ES2368267T3 - Preparación y utilizaciones de las secuencias génicas codificantes de las glucosiltransferasas quiméricas con actividad de glucosilación optimizada. - Google Patents

Preparación y utilizaciones de las secuencias génicas codificantes de las glucosiltransferasas quiméricas con actividad de glucosilación optimizada. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la producción de secuencias génicas codificantes de glucosiltransferasas membranales quiméricas que presentan una actividad de glucosilación optimizada en las células transformadas con dichas secuencias, en comparación con la actividad de glucosilación de las glucosiltransferasas nativas correspondientes hacia el sustrato aceptor, siendo dicha actividad de glucosilación optimizada por lo menos 30 veces superior a la actividad inicial de las glucosiltransferasas de longitud completa nativas, comprendiendo dicho procedimiento la fusión: - de un primer ácido nucleico codificante de un fragmento mínimo C-terminal del dominio catalítico (CD) de la glucosiltransferasa de longitud completa nativa, siendo dicha primera secuencia de ácidos nucleicos obtenida mediante la eliminación de nucleótidos codificantes de uno o varios aminoácidos contiguos que se extienden desde el primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho CD, y la selección del ácido nucleico codificante de dicho fragmento de CD mínimo C-terminal de manera que si n representa el número de aminoácidos contiguos tal como se ha definido anteriormente, que han sido delecionados, el fragmento obtenido al delecionar por lo menos n+1 aminoácidos contiguos, tal como se ha definido anteriormente, no presenta ninguna actividad sustancial de transferasa, - con un segundo ácido nucleico de secuencia variable codificante de una cadena peptídica transmembranal que especifica el anclaje de las glucosiltransferasas en compartimentos intracelulares, y que comprende en su región Nterminal una región de cola citoplasmática (CT) situada cadena arriba de un dominio transmembranal (TMD) situado cadena arriba de una región de tallo (SR) o de un fragmento de por lo menos 3 aminoácidos contiguos de la SR, estando dicha SR o parte de la misma unida a dicho dominio catalítico mediante un conector o péptido de conexión de por lo menos 2 aminoácidos codificados por un sitio de restricción que no existe en la secuencia de nucleótidos codificante del CD nativo mencionado anteriormente, con la condición de que por lo menos uno de estos péptidos CT, TMD y SR sea diferente de la estructura primaria de las contrapartidas peptídicas naturales presentes en la glucosiltransferasa nativa a partir de la que se obtiene el fragmento de CD con actividad de glucosiltransferasa óptima tal como se ha definido anteriormente, siendo dicha fusión realizada de manera que el primer ácido nucleico se encuentre situado cadena abajo del segundo ácido nucleico y proporcione un producto proteína en el que el CD se encuentre en la mitad C-terminal.

Description

Preparación y utilizaciones de las secuencias génicas codificantes de las glucosiltransferasas quiméricas con actividad de glucosilación optimizada.
La presente invención se refiere a la producción de secuencias génicas codificantes de las glucosiltransferasas quiméricas que presentan una actividad de glucosilación optimizada, y a sus utilizaciones en el contexto de la preparación de proteínas recombinantes de interés por parte de células transformadas con dichas secuencias y a secuencias codificantes de dichas proteínas recombinantes.
Glucosilación de proteínas y lípidos
Las proteínas y lípidos son componentes importantes de las membranas celulares. Los carbohidratos asociados a membrana se encuentran exclusivamente en forma de oligosacáridos unidos covalentemente a proteínas que forman glucoproteínas, y a lípidos que forman glucolípidos. Los glucoconjugados (incluyendo los glucolípidos y glucoproteínas) con frecuencia son moléculas de superficie celular claves que se considera que se encuentran implicadas en interacciones célula-célula y en la adhesión celular (Feizi, 1993, Crocker y Feizi, 1996).
Los monosacáridos predominantes presentes en las glucoproteínas eucarióticas son la glucosa (Glc), la galactosa (Gal), la manosa (Man), la fucosa (Fuc), la N-acetilgalactosamina (GalNAc), la N-acetilglucosamina (GlcNAc) y el ácido siálico (Sia), con frecuencia en forma de ácido neuramínico (NeuAc), que puede encontrarse N-acetilado o Nglucolilado en mamíferos, pero únicamente N-acetilado en seres humanos. Las cadenas de carbohidrato también denominadas glicanos se encuentran unidas al esqueleto polipeptídico mediante enlaces O-glucosídicos o Nglucosídicos. El enlace N-glucosídico se establece a través del grupo amida de la asparagina. El enlace Oglucosídico une el hidroxilo de la serina, treonina o hidroxilisina. En las glucoproteínas O-ligadas de tipo ser o de tipo thr, el monosacárido unido directamente a la proteína frecuentemente s GalNAc, mientras que en las glucoproteínas N-ligadas, únicamente se encuentra GlcNAc.
El enlace N-glucosídico se encuentra conservado en todo el reino eucariótico, incluyendo en levaduras, plantas, insectos, mamíferos y seres humanos. El sitio de glucosilación N-ligada se produce dentro de una secuencia de consenso de aminoácidos, Asn-X-Ser/Thr (N-X-S(T)), en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina. En el caso de que se lleve a cabo un análisis de proteínas en las bases de datos públicas, puede demostrarse que aproximadamente 65% de todas las proteínas contienen por lo menos una de dichas secuencias de consenso. Todas las glucoproteínas N-ligadas contienen un pentasacárido común (invariante) unido al polipéptido. Este núcleo consta de tres residuos de Man y dos de GlcNAc. Unas antenas de secuencia variable completan el glicano y permiten la clasificación en tres subclases N-ligadas principales:
1.
glicanos ricos en manosa que contienen únicamente manosa como azucares terminales.
2.
Glicanos híbridos que contienen por lo menos una antena GlcNAc-Gal.
3.
Glicanos complejos que contienen entre 2 y 5 de dichas antenas terminadas en GlcNAc, Gal o ácido siálico.
En todas las células eucarióticas, las glucoproteínas N-ligadas son sintetizadas cotraduccionalmente a partir de polirribosomas unidos al retículo endoplasmático (RE). El tratamiento de los glicanos N-ligados se produce en etapas tempranas en la luz del RE y continua en el aparato de Golgi y la red trans-Golgi, en la que las glucoproteínas alcanzan su polimorfismo final y funcional. La unión de glicanos O-ligados se produce postraduccionalmente en el aparato de Golgi, en el que también se produce la glucosilación de los lípidos. Los azúcares utilizados para tanto la N-glucosilación como la O-glucosilación resultan activados mediante acoplamiento de nucleótidos específicos presentes en el citoplasma y se importan hacia el interior de los orgánulos mediante transportadores específicos.
La glucosilación es el conjunto más sofisticado de modificaciones postraduccionales que pueden producirse en las proteínas. Está destinada a: i) controlar la actividad biológica de las proteínas, ii) señalizar las proteínas para la unión de receptores de tipo lectina y/o de sistemas de degradación, iii) enviar proteínas a la superficie celular (secreción), iv) dirigir proteínas a compartimentos celulares, v) definir una identidad inmunológica (grupos sanguíneos). En consecuencia, las proteínas glucosiladas existen en forma de una mezcla de glucoformas cuyas propiedades físicoquímicas y biológicas difieren del producto directamente codificado por el gen relevante. Se admite ampliamente que las modificaciones postraduccionales de las proteínas permiten una mejor adaptación de la proteína a su función biológica (Helenius y Aebi, 2001).
Muchas glucoproteínas humanas son de elevada relevancia clínica. Por ejemplo, sobre las superficies celulares resultan importantes para la comunicación entre las células, para mantener la estructura celular y para el autorreconocimiento por parte del sistema inmunológico.
Las glucoproteínas son más abundantes en forma soluble en líquidos biológicos tales como la leche y la sangre. En este caso, los glicanos protegen a las proteínas frente a proteasas, incrementan su solubilidad y controlan su eliminación plasmática y los dirigen a órganos diana.
Enzimas de glucosilación
Las reacciones de glucosilación son de gran importancia biológica para tanto procariotas como eucariotas y requieren la acción coordinada de un gran número de enzimas denominados glucosiltransferasas (GT) (Breton y Imberty, 1999).
Las glucosiltransferasas (GT) constituyen una gran familia de enzimas implicados en la biosíntesis de polisacáridos y glucoconjugados en los reinos procariótico y eucariótico, respectivamente. Las secuencias de los enzimas procarióticos no son homólogas a las de las glucosiltransferasas de mamífero, mientras que los enzimas de seres humanos, mamíferos y de Drosophila con frecuencia comparten homologías significativas. Hasta hoy, se conocen más de mil GT que median en un amplio abanico de funciones biológicas. El desarrollo de la biología molecular de estos enzimas ha revelado una inesperada diversidad, sugiriendo que el proceso de glucosilación probablemente requiere la participación de aproximadamente 250 genes en una sola célula humana viva (Breton et al., 2001). Hasta hoy se han clonado aproximadamente 500 glucosiltransferasas, incluyendo 160 enzimas humanos. Está creciendo el número de enzimas clonados de origen humano y podría alcanzar los 200 en poco tiempo (Narimatsu, 2004). Las GT se clasifican según la estereoquímica de los sustratos y productos de reacción como enzimas conservadores o inversores (Sinnott, 1990). Se ha establecido una clasificación de las glucosiltransferasas utilizando nucleótido disfosfo-azúcar, nucleótido monofosfo-azúcares y azúcares fosfato y proteínas relacionadas en familias diferentes basadas en la secuencia. Demuestra que las GT humanas se reparten hasta el momento en 42 familias estructurales (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/Homo-sapiens.html).
Las glucosiltransferasas catalizan la transferencia de residuos sacáridos de un nucleótido-azúcar (sustrato donador activado) a un aceptor (lípido, proteína o cadena sacárida en crecimiento). Además de la clasificación oficial de los enzimas, pueden agruparse en familias funcionales basándose en sus similitudes de secuencia, lo que podría reflejar características enzimáticas tales como la especificidad de donador, la especificidad de aceptor y la especificidad de unión entre donador y aceptor. Basándose en el azúcar que transfieren, las GT se denominan Nacetilglucosaminiltransferasa (GlcNAcT), galactosiltransferasa (GalT), fucosiltransferasa (FucT) o sialiltransferasa (SiaT o ST). Debido a la acumulación de datos génicos de glucosiltransferasas, se cree que éstas presentan una elevada especificidad para el tipo de enlace en los sustratos donador y aceptor, así como para la naturaleza del aceptor glucoconjugado (glucoproteínas o lípidos N-ligados/O-ligados).
Estructura de las glucosiltransferasas:
Todas las GT clonadas, hasta hoy en vertebrados, muestran la misma topología. Son proteínas membranales de tipo II (dominio citoplasmático N-terminal) compuestas de cuatro dominios principales: una cola citoplasmática corta (CT) en el extremo N-terminal, una región de anclaje membranal (TMD) de 10 a 20 aminoácidos, una región de tallo (SR) y un gran dominio catalítico C-terminal (CD) (figura 1) (Paulson et al., 1987). La región de anclaje actúa como péptido de señal no escindible y también como dominio transmembranal (Wickner y Lodisch, 1985), orientando el dominio catalítico de las GT en la parte luminal del aparato de Golgi. La SR se considera ampliamente una región flexible que también permite la orientación del CD en la parte luminal del aparato de Golgi. De modo general, el CD se encuentra razonablemente conservado dentro de las GT de diversas especies, mientras que la SR constituye una parte hipervariable de la transferasa. Algunos de estos enzimas pueden ser cortados en su SR por una o más proteasas endógenas, y secretarse al exterior de la célula (Paulson y Colley, 1989), produciendo enzimas de la leche o la sangre. Está bien documentado que el corte proteolítico y la secreción de las glucosiltransferasas resultan afectadas por diversas condiciones patológicas tales como la transformación maligna y la inflamación, aunque los mecanismos moleculares subyacentes al corte y secreción no han sido clarificados todavía.
Las GT y las proteínas/lípidos neoglucosilados han sido localizados en el interior del ER y de los subcompartimentos del Golgi utilizando tanto el fraccionamiento subcelular de las membranas celulares como la microscopía inmunoelectrónica (Roth, 1987). Los primeros estudios sugerían que la compartimentalización de las GT podría reflejar la secuencia de modificación de la cadena oligosacárida (Kornfeld y Kornfeld, 1985). Se creía que esta localización estricta garantizaba una biosíntesis óptima de las cadneas de glicano al proporcionar una eficiente vecindad entre enzima, sustrato y donador de azúcar-nucleótido. Algunos estudios posteriores han demostrado que muchos enzimas de glucosilación se solapan en su localización, y han demostrado una subcompartimentalización en el Golgi específica de tipo celular (Colley, 1997). Las GT se encuentran extendidas en los dictiosomas del Golgi y esto puede diferir entre tipos celulares para una proteína dada (Roth, 1991).
De manera general, se ha demostrado que el dominio transmembranal (TMD) de las proteínas es un determinante clave para la localización en el Golgi, esencial por lo menos para que las GalNAcT, GlcNAcT, GalT, FucT y SiaT encuentren sus aceptores. Se ha demostrado que la región flanqueante de TMD y/o la parte luminal, también contribuye a la localización (Munro, 1998; Yang et al., 1996). Además, la CT y la SR de las GT especifican su sublocalización y estabilidad funcionales in vivo en el aparato de Golgi. La sustitución de cualquiera de los tres dominios (CT, TMD y SR) no modifica la actividad catalítica del enzima, pero contribuye a alterar su distribución en los compartimentos del Golgi (Grabenhorst y Conradt, 1999). No se han encontrado secuencias específicas de direccionamiento claras durante la última década y sólo se han identificado regiones de las GT críticas para su compartimentalización (Opat et al., 2001). Más recientemente, los inventores han encontrado que el dominio catalítico soluble de ST6Gal seguía una ruta subcelular diferente que el enzima de longitud completa (Ronin, Biochimie, 2003).
Entre el gran número de GT, las familias que son de mayor interés son aquéllas responsables de la glucosilación terminal debido a que estos azúcares desempeñan un papel importante en fenómenos de reconocimiento y señalización en seres humanos. Entre ellos se incluyen esencialmente las sialiltransferasas (SiaTs), las fucosiltransferasas (FucT) y las galactosiltransferasas (GalT). La galactosa y la fucosa se encuentran implicadas en el reconocimiento de los antígenos de grupo sanguíneo (ABH/Lewis). Los oligosacáridos sialilados de las glucoproteínas y glucolípidos se encuentran implicados en muchos procesos biológicos tales como la adhesión celular y el reconocimiento de receptores en la inflamación y el cáncer (antígeno sialil-Lewis), así como en el crecimiento neuronal (antígeno polisiálico) (Paulson, 1989). La diversidad estructural y la expresión regulada de los sialilglucoconjugados aparentemente se encuentran bien correlacionadas con las funciones de los mismos (Sasaki, 1996).
Sialiltransferasas:
La familia del ácido siálico está compuesta de más de cien derivados entre los que el ácido neuramínico es el más frecuente en mamíferos y seres humanos. Las sialiltransferasas (ST) catalizan la transferencia de un residuo de ácido sialico de su forma activada, el ácido citidil-monofosfo-N-acetil-neuramínico (CMP-Neu5-Ac), a una posición terminal no reductora en un aceptor glicano en glicoproteínas o en glicolípidos. La reacción catalizada es la siguiente:
CMP-j-Neu5Ac + aceptor-OH - CMP-H + Neu5Ac-a-O-aceptor
Cada ST se clasifica según el tipo de enlace establecido entre el residuo de ácido siálico y la especificidad del sustrato aceptor (que puede ser una proteína o un lípido). De esta manera, se distinguen tres grupos: las a2,3sialiltransferasas (a2,3-ST), las a2,6-sialiltransferasas (a2,6-ST) y las a2,8-sialiltransferasas (a2,8-ST). Las a2,6-ST transfieren un residuo de ácido siálico en una posición alfa2,6 (ST6Gal) a una residuo de galactosa, o a una N-acetilD-galactosamina (ST6GalNAc) o a una N-acetil-D-glucosamina (ST6GlcNAc). Sin embargo, todavía se desconoce cuál es el enzima implicado en la formación de este último tipo de enlace. Las a2,3-ST transfieren un ácido siálico al carbono 3 de la galactosa (ST3Gal) y las a2,8-ST, al carbono 8 de otro residuo de ácido siálico (ST8Sia).
Las ST también han sido identificadas en todos los animales (de aves a seres humanos), en células bacterianas y en virus (Sujino et al., 2000). La familia de las ST humanas está compuesta de 20 genes diferentes clonados tal como se muestra en la Tabla 1 (Sasaki, 1996; Ronin, 2003). Sus especificidades de sustrato son las siguientes.
1) a2,6-ST
• ST6Gal:
La ST6Gal I transfiere un residuo de ácido siálico al disacárido Gal�1-4GlcNAc de los N-glicanos (van den Eijnden et al., 1980; Weinstein et al., 1982). Se expresa de modo ubicuo en los tejidos humanos, excepto en los testículos y en el cerebro, en donde se expresa a niveles más bajos (Tabla 2) (Kitagawa y Paulson, 1994a).
La ST6Gal II, identificada recientemente (Krzewinski-Recchi et al., 2003; Takashima et al., 2002), reconoce el disacárido Gal�1-4GlcNac como sustrato aceptor, particularmente en el caso de que se encuentre en un oligosacárido libre (proteína o lípido desconocido). El patrón de expresión de ST6Gal II se restringe al cerebro y muestra un nivel de expresión reducido en testículos, tiroides, ganglios linfáticos y en algunos tejidos fetales (Tabla 2).
• ST6GalNAc:
La segunda subfamilia de a2,6-ST está representada por el grupo de ST6GalNAc, que transfiere un residuo de ácido siálico en un residuo de N-acetil-galactosamina. Se han identificado seis miembros en el ser humano (Tabla 2).
La ST6GalNAc I y la ST6GalNAc II presentan la especificidad de sustrato más amplia, debido a que pueden transferir un ácido siálico a las estructuras de O-glicano siguientes: Gal�1-3GalNAc, GalNAca-O-Ser/Thr, Siaa2-3 Gal�1-3GalNAca-O-Ser/Thr (Ikehara et al., 1999; Kono et al., 2000; Kurosawa et al., 1994; Kurosawa et al., 1996; Harduin-Lepers et al., 2001). Su patrón de expresión es diferente: ST6GalNAc I se expresa en glándulas submaxilares y mamarias, bazo y colon, mientras que ST6GalNAc II se expresa en muchos tejidos, tales como el testículo y las glándulas mamarias lactantes (Kurosawa et al., 1996; Kurosawa et al., 2000).
Las ST6GalNAc III, IV, V y VI presentan una especificidad de sustrato reducida: reconocen únicamente el trisacárido Siaa2,3Gal 1-3GalNAc. Sin embargo, se ha establecido que ST6GalNAc III, V y VI catalizan preferentemente la formación del glucolípido GM1b (Sjoberg et al., 1996; Lee et al., 1999), mientras que ST6GalNAc IV cataliza la transferencia de ácido siálico a O-glicanos (Harduin-Lepers et al., 2000; Ikehara et al., 1999; Lee et al., 1999; Okajima et al., 2000). ST6GalNAc IV muestra una especificidad de sustrato restringida, al utilizar únicamente la secuencia de trisacárido Siaa2,3Gal 1-3GalNAc y no discriminar entre el GalNAc a-ligado y -ligado. Se han descubierto dos isoformas diferentes. El análisis de transferencia northern detectó un transcrito de 2,2 kb en diversos tejidos adultos y niveles de expresión más bajos de un transcrito adicional en cerebro, corazón y músculo esquelético (Harduin-Lepers et al., 2000).
2) a2,3-ST
Todas son ST3Gal que transfieren ácido siálico de un residuo galactosa en un aceptor proteína o lípido.
ST3Gal I fue clonado a partir de una biblioteca de ADNc procedente de glándulas submaxilares y su expresión ubicua (Tabla 2) fue confirmada mediante transferencia northern (Chang et al., 1995). Sintetiza Siaa2,3Gal 1-3-GalNAc, una estructura común a muchos oligosacáridos O-ligados. Difiere de otras ST en su capacidad de utilizar sustratos aceptores glucolípido in vitro (Kitagawa y Paulson, 1994b).
ST3Gal II fue clonada por Kim et al. (1996) a partir de una biblioteca de ADNc procedente de hígado y el análisis de transferencia northern reveló niveles de expresión elevados en corazón, hígado y músculo esquelético, niveles intermedios en timo, nódulo linfático, apéndice y bazo, y niveles más bajos en linfocitos de sangre periférica pulmonar (Tabla 2). ST3Gal II puede transferir residuos de ácido siálico en Gal 1-3-GalNAc o en los gangliósidos (lípidos) GM1 ó asialo-GM1 como sustratos aceptores (Giordanengo et al., 1997).
ST3Gal III ha sido clonada mediante cribado de una biblioteca de ADNc procedente de placenta humana utilizando una sonda basada en un motivo sialilo, aislando el ADNc codificante de ST3Gal III (Kitagawa y Paulson, 1993). El transcrito se expresa abundantemente en el músculo esquelético y en tejido fetal y a un nivel de expresión más bajo en la placenta. Este enzima cataliza la transferencia de ácido siálico a los sustratos que contienen galactosa (Tabla 2).
ST3Gal IV se encuentra implicada en la sialilación de Gal 1-3GalNAc O-ligada (Tabla 2) (Tetteroo et al., 1987). Se expresan 5 ARNm diferentes, y codifican secuencias proteicas idénticas excepto en los extremos 5'. Estos transcritos se producen mediante una combinación de tratamiento alternativo. El análisis de transferencia northern ha demostrado que uno de ellos se expresa específicamente en placenta, testículos y ovarios, indicando que su expresión se encuentra regulada independientemente de la de los demás (Kitagawa et al., 1996).
ST3Gal V ha sido aislada a partir de una biblioteca de ADNc procedente de células humanas y se ha denominado GM3 sintasa. Se expresa un transcrito importante de 2,4 kb en muchos tejidos, particularmente en cerebro, músculo esquelético, placenta y testículos. Se encuentra ampliamente distribuida en el cerebro humano, con un nivel de expresión ligeramente elevado en el córtex cerebral, lóbulo temporal y putamen. La especificidad de sustrato de esta enzima se encuentra muy restringida a la lacosilceramida como aceptor (Tabla 2) (Ishii et al., 1998).
ST3Gal VI ha sido clonada a partir de una biblioteca de ADNc de melanoma humano. Esta ST muestra una especificidad de sustrato restringida: participa en la síntesis del sialil-paraglobósido, un precursor del determinante sialilo-Lewis X (Okajima et al., 1999). Existen 2 formas de ARNm de la ST3Gal VI (denominadas tipo 1 y tipo 2), que difieren únicamente en la región 5' no traducida. Este enzima se expresa a niveles similares en la mayoría de tejidos (Tabla 2) (Taniguchi et al., 2001).
3) a2,8-ST
ST8Sia I también se denomina gangliósido GD3 sintasa y cataliza la transferencia de una molécula de ácido siálico al ácido siálico terminal de GM3 mediante un enlace a2,8 (Sasaki et al., 1994). Se ha demostrado que este enzima también puede utilizar GM1b, GD1a y GT1b como sustrato aceptor (Tabla 2) (Nakayama et al., 1996; Nara et al., 1996; Watanabe et al., 1996).
ST8Sia II también se denomina STX. Scheidegger et al. (1995) utilizaron secuencias de STX de roedor para clonar el ADNc humano a partir de una biblioteca de corazón fetal. STX se expresa principalmente en tejidos embrionarios y a niveles modestos en corazón, cerebro y timo adultos (Angata et al., 1997). Este enzima regula la formación de enlaces entre la molécula de adhesión de las células neurales (NCAM) y el ácido polisiálico (PSA) y de esta manera modula las propiedades adhesivas de NCAM. STX cataliza la transferencia del primer ácido siálico mediante un enlace a2,8 a otro ácido siálico unido en enlace a2,3 ó a2,6 (Tabla 2) (Angata et al., 1997) en un N-glicano, y después participa en el proceso de elongación, generando sucesivos enlaces a2,8 con los residuos anteriores.
ST8Sia III transfiere un ácido siálico en las estructuras de Siaa2-3Gal 1-4GlcNAc dentro de N-glicanos y glucolípidos tales como GM3 (Tabla 2) (Lee et al., 1998; Yoshida et al., 1995a; Yoshida et al., 1995b).
ST8Sia IV, también denominada PST (polisialiltransferasa) ha sido clonada por Nakayama et al. (1995). El análisis de transferencia northern ha revelado que PST se expresa en muchos tejidos fetales y en corazón, bazo y timo adultos, y a niveles más bajos en otros órganos y tejidos (Tabla 2). Este enzima también regula la formación de enlace entre la molécula de adhesión de las células neurales (NCAM) y el ácido polisiálico (PSA). Además, se ha demostrado que cataliza la misma reacción que STX (Angata et al., 2000; Nakayama et al., 1995).
ST8Sia V presenta una actividad de transferencia a los gangliósidos GM1b, GD1a, GT1b y GD3 (Tabla 2) (Kono et al., 1996).
ST8Sia VI ha sido clonada bastante recientemente en el ser humano y se conoce poco de ella. La ST8Sia VI de ratón presenta una actividad de transferencia de ácido siálico a la estructura NeuAca2,3(6)Gal presente en el extremo no reducido de O-glicanos, N-glicanos y oligosacáridos libres tales como la sialil-lactosa (Tabla 2) (Takashima et al., 2002).
4) Organización estructural necesaria para estimular la actividad de sialiltransferasa
Todos los miembros de la familia de las ST presentan tres regiones conservadas en su CD denominadas motivos sialilo: el motivo L de Large (grande)), el motivo S de Small (pequeño) y el motivo VS de Very Small, (muy pequeño) (Datta y Paulson, 1995; Geremia et al., 1997) basados en la comparación entre sus secuencias primarias. Recientemente se ha publicado un estudio de los genomas animales (Harduin-Lepers, 2005) que presenta el objetivo de encontrar secuencias desconocidas que presenten motivos sialilo y, de esta manera, potencialmente de encontrar nuevas ST.
El motivo sialilo L consiste de 44 ó 45 aminoácidos y contiene 5 residuos invariantes entre todos los enzimas humanos, tal como se muestra en la figura 2. Esta región se encuentra en el centro del CD. El segundo motivo sialilo S, en la parte COOH-terminal, consiste de 23 residuos aminoácidos, dos de los cuales son idénticos en todas las ST (Drickamer, 1993). El tercer motivo sialilo VS, en la parte terminal del enzima, consiste de 13 aminoácidos con dos residuos conservados (histidina y glutamato).
