ES2368285T3 - Nuevos genes que codifican nuevas enzimas proteolíticas. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado hibridable en condiciones muy restrictivas a polinucleótido SEC ID NO: 10 o a la secuencia SEC ID NO: 67, en el que dicho polinucleótido codifica una proteína que tiene actividad de proteasa.

Description

Nuevos genes que codifican nuevas enzimas proteolíticas

Campo de la invención

La invención se refiere a secuencias polinucleotídicas nuevamente identificadas que comprenden genes que

5 codifican nuevas proteasas aisladas de Aspergillus niger. La invención se refiere a la secuencia nucleotídica de longitud completa de los nuevos genes, a las secuencias de ADNc que comprenden las secuencias codificantes de longitud completa de las nuevas proteasas, así como a las secuencias de aminoácidos de las proteínas funcionales de longitud completa y fragmentos y variantes de las mismas. La invención también se refiere a métodos para usar estas enzimas en procesos industriales, y a métodos para diagnosticar infecciones fúngicas. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención, y células en las que una proteasa según la invención se modifica genéticamente para potenciar o reducir su actividad y/o nivel de expresión.

Antecedentes de la invención

Enzimas proteolíticas

Las proteínas se pueden considerar heteropolímeros que consisten en bloques constructores de aminoácidos

15 conectados mediante un enlace peptídico. La unidad repetitiva en las proteínas es el átomo de carbono alfa central con un grupo amino y un grupo carboxilo. Excepto para la glicina, una denominada cadena lateral de aminoácidos sustituye uno de los dos átomos de hidrógeno del carbono alfa que quedan. La cadena lateral de aminoácidos hace asimétrico al carbono alfa central. En general, en las proteínas se encuentra el enantiómero L del aminoácido. Los siguientes términos describen los diversos tipos de aminoácidos polimerizados. Péptidos son cadenas cortas de restos de aminoácidos con una secuencia definida. Aunque realmente no hay un máximo al número de restos, el término indica habitualmente una cadena cuyas propiedades están determinadas principalmente por su composición de aminoácidos y que no tiene una conformación tridimensional fija. El término polipéptido se usa habitualmente para las cadenas más largas, habitualmente de secuencia y longitud definidas, y en principio de la longitud apropiada para plegarse en una estructura tridimensional. Proteína se reserva para polipéptidos que aparecen de

25 forma natural y que muestran una estructura tridimensional definida. En el caso en el que la función principal de las proteínas sea catalizar una reacción química, habitualmente se denomina una enzima. Las proteasas son las enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace peptídico en (poli)péptidos y proteínas.

En condiciones fisiológicas, las proteasas catalizan la hidrólisis del enlace peptídico. La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (1984) ha recomendado usar el término peptidasa para el conjunto de hidrolasas del enlace peptídico (Subclase E.C 3.4.). Los términos proteasa y hidrolasa peptídica son sinónimos de peptidasa, y también se pueden usar aquí. Las proteasas comprenden dos clases de enzimas: las endopeptidasas y las exopeptidasas, que escinden enlaces peptídicos en puntos dentro de la proteína, y eliminan aminoácidos secuencialmente del término N o C respectivamente. Proteinasa se usa como sinónimo de endopeptidasa. El enlace peptídico se puede producir en el contexto de di-, tri-, tetrapéptidos, péptidos, polipéptidos o proteínas. En general, la

35 composición de aminoácidos de péptidos y polipéptidos naturales comprende 20 aminoácidos diferentes, que muestran la configuración L (excepto para la glicina, que no tiene ningún centro quiral). Sin embargo, la actividad proteolítica de las proteasas no está limitada a péptidos que contienen sólo los 20 aminoácidos naturales. También se pueden escindir enlaces peptídicos entre los denominados aminoácidos no naturales, así como enlaces peptídicos entre aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos. Algunas proteasas no aceptan los enantiómeros D de los aminoácidos en ciertas posiciones. En general, la notable estereoselectividad de las proteasas las hacen muy útiles en el proceso de la resolución química. Muchas proteasas muestran actividades secundarias interesantes, tales como actividad de esterasa, actividad de tiol esterasa y actividad de (des)amidasa. Estas actividades secundarias habitualmente no se limitan a aminoácidos solamente, y pueden ser muy útiles en bioconversiones en el área de productos químicos finos.

45 Hay un número de razones por las cuales las proteasas de hongos filamentosos, microorganismos eucariotas, son de particular interés. El proceso básico de escisión hidrolítica de enlaces peptídicos en las proteínas parece costosa y potencialmente perjudicial para un organismo si no se controla apropiadamente. Los límites deseados a la acción proteolítica se logran a través de la especificidad de proteinasas, mediante compartimentalización de proteasas y sustratos en la célula, a través de la modificación de los sustratos que permiten el reconocimiento por las proteasas respectivas, mediante regulación vía activación de cimógenos, y la presencia o ausencia de inhibidores específicos, así como a través de la regulación de la expresión génica de proteasas. En hongos, las proteasas también están implicadas en otros procesos celulares fundamentales, incluyendo el recambio proteico intracelular, el procesamiento, la translocación, la esporulación, la germinación y la diferenciación. De hecho, Aspergillus nidulans y Neurospora crassa se han usado como organismos modelo para analizar la base molecular de un abanico de

55 procesos fisiológicos y de desarrollo. Su genética permite el acceso directo a estudios bioquímicos y genéticos, en condiciones de nutrientes y de cultivo definidas. Además, se ha aislado un gran grupo de hongos patógenos para seres humanos, ganado y cosechas, y se ha sugerido que la proteolisis desempeña un papel en su patogenicidad (penetración del hospedante, mecanismos de defensa del hospedante opuestos y/o nutrición durante la infección). Las proteasas también se usan frecuentemente en procesos de laboratorio, clínicos e industriales; las proteasas

tanto microbianas como no microbianas se usan ampliamente en la industria alimentaria (cocción, elaboración de cerveza, fabricación de quesos, ablandamiento de la carne), en la industria del curtido, y en la fabricación de detergentes biológicos (Aunstrup, 1980). El interés comercial a la hora de explotar ciertos hongos filamentosos, especialmente los Aspergilli, como hospedantes para la producción de proteínas tanto homólogas como heterólogas también ha renovado recientemente los intereses en las proteasas fúngicas (van Brunt, 1986ab). Las proteasas provocan a menudo problemas en la expresión heteróloga y en la sobreexpresión homóloga de proteínas en hongos. En particular, la expresión heteróloga está impedida por la degradación proteolítica de los productos expresados por proteasas homólogas. Estos intereses comerciales han dado como resultado estudios detallados de espectros proteolíticos y construcción de cepas deficientes en proteasas, y han mejorado el conocimiento sobre la expresión y regulación de las proteasas en estos organismos. En consecuencia, existe una gran necesidad de identificar y eliminar nuevas proteasas en hongos filamentosos.

Los microorganismos tales como, por ejemplo, hongos son particularmente útiles en la producción a gran escala de proteínas. En particular, cuando tales proteínas se segregan al medio. Las enzimas proteolíticas desempeñan un papel en estos procesos de producción. Por otro lado, en general se necesitan enzimas proteolíticas particulares para el procesamiento apropiado de la proteína diana y el bienestar metabólico del hospedante de la producción. Por otro lado, la degradación proteolítica puede disminuir significativamente el rendimiento de las proteínas segregadas. Un mal plegamiento en la ruta de secreción puede conducir a la degradación mediante proteasas intracelulares. Esto puede ser un problema particular a la hora de producir proteínas heterólogas. Los detalles de los procesos proteolíticos, que son responsables de la degradación de las proteínas que se desvían del proceso secretor en hongos, no se conocen exactamente. En eucariotas, la degradación de las proteínas celulares se logra mediante un proteasoma, y habitualmente implica el marcado con ubiquitina de las proteínas a degradar. En hongos, las proteasas proteasómicas y vaculares son también candidatos probables para la degradación proteolítica de proteínas secretoras malamente plegadas. La degradación proteolítica es probablemente citoplásmica, pero no se pueden excluir proteasas residentes en el retículo endoplásmico. Desde el punto de vista de la mejora de la cepa del hospedante de producción, el sistema proteolítico puede ser una diana interesante para la manipulación genética y mejora de la cepa de producción. Copias adicionales de genes de proteasas, la sobreexpresión de ciertas proteasas, la modificación del control transcripcional, así como los procedimientos de eliminación para la supresión de genes de proteasas pueden proporcionar una idea más detallada de la función de una proteasa dada. La supresión de genes que codifican proteasas puede ser una estrategia valiosa para la mejora de la cepa del hospedante, a fin de mejorar el rendimiento de producción para proteínas homólogas así como heterólogas.

Las proteasas microbianas eucariotas han sido revisadas por North (1982). Más recientemente, Suarez Rendueles y Wolf (1988) han repasado las proteasas de S. cerevisiae y su función.

Aparte de la escisión hidrolítica de los enlaces, las proteasas también se pueden aplicar en la formación de enlaces. Enlaces, en este aspecto, comprenden no sólo enlaces peptídicos y amídicos, sino también enlaces de tipo éster. El hecho de que una proteasa catalice la escisión o la formación de un enlace particular depende en primer lugar de la termodinámica de la reacción. Una enzima tal como una proteasa no afecta el equilibrio de la reacción. El equilibrio depende de las condiciones particulares bajo las que se produce la reacción. En condiciones fisiológicas, la termodinámica de las reacciones favorece la hidrólisis del péptido, debido a la estructura termodinámicamente muy estable del producto zwitteriónico. Mediante la aplicación de principios físico-químicos a la influencia del equilibrio, o manipulando las concentraciones o la naturaleza de los agentes reaccionantes y productos, o explotando los parámetros cinéticos de la reacción enzimática, es posible aplicar proteasas con el fin de sintetizar enlaces peptídicos. La adición de disolventes orgánicos miscibles con agua disminuye el grado de ionización del componente carboxílico, incrementando de ese modo la concentración de sustrato disponible para la reacción. A menudo se emplean sistemas bifásicos, miméticos acuosos, micelas inversas, medios anhidros, o grupos amino y carboxilo modificados para invocar la precipitación de productos para mejorar los rendimientos. Cuando están disponibles las proteasas con las propiedades correctas, la aplicación de proteasas para la síntesis ofrece ventajas sustanciales. Puesto que las proteasas son estereoselectivas así como regioselectivas, los grupos sensibles en los agentes reaccionantes habitualmente no necesitan protección, y los agentes reaccionantes no necesitan ser ópticamente puros. Puesto que las condiciones de la síntesis enzimática son suaves, se puede evitar la racemización y descomposición de agentes reaccionantes o productos lábiles. Aparte de los enlaces entre aminoácidos, también otros compuestos que presentan un grupo amino primario, un grupo tiol o un grupo carboxilo se pueden enlazar mediante proteasas apropiadamente seleccionadas. Además, se pueden sintetizar ésteres, ésteres de tiol, y amidas, mediante ciertas proteasas. Se ha demostrado que la proteasa presenta regioselectividad en la acilación de mono-, di- y trisacáridos, nucleósidos, y riboflavina. Mediante la formulación apropiada, se pueden evitar problemas con la estabilidad en las condiciones de reacción algunas veces duras. El encapsulamiento y la inmovilización no sólo estabilizan enzimas, sino también permiten la recuperación y separación fáciles a partir del medio de reacción. La reticulación amplia, el tratamiento con aldehídos, o el recubrimiento de la superficie con ciertos polímeros, tales como dextranos, polietilenglicol, poliiminas, pueden prolongar sustancialmente el tiempo de vida del biocatalizador.

Los papeles naturales de las proteasas

Tradicionalmente, las proteasas se han considerado como enzimas degradantes, capaces de escindir proteínas en pequeños péptidos y/o aminoácidos, y cuyo papel es digerir la proteína nutriente o participar en el recambio de las proteínas celulares. Además, se ha demostrado que las proteasas también desempeñan papeles importantes en una

amplia variedad de procesos celulares, vía mecanismos de modificación selectiva mediante proteolisis limitada, y de este modo pueden tener funciones reguladoras esenciales (Holzer y Tschensche 1979; Holzer y Heinrich, 1980). Se supone que la especificidad de una proteinasa está estrechamente relacionada con su función fisiológica y su modo de expresión. Con respecto a la función de una proteasa particular, su localizaciones es a menudo muy importante; por ejemplo, una gran cantidad de las proteasas vacuolares y periplásmicas están implicadas en la degradación proteica, mientras que muchas de las proteasas unidas a la membrana son importantes en el procesamiento proteico (Suarez Rendueles y Wolf, 1988). Los diferentes papeles de las proteasas en muchos procesos celulares se pueden dividir en cuatro funciones principales de las proteasas: 1) degradación proteica, 2) procesamiento posttraduccional e (in)activación de proteínas específicas, 3) morfogénesis, y 4) patogénesis.

Un papel obvio para las proteasas en organismos que utilizan proteína como fuente nutriente está en la hidrólisis de los nutrientes. En hongos, esto implicaría la degradación fuera de las células mediante proteasas de amplia especificidad extracelulares. La degradación proteica también es importante para el recambio rápido de las proteínas celulares, y permite que las células eliminen proteínas anormales y adapten su complemento de proteína a las condiciones fisiológicas cambiantes. Generalmente, las proteasas de especificidad más bien amplia deberían ser extremadamente bien controladas a fin de proteger a la célula de la degradación aleatoria de proteínas diana distintas de las correctas.

Contrariamente a la hidrólisis, la síntesis de polipéptidos se produce in vivo mediante un proceso conducido por ATP en el ribosoma. A fin de cuentas, la secuencia en la que se enlazan los aminoácidos está dictada por la información derivada del genoma. Este proceso se conoce como transcripción. Los productos primarios de la traducción son a menudo más largos que los productos funcionales finales, y después de la transcripción habitualmente se necesita un procesamiento adicional de tales proteínas precursoras mediante proteasas. Las proteasas desempeñan un papel clave en la maduración de tales proteínas precursoras para obtener la proteína funcional final. En contraste con el recorte y remodelado muy controlados de las proteínas, las proteasas pueden ser también muy destructivas, y pueden degradar completamente polipéptidos en péptidos y aminoácidos. A fin de evitar que la actividad proteolítica se dispare antes de lo necesario, las proteasas se someten a una intensa regulación. Muchas proteasas se sintetizan como precursores más grandes, conocidos como cimógenos, que se activarán cuando se necesite. De forma notable, esta activación siempre se produce mediante proteolisis. Aparte de la implicación directa en el procesamiento, la activación e inactivación selectivas de proteínas individuales son fenómenos bien conocidos catalizados por proteasas específicas.

La selectividad de la proteolisis limitada parece residir más directamente en la interacción proteinasa-sustrato. La especificidad puede derivar de la enzima proteolítica, que sólo reconoce secuencias diana de aminoácidos específicas. Por otro lado, pueden ser el resultado de la exposición selectiva del “sitio de procesamiento” en ciertas condiciones, tales como pH, fuerza iónica o modificaciones secundarias, permitiendo así que una proteasa de otro modo no específica catalice un suceso muy específico. Un ejemplo de este último tipo lo da la activación de cimógenos vaculares por proteolisis limitada.

La morfogénesis o diferenciación se puede definir como una serie regulada de sucesos que conducen a cambios de un estado a otro en un organismo. Aunque en muchos casos no se podrían establecer relaciones directas entre proteasas y efectos morfológicos, los signos presentes sugieren una implicación significativa de las proteasas en la morfogénesis fúngica; aparte del recambio proteico amplio observado durante la diferenciación, esporulación, y germinación de las esporas, se piensa que las proteasas están implicadas directamente en procesos normales como la ramificación de la punta hífica y formación del tabique (Deshpande, 1992).

Las especies de Aspergillus, en particular A. fumigatus y A. flavus, han estado implicadas como agentes etiológicos de un número de enfermedades en seres humanos y animales, denominadas aspergilosis (Bodey y Vartivarian, 1989). Se ha sugerido repetidamente que las proteasas están implicadas en la virulencia de A. fumigatus y A. flavus, puesto que hay muchos estudios que relacionan las proteasas segregadas y la virulencia de las bacterias. De hecho, la mayoría de las infecciones humanas debidas a la especie Aspergillus se caracterizan por una degradación amplia del parénquima del pulmón, que está compuesto principalmente de colágeno y elastina (Campbell et al., 1994). La investigación se ha centrado en el papel putativo de las proteasas segregadas en la virulencia de A. fumigatus y A. flavus, que son los patógenos humanos principales y se sabe que poseen actividades elastinolítica y colagénica (Kolattukudy et al., 1993). Se demostró que estas actividades elastinolíticas se correlacionan in vitro con la infectividad en ratones (Kothary et al., 1984). Se sabe que dos proteasas segregadas son producidas por A. fumigatus y A. flavus, una serina proteasa alcalina (ALP) y una metaloproteasa neutra (MEP). En, A. fumigatus, los dos genes que codifican estas proteasas, se aislaron, caracterizaron y rompieron (Reicherd et al, 1990; Tang et al, 1992, 1993; Jaton-Ogay et al., 1994). Sin embargo, mutantes dobles alp mep no mostraron diferencias en la patogenicidad cuando se compararon con cepas de tipo salvaje. Por lo tanto, se debe de concluir que las proteasas de A. fumigatus segregadas identificadas in vitro no son factores esenciales para la invasión de tejido (Jaton Ogay et al., 1994). Aunque A. fumigatus da cuenta sólo de una pequeña proporción de las esporas del moho portadas por el aire, es el hongo aislado más frecuentemente del pulmón y del esputo (Schmitt et al., 1991). Otras explicaciones para la virulencia del hongo podría ser que las condiciones en los bronquios (temperatura y nutrientes) sean favorables para el crecimiento parasitario de A. fumigatus. Como consecuencia, la aspergilosis invasiva podría ser un suceso circunstancial, cuando las defensas patógenas del hospedante se han debilitado por tratamientos inmunosupresores o enfermedades como SIDA.

Se conocen cuatro clases importantes de proteasas, y se designan por los grupos funcionales principales en su sitio activo: las “serina”, las “tiol” o “cisteína”, las “aspártico” o “carboxil” y las “metalo” proteasas. En Methods in Enzymology parte 244 y 248 (A.J. Barrett ed., 1994 y 1995) se puede encontrar un repaso detallado del estado de la técnica de estas clases principales de proteasas, clases minoritarias y proteasas sin clasificar.

Especificidad de las proteasas

Aparte de la maquinaria catalítica de las proteasas, otro aspecto importante de las enzimas proteolíticas es la especificidad de las proteasas. La especificidad de una proteasa indica qué sustratos es probable que hidrolice la proteasa. Los veinte aminoácidos naturales ofrecen un gran número de posibilidades para construir péptidos. Por ejemplo, con veinte aminoácidos, se pueden construir alrededor de 400 dipéptidos y 800 tripéptidos diferentes, etc. Con péptidos más largos, el número de posibilidades será casi ilimitado. Ciertas proteasas hidrolizan sólo secuencias particulares en una posición muy específica. La interacción de la proteasa con el sustrato peptídico puede englobar uno hasta diez restos de aminoácidos del sustrato peptídico. Con sustratos proteinosos grandes, puede haber incluso más restos del sustrato que interaccionen con las proteasas. Sin embargo, esto implica probablemente interacciones menos específicas con restos de proteasas fuera de la hendidura de unión del sitio activo. En general, el reconocimiento específico está restringido al péptido lineal, que se une al sitio activo de la proteasa.

La nomenclatura para describir la interacción de un sustrato con una proteasa ha sido introducida en 1967 por Schechter y Berger (Biochem. Biophys. Res. Com., 1967, 27, 157-162), y ahora se usa ampliamente en la bibliografía. En este sistema, se considera que los restos de aminoácidos del sustrato polipeptídico se unen a los denominados subsitios en el sitio activo. Por convención, estos subsitios en la proteasa se denominan S (para subsitios), y los restos de aminoácidos correspondientes se denominan P (por péptido). Los restos de aminoácidos del lado N-terminal del enlace escindible se numeran P3, P2, P1, y aquellos restos del lado C-terminal se numeran P1’, P2’, P3’. Los restos de P1 o P1’ son los restos de aminoácidos situados cerca del enlace escindible. Los restos del sustrato alrededor del sitio de escisión se pueden numerar entonces hasta P8. Los subsitios correspondientes en la proteasa que complementan a los restos de unión del sustrato se numeran S3, S2, S1, S1’, S2’, S3’, etc. Las preferencias de los subsitios en el sitio de unión al péptido determinan la preferencia de la proteasa para escindir ciertas secuencias de aminoácidos específicas en un punto particular. La secuencia de aminoácidos del sustrato se debería conformar con las preferencias mostradas por los subsitios. La especificidad por un cierto sustrato depende claramente tanto de la afinidad de unión por el sustrato como por la velocidad a la que subsiguientemente se hidroliza el enlace escindible. Por lo tanto, la especificidad de una proteasa por cierto sustrato está indicada habitualmente por su relación kcat/Km, mejor conocida como la constante de especificidad. En esta constante de especificidad, kcat representa la velocidad de recambio, y Km es la constante de disociación.

Aparte de los restos de aminoácidos implicados en la catálisis y unión, las proteasas contienen muchos otros restos de aminoácidos esenciales. Algunos restos son críticos en el plegamiento, algunos restos mantienen la arquitectura tridimensional global de la proteasa, algunos restos pueden estar implicados en la regulación de la actividad proteolítica, y algún resto puede dirigir a la proteasa hacia una localización particular. Muchas proteasas contienen, fuera del sitio activo, uno o más sitios de unión para iones metálicos. Estos iones metálicos desempeñan a menudo un papel en la estabilización de la estructura. Además las proteasas microbianas eucariotas segregadas se pueden glucosilar ampliamente. Se produce tanto en la glucosilación enlazada mediante N como mediante O. La glucosilación puede ayudar al plegamiento de las proteínas, puede incrementar la solubilidad, prevenir la agregación y, como tal, estabilizar la proteína madura. Además, el grado de glucosilación puede influir en la secreción así como en la unión a agua por la proteína.

Regulación de la actividad proteolítica

Un número sustancial de proteasas están sometidas a regulación amplia de la actividad proteolítica a fin de evitar daño proteolítico indeseado. Hasta cierto grado, esta regulación tiene lugar a nivel transcripcional. Por ejemplo, en hongos, parece que la transcripción de genes de proteasas segregados es sensible a fuentes externas de carbono y nitrógeno, mientras que los genes que codifican proteasas intracelulares son insensibles. El pH extracelular es sentido por los hongos, y algunos genes están regulados por el pH. En este proceso, las proteínas reguladoras transcripcionales desempeñan un papel crucial. A menudo, el procesamiento proteolítico de tales proteínas reguladoras es el interruptor que enciende o apaga a las proteínas reguladoras.

Las proteasas están sometidas a regulación intra- así como intermolecular. Esto implica ciertos aminoácidos en la molécula enzimática proteolítica que son esenciales para tal regulación. Las proteasas se sintetizan típicamente como precursores más grandes, conocidos como cimógenos, que son catalíticamente inactivos. Habitualmente, la extensión de la cadena peptídica que hace inactiva a la proteasa precursora está localizada en el término amino de la proteasa. El precursor se conoce mejor como pro-proteína. Puesto que muchas de las proteasas procesadas de esta manera son segregadas desde las células, contienen además una secuencia señal (presecuencia), de manera que el precursor completo se sintetiza como una pre-pro-proteína. Aparte de hacer inactiva a la proteasa, el propéptido es a menudo esencial para mediar el plegamiento productivo. Los ejemplos de proteasas incluyen serina proteasas (proteasa lítica alfa, subtilisina, acualisina, prohormona convertasa), tiol proteasas (catepsina L y cruciano), proteasas aspárticas (proteinasa A y catepsina D), y metaloproteasas. Además, el pro-péptido puede

desempeñar un papel en el transporte celular, ya sea solo o conjuntamente con péptidos señal. Esto puede facilitar la interacción con chaperonas celulares, o puede facilitar el transporte a lo largo de la membrana. El tamaño de la extensión en la pre-pro-proteína precursora puede variar sustancialmente, oscilando desde un fragmento peptídico corto hasta un polipéptido, que puede existir como una unidad de plegamiento autónoma. En particular, a menudo se observa que estas extensiones más grandes son inhibidores potentes de la proteasa, incluso después de la escisión a partir de la proteasa. Se observó que, incluso después de la escisión, tales pro-péptidos podrían ayudar en el plegamiento apropiado de las proteasas. Como tales, se podría considerar que los pro-péptidos funcionan como chaperonas moleculares, y la coexpresión separada o adicional de tales pro-péptidos podría ser ventajosa para la producción de proteasas.

Hay una diferencia sustancial en el nivel de regulación entre proteasas que son segregadas en el medio y proteasas que quedan intracelularmente. Las proteasas segregadas en el medio habitualmente ya no están sujetas, después de la activación, a control, y por lo tanto son habitualmente relativamente simples en su arquitectura molecular, que consiste en un módulo globular. Las proteasas intracelulares están sujetas necesariamente a control continuo, a fin de evitar el daño a las células. En contraste con cimógenos de proteasas segregadas, en proteasas reguladoras más complejas se pueden insertar segmentos polipeptídicos muy grandes entre la señal y el dominio de activación del cimógeno del módulo proteolítico. Estudios de estructura-función indican que tales partes no proteásicas pueden estar implicadas en interacciones con estructuras macroscópicas, membranas, cofactores, sustratos, efectores, inhibidores, iones, que regulan la actividad y activación del módulo o módulos proteolíticos o su (sus) cimógeno(s). Los módulos no proteolíticos presentan una notable variación en tamaño y estructura. Muchos de los módulos pueden existir como tales, independientemente del módulo proteolítico. Por lo tanto, se puede considerar que tales módulos corresponden a unidades estructurales y funcionales independientes que son autónomas con respecto al plegamiento. El valor de tal organización modular es que la adquisición de nuevos módulos puede dotar a la proteasa receptora de recientes especificidades de unión noveles, y puede conducir a cambios drásticos en su actividad, regulación y selección de dianas. El principio de enzimas proteolíticas organizadas modulares también se puede explotar aplicando herramientas de biología molecular a fin de crear nuevas interacciones, regulación, especificidad, y/o selección de dianas mediante el barajado de módulos. Aunque en general tales módulos adicionales se observan como extensión N o C terminal, también se han observado grandes inserciones dentro de los bucles exteriores del dominio catalítico. Se cree que, también en este caso, el plegamiento principal de la proteasa representa todavía la topología esencial para formar una entidad proteolítica funcional, y que la inserción se puede considerar como una subestructura plegada sobre la superficie del módulo proteolítico.

