ES2365540T3 - Control de expresión usando secuencias intergénicas variables. - Google Patents

Abstract

Un mensaje dicistrónico para producir una molécula de anticuerpo con una particular especificidad de unión al antígeno, en el que el cistrón anterior contiene DNA que codifica para la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón posterior contiene DNA que codifica para la correspondiente cadena ligera o cadena pesada respectivamente, caracterizado porque los dos cistrones están unidos por una secuencia intergénica optimizada (IGS) donde la IGS es IGS 1 (SEQ ID NO:4), IGS2 (SEQ ID NO:7), IGS3 (SEQ ID NO:10) o IGS4 (SEQ ID NO:13), y donde el anticuerpo producido no es un anticuerpo anti-TNFα o un anticuerpo anti-KDR.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de producción de anticuerpos en los que las cadenas pesadas y ligeras de una molécula de anticuerpo concreto se codifican por el DNA presente en un mensaje dicistrónico en el que los dos cistrones están enlazados por una secuencia intergénica optimizada.

Antecedentes de la invención

La capacidad de los anticuerpos para reconocer antígenos específicos los ha hecho herramientas muy útiles y eficaces en medicina y biotecnología. Se han usado anticuerpos específicos para antígenos en tipos seleccionados de célula para dirigir estos anticuerpos a la célula seleccionada. Se ha descubierto que el enlace de anticuerpos a receptores en células afecta en algunos casos a la función de la célula. También se han conjugado a anticuerpos agentes terapéuticos y de diagnóstico para dirigir específicamente estos agentes a células seleccionadas. Esta técnica se ha usado particularmente en células cancerosas como objetivo. También se han usado anticuerpos para dirigirlos a antígenos en células infectadas vírica y bacteriológicamente, tales como el TNFα, o para usarlos en ensayos. En biotecnología los anticuerpos tienen muchos usos, tales como sondas, en purificación y en catálisis.

Las moléculas de anticuerpos consisten globalmente en cuatro cadenas polipeptídicas -dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Cada cadena comprende dominios tanto variables como constantes. Las cadenas ligeras comprenden dos dominios: VL y CL, mientras que las cadenas pesadas comprenden al menos cinco dominios: VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3 y uno opcional CH4. Las cuatro cadenas están siempre organizadas del mismo modo general: las dos cadenas pesadas están enlazadas conjuntamente por al menos un enlace disulfuro y cada cadena pesada está también enlazada a una de las cadenas ligeras por un enlace disulfuro de manera que ambas cadenas ligeras están enlazadas a una cadena pesada diferente.

Las moléculas de anticuerpos tienen aproximadamente forma de Y y consisten fundamentalmente en dos partes funcionales principales. La primera parte funcional es responsable del reconocimiento de antígenos específicos y está formada por la parte superior de los brazos de la Y. La región de unión al antígeno en cada parte comprende un dominio VH y un dominio VL. Cada dominio variable contiene tres regiones hipervariables que, junto con las tres regiones hipervariables de la otra cadena, forman el sitio de unión al antígeno. Estas regiones hipervariables se conocen como regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3). Las CDRs, que forman lazos, están soportadas sobre regiones de armazón. Debido a su variabilidad entre anticuerpos, las regiones que comprenden VH y VL se conocen como regiones 'V'.

La segunda parte funcional es responsable de desencadenar las funciones efectoras de otras células que dispondrán del antígeno reconocido por el anticuerpo y está formada por las partes inferiores de los brazos y el tallo de la Y. Esta región se conoce como la región constante 'C' debido a su relativa constancia. Comprende los dominios CL y todos los dominios C de las cadenas pesadas.

Hay dos tipos de cadena ligera: κ y λ, y cinco tipos de cadena pesada: α, δ, γ, ε y µ. La clase de anticuerpo está determinada por el tipo de cadena pesada que tiene: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM respectivamente.

Los fragmentos de anticuerpo, en los que se ha separado parte de su región constante por escisión enzimática, se usan también en medicina y biotecnología. Estos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv.

Se sabe dirigir la producción de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (que tienen una especificidad antigénica particular) fusionando una célula de bazo productora de anticuerpos con una célula de mieloma, dando por resultado un hibridoma (Kohler, G. and Milstein, C. Cultivos continuos de células fusionadas secretoras de anticuerpo de especificidad predefinida. Naure, 256, 495-497 (1975)). Sin embargo, tales anticuerpos son inadecuados para usar en terapia humana porque son inmunogénicos en humanos. La mayoría de los anticuerpos monoclonales son producidos por células no humanas.

Se han desarrollado técnicas de DNA recombinante que permiten que las propiedades útiles de más de un anticuerpo se combinen para producir un nuevo anticuerpo. La producción de anticuerpos quiméricos, en los que el sitio de unión al antígeno que comprende la región V completa de un anticuerpo se enlaza a la región constante de un anticuerpo diferente, se describe en los documentos EP-A-0120694 (Celltech Limited), EP-A-0125023 (Genentech Inc. and City of Hope), EP-A-0171496 (Research Development Corporation, Japan), EP-A-0173494 (Stanford University) y WO-A-86/01533 (Celltech Limited).

El documento WO-A-86/01533, por ejemplo, describe la preparación de un anticuerpo quimérico en el que regiones V de múridos se unen a regiones constantes de humanos. Sin embargo, la gran proporción de residuos en anticuerpos quiméricos no humanos/humanos que se derivan del donante no humano da por resultado la posibilidad de que el anticuerpo provoque una respuesta inmunológica potencialmente perjudicial, en particular si se administra a lo largo de un periodo prolongado (Begent et al., Br. J. Cancer, 62,487 (1990)).

"Humanización" de anticuerpos es una técnica que hace que los anticuerpos quiméricos no humanos/humanos se muestren más semejantes a los anticuerpos humanos para el sistema inmune humano y se ha desarrollado en un intento para superar la respuesta inmunológica no deseada mencionada anteriormente. El documento EP-A0239400 (Winter) describe cómo, en vez de usar una región variable completa de múridos, se injertan las CDRs de un anticuerpo monoclonal de múridos en las regiones de armazón de los dominios variables de un anticuerpo humano. Así, son de múridos solo las CDRs que forman el dominio mismo de enlace al antígeno y los otros residuos son humanos.

