ES2301579T3 - Prolil endoproteasa a partir de aspergillus niger. - Google Patents

Prolil endoproteasa a partir de aspergillus niger. Download PDF

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Abstract

Una preparación la cual comprende para más del 20% por peso de las proteínas en la preparación, de un polipéptido aislado el cual tiene actividad endoproteasa específica para prolina y el cual tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos del 1 al 526 de la ID SEC NO: 2.

Description

Prolil endoproteasa a partir de Aspergillus níger.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a hidrolizados de proteínas, un método para producir los hidrolizados y el uso de estos hidrolizados.
Antecedentes de la invención
Los hidrolizados enzimáticos de leche de vaca o fracciones de leche de vaca tienen solamente limitada aplicación en la industria alimenticia. Sin embargo, estos hidrolizados ocupan interesantes nichos en el mercado, según lo evidenciado por el gran volumen de literatura que describe y reivindica procesos optimizados para obtener tales hidrolizados. La leche o las fracciones de leche son sometidas a enzimas que tienen actividad proteolítica, para producir los hidrolizados primariamente, para minimizar la alergenicidad del producto, facilitar la absorción gastrointestinal ofreciendo un concentrado fácilmente asimilable, y para estabilizar las proteínas en productos ácidos contra la precipitación durante periodos prolongados de almacenamiento.
Aunque reducir el peso molecular de las proteínas de la leche es una práctica comúnmente aceptada para producir estos efectos beneficiosos, la hidrólisis enzimática de las proteínas de la leche tiene desventajas. Los aspectos negativos de incubar la leche con enzimas incluyen la digestión proteolítica incompleta, un sabor amargo cada vez mayor hasta la disminución de la longitud de los fragmentos de péptidos, rendimientos disminuidos del producto final debido a los requisitos de las etapas de purificación, y cambios de sabor desagradables causados por los altos niveles de aminoácidos libres.
La degradación uniforme y completa de todas las fracciones de la leche por la vía de incubación con endoproteasas, es frecuentemente difícil de obtener. Por ejemplo, la beta-lactoglobulina es conocida por ser una proteasa resistente y la digestión parcial de esta molécula puede conducir a reacciones inmunogénicas inesperadamente fuertes para fórmulas infantiles, así como las visibles precipitaciones de proteínas en productos tales como las bebidas ácidas para deportistas. Para garantizar la ausencia de proteínas inapropiadamente digeridas en un hidrolizado de proteínas, un paso de ultrafiltración final para la eliminación de algunos fragmentos de péptidos largos remanentes a partir de los hidrolizados, es generalmente requerido. El paso indispensable de remover estos fragmentos de proteínas parcialmente digeridas a partir del hidrolizado, inevitablemente baja el rendimiento del producto de la digestión final, aumentando consecuentemente los costos de producción.
La antigenicidad de las proteínas puede ser superada por digestión de las proteínas a péptidos que tengan solamente 8-10 residuos de aminoácidos, pero los péptidos creados por tal digestión proteolítica extensiva pueden ser muy amargos. La explicación general para este fenómeno es que los péptidos pequeños con un alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos, promueven sabores amargos. La naturaleza de la materia prima proteica usada, el tipo de enzimas proteolíticas usadas para la digestión y la longitud de los péptidos obtenidos en gran medida determinan el grado de amargor asociado con el hidrolizado final. Por ejemplo, la caseína, la cual contiene muchos aminoácidos hidrofóbicos, es conocida por generar hidrolizados más amargos que las proteínas del suero.
En operaciones industriales, el desamargado de los hidrolizados de proteínas es llevado a cabo por la eliminación selectiva de los péptidos amargos usando carbono activado o adsorción a resinas hidrofóbicas. La reducción del rendimiento concomitante durante tales pasos de eliminación, incrementa el costo del producto final. Además, este proceso tiene un impacto negativo sobre el valor nutricional del producto final, ya que varios aminoácidos nutricionalmente indispensables pueden perderse debido a su naturaleza hidrofóbica, incluyendo triptófano, leucina, fenilalanina e isoleucina. Así, desamargar por esta vía es propenso a producir hidrolizados deficientes en estos aminoácidos nutricionalmente importantes.
Desamargar también puede ser logrado sometiendo los hidrolizados a exopeptidasas. En este acercamiento, los aminoácidos amino terminal y carboxilo terminal, son liberados de los péptidos en un intento de reducir su hidrofobicidad en general. La exposición de los péptidos a exoproteasas no selectivas, desafortunadamente resulta en la liberación de cantidades incontrolables de aminoácidos libres en el hidrolizado final. El calentamiento subsiguiente de tales hidrolizados que contienen aminoácidos libres, como es requerido para la esterilización o el secado por pulverización, frecuentemente genera sabores empalagosos vía reacciones de Maillard. Además, los altos niveles de aminoácidos libres creados por las exoproteasas pueden incrementar el valor osmótico del producto hidrolizado final a niveles que puedan causar diarrea osmótica.
Por lo tanto, la producción de hidrolizados de proteínas representa un compromiso entre los pros y los contras de la digestión proteolítica. La práctica actual es optimizar la digestión enzimática de sustratos de proteínas para los requerimientos particulares de una categoría de productos. Por ejemplo, los hidrolizados de proteínas deseados para infantes verdaderamente alérgicos, requieren de una digestión proteolítica extensiva seguida por una rigurosa eliminación de cualquier fragmento de péptidos de gran peso molecular remanente. En contraste, los productos diseñados para adultos, quienes raramente exhiben alergias a la leche bovina, típicamente contienen hidrolizados en los cuales el promedio de la longitud de los péptidos es incrementado para minimizar la posibilidad de perder el sabor y maximizar el rendimiento del producto.
Todas las principales proteínas de la leche, tales como beta-caseína, beta-lactoglobulina y alfa-lactoalbúmina, así como las fracciones de proteína vegetal obtenidas a partir de, por ejemplo, aislados de soya, proteínas de arroz y gluten de trigo, son considerados compuestos antigénicos importantes. De esta manera, la digestión enzimática de estas proteínas de leche y cereal hasta pesos moleculares por debajo de 3000 Da, es considerada importante para minimizar la alergenicidad. La fracción de beta-lactoglobulina en suero es especialmente considerada como un importante alergeno porque esta proteína no está presente en la leche humana y ha sido probado que la digestión proteolítica de la beta-lactoglobulina es difícil. Las fórmulas infantiles que contienen hidrolizados de proteínas que son extensivamente hidrolizadas, típicamente contienen altos niveles de aminoácidos libres, los cuales son indicativos de sabor subóptimo y alta osmolalidades. Evaluaciones recientes de productos para fórmulas infantiles hidrolizados comercializados actualmente han mostrado que la mayoría de ellos aún contienen suero basados en materiales inmunogénicos. Esta observación indica que nuevas mezclas de enzimas que conducen a hidrolizados mejorados a más bajo costo continúan estando en demanda.
Los hidrolizados de proteínas en productos destinados para consumidores con necesidades no-médicas, por ejemplo atletas, o personas con una dieta para adelgazar, deben ser personalizados para proporcionar características de buen sabor. Bajo estas circunstancias, la alta palatabilidad así como los aspectos físico-químicos, tales como solubilidad bajo condiciones ácidas, son de importancia primordial. Productos en esta categoría, incluyendo los jugos de frutas fortificados y las bebidas para deportistas, se centran, inter alia, en la suplementación con arginina y glutamina para mejorar la salud del consumidor. Las bebidas para deportistas, por ejemplo sirven para mejorar la resistencia física y la recuperación de un atleta después del ejercicio prolongado de alta intensidad. Fuentes de proteínas de cereal ricas en glutamina, como el gluten de trigo o fuentes de proteínas ricas en arginina como la proteína del arroz y los aislados de soya, han sido consideradas como alternativas a las proteínas de la leche para satisfacer las necesidades de suplementación de productos relacionados con la salud ácidos. Sin embargo, estas proteínas de cereal, particularmente el gluten de trigo, exhiben muy pobres solubilidades a valores de pH más ácidos, es decir, aquellos por encima de 4, significando que los hidrolizados de gluten completamente solubles son muy difíciles de obtener.
Debido a la influencia negativa sobre el costo del producto y la calidad asociada con la hidrólisis de proteína, varias mezclas de enzimas dirigidas a mejorar las características del hidrolizado y los costos de producción se han descrito en publicaciones anteriores. Ejemplos incluyen EP 321 603, la cual se refiere al uso de endoproteasas derivadas de animales como tripsina, quimotripsina y pancreatina, y EP 325 986 y WO 96/13174, las cuales favorecen el uso de endoproteasas obtenidas a partir de especies de Bacillus o Aspergillus. Varias exoproteasas han sido descritas como que son capaces de desamargar las mezclas de péptidos. Mientras que, por ejemplo, EP 0223 560 se refiere al uso de una endoproteasa específica, específica para prolina, WO 96/13174 se refiere a una mezcla de amino-peptidasas y carboxipeptidasas para este propósito.
Un número de publicaciones promocionan los efectos beneficiosos de las endoproteasas específicas para prolina, en combinación con varias exopeptidasas para producir hidrolizados de proteínas los cuales tienen perfiles relativamente bajos de amargor. Por ejemplo, la patente japonesa JP02039896 se refiere al uso de una endoproteasa específica para prolina, combinada con una dipeptidil-carboxipeptidasa para generar preparaciones de péptidos de bajo peso molecular. La degradación de oligopéptidos ricos en prolina por tres hidrolasas de péptidos específicas para prolina, es descrita como esencial para la aceleración de la maduración de quesos sin amargor. (Journal of Dairy Science, 77 (2)385-392 (1994)). Más específicamente, el efecto de desamargar de la endoproteasa específica para prolina en combinación con una carboxipeptidasa, es descrito en JP5015314. JP5015314 describe una preparación enzimática cruda obtenida a partir de Aspergillus oryzae que muestra, además de una actividad proteolítica no específica general, pequeñas cantidades de una actividad carboxipeptidasa y endoproteasa específica para prolina. De acuerdo a JP5015314, los residuos de prolina presentes en el carboxilo terminal de los péptidos, causan sabores amargos y son indeseables. La incubación de la proteína del frijol de soya con una mezcla enzimática de carboxipeptidasa y endoproteasa específica para prolina, produjo un hidrolizado que fue significativamente menos amargo que un hidrolizado de frijol de soya obtenido con una preparación de proteasas carente de la combinación de una carboxipeptidasa y endoproteasa específica para prolina.
Colectivamente, el estado del arte sugiere fuertemente que la liberación del carboxilo terminal (o amino terminal) mediada por exopeptidasa de los residuos de aminoácidos hidrofóbicos a partir de los péptidos, es esencial para desamargar significativamente los de hidrolizados de péptidos. Asimismo, las referencias que especialmente se refieren a endoproteasas específicas para prolina para desamargar, enseñan que la función de esta actividad es exponer los residuos de prolina hidrofóbicos para permitir su subsiguiente eliminación por una carboxipeptidasa. La implicación de esta hipótesis es que, la actividad de eliminar el sabor amargo que tienen las endoproteasas específicas para prolina, está ligada con la eliminación eficiente de los residuos de prolina en el carboxilo terminal, más que la creación de péptidos que porten tales residuos de prolina en el carboxilo terminal.
Extracto de la invención
La presente invención proporciona un hidrolizado de proteínas el cual comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos (%) que portan una prolina en el carboxilo terminal, es más de dos veces mayor que la fracción molar (%) de prolina en el sustrato de proteína utilizado para generar el hidrolizado.
La presente invención también proporciona:
-
un hidrolizado de suero que comprende péptidos, donde la fracción molar de péptidos que portan una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 8%, preferiblemente al menos el 15%, más preferiblemente del 30 al 70%;
-
un hidrolizado de caseína, el cual comprende péptidos donde la fracción molar que portan una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 25%, preferiblemente al menos el 30% y más preferiblemente menos del 70%;
-
un hidrolizado de soya el cual comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos que portan una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 20%, preferiblemente del 30 al 70%;
-
un hidrolizado de gluten el cual comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos que portan una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 20%, preferiblemente al menos el 30%, ventajosamente menos del 70%; y
-
un hidrolizado de cebada el cual comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos que portan una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 20%, preferiblemente al menos el 30%, ventajosamente menos del 70%.
La presente invención además proporciona una endoproteasa específica para la prolina seleccionada del grupo consistente de:
(a)
una polipeptidasa la cual tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 40% con los aminoácidos 1 a 526 de la ID SEC NO: 2 o un fragmento de la misma;
(b)
un polipéptido el cual es codificado por un polinucleótido el cual hidrida en condiciones de baja astringencia con (i) la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC NO: 1 o un fragmento del mismo, el cual es al menos 80% o 90% idéntico por encima de 60, preferiblemente por encima de 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 90% idéntico por encima de 200 nucleótidos, o (ii) una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de ácido nucleico de ID SEC NO: 1
y una molécula de ADN que codifica la endopeptidasa.
La presente invención también proporciona:
-
el uso de un hidrolizado de proteínas de la invención en un alimento o bebida;
-
el uso de una endoproteasa específica para prolina de acuerdo con la invención;
-
un método para producir enzimáticamente un hidrolizado de proteínas a partir de un sustrato de proteínas, donde el sustrato de proteínas es incubado con una endoproteasa específica para la prolina para producir un hidrolizado de proteínas enriquecido en péptidos que tienen prolina en el carboxilo terminal;
-
una composición enzimática que comprende una endoproteasa específica para la prolina de la invención, la composición siendo capaz de producir un hidrolizado de proteínas que comprende péptidos, donde la fracción molar de los péptidos (%) que portan una prolina en el carboxilo terminal, es al menos dos veces la fracción molar (%) de prolina en la proteína o un hidrolizado de la invención; y
-
un alimento que comprende un hidrolizado de proteínas de la invención u obtenible por un método de la invención.
Descripción detallada de la invención
Nosotros hemos mostrado que una alta incidencia de residuos de prolina en el extremo carboxilo terminal de los péptidos, puede ser correlacionada con un bajo amargor. Más aún, se ha demostrado que la deseada alta incidencia de residuos de prolina en el carboxilo terminal solamente puede ser lograda con altas concentraciones de una endoproteasa prolina-específica, es decir concentraciones que excedieron la actividad especificada en JP 5015314 en varios órdenes de magnitud y por otra parte en la ausencia de una carboxipeptidasa.
Desde un punto de vista económico, la implicación de esta observación es que existe una clara necesidad de métodos mejorados para producir endoproteasas específicas para la prolina en altas cantidades y en forma relativamente pura. Una forma preferida de hacer esto es por la vía de la sobreproducción de tal endoproteasa específica para la prolina usando técnicas de ADN recombinante. Como muchos productos alimenticios son ácidos y las incubaciones enzimáticas a largo plazo bajo circunstancias industriales no estériles requieren condiciones de incubación ácidas para prevenir la contaminación microbiana, una forma más preferida para hacer esto es por la vía de la sobreproducción de una endoproteasa específica para la prolina estable al ácido usando técnicas de ADN recombinante. Una forma particularmente preferida de hacerlo es la vía de la sobreproducción de una endoproteasa específica para la prolina derivada de Aspergillus y una forma más preferida de hacerlo es la vía de la sobreproducción de una endopeptidasa específica para la prolina derivada de Aspergillus níger. Para permitirlo, la información reciente de la secuencia de la única ruta de una endoproteasa específica para prolina derivada de Aspergillus es esencial. Más preferible la secuencia de nucleótidos completa del gen que codifica tiene que estar disponible.
Una vez que la nueva enzima ha sido hecha disponible en una forma relativamente pura, otras nuevas y sorprendentes aplicaciones son consideradas las cuales tienen ventajas técnicas y económicas. Una nueva aplicación podría ser la creación de hidrolizados no amargos a partir de sustratos proteicos con composiciones de aminoácidos inusuales. Tales composiciones de aminoácidos inusuales pueden ofrecer serios beneficios en ciertas aplicaciones en alimentos. Ejemplos son los aislados de proteína de maíz o gluten de trigo o caseína con altos niveles de residuos de aminoácidos hidrofóbicos presentes. Hasta ahora tales sustratos fueron de uso no práctico debido a sus reprobables sabores amargos generados luego de la hidrólisis usando métodos del arte anterior. Usando los métodos de hidrólisis de acuerdo con la invención, nuevos hidrolizados no amargos pueden ser hechos disponibles para ser usados en nutrición clínica y en infantes, en dietas terapéuticas así como en dietas de consumidores y nutrición de deportistas. Aparte de tales nuevos hidrolizados, aplicaciones que toman ventajas del efecto reductor del amargor de las endoproteasas específicas para prolina ácidas como tales también son contempladas. Por ejemplo, la incorporación de la endopeptidasa en productos alimenticios proteicos que involucran un paso de fermentación tal como en los quesos o el yogurt, para suprimir el amargor, el cual puede evolucionar con el envejecimiento. También en los productos alimenticios proteicos que requieren tratamiento con proteasas tal como la producción de quesos modificados por enzimas, o la producción de hidrolizados de proteínas para la industria del sabor, la incorporación de la enzima de acuerdo a la invención ayudará a suprimir el amargor.
Más aún, los beneficios no directamente relacionados a la supresión del sabor amargo son también investigados. Una de tales nuevas aplicaciones es la incubación de la enzima con proteínas de los alimentos para reducir su alergenicidad. Muchas proteínas de los alimentos contienen subfracciones altamente alergénicas, tales como el gluten de trigo que contiene prolaminas con secuencia de péptidos ricos en prolina. Estas proteínas pueden ser sometidas a la nueva enzima para mitigar su antigenicidad. Otra nueva aplicación es la incorporación de la enzima en todos los tipos de masas ya que ha sido observado que esta retarda el enranciamiento de los panes obtenidos. Otra nueva aplicación es el uso de la endoproteasa específica para prolina para generar péptidos ricos en prolina. Tales péptidos ricos en prolina son adiciones deseables para varios productos alimenticios o nutracéuticos ya que ellos han sido implicados en la acción anoréxica, en los efectos fibrinolítico y antitrombótico e hipertensivo, en la protección de la mucosa gástrica, así como la prevención de artritis reumatoide.
Otra sorprendente aplicación es la adición de la nueva enzima en el alimento animal para mejorar la utilización de proteínas. Por ejemplo, la adición de la enzima conduce a mejorar la digestibilidad de secuencias ricas en prolina difíciles de digerir presentes en los alimentos de proteínas, así como para las proporciones de conversión mejoradas de proteínas vegetales disponibles a bajo precio que contienen altos niveles de polifenoles.
En aún otra nueva aplicación la enzima es usada en la elaboración de cerveza. Las proteínas de cebada son ricas en secuencias ricas en prolina y sus formas no malteadas de proteínas de cereal son extremadamente difíciles de degradar en los aminoácidos libres requeridos para crear un mosto de cerveza fermentable apropiado. Muy sorprendentemente la incorporación de la nueva enzima en el proceso de amasado ha mostrado estimular la liberación de aminoácidos de la cebada molida pero no malteada, de manera que un mosto de cerveza mucho más rico es obtenido. En una forma similar la fermentación de cerveza a partir de masas que contienen una alta proporción de otros cereales baratos y localmente disponibles tales como por ejemplo el sorgo, puede ser mejorada.
En la mayoría de estas nuevas aplicaciones la endoproteasa específica para prolina debe exhibir preferentemente un espectro de actividad óptimo con un pH ácido. Para superar los problemas anteriormente mencionados, la invención demuestra que la actividad de una endoproteasa específica para prolina aislada y purificada sola, es decir sin actividad concomitante o subsiguiente sustancial de una enzima exoproteolítica, es suficiente para desamargar significativamente un hidrolizado de proteínas. Por consiguiente la endoproteasa específica para prolina puede comprender al menos 5 unidades por gramo de proteína de la preparación enzimática de la invención, preferiblemente 10 u/g, más preferiblemente 25 u/g y aún más preferiblemente 50 u/g. Además, estudios conducidos de acuerdo a la invención demuestran que la actividad de una endoproteasa específica para prolina aislada y purificada sola, significando sin la actividad concomitante o subsiguiente de una enzima exoproteolítica, es suficiente para disminuir significativamente el nivel de inmunogenicidad total de los hidrolizados de proteína, así como para disminuir significativamente su solubilidad total bajo condiciones ácidas. Los hidrolizados producidos de acuerdo a la invención son enriquecidos en péptidos que tienen un residuo de prolina en el carboxilo terminal.
Una realización de la presente invención proporciona una mezcla enzimática que comprende una endoproteasa específica para prolina aislada y purificada, para la producción de hidrolizados de proteínas con alto rendimiento que tienen sustancialmente bajo amargor y bajas propiedades alergénicas, sin la producción concomitante de niveles sustanciales de aminoácidos libres. Esta mezcla enzimática es apropiada para preparar hidrolizados de varias fracciones de proteínas. En particular, un sustrato de proteínas, tal como una proteína de la leche, puede ser incubado con una endoproteasa específica para prolina aislada y purificada y una subtilisina para producir un hidrolizado de proteínas enriquecido en fragmentos de péptidos que tienen una prolina en el carboxilo terminal. El término "enriquecido" se pretende que signifique que al menos el 8% de los fragmentos de péptidos en el producto hidrolizado de la escisión enzimática posee un residuo de prolina en el carboxilo terminal.