Estructura molecular

En principio, la organización modular de proteínas más grandes es un tema general en la naturaleza. En particular dentro de las redes multimodulares más grandes, los módulos proteolíticos típicos muestran tamaños de 100 a 400 aminoácidos de media. Esto se corresponde con el tamaño medio de la mayoría de las enzimas proteolíticas globulares que son segregadas al medio. Como se explica anteriormente, los módulos polipeptídicos son fragmentos polipeptídicos, que se pueden plegar y funcionar como entidades independientes. Otro término para tales módulos es dominios. Sin embargo, el dominio se usa en un contexto más amplio que el módulo. El término dominio, como se usa aquí, se refiere habitualmente a una parte de la cadena polipeptídica que representa en la estructura tridimensional una topología de plegamiento típica. En una proteína, los dominios interaccionan en grados variables, pero de forma menos frecuente que lo que lo hacen los elementos estructurales dentro de los dominios. También se usan en la bibliografía otros términos tales como subdominio y unidad de plegamiento. Como tal, se observa que muchas proteínas que comparten una funcionalidad particular pueden compartir los mismos dominios. Tales dominios se pueden reconocer a partir de la estructura primaria, que puede mostrar ciertos patrones de secuencia, que son típicos para un dominio particular. Ejemplos típicos son el plegamiento de unión a mononucleótidos, dominios de unión a celulosa, el motivo de unión a ADN de hélice-vuelta-hélice, dedos de cinc, manos de EF, anclajes de membrana. Los módulos se refieren a aquellos dominios que se espera que sean capaces de plegarse y funcionar de forma autónoma. La persona experta en la técnica sabe cómo identificar dominios particulares en una estructura primaria aplicando software de ordenador disponible habitualmente a dicha estructura y secuencias homólogas procedentes de otros organismos o especies.

Aunque las proteínas multimodulares o multidominios pueden parecer como una cadena de perlas, se han observado montajes de arquitectura más compleja sustancial. En el caso en el que las diversas perlas residan en la misma cadena polipeptídica, las perlas se denominan generalmente módulos o dominios. Cuando las perlas no residen en una misma cadena polipeptídica, sino que forman montajes vía interacciones no covalentes, entonces se usa el término subunidad para designar a la perla. Las subunidades se pueden transcribir por un mismo gen, o por diferentes genes. La proteína multimodular se puede procesar proteolíticamente después de la transcripción, conduciendo a múltiples subunidades. Las subunidades individuales pueden consistir en múltiples dominios. Típicamente, las proteínas globulares más pequeñas de 100-300 aminoácidos consisten habitualmente sólo en un dominio.

Clasificación molecular de las enzimas proteolíticas

En general, las proteasas se clasifican según sus propiedades moleculares, o según sus propiedades funcionales. La clasificación molecular se basa en la estructura primaria de la proteasa. La estructura primaria de una proteína

representa su secuencia de aminoácidos, que puede derivar de la secuencia nucleotídica del gen correspondiente. El rastreo extensivo de las similitudes en las estructuras primarias puede permitir la observación de similitudes en el mecanismo catalítico y otras propiedades, las cuales se pueden extender incluso a propiedades funcionales. El término familia se usa para describir un grupo de proteasas que muestran una relación evolutiva basándose en la similitud entre sus estructuras primarias. Se cree que los miembros de tal familia han surgido mediante evolución divergente a partir del mismo ancestro. Dentro de una familia, el subagrupamiento adicional de las estructuras primarias basado en un refinamiento más detallado de las comparaciones de las secuencias da como resultado subfamilias. La clasificación según el plegamiento tridimensional de las proteasas puede comprender la estructura secundaria, la estructura terciaria y la estructura cuaternaria. En general, la clasificación en la estructura secundaria está limitada al contenido y a la orientación gruesa de elementos de la estructura secundaria. Las similitudes en la estructura terciaria han conducido al reconocimiento de superfamilias o clanes. Una superfamilia o un clan es un grupo de familias que se piensa que tiene un ancestro común, puesto que muestran un plegamiento tridimensional común. En general, la estructura terciaria está más conservada que la estructura primaria. Como consecuencia, la similitud de la estructura primaria no siempre refleja propiedades funcionales similares. De hecho, las propiedades funcionales pueden haber divergido sustancialmente, dando como resultado nuevas propiedades interesantes. En el presente, la estructura cuaternaria no se ha aplicado para clasificar diversas proteasas. Esto puede ser debido a cierto sesgo de las bases de datos estructurales con respecto a proteasas globulares simples. Es probable que muchos sistemas proteolíticos que están sujetos a activación, regulación, o a cascadas de reacciones complejas, consistan en múltiples dominios o subunidades. Los temas generales en la organización estructural de tales sistemas de proteasas pueden conducir a nuevos tipos de clasificación.

Clasificación según la especificidad

En ausencia de la información de secuencia, las proteasas se han sometido a diversos tipos de clasificación funcional. La clasificación y nomenclatura de las enzimas mediante referencia a las reacciones que son catalizadas es un principio general en la nomenclatura enzimática. Este enfoque es también el principio subyacente de la numeración EC de las enzimas (Enzyme Nomenclature 1992 Academic Press, Orlando). En la Enzyme Nomenclature 1992 se pueden reconocer dos tipos de proteasas (EC 3.4): las de las exopeptidasas (EC 3.4.11-19), y las de las endopeptidasas (EC 3.4.21-24, 3.4.99). Las endopeptidasas escinden enlaces peptídicos en las regiones internas de la cadena peptídica, lejos de los términos. Las exopeptidasas escinden sólo restos de los extremos de la cadena peptídica. Las exopeptidasas que actúan en el término N libre pueden liberar un único resto de aminoácido, un dipéptido o un tripéptido, y se denominan respectivamente aminopeptidasas (EC 3.4.11), dipeptidil peptidasas (EC 3.4.14) y tripeptidil peptidasa (EC 3.3.14). Las proteasas que comienzan el procesamiento peptídico a partir del término carboxilo, que liberan un único aminoácido, se denominan carboxipeptidasas (EC 3.4.16-18). Las peptidil dipeptidasas (EC 3.4.15) eliminan un dipéptido del término carboxilo. La exo- y endopeptidasa en conjunto son las dipeptidasas (EC 3.4.13), que escinden específicamente sólo dipéptidos en sus dos mitades de aminoácidos. Las omega peptidasas (EC 3.4.19) eliminan restos terminales que están sustituidos, son cíclicos, o están enlazados mediante enlaces isopeptídicos.

Aparte de la posición en la que la proteasa escinde una cadena peptídica, para cada tipo de proteasa es posible una división adicional basada en la naturaleza de los restos de aminoácidos preferidos en el sustrato. En general, se pueden distinguir proteasas con una especificidad amplia, media y estrecha. Algunas proteasas se denominan simplemente después de las proteínas o polipéptidos específicos que hidrolizan, por ejemplo queratinasa, colagenasa, elastasa. Se puede fijar una especificidad estrecha a un aminoácido particular o a una secuencia particular, que se elimina o que se escinde respectivamente. Cuando la proteasa muestra una preferencia particular por un aminoácido en la posición P1 o P1’, el nombre de este aminoácido puede ser un calificador. Por ejemplo, la prolil amino peptidasa elimina prolina del término amino de un péptido (la prolina es el resto P1). Se usa X-Pro o prolina cuando se escinde el enlace en el lado imino de la prolina (la prolina es el resto P1’); por ejemplo, la prolina carboxipeptidasa elimina prolina del término carboxilo. La prolil endopeptidasa (o Pro-X) escinde detrás de la prolina, mientras que la prolina endopeptidasa (X-Pro) escinde antes de una prolina. El resto de aminoácido delante de el enlace peptídico escindible se refiere al resto de aminoácido que aporta el grupo carboxilo al enlace peptídico. El resto de aminoácido detrás del enlace peptídico escindible se refiere al resto de aminoácido que aporta el grupo amino al enlace peptídico. Según la convención general, una cadena de aminoácidos va desde el término amino (el principio) al término carboxilo (el final), y se numera en consecuencia. Las endoproteasas también pueden mostrar una clara preferencia por un aminoácido particular en la posición P1 o P1’, por ejemplo glicil endopeptidasa, peptidillisina endopeptidasa, glutamil endopeptidasa. Además, las proteasas pueden mostrar una preferencia por cierto grupo de aminoácidos que comparten un cierto parecido. Tal grupo de aminoácidos preferidos puede comprender los aminoácidos hidrófobos, sólo los aminoácidos hidrófobos voluminosos, aminoácidos hidrófobos pequeños, o sólo aminoácidos pequeños, aminoácidos grandes cargados positivamente, etc. Aparte de las preferencias por los restos de P1 y P1’, también pueden existir preferencias o exclusiones particulares por restos preferidos por otros subsitios en la proteasa. Tales preferencias múltiples pueden dar como resultado proteasas que son muy específicas para sólo aquellas secuencias que satisfacen múltiples requisitos de unión al mismo tiempo. En general, se debería observar que las proteasas son enzimas más bien promiscuas. Incluso una proteasa muy específica puede escindir péptidos que no cumplen con la preferencia generalmente observada de la proteasa. Además, se debería observar que las condiciones medioambientales tales como pH, temperatura, fuerza iónica, actividad acuosa, preferencia de disolventes, presencia de sustratos o inhibidores competidores, pueden influir en las preferencias de las proteasas.

La condición medioambiental puede no sólo influir en la proteasa, sino también influir en la forma en la que se presente el sustrato proteinoso a la proteasa.

Clasificación mediante mecanismo catalítico

Las proteasas se pueden subdividir basándose en su mecanismo catalítico. Se debería entender que para cada

5 mecanismo catalítico, la clasificación anterior basada en la especificidad conduce a una subdivisión adicional para cada tipo de mecanismo. Se conocen cuatro clases importantes de proteasas, y se designan por el grupo funcional principal en el sitio activo: las serina proteasas (endopeptidasa EC 3.4.21, carboxipeptidasa EC 3.4.16), las tiol o cisteína proteasas (endopeptidasa EC 3.4.22, carboxipeptidasa EC 3.4.18), las carboxil o aspártico proteasas (endopeptidasa EC 3.4.23), y las metaloproteasas (endopeptidasa EC 3.4.24, carboxipeptidasa EC 3.4.18). Hay inhibidores característicos de los miembros de cada tipo catalítico de proteasa. Estos pequeños inhibidores modifican irreversiblemente un resto de aminoácido del sitio activo de la proteasa. Por ejemplo, las serinas proteasas son inactivadas por fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) y fluorofosfato de diisopropilo (DFP), que reaccionan con la serina activa, mientras que los derivados de clorometilcetona reaccionan con la histidina de la tríada catalítica. El fosforamidón y 1,10-fenantrolina inhiben típicamente metaloproteasas. La inhibición por

15 pepstatina indica generalmente una proteasa aspártica. E64 inhibe específicamente la tiol proteasa. La amastatina y la bestatina inhiben diversas aminopeptidasas. Se observan variaciones sustanciales en la susceptibilidad de las proteasas a los inhibidores, incluso dentro de una clase catalítica. En cierto grado, esto puede estar relacionado con la especificidad de la proteasa. En el caso de que la arquitectura del sitio de unión evite que un inhibidor basado en el mecanismo se acerque al sitio catalítico, entonces tal proteasa escapa de la inhibición, y la identificación del tipo de mecanismo basado en la inhibición está prohibida. Chymostation, por ejemplo, es un potente inhibidor para serina proteasa, con especificidad similar a quimiotripsina; Elastatinal inhibe serina proteasas similares a elastasa, y no reacciona con tripsina o quimiotripsina; la 4-amido PMSF (APMSF) inhibe sólo serina proteasas con especificidad similar a tripsina. Informes extensos del uso de inhibidores en la clasificación de proteasas incluyen Barret y Salvesen, Proteinase Inhibitors, Elsevier Amstardam, 1986; Bond y Beynon (eds.), Proteolytic Enzymes, A Practical

25 Approach, IRL Press, Oxford, 1989; Methods in Enzymology, eds. E.J. Barret, volumen 244, 1994 y volumen 248, 1995; E. Shaw, Cysteinyl proteinases and their selective inactivation, Adv Enzymol. 63:271-347 (1990).

Clasificación según condiciones óptimas de comportamiento

El mecanismo catalítico de las proteasas, y el requisito de su integridad conformacional, determinan principalmente las condiciones en las que se puede utilizar la proteasa. Encontrar la proteasa que se comporta óptimamente en condiciones de aplicación es un reto importante. A menudo, las condiciones en las que han de funcionar las proteasas no son óptimas, y representan un compromiso entre las condiciones ideales para una aplicación particular y las condiciones que se adecuarían mejor a la proteasa. Aparte de las propiedades particulares de la proteasa, se debería observar que también la presentación de sustratos proteinosos depende de las condiciones, y como tal determina también qué condiciones son las más eficaces para la proteolisis. Las especificaciones para la enzima

35 que son relevantes para la aplicación comprenden, por ejemplo, la dependencia del pH, la dependencia de la temperatura, la sensibilidad a o la dependencia de iones metálicos, la fuerza iónica, la concentración de sal, la compatibilidad con disolventes. Otro factor de vital importancia es la actividad específica de una proteasa. Cuanta mayor sea la actividad específica de la enzima, se necesita menos enzima para una conversión específica. Menores requisitos de enzima implican menores costes y menores niveles de contaminación proteica.

El pH es un parámetro importante que determina el comportamiento de la proteasa en una aplicación. Por lo tanto, la dependencia del pH es un parámetro importante para agrupar a las proteasas. Los grupos principales que son reconocidos son las proteasas ácidas, las proteasas neutras, las proteasas alcalinas, y las proteasas muy alcalinas. El pH óptimo iguala sólo en cierto grado el mecanismo proteolítico; por ejemplo, la proteasa aspártica muestra a menudo un óptimo a pH ácido; las metaloproteasas y tiol proteasas a menudo se comportan óptimamente alrededor 45 de pH neutro a ligeramente alcalino; las serina peptidasas son principalmente activas en la región alcalina y muy alcalina. Para cada clase, se conocen excepciones. Además, también desempeña un papel la actividad acuosa global del sistema. El pH óptimo de una proteasa se define como el intervalo de pH en el que la proteasa muestra una velocidad óptima de hidrólisis para la mayoría de sus sustratos en un entorno particular en condiciones particulares. Este intervalo puede ser estrecho, por ejemplo una unidad de pH, así como bastante amplio, 3-4 unidades de pH. En general, el pH óptimo también depende de la naturaleza del sustrato proteinoso. Tanto la velocidad de recambio como la especificidad pueden variar en función del pH. Para cierta eficacia, puede ser deseable usar la proteasa lejos de su pH óptimo, debido a que se evita la producción de péptidos menos deseados. Los péptidos menos deseados pueden ser, por ejemplo, péptidos muy cortos, o péptidos que provocan un sabor amargo. Además, una especificidad más estrecha puede ser una razón para elegir condiciones que se desvían de

55 las condiciones óptimas con respecto a la velocidad de recambio. Dependiendo del pH, la especificidad puede ser estrecha, por ejemplo escindiendo sólo la cadena peptídica en una posición particular, o antes o después de un aminoácido particular, o puede ser más amplia, por ejemplo escindiendo una cadena en múltiples posiciones, o escindiendo antes o después de tipos más diferentes de aminoácidos. De hecho, la dependencia del pH puede ser una herramienta importante para regular la actividad proteolítica en una aplicación. En el caso de que el pH se desplace durante el proceso, la proteolisis puede cesar espontáneamente sin la necesidad de tratamiento adicional para inactivar la proteasa. En algunos casos, la propia proteolisis puede ser la conductora del desplazamiento de pH.

Muy crucial para la aplicación de proteasas es su estabilidad durante la manipulación y operación. Puesto que la estabilidad de la proteasa se ve fuertemente afectada por la temperatura de trabajo, la estabilidad también se denomina a menudo como termoestabilidad. En general, la estabilidad de una proteasa indica cuánto tiempo retiene una proteasa su actividad proteolítica en condiciones particulares. Las condiciones particulares pueden comprender condiciones de fermentación, condiciones durante el aislamiento y procesamiento aguas abajo de la enzima, condiciones de almacenamiento, condiciones formulación y de operación o aplicación. En el caso en el que las condiciones particulares engloben temperaturas elevadas, la estabilidad se refiere en general a termoestabilidad. Aparte de las causas generales para la inactivación enzimática, tales como modificación química, falta de plegamiento, agregación, etc., un problema principal con las proteasas es que se someten fácilmente a autodegradación. Especialmente para la utilización de proteasas, la temperatura óptima es un criterio relevante para agrupar a proteasas. Aunque hay diferentes definiciones, económicamente la definición más útil es la temperatura o el intervalo de temperaturas en el que la proteasa es más productiva en cierta aplicación. La productividad de la proteasa es una función tanto de la estabilidad como de la velocidad de recambio. Cuando la temperatura elevada en general incrementará la velocidad de recambio, la rápida inactivación contractuará el incremento en la velocidad de recambio, y finalmente conducirá a una baja productividad. La estabilidad conformacional de la proteasa bajo una condición del proceso dada determinará su temperatura máxima de funcionamiento. La temperatura a la que la proteasa pierde su conformación activa, a menudo indicado como pérdida de plegamiento o punto de fusión, se puede determinar según diversos métodos, por ejemplo RMN, espectroscopía de dicroísmo circular, calorimetría diferencial de barrido, etc. Para la proteasa, la pérdida de plegamiento viene acompañada habitualmente por un incremento tremendo en la velocidad de autodegradación.

En aplicaciones en las que se requieren temperaturas bajas, la proteasa se puede seleccionar con énfasis en una actividad intrínseca elevada a temperatura baja a moderada. Puesto que en tales condiciones la inactivación es relativamente lenta, en estas condiciones la actividad puede determinar enormemente la productividad. En procesos en los que se requiere una actividad de la proteasa sólo durante un corto período, se puede usar la estabilidad de la proteasa como un enchufe para apagar la proteasa. En tal caso, puede ser preferible una proteasa más lábil en lugar de una proteasa muy termoestable.

Otros parámetros medioambientales que pueden desempeñar un papel a la hora de seleccionar la proteasa apropiada pueden ser su sensibilidad a sales. La compatibilidad con iones metálicos que se encuentran frecuentemente en concentraciones bajas en diversos materiales naturales puede ser crucial para ciertas aplicaciones. En particular con metaloproteasas, ciertos iones pueden sustituir al ion metálico catalítico y reducir o incluso anular completamente la actividad. En algunas aplicaciones, los iones metálicos han de ser añadidos a propósito con el fin de evitar la eliminación por lavado de los iones metálicos coordinados a la proteasa. Es bien conocido que en aras de la estabilidad enzimática y tiempo de vida, se han de suministrar iones calcio a fin de evitar la disociación de calcio unido a proteína.

La mayoría de los microorganismos muestran una cierta tolerancia con respecto a la adaptación a cambios en la condición medioambiental. Como consecuencia, es probable que al menos el espectro proteolítico que el organismo es capaz de producir muestre al menos tolerancias similares. Tal espectro proteolítico puede ser cubierto por muchas proteasas que cubren juntas todo el espectro, o por sólo unas pocas proteasas de un amplio espectro. Teniendo en cuenta el espectro proteolítico completo de un microorganismo, puede ser muy importante tener en cuenta la localización.

Localización celular y caracterización del procesamiento y degradación proteolítica

Desde un punto de vista industrial, las proteasas que se excretan de la célula tienen ventajas específicas con respecto a la productividad a gran escala y a la tolerancia al estrés, puesto que tienen que sobrevivir sin la protección de la célula. El gran grupo de proteasa celular se puede subdividir además en soluble y unido a la membrana. Unido a la membrana puede comprender una proteasa en el interior así como en el exterior de la membrana. La proteasa soluble intracelular se puede subdividir además según compartimientos específicos de la célula en la que aparecen. Puesto que la célula protege a las proteasas en cierto grado del entorno, y debido a que la célula controla las condiciones en la célula, la proteasa intracelular puede ser más sensible a cambios medioambientales grandes, y sus óptimos se pueden correlacionar mejor con las condiciones intracelulares específicas. Conocer las condiciones del departamento celular en el que reside la proteasa puede indicar sus preferencias. Allí donde la proteasa extracelular en general no requiere ya ninguna otra regulación una vez excretada de la célula, las proteasas intracelulares a menudo se someten a un control y regulación más complicados.

Con respecto a la función de una proteasa particular, su localización es a menudo muy importante; por ejemplo, una gran cantidad de las proteasas vacuolares y periplásmicas están implicadas en la degradación proteica, mientras que muchas de las proteasas unidas a membrana son importantes en el procesamiento de proteínas (Suarez Rendueles y Wolf, 1988).

En van den Hombergh: Thesis Landbouwuniversiteit Wageningen: An analysis of the proteolytic system in Aspergillus in order to improve protein production ISBN 90-5485-545-2, se ha publicado un repaso amplio sobre las propiedades biológicas y la evolución de proteasas.

El problema de las proteasas

Una razón importante por el interés en proteasas microbianas es el problema de la expresión relacionada con proteasas observado en varios hospedantes de expresión usados en la industria del bioprocesamiento. El uso creciente de hospedantes heterólogos para la producción de proteínas, mediante tecnología de ADN recombinante, ha puesto recientemente este problema en el centro de atención, puesto que parece que las proteínas heterólogas son más tendentes a la proteolisis (Archer et al., 1992; van den Hombergh et al., 1996b).

En S. cerevisiae, ya a principios de los ochenta se reconoció el problema de las proteasas y la implicación de varias proteasas, complicando así los enfoques de ruptura de genes seleccionados como dianas para resolver este problema. Durante la secreción, una proteína se expone a varias actividades proteolíticas que residen en la ruta secretora. Adicionalmente, en un microorganismo prototrófico como Aspergillus, las proteínas segregadas se pueden exponer a varias actividades proteolíticas extracelulares.

El problema de la degradación de proteínas heterólogamente expresadas está bien documentado en Aspergillus (van den Hombergh Thesis Landbouwuniversiteit Wageningen: An analysis of the proteolytic system in Aspergillus in order to improve protein production ISBN 90-5485-545-2), y se ha dado a conocer en la expresión de proquimiosina de vaca, interferón D-2 humano, tPA, GMCSF, IL6, lactoferrina, lisozima de clara de huevo de pollo, PLA2 porcina, pectina liasa B de A. niger, enterotoxina B de E. coli y E-glucuronidasa, y pectato liasa 3 de Erwinia carotovora.

El problema de la proteolisis se puede resolver en diversas etapas en la producción proteica. Los ingenieros del bioproceso pueden resolver el problema de la proteolisis procesando aguas abajo a bajas temperaturas, mediante separación temprana de producto y proteasa o proteasas, o mediante uso de inhibidores de proteasas. Todo esto puede conducir a la reducción exitosa del problema. Sin embargo, ciertamente no está eliminado, debido a que gran parte de la degradación se produce in vivo durante la producción de la proteína.

A la hora de comprender cómo la proteolisis es controlada en la célula, una cuestión importante se refiere al mecanismo de reconocimiento mediante el cual se pone en marcha la proteolisis. En qué grado son reconocidas las proteínas proteolíticamente susceptibles (heterólogas) como aberrantes debido al plegamiento erróneo, o, si están correctamente plegadas, como “extrañas”, debido a que no poseen rasgos esenciales para estabilidad que son específicos del hospedante. Diversos tipos de estrés pueden provocar que la proteolisis global en una célula aumente significativamente. Los factores que se sabe que incrementan la velocidad de proteolisis incluyen la falta de nutrientes y otros diversos tipos de estrés (es decir, elevación de la temperatura, estrés osmótico, sustancias tóxicas, y expresión de ciertas proteínas heterólogas). Para manejar los problemas de la expresión relacionados con la proteolisis in vivo, varios enfoques han demostrado ser exitosos, como se explicará más abajo. Sin embargo, se tiene que tener en cuenta que las “células no proteolíticas” verdaderas no pueden existir, puesto que la proteolisis mediante proteasas intracelulares está implicada en muchas reacciones metabólicas y de “mantenimiento y conservación domésticos” esenciales. Por lo tanto, la reducción de la proteolisis será un proceso en el que se han de analizar los antecedentes genéticos cambiados que dan como resultado una proteolisis reducida, en busca de efectos secundarios potenciales que podrían conducir a una producción reducida de proteína (por ejemplo, velocidad reducida de crecimiento o esporulación reducida).

Ruptura de proteasas en hospedantes de expresión fúngicos filamentosos

Berka y colaboradores (1990) describen la clonación y ruptura del gen pepA de A. awamori. Más recientemente, se han descrito tres aspartil proteasas rotas en A. niger. Se describieron destructores para tanto las aspartil proteasas extracelulares principales como la aspartil proteasa vacuolar principal. Se generaron destructores dobles y triples vía recombinación, y se ensayaron en busca de los espectros de proteasas y la expresión y secreción de la proteína pectina liasa PELB de A. niger, que es muy susceptible a la degradación proteolítica (van den Hombergh et al., 1995). La ruptura de pepA y pepB dio como resultado la reducción en ambos casos de actividades de proteasas extracelulares, 80% y 6%, respectivamente. En el destructor 'pepE, también otras actividades de proteasas (vacuolares) se vieron afectadas de forma importante, provocado por la inactivación de la cascada proteolítica para otras proteasas vacuolares. Las actividades extracelulares reducidas se correlacionaron con la degradación in vitro reducida de PELB y la expresión in vivo mejorada de pelB (van den Hombergh et al., 1996f).

