ES2368700T3 - Agente inmunoterapéutico para cd37 y combinación con un agente quimioterapéutico bifuncional del mismo. - Google Patents

Agente inmunoterapéutico para cd37 y combinación con un agente quimioterapéutico bifuncional del mismo. Download PDF

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Abstract

Una molécula de unión específica a CD37, que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO. 253.

Description

Agente Inmunoterapéutico para CD37 y Combinación con un Agente Quimioterapéutico Bifuncional del Mismo
ANTECEDENTES
Campo Técnico
La presente descripción proporciona generalmente composiciones y su uso en métodos para tratar trastornos de las células B y, más específicamente, una molécula inmunofarmacéutica modular pequeña (SMIP) anti-CD37 humanizada, así como terapias combinadas sinérgicas de moléculas de unión específica a CD37 con agente quimioterapéuticos bifuncionales para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades auto-inmunitarias, inflamatorias, o hiperproliferativas relacionadas con las células B.
Descripción de la Técnica Relacionada
El sistema inmunitario humano protege generalmente el organismo de sustancias foráneas invasoras y patógenos. Un componente del sistema inmunitario son los linfocitos B, también referidos como células B, que producen anticuerpos que protegen el organismo uniéndose a, y en algunos casos mediando la destrucción de, una sustancia foránea o patógeno. En algunos casos, no obstante, las funciones del sistema inmunitario pueden fracasar y producir enfermedades. Por ejemplo, existen numerosos cánceres, enfermedades autoinmunitarias, y enfermedades inflamatorias que implican proliferación no controlada de células B.
Las células B pueden ser identificadas por las moléculas de su superficie celular, tales como CD37. CD37 es una proteína de 40-52 kDa altamente glicosilada que pertenece a la familia de los antígenos de la superficie celular transmembrana de la tetraspanina, que es altamente expresada sobre células B productoras de anticuerpos normales pero no sobre pre-células B o células plasmáticas . Además de las células B normales, casi todas las malignidades con origen en las células B son positivas para la expresión de CD37, incluyendo la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma no Hodgkins (LNH), y la leucemia de las células pilosas (Moore et al., J. Pathol. 152:13 (1987); Merson y Brochier, Immunol. Lett. 19:269 (1988); y Faure et al., Am. J. Dermatopathol. 12:122 (1990)).
Se han desarrollado algunas terapias específicas para CD37. Un anticuerpo monoclonal murino IgG1 específico para CD37, MB-1, se marcó con I131 y se sometió a ensayo en una prueba clínica en el tratamiento del LNH (véase Press et al., J. Clin. Oncol. 7:1027 (1989); Bernstein et al., Cancer Res. (Suppl.) 50:1017 (1990); Press et al., Front. Radiat. Ther. Oncol. 24:204 (1990); Press et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303:91 (1991) y Brown et al., Nucl. Med. Biol.
24:657 (1997)). El anticuerpo MB-1 carece de funciones efectoras Fc, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA), y el anticuerpo MB-1 desnudo no inhibió el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto in vivo (Buchsbaum et al., Cancer Res. 52:6476 (1992)). Además, se administró un producto inmunoconjugado que tenía adriamicina ligada a G28-1, otro anti-CD37 monoclonal murino, a ratones y se demostró que era internalizado con adriamicina siendo liberado intracelularmente (véase, Braslawsky et al., Cancer Immunol. Immunother. 33:367 (1991)). Una proteína de fusión diseñada, denominada producto inmunofarmacéutico modular pequeño (SMIP®), dirigido a CD37 está siendo sometida a ensayo en la actualidad en seres humanos (véase, p. ej., Publicaciones de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos 2003/0133939 y 2007/0059306).
Aunque se ha llevado a cabo una investigación exhaustiva sobre las terapias basadas en anticuerpos, sigue existiendo la necesidad en la técnica de composiciones y métodos alternativos y mejorados para tratar los trastornos y enfermedades asociados con las células B.
La presente invención proporciona una molécula de unión específica a CD37 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 253.
En ciertas realizaciones, la molécula de unión específica a CD37 consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 253.
En ciertas realizaciones, la molécula de unión específica a CD37 consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 253.
En un aspecto relacionado, la presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de unión específica a CD37 humanizada de la presente invención.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula de unión específica a CD37 humanizada de la presente invención.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona una célula anfitriona que comprende el vector descrito más arriba.
