ES2365606T3 - Anticuerpos contra gm-csf quiméricos. - Google Patents

Anticuerpos contra gm-csf quiméricos. Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado que consiste en una cadena pesada, cuya secuencia de aminoácidos consiste en los aminoácidos codificados por los nucleótidos 1357-1764 de la SEQ ID NO: 36, concatenada con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1839-2825 de la SEQ ID NO: 36, y una cadena ligera.

Description

Campo de la invención
[0001] Esta invención se refiere al campo de la inmunología molecular en general, y a vectores útiles para la expresión de proteínas, en especial anticuerpos, tales como anticuerpos humanos, humanizados y quiméricos, así como a proteínas de fusión que incorporan el anticuerpo y una proteína o fragmento de proteína, en células eucariotas, en particular células de mamíferos. Los anticuerpos y las proteínas de fusión resultantes también son una característica de la invención.
Antecedentes y técnica anterior
[0002] Un problema grave con el uso de anticuerpos murinos para aplicaciones terapéuticas en seres humanos, es que producen rápidamente una respuesta humana dirigida contra IgG de ratón (HAMA) que reduce la eficacia del anticuerpo en los pacientes, e impide la administración continuada de los mismos. Surgen problemas paralelos con la administración de anticuerpos de otras especies no humanas. Un procedimiento para superar este problema es generar los llamados anticuerpos “quiméricos”. Estos pueden comprender regiones variables murinas y regiones constantes humanas (Boulianne y col. (1984) Nature 312(5995): 643-646). Aunque los anticuerpos quiméricos contienen secuencias murinas y pueden producir una respuesta dirigida contra IgG de ratón en seres humanos (LoBuglio y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(11): 4220-4224), los ensayos con anticuerpos quiméricos en el campo de las enfermedades hematológicas (p. ej., linfoma no Hodgkin; Witzig y col. (1999) J. Clin. Oncol. 17(12): 3793-3803.) o enfermedades autoinmunitarias (p. ej., artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino crónica; Van den Bosch y col., Lancet 356(9244):1821-2 (2000) han llevado a la aprobación de la FDA y demuestran que estas moléculas tienen un potencial y eficacia clínicas significativas.
[0003] Estudios recientes han indicado que el factor de crecimiento estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) tiene una función en el desarrollo de la artritis reumatoide (AR) (Cook, y col., Arthritis Res. 2001, 3:293-298) y posiblemente otras enfermedades y afecciones inflamatorias. Por lo tanto, sería interesante desarrollar un fármaco que bloqueara el GM-CSF y su efecto en las células.
[0004] Los anticuerpos monoclonales murinos que son específicos para el GM-CSF humano y que neutralizan su actividad in vitro, se han identificado y caracterizado previamente (Dempsey y col., Hybridoma 9:545-558).
[0005] La presente invención se refiere a un anticuerpo quimérico, que se dirige a la molécula de GM-CSF, que tiene capacidad de bloqueo.
[0006] El mayor uso de anticuerpos quiméricos en aplicaciones terapéuticas ha creado la necesidad de vectores de expresión que produzcan de forma eficaz rendimientos altos de anticuerpos quiméricos en células eucariotas, tales como células de mamíferos, que son preferidas para la producción. La presente invención proporciona vectores de expresión nuevos, células huésped transformadas y procedimientos para producir anticuerpos quiméricos en células de mamíferos, así como los propios anticuerpos y las proteínas de fusión que los contienen.
Breve descripción de las figuras
[0007]
La figura 1 muestra la unión del anticuerpo quimérico dirigido contra GM-CSF recombinante por transferencia Western.
La figura 2 muestra la unión del anticuerpo por ELISA.
La figura 3 muestra el efecto de bloqueo del anticuerpo en el crecimiento de células TF-1 dependiente de GM-CSF.
La figura 4 muestra el efecto de bloqueo del anticuerpo en el crecimiento de células AML-193 dependiente de GMCSF.
La figura 5 muestra los resultados de un ensayo que prueba el efecto de aumentar la concentración de anticuerpos 19/2 murinos o quiméricos en el crecimiento de células TF-1 en presencia de una cantidad constante de GM-CSF humano.
La figura 6 es similar al experimento de la figura 5, pero usa las células AML-153.
La figura 7 muestra un mapa esquemático de los dos vectores de expresión usados para preparar los anticuerpos recombinantes.
[0008] La presente invención proporciona anticuerpos para GM-CSF quimerizados como se define en las reivindicaciones 1 y 2. La invención también proporciona los vectores de expresión como se definen en las reivindicaciones 3-6. Estos vectores de expresión son útiles para la expresión de los anticuerpos quimerizados de la invención.
[0009] Pueden expresarse tanto las cadenas ligeras como las cadenas pesadas. Los vectores de expresión pueden comprender una secuencia del promotor/potenciador del factor de elongación humano 1  (EF1), una secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) (patente de EE.UU. nº 4.937.190), una secuencia de nucleótidos que confiere resistencia a la neomicina a una célula que contenga el vector de expresión, y una secuencia de nucleótidos bajo el control de un promotor del virus de simio 40 (SV40) que confiere resistencia a la ampicilina a una célula que contenga el vector de expresión. En una realización preferida, la secuencia del promotor/potenciador de EF1 está en la dirección 5’ y adyacente a una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera quimérica.
[0010] El vector de expresión puede contener una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier cadena ligera de inmunoglobulina. La región variable de la cadena ligera puede ser de origen murino y la región constante de la cadena ligera puede ser la kappa humana o lambda humana. La región variable de la cadena ligera quimérica puede derivar de un anticuerpo murino que se une a GM-CSF o CD-30 o G250, en especial a las formas humanas de estas moléculas.
[0011] También se describe en el presente documento un vector de expresión adicional útil en la expresión de proteínas, tales como anticuerpos, en especial anticuerpos totalmente humanos, humanizados o quiméricos, y proteínas de fusión que los contienen. Este vector de expresión difiere del vector de expresión descrito antes en que en lugar de la secuencia de resistencia a la neomicina descrita antes, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la dihidrofolato reductasa o “dhfr”, que genera resistencia contra el marcador de selección metotrexato bien conocido. Dicho vector de expresión puede contener secuencias de nucleótidos que codifican cualquier anticuerpo o parte del mismo, tal como las cadenas pesada o ligera de anticuerpos totalmente humanos, humanizados o quiméricos. Puede ser expresada una cadena pesada en la que la región variable es de origen murino y la región constante de la cadena pesada es la IgG1 humana. La región variable de la cadena pesada quimérica puede derivar de un anticuerpo murino que se une a CD-30, GM-CSF o G250, preferiblemente las formas humanas de estos.
[0012] En otra realización, la presente invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con uno cualquiera de los vectores de expresión de la presente invención. Una célula huésped, preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula humana, se puede transformar o transfectar con un vector de expresión que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica y un vector de expresión que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica. Se pueden usar células procariotas y eucariotas, tales como células de mamíferos, células de insecto, células bacterianas o fúngicas. La célula huésped puede ser una célula humana o de ovario de hámster chino (“CHO”).
[0013] En el presente documento se describen procedimientos para la producción recombinante de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina quimérica, que comprenden la etapa de cultivar una célula huésped transformada o transfectada. Estos procedimientos pueden comprender además el aislamiento de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina quimérica.
[0014] En el presente documento se describen procedimientos para la producción recombinante de una inmunoglobulina totalmente humana, humanizada o quimérica, que comprende cultivar una célula huésped que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica y un vector de expresión que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, o un vector de expresión que codifica ambas cadenas. Estos procedimientos pueden comprender además el autoensamblaje de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina y el aislamiento de la inmunoglobulina quimérica. Se conocen procedimientos para llevar a cabo esto en la materia.