Hongos filamentosos con mutantes deficientes en proteasas (prt)

Se han estudiado varios mutantes deficientes en proteasas de Aspergillus para saber si se mejora la producción proteica. Archer y colaboradores describen la proteolisis reducida de lisozima de clara de huevo de gallina en sobrenadantes de un mutante prt doble de A. niger generado por Mattern y colaboradores (1992), y concluyen que, aunque la degradación no está ausente, está significativamente reducida. Van den Hombergh et al., (1995) muestran que la degradación in vitro de PELB de A. niger está reducida en los siete grupos de complementación de prt que han aislado. Virtualmente no se observa degradación en los mutantes prtB, prtF y prtG. Recientemente, se demostró que la expresión del gen pelB estaba mejorada en seis grupos de complementación ensayados (prtA-F), y se observaron los mayores niveles de expresión en los mutantes prtB, prtF y prtG. Además de los mutantes individuales, que contenían actividades proteolíticas extracelulares residuales que varían de 2-80% en comparación con la actividad de tipo salvaje, se generaron mutantes dobles tanto mediante recombinación como mediante rondas

adicionales de mutagénesis. Vía este enfoque, se seleccionaron varios mutantes de prt dobles y se caracterizaron posteriormente, lo que mostró una reducción adicional de la degradación de PELB en comparación con sus cepas parentales.

En lugar de eliminar las actividades de proteasas vía ruptura o mutagénesis, la proteolisis reducida también se puede lograr vía disminución de las actividades proteolíticas que interfieren. Esto se puede lograr alterando genéticamente el promotor u otras secuencias reguladoras del gen. Como se muestra mediante Fraissinet-Tachet y colaboradores (1996), las proteasas extracelulares en A. niger están todas reguladas por la represión del catabolito de carbono y la represión del metabolito de nitrógeno. La falta de nutrientes también provoca que aumente enormemente la velocidad global de proteolisis en una célula, lo que tiene sentido para una célula que carece de nutrientes pero que posee proteínas, que, en condiciones de hambruna, no son necesarios o sólo son necesarios en cantidades más pequeñas. En estrategias de expresión que permiten la expresión elevada en medios que contienen concentraciones elevadas de glucosa y amoníaco, se ha dado a conocer proteolisis reducida. Varios promotores glucolíticos constitutivos (gpd y pkiA) están muy expresados en estas condiciones, y también se pueden usar para conducir la expresión génica (heteróloga) en fermentaciones continuas. El tipo de falta de nutrientes impuesto puede influir en grados variables en las diferentes proteasas, lo que significa que la importancia de las condiciones del nutriente en un proceso dado depende del tipo de proteolisis que está implicado. Por lo tanto, se pueden inducir proteolisis específicas mediante condiciones de limitación de sustrato, que se usan frecuentemente en muchos procesos de fermentación a gran escala.

El problema de la proteasa se puede resolver actualmente en parte mediante una o más de las estrategias anteriores. Sin embargo, la actividad proteolítica residual de enzimas proteolíticas todavía no identificadas constituye aún un problema importante en la técnica. A fin de reducir adicionalmente el nivel de proteolisis indeseada, existe una gran necesidad en la técnica de identificar nuevas proteasas responsables de la degradación de proteínas expresadas homóloga y heterólogamente. Esta invención proporciona tales nuevas secuencias génicas de proteasas que codifican nuevas proteasas. Una vez que se conoce la secuencia primaria de una nueva proteasa, se puede emplear una o más de las estrategias de ADN recombinante anteriores para producir mutantes (carentes de un gen) con actividad proteolítica reducida.

A pesar de las aplicaciones ampliamente extendidas de las proteasas en un gran número de procesos industriales, las enzimas actuales también tienen puntos débiles significativos con respecto a al menos una de las siguientes propiedades.

Cuando se añaden al pienso animal, las proteasas actuales no son suficientemente resistentes a las enzimas digestivas presentes en el tubo digestivo (GI) de, por ejemplo, cerdos y aves de corral.

Con respecto a otro aspecto, las enzimas actualmente disponibles no son suficientemente resistentes a condiciones específicas de temperaturas (elevadas) y presiones (elevadas) que se aplican durante las operaciones de extrusión

o formación de peletes.

También, las enzimas actuales no son suficientemente activas en un intervalo de pH de 3-7, condiciones que prevalecen en muchos productos alimentarios, de bebidas, así como en el tubo digestivo de la mayoría de los animales.

Según todavía otro aspecto, la especificidad de las proteasas actualmente disponibles es muy limitada, lo que da como resultado la incapacidad de las enzimas existentes para degradar o disolver ciertas proteínas “resistentes a proteasas”, dando como resultado así rendimientos peptídicos o de aminoácidos bajos. Además, las proteasas con nuevas especificidades permiten la síntesis de nuevos péptidos.

Aún otro inconveniente de las enzimas actualmente disponibles es su baja actividad específica.

Por lo tanto, está claro que, para un gran número de aplicaciones, existe un fuerte deseo de proteasas que sean más resistentes a enzimas digestivas, a temperatura y/o presión elevada, y que muestren nuevas especificidades con respecto a sus sitios de hidrólisis. La presente invención proporciona tales enzimas.

Objeto de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos polinucleótidos que codifican nuevas proteasas. Un objeto adicional es proporcionar proteasas producidas natural y recombinantemente, así como cepas recombinantes que las producen. Tales cepas también se pueden usar para producir de forma más rápida o con mayores rendimientos productos clásicos de fermentación. Todavía otro objeto de la invención es proporcionar una cepa de hongo filamentoso que es defectuosa a la hora de producir una proteasa según la invención. Tales cepas se pueden usar para una producción más eficiente de proteínas heterólogas u homólogas. También los anticuerpos y polipéptidos de fusión son parte de la invención, así como métodos para obtener y usar los polinucleótidos y polipéptidos según la invención.

Sumario de la invención

La invención proporciona nuevos polinucleótidos que codifican nuevas proteasas.

Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica que se hibrida (preferiblemente en condiciones muy restrictivas) a una secuencia según una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 10 ó 67. En consecuencia, la invención proporciona ácidos nucleicos que tienen alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología con las secuencias según una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 10 ó 67.

En una realización más preferida, la invención proporciona tal polinucleótido aislado obtenible de un hongo filamentoso, preferiblemente Aspergilli, en particular se prefiere A. niger.

En una realización, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 124 o sus equivalentes funcionales.

En una realización preferida adicional, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido según una secuencia de SEC ID NO: 124 o sus equivalentes funcionales.

En una realización preferida, la invención proporciona un gen de proteasa según una secuencia de SEC ID NO: 10. En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido, preferiblemente un ADNc que codifica una proteasa de

A. niger de SEC ID NO: 67, o variantes o fragmentos de ese polipéptido. En una realización preferida, el ADNc tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 67 o sus equivalentes funcionales.

También se puede obtener un clon genómico que codifica un polipéptido según la invención seleccionando sondas adecuadas para amplificar específicamente una región genómica que corresponde a las secuencias según SEC ID NO: 10 o sus fragmentos, hibridando esa sonda en condiciones adecuadas a ADN genómico obtenido de un organismo adecuado, tal como Aspergillus, por ejemplo A. niger, amplificando el fragmento deseado, por ejemplo mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), seguido de la purificación y clonación del fragmento amplificado.

En incluso una realización preferida adicional, la invención proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de los polinucleótidos genómicos según la invención; se prefiere una secuencia polinucleotídica de SEC ID NO: 10.

En otra realización preferida, la invención proporciona un ADNc obtenible clonando y expresando una secuencia de SEC ID NO: 67 en un organismo hospedante adecuado, tal como A. niger.

También se puede obtener un polipéptido según la invención clonando y expresando una secuencia de SEC ID NO: 10 en un organismo hospedante adecuado, tal como A. niger.

La invención también se refiere a vectores que comprenden una secuencia polinucleotídica según la invención y cebadores, sondas y fragmentos que se pueden usar para amplificar o detectar el ADN según la invención.

En una realización preferida adicional, se proporciona un vector en el que la secuencia polinucleotídica según la invención está ligada funcionalmente con secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de la secuencia de aminoácidos codificada en una célula hospedante adecuada, tal como A. niger o A. oryzea. La invención también proporciona métodos para preparar polinucleótidos y vectores según la invención.

La invención también se refiere a células hospedantes producidas recombinantemente que contienen polinucleótidos heterólogos u homólogos según la invención.

En una realización, la invención proporciona células hospedantes recombinantes en las que la expresión de una proteasa según la invención está significativamente reducida, o en las que la actividad de la proteasa está reducida,

o en las que la proteasa está incluso inactivada. Tales recombinantes son especialmente útiles para la expresión de proteínas homólogas o heterólogas.

En otra realización, la invención proporciona células hospedantes recombinantes en las que la expresión de una proteasa según la invención está incrementada significativamente, o en las que la actividad de la proteasa está incrementada. Tales recombinantes son especialmente útiles para la expresión de proteínas homólogas o heterólogas en las que la maduración está seriamente impedida en el caso en el que la escisión proteolítica requerida se convierta en la etapa limitante de la velocidad.

En otra realización, la invención proporciona una célula hospedante producida recombinantemente que contiene ADN heterólogo u homólogo según la invención, preferiblemente ADN que codifica proteínas que poseen secuencias señal, y en la que la célula es capaz de producir una proteasa funcional según la invención, preferiblemente una célula capaz de sobreexpresar la proteasa según la invención, por ejemplo una cepa de Aspergillus que comprende un número creciente de copias de un gen o ADNc según la invención.

En otra realización, la invención proporciona una célula hospedante producida recombinantemente que contiene ADN heterólogo u homólogo según la invención, y en la que la célula es capaz de segregar una proteasa funcional según la invención, preferiblemente una célula capaz de sobreexpresar y segregar la proteasa según la invención, por ejemplo una cepa de Aspergillus que comprende un número creciente de copias de un gen o ADNc según la invención.

En todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido purificado. Los polipéptidos según la invención incluyen los polipéptidos codificados por los polinucleótidos según la invención. Se prefiere especialmente un polipéptido según una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 115 a SEC ID NO: 171 o sus equivalentes funcionales.

La invención también proporciona anticuerpos que reaccionan con un polipéptido según la invención. Estos anticuerpos pueden ser policlonales, aunque se prefiere especialmente que sean anticuerpos monoclonales. Tales anticuerpos son particularmente útiles para purificar los polipéptidos según la invención.

También están dentro del alcance de la invención las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido según la invención. La invención también proporciona métodos para obtener los polipéptidos según la invención.

La invención se refiere además a un método para diagnosticar aspergilosis detectando la presencia de un polipéptido según la invención o sus equivalentes funcionales, o detectando la presencia de un ADN según la invención o sus fragmentos o equivalentes funcionales.

La invención también se refiere al uso de la proteasa según la invención en un proceso industrial como se describe aquí.

Descripción detallada de la invención

Polinucleótidos

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican proteasas que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 124 o sus equivalentes funcionales. La secuencia de estos genes se determinó secuenciando un clon genómico obtenido a partir de Aspergillus niger. La invención proporciona secuencias polinucleotídicas que comprenden el gen que codifica estas proteasas, así como su secuencia de ADNc completa y su secuencia codificante. En consecuencia, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 10, o una secuencia de SEC ID NO: 67, o sus equivalentes funcionales.

Más en particular, la invención se refiere a un polinucleótido aislado hibridable en condiciones restrictivas a un polinucleótido de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67, preferiblemente en condiciones muy restrictivas. Ventajosamente, tales polinucleótidos se pueden obtener a partir de hongos filamentosos, en particular a partir de Aspergillus niger. Más específicamente, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que tiene una secuencia nucleotídica según una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido según SEC ID NO: 124 o sus equivalentes funcionales.

Como se usan aquí, los términos “gen” y “gen recombinante” se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que se pueden aislar a partir de ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, por ejemplo una proteasa de A. niger. Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias no codificantes, intrones y secuencias reguladoras. Además, un gen se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada como se define aquí.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67, o un equivalente funcional de las mismas, se puede aislar usando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia proporcionada aquí. Por ejemplo, usando toda o parte de la secuencia de ácido nucleico de una secuencia de SEC ID NO: 10, o la secuencia nucleotídica de una secuencia de SEC ID NO: 67, como sonda de hibridación, se pueden aislar moléculas de ácidos nucleicos según la invención usando técnicas de hibridación y clonación estándar (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Además, una molécula de ácido nucleico que engloba toda o una porción de una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67 se puede aislar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleótidos sintéticos diseñados basándose en la información de secuencia contenida en una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67.

Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar usando ADNc, ARNm, o, como alternativa, ADN genómico, como molde, y cebadores oligonucleotídicos apropiados según técnicas de amplificación mediante PCR estándar. El

ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y se puede caracterizar mediante análisis de secuencia de ADN.

Además, se pueden preparar oligonucleótidos que corresponden a o son hibridables a secuencias nucleotídicas según la invención mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo usando un sintetizador de ADN automatizado.

5 En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia nucleotídica mostrada en una secuencia de SEC ID NO: 67. La secuencia de una secuencia de SEC ID NO: 67 corresponde a la región codificante del ADNc de proteasa de A. niger. Este ADNc comprende secuencias que codifican el polipéptido de proteasa de A. niger según una secuencia de SEC ID NO: 124.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia nucleotídica mostrada en una secuencia de SEC ID NO: 10

o una secuencia de SEC ID NO: 57, o un equivalente funcional de estas secuencias nucleotídicas.

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia de ácido nucleico es aquella que es suficientemente complementaria a la otra secuencia nucleotídica, de forma que se puede hibridar a la otra secuencia nucleotídica formando de ese modo un dúplex estable.

15 Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido de la invención o un equivalente funcional del mismo, tal como un fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para uso como sonda de hibridación para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de ácidos nucleicos adecuados para uso como cebadores de la PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácidos nucleicos.

Un “polinucleótido aislado” o “ácido nucleico aislado” es un ADN o ARN que no está inmediatamente contiguo a ambas secuencias codificantes con las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5’ y una en el extremo 3’) en el genoma de origen natural del organismo a partir del que deriva. De este modo, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye algunas o todas las secuencias no codificantes en 5’ (por ejemplo, promotoras) que están inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. Por lo tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN

25 recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus que se replica autónomamente, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material celular, material vírico, o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante), o precursores víricos u otros productos químicos (cuando se sintetiza químicamente). Además, un “fragmento de ácido nucleico aislado” es un fragmento de ácido nucleico que no es de origen natural como fragmento, y que no se encontraría en el estado natural.

Como se usa aquí, los términos “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” están destinados a incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), y análogos del ADN o

35 ARN generados usando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede sintetizar usando análogos o derivados oligonucleotídicos (por ejemplo, inosina o nucleótidos de fosforotioato). Tales oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades alteradas de emparejamiento de bases, o que tienen resistencia incrementada a nucleasas.

Otra realización de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido a una molécula de ácido nucleico de proteasa, por ejemplo la hebra codificante de una molécula de ácido nucleico de proteasa. También se incluyen en el alcance de la invención las hebras complementarias de las moléculas de ácidos nucleicos descritas aquí.

Errores de secuenciación

45 La información de secuencia, como se proporciona aquí, no se debería de interpretar tan estrechamente como para requerir la inclusión de bases erróneamente identificadas. Las secuencias específicas descritas aquí se pueden usar fácilmente para aislar el gen completo a partir de hongos filamentosos, en particular A. niger, que a su vez se puede someter fácilmente a análisis de secuencia adicionales, identificando de ese modo errores de secuenciación.

Excepto que se indique de otro modo, todas las secuencias nucleotídicas determinadas secuenciando una molécula de ADN aquí se determinaron usando un secuenciador automatizado de ADN, y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas aquí se predijeron mediante traducción de una secuencia de ADN determinada como antes. Por lo tanto, como se sabe en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante este enfoque automatizado, cualquier secuencia nucleotídica determinada aquí puede contener algunos errores. Las secuencias nucleotídicas determinadas mediante 55 automatización son típicamente al menos alrededor de 90% idénticas, más típicamente al menos alrededor de 95% hasta al menos alrededor de 99,9% idénticas a la secuencia nucleotídica real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real se puede determinar de forma más precisa mediante otros enfoques, incluyendo métodos de

secuenciación manual de ADN, bien conocidos en la técnica. Como también se sabe en la técnica, una inserción o supresión individual en una secuencia nucleotídica determinada comparada con la secuencia real provocará un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia nucleotídica, de manera que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia nucleotídica determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de tal inserción o supresión.

La persona experta en la técnica es capaz de identificar tales bases, identificadas erróneamente, y sabe cómo corregir tales errores.

Fragmentos de ácidos nucleicos, sondas y cebadores

Una molécula de ácido nucleico según la invención puede comprender sólo una porción o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 57, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 58 a SEC ID NO: 114, por ejemplo un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador, o un fragmento que codifica una porción de una proteína de tipo proteasa. La secuencia nucleotídica determinada a partir de la clonación del gen de proteasa y ADNc permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en identificar y/o clonar otros miembros de la familia de proteasas, así como homólogos de proteasa procedentes de otras especies. La sonda/cebador comprende típicamente oligonucleótido sustancialmente purificado, el cual comprende típicamente una región de secuencia nucleotídica que se hibrida preferentemente en condiciones muy restrictivas a al menos alrededor de 12 ó 15, preferiblemente alrededor de 18 ó 20, preferiblemente alrededor de 22 ó 25, más preferiblemente alrededor de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ó 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleotídica mostrada en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 57, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 58 a SEC ID NO: 114, o en un equivalente funcional de la misma.

Las sondas basadas en las secuencias nucleotídicas de las proteasas se pueden usar para detectar transcritos o secuencias de proteasas genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homólogas, por ejemplo en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo lábil unido a ella, por ejemplo el grupo lábil puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas se pueden usar como parte de un kit de ensayo de diagnóstico para identificar células que expresan una proteína de tipo proteasa.

Identidad y homología

Los términos “homología” o “porcentaje de identidad” se usan de forma intercambiable aquí. Para los fines de esta invención, se define aquí que, a fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir saltos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos). Entonces se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de los aminoácidos o posiciones nucleotídicas correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente a la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones que solapan) x 100).

Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.

La persona experta estará al tanto del hecho de que existen varios programas de ordenador diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software de GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de salto de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. La persona experta apreciará que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje global de identidad de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan algoritmos diferentes.

En todavía otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias nucleotídicas se determina usando el programa GAP en el paquete de software de GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de salto de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. En otra realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o nucleotídicas se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en http://vega(igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi), usando una tabla de restos de peso de PAM120, una penalización de longitud de salto de 12, y una penalización de salto de 4.

Las secuencias de ácidos nucleicos y proteicas de la presente invención se pueden usar además como una “secuencia de interrogación” para llevar a cabo una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden llevar a cabo usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas nucleotídicas de BLAST se pueden llevar a cabo con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a moléculas de ácidos nucleicos de proteasas de la invención. Las búsquedas de proteínas de BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de la palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas proteicas de proteasas de la invención. Para obtener alineamientos con saltos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST, como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Hibridación

Como se usa aquí, el término “hibridar” pretende describir condiciones para la hibridación y lavado, en las que las secuencias nucleotídicas al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, más preferiblemente al menos alrededor de 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 85% a 90%, más preferiblemente al menos 95% homólogas entre sí, permanecen típicamente hibridadas entre sí.

Un ejemplo preferido no limitante de tales condiciones de hibridación es la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45ºC, seguido de uno o más lavados en 1 X SSC, 0,1% de SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, preferiblemente a 60ºC, e incluso más preferiblemente a 65ºC.

Las condiciones muy restrictivas incluyen, por ejemplo, hibridar a 68ºC en 5x SSC/5x de disolución de Denhardt/1,0% de SDS, y lavar en 0,2x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente. Como alternativa, el lavado se puede llevar a cabo a 42ºC.

El experto sabrá qué condiciones aplicar para las condiciones de hibridación restrictivas y muy restrictivas. En la técnica hay fácilmente una guía adicional con relación a tales condiciones, por ejemplo en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida sólo a una secuencia poly A (tal como el tramo poly(A) terminal de 3’ de los ARNm), o a un trecho complementario de restos T (o U), no se incluirá en un polinucleótido de la invención usado para hibridarse específicamente a una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que tal polinucleótido se hibridaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo de poly(A) o su complemento (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario).

Obtención de ADN de longitud completa a partir de otros organismos

En un enfoque típico, se identificarán librerías de ADNc construidas a partir de otros organismos, por ejemplo hongos filamentosos, en particular de la especie Aspergillus.

Por ejemplo, las cepas de Aspergillus se pueden identificar en busca de polinucleótidos de proteasas homólogas mediante análisis de transferencia Northern. Con la detección de transcritos homólogos a polinucleótidos según la invención, se pueden construir librerías de ADNc a partir de ARN aislado de la cepa apropiada, utilizando técnicas estándar bien conocidas para los expertos en la técnica. Como alternativa, se puede identificar una librería de ADN genómico total usando una sonda que se puede hibridar a un polinucleótido de proteasa según la invención.

Se pueden aislar secuencias génicas homólogas, por ejemplo llevando a cabo PCR usando dos cebadores oligonucleotídicos o conjuntos de dos cebadores oligonucleotídicos degenerados diseñados en base a las secuencias nucleotídicas enseñadas aquí.

El molde para la reacción puede ser ADNc obtenido mediante transcripción inversa de ARNm preparado a partir de cepas que se sabe o que se sospecha que expresan un polinucleótido según la invención. El producto de la PCR se puede subclonar y secuenciar para asegurarse de que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico de proteasa, o un equivalente funcional de la misma.

El fragmento de la PCR se puede usar entonces para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado se puede marcar y usar para identificar una librería de ADNc de bacteriófago o de cósmido. Como alternativa, el fragmento marcado se puede usar para identificar una librería genómica.

La tecnología de la PCR también se puede usar para aislar secuencias de ADNc de longitud completa a partir de otros organismos. Por ejemplo, se puede aislar ARN, siguiendo procedimientos estándar, a partir de una fuente celular o tisular apropiada. Se puede llevar a cabo una reacción de transcripción inversa sobre el ARN usando un

cebador oligonucleotídico específico para la mayoría del extremo 5’ del fragmento amplificado para cebar la síntesis de la primera hebra.

El híbrido de ARN/ADN resultante se puede “colear” (por ejemplo, con guaninas) usando una reacción de transferasa terminal estándar, el híbrido se puede digerir con ARNasa H, y entonces se puede cebar la síntesis de la segunda hebra (por ejemplo, con un cebador poly-C). De este modo, se pueden aislar fácilmente secuencias de ADNc en dirección 5’ del fragmento amplificado. Para un repaso de estrategias de clonación útiles, véase por ejemplo Sambrook et al., más arriba; y Ausubel et al., más arriba.

Vectores

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína de proteasa o un equivalente funcional de la misma. Como se usa aquí, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está enlazada. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano, y vectores de mamíferos episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedante con la introducción en la célula hospedante, y de ese modo se replican junto con el genoma del hospedante. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están ligados operativamente. Tales vectores se denominan aquí como “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. Los términos “plásmido” y “vector” se usan aquí de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedante, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedantes a usar para la expresión, que están operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, “operativamente enlazado” quiere decir que la secuencia nucleotídica de interés está enlazada a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro, o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). La expresión “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señal de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospedantes, y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia nucleotídica sólo en una cierta célula hospedante (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejidos). Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedante a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células hospedantes para producir de ese modo proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe aquí (por ejemplo proteínas de proteasas, formas mutantes de proteínas de proteasas, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de las mismas, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de proteínas de proteasas en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, las proteínas de proteasas se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamíferos. Las células hospedantes adecuadas se explican adicionalmente en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.

Los vectores de expresión útiles de la presente invención incluyen vectores derivados de cromosomas, de episomas, y de virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levaduras, virus tales como baculovirus, virus de papova, virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia, y retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.

El inserto de ADN se debería enlazar operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40, y promotores de LTR retrovíricas, por citar unos pocos. Otros promotores adecuados serán conocidos por la persona experta. En una realización específica, se prefieren promotores que son capaces de dirigir un nivel elevado de expresión de proteasas en hongos filamentosos. Tales promotores son conocidos en la técnica. Los constructos de expresión

pueden contener sitios para la iniciación de la transcripción, la terminación, y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirá un AUG iniciador de la traducción al comienzo, y un codón de terminación situado apropiadamente al final del polipéptido a traducir.

El ADN vectorial se puede introducir en células procariotas o eucariotas, vía técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usan aquí, los términos “transformación” y “transfección” se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedante, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes se pueden encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección usados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce en las células hospedantes, junto con el gen de interés, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos). Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula hospedante en el mismo vector que aquel que codifica una proteína de proteasa, o se puede introducir en un vector separado. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar mediante selección por fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o proteínas que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada allí, por ejemplo el término amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven típicamente para tres fines: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante, para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión tras la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognatas, incluyen el Factor Xa, trombina y enterocinasa.

Como se indica, los vectores de expresión contendrán preferiblemente marcadores seleccionables. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para el cultivo de las células eucariotas, y resistencia a tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de hospedante apropiado incluyen células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como levadura; células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales, tales como CHO, COS y melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospedantes descritas anteriormente son conocidas en la técnica.

Entre los vectores preferidos para uso en bacterias están pQE70, pQE60 y PQE9, disponibles de Qiagen; los vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucariotas preferidos están PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán fácilmente manifiestos para el experto.

Entre los promotores bacterianos conocidos para uso en la presente invención están incluidos los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores PR, PL del fago lambda, y el promotor trp, el promotor de timidina cinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de las LTR retrovíricas, tales como los del virus del sarcoma de Rous (“RSV”), y promotores de metalotioneína, tales como el promotor de metalotioneína I de ratón.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se puede incrementar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente de alrededor de 10 a 300 pb, que actúan para incrementar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula hospedante dado. Los ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador de SV40, que está situado en el lado tardío del origen de replicación a pb 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus.