Se ha demostrado que el motivo sialilo L participa en la unión del sustrato donador CMP-ácido siálico (Datta y Paulson, 1995). Algunos aminoácidos de este motivo también pueden participar en la actividad catalítica de los enzimas (Sasaki, 1996). Se ha propuesto que el motivo sialilo S participa en la unión de tanto donador como aceptor (Datta et al., 1998). El papel exacto del VS todavía no está claro pero algunos estudios recientes sobre STX y PST han estudiado el papel funcional de la His conservada en este motivo (Kitazume-Kawaguchi et al., 2001). El cambio de la histidina por un residuo de lisina afecta a su actividad catalítica, demostrando que el motivo VS participa en la catálisis. El motivo sialilo VS resulta necesario para una eficiencia catalítica óptima y es parte del sitio activo, principalmente en el sitio aceptor o en proximidad a sustratos azúcar tanto donadores como aceptores (Jeanneau et al., 2004). A partir de trabajos anteriores ahora resulta evidente que la parte C-terminal del CD (parte del motivo sialilo S, del motivo 3 y del motivo sialilo VS) se dedica principalmente al reconocimiento de los sustratos aceptores, mientras que la parte N-terminal (motivos sialilo L y parte del motivo S) participan principalmente en la unión del nucleótido-azúcar (Datta y Paulson, 1995; Datta et al., 1998; Laroy et al., 2001; Kitazume-Kawaguchi et al., 2001; Jeanneau et al., 2004). Sin embargo, no puede excluirse que el motivo sialilo F también participe en el reconocimiento de aceptores (Legaigneur et al., 2001).
Tal como se ha indicado anteriormente, las secuencias de aminoácidos deducidas a partir del ADNc de sialiltransferasa humana clonada muestra la misma organización en cuatro dominios compartidos por muchas GT: i) una cola citoplasmática N-terminal corta (CT, de aproximadamente 10 aminoácidos), ii) un dominio transmembranal (TMD, de aproximadamente 20 aminoácidos), iii) una región de tallo (SR), de longitud muy variable, e iv) un dominio catalítico (CD, de aproximadamente 300 aminoácidos).
La SR se define como la región peptídica situada entre el TMD y el CD que puede eliminarse sin alterar la actividad enzimática (Paulson, 1989; Ronin, 2001; Vallejo-Ruiz et al., 2001; Jeanneau et al., 2004). Sin embargo, se ha demostrado que esta región hipervariable puede resultar esencial para definir un reconocimiento fino del aceptor glicano (tri>bi>tetraantenario) y propusieron que podría participar en un cambio conformacional que abriese el sitio catalítico (Ronin, 2001). Como resultado, se incrementó la eficiencia catalítica en un factor de 35 y se amplió el reconocimiento del glicano aceptor.
El CD resulta crucial para que las ST muestren actividad enzimática. Contiene por lo menos tres secuencias altamente conservadas que mantienen posiciones aminoácidas idénticas en todas las ST de mamífero clonadas. Estos dominios son motivos sialilo L, S y VS (Livingston y Paulson, 1993; Geremia et al., 1997). También se ha aislado recientemente un dominio adicional (motivo 3) entre los motivos sialilo S y VS, que contiene cuatro residuos altamente conservados, con la secuencia de consenso siguiente: (H/y)Y(Y/F/W/h)(E/D/q/g) (las letras mayúsculas y minúsculas indican la aparición frecuente o rara del aminoácido, respectivamente) (Jeanneau et al., 2004). Muchos estudios descritos en la literatura presentan el objetivo de comprender las relaciones estructura/función en la gran familia de ST y, de esta manera, definir particularmente un dominio catalítico mínimo dentro de la misma. De esta manera, el CD mínimo ha sido definido experimentalmente mediante mutagénesis sitio-dirigida o, alternativamente, mediante alineación de secuencias y la comparación de unas cuantas ST (Vallejo-Ruiz et al., 2001; Chen y Colley, 2000; Ronin, 2003).
A pesar de la amplia definición del CD y de la actividad catalítica, todavía resulta difícil delinear un CD mínimo de las ST. La ST6Gal I es el enzima más estudiado de entre las ST y la mayor parte del a investigación se ha centrado en definir tanto un dominio catalítico mínimo como la actividad catalítica misma. Esto se debe a la ausencia de ST6Gal en todas las células utilizadas para producir proteínas recombinantes humanas. Esta carencia es un cuello de botella tecnológico para sistemas heterólogos que utilizan células no animales (levaduras, insectos y plantas), debido a que no contienen nada de ácido siálico. En las células CHO, alternativamente, sólo se expresa una actividad de ST3.
La diferenciación entre el SR y el CD nunca ha sido bien definida, excepto experimentalmente. Basándose en la bioinformática, se ha diseñado una estrategia para identificar el extremo del SR para las 3 familias de ST (Ronin, 2003).
El CD generalmente coincide con el extremo de la región hipervariable en la mitad N-terminal de los enzimas (Ronin, 2003). Por lo tanto, se supone que el dominio catalítico se inicia aproximadamente 70 a 90 residuos cadena arriba del motivo sialilo L y aproximadamente 40 a 45 residuos en el caso de ST6GalNAc III a VI. El tamaño medio del CD se estima en aproximadamente 300 (±20) aminoácidos, incluyendo los motivos sialilo (Jeanneau et al., 2004) (Tabla 3). El CD mínimo ha sido definido para unas cuantas ST, mediante experimentos de truncado o la comparación entre secuencias (Legaigneur et al., 2001; Vallejo-Ruiz et al., 2001; Chen y Colley, 2000), tal como para hST3Gal I (CD mínimo consistente de los aminoácidos 57 a 350; Vallejo-Ruiz et al., 2001) y hST8Sia IV (CD mínimo que consiste de los aminoácidos 62 a 359; Angata et al., 2004).
Tras la transfección en células CHO, se ha encontrado que el CD soluble de hST6Gal I (aminoácidos 90 a 406) muestra una especificidad incrementada para aceptores endógenos debido a que sigue la ruta secretoria intracelular dentro del aparato de Golgi. De esta manera, ha resultado posible delinear un CD mínimo para hST6Gal I que contiene una secuencia crítica capaz de desplazar el reconocimiento de aceptores de aceptores residentes intracelularmente a glicoconjugados de superficie celular (Donadio et al., 2003). Además, el CD secretado soluble de hST6Gal I muestra una eficiencia de transferencia incrementada, con independencia del patrón de ramificación del aceptor glicano (Legaigneur et al., 2001).
Glucosilación de proteínas (fármacos) producidos en sistemas de expresión heteróloga
Las proteínas de interés terapéutico se extrajeron por primera vez de fuentes naturales tales como sangre, placenta,
o tejidos humanos o animales. Sin embargo, este enfoque se encuentra limitado por la fuente, cantidad y disponibilidad de los tejidos humanos y puede contener contaminantes potencialmente letales (priones, oncogenes, virus, etc.), así como alérgenos potenciales generados por proteínas de animales. Con el incremento de las proteínas-fármacos autorizados y de las necesidades clínicas, se han desarrollado nuevos enfoques para la producción de proteínas utilizando diferentes sistemas de expresión.
En la mayoría de casos, los mayores esfuerzos se están focalizando actualmente en la humanización del patrón de glucosilación de las proteínas recombinantes para aproximarse al máximo al patrón en las glucoproteínas naturales con el fin de mejorar la farmacocinética y reducir la inmunogenicidad del producto.
La maquinaria necesaria para la síntesis, la activación y la introducción de los residuos sialilo se expresa pobremente en los diversos sistemas de expresión de proteínas recombinantes existentes. Por lo tanto, las proteínas humanas recombinantes producidas con frecuencia se encuentran infrasialiladas o incluso no sialiladas en absoluto en comparación con sus contrapartidas nativas.
Uno de los sistemas más utilizados es la bacteria Escherichia coli (E. coli) (Swartz, 2001; Baneyx, 1999), pero su inconveniente principal es que este procariota no lleva a cabo las modificaciones postraduccionales humanas, en particular las glucosilaciones de proteínas, debido a que no se expresa ninguna glucosiltransferasa de este tipo en
E. coli. Lo anterior puede llevar al rechazo de la proteína terapéutica de interés por parte del sistema inmunológico, a la reducción de la vida media en circulación y/o de su actividad biológica. La proteína producida finalmente puede plegarse incorrectamente y agregar formando cuerpos de inclusión.
Las levaduras y hongos filamentosos también son sistemas de expresión eucarióticos bien conocidos y presentan una maquinaria celular similar a la de las células humanas. Las levaduras producen proteínas complejas y pueden llevar a cabo varias modificaciones postraduccionales tales como glucosilaciones simples. Sin embargo, aunque el proceso de la N-glucosilación realizado por las levaduras y los hongos es el mismo que el proceso en los mamíferos en las etapas iniciales en el retículo endoplasmático, no se ha encontrado ningún oligosacárido complejo que contenga ácido siálico, galactosa, fucosa y N-acetilgalactosamina en las glucoproteínas producidas por estos organismos (Blanchard, 2004); tanto las levaduras como los hongos típicamente producen glicanos ricos en manosa mediante la adición de hasta 100 residuos de manosa (en el caso de las levaduras) en el núcleo pentasacarídico (Tanner y Lehele, 1987; Herscovics y Orlean, 1993) en el aparato de Golgi. Esta hipermanosilación promueve una respuesta inmunológica en el ser humano.
La introducción de la glucosilación en levaduras (Hamilton et al., 2003; Roy et al., 2000) en primer lugar ha permitido la reducción del número de residuos de manosa añadidos. Los enzimas que resultan necesarios para la Nacetilglucosaminilación y galactosilación han sido añadidos en estos sistemas (Maras et al., 1999; Bretthauer, 2003; Vervecken et al., 2004). Sin embargo, la adición del ácido siálico terminal todavía resulta difícil de conseguir debido al gran número de enzimas implicado en esta etapa terminal.
Las proteínas expresadas en las células de insecto se pliegan correctamente, pueden experimentar modificaciones postraduccionales y ser secretadas. La glucosilación N-ligada temprana realizada por estas células resulta similar a la realizada por las células de mamífero. Sin embargo, las estructuras de glicano obtenidas en este caso son del tipo paucimanosídico, es decir, truncadas debido a la presencia de una actividad de N-acetilhexosaminidasa no deseable que degrada las neoglucoproteínas expresadas durante la expresión baculovírica (Blanchard, 2004). Además, en algunas líneas de células de insecto pueden encontrarse residuos a1,3-fucosa y estos residuos generalmente inducen una respuesta inmunológica no deseable en el ser humano. De esta manera, la utilización de este sistema se restringe a la producción de antígenos vacunales.
En las células de insecto, las GT que catalizan la transferencia de azúcares inmunogénicos han sido delecionadas y la sialilación ha podido conseguirse mediante la adición de 3 genes codificantes de N-acetilglucosamina 2epimerasa, N-acetilneuraminil-liasa y CMP-Neu5Ac sintasa (Jarvis et al., 1998; Aumiller et al., 2003). Se ha creado una nueva línea celular de insecto (SfSWT-3) diseñada para sintetizar su propio CMP-ácido siálico. Las células resultantes expresan la totalidad de los 7 genes de mamífero, pueden producir CMP-ácido siálico y sialilato, una proteína heteróloga en el caso de que el cultivo se realice en un medio de cultivo sin suero (Aumiller et al., 2003).
Al igual que las células eucarióticas, las plantas muestran una compleja y sofisticada maquinaria celular que puede utilizarse para producir proteínas terapéuticas. Las proteínas recombinantes presentan una calidad farmacológica muy buena debido a que las plantas presentan muchos de los enzimas necesarios para la maduración de las proteínas. Sin embargo, la ruta de glucosilación requiere ajustes importantes para no producir proteínas alergénicas. En efecto, las N-glucosilaciones en plantas (Lerouge et al., 2000) son similares a las realizadas en el ser humano en el aspecto de la glucosilación nuclear. Sin embargo, los glicanos todavía no presentan antenas sialiladas y contienen
1,2-xilosa y a1,3-fucosa internas. Ambos residuos son altamente inmunogénicos en el ser humano y en la actualidad dificultan la aprobación de las plantas transgénicas como sistemas de expresión para uso terapéutico.
En las plantas, la primera estrategia utilizada estaba destinada a prevenir la adición de azúcares alergénicos al prevenir que las proteínas salgan del retículo endoplasmático. En consecuencia, los glicanos N-ligados no pueden madurar hasta el tipo complejo. Otra estrategia se basa en la inhibición de varias GT en el interior del aparato de Golgi. Esta inhibición no puede ser completa y/o puede competir con la maquinaria endógena para la maduración.
El sistema de expresión celular de mamífero, es decir las células CHO, en la actualidad es el único sistema farmacológico aprobado para producir terapéuticos recombinantes. Estas células muestran una ventaja importante debido a que pueden sintetizar glucoproteínas N-ligadas de elevado peso molecular y/o multiméricas. Las células de mamífero expresan naturalmente no sólo los enzimas participantes en la síntesis y transporte de los azúcares de nucleótido, sino también las glucosiltransferasas necesarias para conseguir la glucosilación compleja de las proteínas recombinantes con un contenido satisfactorio de ácido siálico 3-ligado. Sin embargo, existe una falta de algunos enzimas, tales como las a1,3/4-fucosiltransferasas y las a2,6-sialiltransferasas, que llevan a cabo la glucosilación O-ligada y N-ligada. Además, en las células de mamífero, la sialilación se produce a través del ácido Nglucolilneuramínico (NeuGc), que también difiere significativamente del derivado N-acetilado (NeuAc) presente en células humanas.
En el caso de las células de mamífero, se han llevado a cabo estudios utilizando la sobreexpresión de una a2,3-St y una 1,4GalT (Weikert et al., 1999); ambos enzimas se encuentran presentes en el genoma, pero sus actividades son muy variables dependiendo de las condiciones del cultivo celular. Lo anterior ha conducido a una amplia variabilidad respecto a la presencia de la Gal y ácido siálico terminales y a una extensa microheterogeneidad en las proteínas glucosiladas. Los estudios también se han orientado hacia la optimización de la galactosilación y la sialilación (Granbenhorst et al., 1999) mediante la introducción de una a2,6-ST (Bragonzi et al., 2000) en células de mamífero. Se ha establecido una línea celular CHO que expresa establemente a2,6-ST de rata nativa. Las glucoproteínas producidas por estas células CHO muestran residuos de ácido siálico terminales tanto a2,6-ligados como a2,3-ligados, de manera similar al ser humano; la proporción observada entre los residuos presentes de ácido siálico terminales a2,6-ligados y a2,3-ligados era de 40,4% de residuos ácido a2,6-siálico y 59,6% de residuos ácido a2,3-siálico, lo que mejoró la farmacocinética en los estudios de eliminación (Bragonzi et al., 2000). A pesar de estas mejoras en la humanización de las células, la proporción entre los residuos de ácido siálico terminal a2,6-ligados y a2,3-ligados no puede controlarse y no se ha encontrado que resulte favorable a la actividad en posición 6. De esta manera, aparentemente la primera sialilación es una etapa crítica para el control de las estructuras de glicano y, en segundo lugar, la dificultad reside también en expresar la ST heteróloga en un compartimento específico de la célula (direccionamiento), en optimizar su actividad en el caso de que el sustrato donador para este enzima se encuentre presente (portador).
Por lo tanto, cabe indicar que la sialilación terminal de los fármacos glucoproteicos aprobados es la etapa más difícil de alcanzar en todos los sistemas de expresión disponibles hasta hoy.
Objetivo de la invención
El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para generar un panel de nuevas secuencias génicas codificantes de enzimas membranales quiméricos con actividad de glucosiltransferasa, y en particular para diseñar secuencias génicas codificantes de sialiltransferasas quiméricas innovadoras que doten a células de una necesaria actividad sialilante y mejoren la calidad y rendimiento de proteínas glucosiladas recombinantes.
La invención se refiere a un procedimiento para producir secuencias génicas codificantes de glucosiltransferasas membranales quiméricas que presentan una actividad de glucosilación optimizada en células transformadas con dichas secuencias, en comparación con la actividad de glucosilación de las glucosiltransferasas nativas correspondientes, es decir, una glucosilación menos selectiva y/o más eficiente (hasta por lo menos 30 veces más elevada que la actividad inicial de las glucosiltransferasas de longitud completa nativas) hacia el sustrato aceptor, comprendiendo dicho procedimiento la fusión:
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de una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de un fragmento mínimo C-terminal del dominio catalítico (CD) de la glucosiltransferasa de longitud completa nativa, mostrando dicho fragmento CD mínimo Cterminal una actividad de transferasa (que puede incrementarse por lo menos 30 veces respecto a la actividad inicial del CD nativo), obteniendo dicha primera secuencia de ácidos nucleicos mediante la eliminación de los nucleótidos codificantes de uno o varios aminoácidos contiguos que se extienden desde el primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho CD, y la selección del ácido nucleico codificante de dicho fragmento CD mínimo Cterminal, el cual, en el caso de que n represente el número de aminoácidos contiguos tal como se ha indicado anteriormente que han sido delecionados, el fragmento obtenido al delecionar por lo menos n+1 aminoácidos contiguos tal como se ha definido anteriormente, no presenta actividad de transferasa sustancial,
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con un segundo ácido nucleico de secuencia variable codificante de una cadena peptídica transmembranal que especifica un anclaje de las glucosiltransferasas en comportamientos intracelulares, y que comprende (o que consiste) en su región N-terminal, una región de cola citoplasmática (CT) situada cadena arriba de un dominio transmembranal (TMB), éste localizado cadena arriba de una región tallo (SR) o de un fragmento de por lo menos 3 aminoácidos contiguos de la SR, estando unida dicha SR o parte de la misma a dicho dominio catalítico, opcionalmente mediante un conector o péptido de conexión de por lo menos 2 aminoácidos codificados por un sitio de restricción que no existe en la secuencia de nucleótidos codificante del CD nativo indicado anteriormente,
con la condición de que por lo menos uno de dichos péptidos CT, TMD y SR sea diferente de la estructura primaria de los péptidos nativos correspondientes en la glucosiltransferasa nativa de la que se deriva el fragmento de CD con actividad de glucosiltransferasa óptima tal como se ha definido anteriormente,
llevando a cabo dicha fusión de manera que el primer ácido nucleico se localice cadena abajo del segundo ácido nucleico y proporcione un producto proteico en el que el CD se encuentre en la mitad C-terminal.
Debe apreciarse la referencia a las glucosiltransferasas membranales quiméricas que presentan una actividad de glucosilación optimizada en células transformadas con dichas secuencias, en comparación con la actividad de glucosilación de las glucosiltransferasas nativas correspondientes, como que dichas glucosiltransferasas membranales quiméricas:
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presentan una actividad de transferencia de azúcares menos selectiva hacia sustratos aceptores que las glucosiltransferasas nativas correspondientes en ensayo in vitro con glucoproteínas aceptoras exógenas/disponibles comercialmente que presentan glicanos biantenarios, triantenarios o tetraantenarios conocidos, es decir, que presentan una actividad de glucosilación in vivo en células hacia todas las glucoproteínas aceptoras celulares, siendo medible dicha actividad de glucosilación preferentemente en compartimentos intracelulares y de superficie celular según el procedimiento general siguiente utilizando la unión de lectina SNA.
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y/o presentan una actividad de transferencia de azúcares más eficiente hacia sus sustratos aceptores que las glucosiltransferasas nativas correspondientes, es decir, muestran una actividad de glucosilación por lo menos 30 veces superior que la actividad inicial de las glucosiltransferasas de longitud completa nativas, siendo medible dicha actividad de glucosilación según el procedimiento in vitro general con glucoproteínas aceptoras exógenas/disponibles comercialmente que presentan glicanos biantenarios, triantenarios o tetraantenarios.
La expresión "glucosiltransferasas quiméricas" utilizada anteriormente corresponde a uan glucosiltransferasa cuya secuencia de longitud completa no es el producto directo de un gen nativo o un transcrito, sino que ha sido diseñada utilizando secuencias de otras glucosiltransferasas exclusivamente.
La expresión "glucosiltransferasas nativas" utilizada anteriormente corresponde a la secuencia del enzima de longitud completa según se encuentra representada por una secuencia codificante natural.
La expresión "actividad de glucosilación" utilizada anteriormente corresponde a la reacción catalítica de transferir un azúcar de un nucleótido donador a un sustrato aceptor.
La expresión "dominio catalítico mínimo (CD)" utilizada anteriormente corresponde al dominio peptídico C-terminal de una secuencia de glucosiltransferasa que no puede delecionarse adicionalmente sin pérdida de actividad de transferencia.
La expresión "dominio transmembranal (TMD)" utilizada anteriormente corresponde a una parte peptídica compuesta de un tramo de 17 a 24 aminoácidos esencialmente hidrofóbicos.
La expresión "cola citoplasmática (CT)" utilizada anteriormente corresponde al péptido N-terminal de una glucosiltransferasa que puede comprender por lo menos más de 3 aminoácidos cadena arriba del TMD.
La expresión "región tallo (SR)" utilizada anteriormente corresponde a un tramo de, como máximo, 246 aminoacidos cadena abajo del TMD/cadena arriba del CD.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el primer y el segundo ácidos nucleicos se derivan de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD, o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en glucosiltransferasas de origen eucariótico, preferentemente mamíferos y seres humanos, participando dichas glucosiltransferasas en:
•
la O-glucosilación de las proteínas en las células, tales como las transferasas N-acetilgalactosaminilo, Nacetilglucosaminilo, glucosilo, fucosilo, galactosilo o sialilo,
•
la N-glucosilación de las proteínas en células, tales como las transferasas N-acetilglucosaminilo, galactosilo, fucosilo o sialiltransferasas,
•
la glucosilación de lípidos tales como las transferasas N-acetilgalactosaminilo, N-acetilglucosaminilo, fucosilo, galactosilo o sialilo.
La expresión "O-glucosilación" utilizada anteriormente corresponde a la ruta biosintética que elabora monosacáridos u oligosacáridos unidos covalentemente a aminoácidos que no son residuos asparagina, pero que preferentemente pueden ser hidroxiaminoácidos tales como los residuos serina, treonina o hidroxilisina.
La expresión "N-glucosilación" utilizada anteriormente corresponde a la ruta biosintética que elabora oligosacáridos unidos a los residuos asparagina dentro del tripéptido de consenso Asn-X-Ser/Thr (X no siendo prolina).
La expresión "galactosiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a uan glucosiltransferasa que transfiere un residuo galactosa de UDP-Gal a una proteína o glucolípido aceptor N-ligado/O-ligado.
La expresión "sialiltrnasferasas" utilziada anteriormente corresponde a uan glucosiltransferasa que transfiere un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado del ácido neuramínico, de CMP-NeuAc a una proteína o glucolípido aceptor N-ligado/O-ligado.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque los primer y segundo ácidos nucleicos se derivan de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD,
o regiones CT, TMD y SR, respectivamente en N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas, glucosiltransferasas, galactosiltransferasas, fucosiltransferasas o sialiltransferasas.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el primer y segundo ácidos nucleicos se derivan de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD,
o regiones CT, TMD y SR, respectivamente en alfa-6-fucosiltransferasas (glucosilación del núcleo), beta-2/4/6-Nacetilglucosaminiltransferasas (ramificación), beta-4-galactosiltransferasas y alfa-3/6/8-sialiltransferasas (glucosilación terminal).
Ventajosamente, el primer y segundo ácidos nucleicos se derivan de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD, o regiones CT, TMD y SR, de enzimas implicados en la ruta de N-glucosilación.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el primer y segundo ácidos nucleicos se derivan de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD,
o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en sialiltransferasas.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el primer y segundo ácidos nucleicos se derivan de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD,
o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en a2,6-sialiltransferasas, a2,3-siaililtransferasas o a2,8sialiltransferasas.
Ventajosamente, las secuencias de nucleótidos codificantes de CT, TMD y/o SR o fragmento de SR mencionados anteriormente son preferentemente de origen sintético.
La expresión "a2,6-sialiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a una glucosiltransferasa que puede transferir un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado de ácido neuramínico, de CMP-NeuAc a la posición 6 de un carbohidrato aceptor del tipo proteína o glucolípido N-ligado/O-ligado.
La expresión "a2,3-sialiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a una glucosiltransferasa que puede transferir un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado del ácido neuramínico, de CMP-NeuAc a la posición 3 un carbohidrato aceptor del tipo proteína o glucolípido N-ligado/O-ligado.
La expresión "a2,8-sialiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a una glucosiltransferasa capaz de transferir un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado del ácido neuramínico, de CMP-NeuAc a la posición 8 de un aceptor sialilado del tipo proteína o glucolípido N-ligado/O-ligado.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque los primer y segundo ácidos nucleicos se derivan de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD,
o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en:
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a2,6-sialiltransferasas seleccionadas de entre:
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las 1,4-galactósido a2,6-sialiltransferasas I y II humanas (hST6Gal I y hST6Gal II) representadas por las secuencias SEC ID nº 2 y SEC ID nº 4, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3, respectivamente, o
*
las N-acetilgalactosaminido-a2,6-sialiltransferasas I a VI humanas (hST6GalNAc I a VI), representadas por las secuencias SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10, SEC ID nº 12, SEC ID nº 14 y SEC ID nº 16, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 13 y SEC ID nº 15, respectivamente,
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a2,3-sialiltransferasas seleccionadas de entre las galactósido-a2,3-sialiltransferasas I a VI humanas (hST3Gal I a VI) representadas por las secuencias SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 22, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 y SEC ID nº 28, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 21, SEC ID nº 23, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27, respectivamente, o las galactósido-a2,3-sialiltransferasas I a VI de rata (rST3Gal I a VI), tales como la rST3Gal III representada por la secuencia SEC ID nº 30 codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 29, o cualquier ST de otro origen animal con la condición de que comparta una homología de por lo menos 85% con el enzima humano.
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a2,8-sialiltransferasas seleccionadas de entre las ácido siálico-a2,8-sialiltransferasas I a VI humanas (hST8Sia I a VI) representadas por las secuencias SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40 y SEC ID nº 42, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39 y SEC ID nº 41, respectivamente.