La presente invención proporciona un hidrolizado de proteínas obtenido por hidrólisis de una proteína la cual comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos (%) que lleva una prolina en el carboxilo terminal es al menos dos veces la fracción molar (%) de prolina en el sustrato de proteína usado para producir el hidrolizado.
La longitud promedio de los péptidos en los hidrolizados es en general de 3 a 9 aminoácidos.
Los hidrolizados preferidos de acuerdo a la invención son: un hidrolizado de suero que comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos que lleva una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 8%, preferiblemente al menos el 15%, más preferiblemente del 30 al 70%, un hidrolizado de caseína el cual comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos que lleva una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 25%, preferiblemente del 30 al 70%, y un hidrolizado de soya que comprende péptidos donde la fracción molar de péptidos que lleva una prolina en el carboxilo terminal es al menos el 20%, preferiblemente del 30 al 70%.
Por péptidos o fragmentos de péptidos se entiende péptidos con masas moleculares de 400 a 2000 Dalton. Estos péptidos pueden ser analizados de acuerdo al análisis de LC/MC como se describe en la sección de "Materiales y Métodos".
En general, en la producción de hidrolizados de proteínas de la invención, el sustrato de proteínas es sustancialmente hidrolizado, ventajosamente para al menos el 50%. Preferiblemente al menos el 10% del sustrato de proteínas es convertido a péptidos que tienen masas moleculares de 400 a 2000 Dalton. Más preferiblemente del 20 al 90% y aún más preferiblemente del 30 al 80% del sustrato de proteínas es convertido en tales péptidos.
En otra realización de la invención, un sustrato de proteína puede ser incubado con una mezcla enzimática que comprende una endoproteasa aislada y purificada, una serina endoproteasa o una metalo endoproteasa y una carboxipeptidasa para producir un hidrolizado de proteínas enriquecido en fragmentos de péptidos que tienen una prolina en el carboxilo terminal.
La mezcla enzimática de la invención es particularmente conveniente para usar en la producción de hidrolizados de proteínas pretendidos para saborizar e incrementar en nutrientes las bebidas para deportistas y las bebidas basadas en jugos, ya que la mezcla de péptidos hidrolizados resultante combina un muy bajo perfil de amargor con excelente solubilidad bajo las condiciones prevalentemente ácidas de tales bebidas. La mezcla enzimática de la invención se caracteriza porque contiene al menos una endoproteasa por ejemplo una serina proteasa o una metalo endoproteasa junto con una endoproteasa específica para serina (E.C. 3.4.2.21.26), para proporcionar un hidrolizado primario. Más específicamente, la invención se refiere a una endoproteasa específica para prolina aislada, purificada y una mezcla enzimática de serina proteasa o metalo proteasa capaz de producir un hidrolizado de proteínas que comprende fragmentos de péptidos, donde al menos el 8%, preferiblemente al menos el 15%, más preferiblemente del 30 al 70% de dichos fragmentos de péptidos, tiene una prolina en el carboxilo terminal.
Otra realización de la invención es un hidrolizado de proteínas enriquecido con un contenido relativamente alto de péptidos que contienen prolina como el residuo de aminoácido en el carboxilo terminal. Tales hidrolizados enriquecidos pueden comprender al menos el 8%, preferiblemente al menos el 15%, más preferiblemente del 30 al 70% de fragmentos de péptidos que tienen un residuo de prolina en el carboxilo terminal.
Puesto que las preparaciones enzimáticas típicamente usadas en la génesis de los hidrolizados de proteínas no son capaces de generar péptidos que produzcan residuos de prolina en el carboxilo terminal, los hidrolizados de proteínas que son relativamente ricos en estos péptidos son novedosos.
Sustratos para la hidrólisis por una mezcla enzimática de la invención incluyen leche entera, leche descremada, caseína ácida, cuajo de caseína, productos de suero ácidos o productos de suero de quesos. Muy sorprendentemente la endoproteasa específica para prolina derivada del Aspergillus no solamente escinde los residuos de prolina en el lado del carboxilo terminal, sino también los residuos de hidroxiprolina en el lado del carboxilo terminal, lo cual hace a otras proteínas animales basadas en colágeno, tales como la gelatina, así como los huesos o espinas de pescado que contienen alimentos residuales, sustratos interesantes para las enzimas. Más aún, sustratos vegetales como el gluten de trigo, la cebada molida y las fracciones de proteínas obtenidas a partir de, por ejemplo, soya, arroz o maíz son sustratos apropiados. Hidrolizados de proteínas de la leche producidos de acuerdo a la invención, pueden ser usados con o sin pasos de filtración o purificación adicionales en varias especialidades alimenticias tales como hidrolizados hipoalergénicos para nutrición infantil, hidrolizados básicos para nutrición entera o dietética, así como concentrados de proteínas para varias formas de alimentos saludable. De esta forma, los hidrolizados de proteínas de la invención pueden ser usados para producir productos alimenticios que tienen baja antigenicidad, tal como fórmulas infantiles. Además, las preparaciones enzimáticas de acuerdo con la invención pueden ser utilizadas para reducir el amargor en alimentos saborizados mediante al menos un hidrolizado de proteínas, aún cuando el hidrolizado de proteínas esté presente en grandes cantidades. Por ejemplo, los alimentos pueden comprender entre el 5% y el 10% (p/v) de un hidrolizado de proteínas, y aún tener su sabor amargo reducido usando una preparación enzimática de la
invención.
La presente invención proporciona una endoproteasa específica para prolina aislada y purificada con un pH ácido óptimo, sola o en una composición que comprende una o más enzimas adicionales para la preparación de un hidrolizado de proteínas para varias aplicaciones alimenticias. Tal endoproteasa específica para prolina aislada y purificada está definida que tiene al menos 10 unidades de actividad específica para prolina por gramo de material proteico. Estas unidades deben ser medidas usando el péptido sintético Z-Gli-Pro-pNA a 37 grados C y pH 5 en caso que el pH óptimo de la endoproteasa específica para prolina sea por debajo de pH 6, por ejemplo en el caso de la endoproteasa específica para prolina de Aspergillus níger, o también las unidades deben ser medidas a pH=7, según lo especificado en la sección de Materiales y Métodos. Esta enzima aislada, purificada, sola o en una mezcla enzimática, supera un número de desventajas de mezclas ezimáticas conocidas previamente en el arte. Más importantemente, la endoproteasa específica para prolina aislada, purificada inventiva es clave en la producción de hidrolizados los cuales combinan un bajo potencial alergénico, un alto rendimiento y un bajo perfil amargo. Más aún, los hidrolizados producidos con la endoproteasa específica para prolina aislada, purificada o una mezcla enzimática que comprende esta endoproteasa específica para prolina, son estables al ácido y contienen muy bajos niveles de aminoácidos libres, de manera tal que malos sabores mínimos sean generados durante las etapas de calentamiento, tales como el secado por pulverización o la esterilización del producto. Los hidrolizados de acuerdo a la invención contendrán menos de 900 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, preferiblemente menos de 300 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, más preferiblemente menos de 150 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, y aún más preferiblemente menos de 50 micromoles por gramo de polvo seco.
La mezcla enzimática de acuerdo con la invención se caracteriza porque comprende otra endoproteasa tal como una serina proteasa o una metalo endoproteasa junto con una endoproteasa específica para prolina aislada, purificada (E.C. 3.4.21.26), las cuales trabajan juntas para proporcionar un hidrolizado de proteínas primario.
Las serinas proteasas representan una bien conocida clase de endoproteasas alcalinas y algunas de sus más importantes representantes tales como la subtisilina (E.C.3.4.21.62) y la quimotripsina (E.C.3.4.21.1) prefieren la escisión de la cadena peptídica por el lado del carboxilo terminal de los aminoácidos hidrofóbicos tales como Tyr, Trp, Phe y Leu. La mezcla enzimática de la invención puede contener quimotripsina y/o subtilisina. La subtilisina es producida por especies de Bacillus, tiene una especificidad de sustrato particularmente amplia y un amplio pH óptimo alcalino. La enzima es óptimamente activa entre 50ºC y 60ºC. La enzima está disponible de a bajo precio como un producto comercial regular y es útil en la producción de, por ejemplo, varios hidrolizados de leche. La quimotripsina puede ser obtenida a partir de páncreas animal, tiene una especificidad de sustrato algo más estrecha a valores de pH ligeramente más alcalinos que la subtilisina y es óptimamente activa por debajo de 50 grados C.
La clase de metalo endoproteasas está ampliamente diseminada en bacterias, hongos y organismos superiores. Ellas pueden ser separadas en metaloproteasas ácidas y neutras. De estas dos subclases solamente las proteasas neutras exhiben la preferencia de escisión deseable, es decir escindiendo la cadena peptídico en el lado carboxilo terminal de los residuos aminoácidos hidrofóbicos tales como Phe y Leu. Representantes bien conocidos de la categoría de metalo proteasas neutras son la bacilolisina (E.C.3.4.24.28) y la termolisina (E.C.3.4.24.27) y alguna, o ambas de éstas, pueden estar presentes en la mezcla enzimática de la invención. Ambas enzimas son obtenidas a partir de especies de Bacillus y exhiben actividad máxima bajo condiciones neutras o ligeramente alcalinas. Representantes menos conocidos de estas metalo proteasas neutras han sido obtenidas a partir de especies Aspergillus. En aquellos casos, en los cuales la endoproteasa específica para prolina no es utilizada por su efecto eliminador del amargor, sino para ayudar en la hidrólisis de secuencia de proteínas ricas en prolina, combinaciones con el tipo de metaloproteasas ácidas, como por ejemplo deuterolisina (E.C.3.4.24.39) pueden ser ventajosas.
Una endoproteasa específica para prolina es una endoproteasa capaz de escindir péptidos o polipéptidos en el extremo carboxilo terminal de residuos de prolina. Tales enzimas son ampliamente encontradas en animales y plantas, pero su presencia en microorganismos parece estar limitada. Hasta la fecha, endoproteasas específica para prolinas han sido identificadas en especies de Aspergillus (EP 0 522 428), Flavobacterium (EP 0 967 285) y Aeromonas (J. Biochem.113, 790-796), Xanthomonas y Bacteroides. Aunque las enzimas específicas para prolinas de la mayoría de estos organismos son activas alrededor de pH 8, la enzima de Aspergillus es óptimamente activa a pH alrededor de 5. De acuerdo a una realización preferida, la endoproteasa específica para prolina que tiene un pH óptimo por debajo de 7, preferiblemente que tiene un pH óptimo de 3.5 a 6.5, es usada debido a las ventajas técnicas y económicas de tales enzimas. La endoproteasa específica para prolina de la invención puede ser aislada a partir de una de las especies microbianas antes mencionadas, particularmente a partir de las especies de Aspergillus. Preferiblemente, la endoproteasa específica para prolina es aislada a partir de un cepa de Aspergillus níger. Más preferiblemente, la endoproteasa específica para prolina es aislada a partir de un hospedero Aspergillus níger manipulado para sobreexpresar un gen que codifica una endoproteasa específica para prolina, aunque otros hospederos como E. coli son vectores de expresión apropiados. Por ejemplo, la clonación y la sobreproducción de la endoproteasa específica para prolina derivada de Flavobacterium en, entre otros, E. coli, ha hecho ciertas endoproteasas específica para prolinas disponibles en una forma pura. Un ejemplo de tal construcción de sobreproducción es proporcionado en World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 11, pp 209-212. Un hospedero Aspergillus níger es preferiblemente usado para producir una construcción propia no recombinante utilizando promotores de A. níger para dirigir la expresión de un gen que codifica una endoproteasa específica para prolina de A. níger.
La mayoría de las publicaciones científicas concernientes a la clonación y producción de endoproteasas específica para prolinas enfoca el papel de esta enzima en la síntesis y la regulación de proteínas biológicamente activas. Las publicaciones que implican esta enzima en la producción de hidrolizados de proteínas útiles son escasas y están involucradas con el uso de la enzima junto con una exoproteasa. Varias publicaciones japonesas refieren la presencia de actividad endoproteolítica específica para prolina en mezclas de enzimas crudas complejas, capaces de producir hidrolizados con bajo perfil amargo, pero la mezcla enzimática usada siempre contiene exoproteasas. La conexión no directa entre desamargar y la actividad endoproteolítica específica para prolina en ausencia de exoproteasas, como las carboxipeptidasas o aminopeptidasas, está sugerida en el arte. Más aún, datos vinculantes que relacionen hidrolizados producidos usando actividad endoproteolítica específica para prolina con una respuesta inmunogénica disminuida o una solubilidad ácida mejorada no han sido previamente descritos.
Un polipéptido de la invención el cual tiene endoproteasa específica para prolina puede estar en forma aislada. Como se define aquí, un polipéptido aislado es un polipéptido recombinante o producido endógenamente el cual es esencialmente libre de otros polipéptidos endoproteasas no específicas para prolina, y es típicamente al menos alrededor del 20% puro, preferiblemente al menos alrededor del 40% puro, más preferiblemente al menos alrededor del 60% puro, aún más preferiblemente al menos alrededor del 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor del 90% puro, y lo más preferiblemente alrededor del 95%, según lo determinado por SDS-PAGE. El polipéptido puede ser aislado por centrifugación y métodos cromatográficos, o cualquier otra técnica conocida en el arte para obtener proteínas puras a partir de soluciones crudas. Se entenderá que el polipéptido puede ser mezclado con portadores o diluyentes los cuales no interfieren con el propósito pretendido del polipéptido, y así el polipéptido en esta forma se considerará aislado. Esto generalmente comprenderá el polipéptido en una preparación en la cual más del 20%, por ejemplo más del 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% o 99%, por peso de las proteínas en la preparación es un polipéptido de la invención.
Preferiblemente el polipéptido de la invención es obtenible a partir de un microorganismo el cual posee un gen que codifica una enzima con actividad endoproteasa específica para prolina. Más preferiblemente el microorganismo es un hongo, y óptimamente es un hongo filamentoso. Organismos preferidos son así del género Aspergillus, tales como aquellos de la especie Aspergillus níger.
En una primera realización, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad de secuencias de aminoácidos para los aminoácidos 1 a 526 de ID SEC NO: 2 (es decir el polipéptido) de al menos alrededor del 80%, preferiblemente al menos alrededor del 90%, más preferible al menos alrededor de 95%, y lo más preferiblemente al menos alrededor del 97%, y el cual tiene una actividad endoproteasa específica para prolina.
Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos es determinado por el programa de búsqueda de en base de datos de proteínas BLAST P (Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Research 25:3389-3402) con matriz Blosum 62 y un umbral esperado de 10.
Un polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en la ID SEC NO: 2 o una secuencia sustancialmente homóloga, o un fragmento de alguna secuencia que tenga actividad endoproteasa específica para prolina. En general, la secuencia de aminoácidos que existe de manera natural mostrada en la ID SEC NO: 2 es preferida.
El polipéptido de la invención puede también comprender a una variante que exista de manera natural o especies homólogas del polipéptido de la ID SEC NO: 2.
Una variante es un polipéptido que se encuentra de manera natural en, por ejemplo hongos, bacterias, levaduras o células de plantas, la variante que tiene actividad endoproteasa específica para prolina y una secuencia sustancialmente similar a la de la proteína de la ID SEC NO: 2. El término "variante" se refiere a polipéptidos los cuales tienen las mismas características esenciales o funcionalidad biológica básica que las endoproteasas específica para prolinas de la ID SEC NO: 2, e incluye las variantes alélicas. El carácter esencial de la endoproteasa específica para prolina de la ID SEC NO: 2 es que ella es una enzima capaz de escindir el aminoácido amino terminal de una proteína o (poli)péptido. Preferiblemente, una polipéptido variante tiene al menos el mismo nivel de actividad endoproteasa específica para prolina que el polipéptido de la ID SEC NO: 2. Las variantes incluyen algunas variantes alélicas ya sean de la misma cepa, como los polipéptidos de la ID SEC NO: 2, o a partir de una cepa diferente del mismo género o especie.
Similarmente, una especie homóloga de la proteína inventiva es una proteína equivalente de secuencia similar, la cual es una endoproteasa específica para prolina y se encuentra de manera natural en otras especies de Aspergillus.
Variantes y especies homólogas pueden ser aisladas usando los procedimientos descritos aquí, los cuales fueron usados para aislar el polipéptido de la ID SEC NO: 2 y llevando a cabo tales procedimientos sobre una fuente de células apropiada, por ejemplo una célula bacteriana, de levadura, de hongo o de planta. También es posible usar una sonda de la invención para explorar bibliotecas hechas a partir de células de levaduras, bacterianas, de hongos o de plantas, con el objetivo de obtener clones que expresen variantes o especies homólogas del polipéptido de la ID SEC NO: 2. Estos clones pueden ser manipulados por técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención el cual después de esto puede ser producido por técnicas sintéticas o recombinantes conocidas per se.
La secuencia del polipéptido de la ID SEC NO: 2 y de las variantes y especies homólogas, pueden ser también ser modificadas para proporcionar los polipéptidos de la invención. Sustituciones de los aminoácidos pueden ser hechas, por ejemplo desde 1, 2, ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones. El mismo número de eliminaciones que de inserciones pueden también ser hechas. Estos cambios pueden ser hechos fuera de las regiones críticas para la función del polipéptido, como tal un polipéptido modificado retendrá su actividad endoproteasa específica para prolina.
Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos longitud completa antes mencionados y las variantes de los mismos, incluyendo fragmentos de la secuencia establecida en la ID SEC NO: 2. Tales fragmentos típicamente retendrán actividad como una endoproteasa específica para prolina. Los fragmentos pueden ser al menos de 50, 100 ó 200 aminoácidos de longitud, o puede ser este número de aminoácidos corto de la secuencia de longitud completa mostrada en la ID SEC NO: 2.
Los polipéptidos de la invención pueden, si es necesario, ser producidos por medios sintéticos, aunque usualmente ellos serán hechos por vía recombinante como se describe más adelante. Los polipéptidos sintéticos pueden ser modificados, por ejemplo, por la adición de residuos de histidina o un marcador T7 para ayudar a su identificación o purificación, o por la adición de una secuencia señal para promover su secreción a partir de una célula.
De esta manera, las secuencias variantes pueden comprender aquellas derivadas de cepas de Aspergillus diferentes de la cepa a partir de la cual el polipéptido de la ID SEC NO: 2 fue aislado. Las variantes pueden ser identificadas a partir de otras cepas de Aspergillus mediante la búsqueda de actividad endoproteasa específica para prolina y clonando y secuenciando según lo descrito aquí. Las variantes pueden incluir la delección, modificación o adición de aminoácidos simples o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de proteína, hasta tanto el péptido mantenga la funcionabilidad biológica básica de la endoproteasa específica para prolina de la ID SEC NO: 2.
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser hechas, por ejemplo desde 1, 2 ó de 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones. Los polipéptidos modificados generalmente mantendrán su actividad como endoprotesas específica para prolina. Las sustituciones conservadoras pueden ser hechas; tales sustituciones son bien conocidas en el arte. Las sustituciones preferentemente no afectan el plegamiento o la actividad del polipéptido.
Las secuencias de polipéptidos más cortas están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo un péptido de al menos 50 aminoácidos o hasta 60, 70, 80, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud es considerado que está dentro del alcance de la invención, mientras que demuestre la funcionabilidad biológica básica de la endoproteasa específica para prolina de la ID SEC NO: 2. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención comprende la situación en la cual la proteína es un fragmento de la secuencia de la proteína completa.
El término "capaz de hibridar" significa que el polinucleótido objetivo de la invención puede hibridar con los ácidos nucleicos usados como una sonda (por ejemplo, la secuencia de nucleótido establecida en la ID SEC NO: 1, o un fragmento de la misma, o la complementaria de la ID SEC NO: 1) a un nivel significativamente por encima del fondo. La invención también incluye los polinucleótidos que codifican la endoproteasa específica para prolina de la invención, así como las secuencias de nucleótidos las cuales son complementarias a ellas. La secuencia de nucleótidos puede ser ARN o ADN, incluyendo ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es ADN y más preferiblemente, una secuencia de ADN genómico. Típicamente, un polinucleótido de la invención comprende una secuencia contigua de nucleótidos, la cual es capaz de hibridar bajo condiciones selectivas con la secuencia codificante o con la complementaria de la secuencia codificante de la ID SEC NO: 1. Tales nucleótidos pueden ser sintetizados de acuerdo a métodos bien conocidos en el arte.
Un polinucleótido de la invención puede hibridar con la secuencia codificante o la complementaria de la secuencia codificante de la ID SEC NO: 1, a un nivel significativamente por encima del fondo. El fondo de hibridación puede existir, por ejemplo debido a otros ADNcs presentes en una biblioteca de ADNc. El nivel de señal generado por la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia codificante o la complementaria de la secuencia codificante de la ID SEC NO: 1, es típicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20 veces, más preferiblemente al menos 50 veces, y aún más preferiblemente al menos 100 veces, tan intensa como las interacciones entre otros polinucleótidos y la secuencia codificante de la ID SEC NO: 1. La intensidad de la interacción puede ser medida, por ejemplo, radiomarcando la sonda, por ejemplo con ^{32}P. La hibridación selectiva puede ser típicamente lograda usando condiciones de astringencia baja (cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 40ºC), astringencia media (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 50ºC) o astringencia alta (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 60ºC).