Para la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, se puede incorporar en el polipéptido expresado una señal de secreción apropiada. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido, o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. De este modo, por ejemplo, se puede añadir al término N del polipéptido una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedante, durante la purificación o durante la manipulación y almacenamiento subsiguientes. También, se pueden añadir restos peptídicos al polipéptido, para facilitar la purificación.

Polipéptidos según la invención

La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 124, una secuencia de aminoácidos obtenible expresando un polinucleótido según la invención o en una realización preferida de una secuencia de SEC ID NO: 10 en un hospedante apropiado, así como una secuencia de aminoácidos obtenible expresando una secuencia polinucleotídica de SEC ID NO: 67 en un hospedante apropiado. También, dentro de la presente invención está comprendido un péptido o polipéptido que comprende un equivalente funcional de los polipéptidos anteriores. Los polipéptidos anteriores están comprendidos colectivamente en la expresión “polipéptidos según la invención”.

Los términos “péptido” y “oligopéptido” se consideran sinónimos (como se reconoce normalmente), y cada término se puede usar de forma intercambiable según lo requiera el contexto para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados mediante enlaces peptidílicos. La palabra “polipéptido” se usa aquí para cadenas que contienen más de siete restos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias oligopeptídicas y polipeptídicas aquí están escritas de izquierda a derecha, y en la dirección desde el término amino al término carboxi. Habitualmente se conoce en la técnica el código de una letra de aminoácidos usado aquí, y se puede encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Por polipéptido o proteína “aislado” se quiere decir un polipéptido o proteína retirado de su entorno nativo. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas producidos recombinantemente, expresados en células hospedantes, se consideran aislados para los fines de la invención como lo son los polipéptidos nativos o recombinantes que se han purificado sustancialmente por cualquier técnica adecuada, tal como, por ejemplo, el método de purificación de una sola etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

La proteasa según la invención se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos, que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito, y cromatografía de lecitina. Para los fines analíticos, se emplea muy preferiblemente la cromatografía de líquidos de altas prestaciones (“HPLC”) para la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados de forma natural, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedante procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glucosilados, o pueden estar no glucosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedante.

Además, una proteína según la invención puede ser una proteína precursora tal como un cimógeno, una proteína híbrida, una proteína obtenida como una prosecuencia o una pre-prosecuencia, o cualquier otro tipo de forma inmadura.

Fragmentos proteicos

La invención también se refiere a fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos según la invención.

Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína de proteasa (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 115 a SEC ID NO: 171), que incluye un menor número de aminoácidos que la proteína de longitud completa, y muestra al menos una actividad biológica de la proteína de longitud completa correspondiente. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína de proteasa. Un fragmento biológicamente activo de una proteína de la invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, una longitud de 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos. Además, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes otras porciones biológicamente activas, en las que están suprimidas otras

regiones de la proteína, y se pueden evaluar en busca de una o más de las actividades biológicas de la forma nativa de un polipéptido de la invención.

La invención también se refiere a fragmentos de ácidos nucleicos que codifican los fragmentos biológicamente activos anteriores de la proteína de proteasa.

5 Proteínas de fusión

Las proteínas de la presente invención o sus equivalentes funcionales, por ejemplo sus porciones biológicamente activas, se pueden ligar operativamente a un polipéptido que no sea de proteasa (por ejemplo, secuencias de aminoácidos heterólogas), para formar proteínas de fusión. Como se usa aquí, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” de proteasa comprende un polipéptido de proteasa ligado operablemente a un polipéptido que no es de proteasa. Un “polipéptido de proteasa” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia polipeptídica según la invención, mientras que un “polipéptido que no es de proteasa” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homóloga a una proteína según la invención, por ejemplo una proteína que es diferente de la proteína de proteasa y que deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de una proteína de

15 fusión de proteasa, el polipéptido de proteasa puede corresponder a toda o a una porción de una proteína según la invención. En una realización preferida, una proteína de fusión de proteasa comprende al menos un fragmento biológicamente activo de una proteína según la invención. En otra realización preferida, una proteína de fusión de proteasa comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína según la invención. Dentro de la proteína de fusión, la expresión “ligado operativamente” pretende indicar que el polipéptido de proteasa y el polipéptido que no es de proteasa están fusionados en el marco entre sí. El polipéptido que no es de proteasa se puede fusionar al término N o al término C del polipéptido de proteasa.

Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión de GST-proteasa en la que las secuencias de la proteasa se fusionan al término C de las secuencias de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de proteasa recombinante. En otra realización, la proteína de fusión es una proteína de

25 proteasa que contiene una secuencia señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospedantes (por ejemplo, células hospedantes de mamíferos y de levaduras), la expresión y/o secreción de la proteasa se puede incrementar a través del uso de una secuencia señal heteróloga.

En otro ejemplo, como secuencia señal heteróloga se puede usar la secuencia secretora de gp67 de la proteína de cubierta de baculovirus (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992). Otros ejemplos de secuencias señales heterólogas eucariotas incluyen las secuencias secretoras de melitina y de fosfatasa alcalina de la placenta humana (Stratagene; La Jolla, California). En todavía otro ejemplo, las secuencias señal heterólogas procariotas útiles incluyen la señal secretora de phoA (Sambrook et al., más arriba) y la señal secretora de la proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey).

Una secuencia señal se puede usar para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la

35 invención. Las secuencias señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos que se escinden generalmente de la proteína madura durante la secreción en uno o más sucesos de escisión. Tales péptidos señal contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia señal a partir de las proteínas maduras a medida que pasan a través de la ruta secretora. La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, tal como desde un hospedante eucariota en el que se transforma el vector de expresión, y la secuencia señal se escinde subsiguiente o concurrentemente. La proteína se puede purificar entonces fácilmente del medio extracelular por métodos reconocidos en la técnica. Como alternativa, la secuencia señal se puede ligar a la proteína de interés usando una secuencia que facilita la purificación, tal como con un dominio de GST. De este modo, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un polipéptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones

45 preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en el vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta de HA es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrita por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por ejemplo.

Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión de proteasa de la invención se produce mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan juntos en el marco según técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos con extremos romos o extremos escalonados para la ligación, digestión mediante enzimas de restricción para proporcionar términos 55 apropiados, llenado de los extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, se puede llevar la amplificación mediante PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje, que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que se pueden hibridar subsiguientemente y reamplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al.

John Wiley & Sons: 1992). Además, hay comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica la proteasa en tal vector de expresión, de manera que el resto de fusión esté ligado en el marco a la proteína de proteasa.

Equivalentes funcionales

5 Las expresiones “equivalentes funcionales” y “variantes funcionales” se usan aquí de forma intercambiable. Los equivalentes funcionales de un ADN según la invención son fragmentos de ADN aislados que codifican un polipéptido que muestra una función particular de una proteasa de A. niger como se define aquí. Un equivalente funcional de un polipéptido según la invención es un polipéptido que muestra al menos una función de una proteasa de A. niger como se define aquí.

Los equivalentes proteicos o polipeptídicos funcionales pueden contener sólo sustituciones conservativas de uno o más aminoácidos de una secuencia de SEC ID NO: 124 o sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos no esenciales. En consecuencia, un aminoácido no esencial es un resto que se puede alterar en una secuencia de SEC ID NO: 124 sin alterar sustancialmente la función biológica. Por ejemplo, se predice que los restos de aminoácidos que están conservados entre las proteínas de proteasas de la presente invención son particularmente

15 no susceptibles a alteración. Además, no es probable que los aminoácidos conservados entre las proteínas de proteasas según la presente invención y otras proteasas sean susceptibles a alteración.

La expresión “sustitución conservativa” quiere decir aquella sustitución en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Estas familias son conocidas en la técnica, e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparaginas, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

25 Los equivalentes de ácidos nucleicos funcionales pueden contener típicamente mutaciones silenciosas o mutaciones que no alteran la función biológica del polipéptido codificado. En consecuencia, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas de proteasas que contienen cambios en restos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica particular. Tales proteínas de proteasas difieren en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de SEC ID NO: 124 aunque retienen al menos una actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga de al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en una secuencia de SEC ID NO: 124.

Por ejemplo, en Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990) se proporciona una guía que se refiere a cómo

35 obtener sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas, referencia en la que los autores indican que hay dos enfoques principales para estudiar la tolerancia al cambio de una secuencia de aminoácidos. El primer método se basa en el proceso de evolución, en el que las mutaciones se aceptan o se rechazan mediante selección natural. El segundo enfoque usa manipulación genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado, y selecciona o identifica secuencias que mantienen la funcionalidad. Como afirman los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además qué cambios son probablemente permisivos en una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, los restos de aminoácidos más enterrados requieren cadenas laterales no polares, mientras que generalmente se conservan pocos rasgos de las cadenas laterales de la superficie. Otras de tales sustituciones fenotípicamente silenciosas se describen en Bowie et al., más arriba, y las referencias citadas allí.

45 Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de proteasa homóloga a la proteína de SEC ID NO: 124 se puede crear introduciendo una o más sustituciones, adiciones o supresiones nucleotídicas en las secuencias nucleotídicas codificantes según SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67, de manera que se introducen en la proteína codificada una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos. Tales mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR.

La expresión “equivalentes funcionales” también engloba ortólogos de la proteína de proteasa de A. niger. Los ortólogos de la proteína de proteasa de A. niger son proteínas que se pueden aislar de otras cepas o especies, y poseen una actividad biológica similar o idéntica. Tales ortólogos se pueden identificar fácilmente ya que comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a una secuencia de SEC ID NO: 124.

55 Como se define aquí, la expresión “sustancialmente homóloga” se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleotídica que contiene un número suficiente o mínimo de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con cadena lateral similar) a una segunda secuencia de ácidos nucleicos o nucleotídica, de forma que las secuencias de aminoácidos o nucleotídicas primera y segunda tienen un dominio común. Por ejemplo, las

secuencias de aminoácidos o nucleotídicas que contienen un dominio común que tienen alrededor de 60%, preferiblemente 65%, más preferiblemente 70%, incluso más preferiblemente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad o más, se definen aquí como suficientemente idénticas.

También, los ácidos nucleicos que codifican otros miembros de la familia de proteasas, que tienen así una secuencia nucleotídica que difieren de una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67, están dentro del alcance de la invención. Además, los ácidos nucleicos que codifican proteínas de proteasas a partir de diferentes especies, que tienen así una secuencia nucleotídica que difiere de una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67, están dentro del alcance de la invención.

Las moléculas de ácidos nucleicos que corresponden a variantes (por ejemplo variantes alélicas naturales) y homólogos del ADN de proteasa de la invención se pueden aislar basándose en su homología con los ácidos nucleicos de proteasas descritos aquí usando los ADNc descritos aquí o un fragmento adecuado de los mismos, como una sonda de hibridación según técnicas de hibridación estándar, preferiblemente en condiciones de hibridación muy restrictivas.

Además de las variantes alélicas de origen natural de la secuencia de proteasa, la persona experta reconocerá que se pueden introducir cambios mediante mutación en las secuencias nucleotídicas de una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67, conduciendo de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína de proteasa sin alterar sustancialmente la función de la proteína de proteasa.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan proteínas de proteasas mejoradas. Las proteínas de proteasas mejoradas son proteínas en las que al menos se mejora una actividad biológica. Tales proteínas se pueden obtener introduciendo al azar mutaciones a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante de la proteasa, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden expresar recombinantemente y se pueden identificar en busca de la actividad biológica. Por ejemplo, la técnica proporciona ensayos estándar para medir la actividad enzimática de proteasas, y de este modo se pueden seleccionar fácilmente proteínas mejoradas.

En una realización preferida, la proteína de proteasa tienen una secuencia de aminoácidos según una secuencia de SEC ID NO: 124. En otra realización, el polipéptido de proteasa es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos según una secuencia de SEC ID NO: 124, y retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido según una secuencia de SEC ID NO: 124, aunque difiere en la secuencia de aminoácidos debido a variación natural

o mutagénesis como se describe anteriormente.

En una realización preferida adicional, la proteína de proteasa tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridarse a un ácido nucleico según una secuencia de SEC ID NO: 10 o una secuencia de SEC ID NO: 67, preferiblemente en condiciones de hibridación muy restrictivas.

En consecuencia, la proteína de proteasa es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en una secuencia de SEC ID NO: 124, y retiene al menos una actividad funcional del polipéptido según una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 124.

Los equivalentes funcionales de una proteína según la invención también se pueden identificar, por ejemplo, detectando librerías combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, de la proteína de la invención en busca de actividad de proteasa. En una realización, una librería variada de variantes se genera mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico. Una librería variada de variantes se puede producir, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de forma que un conjunto degenerado de secuencias proteicas potenciales es expresable como polipéptidos individuales, o, como alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la presentación de fagos). Existe una variedad de métodos que se pueden usar para producir librerías de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. En la técnica se conocen métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (véanse, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Además, se pueden usar librerías de fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la invención para generar una población variada de polipéptidos para identificar una selección subsiguiente de variantes. Por ejemplo, se puede generar una librería de fragmentos de secuencias codificantes tratando un fragmento de PCR bicatenario de la secuencia codificante de interés con una nucleasa en condiciones en las que el mellado se produce sólo alrededor de una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario, que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos mellados, eliminando las porciones monocatenarias de los dúplex reformados mediante tratamiento con nucleasa S1, y ligando la librería del fragmento resultante en un vector de expresión. Mediante este método, se puede derivar una librería de expresión que codifica fragmentos N-terminales e internos de diversos tamaños de la proteína de interés.

En la técnica se conocen varias técnicas para identificar productos génicos de librerías combinatorias obtenidas mediante mutaciones de punto de truncamiento, y para identificar librerías de ADNc en busca de productos génicos

que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas usadas más ampliamente, que son susceptibles de análisis de rendimiento elevado, para identificar grandes librerías génicas incluyen típicamente clonar la librería génica en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la librería resultante de vectores, y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Se puede usar mutagénesis de ensamblaje recurrente (REM), una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las librerías, en combinación con los ensayos de identificación para identificar variantes de una proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Además de la secuencia génica de la proteasa mostrada en una secuencia de SEC ID NO: 10, será manifiesto para la persona experta en la técnica que pueden existir en una población dada polimorfismos de la secuencia de ADN que pueden conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína de proteasa. Tales polimorfismos genéticos pueden existir en células procedentes de diferentes poblaciones, o en una población, debido a variación alélica natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales.

Los fragmentos de un polinucleótido según la invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Tales polinucleótidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción de PCR. Tales polinucleótidos también pueden ser útiles cuando se desea abolir la actividad funcional de una proteasa en un organismo particular (mutantes carentes de genes).

Los ácidos nucleicos según la invención, independientemente de si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales, se pueden usar como sondas de hibridación o cebadores de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene una actividad de proteasa incluyen, entre otros, (1) aislar el gen que codifica la proteína de proteasa, o sus variantes alélicas, a partir de una librería de ADNc, por ejemplo a partir de otros organismos distintos de A. niger; (2) la hibridación in situ (por ejemplo FISH) a extensiones cromosómicas metafásicas, para proporcionar una localización cromosómica precisa del gen de proteasa como se describe en Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) el análisis de transferencia Northern, para detectar la expresión de ARNm de proteasa en tejidos y/o células específicos, y (4) sondas y cebadores que se pueden usar como una herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridable a la sonda de proteasa en una muestra biológica dada (por ejemplo, tejido).

También está englobado por la invención un método para obtener un equivalente funcional de un gen o ADNc de proteasa. Tal método supone obtener una sonda marcada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica toda o una porción de la secuencia según una secuencia de SEC ID NO: 124 o una variante de la misma; identificar una librería de fragmentos de ácidos nucleicos con la sonda marcada, en condiciones que permitan la hibridación de la sonda a los fragmentos de ácidos nucleicos en la librería, formando de ese modo dúplex de ácidos nucleicos, y preparar una secuencia génica de longitud completa a partir de los fragmentos de ácidos nucleicos en cualquier dúplex marcado, para obtener un gen relacionado con el gen de proteasa.

En una realización, un ácido nucleico de proteasa de la invención es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogo a una secuencia de ácido nucleico mostrada en una secuencia de SEC ID NO: 10, una secuencia de SEC ID NO: 67, o el complemento de las mismas.

En otra realización preferida, un polipéptido de proteasa de la invención es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homólogo a la secuencia de aminoácidos mostrada en una secuencia de SEC ID NO: 124.

Células hospedantes

En otra realización, la invención se refiere a células, por ejemplo células hospedantes transformadas o células hospedantes recombinantes, que contienen un ácido nucleico englobado por la invención. Una “célula transformada”

o “célula recombinante” es una célula en la que (o un ancestro en el que) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico según la invención. Se incluyen células tanto procariotas como eucariotas, por ejemplo bacterias, hongos, levaduras, y similares; se prefieren especialmente células de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger.

Se puede escoger una célula hospedante que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de una manera específica y deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.

Diversas células hospedantes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento posttraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Se pueden escoger estirpes celulares o sistemas de hospedantes apropiados, familiares para aquellos expertos en la técnica de biología molecular y/o microbiología, para asegurar la modificación y procesamiento deseados y correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden usar células hospedantes eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado

del transcrito primario, glucosilación, y fosforilación del producto génico. Tales células hospedantes son bien conocidas en la técnica.

Las células hospedantes también incluyen, pero no se limitan a, estirpes celulares de mamíferos, tales como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y estirpes celulares del plexo coroideo.

5 Si se desea, los polipéptidos según la invención se pueden producir mediante una estirpe celular transfectada de forma estable. Hay disponibles al público un número de vectores adecuados para la transfección estable de células de mamíferos; también se conocen públicamente métodos para construir tales células, por ejemplo en Ausubel et al. (más arriba).

Anticuerpos

10 La invención se refiere además a anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, que se unen específicamente a proteínas de proteasas según la invención.

Como se usa aquí, el término “anticuerpo” (Ab) o “anticuerpo monoclonal” (Mab) incluye moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab’)2) que son capaces de unirse específicamente a proteína de proteasa. Los fragmentos Fab y F(ab’)2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo

15 intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión no específica a tejidos de un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). De este modo, se prefieren estos fragmentos.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar mediante cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo, se pueden administrar células que expresan la proteína de proteasa o un fragmento antigénico de la misma a un mamífero, a fin de inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. En un método

20 preferido, se prepara una preparación de proteína de proteasa y se purifica para hacerla sustancialmente libre de contaminantes naturales. Tal preparación se introduce entonces en un animal a fin de producir antisueros policlonales de mayor actividad específica.

En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o sus fragmentos de unión a proteína de proteasa). Tales anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando 25 tecnología de hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., p. 563-681 (1981)). En general, tales procedimientos implican inmunizar a un animal (preferiblemente un ratón) con un antígeno de la proteína de proteasa, o con una célula que expresa la proteína de proteasa. Se extraen los esplenocitos de tales ratones y se fusionan con una estirpe celular de mieloma adecuada. Se puede emplear cualquier estirpe celular de mieloma 30 adecuada según la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la estirpe celular de mieloma progenitora (SP2O), disponible de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Tras la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y después se clonan mediante dilución limitante como se describe por Wands et al. (Gastro-enterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de tal selección se evalúan entonces para identificar clones que segregan anticuerpos capaces de unirse al

35 antígeno de la proteína de proteasa. En general, los polipéptidos se pueden acoplar a una proteína portadora, tal como KLH, como se describe en Ausubel et al., más arriba, mezclada con un adyuvante, y se pueden inyectar en un mamífero hospedante.

En particular, diversos animales hospedantes se pueden inmunizar mediante inyección de un polipéptido de interés. Los ejemplos de animales hospedantes adecuados incluyen conejos, ratones, cobayas, y ratas. Se pueden usar 40 diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedante, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales adyuvantes tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles de tipo Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos

45 derivadas de los sueros de los animales inmunizados.

Tales anticuerpos pueden ser cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de las mismas. Los hibridomas que producen los mAb de esta invención se pueden cultivar in vitro o in vivo.

Una vez producidos, los anticuerpos policlonales o monoclonales se ensayan en busca del reconocimiento

50 específico de un polipéptido de proteasa o equivalente funcional del mismo en un inmunoensayo, tal como un análisis de transferencia Western o un análisis de inmunoprecipitación, usando técnicas estándar, por ejemplo como se describe en Ausubel et al., más arriba. Los anticuerpos que se unen específicamente a proteínas de proteasas o sus equivalentes funcionales son útiles en la invención. Por ejemplo, tales anticuerpos se pueden usar en un inmunoensayo para detectar proteasa en cepas patógenas o no patógenas de Aspergillus (por ejemplo, en extractos

55 de Aspergillus).

Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se producen usando fragmentos de los polipéptidos de proteasas que parecen probablemente antigénicos, mediante criterios tales como frecuencia elevada de restos cargados. Por

ejemplo, tales fragmentos se pueden generar mediante técnicas estándar de PCR, y después se pueden clonar en el vector de expresión pGEX (Ausubel et al., más arriba). Entonces, las proteínas de fusión se pueden expresar en E. coli y se pueden purificar usando una matriz de afinidad en gel de agarosa con glutationa, como se describe en Ausubel et al., más arriba. Si se desea, se pueden generar varias (por ejemplo, dos o tres) fusiones para cada proteína, y cada fusión se puede inyectar en al menos dos conejos. Los anticuerpos se pueden producir mediante inyecciones en serie, incluyendo típicamente al menos tres revacunaciones. Típicamente, los anticuerpos se comprueban en busca de su capacidad para inmunoprecipitar un polipéptido de proteasa recombinante o sus equivalentes funcionales, mientras que las proteínas no relacionadas pueden servir como un control para la especificidad de la reacción inmunitaria.

Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patentes U.S. 4.946.778 y 4.704.692) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios frente a un polipéptido de proteasa o sus equivalentes funcionales. Los kits para generar e identificar librerías de presentación de fagos están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Pharmacia.

Adicionalmente, los ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para uso en generar e identificar la librería de presentación de anticuerpos se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.223.409; en la Publicación PCT nº WO 92/18619; en la Publicación PCT nº WO 91/17271; en la Publicación PCT nº WO 20791; en la Publicación PCT nº WO 92/20791; en la Publicación PCT nº WO 92/15679; en la Publicación PCT nº WO 93/01288; en la Publicación PCT nº WO 92/01047; en la Publicación PCT nº WO 92/09690; en la Publicación PCT nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:8185; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734.

Los anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen específicamente a polipéptidos de proteasas o sus equivalentes funcionales se pueden usar, por ejemplo, para detectar la expresión de un gen de proteasa o un equivalente funcional del mismo, por ejemplo, en otra cepa de Aspergillus. Por ejemplo, el polipéptido de proteasa se puede detectar fácilmente en inmunoensayos convencionales de células o extractos de Aspergillus. Los ejemplos de ensayos adecuados incluyen, sin limitación, transferencia Western, los ELISA, radioinmunoensayos, y similares.

Por “se une específicamente” se quiere decir que un anticuerpo reconoce y se une a un antígeno particular, por ejemplo un polipéptido de proteasa, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas no relacionadas en una muestra.

Los anticuerpos se pueden purificar, por ejemplo, mediante métodos de cromatografía de afinidad, en los que el antígeno polipeptídico se inmoviliza sobre una resina.

Se puede usar un anticuerpo dirigido frente a un polipéptido de la invención (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar el polipéptido mediante técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, tal anticuerpo se puede usar para detectar la proteína (por ejemplo, en un lisado celular o un sobrenadante celular) a fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión del polipéptido. Los anticuerpos también se pueden usar de forma diagnóstica para monitorizar los niveles proteicos en células o tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado, o en el diagnóstico de aspergilosis.

La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, E-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de materiales fluorescentes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamin fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

Los epítopos preferidos englobados por el péptido antigénico son regiones que están localizadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo regiones hidrófilas. Se pueden usar gráficas de hidrofobia de las proteínas de la invención para identificar regiones hidrófilas.

El péptido antigénico de una proteína de la invención comprende al menos 7 (preferiblemente 10, 15, 20, ó 30) restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 115 a SEC ID NO: 171, y engloba un epítopo de la proteína de manera que un anticuerpo provocado frente al péptido forma un complejo inmunitario específico con la proteína.

Los epítopos preferidos englobados por el péptido antigénico son regiones de proteasa que están localizadas en la superficie de la proteína, por ejemplo regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa, regiones beta, regiones de enrollamiento, regiones de vuelta y regiones flexibles.

Inmunoensayos

La determinación cualitativa o cuantitativa de un polipéptido según la presente invención en una muestra biológica se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica. Las técnicas basadas en anticuerpos proporcionan ventajas especiales para ensayar niveles polipeptídicos específicos en una muestra biológica.

5 En éstas, el reconocimiento específico se proporciona mediante el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal), pero el sistema de detección secundario puede utilizar materiales fluorescentes, enzimas, u otros anticuerpos secundarios conjugados. Como resultado, se obtiene un inmunocomplejo.

En consecuencia, la invención proporciona un método para diagnosticar si cierto organismo está infectado con Aspergillus, que comprende las etapas de:

10 x aislar una muestra biológica de dicho organismo sospechoso de estar infectado con Aspergillus,

x hacer reaccionar dicha muestra biológica con un anticuerpo según la invención,

x determinar si se forman inmunocomplejos.

Los tejidos también se pueden extraer, por ejemplo, con urea y detergente neutro, para la liberación de proteína para el ensayo de transferencia Western o de punto/ranura. Este técnica también se puede aplicar a fluidos corporales.

15 Otros métodos basados en anticuerpos, útiles para detectar la expresión del gen de proteasa, incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales específicos de proteasas se pueden usar tanto como un inmunoabsorbente como como una sonda marcada enzimáticamente, para detectar y cuantificar la proteína de proteasa. La cantidad de proteína de proteasa presente en la muestra se puede calcular haciendo referencia a la cantidad presente en una

20 preparación estándar usando un algoritmo de ordenador de regresión lineal. En otro ensayo ELISA, se pueden usar dos anticuerpos monoclonales específicos distintos para detectar la proteína de proteasa en un fluido biológico. En este ensayo, uno de los anticuerpos se usa como el inmunoabsorbente, y el otro como la sonda marcada enzimáticamente.