La expresión "galactósido-a2,6-sialiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a una glucosiltransferasa que transfiere un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado del ácido neuramínico, de CMP-NeuAc a la posición 6 de un receptor galactosilado del tipo proteína o lípido N-ligado/O-ligado.
La expresión "N-acetilgalactosaminido-a2,6-sialiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a una glucosiltransferasa que transfiere un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado del ácido neuramínico de CMP-NeuAc a la posición 6 de un residuo N-acetilgalactosaminilo de un aceptor proteína o glucolípido N-ligado/Oligado.
La expresión "galactósido-a2,3-sialiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a una glucosiltransferaa que transfiere un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado del ácido neuramínico, de CMP-NeuAc a la posición 3 de un aceptor proteína o lípido N-ligado/O-ligado galactosilado.
La expresión "ácido sialico-a2,8-sialiltransferasas" utilizada anteriormente corresponde a una glucosiltransferasa que transfiere un residuo ácido siálico, preferentemente un derivado del ácido neuramínico, de CMP-NeuAc a un aceptor proteína o glucolípido N-ligado/O-ligado sialilado.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos codificante del dominio CD comprendido en el primer ácido nucleico se selecciona de entre las secuencias constituidas por, o que comprenden:
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 268 y 330, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.218 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6Gal I delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 90 y 110 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 406 de la secuencia SEC ID nº 2,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 307 y 369, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.587 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6Gal II delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 103 y 123, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 529 de la secuencia SEC ID nº 4,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 814 y 876, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.800 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNAc I delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 272 y 292 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 600 de la secuencia SEC ID nº 6,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 172 y 234, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.122 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 58 y 78 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 374 de la secuencia SEC ID nº 8,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 73 y 135, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 915 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac III delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 25 y 45, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 305 de la secuencia SEC ID nº 10,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 61 y 123, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 906 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac IV delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 21 y 41, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 302 de la secuencia SEC ID nº 12,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 121 y 183, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.008 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac V delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 41 y 61, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 336 de la secuencia SEC ID nº 14,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 154 y 216, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 999 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 52 y 72 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 333 de la secuencia SEC ID nº 16,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 145 y 207, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.020 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 49 y 69, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 340 de la secuencia SEC ID nº 18,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 175 y 237, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.050 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal II delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 59 y 79, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 350 de la secuencia SEC ID nº 20,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 199 y 261, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.332 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha
secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 67 y 87, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 444 de la secuencia SEC ID nº 22,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 79 y 141, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 987 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 27 y 47, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 329 de la secuencia SEC ID nº 24,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 136 y 198, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.086 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 46 y 66, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 362 de la secuencia SEC ID nº 26,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 73 a 135, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 993 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 25 y 45, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 331 de la secuencia SEC ID nº 28,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 103 y 165, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.122 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de ST3Gal III de rata delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 35 y 55, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 374 de la secuencia SEC ID nº 30,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 133 a 195, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.068 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 45 y 65, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 356 de la secuencia SEC ID nº 32,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 190 a 252, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.125 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 64 y 84, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 375 de la secuencia SEC ID nº 34,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 205 a 267, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.140 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 69 y 89, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 380 de la secuencia SEC ID nº 36,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 145 a 207, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.077 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 49 y 69, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 359 de la secuencia SEC ID nº 38,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 211 a 273, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.128 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 71 y 91, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 376 de la secuencia SEC ID nº 40,
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la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 277 a 339, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.194 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 93 y 113, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 398 de la secuencia SEC ID nº 42.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el primer ácido nucleico es la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 43, correspondiente a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 268 y 1.218 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 43 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 44, correspondiente al fragmento mínimo C-terminal del dominio CD de hST6Gal I delimitado por los aminoácidos situados entre las posiciones 90 y 406 de la secuencia SEC ID nº 2.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque:
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la secuencia de nucleótidos codificante de la región CT comprendida en el segundo ácido nucleico se selecciona de entre:
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 45 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 27 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 45 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 46 correspondiente a la región CT de hST6Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 9 de la secuencia SEC ID nº 2,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 47 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 30 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 47 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 48 correspondiente a la región CT de hST6Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 10 de la secuencia SEC ID nº 4,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 49 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 42 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 50 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 49 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 14 de la secuencia SEC ID nº 6,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 51 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 21 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 51 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 52 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 7 de la secuencia SEC ID nº 8,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 53 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 53 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 54 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 10,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 55 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 55 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 56 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 12,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 57 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 57 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 58 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 14,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 59 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 129 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 59 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 60 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 43 de la secuencia SEC ID nº 16,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 61 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 39 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 61 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 62 correspondiente a la región CT de hST3Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 13 de la secuencia SEC ID nº 18,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 63 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 63 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 64 correspondiente a la región CT de hST3Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 20,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 66 correspondiente a la región CT de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 22,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 67 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 67 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 68 correspondiente a la región CT de hST3Gal IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 24,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 69 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 15 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 69 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 70 correspondiente a la región CT de hST3Gal V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 5 de la secuencia SEC ID nº 26,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 71 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 12 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 71 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 72 correspondiente a la región CT de hST3Gal VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 4 de la secuencia SEC ID nº 28,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 74 correspondiente a la región CT de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 30,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 75 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 87 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 75 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 76 correspondiente a la región CT de hST8Sia I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 29 de la secuencia SEC ID nº 32,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 78 correspondiente a la región CT de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 34,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 79 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 27 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 79 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 80 correspondiente a la región CT de hST8Sia III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 9 de la secuencia SEC ID nº 36,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 21 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 82 correspondiente a la región CT de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 7 de la secuencia SEC ID nº 38,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 83 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 51 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 83 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 84 correspondiente a la región CT de hST8Sia V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 17 de la secuencia SEC ID nº 40,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 85 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 9 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 85 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 86 correspondiente a la región CT de hST8Sia VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 3 de la secuencia SEC ID nº 42,
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la secuencia de nucleótidos codificante de la región TMD comprendida en el segundo ácido nucleico se selecciona de entre:
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 87 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 28 y 78 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 87 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 88 correspondiente a la región TMD de hST6Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 10 y 26 de la secuencia SEC ID nº 2,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 89 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 31 y 90 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 89 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 90 correspondiente a la región TMD de hST6Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 11 y 30 de la secuencia SEC ID nº 4,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 91 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 43 y 105 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 91 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 92 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 15 y 35 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 93 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 22 y 84 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 93 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 94 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 8 y 28 de la secuencia SEC ID nº 8,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 95 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 95 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 96 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 10,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 97 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 19 y 81 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 97 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 98 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 27 de la secuencia SEC ID nº 12,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 99 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 87 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 99 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 100 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 29 de la secuencia SEC ID nº 14,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 101 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 130 y 177 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 101 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 102 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 44 y 59 de la secuencia SEC ID nº 16,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 103 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 40 y 102 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 103 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 104 correspondiente a la región TMD de hST3Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 14 y 34 de la secuencia SEC ID nº 18,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 105 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 19 y 81 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 105 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 106 correspondiente a la región TMD de hST3Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 27 de la secuencia SEC ID nº 20,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 108 correspondiente a la región TMD de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 22,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 109 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 78 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 109 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 110 correspondiente a la región TMD de hST3Gal IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 26 de la secuencia SEC ID nº 24,
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la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 111 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 16 y 78 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 111 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 112 correspondiente a la región TMD de hST3Gal V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 6 y 26 de la secuencia SEC ID nº 26,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 113 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 13 y 75 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 113 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 114 correspondiente a la región TMD de hST3Gal VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 5 y 25 de la secuencia SEC ID nº 28,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 116 correspondiente a la región TMD de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 30,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 117 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 88 y 144 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de
nucleótidos SEC ID nº 117 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 118 correspondiente a la región TMD de hST8Sia I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 30 y 48 de la secuencia SEC ID nº 32,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 19 y 69 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 120 correspondiente a la región TMD de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 23 de la secuencia SEC ID nº 34,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 121 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 28 y 99 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 121 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 122 correspondiente a la región TMD de hST8Sia III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 10 y 33 de la secuencia SEC ID nº 36,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 22 y 60 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 124 correspondiente a la región TMD de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 8 y 20 de la secuencia SEC ID nº 38,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 125 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 52 y 114 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 125 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 126 correspondiente a la región TMD de hST8Sia V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 18 y 38 de la secuencia SEC ID nº 40,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 127 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 10 y 72 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 127 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 128 correspondiente a la región TMD de hST8Sia VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 4 y 24 de la secuencia SEC ID nº 42,
-
la secuencia de nucleótidos codificante de la región SR comprendida en el segundo ácido nucleico, o codificante de un fragmento de por lo menos 2 aminoácidos del mismo, se selecciona de entre las secuencias constituidas o que comprenden:
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 79, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 267 y 327 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 27 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 89 y 109 de la secuencia SEC ID nº 2,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 91, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 306 y 336 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 31 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 102 y 112 de la secuencia SEC ID nº 4,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 106, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 813 y 873 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 36 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 271 y 291 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 171 y 231 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 57 y 77 de la secuencia SEC ID nº 8,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 102 y 132 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 34 y 44 de la secuencia SEC ID nº 10,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 82, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 90 y 120 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc IV delimitada
en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 28 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 30 y 40 de la secuencia SEC ID nº 12,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 88, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 120 y 180 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 30 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 40 y 60 de la secuencia SEC ID nº 14,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 178, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 183 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 60 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 61 de la secuencia SEC ID nº 16,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 103, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 144 y 204 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 35 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 48 y 68 de la secuencia SEC ID nº 18,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 82, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 174 y 234 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 28 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 58 y 78 de la secuencia SEC ID nº 20,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 198 y 258 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 66 y 86 de la secuencia SEC ID nº 22,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 79, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 108 y 138 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 27 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 36 y 46 de la secuencia SEC ID nº 24,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 79, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 135 y 195 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 27 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 45 y 65 de la secuencia SEC ID nº 26,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 76, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 103 y 132 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 26 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 34 y 44 de la secuencia SEC ID nº 28,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 105 y 165 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de rST3Gal III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 35 y 55 de la secuencia SEC ID nº 30,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 145, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 162 y 192 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 49 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 54 y 64 de la secuencia SEC ID nº 32,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 70, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 189 y 249 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia II delimitada
en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 24 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 63 y 83 de la secuencia SEC ID nº 34,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 100, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 204 y 264 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 34 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 68 y 88 de la secuencia SEC ID nº 36,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 61, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 144 y 204 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 21 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 48 y 68 de la secuencia SEC ID nº 38,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 115, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 210 y 270 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 39 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 70 y 90 de la secuencia SEC ID nº 40,
*
la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 73, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 276 y 336 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 25 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 92 y 112 de la secuencia SEC ID nº 42,
* o cualquier fragmento de por lo menos 6 nucleótidos de las secuencias de nucleótidos codificantes secuencias polipeptídicas correspondientes a las regiones SR indicadas anteriormente, y codificantes de por lo menos 2 aminoácidos contiguos de dichas regiones SR, tales como:
** el fragmento SEC ID nº 129 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 130 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
** el fragmento SEC ID nº 131 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 109 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 132 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 37 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
** el fragmento SEC ID nº 133 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 420 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 134 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 140 de la secuencia SEC ID nº 6,
** el fragmento SEC ID nº 135 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 774 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 136 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 258 de la secuencia SEC ID nº 6,
** el fragmento SEC ID nº 137 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 21, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 138 correspondiente al fragmento de la región SR de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 22,
** el fragmento SEC ID nº 139 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 29, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 140 correspondiente al fragmento de la región SR de ST3GalII de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 30,
** el fragmento SEC ID nº 141 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 70 y 237 de la secuencia SEC ID nº 33, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 142 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 24 y 79 de la secuencia SEC ID nº 34,
** el fragmento SEC ID nº 143 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 61 y 201 de la secuencia SEC ID nº 37, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 144 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 21 y 67 de la secuencia SEC ID nº 38.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque:
-
la secuencia de nucleótidos codificante de la región CT comprendida en el segundo ácido nucleico se selecciona de entre:
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 49 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 42 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 49 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 50 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 14 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 66 correspondiente a la región CT de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 22,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 74 correspondiente a la región CT de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 30,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 78 correspondiente a la región CT de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 34,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 1 y 21 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 82 correspondiente a la región CT de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 7 de la secuencia SEC ID nº 38,
-
la secuencia de nucleótidos codificante de la región TMD comprendida en el segundo ácido nucleico se selecciona de entre:
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 91 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 43 y 105 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 91 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 92 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 15 y 35 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 108 correspondiente a la región TMD de hST3GalII delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 22,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 116 correspondiente a la región TMD de rST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 30,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 19 y 69 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 120 correspondiente a la región TMD de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 23 de la secuencia SEC ID nº 34,
*
la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 22 y 60 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 124 correspondiente a la región TMD de hST8 Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 8 y 20 de la secuencia SEC ID nº 38,
-
la secuencia de nucleótidos codificante de la región SR o un fragmento de la misma comprendido en el segundo ácido nucleico se selecciona de entre:
*
la secuencia SEC ID nº 129 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 130 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia SEC ID nº 131 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 109 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 132 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 37 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia SEC ID nº 133 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 420 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 134 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 140 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia SEC ID nº 135 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 774 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 136 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 258 de la secuencia SEC ID nº 6,
*
la secuencia SEC ID nº 137 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 21, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 138 correspondiente al fragmento de la región SR de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 22,
*
la secuencia SEC ID nº 139 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 29, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 140 correspondiente al fragmento de la región SR de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 30,
*
la secuencia SEC ID nº 141 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 70 y 237 de la secuencia SEC ID nº 33, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 142 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 24 y 79 de la secuencia SEC ID nº 34,
*
la secuencia SEC ID nº 143 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 61 y 201 de la secuencia SEC ID nº 37, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 144 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 21 y 67 de la secuencia SEC ID nº
38.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque los péptidos CT, TMD, SR o fragmento de SR comprendidos en el segundo ácido nucleico, son secuencias homólogas derivadas de la misma glucosiltransferasa nativa, siendo ésta última diferente de los péptidos en la glucosiltransferasa nativa a partir de la que se derivó el fragmento CD con actividad glucosiltransferasa óptima tal como se ha definido anteriormente.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el segundo ácido nucleico se selecciona de entre las secuencias siguientes:
-
la secuencia SEC ID nº 145 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, que contiene las secuencias SEC ID nº 49, 91 y 129, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 146 correspondiente al fragmento de hST6GalNAc I delimitado por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6, y que contiene las regiones CT, TMD y fragmento SR de hST6GalNAc I correspondiente a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 130, respectivamente,
-
la secuencia SEC ID nº 147 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 420 de la secuencia SEC ID nº 5, que contiene las secuencias SEC ID nº 49, 91 y 133, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 148 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 140 de la secuencia SEC ID nº 6, y que contiene las regiones CT, TMD y fragmento SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 134, respectivamente,
-
la secuencia SEC ID nº 149 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 774 de la secuencia SEC ID nº 5, que contiene las secuencias SEC ID nº 49, 91 y 135, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 150 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados
entre las posiciones 1 y 258 de la secuencia SEC ID nº 6, y que contiene las regiones CT, TMD y fragmento SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 136, respectivamente,
-
la secuencia SEC ID nº 151 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 138 de la secuencia SEC ID nº 21, que contiene las secuencias SEC ID nº 65, 107 y 137, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 152 correspondiente al fragmento de la región SR de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 46 de la secuencia SEC ID nº 22, y que contiene las regiones CT, TMD y fragmento SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 108 y 138, respectivamente,
-
la secuencia SEC ID nº 153 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 138 de la secuencia SEC ID nº 29, que contiene las secuencias SEC ID nº 73, 115 y 139, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 154 correspondiente al fragmento de la región SR de rST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 46 de la secuencia SEC ID nº 30, y que contiene las regiones CT, TMD y fragmento SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 74, 116 y 140, respectivamente,
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la secuencia SEC ID nº 155 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 237 de la secuencia SEC ID nº 33, que contiene las secuencias SEC ID nº 77, 119 y 141, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 156 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 79 de la secuencia SEC ID nº 34, y que contiene las regiones CT, TMD y fragmento SR de hST8Sia II correspondientes a las secuencias SEC ID nº 78, 120 y 142, respectivamente,
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la secuencia SEC ID nº 157 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 201 de la secuencia SEC ID nº 37, que contiene las secuencias SEC ID nº 81, 123 y 143, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 158 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 67 de la secuencia SEC ID nº 38, y que contiene las regiones CT, TMD y SR de hST8Sia IV correspondientes a las secuencias SEC ID nº 82, 124 y 144, respectivamente.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque los péptidos CT, TMD, SR o fragmento de SR comprendidos en el segundo ácido nucleico, son secuencias heterólogas derivadas de diferentes genes o transcritos de glucosiltransferasa natural.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el segundo ácido nucleico es la secuencia SEC ID nº 159 correspondiente a la fusión de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 177 que contiene las secuencias SEC ID nº 65 y 107 codificantes de las regiones CT y TMD de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66 y 108, respectivamente, con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 131 codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 132 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 37 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6, codificando dicha secuencia SEC ID nº 159 el polipéptido de fusión SEC ID nº 160 entre las regiones CT y TMD de hST3Gal III, por una parte, y el fragmento 37 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I, por la otra.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque el segundo ácido nucleico es la secuencia SEC ID nº 179 correspondiente a la fusión de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 codificante de la CT de hST3Gal III correspondiente a la secuencia SEC ID nº 66, con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 codificante de la región TMD de hST8Sia II correspondiente a la secuencia SEC ID nº 120, y con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 129 codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 130 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6, codificando dicha secuencia SEC ID nº 179 el polipéptido de fusión SEC ID nº 180 entre la región CT de hST3Gal III, la región TMD de hST8Sia II y el fragmento 36 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque comprende la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 como el primer ácido nucleico, con un segundo ácido nucleico seleccionado de entre:
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la secuencia SEC ID nº 145, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 161 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 162 que contiene las regiones de CT, TMD y fragmento SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS con el fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
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la secuencia SEC ID nº 147, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 163 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 164 que contiene las regiones CT, TMD y fragmento SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 134, respectivamente, unida mediante un conector GS al fragmento mínimo Cterminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
-
la secuencia SEC ID nº 149, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 165 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 166 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I
correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 136, respectivamente, unidas mediante un conector SR al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
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la secuencia SEC ID nº 151, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 167 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 168 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 108 y 138, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
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la secuencia SEC ID nº 153, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 169 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 170 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de ST3Gal III de rata correspondientes a las secuencias SEC ID nº 74, 116 y 140, respectivamente, unidas mediante un conector SR al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
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la secuencia SEC ID nº 155, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 171 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 172 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST8Sia II correspondientes a las secuencias SEC ID nº 78, 120 y 142, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
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la secuencia SEC ID nº 157, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 173 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 174 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST8Sia IV correspondientes a las secuencias SEC ID nº 82, 124 y 144, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
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la secuencia SEC ID nº 159, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 175 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 176 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66 y 108, respectivamente, y el fragmento 37 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I correspondiente a la secuencia SEC ID nº 132, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I,
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la secuencia SEC ID nº 179, que conduce a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 181 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 182 que contiene la región CT de hST3Gal III, la región TMD de hST8Sia II y el fragmento 36 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I, correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 120 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I.
La invención también se refiere a secuencias génicas codificantes de glucosiltransferasas quiméricas tales como las obtenidas siguiendo el procedimiento definido anteriormente.
La invención se refiere más particularmente a secuencias génicas tal como se ha definido anteriormente, seleccionadas de entre:
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la secuencia SEC ID nº 161 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 162 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 161 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 145,
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la secuencia SEC ID nº 163 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 164 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 134, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 163 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 147,
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la secuencia SEC ID nº 165 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 166 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 136, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 165 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 149,
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la secuencia SEC ID nº 167 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 168 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 108 y 138, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 167 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 151,
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la secuencia SEC ID nº 169 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 170 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de ST3Gal III de rata correspondientes a las secuencias SEC ID nº 74, 116 y 140,
respectivamente, unidas mediante un conector SR al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 169 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 153,
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la secuencia SEC ID nº 171 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 172 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST8Sia II correspondientes a las secuencias SEC ID nº 78, 120 y 142, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 171 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 155,
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la secuencia SEC ID nº 173 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 174 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST8Sia IV correspondientes a las secuencias SEC ID nº 82, 124 y 144, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 173 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 157,
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la secuencia SEC ID nº 175 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 176 que contiene las regiones de los fragmentos CT, TMD y SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66 y 108, respectivamente, y el fragmento 37 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I correspondiente a la secuencia SEC ID nº 132, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 175 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 159,
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la secuencia SEC ID nº 181 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 182 que contiene la región CT de hST3Gal III, la región TMD de hST8Sia II y el fragmento 36 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I, correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 120 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 181 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 179.
La invención también se refiere a vectores, tales como plásmidos, constructos víricos o bacterianos, que comprenden por lo menos una secuencia génica tal como se ha definido anteriormente.
La invención también se refiere a células eucarióticas huésped de origen en levaduras, hongos, insectos, plantas, mamíferos o seres humanos, transformadas con por lo menos una secuencia génica tal como se ha definido anteriormente, utilizando por lo menos un vector indicado anteriormente.
La invención también se refiere a la utilización de por lo menos una secuencia génica tal como se ha definido anteriormente, o de un vector tal como se ha indicado anteriormente, para la transformación de células tal como se ha definido anteriormente, o a la utilización de animales transgénicos obtenidos a partir de dichas células transformadas, en el marco de la producción de proteínas recombinantes de interés.
La invención también se refiere a un método para la preparación de proteínas recombinantes de interés. que comprende la transformación de células tal como se ha definido anteriormente, con un vector que contiene por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de dichas proteínas recombinantes de interés.
Las proteínas recombinantes preferentes de interés que pueden prepararse según un método indicado anteriormente según la invención se seleccionan de entre hormonas, enzimas, factores de coagulación, antígenos carbohidrato/biomarcadores séricos, citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos o receptores.
Las células huésped preferentes para la preparación de proteínas recombinantes de interés tal como se ha indicado anteriormente, se seleccionan de entre células u organismos aprobados farmacológicamente, preferentemente de entre células de roedor, mamífero o ser humano.
Descripción de las figuras
La figura 1 representa la topología membranal de las glucosiltransferasas. Las glucosiltransferasas son proteínas membranales de tipo II que incluyen una cola N-terminal citoplasmática (CT), una señal de anclaje transmembranal (TMD) seguido de una región de tallo (SR) y un gran dominio catalítico C-terminal (CD).
Figura 2: secuencia de aminoácidos de los motivos sililo L, S y VS en 20 sialiltransferasas humanas. Los residuos aminoácidos de consenso en todas las sialiltransferasas se muestran en negrita.
La figura 3 representa la distribución esquemática de CT, TMD, SR y CD de la ST6Gal I de rata, mostrando los residuos clave, que son tyr123 y cys conservadas. CT: cola citoplasmática (9 aminoácidos), TMD: dominio transmembranal (17 aminoácidos), SR: región de tallo (70 aminoácidos), CD: dominio catalítico (307 aminoácidos);
L: motivo sialilo L; S: motivo sialilo S y VS: motivo sialilo VS.
La figura 4 representa constructos de ADN para producir quimeras y para evaluar el papel de la cola citoplasmática y el dominio transmembranal en dos isoformas enzimáticas (rST6Gal I Tyr o Cys 123), respectivamente (Fenteany y Colley, 2005).
La figura 5 representa la alineación de secuencias de la ST6Gal I de rata y humana. Puede observarse que la secuencia N-terminal que comprende la CT(1-9) y el TMD(10-26) se encuentra totalmente conservada, mientras que la parte SR yuxtamembranal (27-89) es más variable, aunque el péptido yuxtamembrana y especialmente positivamente los residuos lisina y cisteína, se encuentran bien conservados.
La figura 6 representa la ruta del ácido siálico en células humanas en el contexto de la glucosilación celular global. Los enzimas que participan en este proceso secuencial son: (a y b) UDP-N-acetilglucosamina/2-epimerasa/Nacetilmanosamina quinasa (UDP-GlcNAc 2-epimerasa/ManNAc 6-quinasa). Reacciones: (a) epimerasa y (b) quinasa, c) reacción de fosfato de ácido N-acetilneuramínimo sintasa (NANS SAS; fosfato de ácido Nacetilneuramínico sintasa) y reacción de la N-acetilneuraminato piruvato liasa de Homo sapiens (NPL, Nacetilneuraminato piruvato liasa), (d) NeuAc 9-fosfatasa, (e) citidina-5'-monofosfato de ácido N-acetilneuramínico sintetasa (CMP-NeuAc sintetasa), (f) transportador de citidina monofosfato-ácido siálico (transportador de CMP-NeuAc del Golgi), y (g) sialiltransferasas.
Cabe mencionar que el derivado del ácido siálico mostrado en el diagrama, denominado "Neu5Ac", se considera ampliamente la forma "humana" del ácido siálico. En todos los demás animales, con la excepción del pollo, existe una etapa adicional en la ruta (mostrada en este diagrama), en la que CMP-Neu5Ac se hidroxila adicionalmente y se convierte en CMP-Neu5Gc por la acción enzimática de la ácido CMP-N-acetilneuramínico hidroxilasa.
La figura 7 representa una vista general esquemática de los diversos constructos quiméricos sintéticos generados mediante la invención.
La figura 7A representa la construcción general de una quimera sintética que incluye el dominio sintético Nterminal etiquetado con el epítopo FLAG fusionado con el dominio catalítico mínimo (CD) mediante la adición de un sitio de restricción.
La figura 7B muestra la ligación entre los dominios N-terminal sintético y catalítico utilizando un sitio de restricción BamHI. Observar que los constructos se introducen en el vector utilizando sitios de restricción, en particular AflII y XbaI, que son diferentes del sitio de ligación.
La figura 8 muestra la topología y características del vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).
La figura 9 representa las construcciones del CD de FLAG-hST6Gal I y de las formas quiméricas de este CD fusionadas con varios fragmentos N-terminales de otras sialiltransferasas de longitud variable.
La figura 9A corresponde a FLAG-CD.
La figura 9B corresponde a hST8SiaII-79/CD.
La figura 9C corresponde a hST8SiaIV-67/CD.
La figura 9D corresponde a hST6GalNAc I-258/CD.
La figura 9E corresponde a r/hST3Gal III-46/CD.
La figura 10 representa el dominio catalítico mínimo digerido de hST6Gal I y su producto de PCR amplificado destinado a la utilización en cada construcción de la quimera sintética. Se cargaron las muestras en un gel de agarosa al 1,5% con el marcador de ácidos nucleicos SmartLadder (SL).