Modificaciones
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o RNA. Ellos pueden ser de simple o doble cadena. Pueden también ser polinucleótidos los cuales incluyen dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados que incluyen ácidos nucleicos peptídicos. Un número de diferentes tipos de modificaciones para los polinucleótidos son conocidas en el arte. Estas incluyen un metilfosfonato y estructuras principales de de fosforotioato, y la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para el propósito de la presente invención será entendido que los polinucleótidos descritos aquí pueden ser modificados por cualquier método disponible en el arte.
Será entendido que personas expertas podrán, usando técnicas de rutina, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten la secuencia de polipéptidos codificada por los polinucleótidos de la invención, para reflejar el usaje de codones de cualquier organismo hospedero particular en el cual los polipéptidos de la invención serán expresados.
La secuencia codificante de la ID SEC NO: 1 puede ser modificada por sustitución de nucleótidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 hasta 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El polinucleótido de la ID SEC NO: 1 puede ser modificado alternativamente o adicionalmente por una o más inserciones y/o delecciones y/o por una extensión en alguno o ambos extremos. El polinucleótido modificado generalmente codifica un polipéptido el cual tiene una actividad endoproteasa específica para prolina. Sustituciones degeneradas pueden ser hechas y/o pueden ser hechas sustituciones las cuales podrían resultar en una sustitución de aminoácidos conservadora cuando la secuencia modificada es traducida, por ejemplo según lo discutido con referencia a los polipéptidos posteriormente.
Homólogos
Una secuencia de nucleótidos la cual es capaz de hibridar selectivamente con la complementaria de la secuencia de ADN codificante de la ID SEC NO: 1, es incluida en la invención y generalmente tendrá al menos el 50% ó el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencias con la secuencia codificante de la ID SEC NO: 1 sobre una región de al menos 60, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 200 nucleótidos contiguos, o lo más preferiblemente sobre la longitud completa de la ID SEC NO: 1. Igualmente, un nucleótido el cual codifica una endoproteasa específica para prolina activa y el cual es capaz de hibridar selectivamente un fragmento de un complemento de la secuencia de ADN codificante de la ID SEC NO: 1, es también comprendido en la invención. Un fragmento C-terminal de la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC NO: 1, la cual es al menos el 80% ó el 90% idéntica por encima de 60, preferiblemente por encima de 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 90% idéntica por encima de 200 nucleótidos, es comprendida por la invención.
Cualquier combinación de los grados de identidad y tamaños mínimos antes mencionados pueden ser usados para definir los polinucleótidos de la invención, siendo preferidas las combinaciones más astringentes (es decir mayor identidad por encima de grandes longitudes). Así, por ejemplo, un polinucleótido el cual es al menos 80% o 90% idéntico por encima 60, preferiblemente por encima de 100 nucleótidos, forma un aspecto de la invención, como lo es un polinucleótido el cual es al menos idéntico 90% por encima de 200 nucleótidos.
El Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT el cual puede ser usado para calcular la identidad (por ejemplo usado sobre sus parámetros predeterminados).
Los algoritmos PILEUP y BLAST N pueden ser usados para calcular la identidad de secuencias o para alinear secuencias (tales como identificar secuencias equivalentes o correspondientes, por ejemplo sobre sus parámetros predeterminados).
El programa para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero identificar el par de secuencias de alto puntaje (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de la búsqueda, que ya bien se corresponde o satisface algún puntaje T del umbral evaluado como positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntaje de la palabra en la vecindad. Estos aciertos de las palabras en la vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar las HSPs contenidas en ellas. Los aciertos de palabras son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde el puntaje de alineación acumulativa puede ser incrementado. Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección son detenidas cuando: el puntaje de alineación acumulativa cae fuera mediante la cantidad X a partir de su máximo valor logrado; el puntaje acumulativo va hacia cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos que puntean negativo; o el final de cualquier secuencia es alcanzado. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, las alineaciones de la matriz de puntaje BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la más pequeña suma de probabilidad (P(N)); la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos podría ocurrir por azar. Por ejemplo una secuencia es considerada similar a otra secuencia, si la más pequeña suma de probabilidad en comparación de la primera secuencia a la segunda secuencia es menor que alrededor de 1, preferiblemente menor que alrededor de 0.1, más preferiblemente menor que alrededor de 0.01, y lo más preferiblemente menor que alrededor de 0.001.
Cebadores y Sondas
Los polinucleótidos de la invención incluyen y pueden ser usados como cebadores, por ejemplo como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como cebadores para reacciones de amplificación alternativas, o como sondas por ejemplo marcadas con marcadores reveladores por medios convencionales usando marcadores radioactivos y no radioactivos, o los polinucleótidos pueden ser clonados en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos serán al menos de 15, por ejemplo al menos de 20, 25, 30, ó 40 nucleótidos de longitud. Típicamente serán hasta 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 ó 300 nucleótidos de longitud, o incluso hasta unos pocos nucleótidos cortos (tal como 5 ó 10 nucleótidos) de la secuencia codificante de la ID SEC NO: 1.
En general, los cebadores serán producidos por medios sintéticos, incluyendo una fabricación escalonada de la secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido cada vez. Las técnicas para lograr esto usando los protocolos automatizados están fácilmente disponibles en el arte. Los polinucleótidos más largos serán generalmente producidos usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por PCR. Esto involucrará la fabricación de un par de cebadores (típicamente de alrededor de 15-30 nucleótidos) para amplificar la región deseada de la endoproteasa específica para prolina a ser clonada, poniendo los cebadores en contacto con el ARNm, ADNc o ADN genómico obtenido a partir de una célula de levadura, bacteriana, de planta, procariótica o fúngica, preferiblemente de una cepa de Aspergillus, realizando una reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones apropiadas para la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento purificado (por ejemplo por purificación de la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden ser diseñados para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiadas, de manera que el ADN amplificado pueda ser clonado en un vector de clonación apropiado.
Tales técnicas pueden ser usadas para obtener todo o parte de los polinucleótidos que codifican la secuencia de endoproteasa específica para prolina descrita aquí. Los intrones, promotores y regiones trailer están dentro del alcance de la invención y pueden también ser obtenidos en una manera análoga (por ejemplo por medios recombinantes, PCR o técnicas de clonación) partiendo del ADN genómico proveniente de una célula fúngica, de levadura, bacteriana, de planta o procariótica.
Los polinucleótidos o cebadores pueden llevar un marcador revelador. Marcadores apropiados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S, marcadores enzimáticos, u otros marcadores proteicos tales como la biotina. Tales marcadores pueden ser añadidos a los polinucleótidos o cebadores de la invención, y pueden ser detectados usando técnicas conocidas por personas expertas en el arte.
Los polinucleótidos o cebadores (o fragmentos de los mismos) marcados o no marcados pueden ser usados en pruebas basadas en ácidos nucleicos para detectar o secuenciar una endoproteasa específica para prolina o una variante de la misma en una muestra fúngica. Tales pruebas de detección generalmente comprenderán poner una muestra fúngica que se sospecha que contiene el ADN de interés en contacto con una sonda que comprende un polinucleótido o cebador de la invención bajo condiciones de hibridación, y detectar cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico en la muestra. La detección puede ser lograda usando técnicas tales como PCR o por inmovilización de la sonda en un soporte sólido, eliminando cualquier ácido nucleico en la muestra el cual no es hidridado con la sonda, y luego detectando cualquier ácido nucleico el cual es hidridado con la sonda. Alternativamente, la muestra de ácido nucleico puede ser inmovilizada en un soporte sólido, la sonda hidridada y la cantidad de sonda unida a tal soporte detectada después de la eliminación de cualquier sonda no enlazada.
Las sondas de la invención pueden convenientemente ser empacadas en la forma de un kit de prueba en un contenedor apropiado. En tales kit la sonda puede estar enlazada a un soporte sólido, donde el formato de ensayo para el cual el kit es diseñado requiere tal enlace. El kit también puede contener reactivos apropiados para tratar la muestra a ser ensayada, hibridar la sonda con los ácidos nucleicos en la muestra, reactivos controles, instrucciones y similares. Las sondas y los polinucleótidos de la invención también pueden ser usados en microensayos.
Preferiblemente, el polinucleótido de la invención es obtenible a partir del mismo organismo que el polipéptido, tal como un hongo, en particular un hongo del género Aspergillus.
Los polinucleótidos de la invención también incluyen variantes de la secuencia de la ID SEC NO: 1, la cual codifica para un polipéptido que tiene actividad endoproteasa específica para prolina. Las variantes pueden ser formadas por adiciones, sustituciones y/o delecciones. Tales variantes de la secuencia codificante de la ID SEC NO: 1 pueden de esta forma codificar polipéptidos, los cuales tienen la habilidad de digerir una cadena polipeptídica en el lado de la prolina del carboxilo terminal.
Producción de polinucleótidos
Los polinucleótidos los cuales no tienen 100% de identidad con la ID SEC NO: 1 pero caen dentro del alcance de la invención, pueden ser obtenidos en un número de vías. Así, variantes de la secuencia de la endoproteasa específica para prolina descrita aquí, pueden ser obtenidas por ejemplo, explorando las bibliotecas de ADN genómico hechos a partir de un rango de organismos, tal como aquéllos discutidos como fuentes de los polipéptidos de la invención. Adicionalmente, otros homólogos fúngicos, de plantas o procarióticos de endoproteasa específica para prolina pueden ser obtenidos, y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar con la ID SEC NO: 1. Tales secuencias pueden ser obtenidas explorando bibliotecas de ADNc o bibliotecas de ADN genómico de otras especias, y probando tales bibliotecas con sondas que contienen todo o parte de la ID SEC NO: 1 bajo condiciones de baja, media y alta astringencia (según lo descrito previamente). Las sondas de ácidos nucleicos que comprenden todo o parte de la ID SEC NO: 1 pueden ser usados para probar las bibliotecas de ADNc o genómico de otras especies, tales como aquellas descritas como fuentes para los polipéptidos de la inven-
ción.
Especies homólogas pueden ser obtenidas también usando PCR degenerada, la cual usa cebadores diseñados para secuencias objetivo dentro de las variantes y homólogos los cuales codifican secuencias de aminoácidos conservadas. Los cebadores pueden contener una o más posiciones degeneradas y serán usados en condiciones de astringencia más bajas que aquellos que usados para clonar secuencias con cebadores de secuencias simples contra secuencias conocidas.
Alternativamente, tales polinucleótidos pueden ser obtenidos por mutagénesis sitio- dirigidas a partir de las secuencias de la endoproteasa específica para prolina o variantes de la misma. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, cuando los cambios de codones silentes para las secuencias son requeridos para optimizar preferencias de codones para una célula hospedera particular, en la cual las secuencias de polinucleótidos están siendo expresadas. Otros cambios de secuencias pueden ser hechos con el objetivo de introducir sitios de reconocimiento por enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
La invención incluye polinucleótidos de doble cadena que comprenden un polinucleótido de la invención y su complementario.
La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención descritos anteriormente. Ya que tales polinucleótidos serán útiles como secuencias para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, no es necesario para ellos ser capaces de hibridar la secuencia de ID SEC NO: 1, aunque esto fuera generalmente deseable. Por otra parte, tales polinucleótidos pueden ser marcado, usado, y hecho según lo descrito anteriormente si es deseado.
Polinucleótidos recombinantes
La invención también proporciona vectores que comprenden un polinucleótido de la invención, que incluye vectores de clonación y de expresión, y en otro aspecto métodos de crecimiento, transformación o transfección de tales vector en una célula hospedera apropiada, por ejemplo bajo condiciones en la cuales la expresión de un polipéptido de, o codificado por una secuencia de, la invención ocurre. También son proporcionadas células hospederas que comprenden un polinucleótido o vector de la invención donde el polinucleótido es heterólogo al genoma de la célula hospedera. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula hospedera, significa que el polinucleótido no está naturalmente presente en el genoma de la célula hospedera o que el polipéptido no es producido de manera natural por esa célula. Preferiblemente, la célula hospedera es una célula de levadura, por ejemplo una célula de levadura del género Kluyveromyces o Saccharomyces o una célula de un hongo filamentoso, por ejemplo del género Aspergillus.
Los polinucleótidos de la invención pueden ser incorporados dentro de un vector recombinante replicable, por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector puede ser usado para replicar el ácido nucleico en una célula hospedera compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método para hacer los polinucleótidos de la invención, introduciendo un polinucleótido de la invención dentro de un vector replicable, introduciendo el vector dentro de una célula hospedera compatible, y creciendo la célula hospedera bajo condiciones las cuales causan la replicación del vector. El vector puede ser a partir recuperado de la célula hospedera. Células hospederas apropiadas son descritas más adelante en relación con los vectores de expresión.
Vectores
El vector dentro del cual el casete de expresión de la invención es insertado puede ser cualquier vector que pueda convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedera dentro de la cual será introducido. Así el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector el cual existe como una entidad extra-cromosomal, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosomal, tal como un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando es introducido dentro de la célula hospedera, es integrado dentro del genoma de la célula hospedera y se replica junto con el cromosoma(s) dentro del cual ha sido integrado.
Preferiblemente, cuando un polinucleótido de la invención está en un vector, este está operablemente unido a una secuencia reguladora la cual es capaz de proveer para la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedera, es decir el vector es un vector de expresión. El término "operablemente unido" se refiere a la yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite a ellos funcionar en su manera pretendida. Una secuencia reguladora tal como un promotor, incrementador u otra señal de regulación de la expresión "operablemente unido" a una secuencia codificante está posicionado de tal manera que la expresión de la secuencia codificante es lograda bajo condiciones compatibles con las de las secuencias de control.
Los vectores pueden, por ejemplo en el caso de los plásmidos, cósmidos, virus o fagovectores, ser provistos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un incrementador y/o regulador del promotor. Una secuencia terminadora puede estar presente, como puede ser una secuencia de poliadenilación. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano, o un gen de resistencia a la neomicina para un vector de mamífero. Los vectores pueden ser usados in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o pueden ser usados para transfectar o transformar una célula hospedera.
La secuencia de ADN codificante para el polipéptido es preferiblemente introducida dentro de un hospedero apropiado como parte de una construcción de expresión en la cual la secuencia de ADN está operablemente unida a señales de expresión las cuales son capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las células hospederas. Para la transformación del hospedero apropiado con la construcción de expresión están disponibles procedimientos de transformación los cuales son bien conocidos por una persona experta. La construcción de expresión puede ser usada para la transformación del hospedero como parte de un vector que lleva un marcador seleccionable, o la construcción de expresión es co-transformada como una molécula separada junto con el vector que lleva un marcador seleccionable. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables.
Los marcadores seleccionables preferidos incluyen pero no están limitados a aquellos que complementan un defecto en la célula hospedera o confieren resistencia a un fármaco. Ellos incluyen por ejemplo genes marcadores versátiles que pueden ser usados para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras tales como los genes o ADNcs de acetamidasa (los genes amdS, niaD, facA o ADNcs de A. nidulans, A. oryzae, o A. níger), o genes que proporcionan resistencia a antibióticos tales como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, fleomicina o benomila (benA). Alternativamente, la selección de marcadores específicos puede ser usada, tales como los marcadores auxotróficos los cuales requieren cepas hospederas mutantes correspondientes: por ejemplo URA3 (proveniente de S. cerevisiae o genes análogos provenientes de otras levaduras), pyrG, o pyrA (proveniente de A. nidulans, o A. níger), argB (proveniente de A. nidulans, o A. níger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección es deleccionado de la célula hospedera transformada después de la introducción de la construcción de expresión, de manera que se obtengan células hospederas transformadas capaces de producir el polipéptido, las cuales están libres de genes marcadores de selección.
Otros marcadores incluyen la ATP sintetasa subunidad 9 (oliC), orotidina-5'-fosfato-decarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia a G418 bacteriano (útil en levaduras, pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a la ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a la neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, codificante para la glucuronidasa (GUS). Los vectores pueden ser usados in vitro por ejemplo para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula hospedera.
Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, la construcción de expresión es preferiblemente integrada dentro del genoma de la célula hospedera con el objetivo de obtener transformantes estables. Sin embargo, para algunas levaduras sistemas de vectores episomales apropiados también están disponibles dentro de los cuales la construcción de expresión puede ser incorporada para un nivel de expresión alto y estable. Ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos CEN y pKD1, 2 \mum, de Saccharomyces y Kluyveromyces respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus). Cuando las construcciones de expresión son integradas dentro de los genomas de las células hospederas, las construcciones son ya bien sean integradas en loci al azar en el genoma, o en loci objetivos predeterminados, usando recombinación homóloga, en cuyo caso el loci objetivo preferiblemente comprende un gen altamente expresado. Un gen altamente expresado es un gen cuyo ARNm puede constituir hasta al menos 0,01% (p/p) del ARNm celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas, o alternativamente, un gen cuyo producto genético constituir al menos el 0.2% (p/p) de la proteína celular total, o, en caso de un producto genético secretado, puede ser secretado a un nivel de al menos
0.05 g/l.
Una construcción de expresión para una célula hospedera dada, usualmente contendrá los siguientes elementos operablemente unidos unos a otros en un orden consecutivo desde el extremo 5' al extremo 3', relativo a la cadena codificante de la secuencia codificante del polipéptido del primer aspecto:
(1)
una secuencia promotora capaz de dirigir la trascripción de la secuencia de ADN codificante para el polipéptido en la célula hospedera dada,
(2)
preferiblemente, una región 5' no traducida (líder),
(3)
opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula hospedera dada en un medio de cultivo,
(4)
la secuencia de ADN codificante para una forma preferiblemente activa y madura del polipéptido, y preferiblemente también
(5)
una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de terminar la trascripción corriente abajo de la secuencia de ADN codificante para el polipéptido.
Corriente abajo de la secuencia de ADN codificante para el polipéptido, la construcción de expresión preferiblemente contiene una región 3' no traducida que contiene uno o más sitios de terminación de la trascripción, también referida como un terminador. El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede ser por ejemplo nativo de la secuencia de ADN codificante para el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente un terminador de levadura es usado en células hospederas de levadura y un terminador de hongos filamentosos es usado en células hospederas de hongos filamentosos. Más preferiblemente el terminador es endógeno a la célula hospedera en la cual la secuencia de ADN codificante para el polipéptido es expresada.
La expresión del polinucleótido codificante para el polipéptido de la invención puede también ser lograda mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo el promotor, la secuencia señal y las regiones terminadoras, las cuales sirven para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de proteínas de interés a partir del hospedero de expresión elegido y/o facilitar para el control inducible de la expresión del polipéptido de la invención.
Aparte del promotor nativo al gen codificante para el polipéptido de la invención, otros promotores pueden ser usados para dirigir la expresión del polipéptido de la invención. El promotor puede ser seleccionado por su eficiencia en dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el hospedero de expresión deseado.
Promotores/incrementadores y otras señales de regulación de la expresión pueden ser seleccionados para ser compatibles con la célula hospedera para la cual el vector de expresión es diseñado. Por ejemplo, promotores procariotas pueden ser usados, en particular aquellos apropiados para usar en cepas de E. coli. Cuando la expresión de los polipéptidos de la invención es llevada a cabo en células de mamíferos, promotores de mamíferos pueden ser usados. Promotores específicos de tejidos, por ejemplo promotores específicos para celulares de hepatocitos, pueden también ser utilizados. Los promotores virales pueden también ser usados, por ejemplo el terminal largo repetido del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor SV40, el promotor IE de citomegalovirus humano (CMV), los promotores del virus herpes simplex o los promotores de adenovirus.
Los promotores apropiados de levaduras incluyen los promotores ADH y GAL4 de S. cerevisiae y los promotores nmt1 y adh de S. pombe. Los promotores de mamíferos incluyen el promotor de la metalotioneína, el cual puede ser inducido en respuesta a metales pesado tales como el cadmio. Los promotores virales tales como el promotor del anfígeno T grande SV40 o los promotores de adenovirus pueden también ser usados. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en el arte.
Los promotores de mamíferos, tales como los promotores de la \beta-actina, pueden ser usados. Promotores específicos de tejidos, en particular promotores específicos de células endoteliales o neuronales (por ejemplo los promotores DDAHI y DDAHII), son especialmente preferidos. Los promotores virales pueden también ser usados, por ejemplo el terminal largo repetido del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor SV40, el promotor IE de citomegalovirus humano (CMV), los adenovirus, los promotores HSV (tales como los promotores HSV IE), o los promotores HPV, particularmente la región reguladora corriente arriba HPV (URR). Los promotores virales están fácilmente disponibles en el arte.