Las técnicas anteriores se pueden llevar a cabo esencialmente como un ensayo de “una etapa” o de “dos etapas”. El

25 ensayo de “una etapa” implica poner en contacto la proteína de proteasa con anticuerpo inmovilizado, y, sin lavar, poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado. El ensayo de “dos etapas” implica lavar antes de poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado. También se pueden emplear otros métodos convencionales según sea adecuado. Habitualmente es deseable inmovilizar un componente del sistema de ensayo sobre un soporte, permitiendo de ese modo que otros componentes del sistema se pongan en contacto con el componente y que sean

30 eliminados fácilmente de la muestra.

Los marcadores enzimáticos adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos del grupo oxidasa, que catalizan la producción de peróxido de hidrógeno reaccionando con sustrato. La actividad de un marcador de oxidasa se puede evaluar midiendo la concentración de peróxido de hidrógeno formado por la reacción de anticuerpo marcado con la enzima/sustrato.

35 Además de las enzimas, otros marcadores adecuados incluyen radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In), y tecnecio (99mTc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.

La unión específica de un compuesto de ensayo a un polipéptido de proteasa se puede detectar, por ejemplo, in vitro inmovilizando reversible o irreversiblemente el polipéptido de proteasa sobre un sustrato, por ejemplo la superficie 40 de un pocillo de una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos. Los métodos para inmovilizar polipéptidos y otras pequeñas moléculas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las placas de microtitulación se pueden revestir con un polipéptido de proteasa añadiendo el polipéptido en una disolución (típicamente, a una concentración de 0,05 a 1 mg/ml en un volumen de 1-100 ul) a cada pocillo, e incubando las placas a temperatura ambiente hasta 37ºC durante 0,1 a 36 horas. Los polipéptidos que no se unen a la placa se pueden eliminar 45 agitando la disolución en exceso de la placa, y lavando después la placa (una vez, o repetidamente) con agua o con un tampón. Típicamente, el polipéptido está contenido en agua o en un tampón. La placa se lava entonces con un tampón que carece del polipéptido unido. Para bloquear los sitios de unión a proteína libres en las placas, las placas se bloquean con una proteína que no está relacionada con el polipéptido unido. Por ejemplo, son adecuados 300 ul de seroalbúmina bovina (BSA) a una concentración de 2 mg/ml en Tris-HCl. Los sustratos adecuados incluyen

50 aquellos sustratos que contienen una química de reticulación definida (por ejemplo, sustratos plásticos, tales como poliestireno, estireno, o sustratos de polipropileno de Corning Costar Corp. (Cambridge, MA), por ejemplo). Si se desea, como sustrato, se puede usar una partícula en forma de perla, por ejemplo agarosa en perlas o sefarosa en perlas.

La unión del compuesto de ensayo a los polipéptidos según la invención se puede detectar mediante cualquiera de 55 una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo específico en un

inmunoensayo. Si se desea, el anticuerpo se puede marcar (por ejemplo, fluorescentemente o con un radioisótopo) y detectar directamente (véase, por ejemplo, West y McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977). Como alternativa, se puede usar un segundo anticuerpo para la detección (por ejemplo, un anticuerpo marcado que se une a la porción Fc de un anticuerpo anti-AN97). En un método de detección alternativo, el polipéptido de proteasa se marca, y se detecta el marcador (por ejemplo, marcando un polipéptido de proteasa con un radioisótopo, fluoróforo, cromóforo, o similar). En todavía otro método, el polipéptido de proteasa se produce como una proteína de fusión con una proteína que se puede detectar ópticamente, por ejemplo la proteína fluorescente verde (que se puede detectar bajo luz UV). En un método alternativo, el polipéptido de proteasa se puede unir covalentemente a o fusionar con una enzima que tiene una actividad enzimática detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, a-galactosidasa, o glucosa oxidasa. Los genes que codifican todas estas enzimas se han clonado y están fácilmente disponibles para uso por los expertos en la técnica. Si se desea, la proteína de fusión puede incluir un antígeno, y tal antígeno se puede detectar y medir con un anticuerpo policlonal o monoclonal usando métodos convencionales. Los antígenos adecuados incluyen enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y a-galactosidasa) y polipéptidos no enzimáticos (por ejemplo, proteínas séricas, tal como BSA y globulinas, y proteínas lácteas, tales como caseínas).

Epítopos, antígenos e inmunógenos

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido o polipéptido que comprende una porción que posee un epítopo de un polipéptido de la invención. El epítopo de esta porción del polipéptido es un epítopo inmunógeno o antigénico de un polipéptido de la invención. Un “epítopo inmunógeno” se define como una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunógeno. Se cree que estos epítopos inmunógenos están confinados en unos pocos loci en la molécula. Por otro lado, una región de una molécula proteica a la que se puede unir un anticuerpo se define como un “epítopo antigénico”. El número de epítopos inmunógenos de una proteína generalmente es menor que el número de epítopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen, H. M. et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 81:3998-4002 (1984).

En cuanto a la selección de péptidos o polipéptidos que poseen un epítopo antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula proteica a la que se puede unir un anticuerpo), es bien sabido en esa técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan parte de una secuencia proteica son capaces de forma habitual de provocar un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente imitada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J. G. et al., Science 219:660-666 (1984). Los péptidos capaces de provocar sueros reactivos con la proteína están representados frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, se pueden caracterizar mediante un conjunto de reglas químicas simples, y no están confinados en regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epítopos inmunógenos) ni en los terminales amino o carboxilo. Los péptidos que son extremadamente hidrófobos, y aquellos de seis restos o menos, generalmente son ineficaces induciendo anticuerpos que se unen a la proteína imitada; habitualmente son eficaces los péptidos más largos, solubles, especialmente aquellos que contienen restos de prolina. Sutcliffe et al., más arriba?. Por ejemplo, 18 a 20 péptidos diseñados según estas guías, que contienen 8-39 restos que cubren el 75% de la secuencia de la cadena polipeptídica de HAI de hemaglutinina del virus de la gripe, indujeron anticuerpos que reaccionaron con la proteína HA1 o virus intacto; y 12/12 péptidos procedentes de la polimerasa de MuLV y 18/18 de la glucoproteína de la rabia indujeron anticuerpos que precipitaron las proteínas respectivas.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que poseen epítopos antigénicos son útiles por lo tanto para provocar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a un polipéptido de la invención. De este modo, una proporción elevada de hibridomas obtenidos mediante fusión de esplenocitos procedentes de donantes inmunizados con un péptido que posee un epítopo antigénico segrega generalmente anticuerpo reactivo con la proteína nativa. Sutcliffe et al., más arriba, en 663. Los anticuerpos provocados por péptidos o polipéptidos que poseen epítopos antigénicos son útiles para detectar la proteína imitada, y los anticuerpos dirigidos contra diferentes péptidos se pueden usar para rastrear el destino de diversas regiones de un precursor proteico que sufre un procesamiento de post-traducción. Los péptidos y los anticuerpos antipeptídicos se pueden usar en una variedad de ensayos cualitativos o cuantitativos para la proteína imitada, por ejemplo en ensayos de competición, puesto que se ha demostrado que incluso péptidos cortos (por ejemplo, alrededor de 9 aminoácidos) se pueden unir y desplazar a los péptidos más grandes en ensayos de inmunoprecipitación. Véase, por ejemplo, Wilson, I.A. et al., Cell 37:767778 en 777 (1984). Los anticuerpos antipeptídicos de la invención también son útiles para la purificación de la proteína imitada, por ejemplo mediante cromatografía de adsorción, usando métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que poseen epítopos antigénicos diseñados según las guías anteriores contienen preferiblemente una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve, y lo más preferible entre alrededor de 15 y alrededor de 30 aminoácidos contenidos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción más grande de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención, que contienen alrededor de 30 a alrededor de 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia completa de aminoácidos de un polipéptido de la invención, también se consideran péptidos o polipéptidos de la invención que poseen epítopos, y también son útiles para inducir anticuerpos que reaccionan con la proteína imitada. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del péptido que posee epítopos se selecciona para proporcionar solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es decir,

la secuencia incluye restos relativamente hidrófilos, y preferiblemente se evitan secuencias muy hidrófobas); y se prefieren particularmente secuencias que contienen restos de prolina.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que poseen epítopos se pueden producir por cualquier medio convencional para obtener péptidos o polipéptidos, incluyendo medios recombinantes que usan moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, una secuencia corta de aminoácidos que posee epítopos se puede fusionar a un polipéptido más grande que actúa como un portador durante la producción y purificación recombinante, así como durante la inmunización para producir anticuerpos antipeptídicos.

Los péptidos que poseen epítopos también se pueden sintetizar usando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple para la síntesis de gran número de péptidos, tal como 10-20 mg de 248 péptidos de 13 restos diferentes que representan variantes de aminoácidos individuales de un segmento de polipéptido HAI que se prepararon y caracterizaron (mediante estudios de unión de tipo ELISA) en menos de cuatro semanas. Houghten, R. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985). Este proceso de “síntesis peptídica múltiple simultánea (SMPS)” se describe adicionalmente en la patente U.S. nº 4.631.211 de Houghten et al. (1986). En este procedimiento, las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de diversos péptidos están contenidas en paquetes permeables a disolventes separados, que permiten el uso óptimo de las muchas etapas repetitivas idénticas implicadas en los métodos de fase sólida.

Un procedimiento manual permite que se lleven a cabo simultáneamente 500-1000 o más síntesis. Houghten et al., más arriba en 5134.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que poseen epítopos se usan para inducir anticuerpos según métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., más arriba; Wilson et al., más arriba; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985).

Generalmente, los animales se pueden inmunizar con péptido libre; sin embargo, el título de anticuerpo antipeptídico se puede incrementar acoplando el péptido a un portador macromolecular, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) o toxoide tetánico. Por ejemplo, los péptidos que contienen cisteína se pueden acoplar a un portador usando un ligador tal como éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), mientras que otros péptidos se pueden acoplar a un portador usando un agente ligante más general, tal como glutaraldehído.

Los animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan con péptidos libres o acoplados al portador, por ejemplo mediante inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen alrededor de 100 ug de péptido o proteína portadora y adyuvante de Freund. Pueden ser necesarias varias revacunaciones, por ejemplo a intervalos de alrededor de dos semanas, para proporcionar un título útil de anticuerpo antipeptídico que se puede detectar, por ejemplo, mediante ensayo ELISA usando un péptido libre adsorbido a una superficie sólida. El título de anticuerpos antipeptídicos en el suero procedente de un animal inmunizado se puede incrementar seleccionando anticuerpos antipeptídicos, por ejemplo mediante adsorción al péptido sobre un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados según métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos de la invención que poseen epítopos inmunógenos, es decir, aquellas partes de una proteína que provocan una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunógeno, se identifican según métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Geysen et al., 1984, más arriba, describen un procedimiento para la síntesis concurrente rápida sobre soportes sólidos de cientos de péptidos de suficiente pureza para que reaccionen en un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas. La interacción de los péptidos sintetizados con los anticuerpos se detecta entonces fácilmente sin retirarlos del soporte. De esta manera, un péptido que posee un epítopo inmunógeno de una proteína deseada se puede identificar de forma habitual por cualquier experto en la técnica. Por ejemplo, el epítopo inmunológicamente importante en la proteína de recubrimiento del virus de la glosopeda fue localizado por Geysen et al. con una resolución de siete aminoácidos mediante síntesis de un conjunto solapante de todos los 208 hexapéptidos posibles que cubren toda la secuencia de 213 aminoácidos de la proteína. Después, se sintetizó un conjunto de sustitución completo de péptidos en el que los 20 aminoácidos se sustituyeron a su vez en cada posición dentro del epítopo, y se determinaron los aminoácidos particulares que confieren especificidad para la reacción con el anticuerpo. De este modo, mediante este método se pueden obtener de forma habitual análogos peptídicos de los péptidos de la invención que poseen epítopos. La patente U.S. nº 4.708.781 de Geysen (1987) describe además este método para identificar un péptido que posee un epítopo inmunógeno de una proteína deseada.

Todavía más, la patente U.S. nº 5.194.392 de Geysen (1990) describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos) que es un equivalente topológico del epítopo (es decir, un “mimétopo”) que es complementario a un paratopo particular (sitio de unión a antígeno) de un anticuerpo de interés. Más generalmente, la patente U.S. nº 4.433.092 de Geysen (1989) describe un método para detectar o determinar una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfico de un ligando que es complementario al sitio de unión a ligando de un receptor particular de interés. De forma similar, la patente U.S. nº 5.480.971 de Houghten, R.A. et al. (1996) en Mezclas Oligopeptídicas Peralquiladas describe oligopéptidos peralquilados de alquilo C1-C7 lineales, y conjuntos y librerías de tales péptidos, así como métodos para usar tales conjuntos y librerías de oligopéptidos para determinar la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se une preferentemente

a una molécula aceptora de interés. De este modo, mediante estos métodos se pueden obtener de forma habitual análogos no peptídicos de los péptidos de la invención que poseen epítopos.

Eliminación o reducción de la actividad de proteasa

La presente invención también se refiere a métodos para producir una célula mutante de una célula progenitora, que 5 comprende destruir o suprimir una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteasa o una secuencia de control de la misma, que da como resultado que la célula mutante produzca menos proteasa que la célula progenitora.

La construcción de cepas que tienen actividad reducida de proteasa se puede lograr convenientemente modificando

o inactivando una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de la actividad de proteasa en la célula. La secuencia de ácido nucleico a modificar o inactivar puede ser, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteasa o una parte de la misma esencial para mostrar actividad de proteasa; o la secuencia de ácido nucleico puede tener una función reguladora necesaria para la expresión de la proteasa a partir de la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico. Un ejemplo de tal secuencia reguladora o de control puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte que es suficiente para afectar a la expresión de la proteasa. Otras secuencias de control para la posible modificación incluyen, pero no se limitan a,

15 una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, una secuencia señal, y un sitio de terminación.

La modificación o inactivación de la secuencia de ácido nucleico se puede realizar sometiendo a la célula a mutagénesis y seleccionando células en las que se ha reducido o eliminado la capacidad de producir proteasa. La mutagénesis, que puede ser específica o aleatoria, se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, mediante uso de un oligonucleótido adecuado, o sometiendo a la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis se puede llevar a cabo mediante uso de cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes. Los ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente fin incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N’-nitro-Nnitrosoguanidina (MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, metanosulfonato de etilo (EMS), bisulfito de sodio,

25 ácido fórmico, y análogos nucleotídicos. Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis se lleva a cabo típicamente incubando la célula a mutagenizar en presencia del agente mutagenizante de elección, en condiciones adecuadas, y seleccionando células que presentan una expresión reducida o ninguna expresión de la actividad de proteasa.

La modificación o inactivación de la producción de una proteasa de la presente invención se puede lograr mediante introducción, sustitución, o eliminación de uno o más nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteasa o un elemento regulador requerido para la transcripción o traducción de la misma. Por ejemplo, se pueden insertar o eliminar nucleótidos para dar como resultado la introducción de un codón de parada, la eliminación del codón de parada, o un cambio del marco de lectura abierto. Tal modificación o inactivación se puede lograr mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis generada por PCR, según métodos conocidos en la técnica.

Aunque, en principio, la modificación se puede llevar a cabo in vivo, es decir, directamente sobre la célula que

35 expresa la secuencia de ácido nucleico a modificar, se prefiere que la modificación se lleve a cabo in vitro, como se ejemplifica a continuación.

Un ejemplo de una manera conveniente para inactivar o reducir la producción mediante una célula hospedante de elección se basa en técnicas de sustitución génica o interrupción génica. Por ejemplo, en el método de interrupción génica, se mutageniza in vitro una secuencia de ácido nucleico que corresponde al gen endógeno o fragmento génico de interés para producir una secuencia de ácido nucleico defectuosa, la cual se transforma entonces en la célula hospedante para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación homóloga, la secuencia de ácido nucleico defectuosa sustituye al gen endógeno o fragmento génico. Puede ser deseable que el gen o fragmento génico defectuoso también codifique un marcador que se puede usar para la selección de transformantes en los que el gen que codifica la proteasa se ha modificado o destruido.

45 Como alternativa, la modificación o inactivación de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteasa de la presente invención se puede llevar a cabo mediante técnicas antisentido consolidadas, usando una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia que codifica la proteasa. Más específicamente, la producción de la proteasa por una célula se puede reducir o eliminar introduciendo una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteasa, que se puede transcribir en la célula y es capaz de hibridarse al ARNm de proteasa producido en la célula. Se reduce o elimina así la cantidad de proteasa traducida, en condiciones que permiten que la secuencia nucleotídica antisentido complementaria se hibride al ARNm de proteasa.

Se prefiere que la célula a modificar según los métodos de la presente invención sea de origen microbiano, por ejemplo una cepa fúngica que es adecuada para la producción de productos proteicos deseados, ya sea homólogos

55 o heterólogos a la célula.

La presente invención se refiere además a una célula mutante de una célula progenitora que comprende una interrupción o supresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteasa o una secuencia de control de la misma, lo que da como resultado que la célula mutante produzca menos proteasa que la célula progenitora.

Las células mutantes así creadas, deficientes en proteasa, son particularmente útiles como células hospedantes para la expresión de polipéptidos homólogos y/o heterólogos. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a métodos para producir un polipéptido homólogo o heterólogo, que comprenden (a) cultivar la célula mutante en condiciones que conduzcan a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. En el presente contexto, la expresión “polipéptidos heterólogos” se define aquí como polipéptidos que no son nativos a la célula hospedante, una proteína nativa en la que se han realizado modificaciones que alteran la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión está alterada cuantitativamente como resultado de la manipulación de la célula hospedante mediante técnicas de ADN recombinante.

Los métodos de la presente invención para producir un producto esencialmente libre de proteasa son de particular interés en la producción de polipéptidos eucariotas, en particular proteínas fúngicas tales como enzimas. Las células deficientes en proteasa también se pueden usar para expresar proteínas heterólogas de interés para la industria alimentaria, o de interés farmacéutico.

Uso de proteasas en procesos industriales

La invención también se refiere al uso de la proteasa según la invención en un número selecto de procesos industriales y farmacéuticos. A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procesos, la proteasa según la invención posee un número de ventajas significativas con respecto a las enzimas usadas actualmente. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos como menores costes de producción, mayor especificidad frente al sustrato, menor antigenicidad, menos actividades secundarias indeseables, mayores rendimientos cuando se producen en un organismo adecuado, intervalos de pH y temperatura más adecuados, mejores sabores del producto final, así como aspectos de kósher y grado alimentario.

En aplicaciones industriales a gran escala dirigidas a la producción de alimentos o de piensos, las enzimas proteolíticas se usan habitualmente para mejorar aspectos como la solubilidad de la proteína, rendimientos de la extracción, viscosidad o sabor, textura, valor nutricional, minimización de la antigenicidad o factores antinutricionales, color o funcionalidad, así como aspectos del procesamiento como capacidad de filtración de la materia prima proteinosa. En estas aplicaciones, la materia prima proteinosa puede ser de origen animal o vegetal, y los ejemplos incluyen proteínas vegetales tales como proteína de soja, gluten de trigo, proteína de colza, proteína de guisante, proteína de alfalfa, proteína de girasol, proteína de haba, proteína de semilla de algodón o de sésamo, proteína de maíz, proteína de cebada, proteína de sorgo, proteína de patata, proteína de arroz, proteínas de café, y proteína derivada de animales, tales como proteína láctea (por ejemplo caseína, proteína del suero), clara de huevo, proteína de pescado, proteína de carne, incluyendo gelatina, colágeno, proteína de la sangre (por ejemplo hemoglobina), pelo, plumas y harina de pescado.

Un aspecto importante de las proteasas según la invención es que cubren un intervalo completo de óptimos de pH y temperatura que son adecuados idealmente para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, muchos procesos a gran escala se benefician de temperaturas de procesamiento relativamente elevadas, de 50 grados C o superiores, para controlar los riesgos de infecciones microbianas. Varias proteasas según la invención cumplen con esta demanda, pero al mismo tiempo muestran estabilidades térmicas no extremas, de manera que resisten los intentos para inactivar la enzima mediante un tratamiento térmico adicional. Este último rasgo permite rutas de producción que producen productos finales libres de actividad proteolítica residual. De forma similar, muchos productos de piensos y de alimentos tienen valores de pH ligeramente ácidos, de forma que se prefieren, para su procesamiento, proteasas con óptimos de pH ácidos o casi neutros. Una proteasa según la invención cumple igualmente con este requisito.

La especificidad de las endoproteasas se define habitualmente en términos de escisiones preferentes de enlaces entre el carboxilo del resto del aminoácido en la posición P1 y el grupo amino del resto en la posición P1’, respectivamente. La preferencia puede estar condicionada predominantemente por P1 (por ejemplo restos cargados positivamente en sustratos para tripsina), por P1’ (por ejemplo restos hidrófobos en escisiones mediante termolisina), o por tanto P1 como P2 (por ejemplo escisiones específicas entre dos restos cargados positivamente mediante serina endoproteasa de la médula suprarrenal). En algunos casos, restos más distantes pueden determinar la preferencia de la escisión, por ejemplo P2 para peptidasa A estreptocócica. Se sabe que algunos restos influyen negativamente sobre las escisiones; es bien conocido que los enlaces con prolina en la posición P1’ son resistentes a la acción de muchas proteasas. La mayoría de las endoproteasas escinden preferentemente en un entorno hidrófobo o en la cercanía de restos cargados negativamente. Por ejemplo, las endoproteasas disponibles industrialmente como quimiotripsina (obtenida de páncreas bovino) o subtilisina, metaloproteasa neutra o termolisina (todas obtenidas de la especie Bacillus) tienden a favorecer la escisión “por detrás” de los aminoácidos hidrófobos como –Phe, -Leu y –Tyr. Otras endoproteasas disponibles industrialmente (obtenidas de páncreas bovino) escinden preferentemente detrás de –Arg y –Lys, y la papaína (una mezcla compleja de diversas enzimas que incluyen proteasas obtenidas de las frutas de la papaya) escinden preferentemente por detrás de –Arg.

En contraste, los enlaces peptídicos formados por restos de pequeño tamaño tales como Ala, Gly, Ser, Thre, así como Ile y Pro, son malos sustratos (Keil, B et al.; Protein Seq Data Anal (1993) 5; 401-407). Esta situación tiene profundas implicaciones para la industria farmacéutica, la industria de bebidas y de alimentos, la agroindustria e incluso para la industria química. Una proteasa según la invención presenta preferencias de escisión no habituales.

Las exopeptidasas actúan sólo cerca de los extremos de las cadenas polipeptídicas. Aquellas que actúan en el término N libre liberan un resto de aminoácido individual (denominadas aminopeptidasas) o un dipéptido o un tripéptido (denominadas dipeptidil-peptidasas y tripeptidil-peptidasas). Aquellas que actúan en el término C libre liberan un único resto (las denominadas carboxipeptidasas) o un dipéptido (las denominadas peptidil-dipeptidasas). Las carboxipeptidasas están destinadas a tres grupos en base al mecanismo catalítico, es decir, carboxipeptidasas de tipo serina, metalocarboxipeptidasas, y carboxipeptidasas de tipo cisteína. Otras exopeptidasas son específicas para dipéptidos (las denominadas dipeptidasas), o son capaces de escindir enlaces peptídicos diferentes de aquellos de los grupos alfa-carboxílico o alfa-amínico (las denominadas omega peptidasas). Los ejemplos de tales nuevas omega peptidasas son la piroglutamil-peptidasa y la acilaminoacil-peptidasa como se identifica en la presente invención (véase la Tabla 1, genes 18 y 45, respectivamente).

Los ejemplos típicos de aplicación industrial que dependen del uso de endoproteasas puras y en los que se puede esperar que la proteasa según la invención suministre un comportamiento superior incluyen el procesamiento de materiales de origen vegetal o animal. Estas etapas de procesamiento se pueden dirigir a modificar un gran conjunto de características del material bruto o de la fracción proteica (parcialmente) purificada. Por ejemplo, estas etapas de procesamiento se pueden dirigir a maximizar las solubilidades de los productos, las capacidades de filtración, las capacidades de separación, los rendimientos de la extracción proteica y las capacidades de digestión, o a minimizar toxicidades, malos sabores y viscosidades. Además, el tratamiento se puede dirigir a alterar características físico-químicas del material crudo o de la proteína purificada (o parcialmente purificada). Estas ventajas se aplican no sólo si la endoproteasa según la invención se aplica como un auxiliar del procesamiento en aplicaciones industriales, sino también si se aplica como un componente enzimático activo en el pienso para animales. Específicamente, la endoproteasa según la invención se puede aplicar como un mejorador del pan en la industria panadera, por ejemplo para retardar el endurecimiento del pan, o para disminuir la viscosidad de las masas. O la endoproteasa se puede usar en la industria cervecera y vinícola, para prevenir o minimizar la formación de enturbiamientos proteicos indeseables. Como alternativa, se puede usar en la industria cervecera para optimizar los rendimientos de extracción de la proteína de cereales usados en la preparación del mosto. Además, se puede usar también ventajosamente en la industria láctea como agente de coagulación de la leche, con características superiores, o para optimizar las características de texturización, espumación o endurecimiento de diversos componentes de la leche. Otra aplicación en la industria láctea es el uso de la nueva proteasa en la preparación de quesos modificados con enzimas (EMC).

Además, diversos sustratos proteinosos se pueden someter a una endoproteasa según la invención, habitualmente en combinación con otras enzimas proteolíticas, para obtener hidrolizados para aplicaciones médicas o no médicas. Aquí, la endoproteasa según la invención es sorprendentemente eficaz logrando una hidrólisis completa del sustrato proteinoso de manera que se hidrolizan completamente incluso las partes resistentes a proteasas; la endoproteasa también es sorprendentemente activa minimizando la alergenicidad del hidrolizado final, o suprimiendo la formación de sabores amargos desagradables.