La invención también proporciona una composición que comprende una molécula de unión específica a CD37 humanizada de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de los compuestos de la invención en un método para reducir las células B o tratar una enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B, que comprende administra a un sujeto que lo necesite, una cantidad eficaz de una molécula de unión específica a CD37 humanizada proporcionada en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B es un linfoma de células B, una leucemia de células B, un mieloma de células B, una enfermedad caracterizada por la producción de autoanticuerpos, o una enfermedad caracterizada por la estimulación inapropiada de células T asociada con una ruta de células B.
En ciertas realizaciones, la enfermedad caracterizada por la producción de auto-anticuerpos es una miopatía inflamatoria idiopática, artritis reumatoide, miastenia grave, enfermedad de Graves, diabetes melitus de tipo I, esclerosis múltiple, una enfermedad auto-inmunitaria, dermatomiositis, polimiositis, o macroglobinemia de Waldenstrom.
En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B es la leucemia linfocítica crónica (LLC).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra los alineamientos de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera de las secuencias G28.1 y CAS-024 de ratón, junto con una secuencia identidad consenso.
Las Figuras 2A-2D muestran los cromatogramas de la cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) de CAS001, CAS-002, CAS-003, y CAS-024. Los picos de interés (PDI) tienen 98-99% de moléculas SMIP que están siendo purificadas. CAS-024 tiene un pico muy agudo y simétrico (que indica homogeneidad), mientras los picos de CAS-001, CAS-002, y CAS-003 tienen un hombro ligero (donde después de la integración, el hombro representa aproximadamente un 35% de PDI), lo que indica una población heterogénea de moléculas.
La Figura 3 es un gráfico que muestra cómo compiten diferentes proteínas SMIP específicas anti-CD37 con la molécula CAS-006 parental (proteína SMIP anti-CD37 quimérica, mVLmVH) por la unión a CD37 sobre células Ramos, lo que proporciona una indicación de la afinidad de la unión en comparación con la molécula parental. CAS-024 (hVHhVL) tiene sustancialmente la misma afinidad por CD37 que CAS-006, mientras las otras moléculas (CAS-001, CAS-002, y CAS-003, todas hVLhVH) tienen un descenso de afinidad de 2 a 4 veces.
Las Figuras 4A y 4B son gráficos de análisis competitivo por la unión adicionales frente a CAS-006 (marcada como SMIP-016 en estos gráficos). Aquí, las moléculas SMIP híbridas de ratón-humano (CAS-014 mVHhVL y CAS-017 hVLmVH) tienen una afinidad que es superior a CAS-006, mientras CAS-024 muestra la misma afinidad de unión que CAS-006 y CAS-003 (hVLhVH) tiene una afinidad de unión inferior.
Las Figuras 5A-5E muestran la unión competitiva entre varios anticuerpos anti-CD37 diferentes y CAS-006 (una molécula SMIP anti-CD37 quimérica).
Las Figuras 6A y 6B demuestran que CAS-024 era estadísticamente superior a Rituxán® en el tratamiento in vivo de un modelo animal de linfoma folicular como se muestra por medio de (A) la tasa de supervivencia y (B) el porcentaje sin tumores.
La Figura 7 demuestra que CAS-024 actúa sinérgicamente con los agentes quimioterapéuticos fludarabina y
vincristina para eliminar las células del linfoma de células del manto (LCM), células Rec-1.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra el nivel de agotamiento de los linfocitos de sangre periférica en pacientes humanos tratados con una molécula SMIP anti-CD37 de esta descripción.
La Figura 9 muestra el agotamiento de los linfocitos y el transcurso del tratamiento para el paciente BJB. BJB (parte de la Cohorte 7) se trató con 3,0 mg/kg los días 1, 3 y 5 la primera semana seguido de 3 dosis semanales en el primer ciclo, y este mismo tratamiento se administró en un segundo ciclo. El paciente BJB mostró una caída espectacular de linfocitos (en 48 horas), mostró un descenso palpable en los gánglios linfáticos alrededor del día 4, y continuó respondiendo al tratamiento.
La Figura 10 muestra el agotamiento de los linfocitos y el transcurso del tratamiento para el paciente GRP. GRP (parte de la Cohorte 4) se trató con 1,0 mg/kg una vez a la semana durante cuatro semanas como primer ciclo, y después dos meses más tarde se trató de la misma manera en un segundo ciclo. El paciente GRP mostró una caída espectacular de linfocitos (en 2 semanas), mostró un descenso del 36% en el tamaño del gánglio linfático mediante TC, un descenso en el tamaño del bazo, una mejora en el nivel de hemoglobina, y continuó respondiendo al tratamiento.