Una variedad de promotores pueden ser usados que sean capaces de dirigir la transcripción en las células hospederas de la invención. Preferiblemente la secuencia promotora es derivada a partir de un gen altamente expresado según lo definido previamente. Ejemplos de genes altamente expresados preferidos, a partir de los cuales los promotores son preferiblemente derivados, y/o los cuales son comprendidos en los loci objetivos predeterminados preferidos para la integración de construcciones de expresión, incluyen pero no están limitados a genes que codifican enzimas glicolíticas tales como triosa-fosfato isomerasas (TPI), glicerladehído fosfato deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato quinasas (PGK), piruvato quinasas (PYK), alcohol deshidrogenasas (ADH), así como genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, \beta-galactosidasas, alcohol(metanol) oxidasas, factores de elongación y proteínas ribosomales. Ejemplos específicos de genes altamente expresados apropiados incluyen por ejemplo el gen LAC4 proveniente de Kluyveromyces sp., los genes de la metanol oxidasa (AOX y MOX) provenientes de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes de la glucoamilasa (glaA) provenientes de A. níger y A. awamori, el gen de la TAKA amilasa proveniente de A. oryzae, el gen gpdA proveniente de A. nidulans y los genes de la celobiohidrolasa proveniente de T. reesei.
Ejemplos de promotores inducibles y/o constitutivos fuertes los cuales son preferidos para el uso en los hospederos de expresión fúngica, son aquéllos promotores que son obtenibles a partir de los genes fúngicos tales para xilanasa (xlnA), fitasa, ATP sintetasa subunidad 9 (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG a partir del gen glaA) acetamidasa (amdS) y gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (gdp).
Ejemplos de promotores de levadura fuertes los cuales pueden ser usados incluyen aquellos obtenibles a partir de los genes para alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato quinasa y triosafosfato isomerasa.
Ejemplos de promotores bacterianos fuertes los cuales pueden ser usados incluyen los promotores de amilasa y SPo2, así como los promotores a partir de genes de proteasa extracelular.
Promotores apropiados para células de plantas los cuales pueden ser usados incluyen los promotores de napalina sintasa (nos), octopina sintasa (ocs), manopina sintasa (mas), ribulosa subunidad pequeña (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, virus del mosaico de la coliflor (CMV)35S y 19S y de circovirus.
El vector puede incluir adicionalmente secuencias que flanquean el polinucleótido dando lugar al ARN el cual comprende secuencias homólogas a unas de las secuencias genómicas eucarioticas, preferiblemente secuencias genómicas de mamíferos, o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención dentro del genoma de células eucarióticas o virales por recombinación homóloga. En particular, un vector plasmídico que comprende el casete de expresión flanqueado por las secuencias virales, puede ser usado para preparar un vector viral apropiado para transferir el polinucleótido de la invención a una célula de mamífero. Otros ejemplos de vectores virales apropiados incluyen vectores virales de herpes simplex y retroviruses, que incluyen lentiviruses, adenoviruses, viruses adeno- asociados y viruses HPV (tales como HPV-16 o HPV-18). Técnicas de transferencia génica que usan estos virus son conocidas por aquellos expertos en el arte. Los vectores de retrovirus, por ejemplo, pueden ser usados para integrar establemente el polinucleótido que da lugar al ARN antisentido dentro del genoma hospedero. Los vectores de adenovirus defectivos en la replicación, en contraste, permanecen episomales y por lo tanto permiten la expresión transiente.
El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para permitir la producción de ARN antisentido. Este puede ser usado para reducir, si es deseado, los niveles de expresión del polipéptido.
Células hospederas y Expresión
En un aspecto adicional la invención proporciona un proceso para preparar un polipéptido de la invención, el cual comprende cultivar una célula hospedera transformada o transfectada con un vector de expresión como se describe anteriormente, bajo condiciones apropiadas para la expresión por el vector de una secuencia codificante codificante para el polipéptido, y recuperar el polipéptido expresado. Los polipéptidos de la invención pueden ser incorporados en un vector recombinante replicable, tal como un vector de expresión. El vector puede ser usado para replicar el ácido nucleico en una célula hospedera compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método de hacer un polinucleótido de la invención mediante la introducción de un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedera compatible, y creciendo la célula hospedera bajo condiciones que provoquen la replicación del vector. El vector puede ser recuperado a partir de la célula hospedera. Células hospederas apropiadas incluyen bacterias como E. coli, levaduras, líneas celulares de mamíferos, y otras líneas celulares eucariotas, por ejemplo células de insectos tales como las células Sf9 y células fúngicas (por ejemplos de hongos filamentosos).
Preferiblemente el polipéptido es producido como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de ADN que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión, está operablemente unida a la secuencia de ADN que codifica una secuencia señal. En el caso donde el gen codificante para la proteína secretada tiene una secuencia señal en cepa tipo salvaje, preferiblemente la secuencia señal usada será la nativa (homóloga) a la secuencia del ADN codificante para el polipéptido. Alternativamente la secuencia señal es foránea (heteróloga) para la secuencia de ADN codificante para el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferiblemente endógena a la célula hospedera en la cual la secuencia de ADN es expresada. Ejemplos de secuencias señales apropiadas para células hospederas de levaduras son las secuencias señales derivadas de los genes de levadura MFalfa. Similarmente, una secuencia señal apropiada para células hospederas de hongos filamentosos, es por ejemplo una secuencia señal derivada del gen de la amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentoso, por ejemplo el gen glaA de A. níger. Esta secuencia señal puede ser usada en combinación con el promotor de la amiloglucosidasa (también llamada (gluco)amilasa) por sí mismo, así como con otros promotores. Secuencias señales híbridas también puede ser usadas dentro del contexto de la presente invención.
Las secuencias líderes de secreción heteróloga preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de la amiloglucosidasa fúngica (AG) (glaA, ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo provenientes de Aspergillus), elgenMFalfa (de levaduras, por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces o el gen de la alfa amilasa (Bacillus).
Los vectores pueden ser transformados o transfectados dentro de una célula hospedera apropiada como se describe anteriormente, para permitir la expresión del polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula hospedera transformada con un vector de expresión como se describe anteriormente bajo condiciones apropiadas para expresión del polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado.
Un aspecto adicional de la invención así proporciona células hospederas trasformadas o transfectadas con o comprendiendo un polinucleótido o vector de la invención. Preferiblemente el polinucleótido es portado en un vector el cual permite la replicación y expresión del polinucleótido. Las células serán seleccionadas para ser compatibles con dicho vector, y pueden ser por ejemplo procariotas (por ejemplo bacterias), o eucariotas como hongos, levaduras o células de plantas.
La invención comprende procesos para la producción de un polipéptido de la invención por medios de la expresión recombinante de una secuencia de ADN codificante para el polipéptido. Para este propósito la secuencia de ADN de la invención puede ser usada para la amplificación de genes y/o el intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias señales de la secreción, con el objetivo de permitir la producción económica del polipéptido en una célula hospedera apropiada homóloga o heteróloga. Una célula hospedera homóloga es definida aquí como una célula hospedera la cual es de la misma especie o la cual es una variante de la misma especie de la especie a partir de la cual la secuencia de ADN es derivada.
Células hospederas apropiadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como las bacterias, o más preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo los hongos, tales como las levaduras o los hongos filamentosos o las células de plantas. En general, las células de levaduras son preferidas sobre las células de hongos filamentosos, porque estas son más fáciles de manipular. Sin embargo, muchas proteínas son o pobremente secretadas por las levaduras, o en muchos casos no son procesadas apropiadamente (por ejemplo hiperglicosilación en levaduras). En estas instancias, un organismo hospedero de hongos filamentoso debe ser seleccionado.
Bacterias del género Bacillus son muy apropiadas como hospederos heterólogos debido a su capacidad de secretar proteínas en un medio de cultivo. Otras bacterias apropiadas como hospederos son aquellas del género Streptomyces y Pseudomonas. Una célula hospedera preferida de levadura para la expresión de la secuencia de ADN codificante para el polipéptido es una del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, o Schizosaccharomyces. Más preferiblemente, una célula hospedera de levadura es seleccionada a partir del grupo consistente de las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromyces marxianus var. Lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, y Schizosaccharomyces pombe.
Más preferidas para la expresión de la secuencia de ADN codificante para el polipéptido son, sin embargo, las células hospederas de hongos filamentosos. Las células hospederas de hongos filamentosos preferidas son seleccionadas del grupo consistente del género Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, y Talaromyces. Más preferiblemente un hospedero de hongos filamentosos es de las especies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae o Aspergillus nidulans o es de las especies del grupo de Aspergillus níger (según lo definido por Raper y Fennell, The Genus Aspergillus. The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344,1965). Estos incluyen pero no se limitan a Aspergillus níger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae, y Aspergillus ficuum y también otras de las especies de Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris.
Ejemplos de hospederos de expresión preferidos dentro del alcance de la presente invención están los hongos tales como las especies de Aspergillus (en particular aquellos descritos en EP-A-184,438 y EP-A-284,603) y especies de Trichoderma; bacterias tales como especies de Bacillus (en particular aquellos descritos en EP-A-134,048 y EP-A-253,455), especialmente Bacillus subtilis, Bacillus lincheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas especies; y levaduras tales como especies de Kluyveromyces (en particular aquellas descritas en EP-A-096,430 tales como Kluyveromyces lactis y en EP-A-301,670) y especies de Saccharomyces tales como Saccharomyces cerevisiae.
Células hospederas de acuerdo con la invención incluyen células de plantas, y la invención además se extiende a organismos transgénicos, tales como plantas y partes de las mismas, las cuales contienen una o más células de la invención. La planta transgénica (o genéticamente modificada) puede además tener insertada (típicamente estable) dentro de su genoma una secuencia codificante para el polipéptido de la invención. La transformación de células de plantas puede ser realizada usando nuevas técnicas, por ejemplo usando o un plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede también contener secuencias necesarias para infectar una planta, y pueden ser empleados plásmidos derivados de Ti y/o Ri.
La célula hospedera puede sobreexpresar el polipéptido y las técnicas para ingeniería de sobreexpresión son bien conocidas y pueden ser usadas en la presente invención. El hospedero puede tener además dos o más copias del polinucleótido.
Alternativamente, la infección directa de una parte de una planta, tales como una hoja, raíz o tallo pueden ser efectuadas. En esta técnica la planta a ser infectada puede ser puede ser herida, por ejemplo cortando la planta con una cuchilla, puncionando la planta con una aguja, o frotando la planta con un abrasivo. La herida es luego inoculada con Agrobacterium. La planta o parte de la planta pueden luego ser crecidas en un medio de cultivo apropiado y permitiéndosele desarrollarse dentro de una planta madura. La regeneración de células transformadas dentro de plantas genéticamente modificadas puede ser lograda por el uso de técnicas conocidas, por ejemplo seleccionado raíces transformadas usando un antibiótico y mediante el subcultivo de las raíces en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas de plantas y similares.
Cultivo de células hospederas y producción recombinante
La invención también incluye células que están siendo modificadas para expresar la endoproteasa específica para prolina o una variante de la misma. Tales células incluyen líneas celulares eucariotas superiores transientes, o preferiblemente establemente modificadas, tales como células de mamíferos, células de insectos, células eucariotas inferiores, tales como de levaduras y células de hongos filamentosos o células procariotas como células bacterianas.
Es también posible para el polipéptido de la invención ser transientemente expresado en una línea de células o en una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de expresión de baculovirus. Tales sistemas, los cuales son adaptados a expresar las proteínas de acuerdo con la invención, son también incluidos dentro del alcance de la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, la producción de polipéptidos de la invención puede ser efectuada por el cultivo de hospederos de expresión microbianos, los cuales han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la presente invención en un medio de fermentación de nutrientes convencional.
Las células hospederas recombinantes de acuerdo con la invención pueden ser cultivadas utilizando procesos conocidos en el arte. Para cada combinación de un promotor y una célula hospedera, las condiciones de cultivo están disponibles las cuales son propicias para la expresión de la secuencia de ADN codificante para el polipéptido. Después de alcanzar la deseada densidad celular o titración del polipéptido, el cultivo es terminado y el polipéptido es recuperado usando procedimientos conocidos.
El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo glucosa, maltosa, molasas, etc), una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc,) una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levaduras, extracto de malta, peptona, etc) y una fuente de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente un inductor (dependiente de la construcción de expresión usada) puede ser incluido o subsiguientemente ser añadido.
La selección del medio apropiado puede ser basada en la elección del hospedero de expresión y/o basada en los requerimientos regulatorios de las construcciones de expresión. Medios apropiados son bien conocidos para aquellos expertos en el arte. El medio puede, si se desea, contener componentes adicionales que favorezcan la expresión de los hospederos transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.
La fermentación puede ser llevada a cabo durante un período de 0.5 a 30 días. La fermentación puede ser un lote, proceso continuo o lote alimentado, a una temperatura apropiada en el rango de entre 0ºC y 45ºC y, por ejemplo, a un pH desde 2 hasta 10. Las condiciones de fermentación preferidas incluyen una temperatura en el rango de entre 20ºC y 37ºC y/o un pH entre 3 y 9. Las condiciones apropiadas son usualmente seleccionadas basadas en la selección de los hospederos de expresión y la proteína a ser expresada.
Después de la fermentación, si es necesario, las células pueden ser eliminadas del caldo de fermentación por medios de centrifugación o de filtración. Después que la fermentación ha finalizado o después de la eliminación de las células, el polipéptido de la invención puede entonces ser recuperado y si se desea, purificado y aislado por medios convencionales. La endoproteasa específica para prolina de la invención puede ser purificada a partir de micelios de hongos o de caldos de cultivo dentro de los cuales la endoproteasa específica para prolina es liberada por las células fúngicas cultivadas.
En una realización preferida el polipéptido es obtenido a partir de un hongo, más preferiblemente a partir de un Aspergillus, lo más preferiblemente a partir de Aspergillus níger.
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Modificaciones
Los polipéptidos de la invención pueden ser químicamente modificados, por ejemplo, post-traduccionalmente modificados. Por ejemplo, ellos pueden ser glicosilados (una o más veces) o comprender residuos de aminoácidos modificados. Ellos también pueden ser modificados por la adición de residuos de histidina para ayudar a su purificación o por la adición de una secuencia señal para promover la secreción de la célula. Los polipéptidos pueden tener extensiones de los terminales amino- o carboxilo-, tales como un residuo de metionina amino terminal, un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilite la purificación, tales como una cola de poli-histidina, un epitope antigénico o un dominio de unión.
Un polipéptido de la invención puede ser marcado con un marcador revelador. El marcador revelador puede ser cualquier marcador apropiado el cual permita al polipéptido ser detectado. Marcadores apropiados incluyen radioisótopos, por ejemplo ^{125}I, ^{35}S, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y enlazadores tales como la biotina.
El polinucleótido puede ser modificado para incluir aminoácidos que no ocurren naturalmente o para incrementar la estabilidad del polinucleótido. Cuando las proteínas o péptidos son producidos por medios sintéticos, tal aminoácido puede ser introducido durante la producción. Las proteínas o péptidos también pueden ser modificados siguiendo ya sea la producción sintética o recombinante.
Los polipéptidos de la invención también pueden ser producidos usando aminoácidos D. En tales casos los aminoácidos serán enlazados en secuencia inversa en la orientación del C a N. Esto es convencional en el arte para producir tal proteína o péptido.
Un número de modificaciones de cadena lateral son conocidas en el arte y pueden ser hechas a las cadenas laterales de las proteínas o los polipéptidos de la presente invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos por alquilación reductiva, por reacción con un aldehído seguido por la reducción con NaBH_{4}, amidinación con metilacetimidato o acilación con anhídrido acético.
Las secuencias proporcionadas por la presente invención también pueden ser usadas como materiales de partida para la construcción de enzimas de "segunda generación". Proteasas específica para prolina de "segunda generación" son proteasas específica para prolina, alteradas por técnicas de mutagénesis (por ejemplo mutagénesis sitio-dirigida), las cuales tienen propiedades que difieren de aquellas proteasa específica para prolina del tipo salvaje, o proteasas específica para prolinas recombinantes tales como aquellas producidas por la presente invención. Por ejemplo, su temperatura o pH óptimo, actividad específica, afinidad por el sustrato, o termoestabilidad pueden ser alteradas, de manera que sean mejores adaptadas para usar en un proceso particular.
Los aminoácidos esenciales para la actividad de la proteasa específica para prolina de la invención, y por lo tanto preferiblemente sometidos a sustitución, pueden ser identificados de acuerdo a procesos conocidos en el arte, tales como mutagénesis sitio-dirigida o mutagénesis de rastreo de alanina. En la última técnica, mutaciones son introducidas en cada uno de tal residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son testadas para la actividad biológica (por ejemplo para la actividad endoproteasa específica para prolina) para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Sitios de interacción enzima-sustrato pueden también ser determinados por análisis de la estructura cristalina según lo determinado por técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, o marcaje de fotoafinidad.
El uso de células hospederas de levaduras y hongos filamentosos es esperado que facilite tales modificaciones post-traduccionales (por ejemplo procesamiento proteolítico, miristilación, glicosilación, truncación y fosforilación de serina, tirosina o treonina) como puede ser necesario para conferir la actividad biológica óptima sobre los productos de expresión recombinante de la invención.
Preparaciones
Los polipéptidos de la invención pueden estar en una forma aislada. Se entenderá que el polipéptido puede estar mezclado con portadores o diluyentes los cuales no interferirán con el propósito deseado del polipéptido y aún será considerado como aislado. Un polipéptido de la invención puede ser también una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá el polipéptido en una preparación en la cual más del 70%, por ejemplo más del 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de las proteínas en la preparación es un polipéptido de la invención.
Los polipéptidos de la invención pueden ser proporcionados en una forma que ellos están fuera de su ambiente celular natural. Así ellos pueden estar sustancialmente aislados o purificados como lo discutido anteriormente, o en una célula en la cual ellos no ocurren en la naturaleza, por ejemplo en una célula de otras especies fúngicas, animal, planta o bacteria.
Eliminación o reducción de actividad endoproteasa específica para prolina
La presente invención también se refiere a métodos para producir una célula mutante de una célula parental, la cual comprende interrumpir o eliminar la secuencia de ácido nucleico endógena codificante para el polipéptido o una secuencia control de la misma, lo cual resulta en la célula mutante que produzca menos del polipéptido que la célula parental.
La construcción de cepas las cuales han reducido la actividad endoproteasa específica para prolina puede ser convenientemente conseguida por la modificación o in activación de una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de la endoproteasa específica para prolina en la célula. La secuencia de ácido nucleico a ser modificada o inactivada puede ser, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifique el polipéptido o una parte esencial del mismo para exhibir la actividad específica para prolina, o la secuencia de ácido nucleico puede tener una función reguladora requerida para la expresión del polipéptido a partir de la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico. Un ejemplo de tal secuencia control o reguladora puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte la cual es suficiente para afectar la expresión del polipéptido. Otra secuencia control para posible modificación incluye, pero no se limita a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propéptido, una secuencia señal, y una secuencia de terminación.
La modificación o in activación de la secuencia de ácido nucleico puede ser realizada sometiendo a la célula a mutagénesis y seleccionando las células en las cuales la capacidad de producir la endoproteasa específica para prolina ha sido reducida o eliminada. La mutagénesis, la cual puede ser específica o aleatoria, puede ser realizada, por ejemplo, mediante el uso de un agente mutagenizante físico o químico apropiado, mediante el uso de un oligonucleótido apropiado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis por PCR. Es más, la mutagénesis puede ser realizada mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico apropiado para el presente propósito incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etilmetanosulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y nucleótidos análogos.
Cuando tal agente es usado, la mutagénesis es típicamente realizada incubando la célula a ser mutagenizada en la presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones apropiadas, y seleccionado para las células que exhiben reducida o no expresión de la actividad endoproteasa específica para prolina.
La modificación o in activación de la producción de un polipéptido de la presente invención puede ser lograda por introducción, sustitución, o remoción de uno o más nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico codificante para el polipéptido o en un elemento regulatorio requerido para la transcripción o traducción del mismo. Por ejemplo, los nucleótidos pueden ser insertados o removidos de manera que resulte en la introducción de un codón de parada, la eliminación del codón inicial, o un cambio en el marco abierto de lectura. Tal modificación o in activación puede ser lograda por mutagénesis sitio-dirigida o mutagénesis por PCR, según los métodos conocidos en el
arte.
Aunque, en principio, la modificación puede ser realizada in vivo, es decir, directamente en la célula que expresa la secuencia del ácido nucleico a ser modificada, es preferible que la modificación sea realizada in vitro según lo ejemplificado posteriormente.
Un ejemplo de una vía conveniente de inactivar o reducir la producción de endoproteasa específica para prolina por una célula hospedera de elección, es basada en técnicas de reemplazo g o interrupción de genes. Por ejemplo, en el método de interrupción de genes, una secuencia de ácido nucleico que corresponde un gen endógeno o un fragmento de gen de interés es mutagenizada in vitro para producir una secuencia de ácido nucleico defectuosa, la cual es luego transformada dentro de la célula hospedera para producir un gen defectuoso. Por recombinación homóloga, la secuencia de ácido nucleico defectuosa reemplaza el gen endógeno o el fragmento de gen. Preferiblemente el gen defectuoso o fragmento de gen también codifica un marcador el cual puede ser usado para seleccionar los transformantes en los cuales el gen codificante para el polipéptido ha sido modificado o destruido.