Más específicamente, la endoproteasa según la invención se caracteriza por su preferencia por escindir proteínas en enlaces peptídicos no habituales, especialmente con los restos de aminoácidos de pequeño tamaño de Ala, Gly, Ser y Thr, o los restos de Ile y Pro en la posición P1 o la P1’ (Keil, B et al.; Protein Seq Data Anal (1993) 5; 401-407). Como resultado, aquellas fracciones de los materiales de partida proteinosos que resisten la hidrólisis al usar endoproteasas de la técnica anterior, se pueden disolver e hidrolizar usando la endoproteasa según la invención. Los ejemplos no limitantes de tales fracciones resistentes a proteasas incluyen las denominadas extensinas en materiales vegetales y colágeno, gelatina pero también componentes lácteos específicos en el material de origen animal.

Diversos productos alimentarios, tales como, por ejemplo, habas de soja, contienen inhibidores de tripsina. Estas proteínas inhiben la actividad de tripsina en el tubo digestivo de, por ejemplo, cerdos y aves de corral. Esta actividad inhibidora de tripsina da como resultado una digestibilidad proteica subóptima en estos animales, dando como resultado un aumento de la producción de desechos y una mala economía. Este problema se puede superar en parte tostando habas de soja a temperaturas elevadas. Se han identificado en habas de soja dos tipos diferentes de inhibidores de tripsina, es decir, los inhibidores de tripsina de tipo Bowman-Birk, y los inhibidores de tripsina de tipo Kunitz.

La invención proporciona ahora una manera alternativa para degradar la actividad inhibidora de tripsina con respecto al tostado, por cuanto proporciona una cisteína proteasa (EC 3.4.22, tabla 1) capaz de escindir el enlace peptídico de leucina 176-aspartato 177 cerca del término carboxílico del inhibidor de tripsina de tipo Kunitz (según se repasa en Wilson (1988) en CRC Critical Reviews in Biotechnology 8 (3): 197-216). Esto da como resultado la inactivación de este inhibidor de tripsina en haba de soja. Se encontró sorprendentemente que las cisteína proteasas segregadas por el hongo Aspergillus niger satisficieron estos criterios mucho mejor que enzimas similares derivadas de otros organismos.

Las proteasas también se usan ampliamente en la técnica de obtención de quesos. En la producción de quesos, es necesario coagular la leche del queso para ser capaces de separar las materias del queso, por ejemplo caseína, del suero de la leche. Se han descrito varias enzimas que coagulan la leche, también denominadas como coagulantes, e incluyen quimiosina (bovina), pepsina bovina, pepsina porcina, así como enzimas microbianas como proteasa de Rhizomucor miehei, proteasa de Rhizomucor pusillus, y proteasa de Cryptonectria parasitica. La quimiosina se

puede obtener de estómagos de ternera, pero también se puede producir de forma microbiana, por ejemplo, mediante Kluyveromyces lactis. Todas estas enzimas se caracterizan por tener una especificidad por el enlace peptídico entre el resto 105 (fenilalanina) y el resto 106 (metionina), o el enlace adyacente a aquel en N-caseína. Esto significa que, empleando estas enzimas en la obtención de quesos, la N-caseína se divide en la unión entre para-N-caseína y el resto macropeptídico denominado glucomacropéptido (GMP) que posee las cargas negativas. Cuando esto ocurre, el macropéptido se difunde en el suero lácteo, se pierde su efecto estabilizante sobre la solubilidad de las micelas de caseína, y las micelas de caseína pueden comenzar a agregarse una vez que se ha hidrolizado suficiente kappa-caseína. Para una elaboración adicional sobre la coagulación enzimática de la leche (por ejemplo D.G. Dalgleish en Advanced Dairy Chemistry vol. 1 editado por P.F. Fox, Elsevier, Londres, 1992).

Los coagulantes actualmente disponibles permiten un rendimiento más bien elevado de quesos; sin embargo, se debería observar que, debido a los enormes volúmenes de queso producidos, un aumento del rendimiento del orden de magnitud de decenas de puntos porcentuales puede constituir una ventaja económica sustancial. En consecuencia, existe una gran necesidad en la técnica de coagulantes con un rendimiento (incluso ligeramente) mejorado.

Los coagulantes se caracterizan por su elevada especificidad por el sustrato, que, sin embargo, depende del pH y de la temperatura. En un proceso típico de obtención de queso, el pH cambiará desde el pH inicial de 6,3 a valores de pH más bajos, en el intervalo de 4,5-5,5, dependiendo el valor final de las condiciones usadas durante el proceso de producción del queso. Algunos coagulantes son más sensibles a los cambios de pH que otros. La proteasa de Rhizomucor pusillus, por ejemplo, es más sensible a cambios de pH que la quimiosina. Además del pH, también otros parámetros, como la temperatura y el contenido de agua, pueden afectar a la especificidad de la proteasa. Es bien sabido que la mayoría de los coagulantes muestran una especificidad cambiante por el sustrato cuando cambia el pH, dando como resultado una actividad proteolítica alterada en las etapas finales del proceso de obtención del queso. También es bien conocido que los coagulantes difieren en el grado de proteolisis de la caseína; pueden mostrar también diferencias en los patrones peptídicos producidos durante la proteolisis. Hay factores relevantes durante la maduración del queso, y pueden afectar a las propiedades del queso como sabor, aroma y textura. En algunos casos, los coagulantes dan lugar a efectos indeseados, como la formación de péptidos de sabor amargo, o malos sabores. Además, los cambios en la especificidad proteolítica pueden conducir a una reducción del rendimiento. La pepsina, un componente bien conocido en muchas preparaciones de quimiosina bovina, es un ejemplo de una proteasa que da lugar a menores rendimientos y efectos de sabor cuando se compara con la quimiosina pura. Todavía existe la necesidad de coagulantes que den lugar a una nueva textura y sabor mejorados del queso. Tales nuevos coagulantes dan como resultado el desarrollo acelerado de perfiles de sabor y textura relacionados con el envejecimiento de los quesos, proporcionando con ello un beneficio económico sustancial.

Es bien sabido que los aminoácidos libres son muy importantes en la generación de sabor y aroma. Especialmente, los aminoácidos leucina, fenilalanina, metionina y valina desempeñan un papel importante en la generación de componentes de sabor y aroma típicos del queso. Los aminoácidos libres se convierten, vía fermentación por microorganismos que son añadidos durante el proceso de fabricación del queso, en los compuestos reales generadores de aroma y sabor, como metanodiol, disulfuro de dimetilo, ácido metilpropanoico y metilpropanal. Las exopeptidasas desempeñan un papel importante en la generación de aminoácidos libres. Sin embargo, sólo pueden ser eficaces cuando se combinan con una endoproteasa de especificidad apropiada. Se pueden usar combinaciones apropiadas de exo- y endopeptidasas en la obtención de quesos, dando como resultado la fabricación de quesos con perfiles de sabor nuevos y mejorados.

Las enzimas según la invención se pueden usar para hidrolizar materiales proteinosos de origen animal, tales como leche entera, leche desnatada, caseína, proteína del suero, o mezclas de caseína y proteína de suero. Tales mezclas de caseína y proteína de suero se pueden usar, por ejemplo, en relaciones similares a las encontradas en la leche humana. Además, la mezcla enzimática según la invención se puede usar para hidrolizar materiales proteinosos de origen vegetal, tales como, por ejemplo, gluten de trigo, cebada malteada o sin maltear u otros cereales usados para obtener cerveza, leche de soja, sus concentrados o aislados, concentrados proteicos de maíz y sus aislados, y proteínas de arroz.

Dentro del área de procesos industriales a gran escala, algunas aplicaciones se basan sólo en el uso de endoproteasas, mientras que en otras aplicaciones son esenciales las combinaciones de endoproteasas con exoproteasas. Los ejemplos típicos que dependen del uso de endoproteasas puras y en los que la proteasa según la invención puede proporcionar un comportamiento superior incluyen aplicaciones como el procesamiento de proteínas de soja o de guisantes o de cereales dirigido a minimizar viscosidades u optimizar la espumación u otras características físico-químicas, mejoradores del pan en la industria panadera también dirigidos a disminuir la viscosidad de las masas, auxiliares del procesamiento en la industria cervecera y vinícola dirigidos a la prevención de enturbiamientos proteicos o a optimizar los rendimientos de extracción de cereales, aditivos alimentarios en la bioindustria dirigidos a potenciar la absorción intestinal o a modular las actividades microbianas en el intestino, auxiliares del procesamiento en la industria láctea dirigidos a optimizar las características de coagulación, espumación o endurecimiento de diversos componentes de la leche. Además, para segmentos de mercados específicos, las proteínas derivadas de la leche o de la soja o del colágeno se exponen a proteasas para producir los denominados hidrolizados proteicos. Aunque los principales mercados de estos hidrolizados proteicos son fórmulas infantiles y productos alimentarios para personas hospitalizadas, los productos destinados a personas sin

necesidades médicas, tales como atletas, o personas en una dieta de adelgazamiento, forman un segmento que crece rápidamente. En todas estas aplicaciones, los hidrolizados proteicos ofrecen ventajas atractivas, tales como alergenicidades reducidas, captación gastrointestinal facilitada, menor deterioro químico de aminoácidos deseables como glutamina y cisteína, y, finalmente, ausencia de precipitación proteinosas en bebidas ácidas durante períodos de almacenamiento prolongados. Todas estas ventajas se pueden combinar si el hidrolizado se ofrece como una mezcla de di-y tripéptidos. Sin embargo, actualmente todos los hidrolizados comercialmente disponibles se producen combinando varias endoproteasas. Este último enfoque implica una degradación no uniforme e incompleta de la proteína. Para obtener la mezcla deseada de di- y tripéptidos, sería ideal un proceso de hidrólisis que implicase una combinación de diversos di- y tripeptidil peptidasas. Desafortunadamente, sólo se conocen unas pocas de estas enzimas procedentes de microorganismos de grado alimentario e industrialmente aceptables, sin mencionar industrialmente disponibles. Según la invención, varias de las di- y tripeptidil peptidasas enormemente útiles son obtenibles económicamente en un estado relativamente puro. Se prefieren aquellas di- o tripeptidil peptidasas que presentan una baja selectividad por el sustrato a escindir, es decir, presentan sólo mínimas preferencias por la escisión de restos de aminoácidos. Se prefieren las combinaciones de aquellas di- o tripeptidil peptidasas que hidrolizan un porcentaje elevado de los enlaces peptídicos de origen natural. A pesar de esta elevada actividad hacia enlaces peptídicos de origen natural, se evita la hidrólisis total hasta aminoácidos libres por la naturaleza de las di- y tripeptidil peptidasas. También se prefieren aquellas di- o tripeptidil peptidasas que son óptimamente activas entre pH 4 y 8, y muestran una estabilidad adecuada de temperatura. La estabilidad adecuada de temperatura implica que al menos 40%, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente entre 70 y 100% de la actividad hidrolítica inicial sobrevive después de calentar la enzima junto con el sustrato durante 1 hora a 50 grados C.

Aunque el proceso con respecto a una producción eficiente de mezclas de di- o tripéptidos o di-y tripéptidos depende de la disponibilidad de las enzimas según la invención, la primera incubación enzimática con el sustrato proteinoso será habitualmente una endoproteasa. Preferiblemente, una endoproteasa con una endopeptidasa de amplio espectro adecuada para la situación, por ejemplo subtilisina (Delvolase de DSM), metaloproteasa neutra (Neutrase de NOVO) o termolisina (Thermoase de Daiwa Kasei) para las condiciones casi neutras, y pepsina o aspergilopepsina (por ejemplo Sumizyme AP de Shin Nihon, Japón) para las condiciones ácidas. El objetivo de esta primera digestión es mejorar la solubilidad, reducir la viscosidad, y reducir las características de termoendurecimiento de la mezcla de agua/proteína. Además, este pretratamiento con una endonucleasa es esencial para crear suficientes puntos de partida para las di- y tripeptidil peptidasas, acelerando con ello el proceso de la formación de di- o tripéptidos. Opcionalmente, en esta etapa del proceso, o más tarde, se puede incluir una proteasa destinada a desamargar el hidrolizado, junto con las di- o tripeptidil peptidasas.

El objetivo principal de estos últimos hidrolizados es minimizar la alergenicidad del producto, o facilitar la captación gastrointestinal. En la producción de tales hidrolizados, es de especial importancia el uso de dipeptidil-y tripeptidilpeptidasas, puesto que estas ofrecen una forma eficiente de producir hidrolizados.

Otras aplicaciones en estas industrias alimentaria y de piensos se basan totalmente en combinaciones de una o más endoproteasas con una o más exoproteasas. Tales combinaciones de una endoproteasa con una exoproteasa se usan típicamente en industrias para mejorar aspectos como el sabor y el color del producto final. La razón para esto es que el desarrollo del sabor y del color depende en gran medida de la presencia de aminoácidos libres. Los aminoácidos libres se pueden obtener no sólo mediante exoproteasas tales como carboxipeptidasas y aminopeptidasas, sino también mediante peptidil-dipeptidasas. Si se combinan con endoproteasas, o incluso con dipeptidil- o tripeptidil-peptidasas, las carboxipeptidasas, aminopeptidasas y peptidil-dipeptidasas pueden crear mayores cantidades de aminoácidos libres en menos tiempo. Sin embargo, en todos estos procesos se debería evitar una liberación incontrolada de aminoácidos o incluso componentes no proteinosos, para minimizar reacciones secundarias indeseables.

Aunque los aminoácidos libres como tales pueden provocar un número de impresiones de sabor, estas impresiones de sabor son muy básicas (amarga, dulce, agria y “umami”), y la concentración de aminoácidos requerida para percibir estos sabores es muy elevada. A pesar de estos valores umbral elevados, los aminoácidos libres son capaces de crear efectos sensoriales importantes a intervalos de concentraciones mucho menores, a través de un número de mecanismos que potencian el sabor. Uno de estos mecanismos implica la combinación de aminoácidos libres con azúcares en las denominadas reacciones de Maillard. Comparados con los aminoácidos libres, con estos productos de Maillard se pueden desarrollar sistemas de sabor y olor abrumadoramente complejos, con valores umbral que son de varios órdenes de magnitud menores que los registrados para los aminoácidos libres. Los productos de Maillard se forman a temperaturas elevadas, habitualmente durante la cocción, horneado o tueste, cuando se preparan productos alimentarios o de piensos. Durante estos tratamientos, se desarrolla tanto color como un gran conjunto de aromas. En estas reacciones, los grupos amino reaccionan con compuestos reductores como primera etapa, y finalmente conducen a una familia completa de rutas de reacción. En alimentos o piensos, los compuestos amínicos implicados son predominantemente aminoácidos libres que son liberados de la materia prima proteinosa mediante diversas proteasas, y los compuestos reductores requeridos representan principalmente azúcares reductores. La implicación es que, durante el procesamiento de la materia prima, se debería evitar la liberación indeseada de aminoácidos libres y azúcares, para minimizar los malos sabores que se podían generar durante etapas subsiguientes de calentamiento, como por ejemplo durante el secado por pulverización o durante la esterilización. Esta última noción enfatiza una vez más el beneficio de la pureza superior y bajos costes en uso de la enzima según la invención.

Aparte de las reacciones de Maillard, los aminoácidos también pueden sufrir importantes transiciones químicas a temperaturas ambiente. Este último tipo de transiciones dependen de las enzimas, y son bastante habituales en alimentos fermentados tales como cerveza, yogur, maduración del queso y procesos de maduración de la carne y del vino. En estos procesos de fermentación, los aminoácidos libres se liberan de las materias primas usadas mediante las proteasas añadidas, o mediante actividad enzimática proteolítica a partir de la materia prima o los fermentos microbianos usados. Durante la fase de maduración, la actividad metabólica microbiana convierte entonces a los aminoácidos libres en derivados con propiedades sensoriales aumentadas. Por ejemplo, L-leucina, Lisoleucina y L-valina conducen a la formación de alcoholes de fusel valiosos como alcoholes amílicos e isobutanol en la fermentación de la cerveza. De forma similar, los volátiles del queso, tales como metanotiol y disulfuro de dimetilo, se han rastreado hasta la aparición de metionina en el queso, así como ácido metilpropanoico y metilpropanal hasta valina. Finalmente, el aminoácido libre glutamato puede crear efectos potenciadores del sabor potentes, debido a su sinergia con los productos de ruptura de ARN, denominados 5’-ribonucleótidos. Si se combinan con las concentraciones apropiadas de 5’-ribonucleótidos, tales como 5’-IMP y 5’-GMP, se sabe que el umbral de detección del sabor de umami generado por glutamato se reduce en casi dos órdenes de magnitud.

A fin de obtener efectos de sabor pronunciados y precisos en todos estos procesos, los sustratos proteinosos se deberían de hidrolizar usando una combinación de una endo- y una exoproteasa, en la que al menos una de las endo- o exoproteasa, preferiblemente tanto la endo- como la exoproteasa, son puras y preferiblemente selectivas con respecto a un conjunto específico de aminoácidos o preferentemente liberan el aminoácido o aminoácidos preferidos. Las proteasas así preferidas se caracterizan por una gran selectividad con respecto a las secuencia de aminoácidos que se pueden escindir, noción la cual hace a la categoría enzimática en Aspergillus conocida como “madurasas” particularmente importante.

Aparte de las industrias alimentaria y de piensos, las proteasas también se aplican habitualmente por las industrias química, farmacéutica, de diagnóstico y de cuidado personal.

En la industria del cuidado personal, las proteasas se usan para crear péptidos que se añaden a una variedad de productos, para mejorar aspectos como la sensación, el brillo o la protección de la piel. Además, hay una nueva tendencia a la aplicación tópica directa de la proteasa. Muy similar al uso enzimático en la industria del cuero, el objetivo primordial en esta última aplicación es limpiar, eliminar el pelo y suavizar la piel.

En la industria química y farmacéutica, las proteasas se están desarrollando como herramientas valiosas para producir ingredientes o intermedios costosos. En estas industrias, las proteasas no sólo se usan debido a su capacidad hidrolítica, sino también debido a su capacidad para sintetizar péptidos de aminoácidos naturales o no naturales. Esta última opción se demuestra claramente mediante la posibilidad de sintetizar aspartamo a partir de sus bloques constructores a base de aminoácidos usando una endoproteasa como termolisina.

A diferencia de la situación en la industria alimentaria y de piensos, la estereo- y regioselectividad de las proteasas también se consideran ventajas importantes, aunque se pueden necesitar condiciones de reacción no habituales para lograr la transformación química deseada. Los ejemplos típicos de la aplicación de proteasas en esta industria incluyen el uso de endoproteasas, aminopeptidasas, así como carboxipeptidasas, en la producción de diversos intermedios para fármacos como insulina, antibióticos, renina, e inhibidores de ACE. En Industrial Biotransformations, A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Wiley-VCH; ISBN 3-527-30094-5 se presenta un repaso de tales usos.

A la vista de las especificidades deseadas, estereo- y regioselectividades, la ausencia de actividades secundarias y la resistencia a condiciones de reacción no habituales tales como concentraciones elevadas de disolventes, el comportamiento mejorado de la proteasa según la invención ofrece ventajas sustanciales.

Desde un punto de vista farmacéutico, el papel de las proteasas se ilustra mediante un número sustancial de referencias en Martindale’s, “The Extra Pharmacopoeia” (Pharmaceutical Press, Londres, UK). Además, el papel importante de proteasas muy específicas a la hora de regular todo tipo de procesos biológicos se ilustra por el hecho de que muchas hormonas se convierten en activas sólo después del procesamiento de una molécula precursora, mayoritariamente inactiva, por tal proteasa muy específica. Los inhibidores activos frente a ciertas categorías de tales proteasas específicas se han visto implicados en el desarrollo de todo tipo de nuevos fármacos. Por lo tanto, ahora se pueden identificar inhibidores nuevos y eficaces para proteasa usando las secuencias proporcionadas aquí.

Tabla 1

Número de SEC ID

Función de la proteína codificada Número EC

Gen

ADNc Proteína

1

58 115 Pepsina A3 EC3.4.23.1

2

59 116 Metaloproteasa EC3.4.24.56

3

60 117 Acilaminoacil-peptidasa EC3.4.19.1

4

61 118 Tripeptidilaminopeptidasa EC3.4.14.

62

119 serina carboxipeptidasa EC3.4.16.6

6

63 120 Serina endoproteasa EC3.4.21.

7

64 121 Carboxipeptidasa Y EC3.4.16.5

8

65 122 aspergilopepsina II - hom EC3.4.23.19

9

66 123 Tripeptidil peptidasa EC3.4.14.9

67

124 Tripeptidil peptidase EC3.4.14.9

11

68 125 aspergilopepsina II – hom EC3.4.23.19

12

69 126 Tripeptidil peptidasa EC3.4.14.9

13

70 127 Metaloproteasa EC3.4.24.

14

71 128 aspergilopepsina I EC3.4.23.18

72

129 Pepsinógeno E EC3.4.23.25

16

73 130 aspergilopepsina I - hom EC3.4.23.18

17

74 131 aspergilopepsina II EC3.4.23.19

18

75 132 Pyro-Glu peptidasa EC3.4.19.3

19

76 133 dipeptidil peptidasa EC3.4.14.2

77

134 aminopeptidasa secr. EC3.4.11.10

21

78 135 D-peptidasa alcalina EC3.4.16.4

22

79 136 Carboxipeptidasa EC3.4.16.1

23

80 137 Carboxipeptidasa EC3.4.16.1

24

81 138 Carboxipeptidasa-II EC3.4.16.1

82

139 proteinasa aspártica EC3.4.23.

26

83 140 Tripeptidil peptidasa EC3.4.14.9

27

84 141 Carboxipeptidasa EC3.4.16.1

28

85 142 cisteína proteinasa EC3.4.22.

29

86 143 Metalocarboxipeptidasa EC3.4.17.

87

144 Subtilisina hom. EC3.4.21.62

31

88 145 Carboxipeptidasa Y EC3.4.16.5

32

89 146 Metaloproteasa EC3.4.24.

33

90 147 Carboxipeptidasa Y EC3.4.16.5

34

91 148 Metaloproteasa EC3.4.24.

92

149 Tripeptidil peptidasa EC3.4.14.9

36

93 150 proteasa aspártica EC3.4.23.24

37

94 151 proteasa aspártica EC3.4.23.24

38

95 152 Pepsina A3 EC3.4.23.1

39

96 153 proteasa aspártica EC3.4.23.24

40

97 154 proteasa aspártica EC3.4.23.24

41

98 155 Kex EC3.4.21.61

42

99 156 Serina proteasa EC3.4.21.

43

100 157 Glutamil endoproteasa EC3.4.21.82

44

101 158 Aspergilopepsina II - hom EC3.4.23.19

45

102 159 acilaminoacil-peptidasa EC3.4.19.1

46

103 160 Tripeptidilaminopeptidasa EC3.4.14.

47

104 161 Serina carboxipeptidasa EC3.4.16.6

48

105 162 Gly-X carboxipeptidasa EC3.4.17.4

49

106 163 proteinasa aspártica EC3.4.23.

50

107 164 Tripeptidil peptidasa EC3.4.14.9

51

108 165 Carboxipeptidasa-I EC3.4.16.1

52

109 166 serina carboxipeptidasa EC3.4.16.6

53

110 167 serina carboxipeptidasa EC3.4.16.6

54

111 168 aminopeptidasa secr. EC3.4.11.10

55

112 169 Prolil endopeptidasa EC3.4.21.26

56

113 170 Aspergilopepsina I - hom EC3.4.23.18

57

114 171 Aminopeptidasa EC 3.4.11.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Evaluación de la actividad proteolítica y especificidad

5 La especificidad de la proteasa se puede explorar usando diversos sustratos peptídicos. Los sustratos sintéticos se usan ampliamente para detectar enzimas proteolíticas en la identificación, en la fermentación, durante el aislamiento, para estudiar la actividad enzimática, para determinar concentraciones enzimáticas, para investigar la especificidad, y para explorar las interacciones con los inhibidores. Para estudiar la actividad de la proteasa, preferiblemente se usan p-nitroanilidas peptídicas, ya que la actividad puede ser seguida de forma continua, y por lo tanto permite la

10 medida cinética. La escisión de p-nitroanilidas peptídicas puede ser seguida midiendo el incremento en la adsorción a 410 nm al liberar 4-nitroanilida. Los sustratos de paranitroanilida se usan generalmente para serina y cisteína proteasas. Además, se usan tioésteres peptídicos y derivados peptídicos de 7-amino-p-metilcumarina. Los tioésteres peptídicos son sustratos muy sensibles para serina y metaloproteasas, que presentan una velocidad de recambio relativamente elevada, puesto que el enlace de tioéster es más fácil de escindir que el enlace amídico. La escisión

15 de los ésteres de tiol puede ser seguida con un reactivo tiólico tal como 4,4-ditiopiridina (324 nm) o ácido 5,5-ditiobis2-nitrobenzoico (405 nm). Habitualmente se observa la misma velocidad incrementada de recambio para la escisión de enlaces de éster con relación al enlace amídico. Los sustratos mejor conocidos para estudiar la actividad de esterasa de las proteasas son los derivados de p-nitrofenol. La liberación de p-nitrofenol se puede monitorizar a diferentes longitudes de onda, dependiendo del pH que se use, por ejemplo alrededor de pH neutro se usa una

20 longitud de onda de 340 nm, mientras que, por encima de pH 9, la monitorización se realiza alrededor de 405 nm. Además, la hidrólisis de los ésteres también puede ser seguida mediante valoración usando equipo medidor del pH. En caso de la medida cualitativa de la actividad de esterasa, se pueden aplicar colorantes sensibles al pH.