[0015] En el presente documento se describe la cadena ligera, la cadena pesada de inmunoglobulina quimérica o la inmunoglobulina quimérica ensamblada producida por los procedimientos descritos antes. En el presente documento se describen composiciones que comprenden la cadena ligera, la cadena pesada de inmunoglobulina quimérica o la inmunoglobulina quimérica ensamblada y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Descripción detallada de la invención
1. Definiciones
[0016] Como se usa en el presente documento “quimerizado” se refiere a una inmunoglobulina tal como un anticuerpo, en el que las cadenas pesadas y ligeras de las regiones variables no son de origen humano y en la que las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera son de origen humano.
[0017] “Humanizado” se refiere a una inmunoglobulina tal como un anticuerpo, en el que los aminoácidos directamente implicados en la unión de antígeno, las llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de las cadenas pesada y ligera no son de origen humano, mientras que el resto de la molécula de inmunoglobulina, las llamadas regiones armazón de las cadenas pesada y ligera variables, y las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera son de origen humano.
[0018] “Totalmente humano” se refiere a una inmunoglobulina tal como un anticuerpo, en la que la molécula entera es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo.
[0019] “Inmunoglobulina” o “anticuerpo” se refiere a cualquier miembro de un grupo de glicoproteínas que se encuentran en mamíferos superiores, que son componentes principales del sistema inmunitario. Como se usa en el presente documento, “inmunoglobulinas” y “anticuerpos” comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas entre sí por enlaces disulfuro. Una molécula de inmunoglobulina incluye dominios de unión al antígeno, que incluye cada uno las cadenas ligeras y la parte terminal de la cadena pasada, y la región Fc, que es necesaria para una variedad de funciones, tales como la fijación del complemento. Hay cinco clases de inmunoglobulinas en las que la estructura primaria de la cadena pesada, en la región Fc, determina la clase de inmunoglobulina. Específicamente, las cadenas alfa, delta, épsilon, gamma y mu corresponden a la IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Como se usa en el presente documento, “Inmunoglobulina” o “anticuerpo” incluyen todas las subclases alfa, delta, épsilon, gamma y mu, y también se refieren a cualquier multímero natural (p. ej., IgA e IgM) o sintético de estructura de inmunoglobulina de cuatro cadenas.
[0020] El “fragmento de unión al antígeno”, “dominio de unión al antígeno” y “fragmento Fab” se refieren todos al fragmento de aproximadamente 45 kDa obtenido por digestión con papaína de una molécula de inmunoglobulina y consiste en una cadena ligera intacta unida por un enlace disulfuro a la parte N-terminal de la cadena pesada contigua. Como se usa en el presente documento, el “fragmento F(ab)2” se refiere a la proteína de aproximadamente 90 kDa producida por hidrólisis por pepsina de una molécula de inmunoglobulina. Consiste en el producto N-terminal de escisión por pepsina y contiene ambos fragmentos de unión al antígeno de una inmunoglobulina bivalente, tal como IgD, IgE e IgG. Ni el “fragmento de unión al antígeno” ni el “fragmento F(ab)2” contienen el fragmento Fc de aproximadamente 50 kDa producido por digestión con papaína de una molécula de inmunoglobulina que contiene las mitades C-terminales de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas, que están unidas por enlaces disulfuro, y contienen sitios necesarios para la fijación del complemento.
[0021] “Epítopo” se refiere a un determinante inmunológico de un antígeno que sirve como un sitio de unión al anticuerpo. Los epítopos pueden ser estructurales o conformacionales.
[0022] “Hibridoma” se refiere al producto de una célula de fusión entre un linfocito neoplásico cultivado y un linfocito B o T cebado, normal, que expresa el potencial inmunitario específico de la célula parental.
[0023] “Cadena pesada” se refiere a las más largas y pesadas los dos tipos de cadena de polipéptido de las moléculas de inmunoglobulinas que contienen los determinantes antigénicos que diferencian las diferentes clases de Ig, p. ej., IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, y los dominios necesarios para la fijación del complemento, transferencia placentaria, secreción de mucosa e interacción con receptores Fc.
[0024] “Cadena ligera” se refiere a las más cortas y más ligeras de los dos tipos de cadena de polipéptido de una molécula de Ig de cualquier clase. Las cadenas ligeras, como las cadenas pesadas, comprenden regiones variables y constantes.
[0025] La “región variable de la cadena pesada” se refiere al dominio amino terminal de la cadena pesada que está implicada en la unión al antígeno y se combina con la región variable de la cadena ligera para formar el dominio de unión al antígeno de la inmunoglobulina.
[0026] La “región constante de la cadena pesada” se refiere a uno de los tres dominios de cadena pesada que son partes carboxi terminales de la cadena pesada.
[0027] La “región variable de la cadena ligera” se refiere al dominio amino terminal de la cadena ligera y está implicada en la unión al antígeno y se combina con la cadena pesada para formar la región de unión al antígeno.
[0028] La “región constante de la cadena ligera” se refiere al dominio constante de cada cadena ligera. La región constante de la cadena ligera consiste en las cadenas kappa o lambda.
[0029] El “anticuerpo murino dirigido contra GM-CSF 19/2 humano” se refiere a un anticuerpo monoclonal murino que es específico para el GM-CSF humano. El anticuerpo es muy conocido y se ha estudiado con detalle. Véase, Dempsey, y col., Hybridoma 9:545-58 (1990); Nice, y col., Growth Factors 3:159-169 (1990).
[0030] “Cantidad eficaz” se refiere a una cantidad necesaria para producir el efecto deseado.
[0031] “Anticuerpo” se refiere a cualquier glicoproteína de la familia de inmunoglobulinas que se une de forma no covalente, específica y reversible a un antígeno correspondiente.
[0032] “Anticuerpo monoclonal” se refiere a una inmunoglobulina producida por un solo clon de células productoras de anticuerpos. A diferencia del antisuero policlonal, los anticuerpos monoclonales son monoespecíficos
(p. ej. específicos para un solo epítopo de un solo antígeno).
[0033] Los “granulocitos” incluyen neutrófilos, eosinófilos y basófilos.
[0034] “GM-CSF” se refiere a una familia de factores de crecimiento glicoproteicos que controlan la producción, diferenciación y función de granulocitos y monocitos macrófagos. Se pueden ver ejemplos, pero de ninguna manera las únicas formas de dichas moléculas, en la patente de EE.UU. nº 5.602.007.
[0035] “Afección inflamatoria” se refiere a reacciones inmunitarias que son específicas o no específicas. Por ejemplo, una reacción específica es una reacción inmunitaria a un antígeno. Los ejemplos de reacciones específicas incluyen respuestas de anticuerpos a antígenos, tales como virus y alérgenos, incluyendo hipersensibilidad de tipo retardado, incluyendo psoriasis, asma, hipersensibilidad de tipo retardado, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, neumonía vírica, neumonía bacteriana, y similares. Una reacción no específica es una respuesta inflamatoria que es mediada por leucocitos tales como macrófagos, eosinófilos y neutrófilos. Los ejemplos de reacciones no específicas incluyen el hinchamiento inmediato después de una picadura de abeja, y la recolección de leucocitos polimorfonucleares (PMN) en sitios de infección bacteriana. Otras “afecciones inflamatorias” dentro del campo de esta invención incluyen, p. ej., trastornos autoinmunitarios tales como psoriasis, artritis reumatoide, lupus, daño tisular posisquémico mediado por leucocitos (lesión por reperfusión), lesión o choque por congelación, lesión pulmonar aguda mediada por leucocitos (síndrome de dificultad respiratoria agudo o SDRA), asma, choque traumático, choque séptico, nefritis, inflamación aguda y crónica, y patologías mediadas por plaquetas tales como ateroesclerosis y coagulación sanguínea inadecuada.
[0036] “Vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier vehículo, disolvente, diluyente, vehículo, excipiente, adyuvante, aditivo, conservante y similar, incluyendo cualquier combinación de los mismos, que se usa rutinariamente en la técnica.