Reichmann et al., ("Remodelación de anticuerpos humanos para terapia", Nature, 332, 323-324, 1988) descubrió que es conveniente convertir otros residuos humanos del dominio variable en sus homólogos del donante no humano para mejorar la actividad de unión al antígeno. Un tal residuo se encontró en la posición 27 de la cadena pesada humana, que, cuando se transformó de serina humana en el correspondiente residuo de rata (fenilalanina) dio por resultado una capacidad mejorada de unión al antígeno. Otro tal residuo se descubrió en la posición 30. Sin embargo, una construcción que contenía un cambio de serina humana a tirosina de rata en la posición 30 de la cadena pesada además del cambio en la posición 27 mencionado anteriormente no tuvo una actividad enlazante significativamente alterada sobre el anticuerpo humanizado con el cambio de serina a fenilalanina en la posición 27 solamente.

Los residuos de cadena pesada 27 y 30 están dentro del lazo estructural adyacente a CDR1. Queen et al., (WO 90/07861) conjeturaron que otros residuos que interaccionan con las CDRs son también importantes en la determinación de la afinidad de unión al antígeno. Teniendo esto en cuenta, Queen et al., propusieron cuatro criterios para determinar qué residuos deben proceder del donante y cuáles del aceptor cuando se diseñan anticuerpos humanizados. En un análisis más definitivo, Adair et al., (documento WO 91/09967) revelaron una jerarquía de números de residuos que permitirá diseñar un anticuerpo humanizado.

Se han publicado una serie de reseñas que exponen los anticuerpos injertados con CDR, que incluyen Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

Se han descrito también conjugados de anticuerpos en los que la región constante se ha fusionado con moléculas efectoras o reporteras que pueden actuar como agentes terapéuticos o de diagnóstico (documentos WO 95/01155, US 3927193, US 4331647, US 4348376, US 4361544, US 468457, US 4444744, US 4460459 y US 4460561 y reseñas por Waldmann, T.A., Science, 252, 1657, (1991); Koppel, G.A., Bioconjug. Chem., 1, 13, (1990); Oeltmann,

T.N. and Frankel, A.E., FASEB J., 5, 2334, (1991); y van den Bergh, H.E., Chemistry in Britain, Mayo 1986, 430439).

Se sabía producir anticuerpos normales, quiméricos o humanizados transfectando una célula huésped adecuada con dos vectores de expresión, uno que contiene una secuencia de DNA que codifica la cadena pesada y uno que contiene una secuencia de DNA que codifica la cadena ligera del anticuerpo requerido (documento WO-A91/09967). Alternativamente, se sabía transfectar una célula huésped con un vector de expresión que contiene tanto la secuencia de DNA que codifica la cadena pesada como la secuencia de DNA que codifica la cadena ligera del anticuerpo requerido. En el último ejemplo, las secuencias de DNA que codifican la cadena pesada y la cadena ligera están bajo el control de sus propios promotores individuales (documento WO-A-91/09967) o están presentes en un mensaje dicistrónico (Better, M., Paul Chang, C., Robinson, R.R. y Horwitz, A.H. Escherichia coli: Secreción de un Fragmento de Anticuerpo Quimérico Activo. Science, 240, 1041-1043 (1988)).

Se usó un mensaje dicistrónico por Better et al. para producir un anticuerpo L6 Fab de ratón quimérico dirigido hacia un antígeno gangliósido expresado sobre la superficie de muchos carcinomas humanos. En este caso se eligió un mensaje dicistrónico en un intento para garantizar que tanto las cadenas pesadas truncadas (Fd) como las cadenas ligeras κ sean traducidas en estrecha proximidad física de manera que se ensamblen correctamente y se segreguen. Los mensajes dicistrónicos son capaces solamente de funcionar en bacterias mientras que el concepto de "un gen, un promotor" funciona tanto en mamíferos como en bacterias. En un mensaje dicistrónico, un promotor está asociado solamente con el primer cistrón. El segundo cistrón se transcribe por la "ultralectura" de las polimerasas al segundo cistrón tal que ambos cistrones están representados por una sola molécula de RNA. Los dos cistrones de DNA codificantes están separados por un segmento de DNA conocido como una "secuencia intergénica" o "IGS". Esta región de IGS está presente también en la molécula de RNA que se transcribe del DNA. El documento WO 01/94585 describe secuencias intergénicas IGS1 a IGS4 para la expresión de Fab' en E. coli.

La optimización de la velocidad de iniciación de traducción se ha reconocido durante algún tiempo como fundamental para la expresión de alto nivel de proteínas heterólogas segregadas en E. coli (Simmons, L. y Yansura,

D. Nature Biotech, 14, 629-634 (1996)). Sin embargo, diferentes fragmentos Fab's tienen armazones y secuencias CDR diferentes que confieren propiedades diferentes a la molécula, incluyendo diferencias en la facilidad (o velocidad) de plegamiento en el periplasma de E. coli (Knappik, A. y Pluckthun, A. Prot Eng 8, 81-89 (1995)). Por ejemplo, un Fab' que se pliega en su conformación nativa fácil y rápidamente en el periplasma de E. coli es probable que sea "tolerado" en un alto nivel y la traducción rápida se pueda acomodar para conseguir acumulación en alto nivel. Un Fab' que se pliega peor es probable que sea tolerado peor por la bacteria huésped si es traducido rápidamente, saturando potencialmente la maquinaria de plegamiento/secreción del huésped y teniendo un efecto perjudicial en la fisiología de la célula huésped.

Así, cuando se producen anticuerpos usando un sistema de vectores de expresión en célula huésped, se puede tolerar un alto nivel de expresión de un anticuerpo particular, pero para un anticuerpo diferente un alto nivel de expresión podría resultar tóxico para la célula, tal vez a causa de eficacias diferentes de secreción o plegamiento.

El nivel de expresión de un anticuerpo concreto está determinado por la cantidad presente de cadenas pesadas y ligeras. Para producción máxima, la relación de cadenas pesadas a cadenas ligeras debe estar equilibrada, tal como cantidades iguales de ambas. Sin embargo, si la cadena pesada o ligera está presente en una cantidad menor, esto limitará la cantidad de anticuerpo producido. La acumulación de cadena pesada en exceso es probable que sea particularmente mal tolerada.