La Figura 11 muestra un gráfico del índice de combinación (IC) para los efectos inhibidores de CAS-024 y bendamustina frente al crecimiento de células Rec-1.
La Figura 12 muestra los efectos inhibidores del clorambucilo solo y combinado con CAS-024 sobre el crecimiento de células SU-DHL-6.
La Figura 13 muestra un gráfico del índice de combinación para los efectos inhibidores de CAS-024 y clorambucilo sobre el crecimiento de células SU-DHL-6.
La Figura 14A muestra comparaciones del volumen del tumor en ratones que portan tumores como resultado de inyecciones de células DOHH2 y tratados con posterioridad con hulgG (IgG Humana, R&D Systems), CAS-024, bendamustina, y la combinación de CAS-024 y bendamustina. La Figura 14B muestra el volumen del tumor en ratones individuales el día 13 con respecto al día 0.
La Figura 15 muestra los volúmenes tumorales medios a lo largo del tiempo en ratones portadores de tumores como resultado de inyecciones de células DOHH2 y tratados con posterioridad con hulgG, CAS-024, bendamustina, y la combinación de CAS-024 y bendamustina. Los valores son la media ± el error típico de la media para cada día medido. Las curvas para cada grupo terminan después de que uno o más de los ratones del grupo fueran sometidos a eutanasia.
La Figura 16 muestra los porcentajes de supervivencia a lo largo del tiempo de ratones portadores de tumores como resultado de inyecciones de células DOHH2 y tratados con posterioridad con hulgG, CAS-024, bendamustina, y la combinación de CAS-024 y bendamustina.
La Figura 17 muestra la incidencia de ratones libres de tumores a lo largo del tiempo después de los tratamientos con hulgG, CAS-024, bendamustina, y la combinación de CAS-024 y bendamustina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En un aspecto, la presente invención proporciona la molécula de unión específica a CD37 CAS-024 (SEQ ID NO: 253), que es una versión humanizada de CAS-006 (una proteína inmunofarmacéutica modular pequeña (SMIP) que tiene las regiones variables de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal anti-CD37 humano de ratón G28-1). La proteína SMIP CAS-024 inesperadamente es (1) expresada hasta unos niveles máximos de aproximadamente 25 veces superiores a los de las versiones humanizadas de CAS-006 (tales como CAS-002, CAS-003; véanse los Ejemplos 2 y 5), (2) capaz de unirse a CD37 así como a CAS-006 mientras otras versiones humanizadas no (véanse los Ejemplos 4 y 5), y (3) producida en forma de una población homogénea de moléculas en comparación con la naturaleza heterogénea de otras versiones humanizadas (véase el Ejemplo 3). Adicionalmente, la presente descripción proporciona la molécula de unión específica a CD37 CAS-024 (SEQ ID NO: 253) para su uso en los métodos para reducir las células B o tratar enfermedades asociadas con la actividad aberrante de las células B que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de CAS-024 proporcionada en la presente memoria.
Antes de la exposición de esta descripción con mayor detalle, puede resultar útil comprender la misma para proporcionar definiciones de ciertos términos que se van a utilizar en la presente memoria. Las definiciones adicionales se exponen a lo largo de toda esta descripción.
En la presente descripción, se debe entender que cualquier intervalo de concentraciones, intervalo de porcentajes, intervalo de proporciones, o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, sus fracciones (tales como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique de otro modo. Asimismo, se debe entender que cualquiera de los intervalos numéricos citados en la presente memoria referentes a cualquier rasgo físico, tales como subunidades de polímeros, tamaños o grosores, incluyen cualquier número entero dentro del intervalo citado, a menos que se indique de otro modo. Según se utiliza en la presente memoria, "aproximadamente" o "que consiste esencialmente en" representa ± 20% del intervalo, valor, o estructura indicados, a menos que se indique de otro modo. Se debe entender que los términos "un", "uno", y "una" según se utilizan en la presente memoria hacen referencia a "uno o más" de los componentes enumerados. Se debe entender que el uso de la alternativa (p. ej., "o") representa cualquiera, ambos,
o cualquier combinación de las alternativas. Según se utiliza en la presente memoria, los términos "incluye" y "comprende" se utilizan indistintamente. Además, se debe entender que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las diferentes combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en la presente memoria, son descritos por la presente solicitud hasta el mismo punto que si cada compuesto o grupo de compuestos fuera expuesto individualmente. De este modo, la selección de estructuras concretas o sustituyentes concretos está dentro del alcance de la presente descripción.