[0037] La disolución salina fisiológica, por ejemplo, es un vehículo al que se hace referencia, pero la presente invención también contempla otros vehículos farmacéuticamente aceptables. El disolvente principal en dicho vehículo puede ser acuoso o no acuoso. El vehículo puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, color, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución, y/u olor. Igualmente, el vehículo puede contener todavía otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener la estabilidad, velocidad de disolución, liberación o absorción o penetración a través de la barrera hematoencefálica.
[0038] Los anticuerpos totalmente humanos, humanizados o quimerizados de la presente invención se pueden administrar por vía oral, tópica, parenteral, rectal, o mediante pulverizador para inhalación en formulaciones de unidad de dosificación que contienen excipientes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, convencionales. Como se usa en el presente documento, “por vía parenteral” se refiere a la inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intratecal e intracerebral, incluyendo las técnicas de infusión.
[0039] Los anticuerpos totalmente humanos, humanizados o quimerizados se pueden administrar por vía parenteral en un medio estéril. Los anticuerpos, dependiendo del vehículo y la concentración usada, se pueden suspender o disolver en el vehículo. Ventajosamente, los adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes de tamponamiento se pueden disolver en el vehículo. Las vías de administración más preferidas de las composiciones farmacéuticas de la invención son la administración subcutánea, intramuscular, intratecal o intracerebral. Otras realizaciones de la presente invención abarcan la administración de la composición en combinación con uno o más agentes que se usan normalmente y habitualmente para formular dosificaciones para la administración parenteral en forma de dosis unitaria o múltiples dosis, o para la infusión directa.
[0040] El principio activo se puede combinar con los materiales vehículo en cantidades necesarias para producir formas de dosificación individuales. La cantidad de principio activo variará, dependiendo del tipo de anticuerpo usado, el huésped tratado, el modo particular de administración y la afección que padece el paciente. Preferiblemente, la cantidad de inmunoglobulina totalmente humana, humanizada o quimerizada dirigida contra GMCSF, por ejemplo, es una cantidad terapéuticamente eficaz que es suficiente para disminuir una respuesta inflamatoria o mejorar los síntomas de una afección inflamatoria. Sin embargo, los expertos en la materia entenderán que los niveles de dosificación específicos para pacientes específicos dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad de las inmunoglobulinas específicas usadas, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, vía de administración y tasa de excreción, combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular sometida a terapia. La administración de las inmunoglobulinas totalmente humanas, humanizadas o quimerizadas de la presente invención puede requerir una o múltiples dosis.
5 [0041] Sin embargo, independientemente de la forma de administración, la dosis específica se calcula de acuerdo con el peso corporal o superficie específica corporal aproximadas del paciente. El refinamiento adicional de los cálculos de las dosificaciones necesario para optimizar la dosificación para cada una de las formulaciones contempladas lo lleva a cabo rutinariamente el experto en la materia sin experimentación excesiva, en especial en
10 vista de la información de la dosificación y los ensayos descritos en el presente documento.
[0042] Sin más descripción, se cree que el experto en la materia usando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, puede hacer y usar los compuestos de la presente invención y practicar los procedimientos reivindicados. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo, señalan específicamente las realizaciones preferidas
15 de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Estrategia de clonación para genes de la región variable (N’) pesada (H) y ligera (L) 19/2
20 [0043] El ARN total del hibridoma que produce el anticuerpo 19/2 murino se obtuvo por técnicas de aislamiento de ARN estándar (Chomczynski y col., (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159). La primera cadena de ADNc se preparó usando un kit de síntesis de la primera cadena de ADN disponible en el comercio y cebando con d(T)18 tanto para la cadena pesada como la ligera (Renner y col., (1998) Biotechimiques 24(5): 720-722). El ADNc resultante se sometió
25 a PCR usando combinaciones de cebadores tanto para la cadena pesada como la ligera. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores 5’ para las cadenas pesada y ligera se muestran en las tablas 1 y 2 respectivamente. Los cebadores 3’ se muestran en la tabla 3. El cebador de la cadena ligera hibridaba con la región constante kappa de ratón no lejos de la unión V-C. El cebador 3’ de la cadena pesada hibridaba con la región constante CH-I del subgrupo 1 de cadena pesada de ratón, no lejos de la unión V-CHI.
Tabla 1: Cebadores oligonucleótidos para la región 5’ de dominios variables pesados de ratón (MHV) 30
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Clave R=A/G, Y=T/C, W=A/T, K=T/G, M=A/C, S=C/G. Tabla 2: Cebadores oligonucleótidos para la región 5’ de dominios variables kappa de ratón (MKV)
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Clave R=A/G, Y=T/C, W=A/T, K=T/G, M=A/C, S=C/G. Tabla 3: cebadores oligonucleótidos para los extremos 3’ de genes de VH y VL de ratón
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Ejemplo 2: Secuencias de Ig clonadas a partir del hibridoma murino 19/2
[0044] Usando la estrategia de clonación descrita, véase antes, los productos de la PCR para las VH y VL del anticuerpo 19/2 murino se clonaron usando un producto disponible en el comercio y técnicas reconocidas en la materia. Para la región VL del anticuerpo 19/2 murino, los productos de la PCR se obtuvieron usando el cebador de la región constante kappa de ratón y los cebadores MKV2 y MKV7 (SEQ ID NO: 14 y 19). Para la región VH del anticuerpo 19/2 de ratón, los productos de la PCR se obtuvieron usando el cebador de la región constante gamma 1 de ratón y los cebadores MHV2, MHV5 y MHV7 (SEQ ID NO: 2, 5 y 7). La secuenciación del ADN extensiva de los insertos de la región V clonada pusieron de manifiesto 2 secuencias de cadena ligera diferentes y 2 secuencias de cadena pesada diferentes. Los pseudogenes para la cadena pesada y ligera se amplificaron y se eliminaron por análisis de secuencia estándar. Se determinó una nueva secuencia que codifica una inmunoglobulina tanto para la cadena pesada como la ligera. Esta se expone en las SEQ ID NO: 27, 28, 29 y 30, que presentan el ADNc y secuencias de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 19/2 murino (27 y 28), y la región variable de la cadena ligera (29 y 30).
Ejemplo 3. Secuencia líder de la cadena pesada del anticuerpo 19/2 murino
[0045] Cuando se compara la secuencia de ADN de la secuencia líder para la cadena pesada de 19/2 obtenida con los cebadores descritos antes, con las bases de datos, parece que la secuencia líder de 19/2HC es corta (17 aminoácidos) y única en relación con las bases de datos públicas. Específicamente, los aminoácidos 2, 3 y 5 eran E, L y M, comparado con S, W y F en las bases de datos. Comparado con la base de datos, los aminoácidos hidrófilos en la región N-terminal estaban separados por aminoácidos neutros o básicos, respectivamente; sin embargo, puesto que la influencia de estos cambios en la capacidad secretora de la secuencia líder no está clara, esta secuencia no se alteró en experimentos posteriores.