La figura 10A muestra el dominio catalítico de hST6Gal I digerido del vector CMV, producido a partir de clonación en el laboratorio.
La figura 10B muestra el producto de PCR del dominio catalítico mínimo en 966 pb.
La figura 10C muestra el producto de PCR concentrado del dominio catalítico mínimo de hST6Gal I con 5 μl cargados en el gel.
La figura 11 muestra un gel de agarosa (al 2%) que muestra la banda de ADN de la región N-terminal sintética reconstituida de hST3Gal III. El carril 1 corresponde a un producto de PCR de 174 pb; el carril 2 corresponde al SmartLadder SF; el carril 3 corresponde a 5 μl del producto de PCR concentrado de 174 pb de longitud.
La figura 12 representa el gen de enzima reconstruido total de hST3Gal III/CD.
En la figura 12A, un gel de agarosa (al 1,5%) muestra la banda de ADN de hST3Gal III/CD sintético reconstituido amplificado mediante PCR.
La figura 12B corresponde a 5 μl de los productos de PCR concentrados de aproximadamente 1.200 pb de longitud.
La figura 12C representa el producto de la digestión del vector recombinante con los enzimas de restricción AflII y XbaI, que muestra la inserción del gen quimérico (tamaño esperado: 1.200 pb).
La figura 13 muestra un gel de agarosa (al 2%) que muestra la banda de ADN de la región N-terminal sintética reconstituida de hST6GalNAc 1-74. El carril 1 corresponde a un producto de PCR de 270 pb; el carril 2 corresponde al SmartLadder SF; el carril 3 corresponde a 5 μl de los productos de PCR concentrados de 270 pb de longitud.
La figura 14 representa el gen sintético reconstruido completo de hST6GalNAc I-74/CD.
La figura 14A muestra un gel de agarosa (al 1,5%) con la banda de ADN de hST6GalNAc I-74/CD sintético reconstituido amplificado mediante PCR.
La figura 14B muestra 5 μl de los productos de PCR concentrados de la quimera de aproximadamente 1.200 pb de longitud.
La figura 14C muestra el producto de la digestión del vector recombinante con los enzimas de restricción AflII y XbaI, que muestra la inserción del gen quimera (tamaño esperado: 1.225 pb).
La figura 15 muestra un gel de agarosa (al 1,5%) que muestra la banda de ADN de la región N-terminal sintética reconstituida de hST6GalNAc 1-40. Carril 1: SmartLadder SF; carril 2: producto de PCR de 468 pb.
La figura 16 muestra un gel de agarosa (al 1,5%) que muestra la banda de ADN del gen híbrido sintético reconstituido compuesto de hST3Gal III-29/37-hST6GalNAc I-74. El carril 1 corresponde al SmartLadder SF; el carril 2 corresponde a un producto de PCR de 249 pb.
La figura 17 muestra un gel de agarosa (al 1,5%) que muestra la banda de ADN del gen híbrido sintético reconstituido compuesto de hST3Gal III-29/37-hST6GalNAc I-74 ligado con el CD. El carril 1 corresponde al SmartLadder SF; el carril 2 corresponde a un producto de PCR de 1.197 pb.
La figura 18 representa la expresión del dominio catalítico mínimo (CD) (panel A) de hST6Gal I en células CHO, basado en un doble marcaje con FITC-SNA ligante de ácido siálico unido en posición 6 y con un mAb anti-FLAG, utilizando microscopía confocal. La expresión transitoria del CD se analizó mediante marcaje anti-FLAG (panel B) y para la unión de SNA-FITC (panel C). El panel D muestra la superposición de la señal de los paneles B y C (Donadio et al., 2003).
La figura 19 muestra la expresión de dos enzimas quiméricos: hST8SiaIV-67/CD, hST8SiaII-79/CD en células CHO. Las células transfectadas se marcaron doblemente con un mAb anti-FLAG (A y D) y con FITC-SNA (B y E). Se representan las superposiciones en C y F.
La figura 20 muestra la expresión de ST3GalIII/CD y ST3GalIII-hST6GalNAc I-74/CD en células CHO. Las células transfectadas se marcaron doblemente con un mAb anti-FLAG (A y D) y con FITC-SNA (B y E). Las superposiciones se representan en C y F.
La figura 21 muestra la expresión de hST6GalNAc I-74/CD y 258/CD en células CHO. Las células transfectadas se marcaron doblemente con un mAb anti-FLAG (A y D) y con FITC-SNA (B y E). Las superposiciones se representan en C y F.
La figura 22 muestra un gel de agarosa (al 2%) que muestra la banda de ADN de la región N-terminal sintética reconstituida de hST3Gal III/hST8Sia II/hST6GalNAc I. El carril 1 corresponde a un producto de PCR de 240 pb; el carril 2 corresponde al SmartLadder SF; el carril 3 corresponde a 3 μl del producto de PCR concentrado de 240 pb.
La figura 23 representa el producto de la digestión del vector recombinante con los enzimas de restricción XbaI y BamHI, que muestra la inserción del gen del dominio catalítico (tamaño esperado: 960 pb). La muestra se cargó en u ngel de agarosa al 1,5% con el marcador de ácidos nucleicos SL.
La figura 24 muestra el gen de enzima reconstruido de hST3Gal III/hST8Sia II/hST6GalNAc I/CD.
En la figura 24a, un gel de agarosa (al 1,5%) muestra el producto de la digestión del vector recombinante con los enzimas de restricción XbaI y AflII, que muestra la inserción del gen quimera (tamaño esperado: 1.200 pb).
La figura 24b representa el producto de PCR obtenido tras la amplificación de una muestra miniprep, que confirma la inserción del gen quimera.
5 La figura 25 muestra la expresión del enzima quimérico hST3Gal III/hST8Sia II/hST6GalNAc 1/CD en células CHO. Las células transfectadas se marcaron doblemente con un mAb anti-FLAG (A) y con FITC-SNA (B). Se representa la superposición en C.
Leyendas de las Tabla 1 a 5
10 Tabla 1: secuencias y números de acceso de las 20 sialiltransferasas conocidas en el ser humano.
Tabla 2: sustratos aceptores y sitios de expresión de las sialiltransferasas humanas tal como se describe en Harduin-Lepers et al., 2001, y en Jeanneau et al., 2003.
15 Tabla 3: distribución de los 4 dominios peptídicos compartidos por las ST humanas. Una cola citoplasmática Nterminal corta (CT; aproximadamente 10 aminoácidos), un dominio transmembranal (TMD, aproximadamente 20 aminoácidos), una región de tallo (SR), de longitud muy variable, y un dominio catalítico (CD, aproximadamente 300 aminoácidos), incluyendo los motivos sialilo L, S y VS.
20 Tabla 4: péptidos conservados propuestos de aproximadamente 31 a 85 aminoácidos identificados dentro de la región SR hipervariable. Se encuentran 5 motivos: motivo A común a ST6Gal y ST6GalNAc I, motivo B común a ST6GalNAc I y ST6GalNAc II, motivos C y D comunes a todos los ST8Sia y motivo E, presente en ST3Gal excepto en ST3Gal I y II (Donadio et al., 2003).
25 Tabla 5: diseño de las cuatro parejas de cebadores utilizadas para la amplificación de PCR.
Tabla 1 Tabla 2
SIALILTRANSFERASAS HUMANAS
Nº DE ACCESO DE GenBank Nº DE ACCESO DE SwissProt
ST6Gal I
Al7362 P15907
ST6Gal II
NM_032528 Q8IUG7
ST6GalNAc I
NM_018414 Q9NSC7
ST6GalNAc II
NM_006456 Q9UJ37
ST6GalNAc III
NM_152996 Q8NDV1
ST6GalNAc IV
NM_014403 Q9H4F1
ST6GalNAc V
NM_030965 Q9BVH7
ST6GalNAc VI
AB035173 Q969X2
ST3Gal I
L29555 Q11201
ST3Gal II
U63090 Q16842
ST3Gal III
L23768 Q11203
ST3Gal IV
L23767 Q11206
ST3Gal V
AF105026 Q9UNP4
ST3Gal VI
AF119391 Q9Y274
ST8Sia I
L32867 Q92185
ST8Sia II
U33551 Q92186
ST8Sia III
AF004668 043173
ST8Sia IV
L41680 Q92187
ST8Sia V
U91641 015466
ST8Sia VI
AJ621583 P61647
SIALILTRANSFERASAS HUMANAS
Aceptor Expresión
ST6Gal I
Gal 1-4GlcNAc Ubicuo
ST6Gal II
Gal 1-4GlcNAc Cerebro, testículos, tiroide, tejido fetal, ganglios linfáticos
ST6GalNAc I
Gal 1-3GalNAc GalNAca-O-Ser/Thr Siaa2-3 Gal 1-3GalNAca-O-Ser/Thr Submaxilar y mamaria Glándulas, bazo, colon
ST6GalNAc II
Gal 1-3GalNAc-O-Ser/Thr Siaa2-3Gal 1-3GalNAca-O-Ser/Thr Glándulas mamarias lactantes, testículo
ST6GalNAc III
Siaa2-3Gal 1-3GalNAc
ST6GalNAc IV
Siaa2-3Gal 1-3GalNAc, GM1b Ubicuo
ST6GalNAc V
Siaa2-3Gal 1-3GalNAc, GM1b
ST6GalNAc VI
GM1b, GT1b
ST3Gal I
Gal 1-3GalNAc Ubicuo
ST3Gal II
Gal 1-3GalNAc, GM1, Corazón, hígado, músculo esquelético
Asialo-GM1
Timo, nódulo linfático, apéndice, glándulas salivares, bazo
ST3Gal III
Gal 1-3GlcNAc Músculo esquelético, tejido fetal
Gal 1-4GlcNAc
ST3Gal IV
Gal 1-4GlcNAc-O Placenta, testículo, ovario
Gal 1-3GlcNAc-O
ST3Gal V
Gal 1-4Glc -Cer Ubicuo
ST3Gal VI
Gal 1-4GlcNAc Corazón, placenta, hígado y la mayoría de los demás tejidos
ST8Sia I
Siaa2-3Gal 1-4Glc 1-O-Cer, GM3
ST8Sia II
SiaGal 1-4GalNAc Tejidos embrionarios, cerebro
ST8Sia III
Sia2-3Gal 1-4GlcNAc
ST8Sia IV
SiaGal 1-4GalNAc Cerebro, tejidos fetales, corazón adulto, bazo, timo
ST8Sia V
GM1b, GD1a, GT1b, GD3
ST8Sia VI
NeuAca2, 3(6)Gal
Tabla 3 ESTIMACIÓN DE LA LONGITUD DE LOS DOMINIOS
Sialiltransferasas humanas
Total Cola citoplasmática (CT) Dominio transmembranal (TMD) Región de tallo (SR; +/- 10 aa) Dominio catalítico (CD; +/- 10 aa) Motivo sialilo L (47 aa) Motivo sialilo S (24 aa) Motivo sialilo VS (12 aa)
ST6Gal I
406 1-9 (9 AA) 10-26 (17 AA) 27-100 (74 AA) 101-406 (306 AA) 181-227 320-343 366-378
ST6Gal II
529 1-10 (10 AA) 11-30 (20 AA) 31-112 (82 AA) 113-529 (417 AA) 293-339 433-456 479-491
ST6GalNAc I
600 1-14 (14 AA) 15-35 (41 AA) 36-281 (246 AA) 282-600 (319 AA) 362-408 518-541 563-575
ST6GalNAc II
374 1-7 (7 AA) 8-28 (21 AA) 29-67 (39 AA) 68-374 (307 AA) 148-194 302-325 347-359
ST6GalNAc III
305 1-8 (8 AA) 9-28 (20 AA) 29-34 (6 AA) 35-305 (271 AA) 77-123 214-237 273-285
ST6GalNAc IV
302 1-6 (6 AA) 7-27 (21 AA) 28-30 (3 AA) 31-302 (272 AA) 73-119 210-233 270-282
ST6GalNAc V
336 1-8 (8 AA) 9-29 (21 AA) 30-50 (21 AA) 51-336 (286 AA) 93-139 230-253 291-303
ST6GalNAc VI
333 1-43 (43 AA) 44-59 (16 AA) 60-61 (2 AA) 62-333 (272 AA) 105-151 241-264 303-315
ST3Gal I
340 1-13 (13 AA) 14-34 (21 AA) 35-58 (24 AA) 59-340 (282 AA) 139-185 266-289 312-324
ST3Gal II
350 1-6 (6 AA) 7-27 (21 AA) 28-68 (41 AA) 69-350 (282 AA) 149-195 276-299 322-334
ST3Gal III
444 1-8 (8 AA) 9-28 (20 AA) 29-76 (48 AA) 17-444 (368 AA) 157-203 299-322 346-358
ST3Gal IV
329 1-8 (8 AA) 9-26 (18 AA) 27-36 (10 AA) 37-329 (293 AA) 117-163 258-281 307-319
ST3Gal V
362 1-5 (5 AA) 6-26 (21 AA) 27-55 (29 AA) 56-362 (307 AA) 136-182 282-305 329-341
ST3Gal VI
331 1-4 (4 AA) 5-25 (21 AA) 26-34 (9 AA) 35-331 (297 AA) 115-161 256-279 303-315
ST8Sia I
356 1-29 (29 AA) 30-48 (19 AA) 49-54 (6 AA) 55-356 (302 AA) 135-182 272-295 318-330
ST8Sia II
375 1-6 (6 AA) 7-23 (17 AA) 24-73 (50 AA) 74-375 (302 AA) 157-200 292-315 342-354
ST8Sia III
380 1-9 (9 AA) 10-33 (24 AA) 34-78 (45 AA) 79-380 (302 AA) 159-205 298-321 350-362
ST8Sia IV
359 1-7 (7 AA) 8-20 (13 AA) 21-58 (38 AA) 59-359 (301 AA) 139-185 277-300 327-339
ST8Sia V
376 1-17 (17 AA) 18-38 (21 AA) 39-80 (42 AA) 81-376 (296 AA) 93-208 298-321 344-350
ST8Sia VI
398 1-3 (3 AA) 4-24 (21 AA) 25-102 (78 AA) 103-398 (296 AA) 183-230 320-343 360-378
Tabla 4
ENZIMAS
Región conservada Motivo A Motivo B Motivo C Motivo D Motivo E
hST6Gal I
93-165 159-165 X X X X
hST6GalNAc I
259-331 310-315 324-331 X X X
hST8Sia IV
71-133 X X 71-90 119-133 X
hST3Gal IV
75-106 X X X X 84-91
Tabla 5
Fragmentos amplificados
Conjunto de cebadores Tamaño del producto de PCR (pb)
hST3Gal III hST6GalNAc I-74 hST6GalNAc I-140 hST3Gal III-29/37-hST6GalNAc-74
5’ AflII-ST3 3’ST3-BamHI 5’ AflII-ST6 3 ’ST6-BamHI 5’ AflII-ST6 3’ST6-BamHIn°2 5’ AflII-ST3 3’ST6-BamHI 186 270 468 246
Descripción de la invención
La invención se describe con mayor detalle en la descripción detallada a continuación. 10
1. Introducción
Bases de la invención:
15 Se han centrado en el estudio de hST6Gal I debido a que esta actividad enzimática no se encuentra presente en todas las células huésped utilizadas hasta hoy para la producción de proteínas heterólogas, especialmente en los sistemas celulares aprobados farmacológicamente. El enzima humano fue clonado en Ronin, 2001.
En contraste con la literatura, se pudo demostrar inicialmente que el enzima de longitud completa puede sialilar
20 diferencialmente las glucoproteínas aceptoras de estructura de glicano biantenaria, triantenaria y/o tetraantenaria (Ronin, 2001) y, a partir de ello, se planteó la hipótesis de que, dentro de la estructura de transferasa, debe ejercerse un control estéril situado en la región SR hipervariable sobre el CD para regular y restringir naturalmente la especificidad enzimática. Para el propósito de producir proteínas sialiladas de interés biomédico, este control regulador debería eliminarse y, como resultado, ampliarse la especificidad. En el interior de la región conservada
25 (93-165) de hST6Gal I, se ha identificado una secuencia hidrofóbica: 93-QVWxKDS-100. La importancia de esta secuencia ha sido estudiada mediante la deleción progresiva en hST6Gal I de su parte N-terminal dentro de la región conservada recién identificada. Los mutantes por deleción �35, �48, �60 y �82 muestran una eficiencia de transferencia incrementada. Las deleciones realizadas antes y después del dominio conservado (93-165 de ST6Gal I) demostraron que el mutante �100 pierde su actividad catalítica, mientras que �89 (que contiene la secuencia
30 hidrofóbica QVWxKDS) presenta una actividad catalítica óptima. Los resultados indican claramente que esta secuencia corta resulta crucial para estimular la actividad. Esta secuencia hidrofóbica podría contribuir a cambios conformacionales locales que resultan esenciales para que el sitio activo estimule la transferencia de ácido siálico.
Se ha llevado a cabo un segundo estudio destinado a identificar la base molecular y celular que controla la
35 preferencia de aceptor de las ST (Ronin, 2003). Debido a que resultaba difícil delinear el CD de la región hipervariable de la SR, plantearon la hipótesis de que la SR de las ST podría contener características estructurales relacionadas con la preferencia de aceptor. Se analizaron 53 enzimas animales y humanos de especificidad conocida mediante análisis bioinformático con el fin de determinar si las ST podían compartir una parte peptídica con el fin de restringir el reconocimiento de aceptor a una subfamilia de enzimas. Se ha identificado una región altamente
40 conservada de aproximadamente 31 a 85 aminoácidos y, en el interior de esta región, se han identificado 5 motivos: el motivo A, común a ST6Gal y ST6GalNAc I; el motivo B, común a ST6GalNAc I y ST6GalNAc II, los motivos C y D comunes a todas las ST8Sia, y el motivo E, presente en ST3Gal excepto en ST3Gal I y II (Tabla 4).
Dichos 5 motivos son típicos de un subgrupo de ST que comparte una actividad catalítica similar y que de esta
45 manera participan de la misma manera en la transferencia de ácido siálico. Se encuentran situados al final de la SR en proximidad al motivo sialilo L y pueden considerarse parte del CD como característica clave del reconocimiento de aceptor.
También resulta de interés especial el resultado de que el mutante �89 es muy eficiente en las células CHO y que
50 sigue la ruta intracelular desde el Golgi temprano hasta la red trans-Golgi/trans-Golgi. El mutante �89 se expresa a lo largo de la ruta intracelular de las glucoproteínas y glucolípidos en los dictiosomas completos del aparato de Golgi (Ronin, 2003). Este estudio permitió delinear el CD mínimo para hST6Gal I que contenía la secuencia hidrofóbica crucial (QVWxKDS) y que desplazaba el reconocimiento de aceptor de los aceptores residentes intracelulares a los glucoconjugados de superficie celular. Estos resultados proporcionaron la base para el diseño de nuevas quimeras
55 ancladas a membrana que podrían mostrar un tráfico intracelular similar para encontrar glucoproteínas nuevamente sintetizadas dentro de la ruta secretoria a medida que son empaquetadas en células huésped artificiales durante su producción como fármaco.
El CD mínimo de hST6Gal I 89 ha sido utilizado en la invención como "CD optimizado" de especificidad ampliada y eficiencia de transferencia incrementada y en lo sucesivo se denominará "CD".
Distribución de las sialiltransferasas en el aparato de Golgi
La localización en el Golgi de las GT no se encuentra organizada estrictamente; los enzimas no se distribuyen y aíslan en un único compartimento del aparato de Golgi, más frecuentemente se solapan y cocompartimentalizan (Colley, 1997; Berger et al., 1998; Berger, 2002). Todavía no se han identificado señales de retención claras, pero los enzimas forman gradientes solapantes a través de los dictiosomas (Opat et al., 2001) y se han identificado únicamente las regiones cruciales.
Se han planteado dos hipótesis respecto a los mecanismos de retención en el Golgi: i) la longitud del TMD controla la retención en el Golgi (modelo de grosor de bicapa; Bretscher y Munro, 1993; Colley, 1997; Munro, 1998), e ii) la oligomerización de las proteínas conduce a la retención en el Golgi (hipótesis de oligomerización/reconocimiento de afines; Machamer, 1991; Colley, 1997), en la que los autores postulan que los enzimas interactúan en las cisternas del Golgi formando estructuras excesivamente grandes para entrar en las vesículas de transporte (Munro, 1998).
La longitud del TMD aparentemente también resulta crucial como señal de retención. El TMD representa un factor clave en el proceso de retención; en la mayoría de casos resulta suficiente estimular una localización en el Golgi, es decir a través de los compartimentos cis, mediales y trans. El alargamiento del TMD de las ST resulta en una retención reducida y el TMD sintético (creado mediante mutagénesis) de 17 leucinas confiere retención en el Golgi, mientras que 23 leucinas no lo consiguen (Munro, 1991, 1995, 1998). Respecto a las señales de retención de las ST, participan varias regiones de un modo independiente para retener enzimas en el aparato de Golgi. El TMD con sus regiones flanqueantes resultan suficientes para la retención en el Golgi (Colley, 1997). Otros estudios sugieren que no resulta necesaria ninguna secuencia específica en el TMD para la retención en el Golgi, especialmente en presencia de secuencias flanqueantes citoplasmáticas y luminales espaciadas apropiadas y/o SR (Colley, 1997). Se encontró que la presencia de secuencias de aminoácidos de carga negativa en las ST, particularmente en proximidad al anclaje membranal, localizaba erróneamente las proteínas en el aparato de Golgi. La presencia de epítopo FLAG o MYC en el CT interfiere en la localización en el Golgi de ST6Gal I, mientras que la utilización de una secuencia espaciadora adicional para espaciar las cargas negativas del TMD, muestra una fuerte ventaja en la retención en el Golgi (Yang et al., 1996). Las secuencias de la SR por sí solas aparentemente funcionan como otro tipo de retención en el Golgi (Colley, 1997).
Probablemente existe más de un mecanismo de retención que explique la colocalización de las ST en el interior del trans-Golgi y en la red del trans-Golgi. Además, la localización de los enzimas también depende del tipo celular en el que se expresan (Colley, 1997). El TMD de las ST por sí solo podría resultar suficiente para la retención en el Golgi en las células MDCK, mientras que este mismo TMD y sus secuencias flanqueantes resultan claramente necesarias para la retención en el Golgi en las células CHO (Colley, 1997). Resulta interesante que los datos disponibles revelan que la modificación del CT, del TMD y de la SR no altera la actividad catalítica de las ST, sino que permite deslocalizarlos en el interior del aparato de Golgi (Grabenhorst y Condradt, 1999).
El enzima más estudiado para la señal de retención en el Golgi es la ST6Gal I de rata (rST6Gal I), que ha sido localizada en el trans-Golgi y en la red del trans-Golgi de los hepatocitos (Roth et al., 1985; Opat et al., 2001) y en los compartimentos post-Golgi en otras células (Colley, 1997). Existen dos isoformas naturales de rST6Gal I, que difieren únicamente en un aminoácido en la posición 123 en el CD. Esto se debe a un único cambio de nucleótido, de A a G, resultando en un cambio de aminoácido Tyr a Cys. No se han observado diferencias de actividad catalítica entre las dos isoformas del enzima (Chen et al., 2003). La forma STcys se encuentra en el Golgi en células de expresión moderada y en ningún caso en las superficies celulares o escindido o secretado al medio de células COS1 o HeLa, mientras que la forma STtyr se encuentra en el Golgi, a niveles bajos sobre la superficie celular y se escinde y se secreta de las célula COS-1 y HeLa (Ma et al., 1997). Con el fin de explicar las dos localizaciones diferentes de las proteínas, los autores han propuesto dos hipótesis sobre el mecanismo de retención: el grosor de la bicapa y la oligomerización. En primer lugar, el análisis del alargamiento del TMD de STcys y tyr sugiere que el grosor de la bicapa no es un proceso prioritario para la retención en el Golgi de ST6Gal I. En segundo lugar, el análisis de los oligómeros revela que el 100% y el 13% de STcys y STtyr, respectivamente, son insolubles a pH 6,3 (pH de Golgi tardío), pero que a pH 8,0, ambas isoformas son solubles. Los resultados sugieren que los cambios conformacionales y formación de enlaces disulfuro en el CD representan la bae para la capacidad incrementada de la STcys de formar oligómeros y su localización estable en el aparato de Golgi. La naturaleza del aminoácido 123 influye sobre la formación de los oligómeros (Chen et al., 2000). Además, el proceso de oligomerización y la actividad catalítica también depende de los otros siete residuos cisteína conservados (C24, 139, 181, 332, 359, 361 y 403). La Cys24, en el interior del TMD, resulta necesaria para la dimerización, mientras que los residuos de cisteína presentes en el CD resultan necesarios para el tráfico y la actividad catalítica. Los enzimas con Cys181 y Cys332 (en los motivos sialilo L y S, respectivamente) resultan retenidos en el retículo endoplasmático y presentan una actividad mínima o nula, respectivamente. Los enzimas con Cys359 y 361 (entre los motivos sialilo S y VS) son enzimas inactivos sin comprometer la localización y tráfico. Los enzimas con mutaciones Cys139 ó Cys403 no producen ningún cambio en la actividad catalítica y en la localización en el Golgi. La sustitución de estos dos residuos cisteína reduce la escisión y secreción, sugiriendo que resultan necesarios para la escisión de una señal (Qian et al., 2001) (figura 3).
Se han caracterizado los mutantes del enzima STtyr que comparten una deleción en el SR: STtyr 4 y STtyr 5 (con deleciones de los aminoácidos 32 a 104 y 86 a 104, respectivamente) no son activos y/o no resultan secretados; STtyr 1, 2 y 3 (delecionados entre los aminoácidos 32 y 86) representan formas no escindibles y muestran una expresión creciente en la superficie celular (Kitazume et al., 1999).
Un estudio reciente (Fenteany y Colley, 2005) demuestra que en efecto resultan necesarias múltiples señales para la oligomerización de rST6Gal I y para la localización en el Golgi. Los autores pretendían reevaluar el papel de la CT y del TMD de las dos isoformas del enzima (Tyr o Cys 123). Prepararon varios constructos de ADN para producir quimeras tales como las representadas en la figura 4. El alargamiento del dominio transmembranal (con más de 17 aminoácidos) no intensifica la salida del Golgi, no modifica el tráfico ni la localización en el Golgi. Respecto al papel del CT y del TMD con la isoforma STcys, existe una señal compuesta de 3 residuos lisina en el CT que resulta reconocida como señal de exportación al exterior del RE. Los autores demuestran que la alteración de tanto el CT como el TMD altera el enrutamiento del enzima. La única diferencia entre las isoformas de rST6Gal I es su capacidad de formar oligómeros según el pH. En el caso de la STcys, la formación de oligómeros según el pH resulta comprometida únicamente en el caso de que se alteren el CT y el TMD. En el caso de la STtyr, incrementa ligeramente la tasa de salida del Golgi (Fenteany y Colley, 2005).