Alternativamente, la modificación o in activación de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser logrado por técnicas anti sentido establecidas, usando una secuencia de nucleótido complementaria al polipéptido que codifica la secuencia. Más específicamente, la producción del polipéptido por una célula puede ser reducida o eliminada por introducción de una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico codificante para el polipéptido. El polinucleótido anti sentido luego será típicamente transcripto en la célula y será capaz de hibridar con el ARNm que codifica la endoproteasa específica para prolina. Bajo condiciones que permitan a la secuencia del nucleótido antisentido complementaria que hibride con el ARNm, la cantidad de endoproteasa específica para prolina producida en la célula será reducida o eliminada.
Es preferido que la célula a ser modificada de acuerdo con los métodos de la presente invención sea de origen microbiano, por ejemplo una cepa fúngica la cual es apropiada para la producción de productos proteicos deseados, ya sean homólogos o heterólogos para la célula.
La presente invención además se refiere a una célula mutante de una célula parental la cual comprende una interrupción o eliminación de la secuencia de ácido nucleico endógena codificante para el polipéptido o una secuencia control del mismo, lo cual resulta en la célula mutante que produce menos del polipéptido que la célula parental.
Las células mutantes deficientes en el polipéptido así creadas son particularmente útiles como células hospederas para la expresión de polipéptidos homólogos y/o heterólogos. Por lo tanto, la presente invención además se refiere a métodos para producir un polipéptido homólogo o heterólogo que comprende (a) cultivar la célula mutante bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; (b) recuperar el polipéptido. En el presente contexto, el termino "polipéptido heterólogo" es definido aquí como los polipéptidos los cuales no son nativos para la célula hospedera, una proteína nativa en la cual se han estado haciendo modificaciones para alterar su secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión ha sido cuantitativamente alterada como un resultado de una manipulación de la célula hospedera por técnicas de ADN recombinante.
En aún aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir un producto proteico esencialmente libre de actividad endoproteasa específica para prolina por fermentación de una célula la cual produce ambos, un polipéptido endoproteasa específico para prolina de la presente invención, así como el producto proteico de interés. El método comprende adicionar una cantidad efectiva de un agente capaz de inhibir la actividad endoproteasa específica para prolina al caldo de fermentación ya bien sea durante o después que la fermentación ha sido completada, recobrando el producto de interés del caldo de fermentación, y opcionalmente sometiendo el producto recobrado a purificación posterior. Alternativamente, después del cultivo, el caldo de cultivo resultante puede ser sometido a tratamientos con pH o temperatura para reducir así sustancialmente la actividad endoproteasa específica para prolina, y permitir el recobrado del producto a partir del caldo de cultivo. Los tratamientos combinados de PH o temperatura pueden ser realizados en una preparación de proteínas recobrada a partir del caldo de cultivo.
Los métodos de la presente invención para producir un producto esencialmente libre de endoproteasa específica para prolina son de particular interés en la producción de polipéptidos eucariotas, en particular en la producción de proteínas fúngicas, tales como enzimas. Las células deficientes en endoproteasa específica para prolinas pueden también ser usadas para expresar proteínas heterólogas de interés para la industria alimenticia, o de interés farmacéutico.
Fuentes preferidas para la endoproteasa específica para prolina son obtenidas mediante clonación de un gen microbiano que codifica una endoproteasa específica para prolina dentro de un organismo hospedero microbiano. Fuentes más preferidas de endoproteasa específica para prolina son obtenidas mediante clonación en un gen derivado de Aspergillus codificante para una endoproteasa específica para prolina, en de un hospedero que pertenece al género de Aspergillus capaz de sobreexpresar el gen de endoproteasa específica para prolina.
En la categoría de productos que contienen hidrolizados de proteínas para consumidores objetivo con necesidades no médicas, el nicho en el mercado de emplear hidrolizados de proteínas en productos para atletas se está incrementando rápidamente. En esta categoría de producto, la alergenicidad del producto final no es un tema. En lugar de esto, aspectos tales como el sabor, valor nutricional y la presencia de aminoácidos específicos que apoyan la resistencia y estimulan la recuperación fisiológica después del ejercicio, son parámetros importantes para tal hidrolizado, particularmente cuando es usado en bebidas para deportistas. Por ejemplo, la glutamina ha sido implicada en luchar contra el estrés metabólico, pero solo puede ser suplida en pequeños péptidos, que como aminoácido libre no es estable en solución. Los hidrolizados de proteínas producidos según la invención son muy apropiados para su uso en productos relacionados con atletas debido a su muy alta solubilidad bajo las condiciones de pH prevalentes, por ejemplo en bebidas para deportistas. Una implicación importante de este criterio es que altos niveles de hidrolizados producidos según la invención pueden ser incluidos en productos nutricionales para deportistas sin el inconveniente de la precipitación de proteínas luego de la esterilización y el almacenamiento prolongado. Así, la vida de útil de los productos para deportistas puede ser extendida por la adición de un hidrolizado de proteínas de la invención.
La mezcla enzimática según la invención puede ser usada para hidrolizar materiales proteicos de origen animal, tales como leche entera, leche descremada, caseína, proteínas del suero o mezclas de caseína y proteínas del suero. Tal mezcla de caseína y proteínas del suero pueden ser usadas por ejemplo, en proporciones similares a aquellas encontradas en la leche humana. Además, el colágeno basado en proteínas animales forma un sustrato debido a la posibilidad de degradar estas proteínas a moléculas más pequeñas, de esta manera desamarrando los extractos de carne animal o mejorando la incorporación de residuos de prolina e hidroxiprolina, con beneficio en las articulaciones de los atletas.
La mezcla enzimática según la invención puede también ser usada para hidrolizar materiales proteicos originarios de plantas tales como, por ejemplo, gluten de trigo, cebada malteada o no malteada, u otros cereales usados para hacer cerveza, leche de soya, concentrados o aislados de la misma, concentrados de proteínas de maíz y aislados de los mismos, y proteínas del arroz.
La invención será adicionalmente ilustrada por los siguientes ejemplos no limitados.
Ejemplos Materiales y Métodos
Beta-caseína proveniente de leche bovina (liofilizada, en polvo esencialmente libre de sal) con un mínimo de 90% de beta-caseína fue obtenida a partir de Sigma. El colágeno (tipo 1, insoluble, proveniente de tendón de Aquiles bovino) también fue obtenido a partir de Sigma.
El caseinato de sodio (Miprodan 30®)) fue obtenido a partir de MD foods (Viby, Denmark). Concentrados dulces de suero, no pasteurizados, 10% ds, 35% de proteínas, fue obtenido a partir de Borculo Domo (Zwoile, Países Bajos).
Un hidrolizado de suero de bajo amargor Vitalarmor® 800 LB, así como proteína de suero enriquecida en beta-lactoglobulina (Protarmor® 905) fueron obtenidos a partir de Armor Proteines (Saint-Brice-en-Cogles, Francia). Otros hidrolizados comerciales fueron obtenidos a partir del productor o comprados en farmacias.
El aislado de soya fue obtenida según Soyamin® 90 HV a partir de Lucas Meyer, Hamburg, Alemania.
La subtilisina proveniente de B. lincheniformis (Delvolase®, 560 000 DU por gramo) fue obtenida a partir de DSM Food Specialities (Seclin, Francia). Sumizyme® LP 75.000 fue obtenida a partir de Shin Nohon (Anjyo, Japón). Flavourzyme® 1000L fue obtenida a partir de NOVO Industries, Bagsvaerdm Dinamarca. La termolisina (Termoasa, una metalo endoproteasa termoestable proveniente de Bacillus thermoproteolyticus Rokko, con actividad de 14000 PU/mg) fue producida según Daiwa Kasei, Osaka, Japón.
La endoproteasa específica para prolina de Flavobacterium meningosepticum y clonada en E. coli fue aislada usando construcciones de plásmidos conocidas y métodos de purificación de enzimas (T. Diefenthal y H. Dargatz, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209-212 (1995)). La actividad enzimática fue probada en CBZ-Gli-Pro-pNA 0.26 mM en buffer fosfato 0.1M pH 7.0 a 25ºC. pH 7.0 fue usado en esta prueba porque el pH óptimo de esta enzima es por encima de pH 6.0. El producto fue monitoreado espectrofotométricamente a 410 nm.
Una unidad fue definida como la cantidad de enzima que provoca la liberación de 1 \mumol de p-nitroanilina por minuto bajo estas condiciones.
Endoproteasas específica para prolinas de Aspergillus fueron medidas según el método descrito en la patente japonesa JP5015314, con menores modificaciones. En breve la actividad enzimática fue probada in CBZ-Gli-Pro-pNA a 37 grados C en un buffer citrato/fosfato disódico pH 5. pH 5.0 es escogido porque en esta prueba el pH óptimo de la enzima es por debajo de pH 6. El producto de reacción también fue monitoreado espectrofotométricamente a 410 nm.
Electroforesis bidimensional en gel
Electroforesis bidimensional en gel y secuenciación parcial de aminoácidos de una endopeptidasa específica para prolina de Aspergillus níger.
La endoproteasa proveniente de A. níger G-306 fue producida y aislada según lo resumido en el Ejemplo 4. La purificación completa fue realizada usando electroforesis bidimensional en gel. A ese extremo, el material activo aislado a partir de la columna de Superdex 75 fue primero desalinizado por dilución (aproximadamente 20 veces) en buffer Tris/HCl 10 mM a pH 6.8 y luego concentrado con un miniconcentrador Centricon 30kD (Amicon).
Básicamente la electroforesis bidimensional fue realizada como se describe en "2-D electrophoresis using immobilized pH gradients; Principles and Methods; Amersham Pharmacia Biotech 80-6429-60 Rev A/10-98". La primera dimensión (IEF) fue realizada en un IPGpHor (Amersham-Pharmacia) usando una tira IPG de 11 cm, en un rango de pH 3-6 (BioRad). La muestra desalinizada 3 veces concentrada fue diluida en urea 8M (urea 6M y tiourea 2M). Esta fue mezclada con 18.5 microlitros de buffer de rehidratación concentrado 10X, que contiene urea 6M, tiourea 2M, 20% CHAPS, y 5% buffer IPG en un rango de 3-10. El total fue usado para rehidratar la tira IPG. Se hizo focalización durante 29.320 Vh usando el protocolo según lo descrito en el folleto suministrado por BioRad con las tiras, como una guía.
La segunda dimensión (SDS) fue hecha sobre una Criterion Mini Vertical Cell (BioRad) usando un gel pre moldeado de 12% (Type Prep+2 Comb) comprado a BioRad.
La tira IPG fue primeramente incubada en un buffer de calibración SDS que contiene DTT (1%) y un segundo tiempo en un buffer que contiene yodoacetamida (2.5%). Ambas incubaciones fueron por 15 minutos a 20ºC. El buffer de calibración SDS consistió en Tris/HCl 50 mM pH 8.8, urea 6M, glicerol 30% (v/v) y SDS 2% (p/v) y una traza de azul de bromofenol.
Después de la incubación, la tira IPG fue recortada para fijarla al tipo de gel mencionado, y fue corrida con buffer TGS diluido 10X (BioRad). Después de la corrida, el gel fue teñido con Sypro Ruby (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) por 3 o 4 horas, y lavado con agua Milli Q por 2 horas. La imagen fue revelada sobre The Imager (Appligene). Las manchas mayores fueron cortadas, lavadas muchas veces con bicarbonato de amonio 50 milimoles/litro, incubadas toda la noche a 37 grados C con tripsina grado secuenciación (nr.1047841, Boehringer Mannheim). Los péptidos fueron extraídos de la pieza del gel mediante lavado muchas veces con acetonitrilo/agua que contiene ácido fórmico (50/50/5, v/v/v). Las muestras fueron secadas usando centrifugación al vacío (New Brunswisk Scientific, Países Bajos) y conservadas a -20ºC, hasta el análisis.
Análisis por LC/MS
HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) usando un espectrómetro de masa Qtof-2 (Micromass, Manchester, UK) fue usada para separar los péptidos formados durante la digestión con tripsina. 5 microlitros de la solución de péptidos fueron atrapados en una micro-precolumna, C18, 5*0.3 mm (MCA30-05-C18, LC packings, Ámsterdam, Países Bajos) usando agua Milli Q que contiene 0.1% de ácido fórmico a una velocidad de flujo de 20 microlitros/min. Los péptidos fueron eluídos de la precolumna, usando un gradiente rápido de 0.1% de ácido fórmico en Agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA, Solution A) y 0.1% de ácido fórmico en acetonitrilo (Solución B). El gradiente comenzó al 100% de la Solución A y se incrementó hasta el 60% de la solución B en 20 minutos y fue conservado en la última proporción por otros 5 minutos. La velocidad de flujo usada durante la elución de los péptidos fue 200 nl/min. Usando LC/MS/MS pudo ser determinado el análisis parcial de la secuencia de aminoácidos de la endopeptidasa específica para prolina de A. níger, mediante secuenciación de novo de péptidos apropiados.
La HPLC usando un espectrómetro de masa con trampa de iones (Thermoquest^{TM}, Breda, Países Bajos) acoplado con una bomba P4000 (Thermoquest^{TM}, Breda, Países Bajos) fue usado para caracterizar el hidrolizado de proteínas producido por la mezcla enzimática inventiva. Los péptidos formados fueron separados usando una columna PEPMAP 18 300A (MIC-15-03-C18-PM, LC Packings, Amsterdam, Países Bajos) en combinación con un gradiente de ácido fórmico 0.1% en Agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA, Solution A) y 0.1% de ácido fórmico en acetonitrilo (Solución B) para la elución. El gradiente comenzó al 100% de la Solución A y se incrementó hasta el 70% de la Solución B en 45 minutos y fue conservado en la última proporción por otros 5 minutos. El volumen de inyección usado fue de 50 microlitros, la velocidad de flujo fue de 50 microlitros por minutos y la temperatura de la columna fue mantenida a 30ºC. La concentración de proteína de la muestra inyectada fue aproximadamente 50 microgramos/
mililitros.
La información detallada sobre los péptidos individuales fue obtenida mediante el uso del algoritmo MS/MS "exploración dependiente" el cual es un algoritmo característico para un espectrómetro de masa con trampa de iones.
El análisis de la exploración completa fue seguido por análisis de exploración aumentada, para la determinación del estado de la carga de los iones más intensos en el rango de masa explorada completa. El análisis MS/MS subsiguiente del último ión resultó en la información de la secuencia de péptidos parcial, la cual pudiera ser usada para buscar en una base de datos usando la aplicación SEQUEST de Xcalibur Bioworks (Thermoquest^{TM}, Breda, Países Bajos). Los bancos de datos usados fueron extraídos a partir de OWL.fastadatabank, disponible en el NCBI (Nacional Centre for Biotechnology Informatics), que contiene las proteínas de interés para la aplicación usada. En aquellos experimentos en los cuales fueron medidos sustratos de proteínas bien caracterizados tales como proteínas del suero o caseínas, la precisión de la técnica de análisis fue incrementada por omisión de aquellos espectros MS/MS con una secuencia ajustada de menos del 50%.
Solamente los péptidos con una masa que se encontraba en el rango desde aproximadamente 400 hasta 2000 Daltons fueron considerados apropiados para análisis posteriores por secuenciación MS.
La angiotensina (M=1295.6) fue usada para ajustar la sensibilidad óptima en el modo MS y para la fragmentación óptima en el modo MS/MS, realizando la infusión constante de 60 \mug/ml, resultando principalmente en especies doblemente y triplemente cargadas en el modo MS, y una óptima colisión de energía de alrededor 35% en el modo MS/MS.
Análisis LC/MS de fórmulas infantiles e hidrolizados de proteínas comerciales
Previo a LC/MS el material graso tenía que ser removido a partir de las formulaciones infantiles. Para este fin las muestras de nutrición completas (13.5 g de polvo en 100 ml Milli Q agua) fueron extraídas 3 veces con 30 ml de hexano. Pequeñas cantidades de NaCl fueron añadidas para mejorar la separación de las capas de solventes. Luego 5 ml de la capa de agua fue obtenida y secada en frío. Previo al análisis la muestra fue redisuelta en 25 ml de agua Milli Q, centrifugada dos veces (a 13000 rpm) y filtrada a través de un filtro de 0,22 \mum. A partir de muestras del hidrolizado puro, 400 mg fueron disueltos en 100 ml de agua Milli Q, centrifugados dos veces (a 13000 rpm) y filtrados a través de un filtro de 0,22 \mum. Para caracterizar el péptido presente en el hidrolizado comercial de proteínas, la misma estrategia fue seguida según lo descrito anteriormente para los hidrolizados enzimáticos formados por la mezcla enzimática inventiva es decir, el hidrolizado filtrado fue aplicado a la columna de HPLC y los péptidos individuales con masas moleculares entre 400 y 2000 Daltons fueron además caracterizados por el análisis MS/MS. Sin embargo, el banco de datos usado para obtener la información de la secuencia de los péptidos sobre los hidrolizados derivados de suero o caseína consistieron de secuencia de proteínas de leche de vaca solamente.
Determinación de la fracción molar de péptidos (%) que portan una prolina en el carboxilo terminal
LC/MS/MS pueden ser usadas para el análisis del C-terminal de un péptido. Con un algoritmo en el cual la masa molecular del péptido (analizada con LC/MS) y su secuencia (parcial) de aminoácidos (analizada con LC/MS/MS) está enlazada con procedimientos de búsqueda automática dentro de bancos de datos de proteínas, las mezclas complejas de péptidos pueden ser analizadas. Estas opciones nos han permitido cuantificar la incidencia de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal. Debido al conjunto de limitaciones de la separación de péptidos por PEPMAP de la columna usada, solamente los péptidos con un peso molecular entre aproximadamente 400 y 2000 Daltons son analizados usando esta técnica. Afortunadamente, en hidrolizados de proteínas la mayoría de los péptidos tiene tales pesos moleculares.
Para determinar la fracción molar de péptidos que portan una prolina en el carboxilo terminal, picos de péptidos individuales que eluyen de la columna PEPMAP son seleccionados y las secuencias de aminoácidos parciales de los carboxilos terminales son determinadas usando las técnicas especificadas arriba. El análisis de al menos 20, preferiblemente al menos 30 y más preferiblemente entre 40 a 60, por ejemplo 50 de los más abundantes péptidos escogidos aleatoriamente, de esta manera proporcionan una perspectiva de la frecuencia en la cual los péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxiterminal del péptido ocurren. El cociente del número de péptidos encontrados que portan residuos carboxiterminal de prolina por 100 y el número total de péptidos así analizados, proporciona la fracción molar de los péptidos (%) que portan una prolina carboxiterminal.
Determinación de la fracción molar de prolina en el sustrato de proteína usado para generar el hidrolizado
El material graso como puede aparecer en los productos de fórmulas infantiles fue primeramente removido por extracción con hexano como se detalló en el párrafo que describe los análisis LC/MS de fórmulas infantiles e hidrolizados de proteínas comerciales. La hidrólisis ácida de los sustratos de proteínas para convertir las proteínas presentes en aminoácidos libres, fue lograda haciendo una suspensión de 100 miligramos del material proteico en 2 mililitros de HCL 6N. La hidrólisis ácida fue llevada a cabo por 22 horas a 112 grados C en una atmósfera libre de oxígeno. Después de la centrifugación el sobrenadante fue diluido 10 veces en HCl diluido. Después de esta hidrólisis los aminoácidos fueron derivatizados y analizados según el método de Picotag según lo especificado en el manual para operadores del Amino Acid Analysis System of Waters (Milford MA, USA). El nivel de prolina presente fue cuantificado usando métodos de HPLC. Para determinar la fracción molar de prolina en la muestra, los micromoles de prolina en la muestra por 100 fueron divididos por la suma de los micromoles de todos los aminoácidos presentes en la muestra analizada. Puesto que durante la hidrólisis ácida Trp y Cys son destruidos, estos dos aminoácidos no son incluidos en esta suma de los micromoles de todos los aminoácidos.
Determinación de los niveles de aminoácidos libres en hidrolizados de proteínas o fórmulas infantiles
Una muestra exactamente pesada de material proteico, fue disuelta en ácido diluido y los precipitados fueron removidos por centrifugación en una centrífuga Eppendorf. El análisis de aminoácidos fue llevado a cabo en el sobrenadante claro según el método de Picotag según lo especificado en el manual para operadores del Amino Acid Analysis System of Waters (Milford MA, USA). Para este fin una muestra apropiada fue obtenida a partir del líquido, añadida al ácido diluido y homogenizada. A partir de la última solución, una nueva muestra fue tomada, secada y derivatizada usando fenilisotiocianato. Los varios aminoácidos derivatizados presentes fueron cuantificados usando métodos de HPLC y sumados para calcular el nivel total de aminoácidos libres en la muestra pesada.
Para relacionar este nivel total de aminoácidos libres en la muestra para el nivel total de aminoácidos, la muestra es también sometida a hidrólisis ácida seguida por una cuantificación del total de aminoácidos libres presentes como lo detallado anteriormente.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Mapa del plásmido, del plásmido de expresión pGBFIN11-EPO. Endo-Pro son para la endoproteasa específica para prolina.
Figura 2: Análisis por SDS-PAGE de cultivos filtrados de la cepa hospedera (A. níger CBS513.88) y varios transformantes que sobreexpresan la endoproteasa específica para prolina, aquí indicada con la flecha.