Ejemplo 4. Construcción de genes quiméricos de ratón-humanos
[0046] El anticuerpo 19/2 quimérico se diseñó para tener las regiones VL y VH de 19/2 de ratón unidas a las regiones constantes kappa y gamma-1, respectivamente. Los cebadores de la PCR se usaron para modificar las secuencias 5’ y 3’ que flanqueaban las secuencias de ADNc que codifican las regiones VL y VH de 19/2 de ratón. Los cebadores de la PCR específicos para la región V de la cadena ligera de 19/2 se diseñaron usando la secuencia del gen de la región V de la cadena ligera de 19/2 obtenido. Después, estas regiones variables de 19/2 de ratón adaptadas se subclonaron en vectores de expresión de células de mamífero que ya contenían las regiones constantes kappa (vector pREN-Neo) o la gamma-1 (pREN-DHFR) humanas. Los vectores usan partes de la secuencia del promotor/potenciador del factor de elongación 1 humano (EFI) para transcribir de forma eficaz las cadenas ligera y pesada. Los vectores también contienen una secuencia IRES después del sitio de clonación múltiple para permitir la expresión bicistrónica, restrictiva, y el control del marcador de selección individual en células CHO. Esta pareja de vectores se usó en todos los trabajos recombinantes descritos en el presente documento, es decir, para fabricar todos los anticuerpos quiméricos. Los vectores de expresión se diseñaron para tener las regiones variables insertadas como fragmentos de ADN PmeI-BamHI. Los cebadores de la PCR se diseñaron para introducir estos sitos de restricción en los extremos 5’ (PmeI) y 3’ (BamHI) de los ADNc que codifican las regiones V. Además, los cebadores de la PCR se diseñaron para introducir una secuencia Kozak estándar (Kozak (1987) Nucleic Acids Res. 15(20): 8125-8148) en los extremos 5’ de los ADNc tanto de la cadena pesada como ligera, para permitir una traducción eficaz, e introducir sitios donadores de corte y empalme en los extremos 3’ de los ADNc tanto de la cadena pesada como ligera, para que las regiones variables sean cortadas y empalmadas en las regiones constantes. Los cebadores de la PCR usados para la construcción de las cadenas ligera y pesada de 19/2 quimérico eran los siguientes: catgtttaaacgccfccaccatgggcttcaagatggagtca (extremo 5’, región variable de la cadena ligera, SEQ ID NO: 31); agaggatccactcacgtttcagttccacttggtcccag (extremo 3’, SEQ ID NO: 32); catgtttaaacgccgccaccatggagctgatcatgctcttcct (cebador para el extremo 5’ de la región variable de la cadena pesada, SEQ ID NO: 33); y agaggatccactcacctgaggagactctgagagtggt (cebador para el extremo 3’ de la región variable de la cadena pesada, SEQ ID NO: 34). El ADN y la secuencia de aminoácidos de las regiones VL y VH de 19/2 de ratón se adaptaron para usar a partir de la construcción de las cadenas ligera y pesada de 19/2 quimérico. Las secuencias de ADN enteras de las cadenas ligera y pesada de 19/2 de ratón clonadas en los vectores de expresión eucariotas pREN-Neo y pREN-DHFR, respectivamente, se exponen en las SEQ ID NO: 35 y 36, produciendo las cadenas ligeras y pesadas resultantes moléculas quiméricas. Específicamente, en la SEQ ID NO: 35, los nucleótidos 13571756 codifican la secuencia de la cadena ligera murina, y los nucleótidos 1763-2206 codifican la región kappa humana. Dentro de esta secuencia (1763-2206), una región de 120 pares de bases constituye un intrón y el sitio aceptor de corte y empalme empieza en el nucleótido 1886. Dentro de la SEQ ID NO: 36, los nucleótidos 1357-1770 codifican la secuencia constante de la cadena pesada de 9/2 murino con un sitio donador de corte y empalme. Los nucleótidos 1777-2833 codifican la región constante de IgGl humana. Dentro de esta secuencia, hay una región intrón de 60 pares de bases y sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región codificante.
Ejemplo 5.
[0047] El objetivo de los experimentos descritos en el presente documento era crear líneas celulares estables que expresaran anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra GM-CSF humano 19/2 quiméricos (c19/2) en células CHO (ovario de hámster chino) DG44, y ensayar las propiedades de unión del anticuerpo secretado. Para hacer esto, se usó DG044 la línea celular CHO negativa para DHFR. Véase, Morris y col. (1990) Gene 94(2): 289-294). Las células CHO se cultivaron en RPMI, complementado con FCS al 10% e hipoxantina-timidina, el ADN para la transfección se purificó de células de E. coli usando un producto disponible en el comercio, y las instrucciones proporcionadas en el mismo. Todas las preparaciones de ADN se examinaron mediante digestión con enzimas de restricción. Las secuencias de las regiones variables del mAb 19/2 quimérico en sus respectivos vectores, se confirmó usando un secuenciador ABI PRISM 310 o LICOR.
[0048] Se cotransfectaron simultáneamente vectores que codifican las cadenas pesada y ligera de mAb 19/2 quiméricos simultáneamente en células CHO DG44 en crecimiento en fase logarítmica, usando electroporación (270 V, 975 F). Las células se cultivaron en placas de 10 cm y se cultivaron con medio estándar. Se recogió el medio 24 h después y se sustituyó por medio RPMI de nueva aportación complementado con FCS dializado al 10% y geneticina 500 g/ml. Después de terminar la fase inicial de muerte celular (7-10 días), se añadió metotrexato de calidad GMP en una concentración 5 nM y se aumentó gradualmente a 100 nM a lo largo de las siguientes semanas. Las colonias de crecimiento exterior se recogieron y se seleccionaron por la producción de anticuerpos.
Ejemplo 6. Amplificación por PCR de ADN de cadena variable
[0049] Se centrifugaron células CHO DG44 en una microcentrífuga Eppendorf, brevemente a velocidad máxima, se lavaron una vez con PBS y se sedimentaron una vez más. El ADN genómico se preparó por precipitación en etanol después de lisis con SDS y tratamiento con proteinasa K de los sedimentos celulares.
[0050] Se usó una mezcla que contenía las parejas de cebadores descritas antes, dNTP, tampón y polimerasa Pfu, para amplificar la región variable de la cadena pesada y ligera usando ADN genómico como molde, usando los procedimientos conocidos en la técnica. Los productos de la PCR resultantes se digirieron con las enzimas de restricción adecuadas y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa para confirmar su identidad.
[0051] Las parejas de cebadores para la cadena ligera eran: [0052] Para la cadena ligera y SEQ ID NO: 37 más
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5 para la cadena pesada.
[0053] El producto de la PCR de la cadena pesada sin digerir tenía un tamaño predicho de 1200 pares de bases, mientras que el producto de la PCR de cadena ligera tenía un tamaño predicho de 800 pares de bases. La identidad se verificó por digestión con enzimas de restricción, con BamHI.
10 Ejemplo 7. Procedimiento de inmunotransferencia para medir el anticuerpo IgG1/Kappa ensamblado en líquidos sobrenadantes de células CHO
[0054] Las líneas de células CHO se transfectaron con los correspondientes plásmidos. Se obtuvieron células
15 resistentes a la geneticina y estas células se seleccionaron además por la resistencia al metotrexato. Se recogieron colonias individuales después de amplificación y se transfirieron a placas de 24 pocillos. Se ensayó en el líquido sobrenadante del cultivo la IgG quimérica 3-4 días después, por ensayos de inmunotransferencia estándar.
[0055] Se subclonaron las colonias positivas y se cultivaron para alcanzar una producción de anticuerpos
20 suficiente. El anticuerpo 19/2 quimérico se purificó del líquido sobrenadante en las columnas de proteína G y se ensayó su unión específica con GM-CSF recombinante por transferencia Western (figura 1) y ELISA (figura 2).
[0056] Finalmente, se confirmó la identidad de las líneas celulares productoras usando amplificación por PCR de las regiones variables tanto de la cadena pesada como ligera. Se confirmó la secuencia de ADN de los productos de
25 la PCR de la región variable de la cadena pesada para las células transfectadas con mAb 19/2 quimérico.
Ejemplo 8.
[0057] Con el fin de optimizar el crecimiento celular y la producción de anticuerpos, la línea celular
30 CHODG44/pREN c19/2 se cultivó primero en IMDM que contenía FCS al 10% disponible en el comercio, a 37ºC, en una atmósfera de CO2 al 10%. Después, las células se separaron en medio exento de suero, y se cultivaron en un medio hecho a medida, es decir, IMDM SFII, con los siguientes aditivos, a 37ºC, en una atmósfera de CO2 al 10%.