Todos estos nuevos resultados referentes a rST6Gal I pueden considerarse aplicables a la ST6Gal I humana debido a que ambos enzimas comparten una homología de 85% y a que ambos CD son prácticamente idénticos. En efecto, la alineación de las dos secuencias (figura 5) demuestra claramente que las siete cisteínas anteriormente indicadas se encuentran conservadas en hST6Gal I y que también se encuentra presente la tirosina 123.
A pesar de los considerables esfuerzos de los científicos, no ha podido identificarse ninguna señal en la secuencia de las ST o FuT. Se cree que un proceso multifactorial podría enlentecer los enzimas en su camino a la superficie para direccionarlos a los compartimentos correctos, que son la red del trans-Golgi en el caso de ST6Gal. Por consiguiente, los inventores plantearon la hipótesis de que el CT, el TMD y la SR podrían intercambiarse alternativamente para anclar un CD definido en las células huésped que no presentan el gen relevante y no expresan la actividad de transferasa relevante. De esta manera, resulta posible, por lo tanto, generar un amplio abanico de combinaciones debido a que estas 3 partes pueden seleccionarse de entre 55 genes animales conocidos. Cada uno de ellos potencialmente puede fusionarse con 20 dominios catalíticos diferentes conocidos para expresar la capacidad de transferir ácido siálico. Lo anterior resulta claramente de interés para la humanización de levaduras (Pichia pastoris o Schizosaccharomyces piombae), plantas e insectos que no expresan estas actividades y que, sin embargo, se utilizan para producir fármacos recombinantes. Aunque sin respaldo experimental, este argumento también podría aplicarse perfectamente a FuTs, GalT, GalNAcT y GlcNAc, debido a que controlan la biosíntesis de glicotopos de elevada relevancia clínica.
Importancia de algunos residuos
Tal como se ha indicado anteriormente, se ha identificado un cuarto motivo (motivo 3) en la familia de las ST, entre los motivos S y VS. EStá compuesto de cuatro aminoácidos altamente conservados con la secuencia de consenso siguiente: (H/y)Y(Y/F/W/h)(E/D/q/g). La mutagénesis sitio-dirigida en hST3Gal I ha demostrado la importancia funcional de dos aminoácidos en este motivo: His299 y Tyr300. Los resultados sugieren la importancia de los residuos aromáticos, su posible participación en el reconocimiento de aceptor y su contribución a una eficiencia catalítica óptima. En particular la Tyr300 invariante desempeña un papel conformacional importante. El análisis de mutaciones ha demostrado que los mutantes H299A e Y300A no muestran actividades catalíticas, mientras que el mutante Y300F restaura parcialmente la actividad (Jeanneau et al., 2004). Este motivo también se encuentra presente en el dominio catalítico de hST6Gal I. Además, varios residuos cisteína resultan de gran importancia en la dimerización y actividad catalítica tal como se ha indicado anteriormente (Qian et al., 2001). Se ha identificado por lo menos un enlace disulfuro entre dos residuos cisteína conservados en el interior de los motivos sialilo L y S. Este enlace resulta esencial para mantener la conformación de la proteína. Las mismas observaciones han revelado la existencia de esta unión en la PST (Angata et al., 2001). Además, existe un segundo enlace disulfuro entre los motivos sialilo y la región C-terminal. Se ha demostrado la dimerización de ST6Gal I, mediante un enlace disulfuro. Aproximadamente 20% a 30% de este enzima en el interior del aparato de Golgi se encuentra en forma de dímero, que presenta una menor afinidad debido a su menor afinidad para CMP-NeuAc (Jeanneau, 2003).
"Autoglucosilaciones"
Las GT mismas con frecuencia se encuentran glucosiladas. Se dispone de pocos datos sobre el estado de glucosilación de las ST y su importancia para la función biológica de los enzimas. Aparentemente la N-glucosilación en ST6Gal I no resulta necesaria para la actividad biológica del enzima in vivo. Por otra parte, en ensayos in vitro con mutantes, únicamente se observa actividad enzimática para la proteína mutada en el primer sitio de glucosilación. Estos resultados sugieren la existencia de dos N-glicanos (Asn146 y Asn158) que pueden estabilizar y/o prevenir la degradación de la proteína. La mutación en el segundo sitio de glucosilación puede conducir a la agregación o degradación de la proteína (Chen y Colley, 2000; Chen et al., 2000). Sin embargo, la N-glucosilación en ST8Sia I puede afectar a su actividad y a su localización subcelular (Martina et al., 1998). La eliminación de los N-glicanos redujo su actividad in vivo a menos del 10% de la actividad inicial. Recientemente se ha demostrado que ST8Sia II y ST8Sia IV presentan, además de su actividad clásica, una actividad de autopolisialilación (Muhlenhoff et al., 2001). Esta autopolisialilación se produce en los N-glicanos en la posición Asn 74 en la PST y en las posiciones Asn 69 y 219 en la STX. La mutagénesis sitio-dirigida en estos sitios inactiva el enzima tanto in vivo como in vitro. En consecuencia, se ha procurado mantener los sitios de glucosilación en Asn 74 y en Asn 69 al utilizar la SR de ST8Sia IV y ST8Sia II, respectivamente, para construir genes quiméricos.
II. Utilización de las secuencias de la invención para introducir nueva actividad de transferasa en sistemas de expresión
IIa. Papel de los glicanos y su importancia en el sistema inmunológico
Los glicanos son señales de reconocimiento en la mayoría de organismos vivos, aunque también son determinantes estructurales clave para la potencia biológica de las proteínas.
Desempeñan un papel crucial en el plegamiento y oligomerización de las proteínas, el control de calidad, la clasificación y el transporte (Helenius y Aebi, 2001). Los glicanos representan epítopos oligosídicos que pueden considerarse antígenos carbohidrato. La naturaleza de los glicanos modifica la inmunorreactividad. Existen varias familias de antígenos oligosídicos: los determinantes de grupo sanguíneo ABH, los grupos de Lewis de tejidos, los miembros antígenos de la familia del antígeno T y los antígenos específicos de adhesión celular polisialilados o sulfatados (Legaigneur et al., 1999). Los glicanos presentan múltiples funciones: también participan en mecanismos de interacciones entre células y entre células y matriz. Algunas proteínas celulares denominadas lectinas reconocen específicamente las estructuras glicánicas y actúan como receptores específicos (Gabius et al., 2004). En la mayoría de casos, son componentes de glucoconjugados de superficie celular.
Los grupos carbohidrato actúan como señales de reconocimiento en el sistema inmunológico y influyen sobre el reconocimiento inmunológico de por lo menos dos maneras: i) alteran la conformación de la proteína y modulan su función biológica, ii) los oligosacáridos actúan de determinantes de reconocimiento. Particularmente, los ácidos siálicos contribuyen en gran medida a ambos efectos debido a que su naturaleza altamente electronegativa e hidrofílica puede influir sobre la conformación de las macromoléculas sialiladas, y ello resulta particularmente relevante para las glucoproteínas. Los ácidos siálicos presentan la capacidad de actuar como máscaras biológicas que evitan o reducen la accesibilidad y desempeñan un papel significativo sobre la superficie celular en el proceso de reconocimiento de auto/no autorreconocimiento (Pilatte et al., 1993; adición que debe realizarse: Glycobiology 2006).
Debido a que los N-glicanos se encuentran bien representados en las glucoproteínas séricas y en muchas otras proteínas de tejidos del cuerpo humano, resulta altamente deseable que no sean antigénicos al encontrarse presentes en fármacos glucosilados recombinantes. Sin embargo, debido a que la HuEPO producida en las células CHO se ha desarrollado como primer fármaco aprobado, aparentemente varios azúcares terminales podrían ser antigénicos en el ser humano: poliLacNAc, alfa1,3-Gal y ácido N-glicolilneuramínico. Según los organismos reguladores más recientes, no deberían encontrarse presentes en el futuro en los terapéuticos recombinantes.
IIb. Eliminación
Aparte de su influencia sobre las propiedades físicoquímicas y sobre las funciones biológicas de las proteínas, los glicanos también presentan una papel prevalente sobre la duración de las glucoproteínas en la sangre. Este fenómeno se denomina eliminación metabólica y representa la tasa a la que un compuesto natural o fármaco resulta eliminado del cuerpo por el hígado o el riñón. Se define como el volumen plasmático purificado por unidad de tiempo (ml/minuto). Este mecanismo permite que el organismo elimine los fármacos.
La mayor parte de las proteínas plasmáticas circulantes pertenecen a la familia de las glucoproteínas que comparten oligosacáridos N-ligados y la totalidad de ellos terminan en ácido siálico, particularmente en el ser humano. La eliminación del ácido siálico por parte de una neuraminidasa reduce drásticamente la duración en el plasma de las glucoproteínas séricas y estimula su incorporación por el hígado (van den Hamer et al., 1970; Morell et al., 1971). Por ejemplo, en el caso de que la hormona gestante (más recientemente la HuEPO recombinante) no presente ácido siálico, su vida media se reduce a 2 minutos, mientras que habitualmente su vida es de aproximadamente 48 horas. Es ampliamente conocido en la actualidad que el ácido siálico resulta necesario para mantener las glucoproteínas en la sangre debido a que evita la eliminación de las proteínas circulantes por parte de un receptor sialoglucoproteína (ASGPR o lectina hepática) compuesto de dos subunidades e incluido en las membranas de los hepatocitos (Hudgin et al., 1974; Kawasaki y Ashwell, 1976; Bianucci y Chiellini, 2000). Este receptor se une a galactosa o residuos Nacetilglucosamina de los N-glicanos desialilados (Meier et al., 2000). Las glucoproteínas reconocidas seguidamente se internalizan en vesículas endocíticas cubiertas de clatrina y se redirigen al interior de los lisosomas, en donde resultan degradados (Ashwell y Hardford, 1982).
Este etapa aparentemente resulta crucial para las propiedades farmacocinéticas de las glucoproteínas recombinantes terapéuticas, debido a que los organismos inferiores no pueden sialilar proteínas y en las células CHO, la adición de ácido siálico es extremadamente sensible al estado energético de las células en cultivo (se sintetiza NeuAc mediante condensación de piruvato y ácido láctico) y con frecuencia no es completa. Todos los fármacos superventas sialilados (EPO, IFN, GM-CSF, FSH, Ab...) deberían purificarse para que el fabricante presente un elevado contenido de ácido siálico y controlarse para la consistencia entre lotes.
IIc. Control de la glucosilación y alergenicidad
Los residuos de ácido siálico en la posición terminal de los N-glicanos resultan de gran importancia para las proteínas terapéuticas debido a que la sialilación de las proteínas confiere importantes propiedades a las glucoproteínas. La maquinaria requerida para la síntesis, activación e introducción de los residuos sialilados se encuentra pobremente representada en los diferentes sistemas de expresión de proteínas recombinantes. Además, las proteínas humanas recombinantes producidas con frecuencia se encuentran infrasialiladas o incluso no sialiladas en absoluto, en comparación con sus contrapartidas nativas. Adicionalmente, en el caso de que se expresen en células de mamífero, la sialilación puede producirse a través del ácido N-glucolilneuramínico (NeuGc), que difiere significativamente del derivado N-acetilado (NeuAc) debido a que se encuentra presente en las células de mamífero pero no en células humanas.
Debido a que existe un problema importante con el ácido siálico en el mercado de lso fármacos recombinantes, muchos equipos de investigación están trabajando en la modificación del proceso de N-glucosilación en los diferentes sistemas de expresión existentes. Se está realizando un trabajo exhaustivo destinado a la humanización del patrón de glucosilación de las proteínas recombinantes para aproximarse al patrón observado en las glucoproteínas naturales al máximo y para mejorar la farmacocinética así como la seguridad del producto. Simultáneamente, el procedimiento tenderá a reducir la presencia de determinantes inmunogénicos. A este respecto, un estudio muy reciente ha confirmado que el ácido siálico unido en posición 6 y el ácido siálico unido en posición 3 evitan que las glucoproteínas se unan a receptores del sistema inmunológico y generen activación (Glycobiology, 2006). Por lo tanto, la adición de ácido siálico unido en posición 6 a proteínas glucosiladas recombinantes presentaría un gran beneficio en la seguridad del fármaco y sería un gran avance en el campo.
En primer lugar se extrajeron las proteínas de interés terapéutico a partir de fuentes naturales tales como sangre, placenta o tejidos humanos o animales. Sin embargo, este enfoque se encuentra limitado por la cantidad de los tejidos humanos disponibles y podría comportar riesgos importantes de contaminación (virus, priones, oncogenes) y/o generar reacciones alérgicas debidas a la presencia de trazas de proteínas animales o toxinas. Con los avances de la biología molecular, se han desarrollado nuevos enfoques para la producción de proteínas utilizando sistemas de expresión bastante diferentes. Se encuentra disponible un amplio abanico de sistemas de expresión heterólogos (Andersen y Krummen, 2002) y cada uno de ellos presenta ventajas y desventajas, con atención particular al patrón de N-glucosilación de las proteínas recombinantes producidas en estos sistemas.
IId. Biosíntesis de N-glicanos en los sistemas de expresión conocidos: necesidades para la humanización de la ruta de glucosilación
Bacterias
Uno de los sistemas más utilizados es la bacteria Escherichia coli (E. coli) (Swartz, 2001; Baneyx, 1999), pero su inconveniente principal es que las modificaciones postraduccionales humanas, particularmente las glucosilaciones, no son llevadas a cabo por este procariota debido a que no se expresa este tipo de glucosiltransferasa en E. coli. Esto puede conducir a un plegamiento incorrecto y al posterior rechazo de las proteínas terapéuticas de interés por parte del sistema inmunológico, a la reducción de su tiempo de vida y de su actividad biológica.
Hasta el momento no se ha apreciado N-glucosilación del tipo humano en dicho microorganismo.
Levaduras y hongos filamentosos
Las levaduras y hongos filamentosos también son sistemas de expresión eucarióticos bien establecidos y presentan una maquinaria celular similar a la de las células humanas. Las levaduras producen proteínas complejas y llevan a cabo varias modificaciones postraduccionales, incluyendo glucosilaciones. Tanto las levaduras como los hongos típicamente producen glicanos ricos en manosa mediante la adición de hasta 100 residuos de manosa (levaduras) sobre el núcleo pentasacárido (Tanner y Lehele, 1987; Herscovics y Orlean, 1993). Esta hipermanosilación definitivamente induce una respuesta inmunológica en el ser humano. Además, hasta hoy, no se ha encontrado ningún oligosacárido complejo que contenga ácido siálico, galactosa, fucosa y N-acetilgalactosamina en el interior de las glucoproteínas producidas por estos organismos (Blanchard, 2004).
El proceso de N-glucosilación llevado a cabo por las levaduras y hongos es similar al proceso en mamífero con respecto a las etapas iniciales en el RE, pero la presencia de polimananos añadidos en el aparato de Golgi evita su aprobación por parte de los organismos reguladores.
Células de insecto
Las proteínas expresadas en las células de insecto se pliegan correctamente, se secretan y pueden recibir modificaciones postraduccionales. Las modificaciones postraduccionales llevadas a cabo por estas células son similares a las llevadas a cabo por las células de mamífero, en particular la N-glucosilación de la proteína. Las estructuras de glicano obtenidas en este caso, sin embargo, son incompletas y se denominan paucimanosa debido a la presencia de una actividad de N-acetilglucosaminidasa no deseable que degrada las nuevas glucoproteínas expresadas durante la expresión baculovírica (Blanchard, 2004).
La falta de ácido neuramínico en los insectos todavía es objeto de activo debate (Marchal et al., 2001; Leuroge et al., 2005). En algunas líneas celulares de insecto, se encuentran residuos de fucosa unidos en a1,3, y ello puede inducir una respuesta inmunológica en el ser humano. En la actualidad, por lo tanto, se restringe la utilización de este sistema a la producción de antígenos vacunales.
Plantas transgénicas
Al igual que con otras células eucarióticas, las células vegetales muestran una compleja y sofisticada maquinaria celular que puede utilizarse para producir proteínas terapéuticas. Las proteínas recombinantes presentan una calidad farmacológica muy buena debido a que las plantas expresan los enzimas necesarios para la maduración de las proteínas.
Sin embargo, el proceso de glucosilación requiere varios ajustes para no producir proteínas alergénicas. En efecto, las N-glucosilaciones en plantas (Lerouge et al., 2000) son similares a las realizadas en el ser humano en cuanto a la glucosilación nuclear. Las glucosilación todavía no presentan antenas sialiladas y se produce una adición de 1,2xilosa y a1,3-fucosa. Ambos residuos son altamente inmunogénicos para el ser humano y en la actualidad comprometen considerablemente la aprobación de las plantas transgénicas como sistemas de expresión para terapéuticos.
Células de mamífero
El sistema de expresión de las células de mamífero, es decir el de las células CHO, en la actualidad es el único sistema farmacológicamente aprobado para la producción de terapéuticos recombinantes. Estas células muestran una ventaja importante debido a que pueden sintetizar proteínas complejas, conseguir una N-glucosilación de tipo complejo de alta masa molecular. Las células de mamífero utilizan naturalmente no sólo los enzimas que participan en la síntesis y transporte de los azúcares de nucleótido, sino también las glucosiltransferasas requeridas para garantizar una glucosilación compleja de las proteínas recombinantes heterólogas con un elevado nivel de a2,3sialilación. Sin embargo, existe una ausencia de otros enzimas, tales como las a1,3/4-fucosiltransferasas y las a2,6sialiltransferasas, que transfieran motivos glucosídicos específicos de los N-glicanos de tejidos humanos. En los roedores, el ácido N-glucolilneuramínico es sustancialmente preferente en los N-glicanos; la O-acetilación del ácido N-acetil-neuramínico en las posiciones 4, 7, 8 y con más frecuencia, 9, también se produce con frecuencia, y cada uno de estos derivados potencialmente puede ser inmunogénico en el ser humano. Esto representa una limitación a la utilización de las células de ratón o de ratones/conejos lactantes para la expresión de proteínas recombinantes (Blanchard, 2004).
IIe. Manipulación mediante glucosilación
Tal como se ha expuesto anteriormente, la sialilación terminal de las glucoproteínas aprobadas es la etapa más difícil de llevar a cabo en todos los sistemas de expresión disponibles en la actualidad. A título de ejemplo, no ha podido añadirse ácido siálico unido en a2,6, aunque es el enlace prevalente en la sangre humana. En todos los organismos simplemente no existe la maquinaria enzimática necesaria (figura 6).
El objetivo final de la investigación en este campo consiste en mejorar el proceso de glucosilación, el rendimiento productivo y la calidad de las proteínas recombinantes. La utilización de sistemas de expresión modificados genéticamente para la glucosilación permitiría producir glucoproteínas con una homogeneidad excepcional de sus estructuras glicánicas. En este caso podrían utilizarse estos sistemas para desarrollar un nivel elevado de producción de proteínas de interés biomédico de estructuras bien definidas. La manipulación mediante glucosilación en las levaduras (Hamilton et al., 2003; Roy et al., 2000) inicialmente ha impedido la adición de cadenas polimanosídicas. Los enzimas que resultan necesarios para la galactosilación y N-acetilglucosaminilación han sido añadidos posteriormente a estos sistemas (Maras et al., 1999; Bretthauer, 2003; Vervecken et al., 2004). Sin embargo, la adición del ácido siálico terminal todavía es difícil de llevar a cabo debido al número y localización de los enzimas que participan en el proceso, aunque en la actualidad se está realizando en Japón (figura 6).
En las células de insecto, se han eliminado las GT que catalizan la transferencia de azúcares inmunogénicos, mediante la adición de 3 genes, codificantes de la N-acetilglucosamina-2-epimerasa, N-acetilneuraminil-liasa y la CMP-Neu5Ac-sintasa (Jarvis et al., 1998; Aumiller et al., 2003). Los autores han creado nuevas líneas celulares de insecto (SfSWT-3) diseñadas para sintetizar su propio CMP-ácido siálico. Las células resultantes expresan la totalidad de los 7 genes de mamífero necesarios para formar un N-glicano, producir CMP-ácido siálico y sialilar una proteína recombinante en un cultivo en un medio sin suero (Aumiller et al., 2003). Este trabajo ha sido patentado.
En plantas, la primera estrategia utilizada presentaba el objetivo de evitar la adición de azúcares alergénicos mediante almacenamiento de proteínas en el RE. Aunque en este caso los glicanos no pueden ser del tipo complejo. Otra estrategia se basa en la inhibición de varias GT en el interior del aparato de Golgi. Esta inhibición puede completarse y/o puede entrar en competencia con la maquinaria endógena de maduración. También se está llevan a cabo la adición de la maquinaria de sialilación.
En el caso de las células de mamífero, se ha llevado a cabo la sobreexpresión de una a2,3-ST y una 1,4-Gal (Weikert et al., 1999); estos dos enzimas se encuentran presentes en el genoma pero sus actividades varían dependiendo de las condiciones de cultivo. Esto conduce a una amplia variabilidad respecto a la presencia de Gal y ácido siálico terminales, además de una extensa microheterogeneidad en las estructuras de glicano de las proteínas secretoras.
La investigación se ha orientado mayoritariamente hacia la optimización de la galactosilación y sialilación (Granbenhorst et al., 1999) mediante la introducción de una a2,6-ST (Bragonzi et al., 2000). Se ha establecido una línea celular CHO que expresa establemente una a2,6-ST de longitud completa desde hace mucho tiempo, aunque también ha proporcionado resultados decepcionantes. La proporción observada entre los residuos terminales de ácido siálico a2,6 y a2,3-ligados transportados era de 40,4% de residuos de ácido a2,6-siálico y 59,6% de ácido a2,3-siálico, mejorando la farmacocinética en estudios de eliminación (Bragonzi et al., 2000). A pesar de la mejora de la humanización de las células, no puede controlarse la proporción entre los residuos terminales de ácido a2,6siálico y ácido a2,3-siálico y ni siquiera resulta favorable para la actividad en posición 6.
En resumen, la sialilación es un etapa crítico en el control de las estructuras de glicano en las proteínas producidas mediante ingeniería genética. La dificultad principal reside no tanto en expresar la actividad faltante, sino en conseguir que el sistema heterólogo de producción funcione correctamente. En efecto, deben alcanzarse 3 objetivos principales para humanizar la glucosilación de los sistemas de expresión actuales: 1) conseguir el funcionamiento del sustrato donador y el transportador relevante necesario para este enzima dentro del Golgi, 2) conseguir que el enzima correctamente compartimentalizado finalmente compita con la actividad endógena de sialiltransferasa, 3) conseguir que el enzima pueda catalizar la transferencia de ácido siálico a cualquier sustrato aceptor relevante.
IIf. Antecedentes de la invención:
La estrategia se basa en la consideración de que el enzima ST6 de longitud completa hasta el momento no ha podido cumplir los objetivos anteriormente indicados, especialmente la competición con la actividad endógena de ST3 existente en la mayoría de células de mamífero, probablemente debido a que el producto génico no se inserta en compartimentos intracelulares implicados en la ruta secretoria. De esta manera, los inventores desarrollaron un procedimiento que pudiese proporcionar una oportunidad óptima para que el CD de una transferasa alcance los compartimentos del Golgi, en los que las neoglucoproteínas se clasifican en vesículas secretorias y/o en donde entran en contacto con la ST manipulada antes/en sustitución de la ST3 existente.
III. Diseño de ST membranales sintéticas
La presente invención consiste en un procedimiento que proporciona un panel de ST quiméricas de actividad catalítica conocida, que presenta un anclaje membranal para dirigirlas al aparato de Golgi de las células eucarióticas. Ninguna de ellas existe en las células vivas y se consideran "ST sintéticas" debido a que su construcción no requiere ninguna de las secuencias de ADN codificantes de la CT, el TMD o el SR. Los oligonucleótidos relevantes presentan menos de 200 pb (60 aminoácidos) de longitud y pudieron diseñarse informáticamente y obtenerse comercialmente. Mediante la utilización de métodos de PCR, se construyó un anclaje sintético etiquetado que codificase la mitad N-terminal de la proteína ST y se fusionó con el dominio catalítico optimizado de hST6GalI.
La invención describe diversos métodos moleculares para construir 3 tipos de ST quiméricas membranales:
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constructo homólogo: anclaje de ST fusionado con el CD 89 de ST6Gal sintético o finalmente copiado mediante PCR. En este caso, las porciones CT+TMD+SR son de la misma ST: ST3Gal/ST6GalNAc/ST8Sia. El ejemplo describe una secuencia de 200 pb.
•
constructo híbrido: CT+TMD son de una ST y la SR de otra ST. El tamaño mínimo también es de 200 pb.
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constructo heterólogo: los fragmentos CT, TMD y SR proceden de diferentes ST. El tamaño mínimo también es de 200 pb.
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constructo largo: se preparó un constructo CT+TMD+SR1 de 200 pb y se fusionó con un segundo constructo SR2 de como máximo 200 pb de manera que SR2 estuviese cadena abajo de SR1. El constructo duplicado puede ligarse adicionalmente en el extremo 3' con cualquier otro constructo de SR y el número de repeticiones que resulte necesario.
El tamaño de 200 pb se basa en la observación de que la parte N-terminal más corta de todas las ST humanas es ST6GalNAcIII con CT+TMD+SR=200 pb. Este enzima prácticamente no presenta tallo.
En la actualidad, se ha validado un método para construir un fragmento sintético de ADN y fusionarlo con un dominio catalítico mínimo con el fin de generar un nuevo enzima transferasa de la actividad deseada. Se encuentran disponibles varios constructos representativos para la expresión adicional. Las quimeras sintéticas son activas y se están estudiando en células CHO utilizando la expresión transitoria y la microscopía confocal.