En el caso de un anticuerpo codificado por un mensaje dicistrónico, el cistrón anterior puede contener el DNA que codifica la cadena pesada o la cadena ligera de un anticuerpo con una particular especificidad de antígeno. El cistrón posterior codificaría después la respectiva cadena ligera o cadena pesada compañera. Sería conveniente que el nivel de expresión de la cadena de anticuerpo correspondiente al DNA codificante en el cistrón posterior de un mensaje dicistrónico pueda ser regulado para producir el deseado nivel de expresión para un anticuerpo concreto.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un mensaje dicistrónico para producir una molécula de anticuerpo con una particular especificidad de unión al antígeno, en el que el cistrón anterior contiene DNA que codifica para la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón posterior contiene DNA que codifica para la correspondiente cadena ligera o cadena pesada respectivamente, caracterizado porque los dos cistrones están unidos por una secuencia intergénica optimizada (IGS) y donde el anticuerpo producido no es un anticuerpo anti-TNFα (por ejemplo, ver el documento PCT/GB01/02477) o un anticuerpo receptor (anti-KDR) que contiene dominios de inserción de quinasa anti-humana (por ejemplo, ver el documento PCT/GB02/004619).

Preferiblemente, el cistrón anterior codifica para la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón posterior codifica para la correspondiente cadena pesada.

La IGS se ha optimizado para ajustar el nivel de expresión de la cadena de anticuerpo correspondiente al cistrón posterior en el mensaje dicistrónico con el fin de conseguir el nivel de expresión deseado para el anticuerpo concreto.

La invención está limitada por las reivindicaciones adjuntas.

En esta especificación, la longitud de la IGS está definida como el número de nucleótidos entre el codón de terminación del cistrón anterior y el codón de iniciación del cistrón posterior (no inclusive). La longitud de la IGS está implicada en la determinación de la velocidad de traducción de la parte del RNA que corresponde al cistrón posterior. Por ejemplo, una secuencia intergénica corta puede dar por resultado un acoplamiento muy ajustado de traducción entre las cadenas pesadas y las ligeras, y que el ribosoma traductor puede no disociarse completamente del mRNA tras completar la síntesis de la cadena de anticuerpo codificada por el cistrón anterior antes de iniciar la síntesis de la cadena de anticuerpo codificada por el cistrón posterior (Adhin, M. y van Duin, J. J. Mol. Biol., 213, 811-818 (1990); Andre, A. et al., FEBS Letts., 468, 73-78 (2000)). Tal procedimiento, llamado reiniciación de traducción, ocurrirá solamente si el codón de terminación del gen anterior está muy próximo al codón de iniciación del gen posterior. Debido a consideraciones cinéticas, esto dará por resultado mayor expresión del polipéptido codificado por el cistrón posterior puesto que la traducción no requerirá que un ribosoma se una a la molécula de mRNA en su IGS.

Si hay demasiada separación entre los dos genes, el ribosoma se disociará tras la terminación de la síntesis del cistrón anterior, requiriendo un nuevo ribosoma para iniciar la traducción del cistrón posterior. En general, esto reducirá la eficacia de la iniciación de traducción.

La presencia de un sitio Shine Dalgarno (SD) de unión al ribosoma (complementario a 16S RNA) en la IGS permite a un ribosoma unirse a esta secuencia IGS y traducir el cistrón posterior. Cuando la distancia entre cistrones es suficientemente corta para permitir que ocurra la reiniciación de traducción, hay alguna evidencia para sugerir que la presencia de un sitio SD en el cistrón anterior puede aumentar la eficacia de la iniciación de traducción del cistrón posterior (Spanjaard, R.A. y van Duin, J. Nucl. Acids Res., 17, 5501-5507 (1989)).

Hay varias características del sitio SD y de la secuencia nucleotídica entre el final del sitio SD y el codón de iniciación AUG que tienen una influencia sobre la fuerza de iniciación de traducción (reseñado en Makrides, S. Microbiol. Revs., 60, 512-538 (1996)). La distancia entre el sitio SD y el codón de iniciación AUG del cistrón posterior es una de tales características, como es la "fuerza" del sitio SD mismo. Un sitio SD que es 100% complementario a la secuencia de 16S RNA que se une a él dará en general por resultado mayor expresión que si el sitio SD es solo parcialmente complementario a la secuencia de 16S RNA.

La secuencia de la región entre la secuencia SD y el codón de iniciación es otro determinante importante de la velocidad de traducción del cistrón posterior. La distancia y secuencia afectan a la estructura secundaria potencial del mRNA alrededor del codón de iniciación (reseñado en Makrides, S. Microbiol. Revs., 60, 512-538 (1996)). El codón de iniciación debe estar en un "lazo" y no limitado en un "tallo", aunque lo contrario se aplica a la secuencia SD. Por tanto, modificando la secuencia y longitud de la IGS es posible modificar la amplitud del acoplamiento de traducción y/o la fuerza de iniciación de traducción y por tanto el nivel de traducción del cistrón posterior y la subsiguiente velocidad de acumulación de la cadena de anticuerpo que codifica.

La IGS del mensaje dicistrónico de la presente invención se ha modificado con respecto a la longitud, secuencia y estructura secundaria de manera que se consigue acoplamiento óptimo de traducción de los dos cistrones.

La secuencia óptima IGS para usar en la presente invención se puede determinar empíricamente usando el método siguiente. El método comprende construir una serie de vectores de expresión adecuados que contienen una serie de variantes IGS en los se pueden insertar moléculas de anticuerpos para probar. La prueba empírica de cada secuencia IGS para cada anticuerpo se puede conseguir transformando el vector de expresión en un huésped adecuado y analizando la expresión de anticuerpo y rendimiento. La serie de secuencias IGS descritas en la presente solicitud, que varían en longitud y secuencia, se pueden usar para construir tales vectores de los que se puede seleccionar la secuencia óptima IGS para una molécula de anticuerpo concreto. Dichas secuencias incluyen secuencias IGS 1-4.