Medio IMDM base Concentración final
Pluronic F68 1,0 mg/ml Hypep 4601 1,0 mg/ml Hypep 4605 DEV 0,5 mg/ml HEPES 5,958 mg/ml Na2HCO3 3,024 mg/ml
Aditivos Concentración final
Sulfato de dextrano 50,0 g/ml Putrescina 100,0 nM Albumax I 2,0 mg/ml Cloruro de colina 1,0 mg/ml Oligoelementos
FeSO4.7H2O 0,8 g/ml ZnSO4.7H2O 1,0 g/ml CuSO4.5H2O 0,0025 g/ml C6H5FeO7.H2O 5,0 g/ml
IGF-1 50,0 ng/ml Transferrina 35,0 g/ml Etanolamina 50,0 M Mercaptoetanol 50,0 M
35 [0058] Los líquidos sobrenadantes de los cultivos se recogieron de forma aséptica y después se clarificaron por centrifugación. Después, los anticuerpos se purificaron por cromatografía de afinidad en una columna de flujo rápido de 5 ml de proteína A-Sepharose que se había equilibrado previamente en Tris-HCl 50 mM, pH 8. La columna se lavó 20 veces con este tampón, y se eluyó cualquier anticuerpo unido usando citrato sódico 50 mM, pH 3,0, y después se neutralizó el eluato inmediatamente, usando Tris-HCl 1 M, pH 8. Los anticuerpos se concentraron con un
40 filtro de centrífuga, y se dializaron durante la noche a 4ºC en PBS. El rendimiento era aproximadamente 4-5 mg/litro. La pureza de los anticuerpos se examinó por SDS-PAGE, en condiciones tanto reductoras como no reductoras, usando un gradiente de 4-20% en la SDS-PAGE.
[0059] Los anticuerpos purificados migraron como una sola banda en condiciones no reductoras, y se separaron en las cadenas pesada y ligera, como se esperaba, en condiciones reductoras.
[0060] Los anticuerpos también se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaños (0,5 ng/ml), en una columna de HPLC previamente calibrada. Se usó tampón de experimentación (n-propanol/PBS al 5% (fosfato 0,5 M, NaCl 0,25 M, pH 7,4)), con un caudal de 0,2 ml/min a una temperatura de 22ºC, que es una temperatura ambiente para la columna.
[0061] El análisis demostró la integridad de los anticuerpos, que tenían pesos moleculares calculados de 179 kilodaltons.
Ejemplo 9.
[0062] Los experimentos descritos en este ejemplo se diseñaron para determinar la actividad de unión de los anticuerpos.
[0063] Se llevaron a cabo análisis con biosensores usando un BIAcore2000 disponible en el comercio y un chip sensor recubierto con carboximetildextrano. El chip se derivatizó con 1000, 300 o 100 RV de GM-CSF recombinante humano, en los canales 1, 2 y 3 de la máquina usando la química estándar de acoplamiento de aminas, con el canal 4 retenido como canal de blanco de control.
[0064] Las muestras del anticuerpo quimérico se diluyeron en tampón de HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, di-Na-EDTA, Tween-20 al 0,005%) y se inyectaron partes alícuotas sobre el chip sensor con un caudal de 1 l/min. Después de inyección, se siguió la disociación permitiendo que el tampón de HBS fluyera sobre la superficie del chip durante 5 min. Después se eluyó cualquier anticuerpo unido, y se regeneró la superficie del chip entre muestras, inyectando 40 l de HCl 100 mM, pH 2,7 a una velocidad de 5 l/min. Con el fin de llevar a cabo análisis cinéticos de la unión del anticuerpo quimérico, se inyectaron concentraciones variables en el intervalo de 1-10 nM, sobre la superficie del chip, y se calcularon las constantes de velocidad tanto de asociación (“Ka”) como de disociación (“Kd”) aparentes, usando un modelo de unión Langmuir 1:1, con un ajuste global y local para el cálculo de Rmax, usando el software B1Aevaluation V3.1.
[0065] Los resultados indicaban que el anticuerpo quimérico tenía una afinidad ligeramente mayor por rhGM-CSF que por el anticuerpo murino. La Ka calculada para el anticuerpo murino era 5,1x105 M-1s-1 usando 100 RU de GMCSF. No se observó disociación, independientemente de la concentración de analito, impidiendo la determinación de Kd e indicando una afinidad muy alta.
[0066] El ajuste global de Rmax usando el software que se ha mencionado, dio una velocidad de Kd = 1,9x10-5 s-1 y una afinidad alta para el anticuerpo quimérico de 2,69x1010 M-1.
Ejemplo 10.
[0067] Estos experimentos se diseñaron para determinar la actividad de unión de los anticuerpos, y si tenían reacciones cruzadas entre sí.
[0068] Se recubrieron placas Nunc con GM-CSF humano recombinante (1 g/ml), en tampón de carbonato (pH 9,6, 0,05 M), 50 l/pocillo, y se incubaron a 4ºC, durante la noche y después se bloquearon con FCS/PBS al 3% a temperatura ambiente, durante 1 hora.
[0069] Se añadieron muestras de 100 l por triplicado diluidas en forma seriada, semilogarítmica, de anticuerpo murino o quimérico (10 g/ml) a cada pocillo, para dar concentraciones finales desde 1,0 ng/ml a 10 g/ml. Después de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se usó anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón o dirigido contra IgG humana, marcado con peroxidasa de rábano picante (10 l/pocillo específico de Fc; dilución 1:1000 en FCS/PBS al 1%) para detectar el anticuerpo unido. Después de lavados abundantes, los anticuerpos unidos se visualizaron por adición de sustrato ABTS (100 l/pocillo).
[0070] Se leyó la densidad óptica a 415 nm en un lector de microplaca.
[0071] Se usó el mismo protocolo para la unión del anticuerpo a la fase sólida, para determinar si los anticuerpos competían entre sí. Como en los experimentos anteriores, véase antes, se combinaron muestras de 100 l diluidas en forma seriada, semilogarítmica, por triplicado, de 10 g/ml del anticuerpo murino o quimérico, con el anticuerpo que compite 20 g/ml, y después se añadieron 100 ml de la mezcla a las placas de ELISA recubiertas. La incubación fue como antes, y se usó anticuerpo dirigido contra IgG murina o humana marcado con peroxidasa de rábano picante, también como se ha descrito antes.
[0072] Los resultados indicaban que los anticuerpos competían por la unión al GM-CSF humano recombinante. Se produjo un desplazamiento en la curva de unión por adición de anticuerpo competitivo en exceso. Esto indicaba la unión a y competición por un epítopo común.
Ejemplo 11.
[0073] Estos experimentos se diseñaron para ensayar la actividad de neutralización de los anticuerpos dirigidos contra GM-CSF. Se usaron dos líneas celulares dependientes de GM-CSF humano, es decir TF-1 y AML-193. Se establecieron las curvas de crecimiento, en presencia o ausencia de 0,5 ng/ml de GM-CSF humano recombinante, y se determinó el número de células viables, por exclusión con tinta azul de Trypan, el día 0, 1, 2, 3, 5 y 7.
[0074] En un primer bioensayo, se mezcló el GM-CSF humano recombinante, en cantidades en el intervalo de 0,0003 ng/ml hasta 10 g/ml, con anticuerpos dirigidos contra GM-CSF humano, con una concentración final de 30 g/ml, en placas de microvaloración de 96 pocillos. Se añadieron células TF-1 o AML-193 (103 células/pocillo), y las placas se incubaron a 37ºC durante 7 días.
[0075] Después de este periodo de incubación, se añadió el marcador de proliferación de ADN MTS, 20 l/pocillo. La incorporación de colorante se midió después de 2 horas, midiendo la absorbancia de luz a A490 nm.
[0076] Se observó una mayor incorporación de colorante MTS al aumentar la cantidad de rhGM-CSF en el medio. Se observó una inhibición total del crecimiento de ambos tipos de células con el anticuerpo quimérico cuando la concentración de rhGM-CSF era 0,1 ng/ml o menos, y había una notable inhibición del crecimiento celular con rhGM-CSF 0,3-10 ng/ml.
[0077] A diferencia de esto, mientras que el anticuerpo murino tenía un efecto similar en célula AML-193, era menos eficaz en células TF-1. Estos resultados se ven en las figuras 3 y 4.