El término "moléculas de unión específica a CD37" hace referencia a una proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido que se une específicamente a CD37 con una Ka de al menos aproximadamente 106 M-1 (p. ej., al menos aproximadamente 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, o 1013 M-1). El término "dominio de unión específica a CD37" hace referencia a una porción o un dominio de una molécula de unión específica a CD37 responsable de la unión específica a CD37 de la molécula. El propio dominio de unión específica a CD37 (esto es, sin ninguna otra porción de la molécula de unión específica a CD37) se une a CD37 con una Ka de al menos aproximadamente 106 M-1 (p. ej., al menos aproximadamente 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, o 1013 M-1). El propio dominio de unión específico de CD37 puede ser suficiente como molécula de unión específica a CD37. Los dominios de unión específica de CD37 ilustrativos incluyen los fragmentos scFv y Fab específicos de CD37, que pueden ser obtenidos de anticuerpos anti-CD37, tales como el anticuerpo monoclonal G28-1.
"Derivado" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a una versión modificada químicamente o biológicamente de un compuesto que es estructuralmente similar a un compuesto parental y (real o teóricamente) obtenible a partir de ese compuesto parental. Generalmente, un "derivado" difiere de un "análogo" en que un compuesto parental puede ser la sustancia de partida para generar un "derivado", mientras el compuesto parental puede no ser utilizado necesariamente como sustancia de partida para generar un "análogo". Un derivado puede tener propiedades químicas o físicas diferentes de las del compuesto parental. Por ejemplo, un derivado puede ser más hidrófilo o puede ser una secuencia mutada que tenga una reactividad alterada (p. ej., una CDR que tenga un cambio de aminoácidos que altere su afinidad hacia una diana) en comparación con el compuesto o la secuencia parentales.
"Enfermedad o trastorno asociado con células B" hace referencia a una actividad aberrante de las células B o una actividad que se desvía del curso normal, apropiado, o esperado. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con células B puede incluir la proliferación inapropiada de células que tienen ADN u otros componentes celulares dañados o defectuosos. La actividad aberrante de las células B puede incluir la proliferación celular caracterizada por niveles inapropiadamente elevados de división celular, niveles inapropiadamente bajos de apoptosis, o ambos. Tales enfermedades pueden tener, por ejemplo, proliferaciones anómalas locales de células, grupos de células o tejidos individuales o múltiples, ya sean cancerosos o no cancerosos, benignos o malignos. Un trastorno o enfermedad asociado con células B también puede incluir la producción aberrante de anticuerpos, tal como la producción de autoanticuerpos, o la producción en exceso de anticuerpos más deseable cuando se producen a niveles normales. Asimismo se contempla en la presente memoria que la actividad aberrante de las células B se puede producir en ciertas sub-poblaciones de células B y no en otras sub-poblaciones, o puede incluir la estimulación inapropiada de células T, por ejemplo mediante la presentación inapropiada de antígenos a células T o mediante otra ruta de células B.
"Tratamiento" o "tratar" hace referencia a cualquier tratamiento terapéutico o tratamiento profiláctico/preventivo. Un tratamiento terapéutico puede mejorar al menos un síntoma de enfermedad en un individuo que recibe tratamiento o puede retrasar el empeoramiento de una enfermedad progresiva en un individuo, o evitar el comienzo de enfermedades asociadas adicionales.
Una "cantidad (o dosis) terapéuticamente eficaz" o "una cantidad (o dosis) eficaz de una molécula o compuesto de unión específica hace referencia a aquella cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado la mejoría de uno o más síntomas de la enfermedad que está siendo tratada. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, la dosis terapéuticamente eficaz hace referencia a ese ingrediente solo. Cuando se aplican combinados, la dosis terapéuticamente eficaz hace referencia a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que producen el efecto terapéutico, se administren sucesivamente o simultáneamente. La invención contempla específicamente que una o más moléculas de unión específica puedan ser administradas de acuerdo con los métodos de la invención, cada una en una dosis eficaz.