Ejemplos
Ejemplo 1: producción de dominio catalítico mínimo (CD) de hST6Gal I (SEC ID nº 43 codificante de SEC ID nº 44)
Se utilizó la ST6Gal I humana (hST6Gal I) clonada por Legaigneur et al., 2001, para amplificar el CD mínimo clonado en el vector pFLAG-CMV (Sigma) (Donadio et al., 2003), que se utilizó en todos los constructos quiméricos.
En primer lugar, se digirió el vector recombinante para verificar la presencia del CD de hST6Gal I. La electroforesis en gel de agarosa reveló la presencia de una banda de nucleótidos aproximadamente en 1.000 pb, correspondiente al tamaño esperado para el dominio catalítico mínimo (figura 10 A-C).
El CD correspondiente a los aminoácidos 90 a 406 de hST6Gal I se obtuvo mediante PCR utilizando los cebadores siguientes:
5'BamHI-4: 5'-GAGCCCGGATCCGAGGCCTCCTTC-3', y 3' 4-XbaI: 5'TAACCCTCTAGATTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGC-3'.
Dichos cebadores contienen los sitios de restricción BamHI (5'BamHI-4) y XbaI (3' 4-XbaI) y el codón de parada natural de la secuencia. Se utilizó el sitio de restricción BamHI para ligar el CD de hST6Gal 90-406 a la parte Nterminal sintética de otras ST para formar enzimas quiméricos. Se utilizó el sitio de restricción XbaI en el extremo 3' para introducir la quimera en el interior del vector pcDNA3.1 (Invitrogen) (figura 11).
Se llevó a cabo una PCR en un aparato I-Cycler (Biorad) utilizando 2,5 unidades de ADN polimerasa ProofStart (Qiagen), 300 μM de cada dNTP (Sigma Aldrich), 1 μM de cada cebador, 1X de tampón del fabricante de ProofStart (Qiagen), 1X de solución Q del fabricante (Qiagen) y 1,5 mM de Mg2+ en un volumen final de 50 μl con 200 ng de pFlag-CMV-hST6Gal I-90-406. Se llevó a cabo la reacción de la manera siguiente: 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 1 minuto a 72ºC. Se analizó el producto de PCR amplificado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% (amplificación de un producto de PCR en el tamaño esperado de 1.000 pb; figura 17B) y se purificó utilizando el kit de extracción en gel de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se agruparon varios productos de amplificación de PCR y se concentraron para estimar la cantidad de ADN en un gel de agarosa (figura 10C). Los productos de PCR purificados se mantuvieron a -20ºC hasta la utilización.
Ejemplo 2: ensamblaje de dominios N-terminales sintéticos
Para crear un amplio abanico de ST según la clasificación realizada mediante análisis bioinformático, se sintetizaron y ensamblaron la CT, el TMD y la SR de diferentes ST.
Todas las partes N-terminales seleccionadas de la quimera contenían 3 regiones típicas de la familia de las ST: la CT, el TMD y la SR. Cabe indicar que la SR puede presentar una longitud variable y podría originarse de la duplicación génica sintética. Todos estos fragmentos, es decir, CT+TMD+SR se reconstituyeron por completo utilizando las etapas de hibridación de complementarios y fosforilación tal como se describe posteriormente.
a. Construcción del dominio no catalítico de hST3Gal III (SEC ID nº 151 codificante de SEC ID nº 152)
Se diseñaron y sintetizaron (Eurogentec) seis oligonucleótidos de sentido y cinco oligonucleótidos antisentido correspondientes a parte de la región N-terminal (1 a 138 pb) de hST3Gal III. El presente ejemplo muestra el método para sintetizar una secuencia natural de interés. Se añadió un epítopo FLAG (en negrita y subrayado) entre el codón de inicio ATG y el segundo codón (GGA) de la secuencia de hST3Gal III:
ATG GACTACAAAGACGATGACGACAAG GGA.
Se fosforiló un microgramo de cada nucleótido interno utilizando 1 unidad de polinucleótido quinasa (Eurogentec) en un tampón quinasa que contenía 2 mM de ATP (Sigma). Se llevó a cabo la reacción durante 60 minutos a 37ºC, y la incubación finalmente se inactivó durante 10 minutos a 65ºC. Todos los oligonucleótidos se desnaturalizaron separadamente durante 10 minutos a 80ºC y después se mezclaron para encontrar los complementarios. Este procedimiento se llevó a cabo durante la noche con un gradiente decreciente de temperaturas de 80ºC a 20ºC. A continuación, el fragmento resultante se sometió a PCR.
b. Construcción del dominio no catalítico de hST6GalNAc 1-74 (SEC ID nº 145 codificante de SEC ID nº 146)
Uno de los tallos más cortos dentro de la familia de las ST es el tallo de hST6GalNAc III, que está compuesto de aproximadamente 6 aminoácidos. Un posible dominio N-terminal de esta ST presenta 74 aminoácidos (CT, TMD y SR), que corresponden a 222 pb. Por lo tanto, con el fin de delinear un constructo con la SR más corta, se reconstituyó un dominio N-terminal sintético de 222 pb correspondiente a los primeros 74 aminoácidos de hST6GalNAc I.
Se diseñaron y sintetizaron (Eurogentec) nueve oligonucleótidos de sentido y ocho oligonucleótidos antisentido correspondientes a la secuencia de la región N-terminal completa (1 a 222 pb) de hST6GalNAc I. Se añadió una secuencia FLAG (en negrita y subrayada) entre el codón de inicio ATG y el segundo codón (GGA) de la secuencia de hST6GalNAc I:
ATG GACTACAAAGACGATGACGACAAG GGA.
Las reacciones de fosforilación y de apareamiento se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente.
c. Duplicación de oligonucleótidos sintéticos para ensamblar el dominio no catalítico hST6GalNAc I 1-140 (SEC ID nº 148)
Se seleccionó hST6GalNAc I como la sialiltransferasa que mostraba la SR más larga (246 aa). En el presente ejemplo, la longitud de la parte CT+TMD+SR reconstituida sintéticamente (residuos aminoácidos 1 a 35) se unió a otro tramo de la SR (residuos aminoácidos 36 a 140) para duplicar la longitud y poder añadir un anclaje de membrana de 140 residuos aminoácidos tal como se informa en Donadio et al., 2003.
d. Construcción de un dominio sintético híbrido: hST3Gal III 1-28-hST6GalNAc I 37-74 (SEC ID nº 160)
Se construyó una región N-terminal híbrida que contenía el primer CT y el TMD de hST3Gal III (1 a 28 residuos aminoácidos) y después el inicio de la SR de hST6GalNAc I (aminoácidos 37 a 74).
La longitud total de este híbrido sintético era de 66 aminoácidos, correspondiente a 198 nucleótidos (SEC ID nº 159). Se diseñaron y se sintetizaron (Eurogentec) nueve oligonucleótidos de sentido y ocho oligonucleótidos antisentido correspondientes a la región N-terminal híbrida indicada anteriormente (1 a 225 pb) utilizando las secuencias de hST3Gal III/hST6GalNAc I. Se añadió un epítopo FLAG (en negrita) entre el codón de inicio ATG y el segundo codón (GGA) de la secuencia de hST3Gal III:
5'-ATG GACTACAAAGACGATGACGACAAG GGA-3'.
Las reacciones de fosforilación y de apareamiento se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente.
e. Amplificación por PCR de los constructos sintéticos
Tras la etapa de reconstitución sintética, el producto se amplificó mediante la técnica de PCR utilizando cebadores específicos que introducen los sitios de restricción deseados en cada extremo del fragmento de ADN reconstituido con el fin de ligarlos en primer lugar con el CD seleccionado y después en el vector pcDNA3.1.
Se utilizaron los cebadores siguientes:
5'AflII-ST3: 5'-GAGCCCCTTAAGATGGACTACAAAGACGACGATGACG-3'
y 3'ST3-BamHI: 5'-TAAGGGGGATCCGCTAGAGTGACTATACTTACTGGA-3',
5'AflII-ST6: 5'-GAGCCCCTTAAGATGGACTACAAAGACGACGATGACG-3'
y 3'ST6-BamHI: 5'-TAAGGGGGATCCGGTTGTGGAGGAACGGGA-3',
3'ST6-BamHI nº 2: 5'-TAAGGGGGATCCTCTGGGTGACAGTGTGTTCAC-3'.
Estos cebadores contienen los sitios de restricción AflII (5'AflII-ST3 y 5'AflII-ST6) y BamHI (3' ST3-BamHI, 3' ST6-BamHI y 3' ST6-BamHI nº 2) para garantizar las ligaciones posteriores.
Se llevaron a cabo PCR con el conjunto de parejas de cebadores indicado en la Tabla 5. Se llevaron a cabo en un aparato de PCR (I-Cycler, Biorad) con 5 μl de cada uno de los fragmentos sintéticos en una solución que contenía 2,5 unidades de ADN polimerasa ProofStart (Qiagen), 300 μM de cada dNTP (Sigma Aldrich), 1 μM de cada cebador, 1X de tampón del fabricante de ProofStart (Qiagen), 1X de solución Q del fabricante (Qiagen) y 1,5 mM de Mg2+ en un volumen final de 50 μl.
La reacción se llevó a cabo del modo siguiente: 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 53ºC, 53ºC y 55ºC, respectivamente para hST3Gal III (SEC ID nº 151), hST6GalNAc I-74 (SEC ID nº 145), hST6GalNAc I-140 (SEC ID nº 147) y hST3Gal III-28/37-hST6GalNAc I-74 (SEC ID nº 159) y 1 minuto a 72ºC. El producto de PCR amplificado se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% según el tamaño del producto de PCR (Tabla 5):
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hST3 Gal III: se amplificó únicamente un producto de PCR con un tamaño estimado de 170 pb, que corresponde al tamaño esperado de 174 pb (figura 11).
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hST6 Gal NAc I: la figura 13 muestra un producto de PCR amplificado con un tamaño estimado de 270 pb, que corresponde al tamaño esperado de 270 pb.
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hST6GalNAc I-140: se amplificó una secuencia nucleótida de 468 pb (figura 15).
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hST3Gal III-28-hST6GalNAc I37-74: se amplificó una secuencia de nucleótidos de 249 pb (figura 17).
Se purificaron los productos de PCR utilizando el kit de extracción en gel de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante.
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Se sometió el producto de PCR de hST6GalNAc I-140 a secuenciación directa de ambas cadenas de ADN mediante Genome Express (Meylan, Francia).
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Se ligaron los productos de PCR de hST3Gal III y hST6GalNAc I-74 al CD (SEC ID nº 43) antes de introducirlos en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen) para que también se secuenciasen adicionalmente mediante Genome Express (Meylan, Francia).
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Se ligó el fragmento sintético hST3Gal III-28-hST6GalNAc I 37-74 con el CD (SEC ID nº 43) y se secuenció directamente en ambas cadenas previamente a su introducción en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen).
f.
Cuantificación de los productos de PCR
Se agruparon todos los productos de PCR y se concentraron según cada constructo sintético. Se añadieron dos volúmenes de etanol y 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,2, a muestras de productos de PCR. La mezcla se incubó durante 30 minutos a -20ºC y se centrifugó durante 20 minutos a 10.000 g a 4ºC. Se lavaron los sedimentos con 100 μl de etanol al 70% y se realizó una centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g a 4ºC. A continuación, se eliminaron los sobrenadantes y se secaron los sedimentos y se resuspendieron en 50 μl de agua purificada. Se conservaron las muestras a -20ºC hasta la utilización.
Se cargaron cinco microlitros de los cuatro fragmentos sintéticos concentrados en un gel de agarosa al 2% para estimar su cantidad (figuras 11, 12, 13 y 14).
Ejemplo 3: ensamblaje de dominios membranales N-terminales no catalíticos con actividad de sililtransferasa
a. Digestiones y purificación
Se digirieron todos los productos de PCR (los constructos N-terminales sintéticos o el dominio catalítico) con el enzima de restricción BamHI.
Se digirieron 200 nanogramos de los constructos N-terminales sintéticos en una solución que contenía 3 unidades del enzima de restricción BamHI y 0,1 μg·μl-1 de albúmina de suero bovino y 1X del tampón E apropiado del fabricante (Promega) en un volumen final de 20 μl.
Se digirieron 500 nanogramos del CD con 5 unidades de BamHI, 0,1 μg μl-1 de albúmina de suero bovino y 1X de tampón E (Promega) en un volumen final de 20 μl.
Las digestiones se llevaron a cabo durante 90 minutos a 37ºC y la incubación finalmente se inactivó durante 15 minutos a 65ºC. Se purificó el ADN digerido utilizando el kit de purificación de PCR (Qiagen).
b. Ligación
Cada uno de los fragmentos N-terminales se ligó al fragmento CD en una solución que contenía 1,5 unidades de ADN ligasa de T4, 1X del tampón de ligación, ambos comercializados (Promega), 62,5 ng, 78,2 ng y 75 ng, respectivamente, para hST3Gal III, hST6GalNAc I-74 y el fragmento híbrido hST3Gal III-28-hST6GalNAc I 37-74 y 100 ng del CD en un volumen final de 20 μl. La mezcla se incubó a 15ºC durante la noche y después se realizó una etapa de inactivación durante 10 minutos a 70ºC (figura 17).
c. Amplificación de la inserción sintética etiquetada
Con el fin de verificar la ligación correcta, los productos de ligación se sometieron directamente a PCR utilizando las parejas de cebadores siguientes: 5'AflII-ST3/3' 4-XbaI, 5'AflII-ST6/3' 4-XbaI y 5'AflII-ST3/3' 4-XbaI, respectivamente, para ST3/CD, ST6GalNAc-74/CD y el híbrido/CD.
Las reacciones se llevaron a cabo utilizando 2,5 unidades sde ADN polimerasa ProofStart (Qiagen), 300 μM de cada dNTP (Sigma Aldrich), 1 μM de cada cebador, 1X de tampón del fabricante de ProofStart (Qiagen), 1X de solución Q del fabricante (Qiagen) y 3 mM de Mg2+ en un volumen final de 50 μl. La reacción se llevó a cabo del modo siguiente: 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 57ºC y 1 minuto 30 segundos a 72ºC.
Se analizaron los productos de PCR amplificados mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%:
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Inserción sintética de hST3Gal III/CD (SEC ID nº 167): se amplificó un producto de PCR de 1.200 pb (figura 12), que corresponde al tamaño esperado del fragmento de ADN ligado: ST3Gal III más CD.
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inserción de hST6GalNAc I-74/CD (SEC ID nº 161): se amplificó un producto de PCR de 1.200 pb (figura 14), que corresponde al tamaño esperado del fragmento de ADN ligado: ST6GalNAc I más CD, es decir, de 1.225 pb exactamente.
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inserción de hST3Gal III-28/37hST6GalNAc-74/CD (SEC ID nº 175): se amplificó un producto de PCR de 1.200 pb (figura 17), que corresponde al tamaño esperado del fragmento de ADN ligado hST3Gal III-29/hST6GalNAc37-74 más CD.
Se purificaron los productos de PCR amplificados utilizando el kit de extracción en gel de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se agruparon los productos de PCR amplificados de la misma ST sintética, se concentraron y se cuantificaron en un gel de agarosa al 1,5% (figuras 12, 13 y 16), tal como se ha indicado anteriormente, con el fin de obtener suficiente cantidad de ADN para ligar la quimera en el vector pcDNA3.1.
d. Clonación de la inserción de ST sintética en un vector de expresión
1. Digestión y purificación
Se ligaron inserciones sintéticas, tales como hST3Gal III/CD o hST6GalNAc I-74/CD en el vector pcDNA3.1 en los sitios de restricción AflII y XbaI.
La inserción sintética y el vector pcDNA3.1 (figura 12) (Invitrogen) en primer lugar se digirieron con el enzima de restricción XbaI:
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para cada construcción, se digirieron 500 ng de vector utilizando 2,5 unidades de XbaI (Promega), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X del tampón D apropiado, suministrado por el fabricante (Promega), en un volumen final de 20 μl, siguiendo las instrucciones del fabricante,
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la inserción se digirió con 2 a 2,5 unidades de XbaI (Promega), dependiendo de la cantidad de inserción disponible tras la PCR (por ejemplo 200 ng de hST3Gal III/CD, hST3Gal III-28/hST6GalNAc I 37-74/CD y 500 ng de hST6GalNAc I-74/CD se digirieron respectivamente con 2 y 2,5 unidades de XbaI), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X de tampón D (Promega) en un volumen final de 20 μl.
Las digestiones se llevaron a cabo a 37ºC durante 60 minutos y se inactivaron a 65ºC durante 15 minutos.
A continuación, los productos digeridos se sometieron a una digestión con el enzima de restricción AflII siguiendo las instrucciones del fabricante (Biolabs): utilizando el número apropiado de unidades de enzima, dependiendo de la cantidad de ADN (2, 2, 2,5 y 2,5 unidades, respectivamente, para hST3Gal III/CD, hST3Gal III-28/hST6GalNAc I 3774/CD, hST6GalNAc I-74/CD y pcDNA3.1), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X de tampón 2 (Biolabs) en un volumen final de 50 μl. Las digestiones se llevaron a cabo a 37ºC durante 60 minutos y se inactivaron a 65ºC durante 20 minutos. Las digestiones se purificaron con el kit de purificación de PCR (Qiagen).
2. Ligación
Se calcularon las condiciones de ligación según la fórmula siguiente:
(Ypbdeinserción)(xngdevector pcDNA3.1) Inserción
X ng de inserción = x proporciónmolar
tamañoenpbdelvector pcDNA3.1 ≈ 5428 Vector
en la que el tamaño de la inserción es de aproximadamente 1.200 pb para el constructo sintético (por ejemplo hST3Gal III/CD, hST3Gal III-28/hST6GalNAc I 37-74/CD o hST6GalNAc I-74/CD), el tamaño del vector pcDNA3.1 es de 5.428 pb, la cantidad de vector utilizada es de 50 ó 100 ng, y finalmente, la proporción molar de inserción/vector es de 3/1.
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La construcción del vector recombinante pcDNA3.1/ST3/CD se llevó a cabo utilizando 33 ng de la quimera digerida hST3Gal III/CD (SEC ID nº 167), 50 ng de vector digerido pcDNA3.1, 3 unidades de enzima ADN ligasa de T4 (Promega) y 1X del tampón de ligación en un volumen final de 15 μl. La mezcla se incubó durante la noche a 4ºC y la reacción se inactivó durante 10 minutos a 70ºC.
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La segunda construcción de vector recombinante pcDNA3.1/ST6/CD se llevó a cabo utilizando 66,5 ng de la quimera digerida hST6GalNAc I-74/CD (SEC ID nº 161), 100 ng de vector digerido pcDNA3.1, 3 unidades de enzima ADN ligasa de T4 (Promega) y 1X del tampón de ligación en un volumen final de 15 μl. La mezcla se incubó durante la noche a 15ºC y la reacción se inactivó durante 10 minutos a 70ºC.
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La tercera construcción de vector recombinante pcDNA3.1/HYB/CD se llevó a cabo utilizando 66,5 ng de la quimera digerida hST3Gal III-28/hST6GalNAc I 37-74/CD (SEC ID nº 175), 100 ng de vector pcDNA3.1, 3 unidades de enzima ADN ligasa de T4 (Promega) y 1X de tampón de ligación en un volumen final de 15 μl. La mezcla se incubó durante la noche a 15ºC y la reacción se inactivó durante 10 minutos a 70ºC.
3. Clonación
Transformación química de células competentes
Se transformaron E. coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen) con el vector recombinante siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron dos microlitros de cada reacción de ligación a 25 μl de células químicamente competentes y se mezclaron mediante golpes suaves. Los viales se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Las transformaciones químicas se llevaron a cabo durante exactamente 40 segundos en un baño de agua a 42ºC. Se extrajeron los viales del baño a 42ºC y se dejaron sobre hielo durante 2 minutos. Se añadieron doscientos cincuenta microlitros de medio S.O.C. precalentado, proporcionado por Invitrogen, a cada vial bajo condiciones estériles. A continuación, se agitaron las mezclas a 37ºC durante exactamente 1 hora a 225 rpm en un incubador-agitador. Se extendió cada transformación en placas de agar-LB (10 g de bactotriptona, 5 g de bactoextracto de levadura, 10 g de NaCl y 15 g de agar por litro de solución de GibcoBRL) que contenía 50 μg/ml de ampicilina bajo condiciones estériles. Se invirtieron las placas, se incubaron a 37ºC durante la noche y se mantuvieron a 4ºC el día siguiente hasta la selección de los transformantes.
Amplificación
Al final del día, se aislaron colonias individuales y se inocularon en 3 ml de LB (10 g de bacto-triptona, 5 g de bactoextracto de levadura y 10 g de NaCl de Difco) que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Se aseguró el crecimiento a 37ºC en un incubador bajo agitación durante la noche. Al día siguiente, se prepararon cultivos madre en glicerol mediante la mezcla de 0,85 ml de cultivo y 0,15 ml de glicerol estéril y se transfirieron a un vial criogénico. Los cultivos en glicerol se almacenaron a -80ºC hasta la verificación de las secuencias y la utilización posterior.
Minipreparación de plásmidos
Los vectores recombinantes se purificaron mediante el procedimiento de Minipreparación (Maniatis), se aislaron 1,5 ml de los cultivos y se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 g para sedimentar las bacterias. Se añadió solución I fría (glucosa 5 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, pH 8,0) (100 μl) para resuspender el sedimento y también se añadieron 200 μl de solución II (NaOH 0,2 N y SDS al 1%) y 150 μl de solución III (potasio 3 M y acetato 5 M). Las mezclas se agitaron suavemente con vórtex, se dejaron sobre hielo durante 5 minutos y se centrifugaron a 4ºC durante 5 minutos a 15.000 g. Se obtuvieron los sobrenadantes y se añadió 1 volumen de isopropanol. Las minipreparaciones se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron a 4ºC durante 5 minutos a 15.000 g. A continuación, se separaron los sobrenadantes. Se secó el sedimento de ADN y se resuspendió en 50 μl de agua. Se midió la cantidad de ADN utilizando un espectrofotómetro DO (Biophotometer, Eppendorf). Se llevaron a cabo por lo menos 30 minipreparaciones con el fin de cribar para la presencia de la inserción de interés para cada construcción.
Un microgramo de cada una de las 30 minipreparaciones se digirió doblemente utilizando los enzimas de restricción AflII y XbaI con el fin de verificar la presencia de la inserción. En primer lugar, la solución de digestión contenía 10 unidades de XbaI (Promega), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X del tampón D apropiado del fabricante (Promega) en una solución final de 20 μl. Se llevaron a cabo digestiones en un baño de agua a 37ºC durante 1 hora y se inactivaron a 65ºC durante 15 minutos. En segundo lugar se digirieron las muestras utilizando 10 unidades de enzima de restricción AflII (Biolabs), 0,1X de BSA y 1X de tampón 2 (Biolabs) en un volumen final de 50 μl. Las reacciones se llevaron a cabo en un baño de agua a 37ºC durante 1 hora y se inactivaron a 65ºC durante 20 minutos. Se purificó la totalidad de las muestras digeridas utilizando el kit de purificación de PCR (Qiagen). Los productos de digestión se cargaron en un gel de agarosa al 1,5% para detectar la presencia de la inserción quimérica. Se llevó a cabo la electroforesis a 100 V durante aproximadamente 35 minutos.
En el caso de pcDNA3.1/ST3/CD y pcDNA3.1/ST6/CD, se detectó una inserción de 1.200 pb (figura 19C ó 23C). El tamaño de esta inserción correspondía exactamente al tamaño esperado de la quimera reconstituida ST3Gal III/CD
o ST6GalNAc I-74/CD.
Se secuenciaron por completo los clones positivos con el fin de identificar la secuencia esperada de ADN insertado.
Secuenciación
Se verificaron las etapas de clonación mediante secuenciación de ADN de dos cadenas utilizando el Genome Express (Meylan, Francia) con cebadores universales presentes en el interior del vector: promotor de T7 y BGH Reverse.
Se obtuvieron las secuencias esperadas finales de las tres quimeras: ST3Gal III/CD (SEC ID nº 167), hST3Gal III-28/hST6GalNAc I 37-74/CD (SEC ID nº 175) y ST6GalNAc I-74/CD (SEC ID nº 161). La secuencia nucleótida obtenida se alineó con la secuencia esperada y la alineación reveló una identidad de 100% entre estas tres secuencias. También se alineó la secuencia de aminoácidos deducida con la secuencia esperada de la quimera (http://www.infobiogen.fr/services/analyseq/cgi-bin/alignp_in.pl), demostrando una identidad de 100% entre dos de estas secuencias de aminoácidos.
La secuencia de nucleótidos obtenida para hST6GalNAc I-140 mostraba una identidad de 84% con la secuencia teórica. Las partes que faltaban de la secuencia eran los 36 primeros y los 39 últimos nucleótidos, correspondiendo ambos a los cebadores diseñados para la secuenciación del fragmento de ADN en ambas cadenas. Además, la alineación de los aminoácidos entre las secuencias esperadas y las resultantes mostró una identidad de 76,9%. No se encontraban los 12 primeros y los 24 últimos aminoácidos debido a sus correspondencias con los cebadores específicos utilizados para la secuenciación.
Minipreparación
Tras la verificación de la secuencia de la inserción de ADN, se amplificaron los plásmidos recombinantes en 100 ml de cultivo con el fin de obtener una cantidad elevada de cada construcción (pcDNA3.1/ST3/CD y pcDNA3.1/ST6/CD y pcDNA3.1/HYB/CD). Se recolectó una única colonia de cada plásmido de una placa selectiva recién sembrada y se inoculó en un cultivo inicial de 3 ml en medio LB que contenía el antibiótico selectivo ampicilina (50 μg·μl-1). Los cultivos se incubaron durante la noche a 37ºC bajo agitación vigorosa. Los cultivos iniciales se diluyeron en 100 ml de medio LB selectivo y se incubaron nuevamente durante la noche a 37ºC bajo agitación vigorosa. Se recolectaron las células bacterianas y se purificaron los vectores recombinantes utilizando el kit QIAGEN® Plasmid Midi (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se determinó el rendimiento con un espectrofotómetro de UV para cuantificar la concentración de ADN (biofotómetro, Eppendorf). Se almacenó cada constructo a -20ºC hasta su utilización.
Ejemplo 4: expresión funcional de los constructos sintéticos en células CHO
Las inserciones expresadas se representan en la figura 15.
