskip1.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (162)..(162)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cucumis sativus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pinus pinaster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cultivar del Saccharum híbrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157)..(157)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pinus taeda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zinnia elegans
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vitis vinifera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (122)..(122)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lycopersicon esculentum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pinus taeda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pinus taeda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mirabilis jalapa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gossypium hirsutum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vigna radiata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pisum sativum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gossypium barbadense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
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<212> PRT
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<222> (76)..(77)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<212> PRT
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<213> Physcomitrella patens
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<222> (152)..(152)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<213> Mirabilis jalapa
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Zea mays
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<212> PRT
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<213> Glicina max
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<212> PRT
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<221> carac_divers
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<212> PRT
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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que se de en la naturaleza
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que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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que se de en la naturaleza
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que se de en la naturaleza
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que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> carac_divers
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (142)..(144)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (148)..(148)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
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<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
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<222> (14)..(15)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
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<221> carac_divers
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<222> (19)..(19)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
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<221> carac_divers
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<222> (31)..(31)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
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<222> (77)..(77)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> carac_divers
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<222> (92)..(92)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<220>
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<221> carac_divers
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<222> (99)..(99)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
que se de en la naturaleza
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<400> 215
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<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2161
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (178)..(1176)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 216
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1863)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cDNA de longitud completa del que
el clon Ceres 15650 es una Versión truncada
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<400> 218
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 219
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<211> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
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Claims (20)
1. Utilización de un ácido nucleico para mejorar
las características de eficiencia en el uso del nitrógeno de una
planta transgénica, en comparación con una planta de tipo natural
cultivada en las mismas condiciones, en la que el ácido nucleico
incluye una molécula aislada de ácido nucleico que comprende:
- (a)
- un ácido nucleico con una secuencia de nucleótido que codifique una secuencia de aminoácido que presente al menos una identidad de secuencia del 80% con la ID SEC. Nº 2;
- (b)
- un ácido nucleico que sea un complemento de una secuencia de nucleótido de acuerdo con el párrafo (a);
- en el que la secuencia del nucleótido y/o la secuencia del aminoácido desempeñan una función en la eficiencia del uso del nitrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, en la que la molécula aislada de ácido nucleico codifica una
secuencia de aminoácido que presenta al menos una identidad de
secuencia del 85% con la ID SEC. Nº 2.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación
2, en la que la molécula aislada de ácido nucleico codifica una
secuencia de aminoácido que presenta al menos una identidad de
secuencia del 90% con la ID SEC. Nº 2.
4. Utilización de acuerdo con la reivindicación
3, en la que la molécula aislada de ácido nucleico codifica una
secuencia de aminoácido que presenta al menos una identidad de
secuencia del 95% con la ID SEC. Nº 2.
5. Utilización de acuerdo con la reivindicación
4, en la que la molécula aislada de ácido nucleico codifica una
secuencia de aminoácido que presenta al menos una identidad de
secuencia del 96% con la ID SEC. Nº 2.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
5, en la que la molécula aislada de ácido nucleico codifica una
secuencia de aminoácido que presenta al menos una identidad de
secuencia del 97% con la ID SEC. Nº 2.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
6, en la que la molécula aislada de ácido nucleico codifica una
secuencia de aminoácido que presenta al menos una identidad de
secuencia del 98% con la ID SEC. Nº 2.
8. Utilización de acuerdo con la reivindicación
7, en la que la molécula aislada de ácido nucleico codifica una
secuencia de aminoácido que presenta al menos una identidad de
secuencia del 99% con la ID SEC. Nº 2.
9. Utilización de acuerdo con la reivindicación
8, en la que la molécula aislada de ácido presenta la secuencia de
nucleótido de acuerdo con la ID SEC. Nº 1.
10. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha secuencia de aminoácido comprende un polipéptido
acorde con la secuencia de consenso recogida en la Tabla
11-A.
11. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha secuencia de aminoácido tiene una secuencia
acorde con con la ID SEC. Nº 2.
12. Utilización de un polipéptido para mejorar
las características de eficiencia en el uso del nitrógeno de una
planta transgénica en comparación con una planta natural cultivada
en las mismas condiciones, en la que el polipéptido comprende un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que
presenta al menos una identidad de secuencia del 80% con la ID SEC.
Nº 2.
13. Utilización de acuerdo con la reivindicación
12, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
que presenta al menos una identidad de secuencia del 85% con la ID
SEC. Nº 2.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación
13, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
que presenta al menos una identidad de secuencia del 90% con la ID
SEC. Nº 2.
15. Utilización de acuerdo con la reivindicación
14, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
que presenta al menos una identidad de secuencia del 90% con la ID
SEC. Nº 2.
16. Utilización de acuerdo con la reivindicación
15, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
que presenta al menos una identidad de secuencia del 96% con la ID
SEC. Nº 2.
17. Utilización de acuerdo con la reivindicación
16, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
que presenta al menos una identidad de secuencia del 97% con la ID
SEC. Nº 2.
18. Utilización de acuerdo con la reivindicación
17, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
que presenta al menos una identidad de secuencia del 98% con la ID
SEC. Nº 2.
19. Utilización de acuerdo con la reivindicación
18, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
que presenta al menos una identidad de secuencia del 99% con la ID
SEC. Nº 2.
20. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido
incluida en la ID SEC. Nº 2.
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