Un individuo que tiene, o se sospecha que tiene, una enfermedad asociada con una actividad aberrante de las células B" es un individuo en el que una enfermedad o un síntoma de un trastorno pueden estar causados por la actividad aberrante de las células B o la proliferación de las células B, pueden estar exacerbados por la actividad aberrante de las células B, o pueden ser aliviados mediante la regulación de la actividad de las células B. Los ejemplos de tales enfermedades son las malignidades de las células B o el cáncer de células B (por ejemplo, linfoma de células B, leucemia de células B o mieloma de células B), una enfermedad caracterizada por la producción de auto-anticuerpos o una enfermedad caracterizada por la estimulación inapropiada de células T causada por la presentación de antígenos inapropiados de las células B a las células T o causado por otras rutas que implican a las células B.
Las definiciones adicionales se proporcionan en la siguiente presentación detallada de la presente descripción.
Moléculas de Unión Específica a CD37 Humanizadas
En un aspecto, la presente descripción proporciona moléculas de unión específica a CD37 humanizadas como se muestra en las reivindicaciones. Estas moléculas pueden estar en cualquier forma que contenga un dominio de unión específica a CD37 humanizado, incluyendo un anticuerpo anti-CD37 humanizado, un fragmento Fab de un anticuerpo anti-CD37 humanizado, un Fv de cadena sencilla (scFv) específico de CD37 humanizado, una proteína SMIP específica de CD37 humanizada, una proteína, una proteína SCORPION específica de CD37 humanizada, y otras proteínas de unión bi-o multi-específicas que comprenden al menos un dominio de unión específico de CD37 humanizado. La descripción detallada de las proteínas SMIP y los métodos para elaborarlas se pueden encontrar, por ejemplo, en las Publicaciones de las Patentes de los Estados Unidos Núms. 2003/0133939, 2003/0118592, y 2005/0136049 y WO 2005017148. Los métodos para elaborar proteínas SCORPION se pueden encontrar, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud PCT Núm. WO 2007/146968. Otras proteínas de fusión multi-funcionales ilustrativas se pueden encontrar, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2006/0051844 y en la Patente de los Estados Unidos Núm. 7.166.707. Ciertas proteínas de unión bi-o multiespecíficas pueden comprender un scFv específico de CD37 y uno o más dominios de unión diferentes que no están derivados de una inmunoglobulina.
La proteína SMIP CAS-024 es inesperadamente (1) expresada hasta unos niveles máximos de aproximadamente 25 veces superiores a los otras versiones humanizadas de CAS-006 (tales como CAS-002, CAS-003; véanse los Ejemplos 2 y 5), (2) capaz de unirse a CD37 así como a CAS-006 mientras otras versiones humanizadas no (véanse los Ejemplos 4 y 5), y (3) producida en forma de una población homogénea de moléculas en comparación con la naturaleza heterogénea de otras versiones humanizadas (véase el Ejemplo 3). En una realización preferida, la presente descripción proporciona la proteína de unión específica a CD37 que comprende o consiste en CAS-024 (SEQ ID NO: 253). En particular, esta molécula de unión específica a CD37 humanizada tiene esencialmente la misma afinidad de unión a CD37 que su molécula quimérica parental (CAS-006, proteína SMIP que tiene las regiones variables de la inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal anti-CD37 humano de ratón G28-1) en contraste con otras moléculas humanizadas, es expresada a niveles elevados en comparación con otras moléculas humanizadas, y/o muestra un alto grado de homogeneidad cuando es purificada, por ejemplo, por medio de cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) en contraste con otras moléculas humanizadas. Además, se ha demostrado que esta molécula de unión específica a CD37 CAS-024 es eficaz en la inhibición del crecimiento tumoral y ocasiona la regresión tumoral a largo plazo.
La descripción también incluye una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica moléculas de unión específica a CD37 humanizadas de la presente invención. En una realización, la descripción incluye vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico y células anfitrionas que comprenden los vectores.
La descripción también incluye los procedimientos de producción de los polipéptidos descritos en la presente memoria, que comprenden cultivar células anfitrionas en condiciones adecuadas para expresar los polipéptidos, y opcionalmente aislar los polipéptidos del cultivo.
Composiciones y Métodos
En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de las composiciones de la invención en un método para reducir las células B o tratar una enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B que comprende administrar a un sujeto que lo necesite (esto es, un individuo que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B) una cantidad eficaz de una molécula de unión específica a CD37 humanizada proporcionada en la presente memoria (p. ej., CAS-024).