A. Expresión transitoria de ST6 sintéticas en células CHO
Se utilizó la línea celular CHO-K1 para expresar las construcciones, tal como se describe en Donadio et al. (2003). Brevemente, se cultivaron células en medio de Ham suplementado con suero de feto bovino al 10% (FCS), fungizona (2,5 μg/ml) y gentamicina (50 μg/ml) a 37ºC en un incubador con 5% de CO2. Las transfecciones con constructos de vector FLAG-CMV se llevaron a cabo utilizando el reactivo lipofectamina siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante, con 3 μg de ADN de plásmido recombinante. Los experimentos de inmunofluorescencia se llevaron a cabo tras 36 a 48 horas de la transfección.
Se llevó a cabo el doble marcaje con FITC-SNA y mAb anti-FLAG tal como se describe en Donadio et al. (2003). Las células se fijaron en paraformaldehído al 1% (solución de PFA, saturada con BSA al 1%, lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron con FITC-SNA. Las células que expresaban una actividad de ST6 se marcaron en verde. Las muestras se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con PFA al 1%, se lavaron adicionalmente con PBS, se incubaron en NH4Cl 0,05 M y se lavaron con PBS. Las células se permeabilizaron con Triton al 0,1% en PBS y se incubaron adicionalmente en PBS que contenía suero de cabra al 10%. Se llevó a cabo el marcaje anti-FLAG utilizando el mAb anti-FLAG M2 (1:600) en PBS que contenía suero de cabra o de caballo inactivo al 5% seguido de la incubación con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón con Alexa Fluor 568 (1:200) en el mismo tampón. Las células que expresaban la sialiltransferasa etiquetada con FLAG se marcaron en rojo. Tras los lavados, las células se montaron en Mowiol y se mantuvieron a -20ºC en la oscuridad. Se llevó a cabo microscopía confocal con un instrumento Olympus o Leica. Las imágenes confocales se trataron con un sistema de imágenes Metamorph. Los volúmenes se trazaron originalmente como imágenes de color verdadero de 24-bit y se transfirieron a Adobe Photoshop en forma de archivos TIFF en RGB o JPG. Bajo estas condiciones, las células CHO-K1 no transfectadas no se encuentran marcadas con ninguno de los reactivos anteriormente indicados.
B. Actividad enzimática de ST6 sintéticas en células CHO
B1. Actividad del dominio catalítico optimizado de hST6Gal I
Se clonó el CD de hST6Gal I en el vector pFLAG-citomegalovirus (pFLAG-CMV1) de Sigma utilizando un péptido de señal preprotripsinógeno. Esta construcción y estos plásmidos fueron caracterizados anteriormente in vitro por Legaigneur et al. (2001), demostrando que proporcionaban una proteína enzimática del tamaño esperado que se liberaba al medio celular. Se encontró que este CD soluble era igualmente activo con glucoproteínas aceptoras exógenas de diversos grado de ramificación.
Para generar la forma soluble del CD mínimo de hST6Gal I, se generó un fragmento de PCR codificado entre:
5' (5'-TAATAAAGCTTGAGGCCTCCTTCCAG-3') introduciendo un sitio de restricción HindIII y
3' (5'-CTATTGGATCCTTAGCAGTGAATGGT-3') codificante de un sitio BamHI. A continuación, el fragmento se digirió con HindIII/BamHI y se insertó en el vector de expresión de mamífero pFLAG-CMV1 y se subclonó en el vector pBluescript II KS (Stratagene) para construcciones posteriores.
El CD mínimo de ST6Gal I (SEC ID nº 44) etiquetado con el epítopo FLAG (figura 18) se expresó a nivel elevado en células CHO (figura 18 B, D). Se caracterizó su actividad y localización utilizando el doble marcaje con anticuerpo monoclonal anti-FLAG y FITC-SNA. Significativamente, el CD-FLAG mutante era altamente eficiente en la sialilación de los aceptores de superficie celular, tal como se muestra en las figuras 18C y D.
B2. Expresión funcional de ST8/CD
Se transfectaron transitoriamente células CHO-K1 con formas quiméricas de hST8SiaIV (1-67)/CD (SEC ID nº 173), hST8SiaII (1-79)/CD (SEC ID nº 171). Se caracterizó su actividad y localización utilizando el doble marcaje con anticuerpo monoclonal anti-FLAG y FITC-SNA, tal como se muestra en la figura 19.
Se encontró que las quimeras tanto hST8SiaIV (1-67)/CD (SEC ID nº 174) como hST8SiaII (1-79)/CD (SEC ID nº 172) eran activas sobre los aceptores celulares endógenos, ya que la lectina SNA reveló un marcaje intenso de la superficie celular (figura 19 B, C, E y F), indicando que el CD era activo con independencia del origen de la parte Nterminal fusionada con el dominio catalítico. Se mantuvo la actividad de a2,6-sialiltransferasa con ambas quimeras, indicando que en el enzima quimérico la información contenida en el CD mínimo resultaba necesaria y suficiente para el reconocimiento de aceptor y la eficiencia de la transferencia.
B3. Expresión funcional de ST3/CD y del híbrido ST3-ST6GalNAc/CD
Se transfectaron transitoriamente células CHO-K1 con los constructos quiméricos de hST3Gal III/CD (SEC ID nº 167) y ST3 1-28-ST6GalNAc37-74/CD (SEC ID nº 175). Se caracterizó su actividad y localización utilizando el doble marcaje con anticuerpo monoclonal anti-FLAG y FITC-SNA, tal como se muestra en la figura 19.
Nuevamente, se encontró que ambas quimeras eran activas sobre aceptores endógenos, ya que la unión de SNA revelaba un marcaje intenso de la superficie celular (figura 19 B, C, E y F). Lo anterior indica que el CD es activo con independencia del origen de CT+TMD+SR añadido. Debido a que la actividad de la a2,6-sialiltransferasas se mantenía en ambas quimeras, también se concluyó que la información contenida en el CD mínimo resultaba necesaria y suficiente para una eficiencia máxima de la transferencia.
Por lo tanto, la fusión de las secuencias de ST3/8 cadena arriba del CD no altera la expresión de la actividad catalítica de la ST6. Debido a que la ST3 Gal III de rata y humana, y más generalmente la ST3Gal III de roedor y de mamífero, son idénticas en su parte N-terminal (CT+TMD+SR yuxtamembrana), aparentemente el intercambio de cualquier trozo de esta parte peptídica por trozos heterólogos no humanos tampoco presenta ningún efecto sobre la actividad catalítica de ST6. Además, la sustitución de CT, TMD y SR por partes heterólogas seleccionadas de entre enzimas de O-glucosilación como ST GalNAcI no altera el reconocimiento de los aceptores intracelulares ni la actividad enzimática.
B4. Expresión funcional de hST6GalNAc I-74/CD y de hST6GalNAc 258/CD
Se utilizó un enfoque similar para estimar la expresión y actividad de los enzimas hST6GalNAc I (1-74)/CD (SEC ID nº 162) y de hST6GalNAc I-258/CD (SEC ID nº 166). Ambas transferasas quiméricas eran activas: la unión de SNA reveló una sialilación intensa similar de la superficie celular y el marcaje con FLAG mostró una localización idéntica dentro del Golgi (figura 21G, H e I).
De esta manera, puede concluirse que la longitud de la región SR puede ser ampliamente variable y extenderse hasta 258 residuos sin afectar a la expresión funcional y localización intracelular de la actividad catalítica de una ST6Gal quimérica. Lo anterior también confirma adicionalmente que la longitud del anclaje membranal N-terminal heterólogo no afecta a la conformación biológicamente activa de la sialiltransferasa de diseño nuevo.
Basándose en los ejemplos anteriores, puede afirmarse que el procedimiento descrito en la invención puede eliminar el control regulador de la región SR sobre la actividad del CD. En consecuencia, puede seleccionarse cualquier combinación posible de CT+TMD+SR entre las glucosiltransferasas (sialiltransferasas) de la ruta de N-glucosilación u O-glucosilación para dotar a células huésped de una actividad de transferasa necesaria, mediante un CD relevante. Además, el procedimiento descrito en la invención también permite dirigir una actividad necesaria en compartimentos intracelulares en los que migran glucoproteínas recién sintetizadas hasta la superficie celular. Este resultado es de crucial importancia para la correcta clasificación y secreción de proteínas sialiladas de interés terapéutico en las células (de levaduras a humanas) manipuladas tal como se describe en la invención.
Ejemplo 5: construcción de un dominio sintético híbrido: hST3Gal III/hST8Sia II/hST6GalNAc I y fusión con el CD de hST6Gal I
Se construyó una región N-terminal híbrida (SEC ID nº 180) que contenía en primer lugar el CT de hST3Gal III (residuos aminoácidos 1 a 8, SEC ID nº 66), después el TMD de hST8Sia II (residuos aminoácidos 7 a 23, SEC ID nº 120) y finalmente la SR de hST6GalNAc I (aminoácidos 36 a 74, SEC ID nº 130). Se añadió un epítopo FLAG (en negrita) entre el codón de inicio ATG y el segundo codón (GGA) de la secuencia de hST3Gal III.
5'-ATG GACTACAAAGACGATGACGACAAG GGA- 3'
La longitud total de este híbrido era de 72 aminoácidos (SEC ID nº 180), correspondiente a 216 nucleótidos (SEC ID nº 179). Se diseñaron y sintetizaron (Eurogentec) ocho oligonucleótidos de sentido y siete oligonucleótidos antisentido correspondientes a la región N-terminal híbrida indicada anteriormente (nucleótidos 1 a 216) utilizando las secuencias de hST3Gal III/hST8Sia II/hST6GalNAc I.
Se llevaron a cabo reacciones de fosforilación y apareamiento tal como se ha indicado anteriormente.
Amplificación por PCR del constructo sintético
Tras la etapa de reconstitución sintética, se amplificó el producto utilizando una PCR de alta fidelidad utilizando cebadores específicos que introducen los sitios de restricción deseados en cada extremo del fragmento de ADN reconstituido con el fin de ligarlo al vector pcDNA3.1. Se introdujeron los sitios de restricción AflII y BamHI respectivamente en los extremos 5' y 3'.
Se utilizaron los cebadores siguientes:
5' AflII-ST3: 5'-GAGCCCCTTAAGATGGACTACAAAGACGATGACG-3' y 3' ST6-BamHI nº 3: 5'-TAAGGGGGATCCGCTTGTCCTCCTTGCCCT-3'
Se llevó a cabo la PCR en un aparato de PCR (I-Cycler, Biorad) con 5 μl del fragmento sintético en una solución que contenía 1X de tampón ProofStart del fabricante y 1X de solución Q del fabricante, 1,5 mM de Mg2+, 300 μM de cada dNTP (Sigma Aldrich), 1 μM del cebador directo AflII-ST3, 1 μM de cebador inverso ST6-BamHI nº 3, 2,5 unidades de ADN polimerasa ProofStart (Qiagen) en un volumen final de 50 μl. El perfil de termociclado utilizado fue el siguiente: 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 1 minuto a 72ºC.
Los productos de PCR amplificados se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Se amplificó una secuencia nucleótida de 240 pb, que corresponde al tamaño esperado del fragmento (figura 22, carril 1). Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción en gel (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Cuantificación del producto de PCR
Se agruparon todos los productos de PCR y se agruparon. Se añadieron dos volúmenes de etanol y 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,2, a los productos de PCR. La mezcla se incubó durante 30 minutos a -20ºC y se centrifugó durante 20 minutos a 10.000 g a 4ºC. Se lavó el sedimento con 100 μl de etanol al 70% y se centrifugó nuevamente durante 10 minutos a 10.000 g a 4ºC. A continuación, se separó el sobrenadante y se secó el sedimento y se resuspendió en 30 μl de agua doblemente destilada. La muestra de ADN se conservó a -20ºC hasta su utilización.
Se cargaron tres microlitros del fragmento concentrado en un gel de agarosa al 2% para estimar su cantidad (figura 22, carril 3).
Ligación del dominio catalítico a un vector de expresión, pcDNA3.1(+)
1. Digestiones y purificaciones
La secuencia de nucleótidos del dominio catalítico CD de hST6Gal I (SEC ID nº 43) se ligó en el vector pcDNA3.1 en los sitios de restricción BamHI y XbaI.
En primer lugar se digirieron tanto el vector pcDNA3.1(+) como el CD con el enzima de restricción BamHI:
Se digirieron 500 ng del CD con 5 unidades de BamHI (Promega), 0,1 μg μl-1 de albúmina de suero bovino y 1X de tampón E (Promega) en un volumen final de 20 μl.
Se digirió 1 μg del vector pcDNA3.1 con 10 unidades de BamHI (Promega), 0,1 μg μl-1 de albúmina de suero bovino y 1X de tampón E (Promega) en un volumen final de 20 μl.
Se llevaron a cabo las digestiones durante 60 minutos a 37ºC y las incubaciones se inactivaron finalmente durante 15 minutos a 65ºC. Los productos digeridos se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR (Qiagen).
A continuación, los productos digeridos se sometieron a una digestión con el enzima de restricción XbaI (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante: utilizando el número correcto de unidades enzimáticas, dependiendo de la cantidad de ADN (5 y 6, respectivamente para el CD y el pcDNA3.1), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X de tampón D (Promega) en un volumen final de 50 μl. Las digestiones se llevaron a cabo a 37ºC durante 60 minutos. Las digestiones se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR (Qiagen).
2. Ligación
Se calcularon las condiciones de ligación según la fórmula anteriormente indicada. El tamaño del CD insertado era de aproximadamente 960 pb, el tamaño del vector pcDNA3.1 era de 5.428 pb, la cantidad de vector utilizada era de 100 ng y finalmente la proporción molar inserción/vector era de 3/1.
La construcción del vector recombinante pcDNA3.1/CD se llevó a cabo utilizando 53 ng de CD doblemente digerido, 100 ng de vector pcDNA3.1 doblemente digerido, 6 unidades de enzima ADN ligasa de T4 (Promega) y 1X de tampón de ligación en un volumen final de 20 μl. La mezcla se incubó durante la noche a 15ºC y la reacción se inactivó durante 10 minutos a 70ºC.
3. Clonación
Transformación química de células competentes
Se transformaron E. coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen, Life Technologies) con el vector recombinante siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron cinco microlitros del producto de ligación a una alícuota de 50 μl de células TOP10 y se mezclaron mediante golpecitos suaves. La mezcla se incubó sobre hielo durante 30 minutos y después se sometió a choque térmico durante exactamente 30 segundos en un baño de agua a 42ºC y se dejaron sobre hielo durante 2 minutos. Se añadieron doscientos cincuenta microlitros de medio SOC precalentado (Invitrogen) a la reacción de transformación y se incubaron a 37ºC durante una hora bajo agitación a 250 rpm. La reacción de transformación se extendió sobre placas de agar LB (composición indicada anteriormente) que contenía 50 μg·ml-1 de ampicilina. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC.
Amplificación
Al final del día siguiente, se recolectaron colonias individuales y se incubaron con 3 ml de caldo LB (composición indicada anteriormente) que contenía 50 μg ml-1 de ampicilina, durante la noche a 37ºC bajo agitación a 250 rpm.
Minipreparación de plásmidos
Los vectores recombinantes se purificaron a partir de alícuotas de 1,5 ml de los cultivos anteriores utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep proporcionado por Qiagen y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo veinticuatro minipreparaciones con el fin de cribar para la presencia de la inserción.
Cinco microlitros de cada una de las 24 minipreparaciones de digirieron doblemente utilizando los enzimas de restricción XbaI y BamHI con el fin de verificar la presencia de la inserción.
En primer lugar, la solución de digestión contenía 12 unidades de XbaI (Promega), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X de tampón D (Promega) en un volumen final de 10 μl. Las digestiones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37ºC. En segundo lugar, las muestras se digirieron utilizando 20 unidades de BamHI (Promega) y 1X de tampón E (Promega) en un volumen final de 20 μl. Las reacciones se llevaron a cabo durante la noche a 37ºC. Los productos de digestión se cargaron en un gel de agarosa al 1,5% para detectar la presencia del CD. Se detectó una inserción de aproximadamente 1.000 pb (figura 23) que correspondía al tamaño esperado del CD (960 pb).
Se seleccionó un clon positivo para las etapas siguientes de construcción.
Ligación de la región N-terminal en el vector recombinante pcDNA3.1/CD
1. Digestiones y purificaciones
Se ligó la secuencia de nucleótidos de la región N-terminal (SEC ID nº 179) en el vector recombinante pcDNA3.1/CD en los sitios de restricción BamHI y AflII. En primer lugar se digirieron tanto el fragmento N-terminal como el vector recombinante pcDNA3.1/CD con el enzima de restricción BamHI:
se digirieron 300 ng del fragmento N-terminal con 5 unidades de BamHI (Promega), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X de tampón E (Promega) en un volumen final de 20 μl.
Se digirieron 2 μg del vector recombinante pcDNA3.1/CD con 20 unidades de BamHI (Promega), 0,1 μg·μl-1 de BSA y 1X de tampón E (Promega) en un volumen final de 20 μl.
Las digestiones se llevaron a cabo durante 100 minutos a 37ºC y las incubaciones se inactivaron finalmente durante 15 minutos a 65ºC. Los productos digeridos se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR (Qiagen).
A continuación, los productos digeridos se sometieron a una digestión con el enzima de restricción AflII (New England BIOLABS), siguiendo las instrucciones del fabricante: utilizando el número correcto de unidades enzimáticas, dependiendo de la cantidad de ADN (10 y 20, respectivamente para el fragmento N-terminal y el vector recombinante pcDNA3.1/CD), 1X de BSA y 1X de tampón 2 (New England BIOLABS) en un volumen final de 50 μl. Las digestiones se llevaron a cabo a 37ºC durante 60 minutos y finalmente las incubaciones se inactivaron durante 20 minutos a 65ºC. Las digestiones se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR (Qiagen).
2. Ligación
Se calcularon las condiciones de ligación según la fórmula anteriormente indicada. El tamaño del fragmento Nterminal insertado era de 240 pb, el tamaño del vector recombinante pcDNA3.1/CD era de 6.388 pb, la cantidad de vector utilizada era de 100 ng y finalmente la proporción molar de inserción/vector era de 1/1.
Se llevó a cabo la construcción del vector recombinante pcDNA3.1/fragmento N-terminal/CD utilizando 5 ng del fragmento N-terminal digerido, 100 ng de vector recombinante pcDNA3.1/CD digerido, 6 unidades del enzima ADN ligasa de T4 (Promega) y 1X de tampón de ligación en un volumen final de 20 μl. La mezcla se incubó durante la noche a 15ºC y la reacción se inactivó durante 10 minutos a 70ºC.
3. Clonación
Transformación química de células competentes
Se transformaron E. coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen) con el producto de ligación siguiendo las instrucciones del fabricante y tal como se ha indicado anteriormente.
Amplificación
Al final del día siguiente, se recolectaron colonias individuales y se incubaron con 3 ml de caldo LB (composición indicada anteriormente) que contenía 50 μg·ml-1 de ampicilina, durante la noche a 37ºC bajo agitación a 250 rpm.
Minipreparación de plásmidos
Se purificaron los vectores recombinantes a partir de alícuotas de 1,5 ml de los cultivos anteriores utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep proporcionado por Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo veinticuatro minipreparaciones con el fin de cribar para la presencia de la inserción.
Se digirieron doblemente cinco microlitros de cada una de las 24 minipreparaciones utilizando los enzimas de restricción XbaI y AflII con el fin de verificar la presencia de la inserción (fragmento N-terminal + CD, SEC ID nº 181).
La solución de digestión contenía 20 unidades de XbaI (Biolabs), 20 unidades de AflII (Biolabs), 1X de BSA (Biolabs) y 1X de tampón 2 (Biolabs) en un volumen final de 20 μl. Las digestiones se llevaron a cabo durante 2 horas y 30 minutos a 37ºC. Los productos de digestión se cargaron en un gel de agarosa al 1,5% para detectar la presencia de tanto la región N-terminal como el CD. Se detectó una inserción de aproximadamente 1.200 pb (figura 24a) que correspondía al tamaño esperado de la inserción.
Finalmente se llevó a cabo una PCR en cinco muestras minipreparación para verificar la presencia del ADN insertado (fragmento N-terminal seguido del CD: SEC ID nº 181). Se llevó a cabo la PCR en un aparato de PCR (I-Cycler, Biorad) con 1 μl de cada una de las muestras minipreparación en una solución que contenía 1X de tampón del fabricante de ProofStart y 1X de solución Q del fabricante, 3 mM de Mg2+, 300 μM de cada dNTP (Sigma Aldrich), 1 μM de cebador directo AflII-ST3, 1 μM de cebador inverso 4-XbaI, 2,5 unidades de ADN polimerasa ProofStart (Qiagen) en un volumen final de 50 μl.
Los oligonucleótidos incluidos en la reacción fueron los siguientes:
5' AflII-ST3: 5'-GAGCCCCTTAAGATGGACTACAAAGACGATGACG-3'
y 3' 4-XbaI: 5'-TAACCCTCTAGATTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGC-3'
El perfil de termociclado utilizado fue el siguiente: 95ºC durante 5 minutos seguido de 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 57ºC y 1 minuto 30 segundos a 72ºC. Los productos de PCR amplificados se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%: se amplificó una secuencia de nucleótidos de 1.200 pb para cada muestra minipreparación, que corresponde al tamaño esperado de la inserción total (figura 24b).
Secuenciación
Se verificaron las etapas de clonación mediante secuenciación de ADN de las dos cadenas utilizando GENOME Express (Meylan, Francia) con cebadores universales presentes en el interior del vector: promotor de T7 y BGH inverso.
La secuencia nucleótida obtenida se alineó con la secuencia esperada y la alineación reveló una identidad de 100%. También se alineó la secuencia de aminoácidos deducida con la secuencia esperada SEC ID nº 181 de la quimera y mostraba una identidad de 100%.
Midipreparación
Tras la verificación de la secuencia de la inserción de ADN, se amplificó el plásmido recombinante en 100 ml de cultivo con el fin de obtener una cantidad elevada de la construcción. Se inocularon cuatrocientos microlitros del cultivo en 3 ml de caldo LB correspondiente indicado anteriormente, en 100 ml de caldo LB que contenía 50 μg·ml-1 de ampicilina, y se incubaron a 37ºC bajo agitación a 250 rpm. Se recolectaron las células bacterianas y se purificaron los vectores recombinantes utilizando el kit QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se determinó el rendimiento con un espectrofotómetro de UV para cuantificar la concentración del ADN. Se almacenó el constructo a -20ºC.
Cultivo celular: expresión del enzima quimérico hST3Gal III/hST8Sia II/hST6GalNAc I/CD (SEC ID nº 182) en células CHO
Se cultivaron rutinariamente células CHO-K1 a 37ºC con 5% de CO2 en DMEM suplementado con FBS al 10%, 2,5 μg/ml de fungizona y 50 μg/ml de gentamicina. El día antes de la transfección, se sembraron células a una densidad de 100.000 células/ml en una placa de 6 pocillos que contenía 3 cubreobjetos de vidrio en cada pocillo. Se transfectaron transitoriamente células CHO-K1 con reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche) en una proporción
3:1.
Transcurrido un día de cultivo, las células se fijaron con paraformaldehído al 1% durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT). Las células se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon durante 30 minutos a RT con BSA al 1% y después se incubaron con 10 μg/ml de SNA-FITC (Vector Laboratories) durante una hora a 4ºC. Las células se lavaron sucesivamente tres veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 3% durante 20 minutos a RT, se lavaron adicionalmente con PBS y se incubaron con NH4Cl 0,05 M durante 10 minutos a RT. Tras los lavados con PBS, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,25% durante 5 minutos a RT y se bloquearon con suero de cabra inactivado al 10% y BSA al 1% durante 30 minutos a RT. Las células se incubaron durante una hora a RT con 1 μg/ml de anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma) en PBS que contenía suero de cabra inactivado al 5% y BSA al 0,5%. Las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 45 minutos con 5,7 μg/ml de anticuerpo secundario de cabra antirratón acoplado a Alexa Fluor®594 (Molecular Probes) en PBS que contenía suero de cabra inactivado al 5% y BSA al 0,5%. Tras los lavados con PBS, se montaron las células en Mowiol y se analizaron utilizando un microscopio Olympus (figura 25).
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Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la producción de secuencias génicas codificantes de glucosiltransferasas membranales quiméricas que presentan una actividad de glucosilación optimizada en las células transformadas con dichas secuencias, en comparación con la actividad de glucosilación de las glucosiltransferasas nativas correspondientes hacia el sustrato aceptor, siendo dicha actividad de glucosilación optimizada por lo menos 30 veces superior a la actividad inicial de las glucosiltransferasas de longitud completa nativas,
    comprendiendo dicho procedimiento la fusión:
    -
    de un primer ácido nucleico codificante de un fragmento mínimo C-terminal del dominio catalítico (CD) de la glucosiltransferasa de longitud completa nativa,
    siendo dicha primera secuencia de ácidos nucleicos obtenida mediante la eliminación de nucleótidos codificantes de uno o varios aminoácidos contiguos que se extienden desde el primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho CD, y la selección del ácido nucleico codificante de dicho fragmento de CD mínimo C-terminal de manera que si n representa el número de aminoácidos contiguos tal como se ha definido anteriormente, que han sido delecionados, el fragmento obtenido al delecionar por lo menos n+1 aminoácidos contiguos, tal como se ha definido anteriormente, no presenta ninguna actividad sustancial de transferasa,
    -
    con un segundo ácido nucleico de secuencia variable codificante de una cadena peptídica transmembranal que especifica el anclaje de las glucosiltransferasas en compartimentos intracelulares, y que comprende en su región Nterminal una región de cola citoplasmática (CT) situada cadena arriba de un dominio transmembranal (TMD) situado cadena arriba de una región de tallo (SR) o de un fragmento de por lo menos 3 aminoácidos contiguos de la SR, estando dicha SR o parte de la misma unida a dicho dominio catalítico mediante un conector o péptido de conexión de por lo menos 2 aminoácidos codificados por un sitio de restricción que no existe en la secuencia de nucleótidos codificante del CD nativo mencionado anteriormente,
    con la condición de que por lo menos uno de estos péptidos CT, TMD y SR sea diferente de la estructura primaria de las contrapartidas peptídicas naturales presentes en la glucosiltransferasa nativa a partir de la que se obtiene el fragmento de CD con actividad de glucosiltransferasa óptima tal como se ha definido anteriormente,
    siendo dicha fusión realizada de manera que el primer ácido nucleico se encuentre situado cadena abajo del segundo ácido nucleico y proporcione un producto proteína en el que el CD se encuentre en la mitad C-terminal.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los primer y segundo ácidos nucleicos se obtienen de las secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD, o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en glucosiltransferasas de origen eucariótico, preferentemente mamíferos o seres humanos, estando dichas glucosiltransferasas implicadas en:
    •
    la O-glucosilación de las proteínas en las células eucarióticas, tales como las N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas o sialiltransferasas,
    •
    la N-glucosilación de las proteínas en las células eucarióticas, tales como glucosaminiltransferasas, galactosiltransferasas, fucosiltransferasas o sialiltransferasas,
    •
    la glucosilación de los lípidos, tales como glucosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, glucosaminiltransferasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas o sialiltransferasas.