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Ejemplo 1
Hidrolizados de betacaseína usando subtilisina en combinación con una endoproteasa específica para prolina de F. meningosepticum
La beta-caseína representa una de las mayores fracciones de caseína de la leche bovina. La proteína ha sido bien caracterizada en términos de su secuencia de aminoácidos y está comercialmente disponible en una forma casi pura. Como tal, la beta-caseína ofrece un sustrato de prueba excelente para estudiar la relación entre los sitios de escisión o corte de la enzima y la longitud de varios péptidos formados durante la hidrólisis enzimática.
Este ejemplo demuestra que a pesar del carácter de amplio espectro de la subtilisina, la adición de una enzima muy específica, como una endoproteasa específica para prolina, puede tener un mayor impacto en el tamaño de los fragmentos de beta-caseína formados. Rendimientos mejorados para fracciones de caseína luego de la incubación con subtilisina en combinación con una endoproteasa específica para prolina, pueden por lo tanto ser obtenidos. La beta-caseína es relativamente rica en prolina, como reveló la hidrólisis ácida seguida de análisis de aminoácidos llevado a cabo según la sección de Materiales y Métodos, y es que su fracción molar de prolina es 14% (moles de prolina/moles de todos los aminoácidos según lo especificado en la sección de Materiales y Métodos).
Beta-caseína en polvo (Sigma) fue disuelta a una concentración de 10% (p/p) junto con Delvolase^{TM} 0.1% en un buffer fosfato 0.1 mol/litro pH 7. Después una incubación de 24 horas a 45ºC agitando en un baño de agua, la reacción fue detenida calentando la solución por 15 minutos a 90ºC. A una mitad de la solución (1 ml conteniendo 100 miligramos de beta-caseína) fueron añadidos a 100 microlitros de endoproteasa específica para prolina de F. meningosepticum (correspondientes a 4 unidades, según el procedimiento descrito en World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp 209-212) y la reacción fue continuada por otras 24 horas a 45ºC. Después de otro golpe de calor a 90ºC, ambas muestras del material de beta-caseína tratado con Delvolase^{TM} y Delvolase^{TM} más endoproteasa específica para prolina, fueron analizadas por equipos LC/MS como se especificó en la sección Materiales y Métodos.
En la muestra digerida con Delvolase^{TM} solamente, el análisis LC/MS/MS identificó 40 péptidos cubriendo varias partes de la molécula de beta-caseína. Estos péptidos juntos contaron para el 79% del total de la secuencia de beta-caseína. Diferentes tiempos de retención de los péptidos en la columna C18 pudieron ser rastreados para los péptidos de longitudes en el rango de 2 a 23 residuos de aminoácidos. La glutamina demostró ser la que más frecuentemente se encontró en el residuo carboxilo terminal (10 de 40 péptidos). Ninguno de los péptidos analizados pudo mostrar que tuviera prolina como residuo carboxilo terminal.
En contraste, la muestra digerida con Delvolase^{TM} y endoproteasa específica para prolina generó 28 péptidos identificables a partir de beta-caseína. Juntos estos péptidos cubrieron el 63% del total de la secuencia de proteínas de la beta-caseína. La distribución del tamaño de los péptidos fue extraordinariamente homogénea, ya que los péptidos se encontraron en un rango de longitud entre 3 y 9 residuos solamente. Dentro de esta población de péptidos, la glutamina fue el residuo carboxilo terminal en 3 péptidos solamente y la prolina demostró ser la más abundante en los residuos carboxilo terminal (en 17 de 28 péptidos analizados). Los resultados muestran que en un hidrolizado hecho con endoproteasa específica para prolina, estos péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal representan una fracción molar del 61% del total de los péptidos presentes, en el rango de peso molecular entre 400 y 2000 Daltons. Así, la incubación de beta-caseína con endopeptidasa específica para prolina resulta en la generación de péptidos con prolina como el residuo carboxilo terminal. Más aún, la combinación de subtilisina más una endoproteasa específica para prolina resulta en una distribución extraordinariamente homogénea de los varios péptidos generados, sugiriendo altos rendimientos del productos luego de la ultrafiltración de tal hidrolizado.
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Ejemplo 2
Hidrolizados de beta-caseína y amargor
Aunque el ejemplo 1 ilustra el efecto de una endoproteasa específica para prolina en el tamaño de los péptidos y la proporción de péptidos con prolina como el residuo de aminoácido carboxilo Terminal, el efecto de esta enzima en el amargor no fue medido en el Ejemplo 1. Los hidrolizados de caseína son extraordinariamente amargos, y esta propiedad ha sido vinculada a su relativamente alto contenido de residuos de aminoácidos hidrofóbicos.
Para probar el efecto de una endoproteasa específica para prolina en el sabor de beta-caseína hidrolizada por una subtilisina, incubaciones enzimáticas usando Delvolase^{TM} y Delvolase^{TM} con endoproteasa específica para prolina, fueron desarrolladas según lo descrito en el Ejemplo 1. Siguiendo la in activación por calor de la subtilisina y la endoproteasa específica para prolina, ambas muestras fueron enfriadas a temperatura ambiente y agua destilada fue añadida para dar una concentración final de caseína de 4% (p/p). El sabor de las últimas soluciones luego fue evaluado por el panel de experimentados catadores. Los catadores fueron unánimes en su conclusión de que el hidrolizado obtenido por la combinación de subtilisina más endoproteasa específica para prolina fue significativamente menos amargo que el hidrolizado obtenido usando subtilisina sola.
Así, el tratamiento de hidrolizados de caseína con una endoproteasa específica para prolina reduce sustancialmente la amargor del producto final.
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Ejemplo 3
Aislamiento de una endoproteasa específica para prolina a partir de Aspergillus Níger
Una gran colección de mohos capaces de formar esporas negras fueron permitidos crecer en un medio a pH 6.5 conteniendo 1.0 gramo de K_{2}HPO_{4}, 0.5 gramos de KH_{2}PO_{4}, 0.5 gramos de KCl, 0.5 gramos de MgSO_{4.}7H_{2}O, 0.01 gramo de FeSO_{4}.7H_{2}O, 5 gramos de glucosa, 15 gramos de colágeno (Sigma) y agua destilada añadida para obtener un volumen de 1 litro. El inóculo para tal experimento fue preparado por un método en el cual las esporas de los hongos que crecieron en agar inclinado (5 días de edad) fueron llevadas a 5 mililitros de agua estéril. De la última suspensión, 2% (v/v) fue usado para la inoculación del medio a pH 6.5. El crecimiento fue permitido por 100 horas a 28 grados C con agitación después de la cual el cultivo fue filtrado y las muestras del filtrado claro fueron incubadas con el péptido sintético Z-Ala-Pro-pNA (Bachem; Bubendorf; Switzerland) a pH 5.0, 50 grados C. Muestras capaces de liberar pNA fueron identificadas mediante mediciones del incremento de la absorbancia a 410 nanómetros. Cepas positivas que rinden actividades relativamente altas fueron investigadas.
La cepa G-306 excretó una endoproteasa específica para prolina y fue identificada cono Aspergillus níger Van Tieghem var. níger. Esta cepa particular fue usada para aislamiento, purificación y posterior caracterización de una endoproteasa específica para prolina. Para purificar la enzima, 1 litro del sobrenadante del cultivo fue aplicado a una columna de 400 mililitros de bacitracina-silocromo equilibrada con 0.05 mol/litro de acetato de sodio pH 5.0. Las proteasas unidas a la columna fueron eluídas usando buffer acetato complementado con 1 mol/litro de NaCl y 10% (v/v) de isopropanol (J. Appl. Biochem., 1983 pp420-428). Las fracciones activas fueron coleccionadas y dializadas contra agua destilada y aplicadas en 200 mililitros de una columna de bacitracina-Sefarosa, de nuevo equilibrada con buffer acetato. Como anteriormente, la elusión fue llevada a cabo usando buffer acetato complementado con NaCl e isopropanol. Las fracciones activas fueron colectadas, dializadas contra 5 milimol/litro de buffer acetato pH 5.0 y luego concentradas por medios de ultracentrifugación con una membrana Amicon PM-10. Para obtener endoproteasa específica para prolina casi completamente pura, el concentrado líquido fue cromatografiado con una columna Superdex^{TM} 75 equilibrada con el buffer de acetato de sodio 0.05 mol/litro pH 5.0 y complementado con NaCl 0.5
mol/litro.
Experimentos adicionales llevados a cabo con la enzima purificada, indicaron un peso molecular de alrededor de 66.6 kDalton, un IEP alrededor de pH 4.2, un pH óptimo alrededor 5.0 y casi un 100% de termoestabilidad en incubación por 4 horas a 50 grados C.
Para obtener secuencias parciales de aminoácidos de la enzima, la preparación enzimática aislada fue primero sometida a electroforesis en gel bidimencional según los procedimientos descritos en la sección Material y Métodos. La mancha más grande fue cortada, incubada con tripsina y eluída. Los péptidos recobrados fueron luego sometidos a análisis por LC/MS/MS como se describió en la sección Materiales y Métodos, para determinar la secuencia parcial de aminoácidos.
Las siguientes secuencias de aminoácidos pudieron ser derivadas a partir de la endoproteasa específica para prolina de A. níger:
NH2- ATTGEAYFE-COOH
NH2-ATVNSWTGGWDFTR-COOH
NH2-DGAPEGTST-COOH
NH2-EREAGAAVTP-COOH.
Estas secuencias de aminoácidos fueron usadas para sintetizar las secuencias de ADN necesarias para el aislamiento del gen que codifica la endoproteasa específica para prolina de A. níger.
En últimos experimentos (ver experimento 10) la secuencia NH2-ATTGEAYFE-COOH pudo mostrar representar el amino terminal de la endoproteasa específica para prolina madura.
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Ejemplo 4
Endoproteasa específica para prolina y sus efectos en la hidrólisis de proteína de soya
La patente japonesa JP501314 describe una preparación obtenida de Aspergillus oryzae FS1-32 que exhibe mayores cantidades de actividad endoproteolítica no específica y una cantidad menor de endoproteasa específica para prolina y una actividad carboxipeptidasa. La incubación de la proteína de frijol de soya con esta preparación enzimática cruda, es reivindicada para rendir un hidrolizado que es significativamente menos amargo que un hidrolizado de frijol de soya que puede ser obtenido con otra preparación de proteasas, en la cual faltan una endoproteasa específica para prolina en combinación con una carboxipeptidasa. Es sugerido en JP501314 que la actividad de la endoproteasa específica para prolina expone residuos de prolina que son subsiguientemente removidos por la carboxipeptidasa. La eliminación de estos residuos de prolina hidrofóbicos en el carboxilo terminal por la carboxipeptidasa se pensaba que era esencial para obtener hidrolizados menos amargos.
Para probar esta afirmación, uno de los ejemplos proporcionados en JP5015314 fue repetido y el hidrolizado de soya resultante fue analizado usando la tecnología LC/MS descrita anteriormente, evaluando un efecto sobre el sabor.
De acuerdo con JP5015314, sus incubaciones con Aspergillus oryzae FS 1-32 contenía por gramo de sustancia las siguientes actividades enzimáticas.
Proteasa: en el orden de 650 PU; carboxipeptidasa: en el orden de 0.01 unidad y endopeptidasa específica para prolina: en el orden de 0.03 mili-unidades.
Debido a que la preparación original de Aspergillus oryzae FS 1-32 no estaba disponible, dos preparaciones enzimáticas comerciales, también derivadas de Aspergillus oryzae fueron usadas en el presente Ejemplo. Además una endoproteasa específica para prolina purificada cromatográficamente aislada a partir de Aspergillus níger (ver Ejemplo 3) fue usada para lograr una sobredosis de la endoproteasa específica para prolina ácida.
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Las actividades enzimáticas de las varias preparaciones fueron medidas de acuerdo con los procedimientos proporcionados en JP5015314 y éstos proporcionaron lo siguiente:
- Sumizyme LP 75.000, una preparación enzimática comercial de Aspergillus oryzae conocida por ser rica en actividad endoproteolítica.
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Las actividades enzimáticas fueron evaluadas de acuerdo a los métodos de JP5015314:
Proteasa: 226 PU/gramo de producto; carboxipeptidasa: 21 unidades/gramo de producto; prolil-endopeptidasa: 430 mili-unidades/gramo de producto.
- Flavourzyme 1000L una preparación enzimática comercial de Aspergillus oryzae conocida por ser rica en actividad exoproteolítica.
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Las actividades enzimáticas fueron evaluadas de acuerdo a los métodos de JP5015314:
Proteasa: 332PU/gramo de producto; carboxipeptidasa: 10 unidades/gramo de producto; prolil-endopeptidasa: no detectable.
- Endoproteasa específica para prolina cromatográficamente pura obtenida a partir de Aspergillus níger y aislada como se describe en el Ejemplo 3.
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Las actividades enzimáticas fueron evaluadas de acuerdo a los métodos de JP5015314:
Proteasa: no detectable; carboxipeptidasa: no detectable; prolil-endopeptidasa: 45 mili-unidades/mililitro.
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A partir de estos datos es evidente que aunque Sumizyne y Flavourizyme son bien conocidas por su alta actividad proteolítica, ninguna de ellas puede proporcionar la misma alta proporción de actividad (endo)proteasa a carboxipeptidasa como la citada en JP5015314. Sorpresivamente Sumizyme LP 75.000 fue encontrada que contiene una actividad considerablemente más alta de la endoproteasa específica para prolina que la reportada en JP5015314.
Las varias preparaciones enzimáticas fueron incubadas de acuerdo al protocolo descrito en JP5015314, pero estandarizadas de acuerdo a la actividad carboxipeptidasa deseada (0.01 unidades por gramo de sustrato). El aislado de soya (Soyamin 90 HV) fue usado como sustrato en estas reacciones. Después de la incubación por 5 horas a pH 5 y 50 grados C, las muestras fueron centrifugadas y el sobrenadante fue guardado congelado hasta el análisis por LC/MS.
El análisis por LC/MS fue llevado a cabo como se específica en la sección Materiales y Métodos.
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En este experimento el banco de datos de proteínas consistió en proteínas de soya solamente. Los resultados obtenidos son especificados en la Tabla 1.
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TABLA 1 Proteína de soya tratada con varias enzimas
1
PEP: prolil-endopeptidasa o endoproteasa específica para prolina
Sumizyme LP 75.000 contiene una actividad endoproteolítica específica para prolina la cual es alrededor de 7 veces más alta que la actividad endoproteolítica específica para prolina registrada en la cepa FS 1-32 y rinde una fracción molar de aproximadamente 10% de péptidos de soya que portan una prolina en el carboxilo terminal. Sumizyme LP 75.000 enriquecida con la endoproteasa específica para prolina aislada a partir de Aspergillus níger contiene una actividad endoproteolítica específica para prolina la cual es alrededor de 50 veces más alta que la actividad registrada con la cepa FS 1-32, pero también rinde una fracción molar de aproximadamente 10% de péptidos de soya que portan una prolina en el carboxilo terminal. Estos datos fueron confirmados analizando el número de residuos de prolina los cuales están presentes en los péptidos, pero no en la posición carboxilo terminal. Flavourzyme contiene endoproteasa específica para prolina no detectable, pero rinde entre los péptidos generados y apropiados para análisis con la técnica LC/MS una fracción molar de 6% de péptidos que portan una prolina en el extremo carboxilo terminal. Si es combinada con un contenido de prolina de aproximadamente 5% de este aislado de proteína de soya, estas tres observaciones indican que la presencia y la actividad de la endoproteasa específica para prolina en combinación con la actividad carboxipeptidasa tiene un menor efecto sobre la incidencia molar de los residuos de prolina en el carboxilo terminal solamente. Por lo tanto, es difícil de imaginar que el efecto de desamargar descrito en JP5015314 y atribuido a una actividad endoproteasa específica para prolina de 0.03 miliunidades solamente, puede estar vinculado a la alta incidencia de péptidos que portan prolina como el residuo carboxilo terminal del aminoácido.
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Ejemplo 5
Dosis incrementadas de endoproteasa específica para prolina y sus efectos en la hidrólisis de proteína de soya
En este Ejemplo es demostrado que altos niveles de una endoproteasa específica para prolina son requeridos para generar hidrolizados de soya que contienen una cantidad significativa de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal. El diseño general de estos experimentos fue idéntico al descrito en el Ejemplo 4. De nuevo el aislado de proteína de soya fue incubado con Sumizyme LP 75.000 estandarizado de acuerdo a la actividad deseada carboxipeptidasa de 0.01 unidad por gramos de proteína de soya bajo las condiciones descritas en JP5015314. La incubación tuvo lugar ya sea durante 2.5 ó 5 horas a pH 5 y 50 grados C y fue detenida manteniendo el material por 10 minutos a 100 grados C. Subsiguientemente algo del material incubado por 5 horas fue obtenido y su pH fue incrementado a 7.0. A partir de este material fueron obtenidas 3 muestras a las cuales fueron añadidas diferentes porciones de la endoproteasa específica para prolina de F. meningosepticum producida por E. coli. A la primera muestra fueron añadidas 1.5 miliunidades de endoproteasa específica para prolina (de acuerdo con JP5015314 pero medida a pH 7.0 y 30 grados C para satisfacer el pH y la temperatura óptimos de la endoproteasa específica para prolina derivada de E. coli), a la segunda muestra fueron añadidas 150 miliunidades y a la tercera fueron añadidas 15 000 miliunidades, y luego las muestras fueron de nuevo incubadas por 2 horas a 40 grados C. Después de la incubación las muestras fueron centrifugadas y los sobrenadantes fueron conservados congelados hasta el análisis por LC/MS.
El análisis por LC/MS tuvo lugar según lo especificado anteriormente. Los resultados obtenidos son especificados en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Proteína de soya tratada con altas concentraciones de endoproteasa específica para prolina
2
PEP: prolil-endopeptidasa o endoproteasa específica para prolina
Los resultados obtenidos claramente ilustran que un incremento significativo en la incidencia de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal en el hidrolizado, es totalmente dependiente de la adición de la endoproteasa específica para prolina. Sin embargo, solamente actividades las cuales excedieron la actividad mencionada en JP5015314 y la actividad presente en Sumizyme LP 75 000 por varios órdenes de magnitud, son capaces de hacer esto. La implicación de esta observación es que una endoproteasa específica para prolina pura y aislada es esencial para obtener la composición de péptidos deseada en el hidrolizado.
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Ejemplo 6
Incidencia molar de péptidos que portan prolina como residuo carboxilo terminal en hidrolizados comerciales
Según lo descrito anteriormente, LC/MS/MS puede ser usado para el análisis del C-terminal de un péptido. Con un algoritmo en el cual la masa molecular del péptido (analizada con LC/MS) y su secuencia (parcial) de aminoácidos (analizada por LC/MS/MS) están relacionadas con procedimientos de búsqueda automática dentro de banco de datos de proteínas, mezclas complejas de péptidos pueden ser analizadas.
En este Ejemplo estas posibilidades fueron usadas para analizar un número de productos comerciales de fórmulas infantiles así como hidrolizados de proteínas comerciales para la incidencia molar de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo Terminal, los cuales tienen un peso molecular entre 400 y 2000 Daltons.
Los siguientes productos fueron analizados:
1.
Nidal® HA 1(Nestle), que contiene 11.5 g de hidrolizados de proteínas del suero por 100 g de polvo.
2.
Alfare® (Nestle), que contiene 16.5 g proteínas de suero por 100 g de polvo
3.
Nutrilon® Pepti Plus (Nutricia), que contiene 13.5 g de proteínas de suero por 100 g de polvo.
4.
Nutrilon® Pepti Junior (Nutricia), que contiene 16.5 g de hidrolizados de proteína de suero por 100 g de polvo
5.
Aptamil® HA (Milupa), que contiene 12.3 g de proteínas de suero e hidrolizados de caseína por 100 g de polvo
6.
Pregomin® (Milupa), que contiene 13.3 g de soya probablemente e hidrolizados de colágeno por 100 g de polvo
7.
Nutramigen® (Mead Johnson), que contiene 14.0 g de hidrolizados de caseína probablemente por 100 g de polvo
8.
Vitalarmor® 800 LB (Armor Proteines), que contiene 100% de hidrolizados de proteínas del suero
9.
WPH 916 (New Zealand Milk Products), que contiene 100% de hidrolizados de proteínas del suero
10.
WE80 BG (DMV internacional), que contiene 100% de hidrolizados de proteínas del suero
Como las fórmulas infantiles contienen aproximadamente 15% de hidrolizados de proteínas más grasas (25%) y carbohidratos (50%), es indispensable una extracción con hexano de estos productos para remover la fase grasa proporcionada. Los hidrolizados puros podrían ser usados como tales.
Para relacionar la secuencia parcial de proteínas obtenidas con las secuencias de proteínas conocidas, un banco de datos que contiene una secuencia de proteína de leche de vaca solamente fue usado para todas las muestras excepto la muestra de Pregomin. La muestra de Pregomin fue analizada usando un banco de datos que contiene una secuencia específica de soya y colágeno. Por razones analíticas el análisis por LC/MS se focaliza en péptidos con un peso molecular en el rango desde 400 hasta aproximadamente 2000 Daltons, por lo tanto aquellos péptidos fuera de este rango no son tomados en consideración.