Las malignidades de las células B o cánceres de células B incluyen linfomas de células B (tales como las diferentes formas de enfermedad de Hodgkin, el linfoma no Hodgkin (LNH) o los linfomas del sistema nervioso central), las leucemias (tales como la leucemia linfoblástica aguda (LLA), la leucemia linfocítica crónica (LLC), la leucemia de células pilosas y la leucemia mioblástica crónica] y los mielomas (tales como el mieloma múltiple). Los cánceres de células B adicionales incluyen el linfoma linfocítico de células pequeñas, la leucemia prolinfocítica de células B, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma esplénico de la zona marginal, el linfoma de las células plasmáticas, el plasmacitoma solitario de hueso, el plasmacitoma extraóseo, el linfoma de células B de la zona marginal extra-nodal de tejido linfoide asociado a la mucosa (TLAM), el linfoma de células B de la zona marginal nodal, el linfoma folicular, el linfoma de las células del manto, el linfoma de células B grandes difuso, el linfoma de células B grandes del mediastino (tímico), el linfoma de células B grandes intravascular, el linfoma de efusión primaria, el linfoma/leucemia de Burkitt, las proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, la granulomatosis linfomatoide, y el trastorno linfoproliferativo post-transplante.
El linfoma de Burkitt (o "malignidad de células B de Burkitt", o "tumor de Burkitt", o "Linfoma maligno de tipo Burkitt") es un cáncer del sistema linfático (en particular, de los linfocitos B). Se puede dividir en tres variantes clínicas principales: las variantes endémica, esporádica y asociada a la inmunodeficiencia.
Las malignidades de células B no Burkitt incluyen, pero no están limitadas a, leucemia linfocítica crónica de células B (LLC)/linfoma linfocítico de células pequeñas, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma linfoplasmacítico (incluyendo, pero no limitado a, macroglobulinemia de Waldenstrom), linfomas de la zona marginal (incluyendo, pero no limitados a, linfoma esplénico de células B de la zona marginal, linfoma de la zona marginal nodal, y extralinfoma de células B de la zona marginal nodal de tipo tejido linfoide asociado a la mucosa (TLAM)), leucemia de células pilosas, linfoma de las células plasmáticas/plasmacitoma, linfoma folicular, linfoma de las células del manto (LCM), linfoma de células B grandes difuso, linfoma de células B grandes transformante, linfoma de células B grandes del mediastino, el linfoma de células B grandes intravascular, el linfoma de efusión primaria, y el linfoma no Burkitt no Hodgkin (LNH).
Los trastornos caracterizados por la producción de auto-anticuerpos a menudo son considerados enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no están limitadas a: artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, policondritis, artritis psoriásica, psoriasis, dermatitis, polimiositis/dermatomiositis, miositis con cuerpos de inclusión, miositis inflamatoria, necrolisis epidérmica tóxica, esclerodermia sistémica y esclerosis, síndrome de CREST, respuestas asociadas a la enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome de disfunción respiratoria, síndrome de disfunción respiratoria y síndrome de disfunción respiratoria del adulto (SDRA), meningitis, encefalitis, uveítis, colitis, glomerulonefritis, afecciones alérgicas, eczema, asma, afecciones que implican infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, aterosclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adherencia de los leucocitos, lupus eritematoso generalizado (LEG), lupus eritematoso cutáneo sub-agudo, lupus discoide, mielitis por lupus, cerebritis por lupus, diabetes de comienzo juvenil, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, neuromielitis óptica, fiebre reumática, corea de Sydenham, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis de Wegener y enfermedad de Churg-Strauss, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis/angiitis por hipersensibilidad, ANCA y vasculitis reumatoide), anemia aplásica, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica inmunitaria incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), anemia perniciosa, aplasia de glóbulos rojos puros (AGBP), deficiencia en Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoimmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central (SNC), síndrome de lesión multiorgánica, miastenia grave, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana del basamento anti-glomerular, síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, Síndrome Miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjögren, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo de transplantes de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra anfitrión (EICA), pénfigo buloso, pénfigo, poliendocrinopatías autoinmunitarias, espondiloartropatías seronegativas, enfermedad de Reiter, síndrome de la persona rígida, arteritis de células gigantes, nefritis del complejo inmunitario, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM o neuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), púrpura Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del testículo y el ovario incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitaria, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (Tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Graves, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandulares), diabetes de Tipo I, también referida como diabetes melitus insulino-dependiente (DMID) y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmunitaria, pneumonitis intersticial linfoide (VIH), bronquiolitis obliterante (sin transplante) vs NSIP, Síndrome de Guillain-Barre, vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (arteritis de Takayasu), vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa), poliarteritis nodosa (PAN), espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), glomerulonefritis de progreso rápido, cirrosis biliar primaria, sprúe celíaco (enteropatía por gluten), crioglobulinemia, crioglobulinemia asociada a hepatitis, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de la arteria coronaria, fiebre Mediterránea familiar, poliangiitis microscópica, síndrome de Cogan, síndrome de Whiskott-Aldric y tromboangiitis obliterante, enfermedades de tiroides autoinmunitarias (tales como enfermedad de Graves y tiroiditis de Hashimoto), síndrome de Sjögren, y miopatía inflamatoria idiopática (MII), incluyendo dermatomiositis (DM) y polimiositis (PM). Las enfermedades autoinmunitarias anteriores también pueden ser tratadas con moléculas de unión específica a CD37 humanizadas o con una combinación de moléculas de unión específica a CD37 y un agente quimioterapéutico bifuncional.