[0078] En un segundo bioensayo se cultivaron células TF-1 y AML-193 en presencia de rhGM-CSF 0,5 ng/ml y se añadieron cantidades crecientes de mAb 19/2 murino o quimérico (0,003-100 g/ml) al medio de cultivo y la actividad neutralizante se evaluó después de 7 días de cultivo. Los resultados se muestran en la figura 5 y 6 para las células TF-1 y AML-193, respectivamente. De acuerdo con el bioensayo inicial, el anticuerpo 19/2 quimérico demostró una notable actividad neutralizante del crecimiento de células estimuladas por GM-CSF. Se observó una correlación directa entre la concentración creciente de anticuerpo ch19/2 y la actividad neutralizante de GM-CSF con meseta para 3 g/ml para ambas líneas celulares, no pudiendo las concentraciones mayores realizar una mayor reducción del crecimiento de las células TF-1 o AML-193. Estas observaciones pueden deberse a una menor afinidad del mAb murino o a impedimento estérico en el sitio de unión en el GM-CSF.
Ejemplo 12.
[0079] Se llevaron a cabo experimentos adicionales para producir un anticuerpo HRS-3 quimérico. La forma murina de este anticuerpo la describen Hombach, y col., Int. J. Cancer 55:830-836 (1993). El anticuerpo murino se une a moléculas CD-30.
[0080] Se usaron los protocolos expuestos para la producción del anticuerpo dirigido contra GM-CSF quimérico, expuestos antes. Sin embargo, puesto que los anticuerpos eran diferentes, y las secuencias eran conocidas, se usaron cebadores diferentes. Estos cebadores sirven para introducir sitios de corte y empalme en las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera murinas, y se exponen en las SEQ ID NO: 44, 45, 46 y 47, siendo las SEQ ID NO: 44 y 45 las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la cadena pesada, y la 46 y 47 las secuencias comparables para la cadena ligera.
[0081] Los cebadores eran:
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y para la cadena ligera:
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y [0082] Después de la amplificación, las regiones variables de la cadena pesada y ligera murinas se clonaron en las secuencias pREN Neo y pREN-DHFR, que se exponen en las SEQ ID NO: 48 y 49, respectivamente. La clonación era posible porque la amplificación introducía los sitios de restricción PmeI y BamHI en la SEQ ID NO: 46, en los nucleótidos 1-8, y los 6 nucleótidos finales. Se encuentran sitios comparables en los nucleótidos 1340-1348 y 13571362 de la SEQ ID NO: 48. Igualmente, se introdujeron los sitios de restricción PmeI y BamHI en los nucleótidos 1-8, y los 6 últimos nucleótidos de la SEQ ID NO: 44, de modo que esta secuencia de nucleótidos se podía clonar en la SEQ ID NO: 49, en las posiciones 1337-1344 y 1349-1354.
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[0083] El anticuerpo HRS-3 quimérico se diseñó para tener las regiones VL y VH de HRS-3 murino unidas a las regiones constantes kappa y gamma-1 humanas, respectivamente. Se usaron cebadores de la PCR para modificar las secuencias 5’ y 3’ que flanqueaban las secuencias de ADNc que codifican las regiones VL y VH de HRS-3 murino. La modificación incluía la inserción de un sitio NcoI en el extremo del cebador 5’ y un sitio donador de corte y empalme seguido de un sitio de restricción BamHI en el extremo 3’ de los ADNc tanto de la cadena ligera como pesada, para que las regiones variables se cortaran y empalmaran a las regiones constantes. Estas regiones variables de HRS-3 de ratón adaptadas después se subclonaron por los sitios de restricción NcoI/BamHI en un vector procariota que albergaba un sitio 5’ PmeI seguido de una secuencia 5’ Kozak y de una secuencia líder de anticuerpo humano. Las secuencias se cortaron del vector procariota por digestión con PmeI/BamHI y se subclonaron en vectores de expresión de células de mamífero que ya contenían las regiones constantes kappa (vector pREN-Neo) o gamma-1 (vector pREN-DHFR) humanas, descritas anteriormente.
Ejemplo 13
[0084] Una vez establecidas las construcciones, se transfectaron en células DGO44, como se ha descrito anteriormente.
[0085] Las colonias positivas se subclonaron, se cultivaron para alcanzar suficiente producción de anticuerpo, después de lo cual los anticuerpos se purificaron en columnas de proteína G por el fragmento Fc.
[0086] Los anticuerpos purificados se analizaron por SDS-PAGE, siguiendo lo descrito por Laemmli, Nature 227:680-5 (1970), según la modificación de Renner, y col., Eur. J. Immunol. 25:2027-3S (1995). Se diluyeron las muestras de diferentes etapas de purificación en tampón reductor o no reductor, y se separaron en gel de poliacrilamida al 10-12% por electroforesis, seguido de tinción estándar con Coomassie.
[0087] Los resultados estaban de acuerdo con la producción de un anticuerpo quimérico completo, como se ponía de manifiesto por los patrones de bandas encontrados en las disoluciones tanto reductoras como no reductoras.
Ejemplo 14
[0088] La capacidad de unión del anticuerpo HRS-3 quimérico se determinó por citometría de flujo, de acuerdo con Renner y col., véase antes. En resumen, 1x106 células de una línea tumoral objetivo que expresaba CD-30, se lavaron dos veces en PBS y después se incubaron con diferentes concentraciones de anticuerpo, a 4ºC, durante 30 min. Después las células se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario, que se dirigió a la cadena ligera, conjugado con FITC o PE.
[0089] Los resultados indicaban que había una unión débil en el líquido sobrenadante del cultivo celular purificado de las células CHO transfectadas, y unión fuerte con el anticuerpo purificado. No se encontró unión cuando se usaron células tumorales negativas para CD-30.
Ejemplo 15
[0090] La toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés antibody dependent cellular toxicity) y la toxicidad dependiente del complemento del anticuerpo HRS-3 quimérico se determinaron usando un ensayo de liberación de europio, como describen Hombach y col., véase antes, y Renner y col., véase antes.
[0091] En resumen, para el ensayo de la ADCC se aislaron linfocitos de sangre periférica de dos donantes sanos y se usaron en una relación de efector: diana 10:1, con 10.000 células tumorales L540CY positivas para el antígeno CD-30, marcadas con europio. Se añadió el anticuerpo en diferentes concentraciones (10, 1, 0,1 y 0,01 g/ml), así como un control de 0 g/ml. El efecto se comparó con el anticuerpo murino, un anticuerpo dirigido contra CD16/CD30 murino biespecífico, y un anticuerpo IgG1 quimérico irrelevante. También se usó una línea negativa para CD30. Se midió la lisis máxima después de añadir Triton al 0,025%, y todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.
[0092] Los resultados indicaban que el anticuerpo quimérico funcionaba mejor en la ADCC que el anticuerpo murino.
[0093] En los ensayos de CDC, se incubaron 10.000 células marcadas con europio (100 g) (L540Y), con anticuerpo 50, 5, 0,5 ó 0,05 g/ml en un volumen de 50 l. Se añadió complemento recién aislado (50 l), y la mezcla se incubó durante 2 horas, a 37ºC. También se ensayó el anticuerpo murino, así como un anticuerpo dirigido contra CD-16 y un anticuerpo quimérico dirigido contra IgG, que servían como controles, así como una célula negativa para CD-30.
[0094] Como en el ensayo de ADCC, el anticuerpo quimérico era superior, en términos de porcentaje de lisis, a todos los demás anticuerpos ensayados.
Ejemplo 16
[0095] Este ejemplo detalla la producción de una proteína de fusión de un anticuerpo quimérico específico de G250 y el factor de necrosis tumoral (en lo sucesivo “TNF”).
[0096] G250 es un antígeno conocido ahora como “carbónico anhidrasa 9” o “CA9” o “MN”. El antígeno G250 y el correspondiente anticuerpo se describieron como asociados con el carcinoma de cáncer renal por Oosterwijk, y col., documento PCT/US88/01511. El anticuerpo para G250 también se ha sometido a varios ensayos clínicos (Oosterwijk, y col., Int. J. Cancer 1986: Oct. 15, 38(4):489-494; Divgi; y col.; Clin. Cancer Res. 1998: Nov 4(11):2729
739.