En cada muestra entre 32 y 76 péptidos que contienen información de las secuencias de las proteínas hidrolizadas usadas podrían ser identificados. En la mayoría de las muestras más del 95% de los 25 picos más intensos en el cromatograma pueden ser relacionados a la información de secuencias de las proteínas de la leche. En la muestra de Pregomin solamente el 65% de los 25 picos más intensos pueden estar relacionados con la información de secuencias de las proteínas de soya y colágeno. Posibles razones para esto son la incorporación de otras fuentes de proteínas en las proteínas bases o pobres datos de MS/MS a picos pequeños o co-eluyentes.
Para probar la repetibilidad y la reproducibilidad del sistema, la muestra de Nutrilon Pepti Plus fue extraída dos veces y analizada por triplicado (en el principio de las series, en el medio y en el final). Los datos obtenidos de los varios análisis en la distribución de los residuos de aminoácido carboxilo terminal se encontraron ser coincidentes.
La incidencia molar de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal en los varios productos comerciales es proporcionada en la Tabla 3. La incidencia molar de tales péptido es también relacionada con el contenido de prolina en el material crudo proteico usado para preparar el hidrolizado. Por ejemplo la caseína y el colágeno tienen mucho más alto contenido de prolina que proteínas del suero o de la soya. Para tomar en cuenta este aspecto, la fracción molar de prolina entre los aminoácidos presentes en las bases de proteínas usada para tales productos comerciales ha sido también deducida usando hidrólisis ácida seguida de análisis de aminoácidos usando técnicas como las descritas en la sección de Materiales y Métodos. Más aún el material crudo usado difiere en su susceptibilidad a la escisión enzimática, por ejemplo, debido a la presencia de repeticiones específicas de secuencias de aminoácidos.
TABLA 3 Incidencia molar de péptidos que portan prolina en el carboxilo terminal en productos comerciales
3
A partir de los datos presentados en la Tabla 3 está claro que en el popular hidrolizado de suero la incidencia molar de péptidos que portan los residuos de prolina en el carboxilo terminal es bajo. Si también tomamos en cuenta el contenido del suero, concluimos que ninguno de los productos comerciales basados en suero contiene una fracción molar de péptidos que portan residuos de prolina en el carboxilo terminal, la cual es más alta que la fracción molar de prolina presente en las bases de proteínas. Típicamente la fracción molar de péptidos que contiene un prolina en el carboxilo terminal en estos productos comerciales basados en suero es 5% o más baja.
Mirando la incidencia molar de los residuos de prolina en el carboxilo terminal en un producto basado en caseína como Nutramigen, vemos un sustancial aumento del nivel que puede ser encontrado en productos basados en suero aún si el relativamente elevado contenido de prolina de la caseína es tomado en cuenta. Sin embargo, comparando el producto Nutramigen por un lado con el hidrolizado de beta-caseína hecho por incubación con subtilisina y una endoproteasa específica para prolina (ver Ejemplo 1) se muestra la inmensa diferencia composicional que puede ocurrir entre un hidrolizado de caseína existente comercialmente y un hidrolizado de caseína de acuerdo con la invención. Mientras que el producto comercial (es decir Nutramigen) exhibe una incidencia molar de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal del 22%, este número para el hidrolizado de caseína de acuerdo con el Ejemplo 1 es del 61%.
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Ejemplo 7
Incidencia molar de péptidos del suero que portan una prolina en el carboxilo terminal en relación con la concentración de endoproteasa específica para prolina añadida
En este ejemplo una proteína del suero comercial fue incubada bajo varias condiciones con una endoproteasa específica para prolina como la producida por E. coli. En el hidrolizado resultante la incidencia molar de péptidos que portan residuos de prolina en el carboxilo terminal fue determinada.
Una solución de Protamor 905 (Armor Proteines) en agua (10% p/p) fue lentamente calentada a 25ºC hasta 60ºC durante 1 hora en presencia de Devolase al 2.5% (peso enzima/peso sustrato) a pH 8.5. Después de 1 hora, la solución fue rápidamente calentada hasta 80ºC e inmediatamente enfriada a 60ºC, después de lo cual una nueva dosis de Delvolase 2.5% fue añadida. La hidrólisis fue permitida continuar por otra hora; luego calentada a 95ºC por 5 min y enfriada otra vez. Después de ajustado el pH a 7.4, la endoproteasa específica para prolina fue añadida en concentraciones de 0, 87 y 170 unidades/gramo de sustrato (U/g en la Tabla 4; unidades de acuerdo al procedimiento descrito en World Journal of Microbiology & Biotechnology, vol 11 pp209-212) y la hidrólisis fue permitida proceder por otras 3 horas a 45ºC. Al final la solución fue mantenida a 95ºC por 5 minutos para inactivar la enzima y pasteurizar la solución. El hidrolizado según fue obtenido fue luego analizado por LC/MS para determinar la incidencia molar de residuos de prolina en el carboxilo terminal en los péptidos formados según lo descrito previamente. Los resultados obtenidos son presentados en la Tabla 4.
TABLA 4 Dosis de enzima e incidencia molar de péptidos que portan prolina en el carboxilo Terminal
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A partir de esta tabla, parece que a 45ºC la incidencia molar de péptidos que portan una prolina en su C terminal se incrementa con la dosis de la endoproteasa específica para prolina. Usando la dosis más alta de la enzima, hasta el 50% de los péptidos obtenidos a partir de este producto de suero, puede ser mostrado que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal. Cuando la incubación es realizada a 30ºC, la incidencia molar de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal puede alcanzar el 52% con 87 unidades/gramo de sustrato y es fuertemente incrementada con dosis superiores de la enzima. La incidencia superior alcanzada con 87 U/g a 30ºC comparada con la de a 45ºC, pudiera ser explicada por una baja termoestabilidad de la enzima de E. coli. 
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Ejemplo 8
Sabor y composición de hidrolizados de suero producidos con y sin endoproteasa específica para prolina
En este Ejemplo una endoproteasa específica para prolina obtenida de E. coli fue usada en combinación con subtilisina (Delvolase) para producir un hidrolizado de suero de bajo amargor. Usando los datos generados en el Ejemplo 7, la dosis de endoproteasa específica para prolina fue escogida de manera tal que solamente un incremento marginal de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal pudiera ser esperado. El hidrolizado formado con la endoproteasa específica para prolina fue comparado con un hidrolizado similar formado sin una endoproteasa específica para prolina así como con uno hidrolizado de suero bajo de amargor comercial. Todos los tres productos fueron caracterizados en términos de sabor y su contenido de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal.
Una solución de Protarmor 905 (Armor Proteines) en agua (10% p/p) fue lentamente calentada a 25ºC hasta 60ºC durante 1 hora en presencia de Devolase al 2.5% (peso de enzima/peso de sustrato) a pH 8.5. Después de 1 hora la solución fue rápidamente calentada a 80ºC e inmediatamente fue enfriada a 60ºC después de lo cual una nueva dosis de Delvolase al 2.5% fue añadida. La hidrólisis se permitió continuar por otra hora; luego calentada a 95ºC por 5 min y enfriada de nuevo. Después de ajustado el pH a 7.4 la endoproteasa específica para prolina fue añadida en una concentración de 50 unidades/gramo de sustrato. Esta fue permitida continuar por 3 horas a 45ºC. De acuerdo con los datos obtenidos en el Ejemplo 7 estas condiciones condujeron a un incremento marginal solamente en los péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal. Al final la solución fue mantenida a 95ºC por 5 minutos para inactivar la enzima y pasteurizar la solución. Luego la solución fue enfriada. El mismo tratamiento fue aplicado a otra muestra pero sin añadir la endoproteasa específica para prolina.
El análisis sensorial del hidrolizado fue llevado a cabo por el llamado test de series pareadas. Este tipo de prueba es usada por la American Society of Brewers Chemists (ASBC) para comparar el amargor de dos cervezas diferentes. Si aceptamos un 5% de riesgo de error en tal test de un lado, el valor umbral para tener una diferencia estadística es 17 de 24 réplicas. En cada prueba los hidrolizados fueron probados en condiciones de materia seca de 2.5% y porciones de 1 ml de tal solución fueron presentadas en un vial desechable. A cada catador se le pidió tasar el nivel de amargor sin tragar y enjuagarse la boca después con agua. Todas las muestras fueron codificadas y repartidas al azar entre los catadores.
La primera prueba tuvo el objetivo de evaluar el beneficio de la combinación de subtilisina y la endoproteasa específica para prolina contra la subtilisina sola. La segunda prueba tuvo el objetivo de evaluar el amargor de los hidrolizados obtenidos con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica para prolina contra un hidrolizado de bajo en amargor comercial (Vitalarmor 800LB). A ese fin el Vitalarmor 800LB fue diluido en el mismo buffer que el usado para los otros hidrolizados para obtener una concentración comparable de proteínas.
De las 24 personas que participaron en la primera prueba, 17 calificaron las muestras obtenidas con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica para prolina como menos amarga que las muestras obtenidas con subtilisina sola. Este resultado es estadísticamente significativo y confirma la actividad desamargante de la endoproteasa específica para prolina, aún si es aplicada a concentraciones relativamente bajas (cf Ejemplo 7). Es meritorio notar que estas "bajas" concentraciones enzimáticas son en varios órdenes de magnitud mayores que las dosis de enzimas aplicadas en la patente JP5015314 y por lo cual el efecto desamargante fue reivindicado.
En la segunda comparación de muestras pareadas, 19 de los 24 participantes calificaron las muestras tratadas con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica para prolina como de menor sabor amargo que el producto comercial Vitalarmor 800LB. La última observación es también significativa estadísticamente e ilustra el valor económico de los hidrolizados y las mezclas de enzimas de la invención.
Los hidrolizados obtenidos con o sin la endoproteasa específica para prolina fueron analizados por LC/MS como se describe anteriormente. En el hidrolizado obtenido con la subtilisina sola, 41 péptidos fueron analizados. Se obtuvo que ninguno de estos péptidos portaba un residuo de prolina en el carboxilo terminal a pesar del hecho de que 18 péptidos fueron mostrados que contenían al menos un residuo de prolina.
En el hidrolizado obtenido con la combinación de subtilisina y la endoproteasa específica para prolina, 31 péptidos fueron analizados y 6 mostraron que portaban un residuo de prolina en el carboxilo terminal. Esta observación, la cual está en línea con lo que podría ser esperado en base a los resultados obtenidos en el Ejemplo 6, muestra que como el resultado de la incubación con la endoproteasa específica para prolina, la incidencia molar de péptidos que portan una prolina en el carboxilo terminal fue incrementado de 0 a 19%. Como análisis sensorial de los últimos productos ha demostrado un reducido amargor estadísticamente significativo, este experimento claramente vincula un ligero incremento en la incidencia molar de los residuos de prolina en el carboxilo terminal, con un amargor reducido.
Aparte de la disminución de los niveles de amargor, esta incubación con un bajo nivel de endoproteasa específica para prolina podría también mostrar el decrecimiento de la longitud de los péptidos del hidrolizado. En el hidrolizado tratado con Delvolase sola, el análisis por LC/MS demostró que los péptidos varían en longitud de 4 a 14 aminoácidos con una longitud promedio de 7.5 aminoácidos. En el hidrolizado tratado con la combinación de Delvolase y la endoproteasa específica para prolina, la longitud de los péptidos podría mostrar variaciones de 4 a 12 aminoácidos con una longitud promedio de 6.1 aminoácidos. Estos péptidos de longitud reducida no solamente mejoran el rendimiento del proceso de producción de hidrolizados, si no que además reducen la alergenicidad total de los hidrolizados y minimiza la precipitación bajo condiciones ácidas.
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Ejemplo 9
Clonación de una proteasa específica para prolina de Aspergillus níger
Oligonucleótidos cebadores delanteros e inversos fueron desarrollados usando las secuencias de péptidos que fueron dilucidadas en el Ejemplo 3. Para reducir la degeneración de los cebadores, bases inosina fueron introducidas en muchas posiciones. Esto incrementa la abundancia de los oligonucleótidos cebadores en el pool de los que son capaces de cebar una reacción de PCR, pero la desventaja es que la especificidad de la reacción decrece.
El ADN genómico de A. níger G306 (depositada como CBS109712 en la colección CBS, en Septiembre 10, 2001) fue aislado usando técnicas estándar y usado como molde en la reacción de PCR con los cebadores de oligonucleótidos indicados en la tabla 5.
TABLA 5 Péptidos y oligonucleótidos cebadores de endo-Pro (I=inosina)
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En este experimento todas las posibles combinaciones de cebadores delanteros e inversos fueron usadas para amplificar el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina de A. níger. Experimentos iniciales fueron realizados bajo condiciones estándar para PCR (desnaturalización a 94ºC, apareamiento o anneling a 55ºC y prolongación a 72ºC). Sorpresivamente estos experimentos no rindieron ningún producto de PCR específico. Puesto que un resultado negativo pudiera también ser debido a impurezas en el ADN molde, realizamos reacciones de control de PCR usando cebadores de PCR para varios diferentes pero conocidos genes de A. níger. En reacciones comparables, estos últimos genes pudieran ser exitosamente amplificados a partir de ADN genómico de A. níger G306, mostrando que la inhabilidad de amplificar un fragmento usando los cebadores endo-Pro no fue debido a impurezas en la preparación del ADN genómico.
Subsiguientemente fue decidido incrementar la astringencia de la reacción de PCR, por disminución de la temperatura de apareamiento a 45ºC. Consecuentemente la especificidad de la PCR fue disminuida y muchas bandas fueron amplificadas, aunque la mayoría de estas bandas fueron también detectadas en reacciones de control de PCR faltando uno de los cebadores. Varios de estos productos de PCR fueron clonados en un vector de clonación general pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y la secuencia de ADN de estos fragmentos fue determinada. Desafortunadamente ninguno de los fragmentos clonados codificó para el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina.
Adicionalmente, muchos otros ajustes al protocolo de PCR fueron hechos tales como el uso de una polimerasa diferente, incrementando la concentración del cebador o del molde, un toque de PCR e introduciendo inicio caliente, pero ninguno de estos protocolos rindió un fragmento específico del gen que codifica la endoproteasa específica para prolina. Para minimizar el riesgo obvio de este desacertado acercamiento, se decidió tratar otro, bien conocido procedimiento de clonación.
3' RACE
Puesto que ninguno de nuestros intentos para amplificar el gen codificante para la endoproteasa específica para prolina a partir del ADN genómico de A. níger G 306 fueron exitosos, decidimos usar un acercamiento diferente en el cual el ARN es usado como el molde para la síntesis de ADNc. El acercamiento de clonación de un gen conocido usando 3'RACE, 5'RACE y la amplificación completa del marco abierto de lectura, ha sido descrito en WO9938956. La ventaja de este procedimiento, comparado con el procedimiento de PCR descrito anteriormente, es que un sitio adicional de cebo es introducido en el extremo 3' del ADNc, de forma tal que solamente un simple oligonucleótido gen especifico más un cebador universal es requerido para amplificar parte de la secuencia codificante, en lugar de dos cebadores degenerados. Adicionalmente, usando ADNc como molde se evaden problemas en la amplificación debido a los intrones. El uso de ADNc como molde en la reacción de amplificación también incrementa la concentración del molde comparado con la amplificación del ADN genómico.
De acuerdo con este acercamiento, A. níger G306 fue crecido en un medio conteniendo colágeno como única fuente de carbono para inducir la expresión del gen que codifica la endoproteasa específica para prolina. La composición del medio está descrita en la sección de Materiales y Métodos.
El micelio joven fue cosechado después de 48 horas de crecimiento a 34ºC, y usados para el aislamiento de ARN total. Con este fin, los micelios fueron cosechados usando filtración a través del manto de filtración Miracloth y lavados con agua helada estéril desmineralizada. El micelio (250 mg) fue congelado inmediatamente en nitrógeno líquido y molido hasta un polvo blanco fino usando un mortero y un majador. El polvo blanco fino fue transferido a un tubo Greiner de 15 ml y el ARN total fue aislado con el método Trizol exactamente como se describe por el proveedor (Life Technologies, Pasley, UK).
La preparación de ARN fue utilizada para sintetizar ADNc a partir del cebador ancla del kit 3'RACE (AP; Life Technologies), extendiendo el ADNc a partir de la cola poli-A del ARNm, después de un tratamiento con RNasa H, el ADNc fue amplificado por PCR con el cebador de amplificación acortado universal (AUAP, Life Technologies) y los cebadores delanteros del gen especifico de la inosina sustituida (No. 1, 3, 5 y 7) descritos anteriormente. Solamente con el cebador No. 1 más AUAP un producto de amplificación específica de aproximadamente 1.4 kb pudo ser amplificado a partir del RNA de A. níger G306. Con los otros cebadores solamente fue obtenida una amplificación no específica a baja astringencia. Este fragmento de ADNc de 1.4 kb fue clonado en pCR2.1 y la sequencia de ADN fue determinada.
5'RACE
A partir de esta secuencia tres cebadores específicos para el gen fueron diseñados para posteriores amplificaciones de la parte 5' del gen. Los tres cebadores 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3', 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTC
TCC-3' y 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3', fueron complementarios e inversos a la secuencia codificante del gen codificante para endoproteasa específica para prolina.
El ARN total a partir de A. níger G 306 fue usado para sintetizar el ADNc con el kit 5'RACE (Life Technology) usando el cebador 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3'. Después del tratamiento con RNasa, ADNc fue purificado usando el cartucho Glasmax (Life Technology). Una cola poli-dC fue añadida al ADNc usando transferasa terminal (TdT; Life Technology). El ADNC fue amplificado en una reacción de PCR usando el cebador ancla acortado (AAP; Life Technology) y con el primer cebador anidado 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3'. Una segunda reacción de amplificación usando el cebador AUAP (Life Technology) y un segundo cebador 5'-GGATTATGATGGTCCAG
CAGC-3' fue requerido para obtener un producto de amplificación específico de aproximadamente 0.25 kb. Este fragmento fue purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y clonado en pCR2.1 y la secuencia de ADN fue determinada. Este mostró que este fragmento contiene la parte 5'del gen codificante para la endoproteasa específica para prolina.
Caracterización del gen
Combinando las secuencias que se superponen del 3'RACE y el 5'RACE resulta en la secuencia codificante completa del gen que codifica la endoproteasa específica para prolina. La SEC-ID 1 muestra la secuencia del marco abierto de lectura de este gen. La secuencia deducida de proteína de 526 aminoácidos es descrita en la ID SEC NO: 2. El péptido ATTGEAYFE pareció ser completamente correcto. El péptido DGAPEGTST es también correcto pero es codificado por el ADN genómico que está interrumpido por un intrón (ver ID SEC NO: 15 y ejemplo 11 para la clonación y secuenciación del ADN de Aspergillus níger). Los dos otros péptidos incorporan errores debido al método LC/MS/MS, el cual ha sido usado para su caracterización (ver Ejemplo 3). A pesar de estas incertidumbres, exitosamente seleccionamos e identificamos la deseada información genética que codifica la endoproteasa específica para prolina de Aspergillus níger por primera vez.
La novedad de la endoproteasa de Aspergillus fue confirmada por búsquedas BLAST para bases de datos bien conocidas tales como SwissProt, PIR, y trEMBL. No pudo ser detectada identidad fuerte de esta proteína con cualquier otra proteína cuando se comparó para secuencias de proteínas de la base de datos.
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Ejemplo 10
Sobreexpresión del gen codificante para la endoproteasa específica para prolina, y aislamiento de la endoproteasa específica para prolina
La marco abierto de lectura completo del gen codificante para endoproteasa específica para prolina fue amplificado por PCR a partir de ADNc de A. níger G306 usando el cebador 5'-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3' y el cebador AUAP (Life Technology). El fragmento obtenido por PCR fue clonado en el vector de clonación pCR2.1(Invitrogen). El plásmido resultante fue digerido con EcoRI y el fragmento que contiene el gen Endo-Pro fue clonado en el sitio EcoRI del vector de expresión pGBFIN-11 (WO9932617). Los clones resultantes fueron chequeados por restricción con Xhol, lo cual rinde un fragmento de aproximadamente 0.65 kb cuando el fragmento es insertado en la orientación correcta. El plásmido resultante es mostrado en la Figura 1 y fue nombrado pGBFIN11-EPO.
A. níger CBS 513.88 fue usado como hospedero para la sobreexpresión del gen que codifica la endoproteasa específica para prolina. Por consiguiente el vector de expresión pGBFIN11-EPO fue linealizado por digestión con NotI, la cual remueve todas las secuencias derivadas de E. coli del vector de expresión. El ADN digerido fue purificado usando fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:23:1) extracción y purificación con etanol. El procedimiento de transformación de A. níger es extensivamente descrito en WO 98/46772. También es descrito como seleccionar transformantes en placas de agar que contienen acetamida, y como seleccionar integrantes multicopias objetivos. Preferiblemente, los transformantes de A. níger que contienen múltiples copias del casete de expresión, son seleccionados para la generación posterior de material de muestra.