En una realización preferida, la IGS se ha optimizado de manera que se consigue la expresión máxima de la cadena de anticuerpo codificada por el cistrón posterior. Esto da por resultado un nivel máximo de expresión del anticuerpo concreto porque la cantidad de la cadena de anticuerpo codificada por el cistrón posterior no es limitante.

En otra realización más, la IGS se ha optimizado de manera que la velocidad de iniciación de traducción para la traducción del cistrón posterior es lo más alta posible.

En otra realización más, la IGS se ha optimizado de manera que la velocidad de iniciación de traducción para la traducción del cistrón posterior no está en el mayor grado posible realizable.

En otra realización más, la IGS se ha optimizado de manera que la velocidad de iniciación de traducción para la traducción del cistrón posterior está en un grado bajo.

El mensaje dicistrónico de la presente invención codifica para la cadena pesada y la cadena ligera de una molécula de anticuerpo concreto. El anticuerpo puede ser un anticuerpo global o en particular un fragmento suyo, tal como un fragmento Fab o Fab'. El anticuerpo puede ser también un anticuerpo quimérico o humanizado.

El mensaje dicistrónico de la presente invención puede comprender DNA sintético, cDNA o DNA genómico, o una combinación de ellos.

La secuencia de DNA codificante para un anticuerpo concreto se puede obtener por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de DNA que codifican parte o la totalidad de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se pueden sintetizar como se desee a partir de las secuencias de DNA determinadas o sobre la base de las correspondientes secuencias de aminoácidos.

Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de DNA que codifican las cadenas pesadas y ligeras de moléculas de anticuerpo específico a enlazar por la IGS en un mensaje dicistrónico de la presente invención. Las secuencias de DNA deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden utilizar la mutagénesis dirigida al sitio y las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado.

El mensaje dicistrónico de la presente invención puede contener una secuencia de DNA que codifica una proteína efectora o reportera que se fusiona con la secuencia de DNA que codifica una de las cadenas de anticuerpo.

El mensaje dicistrónico de la presente invención puede contener también una secuencia de DNA que codifica un enlace peptídico que se fusiona con la secuencia de DNA que codifica una de las cadenas de anticuerpo de manera que permitirá la subsiguiente unión de una proteína o molécula efectora o reportera al anticuerpo expresado a partir del mensaje dicistrónico.

El mensaje dicistrónico de la presente invención puede contener también una secuencia de señal secretora que se fusiona en la parte anterior de la secuencia de DNA que codifica una o ambas cadenas de anticuerpo con el fin de permitir dirigir las cadenas de anticuerpo al periplasma o a la parte externa de la célula.

Preferiblemente, la secuencia de señal secretora es una secuencia peptídica OmpA.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que contiene un mensaje dicistrónico de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.

Preferiblemente, la cadena principal del vector de expresión es pTTO. El vector de expresión pTTO se diseña para dar lugar a una acumulación soluble periplásmica de proteínas recombinantes en E. coli. Este vector tiene las siguientes características principales:

(i)

Marcador de resistencia a la tetraciclina - antibiótico no inactivado por el producto del gen de resistencia, por tanto la selección para células que contienen plásmido se mantiene;

(ii)

Bajo número de copias - origen de replicación derivado del plásmido p15A, que es compatible con plásmidos que contienen replicones derivados de colE1;

(iii) Promotor tac fuerte, inducible, para transcripción de gen(es) clonado(s);

(iv)

Gen lacIq - da expresión constitutiva de la proteína represora lac, manteniendo el promotor tac en el estado reprimido hasta inducción por IPTG / alolactosa;

(v)

Secuencia señal OmpA - da secreción periplásmica de gen(es) clonado(s); y

(vi)

Acoplamiento de traducción de la secuencia señal OmpA a un péptido corto lacZ, dando iniciación eficaz de traducción.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector de clonación que contiene un mensaje dicistrónico de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.

Son muy conocidos para los profesionales métodos generales por los que se pueden construir vectores de expresión y clonación, métodos de transfección y métodos de cultivo.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona también un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo particular, que comprende cultivar una célula huésped bacteriana que ha sido transformada con un vector de expresión de la presente invención bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión del DNA que codifica dicha molécula de anticuerpo, y aislando dicha molécula de anticuerpo, donde el nivel de expresión de dicho anticuerpo se ha optimizado.

Se puede usar cualquier célula huésped bacteriana para la expresión de las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo particular codificada por un mensaje dicistrónico de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, se han usado preferiblemente células huésped de E. coli. Se pueden usar también otros sistemas microbianos.

La molécula de anticuerpo puede ser secretada de la célula o dirigida al periplasma mediante secuencias señal adecuadas. Alternativamente, las moléculas de anticuerpo se pueden acumular en el citoplasma de la célula. Dependiendo del anticuerpo que se esté produciendo y del procedimiento utilizado, puede ser deseable permitir que la molécula de anticuerpo se repliegue y adopte una conformación funcional. Los procedimientos para permitir que la molécula de anticuerpo se repliegue son bien conocidos por los profesionales.

Las moléculas de anticuerpo producidas por un mensaje dicistrónico de acuerdo con la presente invención se pueden usar para producir una composición terapéutica o para diagnóstico que comprende un anticuerpo particular en combinación con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición terapéutica o para diagnóstico o puede ir acompañado por otro o más ingredientes activos incluyendo otros ingredientes anticuerpos, por ejemplo células anti-T, anticuerpos anti-IFNγ o anti-LPS, o ingredientes no anticuerpos tales como las xantinas.

La molécula de anticuerpo particular producida por la presente invención se puede administrar en cualquier forma y cantidad apropiadas de acuerdo con la terapia en la que se usa.

Las formas adecuadas para administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o perfusión, por ejemplo por inyección rápida o por perfusión continua. Cuando el producto es para inyección o para perfusión, puede tomar la forma de una suspensión, disolución o emulsión en un vehículo acuoso u oleoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes.

Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.

Si la molécula de anticuerpo es adecuada para administración oral, por ejemplo en el caso de fragmentos de anticuerpo, la formulación puede contener, además del ingrediente activo, aditivos adecuados usados en la formulación de composiciones administradas oralmente.

Las composiciones terapéuticas y para diagnóstico pueden estar en forma de dosificación unitaria, en cuyo caso cada dosis unitaria comprende una cantidad eficaz de la molécula de anticuerpo particular. La dosis también será seleccionada de acuerdo con la edad y el estado del paciente.