Como alternativa, los péptidos se pueden unir a un grupo saliente fluorescente. La proteolisis está acompañada por un incremento en la fluorescencia cuando se monitoriza a las longitudes de onda apropiadas. Habitualmente se usan 25 peptidil 2-naftilamidas y peptidil 4-metil-7-cumarilamidas. La liberación de, por ejemplo, 7-amino-4-metilcumarina se

mide usando una longitud de onda de excitación de 350 nm, y una longitud de onda de emisión de 460 nm. El uso de 7-amino-4-trifluorometilcumarina tiene la ventaja de que el grupo saliente es tanto cromógeno (absorción 380 nm) como fluorógeno (excitación 400 nm, emisión 505 nm). Cuando es esencial que en ambos lados del enlace escindible esté presente un aminoácido, puede ser útil la introducción de un grupo que apague la fluorescencia. Las características generales de tales sustratos son que la secuencia peptídica separa un grupo donante fluorescente de un grupo aceptor, que actúa como el apagador de la fluorescencia. La escisión del enlace peptídico entre el grupo apagador y el fluoróforo conducirá a un incremento sustancial de la fluorescencia. Se han dado a conocer varios pares de donante-aceptor, incluyendo ácido o-aminobenzoico (Abz) como donante y 2,4-dinitrofenilo (Dnp) como aceptor, ácido 5-[(2’-aminoetil)-amino]naftalenosulfónico (EDANS) como donante y ácido 4-[[4’(dimetilamino]fenil]azo]-benzoico (DABCYL) como aceptor. El par Abz/EDDnp representa un par de donante-aceptor muy conveniente, puesto que, tras la hidrólisis total, la fluorescencia aumenta en un factor de 7 a 100, y el espectro de absorción de EDDnp no cambia con el pH. Además, la secuencia peptídica puede contener hasta 10 restos sin pérdida del efecto apagador. A medida que aumenta el tamaño de los péptidos que se conectan, la posición del enlace escindible puede hacerse menos específica. Por lo tanto, además de establecer si se produce la proteolisis, puede ser necesario un análisis adicional de los productos. Esto se puede hacer analizando y separando mediante HPLC los péptidos producidos, y determinando la secuencia de aminoácidos de los fragmentos. Además, la composición peptídica del digerido se puede analizar directamente usando una técnica combinada de HPLC/espectroscopía de masas.

Para estudiar la especificidad de las proteasas, aparte de usar péptidos de secuencia definida, también se pueden usar librerías peptídicas sintéticas. Los péptidos se sintetizan mediante síntesis en fase sólida de manera al azar o semialeatoria. Por ejemplo, Meldal et al. (PNAS USA 91, 3314, 1994) dan a conocer la preparación de una familia de sustratos de proteasa partiendo de H-Lys(Abz)-resina, extendiendo la resina con péptidos hasta una longitud de seis aminoácidos, y finalmente acoplando Tyr(NO2) a los péptidos. Cada perla de resina tiene una secuencia única, y, al tratarla con las proteasas, las más susceptibles se hacen fluorescentes a medida que se libera el péptido que contiene Tyr(NO2). El análisis de secuencia de los péptidos en las susceptibles dará información sobre la información de la proteasa.

La actividad de proteasa se expresa habitualmente en unidades. Generalmente, la unidad estándar internacional (UI) se define como la cantidad de enzima que, en condiciones definidas, transfiere un micromol de sustrato por minuto. Específicamente, con proteasas, la UI se referiría a la hidrólisis de un micromol de enlace peptídico por minuto. Sin embargo, en el caso de unidades de proteasa, las desviaciones de la definición internacional son más una regla que una excepción. Así como con los péptidos modelos, que se escinden específicamente en un enlace, el cálculo de las UI es directo, para sustratos proteinosos, en los que la proteasa puede escindir en diversas posiciones en diverso grado, se usan muchas definiciones de unidad que se desvía. Aparte de una definición de la unidad usada, cualquier experimento de hidrólisis requiere una descripción adecuada de las condiciones en las que se miden las unidades. Tales condiciones comprenden, por ejemplo, la concentración de sustrato, la relación enzima-sustrato, el pH y la temperatura. Los ensayos típicos para determinar la actividad específica de proteasas comprenden un sustrato proteinoso, tal como, por ejemplo, hemoglobina desnaturalizada, insulina o caseína. El sustrato polipeptídico es digerido por una proteasa en condiciones fijas durante un intervalo de tiempo fijo. Los polipéptidos sin digerir y grandes son precipitados con TCA, y el producto soluble en TCA se determina midiendo la absorbancia a 220 ó 280 nm, o valorando los péptidos solubles con el reactivo de folina, ninhidrina, fluro 2,4, dinitrobenceno/cloruro de dansilo, método de TNBS, o fluoresceína. En lugar de marcar el producto después de la hidrólisis, también se pueden usar sustratos polipeptídicos que ya están marcados por colorantes específicos o fluoróforos, tales como, por ejemplo, fluoresceína. Además, se pueden aplicar métodos estándar de análisis de aminoácidos usando analizadores estándar de laboratorio. A fin de obtener una idea de la distribución de tamaños de los péptidos generados por una proteasa, se pueden llevar a cabo experimentos de cromatografía en gel. Además de esto, se aplica HPLC usando técnicas de fase inversa, a fin de obtener una mejor resolución de los patrones peptídicos generados por la proteasa. El transcurso de la hidrólisis de los sustratos proteinosos se expresa habitualmente en grado de hidrólisis o DH. En el caso en el que se use la cifra de pH para seguir el transcurso de la hidrólisis, el DH se puede derivar a partir del consumo de base durante la hidrólisis (Enzymatic Hydrolysis of Food Protein, J. Adler-Nissen, 1986, Elsevier Apllied Science Publishers LTD). El DH está relacionado con diversas propiedades funcionales útiles del hidrolizado, tales como solubilidad, capacidad emulsionante, espumación y estabilidad de la espuma, expansión del batido, cualidad organoléptica. Además, el sabor es un aspecto importante de los hidrolizados de grado alimentario. El amargor puede ser un problema importante en hidrolizados proteicos. La terminación de la reacción de hidrólisis se puede realizar cambiando el pH, mediante inactivación térmica, agentes desnaturalizantes tales como SDS, acetonitrilo, etc.

Los polipéptidos mostrados en la Tabla 1 se expresaron y se purificaron al menos parcialmente según procedimientos estándar conocidos en la técnica. Se analizaron según al menos uno de los métodos descritos anteriormente, y se encontró que tienen las actividades enunciadas en la Tabla 1.

Ejemplo 2

Determinación directa de la relación kcat/Km para sustratos de proteasa

Se pueden usar sustratos sintéticos para monitorizar la actividad enzimática durante la purificación, para determinar la concentración enzimática, para determinar las constantes de inhibición, o para investigar la especificidad del sustrato. La determinación de la relación kcat/Km da una medida de la especificidad del sustrato. Permite comparar la especificidad de diferentes sustratos por una enzima, o la comparación de las velocidades de hidrólisis con diferentes enzimas que escinden al mismo sustrato. Esta relación tiene una unidad de una constante de velocidad de segundo orden, y entonces se expresa como 1/(concentración.tiempo). Se considera que los sustratos que tienen una relación kcat/Km en el intervalo de 10,5-10,6 M-1.s-1 son muy buenos sustratos, es decir, tienen buena afinidad y un recambio rápido. Sin embargo, algunos sustratos pueden ser muy específicos con valores de kcat/Km en el intervalo de 10.4 M-1.s-1.

La relación kcat/Km se puede calcular después de la determinación de los parámetros individuales. En ese caso, Km y Vm se pueden obtener a partir de diversas representaciones gráficas lineales (por ejemplo el método de Hanes o de Cornish-Bowden, o mediante un método de regresión no lineal. Sabiendo que Vm = kcat.Et (en la que Et es la concentración de enzima activa final), entonces kcat = Vm/Et. La determinación de la relación Kcat/Km por el método anterior se puede evitar cuando se produce la inhibición del producto o del sustrato, o cuando el sustrato precipita a concentración elevada. Sin embargo, es posible obtener un valor exacto de la relación kcat/Km trabajando en condiciones de primer orden, es decir, a una concentración de sustrato muy por debajo de la Km estimada. En estas condiciones, la ecuación de Michaelis-Menten: v = (Vm.S)/(Km + S) se convierte en:

v = (Vm.S)/Km puesto que S « Km

o v = (Vm/Km).S = kobs. S = -dS/dt

que se integra como lnS = -kobs.t + lnSo, en la que So es la concentración de sustrato de partida y S es la concentración de sustrato en un tiempo dado. La velocidad es proporcional a la concentración de sustrato. En otras palabras, la hidrólisis del sustrato obedece a un proceso de primer orden, con kobs como la constante de velocidad de primer orden. kobs = Vm/Km = (kcat.Et)/Km puesto que Vm = kcat.Et.

Un registro continuo de la hidrólisis del sustrato permitirá la determinación de kobs a partir de la gráfica de lnS frente al tiempo. La relación kcat/Km se infiere simplemente a partir de kobs con tal de que se sepa la concentración de enzima activa:

kcat/Km = kobs/Et

Método de ensayo: usar una concentración de sustrato de partida muy por debajo de la Km estimada, y una concentración enzimática baja para permitir registrar la hidrólisis del sustrato. Se obtendrá una curva de primer orden para la generación del producto:

tras la hidrólisis total del sustrato, la absorbancia (o unidades de fluorescencia) del producto permitirá la determinación exacta de So, puesto que Pt = So. kobs se determina a partir de la pendiente de la gráfica de lnS frente al tiempo, o, como alternativa, usando un software de ajuste (Enzfitter, SigmaPlot…).

Nota: No se olvide de calcular la concentración de sustrato para cualquier tiempo dado a partir de la concentración del producto (S = So – P), puesto que la representación gráfica de P frente al tiempo no proporcionaría la kobs correcta (dP/dt = kobs.S no se integra de la misma manera).

Como alternativa, se puede medir t1/2 (semitiempo) sucesivo a partir de la curva de aparición del producto, puesto que en el proceso de primer orden:

t1/2 = ln2/kobs = 0,693/kobs, entonces kobs = 0,693/t1/2

El uso de este método permite comprobar que se tiene un decaimiento de primer orden verdadero (valores idénticos para los t1/2 sucesivos).

Ejemplo 3

Inactivación de genes de proteasa en Aspergillus

La forma más conveniente para inactivar genes de proteasa en el genoma de Aspergillus es la técnica de sustitución de genes (también denominada “ruptura génica de una etapa”). Los principios básicos de esta técnica se han descrito por Rothstein RJ en Meth. Enzymol. 101, p. 202, 1983. Esencialmente, la técnica se basa en la recombinación homóloga de fragmentos de ADN transformados con el ADN genómico de una célula fúngica. Vía cruzamiento doble, el gen a inactivar se sustituye (parcialmente) por el fragmento de ADN con el que se transforma la célula. Preferiblemente, el fragmento de ADN transformado contiene un gen marcador seleccionable para Aspergillus niger. Básicamente, la manipulación de ADN y la generación de un constructo de inactivación se realizan

usando técnicas generales de biología molecular. En primer lugar, se aísla ADN genómico de la cepa de Aspergillus niger, que se usa más tarde para la inactivación del gen de la proteasa. El ADN genómico de A. niger se puede aislar por cualquiera de las técnicas descritas, por ejemplo mediante el método descrito por de Graaff et al. (1988) Curr. Genet. 13, 315-321, y conocidas por la persona experta en la técnica. Este ADN genómico se usa como molde para la amplificación de las regiones de flanqueo del gen de proteasa, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Con regiones de flanqueo se quiere decir aquí las regiones no codificantes en dirección 5’ y en dirección 3’ del gen de proteasa que se inactivarán. Preferiblemente, las regiones de flanqueo deberían tener cada una más de 1,0 kb de longitud.

Para el cebado de la amplificación mediante PCR de cada región de flanqueo, se usan dos oligonucleótidos de ADN monocatenario. Para la región de flanqueo de 5’, un cebador es homólogo a una secuencia de ADN en dirección 5’ del comienzo de la secuencia codificante del gen de proteasa. Preferiblemente, la región homóloga está situada más de 1,0 kb en dirección 5’ del sitio de comienzo de la traducción. El segundo cebador es homólogo a la secuencia de ADN complementaria e inversa situada inmediatamente en dirección 5’ de la secuencia codificante del gen de proteasa.

Para la región de flanqueo de 3’, un cebador es homólogo a la secuencia de ADN inmediatamente en dirección 3’ de la secuencia codificante del gen de proteasa. El segundo cebador es homólogo a una secuencia de ADN complementaria e inversa situada preferiblemente más de 1,0 kb en dirección 3’ de la secuencia codificante del gen de proteasa.

La secuencia de ADN incluida en todos los cebadores y homóloga al genoma de A. niger debería tener como mínimo una longitud de 15 nucleótidos, preferiblemente una longitud de más de 18 nucleótidos. De forma más conveniente, todos los cebadores deberían contener una secuencia de ADN que codifica el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción adecuadas en dirección 5’ de la secuencia que es homóloga al genoma de A. niger. Estos sitios de reconocimiento adicionales facilitan el proceso de clonación.

Ambos cebadores y el ADN genómico de A. niger se usan en una reacción de PCR en condiciones conocidas por los expertos en la técnica. La temperatura de hibridación de los cebadores se puede calcular a partir de la parte de la secuencia de ADN que es homóloga al genoma de A. niger. Ambos fragmentos que contienen la región de flanqueo de 5’ y la región de flanqueo de 3’ se clonaron en un vector que se puede propagar en E. coli usando técnicas generales de biología molecular. Entonces se clona entre las dos regiones de flanqueo un gen que se puede usar como marcador de selección en Aspergillus niger. Más convenientemente, el gen marcador está bajo el control de un promotor que se expresa en A. niger, preferiblemente un promotor de A. niger endógeno. La orientación de la inserción del gen marcador es preferiblemente en la misma dirección que el gen de proteasa original. El fragmento de inactivación final contiene la región de flanqueo de 5’, un gen marcador de selección preferiblemente bajo el control de un promotor endógeno de A. niger, y la región de flanqueo de 3’, todo en esta dirección y orientación. El ADN del constructo final se clona en un vector, que se puede propagar en E. coli.

El constructo de inactivación se digiere con enzimas de restricción adecuadas, para eliminar las secuencias del vector de E. coli, y el fragmento de inactivación se aísla usando técnicas estándar (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Finalmente, Aspergillus niger se transforma con el fragmento de inactivación usando un método descrito en la bibliografía, por ejemplo mediante el método descrito por Kusters-van Someren et al. (1991) Curr. Genet. 20, 293-299. Las células transformadas se seleccionan cultivando en placas la mezcla de transformación sobre placas de agar que son selectivas para el crecimiento de cepas de Aspergillus niger que expresan el gen marcador. Tras la purificación de las cepas de Aspergillus transformadas mediante cultivo en placas por réplicas, se analiza un número representativo de cepas mediante transferencia Southern usando métodos estándar (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Por lo tanto, el ADN genómico de micelio de cepas transformadas se aísla y se digiere con enzimas de restricción adecuadas. Los fragmentos de restricción se separan usando electroforesis en gel de agarosa, se transfieren a membranas de microcelulosa y se sondan con un fragmento marcado del gen marcador. La hibridación y el lavado se realizan en condiciones restrictivas. Las cepas que contienen fragmentos de restricción marcados de la longitud correcta se consideran correctas.

Usando este método, se pueden seleccionar cepas de A. niger con un gen de proteasa inactivado de elección.

Ejemplo 4

Aislamiento de proteasas mediante cromatografía de intercambio iónico

Pequeñas cantidades de la proteasa codificada por la secuencia nucleotídica según se proporciona aquí se obtienen construyendo un plásmido de expresión que contiene la secuencia de ADN relevante, transformando una cepa de A. niger con este plásmido, y haciendo crecer la cepa de A. niger en un medio adecuado. Tras recoger el caldo libre de células contaminantes, se puede purificar la proteasa buscada.

Para aislar la proteasa según es codificada por la secuencia nucleotídica proporcionada en una forma esencialmente pura, se pueden seguir varias estrategias. Todas estas estrategias se han descrito adecuadamente en la bibliografía científica pertinente (véase, por ejemplo, el Protein Purification Handbook, 18-1132-29 Edición AA según se publica por Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Más abajo se proporciona aquí un procedimiento que es aplicable para purificar proteasas a partir de mezclas complejas. Es esencial que exista un ensayo adecuado que sea selectivo con respecto a las características enzimáticas buscadas. Para proteasas, típicamente se usa un sustrato peptídico cromogénico sintético como se describe en el Ejemplo 1. Tales sustratos peptídicos pueden ser selectivos con respecto a endoproteasas, carboxipeptidasas, aminopeptidasas u omega peptidasas. En el Ejemplo 11 se describe la selectividad con respecto a una tripeptidil peptidasa específica. Eligiendo los restos de aminoácidos correctos en el péptido sintético relevante, se pueden seleccionar proteasas con la especificidad deseada.

En primer lugar, se debería determinar si la proteasa es excretada al medio, dependiendo del sistema de expresión elegido para producir la proteasa, puede ser excretada o estar contenida en la célula. Si la proteasa es excretada al medio de fermentación, las células productoras o fragmentos de estas células se han de eliminar mediante centrifugación o filtración, y el medio claro o aclarado resultante es el punto de partida para la purificación posterior. En aquellos casos en los que la proteasa buscada no es excretada, las células productoras se han de destruir para permitir la purificación de la proteasa. En tales casos, la masa celular recogida se tritura mejor con un abrasivo, se muele con perlas, se somete a ultrasonidos, o se somete a una prensa francesa o a un homogeneizador de Manton-Gaulin, y después se filtra o se centrifuga. En el caso en el que la proteasa sea hidrófoba o esté unida a membrana, puede ser necesaria la adición de un detergente no iónico para solubilizar la proteasa antes de la etapa de filtración

o centrifugación.

Tras la etapa de la clarificación, se puede aplicar una estrategia de purificación de tres fases, para obtener las proteasas desconocidas en un estado esencialmente puro. En todas o algunas de estas tres fases, puede ser necesaria la adición de un detergente.

En la fase primera o de captura, la proteasa diana se aísla, se purifica parcialmente y se concentra. Durante la fase de purificación intermedia subsiguiente, se elimina la mayoría de las impurezas voluminosas, y, en la fase de pulido final, se eliminan cantidades en trazas de impurezas que quedan de cantidades más grandes de sustancias estrechamente relacionadas, y la enzima se disuelve en el tampón deseado. Dependiendo de la naturaleza y de las propiedades físicas de la proteasa disponible, la persona experta en la técnica es capaz de optimizar las tres fases usando versiones ligeramente modificadas de los diferentes materiales de unión a proteínas, y aplicar éstas en condiciones en cierta manera cambiadas. Sin embargo, en todos los casos es indispensable un ensayo analítico selectivo, ya que permitirá la monitorización continua de la actividad proteolítica cada vez más purificada. Los ensayos analíticos adecuados para el fin incluyen el uso de sustratos peptídicos cromógenos como se ha mencionado anteriormente.

En la primera fase de captura de la purificación, preferiblemente se usa una potente resina de intercambio iónico de tipo aniónico para aplicar el medio que contiene la enzima clarificada y desalada. Para garantizar la unión de la actividad proteolítica deseada a la resina, se ensayan tres o cuatro valores de pH diferentes de medio y de resina, en condiciones de baja conductividad. En estos ensayos, la resina se equilibra siempre con un tampón del mismo valor de pH y conductividad que el medio que contiene la enzima. El medio se aplica entonces a la columna en condiciones de pH las cuales han demostrado que permiten la unión adecuada de la proteasa a la resina, es decir, no se puede detectar actividad enzimática deseada en el medio que ha pasado a través. Subsiguientemente, la actividad enzimática deseada se eluye de la resina de intercambio iónico usando un gradiente salino continuo que comienza con el tampón de equilibrado de la resina y termina con este tampón al que se ha añadido 1 mol/litro de NaCl. Las fracciones eluidas que contienen la actividad deseada según el ensayo se reúnen y entonces se preparan para una etapa de purificación adicional. Esta etapa de purificación adicional depende de la pureza de la enzima deseada en la fracción reunida: si es casi pura, una etapa de filtración en gel adicional demostrará ser adecuada. Si no es casi pura, se aplica cromatografía sobre una resina de interacción hidrófoba, seguido de una etapa de filtración en gel.

La cromatografía sobre una resina de interacción hidrófoba se lleva a cabo incrementando en primer lugar el contenido salino de la fracción reunida obtenida de la resina de intercambio iónico hasta 4 moles/litro de NaCl, y eliminando cualquier precipitado formado. Si la fracción clara resultante no contiene la actividad deseada, esta actividad está presente obviamente en el precipitado, y se puede recuperar en un estado esencialmente puro. Si la fracción clara resultante todavía muestra en el ensayo la actividad deseada, entonces el líquido se aplica como tal a una resina fenílica de sepharose (Pharmacia), equilibrada en este tampón con gran concentración salina con un pH y conductividad idénticos. Si la actividad enzimática deseada se une a la resina fenílica de sepharose, la actividad se eluye con un gradiente continuo de contenido decreciente de sal, seguido de un lavado libre de sal y, si es necesario, con un agente caotrópico. Como antes, aquellas fracciones procedentes del gradiente que presentan actividad en el ensayo se reúnen y se someten finalmente a una etapa de filtración en gel. Si la actividad enzimática deseada no se une a la resina fenílica de sepharose, lo harán muchos de los contaminantes, de manera que la actividad proteolítica deseada según está presente en el volumen vacío de la columna requiere sólo una etapa de ultrafiltración adicional para obtener la actividad en una forma más concentrada antes de aplicarla a la columna de

filtración en gel. La columna de filtración en gel no sólo elimina contaminaciones en trazas, sino también lleva a la enzima al tampón, lo que es necesario por uso subsiguiente.

Aunque este método es aplicable generalmente para el aislamiento y purificación de proteasas según la invención, en el Ejemplo 4 se describe una técnica de aislamiento más específica. En ese ejemplo se describe el aislamiento 5 de una proteasa de Aspergillus usando bacitracina inmovilizada, un antibiótico peptídico conocido por su interacción selectiva con diversos tipos de proteasas.

Ejemplo 5

Aislamiento de proteasas mediante cromatografía de afinidad

Un método alternativo para purificar pequeñas cantidades de proteasa es mediante cromatografía de afinidad. Para

10 obtener la proteasa en forma purificada, se hizo crecer un cultivo de 100 mililitros en un matraz de agitación bien aireado. Tras la centrifugación para eliminar cualquier materia no soluble, el sobrenadante se aplicó a una columna de bacitracina-sepharose de 40 mililitros, equilibrada con 0,05 moles/litro de acetato de sodio pH 5,0. Las proteasas unidas a la columna se eluyeron usando el tampón de acetato suplementado con 1 mol/litro de NaCl y 10% (v/v) de isopropanol (J. Appl. Biochem., 1983 p. 420-428). Las fracciones activas se recogieron, se dializaron frente a agua

15 destilada y se aplicaron a una columna de bacitracina-sepharose de 20 mililitros, nuevamente equilibrada con tampón de acetato. Como antes, la elución se llevó a cabo usando el tampón de acetato suplementado con NaCl e isopropanol. Las fracciones activas, es decir, las fracciones que presentan las actividades buscadas, se recogieron, se dializaron frente a tampón de acetato 5 milimoles/litro pH 5,0, y después se concentraron por medio de ultrafiltración con una membrana Amicon PM-10. Para obtener la proteasa en un estado esencialmente puro, el

20 líquido concentrado se cromatografió sobre una columna Superdex 75, equilibrada con el tampón de acetato de sodio 0,05 moles/litro pH 5,0 y suplementada con 0,5 moles/litro de NaCl.

Experimentos adicionales llevados a cabo con la enzima purificada en PAGE pueden confirmar si el peso molecular está en línea con lo que se puede esperar basándose en los datos de secuencia disponibles. La confirmación final se puede obtener llevando a cabo un análisis parcial de aminoácidos N-terminales.

25 Ejemplo 6

Propiedades de una nueva cisteína proteasa procedente de A. niger

En este ejemplo se clonó el gen nr 28 de Aspergillus, y se sobreexpresó en A. niger como se describe anteriormente. La enzima obtenida se purificó según procedimientos descritos en el Ejemplo 4, y se usó para destruir la actividad inhibidora de tripsina de las habas de soja en diversas condiciones. Como materiales de

30 referencia, se usaron papaína y bromelaína. La bromelaína se obtuvo de Sigma, y la papaína se obtuvo de DSM Food Specialties Business Unit Beverage Ingredients, PO Box 1, 2600 MA Delft, Países Bajos.

La inhibición de la tripsina se midió según el método de Kakade, M.L., Rackis, J.J., McGhee, J.E. y Puski, G. (1974):

J. Cereal Chemistry 51: 376-382. La degradación del sustrato N-benzoil-L-arginina-p-nitroanilina a N-benzoil-Larginina y p-nitroanilina se tomó como una medida de la actividad de tripsina. La tripsina se obtuvo de British Drug

35 Houses Ltd., y derivó de páncreas de vaca que contiene más de 0,54 unidades Anson por gramo de producto. El inhibidor Kunitz para habas de soja también se obtuvo de Sigma.

El inhibidor de tripsina se preincubó a una concentración de 2 mg/ml con las enzimas de cisteína proteasa mencionadas anteriormente, a pH 3, en tampón de acetato de sodio 50 mM, antes de medir la inhibición de la tripsina. Las enzimas se añadieron a una relación de proteína enzimática a inhibidor de tripsina de 1:100 (p/p). La

40 albúmina sirvió como control negativo para las enzimas. La actividad de tripsina que queda se midió tras la incubación durante 3 horas a 37ºC. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Efectos de diversas cisteína proteasas sobre la inactivación enzimática del inhibidor de tripsina de tipo Kunitz procedente de habas de soja.