  3. 3.
    Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los primer y segundo ácidos nucleicos se obtienen de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD, o regiones CT, TMD y SR, respectivamente en glucosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas, galactosiltransferasas, fucosiltransferasas o sialiltransferasas.
  4. 4.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los primer y segundo ácidos nucleicos se obtienen de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD, o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en sialiltransferasas.
  5. 5.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los primer y segundo ácidos nucleicos se obtienen de secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD, o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en a2,6-sialiltransferasas, a2,3-sialiltransferasas o a2,8-sialiltransferasas.
  6. 6.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los primer y segundo ácidos nucleicos se obtienen de las secuencias de nucleótidos codificantes de dominios CD, o regiones CT, TMD y SR, respectivamente, en:
    -
    a2,6-sialiltransferasas seleccionadas de entre:
    *
    las 1,4-galactósido a2,6-sialiltransferasas I y II humanas (hST6Gal I y hST6Gal II) representadas por las secuencias SEC ID nº 2 y SEC ID nº 4, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3, respectivamente, o
    *
    las N-acetilgalactosaminida-a2,6-sialiltransferasas I a VI humanas (hST6GalNAc I a VI) representadas por las secuencias SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10, SEC ID nº 12, SEC ID nº 14 y SEC ID nº 16, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 13 y SEC ID nº 15, respectivamente,
    -
    a2,3-sialiltransferasas seleccionadas de entre galactósido-a2,3-sialiltransferasas I a VI humanas (hST3Gal I a VI) representadas por las secuencias SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 22, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 y SEC ID nº 28, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleotidos SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 21, SEC ID nº 23, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27, respectivamente, o las galactosido-a2,3-sialiltransferasas I a VI de rata (ST3Gal I a VI de rata), tales como rST3Gal III representada por la secuencia SEC ID nº 30 codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 29, o cualquier ST de otro origen animal con la condición de que comparta una homología de por lo menos 85% con el enzima humano,
    -
    a2,8-sialiltransferasas seleccionadas de entre las ácido siálico-a2,8-sialiltransferasas I a VI (hST8Sia I a VI) humanas representadas por las secuencias SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40 y SEC ID nº 42, respectivamente, codificadas por las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39 y SEC ID nº 41, respectivamente.
  7. 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos codificante del dominio CD comprendido en el primer ácido nucleico se selecciona de entre las secuencias constituidas por o que comprenden:
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 268 y 330, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.218 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6Gal I delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 90 y 110 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 406 de la secuencia SEC ID nº 2,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 307 y 369, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.587 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6Gal II delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 103 y 123 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 529 de la secuencia SEC ID nº 4,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 814 y 876, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.800 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNAc I delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 272 y 292 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 600 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 172 y 234, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.122 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 58 y 78 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 374 de la secuencia SEC ID nº 8,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 73 y 135, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 915 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac III delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 25 y 45, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 305 de la secuencia SEC ID nº 10,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 61 y 123, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 906 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídcia correspondiente al dominio CD de hST6GalNac IV delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 21 y 41, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 302 de la secuencia SEC ID nº 12,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 121 y 183, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.008 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha
    secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac V delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 41 y 61, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 336 de la secuencia SEC ID nº 14,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 154 y 216, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 999 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST6GalNac VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 52 y 72 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 333 de la secuencia SEC ID nº 16,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 145 y 207, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.020 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 49 y 69, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 340 de la secuencia SEC ID nº 18,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 175 y 237, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.050 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal II delimitado en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 59 y 79, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 350 de la secuencia SEC ID nº 20,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 199 y 261, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.332 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 67 y 87, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 444 de la secuencia SEC ID nº 22,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 79 y 141, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 987 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 27 y 47, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 329 de la secuencia SEC ID nº 24,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 136 y 198, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.086 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 46 y 66, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 362 de la secuencia SEC ID nº 26,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 73 y 135, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 993 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST3Gal VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 25 y 45, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 331 de la secuencia SEC ID nº 28,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 103 y 165, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.122 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de ST3Gal III de rata delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 35 y 55, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 374 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 133 y 195, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.068 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 45 y 65, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 356 de la secuencia SEC ID nº 32,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 190 y 252, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.125 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 64 y 84, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 375 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 205 y 267, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.140 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha
    secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 69 y 89, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 380 de la secuencia SEC ID nº 36,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 145 y 207, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.077 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 49 y 69, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 359 de la secuencia SEC ID nº 38,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 211 y 273, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.128 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 71 y 91, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 376 de la secuencia SEC ID nº 40,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado entre las posiciones 277 y 339, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 1.194 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente al dominio CD de hST8Sia VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 93 y 113, y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 398 de la secuencia SEC ID nº 42.
  8. 8.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el primer ácido nucleico es la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 43 correspondiente a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en la posición 268 y 1.218 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 43 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 44 correspondiente al fragmento mínimo C-terminal del dominio CD de hST6Gal I delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 90 a 406 de la secuencia SEC ID nº 2.
  9. 9.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque:
    -
    la secuencia de nucleótidos codificante de la región CT comprendida en el segundo ácido nucleico se selecciona de entre:
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 45 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 27 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 45 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 46 correspondiente a la región CT de hST6Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 9 de la secuencia SEC ID nº 2,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 47 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 30 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 47 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 48 correspondiente a la región CT de hST6Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 10 de la secuencia SEC ID nº 4,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 49 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 42 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 50 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 50 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 14 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 51 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 21 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 51 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 52 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 7 de la secuencia SEC ID nº 8,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 53 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 53 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 54 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 10,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 55 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 55 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 56 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 12,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 57 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha secuencia de
    nucleótidos SEC ID nº 57 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 58 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 14,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 59 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 129 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 59 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 60 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 43 de la secuencia SEC ID nº 16,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 61 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 39 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 61 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 62 correspondiente a la región CT de hST3Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 13 de la secuencia SEC ID nº 18,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 63 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 63 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 64 correspondiente a la región CT de hST3Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 20,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 66 correspondiente a la región CT de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 22,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 67 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 67 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 68 correspondiente a la región CT de hST3Gal IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 24,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 69 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 15 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 69 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 70 correspondiente a la región CT de hST3Gal V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 5 de la secuencia SEC ID nº 26,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 71 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 12 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 71 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 72 correspondiente a la región CT de hST3Gal VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 4 de la secuencia SEC ID nº 28,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 74 correspondiente a la región CT de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 75 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 87 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 75 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 76 correspondiente a la región CT de hST8Sia I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 29 de la secuencia SEC ID nº 32,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 78 correspondiente a la región CT de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 79 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 27 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 79 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 80 correspondiente a la región CT de hST8Sia III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 9 de la secuencia SEC ID nº 36,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 21 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 82 correspondiente a la región CT de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 7 de la secuencia SEC ID nº 38,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 83 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 51 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de
    nucleótidos SEC ID nº 83 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 84 correspondiente a la región CT de hST8Sia V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 17 de la secuencia SEC ID nº 40,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 85 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 9 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 85 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 86 correspondiente a la región CT de hST8Sia VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 3 de la secuencia SEC ID nº 42,
    -
    la secuencia de nucleótidos codificante de la región TMD comprendida en el segundo ácido nucleico se selecciona de entre:
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 87 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 28 y 78 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 87 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 88 correspondiente a la región TMD de hST6Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 10 y 26 de la secuencia SEC ID nº 2,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 89 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 31 y 90 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 89 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 90 correspondiente a la región TMD de hST6Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 11 y 30 de la secuencia SEC ID nº 4,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 91 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 43 y 105 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 91 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 92 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 15 y 35 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 93 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 22 y 84 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 93 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 94 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 8 y 28 de la secuencia SEC ID nº 8,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 95 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 95 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 96 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 10,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 97 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 19 y 81 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 97 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 98 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 27 de la secuencia SEC ID nº 12,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 99 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 87 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 99 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 100 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 29 de la secuencia SEC ID nº 14,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 101 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 130 y 177 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 101 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 102 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 44 y 59 de la secuencia SEC ID nº 16,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 103 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 40 y 102 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 103 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 104 correspondiente a la región TMD de hST3Gal I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 14 y 34 de la secuencia SEC ID nº 18,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 105 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 19 y 81 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 105 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 106 correspondiente a la región TMD de hST3Gal II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 27 de la secuencia SEC ID nº 20,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 108 correspondiente a la región TMD de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 22,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 109 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 78 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 109 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 110 correspondiente a la región TMD de hST3Gal IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 26 de la secuencia SEC ID nº 24,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 111 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 16 y 78 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 111 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 112 correspondiente a la región TMD de hST3Gal V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 6 y 26 de la secuencia SEC ID nº 26,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 113 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 13 y 75 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 113 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 114 correspondiente a la región TMD de hST3Gal VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 5 y 25 de la secuencia SEC ID nº 28,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 116 correspondiente a la región TMD de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 117 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 88 y 144 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 117 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 118 correspondiente a la región TMD de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 30 y 48 de la secuencia SEC ID nº 32,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 19 y 69 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 120 correspondiente a la región TMD de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 23 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 121 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 28 y 99 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 121 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 122 correspondiente a la región TMD de hST8Sia III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 10 y 33 de la secuencia SEC ID nº 36,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 22 y 60 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 124 correspondiente a la región TMD de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 8 y 20 de la secuencia SEC ID nº 38,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 125 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 52 y 114 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 125 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 126 correspondiente a la región TMD de hST8Sia V delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 18 y 38 de la secuencia SEC ID nº 40,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 127 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 10 y 72 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 127 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 128 correspondiente a la región TMD de hST8Sia VI delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 4 y 24 de la secuencia SEC ID nº 42,
    -
    la secuencia de nucleótidos codificante de la región SR comprendida en el segundo ácido nucleico, o codificante de un fragmento de por lo menos 3 aminoácidos del mismo, se selecciona de entre las secuencias constituidas por o que comprenden:
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 79, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 267 y 327 de la secuencia SEC ID nº 1, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 27 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 89 y 109 de la secuencia SEC ID nº 2,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 91, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 306 y 336 de la secuencia SEC ID nº 3, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 31 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 102 y 112 de la secuencia SEC ID nº 4,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 106, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 813 y 873 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 36 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 271 y 291 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 171 y 231 de la secuencia SEC ID nº 7, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 57 y 77 de la secuencia SEC ID nº 8,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 102 y 132 de la secuencia SEC ID nº 9, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 34 y 44 de la secuencia SEC ID nº 10,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 82, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 90 y 120 de la secuencia SEC ID nº 11, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 28 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 30 y 40 de la secuencia SEC ID nº 12,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 88, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 120 y 180 de la secuencia SEC ID nº 13, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 30 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 40 y 60 de la secuencia SEC ID nº 14,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 178, y en su extremo 3' por el nucleótido situado en la posición 183 de la secuencia SEC ID nº 15, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6GalNAc VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 60 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado en la posición 61 de la secuencia SEC ID nº 16,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 103, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 144 y 204 de la secuencia SEC ID nº 17, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 35 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 48 y 68 de la secuencia SEC ID nº 18,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 82, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 174 y 234 de la secuencia SEC ID nº 19, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST6Gal II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 28 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 58 y 78 de la secuencia SEC ID nº 20,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 198 y 258 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 66 y 86 de la secuencia SEC ID nº 22,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 79, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 108 y 138 de la secuencia SEC ID nº 23, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 27 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 36 y 46 de la secuencia SEC ID nº 24,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 79, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 135 y 195 de la secuencia SEC ID nº 25, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 27 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 45 y 65 de la secuencia SEC ID nº 26,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 76, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 102 y 132 de la secuencia SEC ID nº 27, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST3Gal VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 26 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 34 y 44 de la secuencia SEC ID nº 28,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 85, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 105 y 165 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de ST3Gal III de rata delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 29 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 35 y 55 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 145, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 162 y 192 de la secuencia SEC ID nº 31, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia I delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 49 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 54 y 64 de la secuencia SEC ID nº 32,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 70, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 189 y 249 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia II delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 24 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 63 y 83 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 100, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 204 y 264 de la secuencia SEC ID nº 35, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia III delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 34 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 68 y 88 de la secuencia SEC ID nº 36,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 61, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 144 y 204 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia IV delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 21 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 48 y 68 de la secuencia SEC ID nº 38,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 115, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 210 y 270 de la secuencia SEC ID nº 39, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia V delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 39 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 70 y 90 de la secuencia SEC ID nº 40,
    *
    la secuencia de nucleótidos delimitada en su extremo 5' por el nucleótido situado en la posición 73, y en su extremo 3' por el nucleótido situado entre las posiciones 276 y 336 de la secuencia SEC ID nº 41, codificando dicha secuencia de nucleótidos la secuencia polipeptídica correspondiente a la región SR de hST8Sia VI delimitada en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en la posición 25 y en su extremo C-terminal por el aminoácido situado entre las posiciones 92 y 112 de la secuencia SEC ID nº 42,
    * o cualquier fragmento de por lo menos 6 nucleótidos de las secuencias de nucleótidos codificantes de las secuencias polipeptídicas correspondientes a las regiones SR mencionadas anteriormente, y codificantes de por lo menos 2 aminoácidos contiguos de dichas regiones SR, tales como:
    ** el fragmento SEC ID nº 129 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 130 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
    ** el fragmento SEC ID nº 131 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 109 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 132 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 37 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
    ** el fragmento SEC ID nº 133 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 420 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 134 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 140 de la secuencia SEC ID nº 6,
    ** el fragmento SEC ID nº 135 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 774 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 136 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 258 de la secuencia SEC ID nº 6,
    ** el fragmento SEC ID nº 137 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 21, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 138 correspondiente al fragmento de la región SR de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 22,
    ** el fragmento SEC ID nº 139 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 29, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 140 correspondiente al fragmento de la región SR de ST3GalII de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    el fragmento SEC ID nº 141 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 70 y 237 de la secuencia SEC ID nº 33, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 142 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 24 y 79 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    el fragmento SEC ID nº 143 delimitado por los nucleótidos situados entre las posiciones 61 y 201 de la secuencia SEC ID nº 37, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 144 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 21 y 67 de la secuencia SEC ID nº 38.
  10. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque:
    la secuencia de nucleótidos codificante de la región CT comprendida en el segundo ácido nucleico es seleccionada de entre:
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 49 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 42 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 49 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 50 correspondiente a la región CT de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 14 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 66 correspondiente a la región CT de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 22,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 24 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 73 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 74 correspondiente a la región CT de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 8 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 18 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 77 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 78 correspondiente a la región CT de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 6 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 21 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 81 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 82 correspondiente a la región CT de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 7 de la secuencia SEC ID nº 38,
    -
    la secuencia de nucleótidos codificante de la región TMD comprendida en el segundo ácido nucleico es seleccionada de entre:
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 91 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 43 y 105 de la secuencia SEC ID nº 5, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 91 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 92 correspondiente a la región TMD de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 15 y 35 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 21, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 107 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 108 correspondiente a la región TMD de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 22,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 25 y 84 de la secuencia SEC ID nº 29, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 115 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 116 correspondiente a la región TMD de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 9 y 28 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 19 y 69 de la secuencia SEC ID nº 33, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 120 correspondiente a la región TMD de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 7 y 23 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 correspondiente a la secuencia de nucleótidos delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 22 y 60 de la secuencia SEC ID nº 37, codificando dicha secuencia de nucleótidos SEC ID nº 123 la secuencia polipeptídica SEC ID nº 124 correspondiente a la región TMD de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 8 y 20 de la secuencia SEC ID nº 38,
    -
    la secuencia de nucleótidos codificante de la región SR o su fragmento comprendida en el segundo ácido nucleico es seleccionada de entre:
    *
    la secuencia SEC ID nº 129 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 130 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia SEC ID nº 131 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 109 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 132 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 37 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia SEC ID nº 133 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 420 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 134 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 140 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia SEC ID nº 135 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 106 y 774 de la secuencia SEC ID nº 5, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 136 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 258 de la secuencia SEC ID nº 6,
    *
    la secuencia SEC ID nº 137 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 21, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 138 correspondiente al fragmento de la región SR de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 22,
    *
    la secuencia SEC ID nº 139 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 85 y 138 de la secuencia SEC ID nº 29, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 140 correspondiente al fragmento de la región SR de rST3GalII delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 29 y 46 de la secuencia SEC ID nº 30,
    *
    la secuencia SEC ID nº 141 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 70 y 237 de la secuencia SEC ID nº 33, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 142 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 24 y 79 de la secuencia SEC ID nº 34,
    *
    la secuencia SEC ID nº 143 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 61 y 201 de la secuencia SEC ID nº 37, codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 144 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 21 y 67 de la secuencia SEC ID nº 38.
  11. 11.
    Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque CT, TMD, SR o péptidos de fragmento de SR comprendidos en el segundo ácido nucleico son secuencias homólogas obtenidas de la misma glucosiltransferasa nativa, siendo ésta última diferente de los péptidos en la glucosiltransferasa nativa a partir de la que se obtiene el fragmento de CD con actividad glucosiltransferasas óptima según la reivindicación 1.
  12. 12.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el segundo ácido nucleico se selecciona de entre las secuencias siguientes:
    -
    la secuencia SEC ID nº 145 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 222 de la secuencia SEC ID nº 5, que contiene las secuencias SEC ID nº 49, 91 y 129, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 146 correspondiente al fragmento de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6 y que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 130, respectivamente,
    -
    la secuencia SEC ID nº 147 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 420 de la secuencia SEC ID nº 5, que contiene las secuencias SEC ID nº 49, 91 y 133, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 148 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 140 de la secuencia SEC ID nº 6, y que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 134, respectivamente,
    -
    la secuencia SEC ID nº 149 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 774 de la secuencia SEC ID nº 5, que contiene las secuencias SEC ID nº 49, 91 y 135, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 150 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 258 de la secuencia SEC ID nº 6, y que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 136, respectivamente,
    -
    la secuencia SEC ID nº 151 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 138 de la secuencia SEC ID nº 21, que contiene las secuencias SEC ID nº 65, 107 y 137, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 152 correspondiente al fragmento de la región SR de hST3Gal III delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 46 de la secuencia SEC ID nº 22, y que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 108 y 138, respectivamente,
    -
    la secuencia SEC ID nº 153 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 138 de la secuencia SEC ID nº 29, que contiene las secuencias SEC ID nº 73, 115 y 139, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 154 correspondiente al fragmento de la región SR de ST3Gal III de rata delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 46 de la secuencia SEC ID nº 30, y que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 74, 116 y 140, respectivamente,
    -
    la secuencia SEC ID nº 155 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 237 de la secuencia SEC ID nº 33, que contiene las secuencias SEC ID nº 77, 119 y 141, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 156 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia II delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 79 de la secuencia SEC ID nº 34, y que contiene las regiones CT, TMD y SR de hST8Sia II correspondientes a las secuencias SEC ID nº 78, 120 y 142, respectivamente,
    -
    la secuencia SEC ID nº 157 delimitada por los nucleótidos situados entre las posiciones 1 y 201 de la secuencia SEC ID nº 37, que contiene las secuencias SEC ID nº 81, 123 y 143, y codificantes de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 158 correspondiente al fragmento de la región SR de hST8Sia IV delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 1 y 67 de la secuencia SEC ID nº 38, y que contiene las regiones CT, TMD y SR de hST8Sia IV correspondientes a las secuencias SEC ID nº 82, 124 y 144, respectivamente.
  13. 13.
    Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque los CT, TMD, SR o péptidos de fragmento de SR comprendidos en el segundo ácido nucleico son secuencias heterólogas obtenidas de glucosiltransferasas nativas diferentes.
  14. 14.
    Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el segundo ácido nucleico es la secuencia SEC ID nº 159 correspondiente a la fusión de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 177 que contiene las secuencias SEC ID nº 65 y SEC ID nº 107 codificantes de las regiones CT y TMD de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66 y SEC ID nº 108, respectivamente, con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 131 codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 132 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 37 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6, codificando dicha secuencia SEC ID nº 159 el polipéptido de fusión SEC ID nº 160 entre las regiones CT y TMD de hST3Gal III, por una parte, y el fragmento 37-74 de la región SR de hST6GalNAc I, por la otra.
  15. 15.
    Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el segundo ácido nucleico es la secuencia SEC ID nº 179 correspondiente a la fusión de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 65 codificante de la CT de hST3Gal III correspondiente a la secuencia SEC ID nº 66, con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 119 codificante de la región TMD de hST8Sia II correspondiente a la secuencia SEC ID nº 120 y con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 129 codificante de la secuencia polipeptídica SEC ID nº 130 correspondiente al fragmento de la región SR de hST6GalNAc I delimitada por los aminoácidos situados entre las posiciones 36 y 74 de la secuencia SEC ID nº 6, codificando dicha secuencia SEC ID nº 179 el polipéptido de fusión SEC ID nº 180 entre la región CT de hST3Gal III, la región TMD de hST8Sia II, y el fragmento 36-74 de la región SR de hST6GalNAc I.
  16. 16.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque comprende la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 como primer ácido nucleico, con un segundo ácido nucleico seleccionado de entre:
    -
    la secuencia SEC ID nº 145, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 161 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 162 que contiene las regiones de fragmento CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo Cterminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 147, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 163 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 164 que contiene las regiones de fragmento CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 134, respectivamente, unidas mediante un coector GS al fragmento mínimo Cterminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 149, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 165 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 166 que contiene las regiones de fragmento CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 136, respectivamente, unidas mediante un conector SR al fragmento mínimo Cterminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 151, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 167 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 168 que contiene las regiones de fragmento CT, TMD y SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 108 y 138, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo Cterminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 153, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 169 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 170 que contiene las regiones CT, TMD y SR de ST3Gal III de rata correspondientes a las secuencias SEC ID nº 74, 116 y 140, respectivamente, unidas mediante un conector SR al fragmento mínimo Cterminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 155, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 171 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 172 que contiene las regiones CT, TMD y SR de hST8Sia II correspondientes a las secuencias SEC ID nº 78, 120 y 142, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 157, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 173 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 174 que contiene las regiones CT, TMD y SR de hST8Sia IV correspondientes a las secuencias SEC ID nº 82, 124 y 144, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 159, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 175 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 176 que contiene las regiones CT y TMD de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66 y 108, y el fragmento 37-74 de la región SR de hST6GalNAc I correspondiente a la secuencia SEC ID nº 132, unidas mediante un coenctor GS al fragmento mínimo C-terminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
    -
    la secuencia SEC ID nº 179, conduciendo a la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 181 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 182 que contiene las regiones CT de hST3Gal III, la región TMD de hST8Sia II y el fragmento 36-74 de la región SR de hST6GalNAc I, correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 120 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90-406 del dominio CD de hST6Gal I,
  17. 17.
    Secuencias génicas codificantes de glucosiltransferasas quiméricas obtenidas según el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
  18. 18.
    Secuencias génicas según la reivindicación 17, seleccionadas de entre:
    -
    la secuencia SEC ID nº 161 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 162 que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 161 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 145,
    -
    la secuencia SEC ID nº 163 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 164 que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 134, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 163 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 147,
    -
    la secuencia SEC ID nº 165 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 166 que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST6GalNAc I correspondientes a las secuencias SEC ID nº 50, 92 y 136, respectivamente, unidas mediante un conector SR al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 165 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 149,
    -
    la secuencia SEC ID nº 167 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 168 que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 108 y 138,
    respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 167 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 151,
    -
    la secuencia SEC ID nº 169 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 170 que contiene las regiones de fragmentos CT, TMD y SR de rST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 74, 116 y 140, respectivamente, unidas mediante un conector SR al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 169 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 153,
    -
    la secuencia SEC ID nº 171 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 172 que contiene las regiones CT, TMD y SR de hST8Sia II correspondientes a las secuencias SEC ID nº 78, 120 y 142, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 171 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 155,
    -
    la secuencia SEC ID nº 173 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 174 que contiene las regiones CT, TMD y SR de hST8Sia IV correspondientes a las secuencias SEC ID nº 82, 124 y 144, respectivamente, unidas mediante un conector KL al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 173 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 157,
    -
    la secuencia SEC ID nº 175 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 176 que contiene las regiones CT y TMD de hST3Gal III correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66 y 108, respectivamente, y el fragmento 37 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I correspondiente a la secuencia SEC ID nº 132, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 175 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 159,
    -
    la secuencia SEC ID nº 181 codificante de la proteína de fusión SEC ID nº 182 que contiene la región CT de hST3Gal III, la región TMD de hST8Sia II y el fragmento 36 a 74 de la región SR de hST6GalNAc I, correspondientes a las secuencias SEC ID nº 66, 120 y 130, respectivamente, unidas mediante un conector GS al fragmento mínimo C-terminal 90 a 406 del dominio CD de hST6Gal I, correspondiendo dicha secuencia SEC ID nº 181 a la fusión de la secuencia SEC ID nº 43 y la secuencia SEC ID nº 179.
  19. 19.
    Vectores, tales como plásmidos, vectores víricos o bacterianos, que comprenden por lo menos una secuencia génica según la reivindicación 17 ó 18.
  20. 20.
    Células huésped, tales como células de levaduras, hongos, vegetales, de insecto, de ave, de mamífero o humanas, transformadas con por lo menos una secuencia génica según la reivindicación 17 ó 18, utilizando un vector según la reivindicación 19.
  21. 21.
    Utilización de por lo menos una secuencia génica según la reivindicación 17 ó 18, o de un vector según la reivindicación 19, para la transformación de células según la reivindicación 20, en el marco de la preparación de proteínas recombinantes de interés, siendo dicha proteína de interés seleccionada de entre hormonas, enzimas, factores de coagulación, antígenos carbohidratos/biomarcadores séricos, citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos o receptores.
  22. 22.
    Procedimiento para la preparación de proteínas recombinantes de interés que comprende la transformación de células según la reivindicación 20, con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de dichas proteínas recombinantes de interés.
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