Cultivo y aislamiento de proteasa
Una cepa de A. níger que contiene múltiples copias del casete de expresión fue usada para la generación cromatográfica de material de muestra por cultivo de la cepa en un frasco de cultivo para agitación. Un método útil para el cultivo de una cepa de A. níger y la separación del micelio del caldo, es descrito en WO 98/46772. El caldo de cultivo obtenido fue analizado en SDS-PAGE lo cual es representado en la Figura 2. Subsiguientemente, el caldo de cultivo fue usado para la purificación cromatográfica de la proteasa, para remover cualquier actividad contaminante endo y exo proteolítica. Para este fin el caldo de fermentación fue primero centrifugado para remover el volumen de la masa fúngica y el sobrenadante fue luego pasado a través de un número de filtros con tamaño de poros decrecientes para remover todos los fragmentos celulares. Finalmente, el ultrafiltrado obtenido fue diluido 10 veces en 20 milimoles/litro de acetato de sodio a pH 5.1 y aplicado en una columna Q-Sefarosa F. Las proteínas fueron eluídas en un gradiente de NaCl desde 0 hasta 0.4 moles/litro en acetato de sodio 20 milimoles/litro a pH 5.1. Los picos de las fracciones que despliegan actividad hacia la escisión de Z-Gly-Pro-pNa (Bachem, Switzerland) fueron colectados y unidos de acuerdo con el protocolo descrito en World Journal of Microbiology and Biotechnology 11, 209-212 (1995), pero bajo condiciones de ensayo ligeramente modificadas. Tomando en cuenta el pH ácido óptimo de la endoproteasa específica para prolina derivada de A. Níger, el ensayo enzimático fue llevado a cabo a pH 5.0 en un buffer citrato/fosfato a 37ºC. Uniendo las fracciones activas seguido por concentración, rindió finalmente una preparación la cual muestra solamente una simple banda en SDS-PAGE y un pico en HP-SEC. Otros análisis por cromatografía de interacción hidrofóbica confirmaron la pureza de la preparación enzimática obtenida.
Además, la endoproteasa específica para prolina purificada fue usada para la determinación del extremo amino terminal de la proteína madura, por degradación de Edman. El amino terminal de la endoproteasa específica para prolina madura comienza en la posición 42 en la ID SEC NO: 2 e ID SEC NO: 17.
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Ejemplo 11
Pesquizage de especies fúngicas otras que A. Niger para la presencia del gen que codifica la endoproteasa específica para prolina
Sobre la base de la baja homología en la secuencia de nucleótidos entre los genes de F. meningosepticum y A. níger que codifican la endoproteasa específica para prolina, la hibridación cruzada entre estos dos genes pudo ser excluida. Para conseguir una impresión de la conservación de la secuencia de nucleótidos específica de A. níger en más microorganismos relacionados, fueron seleccionadas las siguientes cepas para un experimento de hibridación. Las especies fúngicas de Aspergillus níger CBS 102.12, Aspergillus níger CBS513.88, Aspergillus níger G306, Aspergillus carbonarius ATCC1025, Aspergillus sojae DSM2809, Aspergillus ochraceus ATCC18500, Aspergillus acculeatis CBS101.43, Verticillium psalliotae CBS396.58, Phialophora mustea CBS142.41, Penicillium chrysogenum URCM237, Phoma exigua CBS431.74, Microsporum gallinae CBS221.55, Acremonium strictum ATCC20371, Rhizomucor miehei CBS370.65, Alternaria alternata CBS103.33, Talaromyces emersonii CBS393.64, Cladosporium chlorocephalum CBS213.73, Cladosporium tenuissinum CBS117.79, y Thrichoderma reesii ATCC26921 fueron cultivadas en 100 ml de PDB (Potato Dextrose Broth, Difco) a 30ºC (excepto para la cepa de Talaromyces la cual fue crecida a 50ºC y agitada a 220 rpm.
Cuando los cultivos estuvieron lo suficientemente crecidos, la masa micelial fue recolectada por filtración a través de filtro Miracloth, lavada con buffer KPi 10 mM (pH 7.0) y secada entre papel de filtro. Los micelios fueron molidos bajo nitrógeno líquido con un mortero y un majador, hasta que un polvo blanco fino fue obtenido. Subsiguientemente, el ADN cromosomal fue aislado usando el kit PureGene (Gentra System, Minneapolis USA) de acuerdo con las instrucciones del suministrador.
Saccharomyces cerevisiae ATCC20785 fue usada como control negativo en el experimento y cultivada en YePD a 30ºC y agitada a 220 rpm.
Para preparar un Southern blot, el ADN cromosomal de todas las especies fue digerido con Xhol y los fragmentos de restricción fueron separados por electroforesis en gel de agarosa sobre un gel de agarosa al 0.8% en buffer TAE. Después de la separación, los fragmentos de ADN fueron bloteados a membranas de celulosa (0,2 \mum, Schleicher & Schuell) mediante procedimiento convencional (Sambrook et al. (1982):Molecular cloning; a laboratory manual, ISBN 0-87969-309-6), y el blot fue corrido hacia atrás por 2 horas a 80ºC.
La sonda para hibridación fue sintetizada con PCR o pGBFIN11-EPO como molde usando el cebador 5'-ATGCGT
GCCTTCTCCGCTGTC-3' y el cebador AUAP. Alrededor de 30 nanogramos del fragmento de ADNc fue marcado con ^{32}P-alfa-dATP (Amersham, England) con el RadPrime ADN labelling system (Life Technology) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Seguidamente los dNTP's con marcaje no incorporado fueron removidos por purificación del fragmento cebador sobre una columna de SepHadex G-50 de acuerdo con el procedimiento columna giratoria (Sambrook et al., 1982).
Previo a la adición de la mezcla de hibridación, el cebador purificado fue desnaturalizado por incubación en agua hirviendo por 5 minutos seguido de un enfriamiento rápido en hielo, y usado inmediatamente.
La prehibridación de los blots fue en 50 ml SSC 6x, SDS0.5%, Denhardt 5X, Herring Sperm ADN 0.1 mg/ml (Life Technologies) por 1 hora a 50ºC bajo agitación continua. Después de la adición del cebador a la solución de prehibridacion, la hibridación fue realizada por 16 horas a 50ºC. Los blots fueron lavados dos veces con 200 ml de SSC 6x, SDS 0.1% por 30 minutos a temperatura ambiente, y una vez con 200 ml de SSC 6x, SDS 0.1% por 30 minutos a 50ºC, para remover la hibridación específica del blot. Películas X-Omat AR (Kodak) fueron usadas para visualizar la hibridación.
Los resultados de este experimento son descritos en la Tabla 6. Las cepas de A. níger y A. carbonarius dieron una fuerte hibridación con la sonda. También otras cepas de Aspergillus como A. Sojae, A. Ochraceus, y A. Acculeatis dieron hibridación con la sonda. Aparentemente el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina está bien conservado dentro de gen Aspergillus. Sorpresivamente, también los hongos que están más distantes de Aspergillus, como Phialophora mustea, Rhizomucor miel, Alternaria alternata, Talaromyces emersonii y Trichodema reesii dieron buena hibridación al ADNc de la endoproteasa específica para prolina. Saccharomyces cerevisiae la cual fue incluida como control negativo, así como algunas otras especies no mostraron ninguna hibridación con el ADNc de A. níger (ver Tabla 6). Este resultado muestra que el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina es conservado en muchas especies fúngicas, y una persona experta en el arte podrá entender que los genes de estas especies pueden ser aislados usando la hibridación heteróloga mostrada aquí como método de detección.
Para ilustrar esto, los fragmentos de ADNc de Aspergillus níger G306, usado en este ejemplo, fueron usados como sonda para el pesquizaje de una biblioteca de ADN genómico a partir de Aspergillus níger CBS513.88. Una persona experta en el arte tendrá conocimientos para generar biblioteca de ADN genómico, y pesquisar tal biblioteca de ADN genómico con una sonda ADN marcado. Este procedimiento también ha sido descrito extensivamente en la literatura (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Clones positivos en el pesquizaje fueron purificados y el ADN fue secuenciado. El ADN genómico del Aspergillus níger CBS513.88 codificante para la endoproteasa específica para prolina está representado en la ID SEC NO: 15. Este ejemplo ilustra que es posible aislar el gen codificante para la endoproteasa específica para prolina de otras especies y cepas, utilizando hibridación de ADNc de este gen de Aspergillus níger G306.
La secuencia codificante deducida y la secuencia de aminoácidos de la endoproteasa específica para prolina de CBS513.88 es representado en la ID SEC NO: 16 e ID SEC NO: 17, respectivamente.
TABLA 6 Hibridación heteróloga del gen endo-Pro de A. níger para el ADN cromosomal de varios hongos
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Ejemplo 12
Mezcla enzimática obtenida a partir de Aspergillus oryzae FS 1-32 y sus efectos en la hidrólisis de proteína de soya
La patente japonesa JP5015314 describe una preparación enzimática cruda obtenida a partir de Aspergillus oryzae FS 1-32 que contiene mayores cantidades de una actividad endoproteolítica y menores cantidades de endoprotesa específica para prolina. Esta preparación cruda además contiene una actividad significativa carboxipeptidasa. En la incubación de la proteína del frijol de soya con esta preparación enzimática cruda, un hidrolizado de proteínas de soya es obtenido que es reivindicado por ser significativamente menos amargo que un hidrolizado que fue obtenido con otras preparaciones de proteasas. La explicación dada en JP5015314 para este efecto beneficioso desamargante es que estas otras preparaciones de proteasas carecen de la presencia de una endoproteasa específica para prolina en combinación con una carboxipeptidasa. JP5015314 sugiere que la base para el efecto desamargante es la eliminación de los residuos de prolina que están expuestos por la actividad de la endoproteasa específica para prolina y subsiguientemente removidos por la carboxipeptidasa.
El Ejemplo 4 de la presente solicitud describe los efectos sobre la proteína de soya de una mezcla de enzimas comerciales que se asemeja al perfil de actividad proteolítica de la cepa de A. oryzae FS 1-32. Una de las conclusiones de este trabajo experimental es que la incorporación de una actividad endoproteolítica específica para prolina en niveles como los registrados con la cepa FS 1-32. no conduce a un apreciable incremento en los péptidos de soya que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal. Como esta conclusión tiene importantes implicaciones con relación a los hidrolizados de proteínas no amargos descritos en la presente aplicación, decidimos repetir el experimento, pero usando la mezcla enzimática obtenida a partir de A. oryzae FS1-32 y bajo condiciones descritas en
JP5015314.
Aspergillus oryzae FS 1-32 (según lo obtenido a partir del depósito 12193 del Micr. Ind LAB en Japón) fue plaqueado en una placa de agar con extracto de malta, incubado por 4 días a 35ºC y luego almacenado por un día a 4ºC. Las esporas de estas placas fueron usadas para inocular el medio de inoculación que contiene 20 gramos/kg de dextrosa, 15 gramos/kg de harina de soya desgrasada, 5 gramos/kg de extracto de levadura bajo en sal, 1 gramo/kg de KH_{2}PO_{4} y 0.2 gramos/kg de antiespumante. Después de la disolución en agua desmineralizada, el pH del medio fue ajustado con ácido sulfúrico a 5.5 y luego dividido en porciones de 20 ml en frascos de agitación de 100 ml con deflectores. Los frascos de agitación con el medio fueron esterilizados por 30 minutos a 121ºC e inoculado y después enfriado. Después de dos días en una incubadora de agitación a 32ºC, 1 ml fue usado para inocular 100 ml de otro medio de inoculación. Después de otro día en la incubadora de agitación a 32ºC, este cultivo fue usado para inocular el medio de cultivo. Puesto que JP501314 no proporciona información con respecto al procedimiento de fermentación usado, ha sido usado el protocolo de fermentación y el medio según lo proporcionado en EP 0 522 428.
El medio de cultivo de acuerdo con EP 0 522 428 contiene los siguientes componentes: caseína ácida (Armor Proteines, France) 25.4 gramos/litro, harina de frijol de soya tostada (Cargill, Países Bajos) 8.6 gramos/litro, salvado de trigo (Zonnatura, Países Bajos) 15.0 gramos/litro, almidón de maíz 20.0 gramos/litro, ácido tánico (Omnichem) 16.0 gramos/litro y KH_{2}PO_{4} 26.6 gramos/litro. Debido a que el ácido tánico recomendado (para estimular la formación de la endoproteasa específica para prolina) no fue especificado en EP 0522428, fueron usados dos tipos de ácido tánico, es decir BREWTAN C y TANAL W2, ambos provenientes de Omnichem (Wetteren, Belgium). Finalmente el valor de pH del medio de cultivo fue ajustado con ácido fosfórico (20%) a 4.5 y luego dividido en porciones de 100 ml en frascos de agitación de 500 ml con deflectores. Los frascos fueron esterilizados por 30 minutos a
121ºC.
Después de la inoculación con 1 mililitro del medio de inoculación precrecido, los cultivos fueron incubados de 2 a 4 días a 32ºC, 250 rpm. Para remover la biomasa, los caldos de cultivo fueron filtrados en un filtro de microfibra de cristal Whatman (cat no 1820090), los cuales fueron luego conservados a -20ºC. Parte de este material congelado fue liofilizado y usado para las mediciones de actividad así como incubaciones con proteína de soya.
Las actividades de la prolil endoproteasa específica, carboxipeptidasa y endoproteasa en el material liofilizado fueron medidas exactamente como se describe en JP5015314. Las muestras que habían sido fermentadas por 2 días, mostraron niveles más altos apreciablemente de actividad enzimática que las muestras que habían sido fermentadas por los 4 días recomendados, por lo que fue decidido usar estas muestras de dos días para la incubación final con la proteína de soya. Los datos de actividad enzimática que muestran las más alta actividad prolil endoproteasa son mostrados aquí abajo.
TABLA 7 Actividad enzimática por gramo de material liofilizado 
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7 
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades prolil endoproteasa y carboxipeptidasa medidas en las muestras 1, 3 y 4 son comparables con los números proporcionados en JP5015314. Sin embargo, las actividades endoproteasas medidas en estas muestras resultaron ser alrededor de 200 veces más bajas que las indicadas en JP5015314. En vista de la actividad endoproteolítica reportada en varias preparaciones enzimáticas industriales (ver ejemplo 4), las actividades proteolíticas extremadamente altas obtenidas con A. oryzae FS 1-32 y especificadas en JP5015314, son probablemente poco
realistas.
En un intento por copiar el Ejemplo 2 de JP5015314 tan precisamente como es posible, el siguiente experimento fue llevado a cabo. 10 gramos de proteína de soya Soyamin 90HV (Lucas Meyer, Hamburg, Germany) fueron suspendidos en 100 ml de agua desmineralizada y el pH fue ajustado con NaOH 4N a 8.5. Entonces 0.5 g de Delvolase fueron añadidos (DSM Food Specialities, Seclin, France) (en lugar de Protin AY a partir de Daiwa Kasei, ambas Delvolase y Protin AY son endoproteasas alcalinas derivadas de Bacillus) y la solución de proteínas fue incubada por 2 horas a 60ºC (en JP5015314 el tiempo de incubación y la temperatura con Protin AY no son especificadas). Finalmente la Delvolase fue inactivada por calentamiento de la solución por 10 minutos a 92ºC.
El hidrolizado de proteínas resultante fue luego incubado con las mezclas enzimáticas 1, 3 y 4 de acuerdo con el protocolo descrito en JP5015314 pero estandarizado de acuerdo con la actividad carboxipeptidasa deseada (0.01 unidad por gramo de sustancia). La implicación fue que por gramo de soya aislada 2.0 miligramos de enzima liofilizada de la muestra 1, 2.7 miligramos de la enzima liofilizada de la muestra 3 y 1.3 miligramos de la enzima liofilizada de la muestra 4 tenían que ser añadidos. La actividad resultante de la endoproteasa y prolil endoproteasa son presentadas en la Tabla 8.
Después de la incubación por 5 horas a pH 5 y 50 grados C, las muestras fueron centrifugadas y los sobrenadantes fueron conservados congeladas hasta el análisis por LC/MS.
El análisis fue llevado a cabo como se especificó en la sección Materiales y Métodos. En este experimento los bancos de datos de proteínas consistieron solo de proteínas de soya. Las frecuencias de los residuos de prolina en el carboxilo terminal detectados en los péptidos obtenidos son especificadas debajo.
TABLA 8 Proteína de soya tratada con varias enzimas
8
9
PEP: prolil-endopeptidasa o endoproteasa específica para prolina
A partir de los datos obtenidos es evidente que la incubación de la proteína de soya con la preparación enzimática cruda obtenida a partir de Aspergillus oryzae FS 1-32, no resulta en un incremento significativo de la fracción molar de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal. Por lo tanto el efecto desamargante descrito en JP5015314 no puede ser atribuido a la alta incidencia de tal péptido en el hidrolizado final.
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Ejemplo 13
Un hidrolizado de caseína no amargo obtenido por combinación de termolisina con una endoproteasa específica para prolina de Aspergillus
La endoproteasa específica para prolina de A. níger G306 fue sobreexpresada y cromatográficamente purificada (ver Ejemplo 10) y subsiguientemente usada para producir un hidrolizado de caseína no amargo. Para este fin añadimos a 100 mL de una solución de caseinato de sodio (Miprodan 30) que contiene 60 gramos por litro, 100 mg de termolisina (Termoasa). La incubación a pH 6.7 y 85 grados C resultó en una inmediata floculación y precipitación de de proteína caseinácea. La incubación por dos horas resultó finalmente en una solución clarificada todavía conteniendo algunos precipitados. Luego el pH de la solución fue ajustado a pH 5.0 y la Termoasa fue inactivada por calentamiento por 45 minutos a 95 grados C. Después del enfriamiento la solución fue probada y observada ser muy amarga. En esta etapa el DH (grado de hidrólisis; estabilizado usando el método TNBS) de la solución de caseinato fue aproximadamente del 35%. El análisis de 64 péptidos por LC/MS/MS usando un banco de datos para caseinatos bovinos indicó una incidencia molar de péptidos que portan un residuo de prolina en el carboxilo terminal del 14%.
Luego 3 unidades de la endoproteasa específica para prolina de A. níger cromatográficamente purificada, fueron añadidas a 25 mL del hidrolizado. Después de la incubación por 20 horas a 50 grados C, otro ciclo de inactivación de la enzima fue llevado a cabo por calentamiento de la solución por 30 minutos a 90ºC. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, la solución fue decantada y el sobrenadante claro fue ajustado a un valor de pH de 4.0; el hidrolizado de caseinato fue encontrado que permaneció completamente disuelto y claro. La degustación demostró la ausencia de cualquier amargor o sabor desagradable. El DH de este hidrolizado final usando el método TNBS fue aproximadamente del 50%; el análisis por LC/MS/MS de los 64 péptidos mostró que la incidencia molar de los péptidos que portan el residuo de prolina en el carboxilo terminal fue incrementado hasta el 45%. Este 45% es casi 4 veces más alto que la fracción molar de prolina que se encuentra en el sustrato Miprodan.
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(Tabla pasa a página siguiente)
10
11 
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<110> DSM NV
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<120> Prolil endoproteasa a partir de Aspergillus níger 
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<130> 20644WO
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 1851
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger G306
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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12
13 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 526
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger G306
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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14
15
16 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Thr Thr Gly Glu Ala Tyr Phe Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base_modificada
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<222> (1)..(26)
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<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 3, 6, 9, 12 y 18
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaacaacag gagargcata yttyga 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 9, 15, 9, 18 y 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcraartaag cytcaccagt agtagc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Phe Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
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<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 6, 9 y 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggacaggag gatgggaytt yac 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 12, 15 y 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtraartccc aaccaccagt cca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 6, 9, 12 y 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gayggagcac cagarggaac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 6, 9 y 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtaccytcag gagcaccrtc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger G306
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Glu Ala Gly Ala Ala Val Thr Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 6, 9, 12, 15, 18 y 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gargcaggag cagcagtaac acc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(23)
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<223> /base_mod="inosina" en las posiciones 6, 9 y 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagtaacag cagcaccagc ytc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 3290
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger G306
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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17
18
19 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 1581
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger 513.88
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 16
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20
21 
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<210> 17
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<211> 526
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger 513.88
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
22
23
24 
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25

Claims (6)

1. Una preparación la cual comprende para más del 20% por peso de las proteínas en la preparación, de un polipéptido aislado el cual tiene actividad endoproteasa específica para prolina y el cual tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos del 1 al 526 de la ID SEC NO: 2.
2. La preparación de la reivindicación 1 donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, y más preferiblemente al menos alrededor del 97% de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos del 1 al 526 de la ID SEC NO: 2.
3. La preparación de la reivindicación 1 donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2.
4. La preparación de la reivindicación 1 donde el polipéptido es obtenido a partir de un hongo, preferiblemente un Aspergillus, más preferiblemente a partir de Aspergillus níger.
5. La preparación de la reivindicación 1 la cual comprende más del 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% ó 99% por peso de las proteínas del polipéptido el cual tiene actividad endoproteasa específica para prolina.
6. Un método para producir la preparación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende cultivar un hospedero de expresión microbiano el cual ha sido transformado con un polinucleótido el cual codifica un polipéptido que tiene una actividad endoproteasa específica para prolina y el cual tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos del 1 al 526 de la ID SEC NO: 2, para producir un sobrenadante y/o células que comprenden el polipéptido y recuperan el polipéptido.
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