[0097] Zavada y col., han expedido una serie de patentes en las que el antígeno G250 se denomina “ imagen1 “ o “NM/CAIX”. Véase, p. ej., las patentes de EE.UU. nº 6.051.226; 6.027.887; 5.995.075 y 5.981.711. Estas patentes proporcionan detalles sobre el antígeno, y describen diferentes tumores en los que se encuentra, incluyendo el cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, carcinoma de mama, cáncer uterino, de cuello uterino, ovario y endometrial.
[0098] Recientemente, Ivanov, y col., Am. Journal of Pathology 158(3):905-919 (2001), llevaron a cabo investigaciones de CA9 y CA12 en células tumorales y líneas celulares.
[0099] Las secuencias del ADNc para las regiones variables ligera y pesada de un anticuerpo murino específico para G250 son conocidas, y estas incluyen la secuencia líder del anticuerpo endógeno. Se usaron los cebadores de la PCR para modificar ambas regiones 5’ y 3’, con el fin de introducir los sitios de restricción necesarios para introducir las secuencias codificantes en los vectores usados, que eran las SEQ ID NO: 48 y 49, véase antes. La secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada de G250 murino se expone en la SEQ ID NO: 50, con la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 51, y la región variable de la cadena ligera en la SEQ ID NO: 52, con la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 53. Los primeros 8 nucleótidos en cada una de las SEQ ID NO: 50 y 52 representan un sitio de restricción PmeI. Los primeros 19 aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos representan la región líder, y los primeros 24 la secuencia líder para la cadena ligera. Los últimos 6 nucleótidos en cada una de las SEQ ID NO: 50 y 52 son un sitio de restricción BamHI. Se usó el mismo protocolo que el usado para la quimera HRS-3 para cortar y empalmar estas regiones variables en las SEQ ID NO: 48 y 49.
[0100] Para asegurar el ADNc que codifica el TNF humano, se usó una biblioteca de ADNc de leucocitos humanos. Se estimularon linfocitos de sangre periférica con PMA, y se amplificó el ADNc para el TNF, usando procedimientos estándar. Se introdujeron sitios de restricción en la secuencia de ADNc, de modo que el ADNc para el TNF se colocó a la derecha justo después de la región bisagra de la cadena pesada de G250. Una secuencia codificante de (Gly) Ser unía las dos. Las SEQ ID NO: 54 y 55 exponen las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un fragmento del TNF, y la SEQ ID NO: 56 una construcción en la que a la cadena pesada de gamma 1 humana le sigue la secuencia que codifica el TNF, justo después de la región bisagra de IgG1.
[0101] Dentro de la SEQ ID NO: 56, los nucleótidos 1419-1754 codifican una región constante parcial de IgG1 humana, que contiene el dominio CH1 y bisagra, precedida por una región intrón de 60 pares de bases y sitio aceptor de corte y empalme. El conector, es decir, (Gly)4Ser es codificado por los nucleótidos 1755-1769. La secuencia codificante para el fragmento de TNF humano se expone en los nucleótidos 1776-2296.
[0102] Las construcciones resultantes se transfectaron en células huésped, como se ha descrito antes, y se expresaron. Obsérvese que la SEQ ID NO: 56 contiene una variante del vector de cadena pesada indicado antes, ya que contiene las regiones CH1 y bisagra humanas, seguido de la secuencia codificante del TNF.
[0103] Las células se transfectaron y cultivaron como se ha descrito antes para la quimera HRS-3, y la amplificación se llevó a cabo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 40-43, descritas antes. El tamaño predicho del producto de amplificación era 1100 pares de bases, y de hecho éste se confirmó.
[0104] Después, las colonias positivas se subclonaron y cultivaron como se ha descrito antes. Las proteínas de fusión G250-TNF quiméricas se purificaron usando la cromatografía de intercambio aniónico en columnas de DEAE, usando muestras de 5 ml, y concentraciones crecientes de sal en el tampón de elución (NaCl, 00,5 M) (pH 8). La pureza de las proteínas de fusión se determinó en SDS-PAGE, en condiciones reductoras. Aparecieron dos bandas de 45 y 28 kDa, respectivamente, concordantes con la producción de una proteína de fusión quimérica.
[0105] La pureza de la proteína de fusión quimérica se confirmó por un análisis de ELISA de tipo sándwich. En resumen, las placas se recubrieron con diluciones 1:6000 de suero de cabra dirigido contra IgG humana purificado por afinidad, y se incubaron durante la noche. Después se bloquearon con gelatina al 2%. Se añadió líquido sobrenadante del cultivo celular o anticuerpo purificado, en varias concentraciones, y después se pusieron en contacto con suero de cabra específico dirigido contra TNF humano biotinilado, 0,1 g/ml, seguido de visualización con un reactivo de estreptavidina peroxidasa estándar.
[0106] El análisis ELISA confirmó la pureza del anticuerpo.
Ejemplo 17
[0107] Se llevó a cabo la separación FACS como se ha descrito antes para anticuerpos HRS-3 quiméricos, esta vez usando la proteína de fusión, y las células tumorales positivas para G250. Se ensayaron dos procedimientos de purificación diferentes, con anticuerpo G250 quimérico como control positivo y un anticuerpo IgG1 quimérico irrelevante como un control negativo.
[0108] Los resultados indicaban que la proteína de fusión quimérica se unió así como también el anticuerpo quimérico. No se detectó unión cuando se usaron células negativas para G250.
Ejemplo 18
[0109] Estos experimentos se diseñaron para determinar si las proteínas de fusión retenían la capacidad del TNF para mediar la muerte celular.
[0110] Esto se llevó a cabo usando un ensayo de MTT como describen Renner, y col., Eur. J. Immunol. 25:2027-2035 (1995), y células sensibles al TNF ("WEHI-R"). Las células WEHI se sembraron con una densidad de
10.000 células/pocillo. Después, tras 18 h se añadieron muestras estériles de proteína de fusión, TNF recombinante, anticuerpo G250 quimérico, o un control negativo (solo medio), en concentraciones 1,0x10-5, 1,0x102, 1, 1,0x10-2, 1,0x10-4, y 1,0x10-5 ng/ml, y el cultivo se incubó durante un periodo adicional de 48-72 horas. Se detectaron todas las células viables, por procedimientos estándar, incluyendo la tinción con anexina V, y citometría de flujo. Para hacer esto, se incubaron 1x106 células WEHI durante la noche, con diferentes concentraciones de anticuerpo y se contaron las células positivas teñidas. El efecto de las células tumorales cargadas de anticuerpo en la muerte de WEHI se determinó mediante tinción previa con el colorante PKH-26GL disponible en el comercio.
[0111] Se encontró que las proteínas de fusión quiméricas eran tan eficaces como el TNF recombinante en la muerte de células.
Ejemplo 19
[0112] Se sabe que el TNF estimula la liberación de H2O2 por leucocitos humanos. Se ensayó está propiedad en las proteínas de fusión quiméricas.
[0113] Se aislaron granulocitos de muestras de sangre por procedimientos estándar, y se volvieron a suspender en tampón de reacción (KRPG = NaCl 145 mM, Na2HPO4 5 mM, KCI 4,8 mM, CaCl2 0,5 mM, MgSO4 1,2 mM, glucosa 0,2 mM, pH 7,35). Esta mezcla se añadió a placas que se habían recubierto previamente con fibronectina (1 g/ml, 2 horas, 37ºC) para permitir la adherencia de granulocitos. Después de esto, se añadieron 100 l de una disolución de colorante (10 ml de KRPG + 50 l de A6550 + 10 l de peroxidasa de rábano picante) y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Se añadieron granulocitos, 30.000 células por pocillo, y después tampón (KRPG), PMA (5 ng/ml), la proteína de fusión quimérica (1 g/ml) más IFN- humano recombinante (100 l/ml), o la proteína de fusión más IFN- recombinante (a las concentraciones indicadas). Se midió la liberación de H2O2 durante 3 horas, usando procedimientos estándar. [0114] El PMA sirvió como control positivo. La proteína de fusión quimérica inducía la liberación de H2O2 significativamente en mayor cantidad que el anticuerpo solo, y la liberación de H2O2 aumentaba incluso más cuando se añadía IFN-.