Si la molécula de anticuerpo tiene una semivida corta (por ejemplo, 2 a 10 horas) puede ser necesario administrar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una semivida larga (por ejemplo, 2 a 15 días) puede ser necesario administrar solamente una dosis una vez al día, una vez por semana o incluso una vez cada 1 ó 2 meses.

Descripción detallada de la invención La presente invención se describe adicionalmente sólo a modo de ilustración en los siguientes ejemplos, que hacen referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1 muestra el vector pTTQ9;

La Figura 2 muestra la secuencia de la región polienlazante OmpA;

La Figura 3 muestra el vector pACYC184;

La Figura 4 muestra el vector pTTO-1;

La Figura 5 muestra la secuencia de DNA completa del vector pTTO-1;

La Figura 6 muestra el vector pTTO-2;

La Figura 7 muestra el vector pDNAbEngG1;

La Figura 8 muestra el vector pTTO(TNFα);

La Figura 9 muestra casetes de oligonucleótidos que codifican cuatro secuencias intergénicas diferentes para la

expresión de Fab' en E. coli ;

La Figura 10 muestra acumulación periplásmica de Fab' de variantes IGS, pTTO(TNFα IGS -1), pTTO(TNFα IGS-2), pTTO(TNFα IGS-3) y pTTO(TNFα IGS-4), como resultado de análisis en matraz agitado; La Figura 11 muestra una ligadura de cuatro formas usada para generar cuatro variantes IGS de Fab' g163; La Figura 12 muestra acumulación soluble de Fab' de variantes IGS, pTTO(g163 IGS-1), pTTO(g163 IGS-2),

pTTO(g163 IGS-3) y pTTO(g163 IGS-4), como resultado de análisis en matraz agitado; La Figura 13 muestra un mapa de restricción del vector pTTOD(g163 IGS-3); La Figura 14 muestra acumulación de Fab' soluble de variantes IGS, pTTOD(g165 IGS-1), pTTOD(g165 IGS-2)

y pTTOD(g165 IGS-3), como resultado de análisis en matraz agitado;

La Figura 15 muestra acumulación de Fab' de variantes IGS, pTTOD(g165 IGS-1), pTTOD(g165 IGS-2), pTTOD(g165 IGS-3) y pTTOD(g165 IGS-4), como resultado de análisis comparativo en fermentadores; La Figura 16 muestra acumulación de Fab' soluble de variantes IGS, pTTOD(gA33 IGS-2) y pTTOD(gA33 IGS

3), como resultado de análisis comparativo en fermentadores;

Ejemplos

Un mensaje discistrónico que codifica un anticuerpo anti-TNFα

Se usó un mensaje dicistrónico de la presente invención para conseguir alto nivel de expresión de fragmentos Fab' anti-TNFα. El cistrón anterior codificó la cadena ligera del anticuerpo, mientras que el cistrón posterior codificó la cadena pesada del anticuerpo. Una secuencia de DNA que codifica el péptido señal OmpA se fusionó al extremo 5' del DNA que codifica para cada cadena ligera y cadena pesada para permitir secreción eficaz al periplasma.

Una serie de casetes de oligonucleótidos que codifican para una serie de diferentes IGSs se usó en el mensaje dicistrónico con el fin de variar el nivel de expresión de la cadena pesada. El uso de diferentes casetes alteró la velocidad de iniciación de traducción de la cadena pesada, dando por resultado una serie de velocidades de acumulación del producto de cadena pesada traducida.

Se diseñó una serie de cuatro IGS2, permitiendo la determinación experimental de la secuencia óptima. La variante IGS que dio lugar a la acumulación de la mayor cantidad de Fab' soluble se seleccionó experimentalmente usando expresión en matraz agitado como una guía o expresión en fermentadores como un medio definitivo. Sorprendentemente, se seleccionaron diferentes IGSs para diferentes Fab's, lo que indica que se requerirá selección empírica para cada nuevo fragmento Fab' a expresar.

Experimental Materiales y Métodos

Microbiología general y técnicas de manipulación de DNA.

Se usó cepa INVαF' de E. coli (Invitrogen, De Schelp, Netherlands) para transformación y desarrollo de cultivo rutinario; se usó cepa W3110 de E. coli (ATCC # 27325) para estudios de expresión. Las enzimas de restricción y modificación de DNA se obtuvieron de Boehringer Mannheim (Lewes, East Sussex, UK) y New England Biolabs (Hitchen, Herts, UK). Las preparaciones de plásmidos se realizaron usando estuches de purificación de plásmidos (QIAGEN, Crawley, West Sussex, UK). La purificación de fragmentos de DNA se realizó usando columnas de centrifugación QIAGEN. Los fragmentos de DNA se purificaron en agarosa usando el protocolo GeneClean (BIO 101). Los oligonucleótidos fueron suministrados por Oswel Oligonucleotide Service y se sintetizaron a escala 40 nM. Se realizó PCR usando 'Amplitaq' Perkin Elmer como se recomienda. Las reacciones de secuenciación de DNA se realizaron usando el estuche de terminación de cadena ABI Prism Dye-Deoxy y se dirigieron en un secuenciador automático ABI 373A (PE Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK). Los datos se analizaron usando el programa AutoAssembler (PE Applied Biosystems).

Inducción en matraz agitado

Se desarrollaron cultivos de E. coli W3110 en medio de cultivo L-Broth complementados con tetraciclina (7,5 µg/ml). Para inducciones se diluyeron cultivos de una noche de nueva aportación (desarrollados a 30°C) a OD600 = 0.1 en 200 ml de medio de cultivo L-Broth en un matraz de 2 L con deflectores y se desarrollaron a 30°C en un incubador orbital. A OD600 = 0.5, se añadió IPTG a 200 µM. Se tomaron periódicamente muestras (normalizadas para la OD).

Extracción Periplásmica

Se enfriaron en hielo muestras de cultivo (5 minutos), después las células se recogieron por centrifugación. A continuación resuspensión en tampón de extracción (Tris.HCl 100 mM, EDTA 10 mM pH7.4); las muestras se incubaron durante una noche a 30°C, después se clarificaron por centrifugación.