1

2 3 4 5

Enzima ensayada

Actividad de TI que queda (%) Actividad de TI que queda tras el tratamiento con pepsina Actividad de TI que queda tras el tratamiento térmico a 75ºC Actividad de TI que queda tras el tratamiento térmico a 90ºC

Papaína

25 55 78 95

Bromelaína

30 62 86 99

A. niger

26 26 28 35

Albúmina (control)

100 100 100 100

TI: Actividad del inhibidor de tripsina

Los experimentos se repitieron en presencia de pepsina durante la preincubación de las cisteína proteasas con el inhibidor de tripsina. La pepsina se añadió a una concentración final de 1,3 mg/ml. Los resultados se muestran en la columna 3.

5 Se llevó a cabo otra serie de experimentos para comprobar la estabilidad térmica. Las cisteína proteasas se incubaron a 75 y 90ºC durante 5 minutos antes de añadir estas enzimas a la preincubación con los inhibidores de tripsina. Los resultados se muestran en las columnas 4 y 5.

Estos resultados demuestran claramente la actividad superior de estas nuevas cisteína proteasas procedentes de Aspergillus niger con respecto a las cisteína proteasas actualmente disponibles para la inactivación de inhibidores de

10 tripsina en pienso para animales.

Ejemplo 7

Exopeptidasas que promueven la maduración del queso y el sabor del queso

Las aminopeptidasas codificadas por los genes nr 20 y 54 (véase la Tabla 1) se sobreexpresaron en A. niger según métodos descritos anteriormente. La purificación de estas enzimas se llevó a cabo según procedimientos como se 15 describe en el Ejemplo 4. La actividad de las muestras enzimáticas purificadas se determinó a pH 7,2 en un tampón acuoso de fosfato (50 mM) que contiene el derivado de para-nitroanilida de un número de aminoácidos hidrófobos (3 mM) como sustrato. La conversión del sustrato por la aminopeptidasa se determinó monitorizando el cambio en la densidad óptica a 400 nm como resultado de la conversión del sustrato, usando una disolución que no contiene la enzima como referencia. La actividad (A) se calculó como el cambio en la OD por minuto, y se expresó como, por 20 ejemplo, unidades de Phe-AP, Leu-AP o Val-AP, dependiendo del sustrato usado. Se inoculó leche de queso normal con cultivo de fermento del intervalo Delvo-tecTM DX 31 (DSM Food Specialities Delft, Países Bajos), para obtener un queso de tipo Gouda, y la coagulación se ejecutó con una dosis media de coagulante (50 IMCU por litro de leche de queso). Además, se añadieron 25 unidades Phe de cada exoproteasa a dos quesos experimentales, mientras que el control no contuvo ninguna de las exoproteasas. Se usaron parámetros de obtención de queso conforme al 25 procedimiento aplicado para queso semiduro para ambos quesos. Se observó una diferencia en términos de desarrollo de sabor y de aroma entre los quesos experimentales y el queso del control hasta un grado tal que los quesos experimentales obtuvieron la mayoría de sus propiedades organolépticas después de tres (3) semanas, mientras que el queso de control obtuvo una clasificación similar después de seis (6) semanas. Se demostró que el nivel de aminoácidos libres después de tres semanas era dos veces tan alto en los quesos experimentales; después

30 de seis semanas de maduración, los niveles fueron nuevamente comparables. Se llevó a cabo un análisis de aminoácidos según el método Picotag de Waters (Milford MA, USA).

Estos datos sugieren que el producto está listo para la venta tres semanas antes, sin disminuir el mantenimiento de la calidad del queso. El carácter organoléptico de los quesos experimentales difirió del del control hasta tal punto que el sabor de queso blando con una tendencia ligera al amargor del queso del control se superó en el queso

35 experimental en presencia de la aminopeptidasa. Se encontró que la textura de los quesos era igualmente algo más suave.

Ejemplo 8

Nueva especificidad de una proteasa codificada por el gen 55

Como se explica anteriormente, ciertas proteínas pueden resistir la hidrólisis enzimática como resultado de

40 composiciones de aminoácidos específicas o estructuras terciarias específicas. En tales casos, la cantidad de péptidos que se puede solubilizar a partir de proteínas resistentes a proteasas se puede mejorar drásticamente usando proteasas que presentan nuevas especificidades.

La beta-caseína es una proteína con una estructura terciaria muy limitada, pero con un extraordinario nivel elevado de restos de prolina. Muchas proteasas tienen dificultades a la hora de escindir secuencias que contienen prolina, de 45 manera que la hidrólisis de beta-caseína con proteasas disponibles normalmente produce un hidrolizado que es relativamente rico en péptidos grandes resistentes a proteasas. Estos últimos péptidos resistentes pueden contribuir a un número de propiedades indeseables del hidrolizado. Por ejemplo, es bien sabido que estos péptidos más grandes tienen un efecto relativamente fuerte sobre la alergenicidad y amargor. Además, estos péptidos soportan una degradación posterior a aminoácidos libres, de forma que, en ciertos procesos, la aparición de estos péptidos

50 grandes, resistentes a proteasas, es sinónimo de pérdidas de rendimiento. Por lo tanto, la disponibilidad y uso de proteasas que son capaces de escindir las partes resistentes a proteasas de las proteínas se traducen en beneficios técnicos y económicos importantes.

La beta-caseína representa una de las fracciones principales de caseína de la leche bovina. La proteína se ha caracterizado bien en términos de su secuencia de aminoácidos, y está comercialmente disponible en forma casi pura. Como tal, la beta-caseína ofrece un excelente sustrato de ensayo para estudiar la relación entre los sitios de escisión enzimática y la longitud de diversos péptidos formados durante la hidrólisis enzimática.

Este Ejemplo demuestra que, a pesar del carácter de escisión de amplio espectro de la endoproteasa subtilisina, la adición de una enzima muy específica como una prolil endopeptidasa, según es codificada por el gen 55 (véase la Tabla 1), tiene un impacto importante sobre el tamaño de los fragmentos de beta-caseína formados.

Se obtuvo beta-caseína de leche bovina (polvo liofilizado, esencialmente libre de sales) con un mínimo de 90% de beta-caseína a partir de Sigma. La subtilisina de B. licheniformis (Delvolase®, 560000 DU por gramo) se obtuvo de DSM Food Specialities (Seclin, Francia). La endoproteasa específica de prolina según es codificada por el gen 55 se sobreexpresó en A. niger y se purificó usando procedimientos descritos en el Ejemplo 4.

El polvo de beta-caseína se disolvió a una concentración de 10% (p/p) junto con 0,1% (p/p) de polvo de DelvolaseTM en un tampón de fosfato de 0,1 moles/litro pH 7,0. Después de una incubación de 24 horas a 45ºC en un baño de agua agitado, la reacción se detuvo calentando la disolución durante 15 minutos a 90ºC. A la mitad de la disolución (1 ml que contiene 100 miligramos de beta-caseína) se añadieron 100 microlitros de la proteasa específica de prolina, y la reacción se continuó durante otras 24 horas a 45ºC. Después de otro choque térmico a 90ºC, las muestras de material de beta-caseína tratado tanto con DelvolaseTM como con DelvolaseTM + endoproteasa específica de prolina se analizaron mediante equipo de LC/MS para estudiar las distribuciones precisas de tamaños de péptidos en las dos muestras.

Análisis de LC/MS

Se usó HPLC, que usa un espectrómetro de masas de trampa iónica (ThermoquestTM, Breda, Países Bajos) acoplado a una bomba P4000 (ThermoquestTM, Breda, Países Bajos), para caracterizar los hidrolizados proteicos enzimáticos producidos por la mezcla enzimática de la invención. Los péptidos formados se separaron usando unacolumna PEPMAP C18 300A (MIC-15-03-C18-PM, LC Packings, Ámsterdam, Países Bajos), en combinación con un gradiente de ácido fórmico al 0,1% en agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; Disolución A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (Disolución B) para elución. El gradiente comenzó a 100% de Disolución A y aumentó hasta 70% de disolución B en 45 minutos, y se mantuvo a esta última relación durante otros 5 minutos. El volumen de inyección usado fue 50 microlitros, el caudal fue 50 microlitros por minuto, y la temperatura de la columna se mantuvo a 30ºC. La concentración de proteína de la muestra inyectada fue aprox. 50 microgramos/mililitro.

La información detallada sobre los péptidos individuales se obtuvo usando el algoritmo de MS/MS “dependiente del barrido”, que es un algoritmo característico para un espectrómetro de masas de trampa de iones. El análisis de barrido completo fue seguido por un análisis de barrido de zoom, para la determinación del estado de la carga del ion más intenso en el intervalo de masas de barrido completo. El análisis subsiguiente de MS/MS de este último ion dio como resultado una información de secuencia peptídica parcial, que se pudo usar para la búsqueda en bases de datos usando la aplicación SEQUEST de Xcalibur Bioworks (ThermoquestTM, Breda, Países Bajos). Los bancos de datos usados se extrajeron del banco de datos OWL.fasta, disponible en el NCBI (National Centre for Biotechnology informatics), que contiene las proteínas de interés para la aplicación usada.

Usando esta técnica como método de identificación, sólo los péptidos con una masa que oscila desde aprox. 400 hasta 2000 Daltons se consideraron adecuados para el análisis posterior mediante secuenciación de MS.

Para ajustar la sensibilidad óptima en el modo de MS, se usó angiotensina (M = 1295,6), y para la fragmentación óptima en el modo MS/MS, llevando a cabo una infusión constante de 60 Pg/ml, dando como resultado principalmente especies doble y tríplemente cargadas en el modo MS, y una energía de colisión óptima de alrededor de 35% en el modo MS/MS.

En la muestra digerida con Delvolase sola, el análisis de LC/MS/MS identificó 40 péptidos que cubren diversas partes de la molécula de beta-caseína. Juntos, estos péptidos dieron cuenta del 79% de la secuencia total de beta-caseína. Se pudieron rastrear nuevamente tiempos de retención diferentes de los péptidos en la columna C18 hasta longitudes peptídicas que oscilan de 2 a 23 restos de aminoácidos. Juntos, < 15% de los péptidos encontrados fueron más pequeños de 6 aminoácidos. La muestra digerida con DelvolaseTM y la proteasa específica de prolina también generó un gran número de péptidos identificables a partir de beta-caseína. Juntos, estos péptidos cubrieron > 50% de la secuencia total de la proteína de beta-caseína. En esta muestra, la distribución de tamaños de los péptidos fue notablemente homogénea, ya que los péptidos oscilaron en longitud sólo entre 2 y 6 restos. Los resultados muestran que, en el hidrolizado obtenido con la proteasa específica de prolina, contiene una gran fracción de dipéptidos, tripéptidos, y de péptidos con hasta 6 AA, que muestran el efecto beneficioso distinto de la coincubación con una endoproteasa que presenta una especificidad inusual. También está claro a partir de estos experimentos que la endoproteasa según el gen 55 codifica una endoproteasa que escinde la cadena peptídica en el término carboxi del resto de prolina.

Ejemplo 9

La liberación selectiva de aminoácidos específicos para promover la formación de sabor.

Los aminoácidos libres como leucina y fenilalanina no sólo han estado implicados en reacciones de Maillard, sino también como precursores para aromas deseables en diversas fermentaciones alimentarias. Para promover la 5 formación de tales aromas en fermentaciones alimentarias o durante la fase de calentamiento, tueste o cocción del alimento, sería ventajoso incorporar en estos productos un hidrolizado proteico que contenga niveles relativamente elevados de estos aminoácidos específicos en una forma libre. En este Ejemplo se describe la producción de extractos de levadura enriquecidos selectivamente en leucina y fenilalanina. Este enriquecimiento se obtiene combinando una endoproteasa con una preferencia de escisión para un conjunto seleccionado de restos de aminoácidos con una exoproteasa que favorece la liberación de un conjunto similar de restos de aminoácidos. La preferencia de la endoproteasa debería de coincidir con la preferencia de la exoproteasa usada. Por ejemplo, se ha establecido que las aminopeptidasas codificadas por los genes 20 y 54 (véase la Tabla 1) presenta una preferencia definida por liberar restos de leucina y fenilalanina que coincide con las preferencias de escisión de termolisina. Las carboxipeptidasas codificadas por los genes 23 y 24 tienen preferencia por liberar restos de arginina y lisina, que

15 coincide con las preferencias de escisión de tripsina. La carboxipeptidasa codificada por el gen 5 presenta una preferencia muy inusual por liberar glicina, que se podría combinar con ciertas endoproteasas presentes en papaína. La carboxipeptidasa codificada por el gen 51 es capaz de eliminar restos de glutamato, lo que coincide con la proteasa específica de glutamato codificada por el gen 43.

Se sabe que la endoproteasa termolisina (comercialmente disponible como Thermoase) C180 de Daiwa Kasei KK (Osaka, Japón) escinde enlaces peptídicos en el lado aminoterminal de aminoácidos hidrófobos voluminosos como Leu y Phe. Para liberar los aminoácidos así expuestos de los péptidos recientemente formados, se usaron las aminopeptidasas codificadas por los genes nr 20 y 54 (véase la Tabla 1). Estos genes se sobreexpresaron en A. niger según métodos descritos anteriormente, y la purificación de estas enzimas se llevó a cabo según procedimientos como se describe en el Ejemplo 4.

25 Para liberar tanta leucina y fenilalanina como sea posible sin la liberación concomitante de aminoácidos indeseados con esta combinación de enzimas, es evidente que se deberían seleccionar con cuidado las condiciones usadas durante la hidrólisis enzimática. Además, se han de inactivar las proteasas endógenas (y probablemente aespecíficas) de las propias levaduras. Después de un número de incubaciones de ensayo, se obtuvo un protocolo que conduce a una liberación sorprendentemente selectiva y eficaz de leucina y fenilalanina a partir de las proteínas de la levadura usando estas dos nuevas enzimas.

Para inactivar las proteasas endógenas de las levaduras, la suspensión de levadura se mantuvo durante 5 minutos a 95 grados C. Después, la suspensión se enfrió rápidamente hasta la temperatura requerida, y el pH se ajustó a 7,0 usando NaOH 4N. La levadura, la termolisina y una de las aminopeptidasas se incubaron todas simultáneamente en las siguientes condiciones. Después del choque térmico, el pH de los 2000 mililitros de suspensión de levadura se

35 ajustó a 7,0, después de lo cual se añadieron 680 miligramos de Thermoase y, tras agitar, la aminopeptidasa purificada. La mezcla se incubó con agitación a 50 grados C durante 3 horas, y se centrifugó. Para detener todas las actividades enzimáticas, el pH del sobrenadante se ajustó a 4 y se sometió a otro tratamiento térmico de 45 minutos a 95 grados C. Después de otra centrifugación, se obtuvo del sobrenadante una muestra para el análisis de aminoácidos. La materia precipitada o no disuelta se eliminó mediante centrifugación durante 15 minutos a 3500 rpm en una centrifugadora Hereaus Megafuge 2.0 R. El sobrenadante se retiró y se mantuvo congelado a -20ºC. Las muestras del sobrenadante se analizaron en busca del contenido de aminoácidos según el método Picotag de Waters (Milford, MA, USA), inmediatamente después de descongelarlas.

En el análisis de aminoácidos, los valores de Trp y Cys se omitieron, y los valores de Asp y Asn se sumaron como un valor. Según los datos obtenidos, en el hidrolizado resultante la relación entre alanina y leucina (21,3:11,7) fue

45 1:0,5. Los hidrolizados de levadura comercialmente disponibles presentan típicamente relaciones de alanina frente a leucina de 1:0,3.

En un segundo experimento, se preparó un extracto de levadura que estaba enriquecido en glutamato libre. Para lograr esto, se hizo uso de una endoproteasa que presenta una preferencia por la escisión en el extremo C-terminal de restos de glutamato (codificada por el gen nr 43 en la Tabla 1), y una carboxipeptidasa (codificada por el gen nr 51 en la Tabla 1) capaz de eliminar estos restos de glutamato así expuestos. La endoproteasa codificada por el gen nr 43 y la carboxipeptidasa codificada por el gen 51 (véase la Tabla 1) se sobreexpresaron en A. niger según métodos descritos anteriormente. La purificación de estas enzimas se llevó a cabo según procedimientos como se describe en el Ejemplo 4.

El papel esencial de glutamato libre en un número de procesos formadores de aroma está bien documentado, y

55 MSG, la sal sódica del ácido glutámico, está reconocida como el componente potenciador del sabor más importante individual.

En este Ejemplo, el pH de 200 ml de suspensión de levadura sometida a choque térmico se ajustó a 8,0, después se añadió el producto enzimático purificado codificado por el gen 43, y la mezcla se incubó durante 4 horas a 50 grados

C. Después, el pH se redujo a 5,0, y la suspensión se centrifugó. A 100 mililitros de sobrenadante se añadió el producto génico purificado del gen 51. La incubación con esta carboxipeptidasa tuvo lugar durante 30 minutos a 50 grados C, con ajustes continuos del pH. Después de detener la incubación enzimática mediante un tratamiento térmico de 5 minutos a 95 grados C, el material se centrifugó nuevamente (véase más arriba), y se obtuvo una

5 muestra para el análisis de aminoácidos.

Según los datos de aminoácidos obtenidos (véase anteriormente), en el hidrolizado resultante la relación entre alanina y glutamato (30,0:48,7) fue 1:1,6. Los hidrolizados de levadura comercialmente disponibles presentan típicamente relaciones de alanina frente a glutamato de 1:1.

Ejemplo 10

10 Evaluación del sabor de hidrolizados de levadura enriquecidos en aminoácidos específicos.

Para demostrar que un hidrolizado proteico enriquecido en aminoácidos específicos según la invención puede generar aromas específicos, se llevó a cabo un número de experimentos con los hidrolizados de levadura descritos en el Ejemplo previo. Para ese fin, se prepararon y liofilizaron porciones más grandes de estos hidrolizados. El comportamiento de los polvos resultantes se comparó con el comportamiento de un extracto de levadura

15 comercialmente disponible (Gistex LS, obtenible de DSM Food Specialties, Delft, Países Bajos) en una mezcla estandarizada bajo varias condiciones de reacción. La mezcla estandarizada consistió en uno de los hidrolizados, mezcla base y agua.

La mezcla base contenía 22 gramos de Maxarome Plus Powder (un extracto de levadura especializado, con un contenido elevado de nucleótidos naturales, también obtenible de DSM Food Specialties), 29,2 gramos de glucosa, 9

20 gramos de grasa REFEL-F (aceite de soja hidrogenado, obtenible de Barentz, Hoofddorp, Países Bajos) y 0,2 gramos de estearoil lactilato de calcio (emulsionante, obtenible de Abitec, Northampton, UK), mezclado a conciencia en un mortero.

Todas las mezclas estandarizadas contenían 5 gramos de polvo de hidrolizado de levadura (es decir, el material enriquecido en leucina o en glutamato, o el extracto de levadura comercial), 3 gramos de la mezcla base, y 3 gramos

25 de agua. Después del mezclamiento a conciencia, estas tres suspensiones se sometieron a diferentes regímenes de calentamiento, es decir, 65 minutos a 90-95 grados C en un vial de reacción (reacción líquida), o se secaron a 20 milibares a 120 grados C en un horno de vacío (reacción de tueste a vacío), o se calentaron en un vial de reacción abierto a 120 grados C durante 10 minutos tras disipar todo el agua (reacción de tueste).

Después del tratamiento térmico, los tres productos asumieron colores que oscilan desde el marrón oscuro hasta

30 casi negro. En el caso de la reacción de tueste a vacío, sólo se usaron las capas superiores de color claro. La evaluación del sabor de los productos calentados se llevó a cabo moliendo las tortas oscurecidas hasta polvos finos, y disolviendo estos polvos hasta una concentración de 2% (p/p) en agua que contiene 0,6% (p/p) de NaCl. Las observaciones del panel de sabor se especifican en la Tabla 3.

Tabla 3

Referencia

Leucina Glutamato

Líquido

Caldo, ligeramente tostado Té frío, ligeramente florido, similar a levadura More caldo, carnoso, similar a levadura

Tueste a vacío

Quemado, patatas fritas Astringente, habas, similar a levadura Quemado, caldo, similar a levadura

Tueste

Tostado oscuro, caldo, umami Menos tueste, florido, umami Tueste, más caldo, más umami

35 Ejemplo 11

Hidrolizados proteicos de suero no alergénicos formados con tripeptidil peptidasas.

Las dipeptidil peptidasas codificadas por los genes 19 y 55, así como las tripeptidil peptidasas codificadas por los genes 4, 9, 10, 12, 26, 35, 46, y 50 (véase la Tabla 1), se pueden sobreproducir como se describe, y se pueden

40 purificar según los métodos proporcionados en el Ejemplo 4. Tras la purificación, el pH óptimo y la estabilidad de temperatura de cada enzima individual se pueden establecer por cualquiera de los métodos disponibles y conocidos por la persona experta. Además, la especificidad de cada enzima individual se puede determinar usando los métodos explicados en el Ejemplo 1. En el siguiente experimento se ilustra la selectividad mostrada por las tripeptidil peptidasas.

45 La enzima codificada por el gen 12 se sobreprodujo en una célula hospedante de Aspergillus niger, y se purificó mediante procedimientos descritos en el Ejemplo 4. La enzima así obtenida se incubó a pH 5 y a 50 grados C con

diferentes sustratos cromógenos sintéticos, es decir, Ala-Ala-Phe-pNA y Ala-Phe-pNA (ambos de Bachem, Suiza). La incubación con el sustrato Ala-Ala-Phe-pNA condujo a un incremento significativo de la absorbancia a 410 nm, mientras que la incubación con Ala-Phe-pNA no lo hizo. Esta observación demuestra claramente que las tripeptidil peptidasas escinden tripéptidos y no presentan actividad de aminopeptidasa que puede conducir a un incremento indeseable de aminoácidos libres.

Además, la enzima codificada por el gen 12 muestra características de estabilidad enzimática favorables, como se muestra en el siguiente experimento. Se incubaron cuatro muestras de la enzima a pH 5 durante una hora a 0, 40, 50 y 60 grados C, respectivamente. Después, cada muestra enzimática se incubó con el sustrato Ala-Ala-Phe-pNA mencionado anteriormente en un tampón de citrato a pH 5, y se determinó la actividad residual en cada muestra individual midiendo el incremento de absorbancia a 410 nm. La muestra a 0 grados C presentó una actividad de 100%, la muestra a 40 grados presentó una actividad residual de 96%, la muestra a 50 grados presentó una actividad residual de 92%, y la muestra a 60 grados presentó una actividad residual de 88%.

En un proceso típico dirigido a producir un hidrolizado con una proporción elevada de tripéptidos, se puede disolver/suspender proteína de suero (WPC 75) en una concentración de 100 gramos de proteína/litro, en un medio acuoso que tiene un pH de 8,5. La primera incubación enzimática se realiza con la endoproteasa de amplio espectro subtilisina (Delvolase®, 560000 DU por gramo, de DSM). Después de una predigestión del suero con esta enzima en una concentración de 0,5% de concentrado enzimático por gramo de proteína durante 2 horas a 60ºC, la mezcla se trató con calor para inactivar la endoproteasa usada. Después, la temperatura se ajustó a 50 grados C y se añadió la tripeptidil peptidasa, y toda la mezcla se incubó hasta que se alcanzó el nivel deseado de tripéptidos. Las etapas del procesamiento adicionales del hidrolizado así obtenido dependen de la aplicación específica, pero pueden incorporar microfiltración o centrifugación seguido de evaporación y secado por pulverización.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DSM NV

<120> Nuevos genes que codifican nuevas encimas proteolíticas

<130> 20095WO

<160> 171

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2520

<212>. DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 1

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polinucleótido aislado hibridable en condiciones muy restrictivas a polinucleótido SEC ID NO: 10 o a la secuencia SEC ID NO: 67, en el que dicho polinucleótido codifica una proteína que tiene actividad de proteasa.

2. 2.

   Un polinucleótido aislado según la reivindicación 1, obtenible de un hongo filamentoso.

3. 3.

   Un polinucleótido aislado según la reivindicación 2, obtenible de A. niger.

4. 4.

   Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos según SEC ID NO: 124 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homóloga a la secuencia de aminoácidos según SEC ID NO: 124, y que tiene actividad de proteasa.

5. 5.

   Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica según SEC ID NO: 10 o la secuencia SEC ID NO: 67.

6. 6.

   Un polinucleótido aislado según la secuencia SEC ID NO: 10 o la secuencia SEC ID NO: 67.

7. 7.

   Un vector que comprende una secuencia polinucleotídica según las reivindicaciones 1 a 6.

8. 8.

   Un vector según la reivindicación 7, en el que dicha secuencia polinucleotídica según las reivindicaciones 1 a 6 está ligada operativamente con secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de dicha secuencia polinucleotídica en una célula hospedante adecuada.

9. 9.

   Un vector según la reivindicación 8, en el que dicha célula hospedante adecuada es un hongo filamentoso.

10. 10.

    Un método para fabricar un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9, que comprende las etapas de cultivas una célula hospedante transformada con dicho polinucleótido o dicho vector, y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula hospedante.

11. 11.

    Un polipéptido aislado según la secuencia SEC ID NO: 124 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homóloga a la secuencia de aminoácidos según SEC ID NO: 124, y que tiene actividad de proteasa.

12. 12.

    Un polipéptido aislado según la reivindicación 11, obtenible de Aspergillus niger.

13. 13.

    Un polipéptido aislado obtenible expresando un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9 en una célula hospedante apropiada, preferiblemente Aspergillus niger.

14. 14.

    Un método para fabricar un polipéptido según las reivindicaciones 11 a 13, que comprende las etapas de transformar una célula hospedante adecuada con un polinucleótido aislado según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9, cultivar dicha célula en condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido, y opcionalmente purificar el polipéptido codificado de dicha célula o medio de cultivo.

15. 15.

    Una célula hospedante recombinante que comprende un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9.

16. 16.

    Una célula hospedante recombinante que expresa un polipéptido según las reivindicaciones 11 a 13.

17. 17.

    Una célula hospedante recombinante según las reivindicaciones 15 ó 16, en la que dicha célula hospedante procede de una especie Aspergillus, preferiblemente A. niger.

18. 18.

    Proteína de fusión que comprende una secuencia polipeptídica según las reivindicaciones 11 a 13.