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A) SEQ ID NO: 35. Vector pREN 19/2 LC Neo
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B) SEQ ID NO: 36. Vector pREN 19/2 HC DHFR
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[0115] Se usaron vectores de expresión de células de mamíferos para producir anticuerpos quiméricos y humanos remodelados con cadenas ligeras kappa humanas y cadenas pesadas gamma-1 humanas. Vector de expresión de la cadena ligera pREN-Neo. SEQ ID NO: 48 [0116] Los componentes del vector (5809 pb) son: 10 1-6 = sitio XhoI 31
135-140 = sitio EcoRI 141-1324 = promotor/potenciador del factor de elongación humano 1 1325-1330 = sitio MluI 1333-1338 = sitio HmdIII 1340-1348 = sitio PmeI 1357-1362 = sitio BamHI 1436-1806 = región constante kappa humana, precedida de una región intrón de 120 pb y sitio aceptor de corte y
empalme 1807-1812 = Ligado de sitios NheI/XbaI 1813-3220 = secuencia IRES-Neo 3221-3230 = sitios SaII/SaII con extremos romos 3299-3754 = interregión F1 3880-4740 = beta-lactamasa
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Vector de expresión de la cadena pesada pREN-DHFR SEQ ID NO: 49
[0117] Los componentes del vector (6257bp) son: 1-7 = sitio XhoI 135-141 = sitio EcoRI 141-1325 = promotor/potenciador del factor de elongación humano 1 1317-1322 = sitio M1uI 1329-1334 = sitio HindIII 1337-1343 = sitio PmeI 1349-1354 = sitio BamHI 1417-2406 = región constante de IgG1 humana, precedida por una región intrón de 60 pb y sitio aceptor de corte y
empalme 2407-2412 = Ligado de sitios NheI/XbaI 2413-3668 = secuencia IRES-DHFR 3669-3678 = sitios SalI/SalI con extremos romos 3748-4203 = interregión F1 4328-5188 = beta-lactamasa
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[0118] Vectores de expresión de células de mamíferos para producir anticuerpos quiméricos y humanos remodelados con partes de la cadena pesada gamma-1 humana seguida de TNF humano después de la región 5 bisagra de IgG1. Vector de expresión de la cadena pesada pREN DHFR-TNF
SEQ ID NO: 56
[0119] Los componentes del vector (6147 pb) son: 1-8 = sitio XhoI 135-142 = sitio EcoRI 141-1326 = promotor/potenciador del factor de elongación humano 1 1320-1325 = sitio MluI 1332-1337 = sitio HindIII 1340-1347 = sitio PmeI 1350-1355 = sitio BamHI 1419-1754 = región constante parcial de IgG1 humana que contiene el dominio CH1 y bisagra, precedida por una
región intrón de 60 pb y sitio aceptor de corte y empalme 1755-1769 = conector de 5 aminoácidos [(Gly)4Ser] 1770-1775 = sitio NcoI 1776-2296 = TNF humano, secuencia madura 2297-2302 =sitio XbaI 2303-3559 = secuencia IRES-DHFR 3560-3569 = sitios SalI/SaII con extremos romos 3639-4104 = interregión F1 4229-5089 = beta-lactamasa
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<110> Ludwig Institute for Cancer Research
<120> ANTICUERPOS CONTRA GM-CSF HUMANIZADOS
<130> SMW/FP6244685
<140> EP 03713430.1
<141> 2003-02-12
<150> PCT/US03/04185
<151> 2003-2-12
<150> 60/355.838
<151> 2002-02-13
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LISTA DE SECUENCIAS
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<120> Anticuerpos contra GM-CSF humanizados
<130> SMW/FP6244685
<140> EP 03713430.1 10 <141> 2003-02-12
<150> PCT/US2003/004185
<151> 2003-02-12
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<223> Cebador oligonucleótido
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<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleótido
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<213> Mus musculus
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<223> región variable de la cadena pesada de 19/2 murino
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<212> PRT
<213> Mus musculus 30 <220>
<223> secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada de 19/2 murino
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<212> ADN 5 <213> Mus musculus
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<223> región variable de la cadena ligera de 19/2 murino
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 15 <223> secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena ligera de 19/2 murino
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<223> cebador usado para la construcción de la cadena ligera de 19/2 quimérico
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<223> cebador usado para la construcción de la cadena ligera de 19/2 quimérico
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<223> cebador usado para la construcción de la cadena pesada de 19/2 quimérico
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<223> cebador usado para la construcción de la cadena pesada de 19/2 quimérico
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Vector pREN 19/2 LC Neo
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<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
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<223> Vector pREN 19/2 HC DHFR
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<213> Mus Musculus
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<223> secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada murina
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<212> PRT
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<223> secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada murina
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<212> ADN 5 <213> Mus musculus
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<223> secuencia de nucleótidos para la región variable de la cadena ligera murina
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<223> secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena ligera murina
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Vector de expresión de la cadena ligera pREN-Neo que es un vector de expresión de célula de mamífero usado para producir anticuerpos quiméricos y humanos remodelados con cadenas ligeras kappa humanas y cadenas pesadas gamma-1 humanas
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<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector de expresión de la cadena pesada pREN-DHFR que es un vector de expresión de célula de mamífero usado para producir anticuerpos quiméricos y humanos remodelados con cadenas ligeras kappa humanas y cadenas pesadas gamma-1 humanas
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<212> ADN 5 <213> Mus musculus
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<223> región variable de la cadena pesada de G250 murino
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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<212> ADN 5 <213> Mus musculus
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<223> región variable de la cadena ligera de G250 murino
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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15 <223> secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena ligera de G250 murino
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<213> Homo sapiens 5 <220>
<223> secuencia de nucleótidos de un fragmento del TNF
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<223> secuencia de aminoácidos de un fragmento del TNF 15 <400> 55
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<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Vector de expresión de la cadena pesada pREN-DHFR-TNF que es un vector de expresión de célula de mamífero usado para producir anticuerpos quiméricos y humanos remodelados con partes de la cadena pesada gamma-1 humana seguida de TNF humano después de la región bisagra de IgG1.
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Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado que consiste en una cadena pesada, cuya secuencia de aminoácidos consiste en los aminoácidos codificados por los nucleótidos 1357-1764 de la SEQ ID NO: 36, concatenada con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1839-2825 de la SEQ ID NO: 36, y una cadena ligera.
  2. 2.
    Un anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos codificados por los nucleótidos 1357-1752 de la SEQ ID NO: 35, concatenada con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 18862203 de la SEQ ID NO: 35.
  3. 3.
    Vectores de expresión, en los que un primer vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada del anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado de la reivindicación 1, operativamente unida a un promotor, y un segundo vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena ligera del anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado, operativamente unida a un promotor.
  4. 4.
    Vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 3, en los que el primer vector de expresión consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 36.
  5. 5.
    Vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o reivindicación 4, en los que la cadena ligera es una cadena ligera de acuerdo con la reivindicación 2.
  6. 6.
    Vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en los que el segundo vector de expresión consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35.
  7. 7.
    Una célula recombinante, transformada o transfectada con el primer y el segundo vector de expresión de la reivindicación 3 ó 4.
  8. 8.
    Una célula recombinante, transformada o transfectada con el primer y el segundo vector de expresión de la reivindicación 5 ó 6.
  9. 9.
    La célula recombinante de la reivindicación 7 u 8, en la que dicha célula es de mamífero.
  10. 10.
    La célula recombinante de la reivindicación 9, en la que dicha célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino.
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