Prueba de Ensamble

Las concentraciones de Fab' se determinaron por ELISA. Se revistieron placas a 4°C durante una noche con Fd 6045 anti-humano (2 µg/ml en tampón de revestimiento, disolución salina fisiológica, 100 µl por pocillo) (ver el documento EP 491031). Después de lavar, se cargaron 100 µl de muestra por pocillo; se usó como un patrón Fab' gamma-1 A5B7 purificado (ver el documento EP 491031), inicialmente a 2 µg/ml. Las muestras se diluyeron en serie al doble a través de la placa en tampón conjugado de muestra (por litro: 6,05 g de tris-aminometano; 2,92 g de NaCl; 0,1 ml de Tween-20; 1 ml de caseína (0,2%)); las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación. Las placas se lavaron y secaron, después se añadieron 100 µl de C-kappa (GD12)-peroxidasa antihumana (diluida en tampón conjugado de muestra). Se realizó incubación a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Las placas se lavaron y secaron, después se añadieron 100 µl de disolución de sustrato (10 ml de disolución de acetato sódico/citrato sódico (0,1 M, pH 6)); 100 µl de disolución de H2O2; 100 µl de disolución de tetrametilbencidina (10mg/ml en dimetilsulfóxido)). Se leyó la absorbancia a 630 nm 4-6 minutos después de la adición de sustrato.

Fermentación

Se desarrollaron cultivos de E. coli W3110 en matraces agitados en medio de cultivo L-Broth complementado con tetraciclina (7,5 µg/ml) a 30°C a OD600 =1,0; se usaron 100 ml de este cultivo para inocular 1 L de medios SM6 (más glicerol) (Patente Europea 651803) dentro de un fermentador de 1,5 L de cultivo semicontinuo. El pH se controló a 7,0 con NH4OH al 50% y H2SO4 al 5%. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo al 30% por agitación variable. No se incluyó tetraciclina en el medio fermentador. La concentración inicial de glicerol fue 3% peso/volumen; se añadió glicerol en una ocasión más durante la fermentación, de manera que dejaba de estar disponible una vez que el cultivo alcanzaba una OD600  60. Los cultivos se desarrollaron a 30°C a OD600 = 55, después se añadieron 120 ml de lactosa al 50%; después de la utilización de glucosa disponible viene la inducción por lactosa. Se añadió un lote de 60 ml más de lactosa 20 horas después. La fermentación se monitorizó durante 25 a 30 horas después de la inducción y periódicamente se tomaron muestras (normalizadas para la OD).

Resultados

Construcción de plásmidos pTTO-1 y pTTO-2

El plásmido pTTQ9 se obtuvo de Amersham y se muestra en la Figura 1. Se digirió una alícuota (2 µg) con las enzimas de restricción SalI y EcoRI, el producto digerido se hizo correr sobre un gel de agarosa al 1% y el fragmento de DNA grande (4520 pb) se purificó. Se sintetizaron dos oligonucleótidos que, cuando se hibridan entre sí, codifican la región polienlazante OmpA mostrada en la Figura 2. Esta secuencia tiene extremos cohesivos que son compatibles con los extremos SalI y EcoRI generados mediante la restricción de pTTQ9. Clonando esta "casete" de oligonucleótidos en el vector pTTQ9, no se regenera el sitio SalI, pero se mantiene el sitio EcoRI. La casete codifica los primeros 13 aminoácidos de la secuencia señal de la proteína Omp-A de la membrana externa de E. coli, precedida por el sitio de unión al ribosoma de Shine Dalgarno del gen OmpA. Además se encuentran presentes los sitios de restricción para las enzimas XbaI, MunI, StyI y SplI. Los sitios MunI y StyI están en la región codificante de la secuencia señal OmpA y están previstos como los sitios de clonación 5' para la inserción de los genes. Los dos oligonucleótidos que componen esta casete fueron hibridados conjuntamente mezclando a una concentración de 5 pmoles/µl, calentando en un baño de agua a 95ºC durante 3 minutos, enfriando después lentamente a la temperatura ambiente. La secuencia hibridada se ligó después en pTTQ9 cortado con SalI/EcoRI. El intermedio plasmídico resultante, denominado pTQOmp, fue verificado mediante secuenciación de DNA.

Alícuotas de este producto intermedio se escindieron después con SspI y EcoRI (fragmento de 2350 pb purificado) y con EcoRI y XmnI (fragmento de 350 pb purificado). El fragmento de 2350 pb codifica la región terminadora de la transcripción y el gen lacIq y el fragmento de 350 pb codifica el promotor tac, la secuencia señal OmpA y el sitio de clonación múltiple. El plásmido pACYC184 (New England Biolabs -Figura 3) se digirió con StyI, se trató con Nucleasa de Frijol Mungo (nucleasa S1 de Aspergillus) para generar extremos romos, después se digirió con PvuII (fragmento de 2348 pb purificado -este fragmento codifica el marcador de resistencia a tetraciclinas y el origen p15A de replicación). Este fragmento se trató con fosfatasa alcalina para separar fosfatos terminales 5' (para evitar autoligadura) y se ligó a otros fragmentos purificados. El plásmido resultante se llamó pTTO-1 y se muestra en el mapa de la Figura 4. La Figura 5 muestra la secuencia de DNA completa de pTTO-1. La inserción del dominio constante kappa de cadena ligera de Ig humana, como un fragmento SplI-EcoRI del plásmido pH132, generó pTTO2 (Figura 6).

Inserción de regiones variables de Fab' en pTTO-2

Los genes de regiones variables de Fab' TNFα se generaron por amplificación PCR a partir de vectores para expresión en células de mamíferos de anticuerpos íntegros que contienen la secuencia de SEQ ID8 del PCT/GB01/02477. El DNA que codifica la secuencia señal OmpA y que incluye el sitio enzimático de restricción MunI para clonar en pTTO-2 sin cambio de marco de lectura, se unió al extremo 5' de cada gen de manera que reemplazó la Ig nativa líder.

El gen VL purificado (MunI/SplI) se insertó después en el sitio MunI / SplI de pTTO-2 para generar el pTTO(TNFαL) intermedio de cadenas ligeras. .

El gen VH de cadenas pesadas fue clonado por medio del vector intermedio pDNAbEng-G1 (figura 7), entre los sitios MunI-ApaI, generando pDNAbEng(TNFαH). La clonación del gen de cadenas pesadas a partir de este plásmido como un fragmento EcoRI en el sitio EcoRI de pTTO(TNFαL) generó el plásmido de expresión en E. coli pTTO(TNFα) (Figura 8).

Construcción de variantes IGS de pTTO(TNFα)

Se construyó una serie de cuatro variantes de secuencia intergénica (Figure 9), permitiendo la determinación empírica de la IGS óptima para Fab' de TNFα. IGS1 y IGS2 tienen secuencias intergénicas muy cortas (-1 y +1 respectivamente) y se podría esperar que causen traducción fuertemente acoplada; las secuencias SD (subrayadas) son ligeramente diferentes. Estas dos secuencias conferirán muy probablemente un alto nivel de iniciación de traducción. IGS3 e IGS4 tienen una distancia mayor entre codones de terminación y de iniciación (+13) y difieren en su composición de secuencia. La secuencia SD de IGS3 es más fuerte que la de IGS1, 2 ó 4. Todas las secuencias se estudiaron en cuanto a estructura secundaria (usando el programa m/fold (Jaeger, J.A. et al. Methods Enzymology, 183: 281-306 (1990); parte del Paquete GCG Wisconsin, Accelrys)) y se "optimizaron" lo más posible; sin embargo, con fuerte acoplamiento de traducción de las dos cadenas, la falta de disociación ribosómica significa que el mRNA puede no estar "desnudo", evitando formación de estructura secundaria.

Las variantes IGS se construyeron por ligadura de dos fragmentos en un vector preparado por digestión SacI -NotI de pTTO(TNFα). Un fragmento de inserción preparado por digestión MunI-NotI de pDNAbEng(TNFα) se purificó y ligó junto con cada casete de IGS (SacI-MunI) en el vector, generando los 4 plásmidos de expresión pTTO(TNFα IGS-1), pTTO(TNFα IGS-2), pTTO(TNFα IGS-3) y pTTO(TNFα IGS-4).

Análisis de expresión en matraz agitado de variantes IGS de TNFα

Los cuatro vectores de variantes IGS y el vector de expresión original pTTO(TNFα) se usaron para transformar la cepa W3110 de E. coli. Las células transformadas de E. coli se analizaron después para la expresión de Fab' en matraces agitados como se ha descrito. Los resultados de un experimento típico se muestran en la Figura 10.

Las diferentes secuencias intergénicas confirieron diferentes perfiles de expresión. IGS1 e IGS2 acumularon Fab' periplásmico rápidamente con un pico a 1 hora después de la inducción, tras el cual cayó el nivel recuperado. El pico fue mayor y la caída más brusca para la IGS1. Estos resultados fueron consistentes con un alto nivel de síntesis, como se esperaba para el estrecho acoplamiento de traducción para estas construcciones. La IGS1 confería aparentemente un mayor nivel de expresión de cadenas pesadas que la IGS2. En este caso resultó que este alto nivel de expresión fue mal tolerado, puesto que los niveles de expresión periplásmica cayeron tras el pico de 1 hora. Esto se observó en el perfil de desarrollo del cultivo de IGS1 (no mostrado), que alcanzó su punto máximo a 1 hora después de la inducción, sugiriendo muerte y lisis celulares.

La IGS3 acumuló Fab' más lentamente, pero alcanzó su punto máximo a las 2 horas después de la inducción con un valor más alto de pico (325 ng/ml/OD), antes de que los niveles disminuyeron. El desarrollo de este cultivo continuó a las 3 horas después de la inducción y alcanzó un pico más alto de biomasa (no mostrado). Esto es consistente con un nivel inferior de síntesis de cadenas pesadas.

La IGS4 acumuló material a una velocidad aún menor y no alcanzó el pico alto de productividad de las otras tres construcciones.

Todas las variantes IGS superaron significativamente al vector original pTTO(TNFα). La hipótesis de que diferentes secuencias IGS confieren diferentes velocidades de iniciación de traducción está apoyada por estos resultados experimentales. Parece que para el Fab' de TNFα es mal tolerada una mayor velocidad de iniciación de traducción de cadenas pesadas y por tanto no es óptima. Una velocidad inferior, como la conferida por la IGS3, da por resultado mejores características de desarrollo de cultivo y en consecuencia un rendimiento mejor se acumula a lo largo del tiempo.

Tras la comparación de productividad en el fermentador (no mostrado), la construcción IGS3 se seleccionó como la de rendimiento más alto.

Un mensaje dicistrónico que codifica un anticuerpo Fab' diferente: creación de variantes IGS de Fab' g163

El juego de vectores pTTO/IGS descrito anteriormente se usó después para análisis de expresión de más Fab's. Incialmente se usó Fab' humanizado. Se usó una ligadura de 4 formas para generar las 4 variantes IGS de Fab' g163 (Figura 11). Una cadena pesada intermedia se generó por inserción de un fragmento MunI - ApaI del gen g163 VH (obtenido mediante recuperación por PCR del vector de expresión en mamíferos pGamma-4) en el plásmido pDNAbEngG1. Este producto intermedio se escindió con PvuII y NotI para generar un fragmento de g163 VH + CH1. El plásmido pTTO(TNFα) se escindió con MunI y NotI y el fragmento grande se purificó para dar un fragmento vector. Se generó un fragmento MunI -SplI VL mediante recuperación por PCR a partir del vector de expresión pMR10.1(g163) en mamíferos. Finalmente se generaron fragmentos Cκ-IGS por digestión SplI - PvuII de las 4 variantes IGS de 4 pTTO(TNFα) descritas anteriormente. Cuatro ligaduras separadas generaron después las construcciones pTTO(g163 IGS-1), pTTO(g163 IGS-2), pTTO(g163 IGS-3) y pTTO(g163 IGS-4). Los resultados del análisis en matraz agitado de estas construcciones se muestran en la Figura 12.

El perfil de expresión fue bastante similar al observado con Fab' TNFα, en que IGS-1 y -2 dieron por resultado acumulación de Fab' muy rápida, alcanzando su punto máximo 1 hora después de la inducción antes de reducirse bruscamente. La IGS-3 dio por resultado una velocidad inicial de acumulación más lenta, alcanzo su punto máximo en un tiempo después (2-3 horas después de la inducción) antes de reducirse a una velocidad más lenta. La construcción IGS-4 aumentó lentamente a lo largo del tiempo de inducción y de nuevo nunca alcanzó los altos rendimientos de las otras construcciones. Debido a los perfiles de expresión y a los perfiles de desarrollo de cultivo que muestran que, para la IGS-1 y -2, la biomasa alcanzó también su pico máximo solo 1 hora después de la inducción (no mostrado), la IGS-3 se eligió y expresó en el fermentador a rendimientos altos (no mostrado).

Construcción del plásmido pTTOD

Con el fin de simplificar las estrategias de codificación de Fab', el plásmido pTTOD se obtuvo a partir de plásmido pTTO-1 por separación de sitios de restricción de la cadena principal para PvuII (3 sitios), EcoRV (2 sitios) and ApaI (1 sitio). Al realizar estos cambios no se alteraron las secuencias del gen lacIq codificantes de la proteína ni el gen de resistencia a la tetraciclina, aunque se realizaron cambios "silenciosos" a nivel del DNA. Se utilizó una estrategia de PCR, en la cual se diseñaron cebadores que portaban cambios "silenciosos" que eliminaban estos sitios de restricción y se utilizaron para amplificar las secciones del plásmido parental (pTTO-1). Después se utilizaron sitios de restricción colindantes (no alterados) para remplazar las secuencias del plásmido parental por estas secuencias modificadas. El plásmido pTTOD se creó por este procedimiento multietapa. Se logró la transferencia de los genes g163 Fab' existentes en el vector pTTO a pTTOD utilizando los sitios PstI y EcoRI únicos que flanquean los genes, creando variantes IGS 1-4 de pTTOD(g163). La Figura 13 muestra el mapa de restricción de pTTOD(g163 IGS-3).

Expresión de otros Fab's como variantes IGS

Además de los Fab's TNFα y g163, se han expresado otros Fab's más como dos o más variantes IGS. Estos incluyen Fab's llamados g165 y gA33. La Figura 14 muestra pTTOD(g165) IGS-1 a -3 comparadas en el matraz agitado. A diferencia del de TNFα y g163, el de IGS-2 y IGS-1 superan al de IGS-3. La expresión de este Fab' parece ser bien tolerada por la célula huésped incluso a una velocidad rápida, y el cultivo que expresa IGS-2 continuó desarrollándose a través del periodo de inducción (no mostrado). La Figura 15 muestra una comparación de fermentadores de IGS-1 a -4 con este Fab', y esto reproduce esencialmente la observación hecha en el matraz agitado. IGS-2 se confirmó como la variante de rendimiento más alto. Con el Fab' gA33 se compararon pTTOD(gA33) IGS-2 y-3 en el fermentador y ambos dieron rendimientos similares (Figura 16). Por tanto, con diferentes Fab's se requieren diferentes secuencias IGS para rendimiento óptimo.

Análisis en matraz agitado frente a fermentador

En el matraz agitado, la desrepresión del promotor se consigue con IPTG que da inducción muy rápida de expresión. El régimen de inducción en el fermentador es diferente y más suave usando lactosa (que se convierte por la bacteria en alolactosa) para activar el promotor. A pesar de estas diferentes cinéticas de inducción, se ha demostrado que el matraz agitado da una indicación de cómo se compararán en el fermentador las construcciones (ver Figuras 14 y 15).

Se demuestra claramente el principio de que diferentes Fab's requieren una IGS diferente para rendimiento óptimo.

5 La novedad del sistema descrito en el presente documento está en el uso de casetes de IGSs para lograr velocidades de iniciación de traducción óptimas del segundo gen de un mensaje dicistrónico como un medio de conseguir expresión de Fab' con alto nivel. En el sistema descrito, la expresión de cadenas ligeras permanece inalterada y solamente se optimiza la velocidad de iniciación de traducción de cadenas pesadas. Hay dos posibles explicaciones por las cuales esta estrategia tiene éxito:

10 (i) La expresión de la cadena ligera es de poca consecuencia para el nivel global de acumulación de Fab', siempre que se sintetice suficiente cadena ligera para evitar que la cadena pesada llegue a estar en exceso. El exceso de cadena ligera se tolera normalmente sin problema, y es el nivel de traducción de la cadena pesada el que dicta la eficacia de expresión soluble; o

(ii) La optimización de cadena pesada en efecto se afina para la velocidad fija de expresión de cadena ligera, de

15 manera que los niveles de las dos cadenas están equilibrados. No es la velocidad de plegamiento/secreción de la cadena pesada per se la que dicta la eficacia de la expresión soluble, sino el equilibrio de expresión de las dos cadenas heterólogas.

Se debe entender que los ejemplos descritos antes son meramente ilustrativos y no limitan el alcance de la presente invención como se define en las siguientes reivindicaciones.

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Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un mensaje dicistrónico para producir una molécula de anticuerpo con una particular especificidad de unión al antígeno, en el que el cistrón anterior contiene DNA que codifica para la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón posterior contiene DNA que codifica para la correspondiente cadena ligera o cadena pesada

   5 respectivamente, caracterizado porque los dos cistrones están unidos por una secuencia intergénica optimizada (IGS) donde la IGS es IGS 1 (SEQ ID NO:4), IGS2 (SEQ ID NO:7), IGS3 (SEQ ID NO:10) o IGS4 (SEQ ID NO:13), y donde el anticuerpo producido no es un anticuerpo anti-TNFα o un anticuerpo anti-KDR.
2. 2. Un vector de expresión que contiene un mensaje dicistrónico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. 3.

   Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2 donde el vector de expresión es pTT0-1 (SEQ ID 10 NO:3).

4. 4.

   Una célula huésped microbiana que se ha transformado con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2 ó la reivindicación 3.

5. 5.

   Una célula huésped microbiana de acuerdo con la reivindicación 4, donde la célula huésped es E.coli.

6. 6.

   Un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo que comprende cultivar la célula 15 huésped de la reivindicación 4 ó la reivindicación 5.

7. 7. Una molécula de anticuerpo producida por el procedimiento de la reivindicación 6.