En un aspecto de la descripción, se administra una molécula de unión específica a CD37 humanizada en una composición farmacéutica. Para administrar una molécula de unión específica a CD37 humanizada a un ser humano
o a animales de ensayo, es preferible formular la molécula de unión en una composición que comprende uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. La expresión "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" hace referencia a entidades moleculares y a composiciones que no producen reacciones alérgicas y otras reacciones adversas cuando se administran utilizando rutas bien conocidas en la técnica, como se describe más abajo. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes anti-bacterianos y anti-fúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción clínicamente útiles y similares. Además, los compuestos pueden formar solvatos con agua o disolventes orgánicos comunes. También se contemplan tales solvatos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción que contienen una molécula de unión específica a CD37 humanizada utilizada en un método de la descripción pueden contener portadores o aditivos farmacéuticamente aceptables dependiendo de la ruta de administración. Los ejemplos de tales portadores o aditivos incluyen agua, un disolvente orgánico farmacéuticamente aceptable, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero carboxivinílico, sal de sodio de carboximetilcelulosa, sal de sodio de ácido poliacrílico, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, sal de sodio de carboximetil-almidón, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma xantana, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, glicerina, propilenglicol, polietilenglicol, Vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina de suero humano (ASH), manitol, sorbitol, lactosa, un tensioactivo farmacéuticamente aceptable y similares. Los aditivos utilizados se seleccionan entre, pero no limitados a, los anteriores o sus combinaciones, según sea apropiado, dependiendo de la forma de dosificación de la presente descripción.
La formulación de la composición farmacéutica variará de acuerdo con la ruta de administración seleccionada (p. ej., solución, emulsión). Una composición apropiada que comprende el anticuerpo que se va a administrar puede ser preparada en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. Para las soluciones o emulsiones, los portadores adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato añadido o aceites fijados. Los vehículos intravenosos pueden incluir diferentes aditivos, conservantes, o reponedores de fluidos, nutrientes o electrolitos.
Una variedad de portadores acuosos, p. ej., agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, solución de glicina al 0,3%, o suspensiones acuosas pueden contener el compuesto activo mezclado con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes suspensores, por ejemplo sal de sodio de carboximetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido de origen natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetil-enoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo phidroxibenzoato de etilo, o n-propilo.
Una molécula de unión específica a CD37, o una composición que comprende la molécula de unión de la invención puede ser liofilizada para su almacenamiento y reconstituida en un portador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con las inmunoglobulinas convencionales. Se puede emplear cualquiera de las técnicas de liofilización y reconstitución adecuadas. Los expertos en la técnica apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad y que los niveles de uso tienen que ser ajustados para compensarlo.
Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el compuesto activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente suspensor y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados se ilustran por medio de los ya mencionados más arriba.
La concentración de molécula de unión específica a CD37 en estas formulaciones puede variar ampliamente, por ejemplo desde menos de aproximadamente 0,5%, normalmente de 1% o al menos aproximadamente 1% hasta 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de los fluidos, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo concreto de administración seleccionado. De este modo, se podría componer una composición farmacéutica típica para la inyección parenteral para que contuviera 1 mL de agua tamponada estéril, y 50 mg de anticuerpo. Se podría componer una composición típica para infusión intravenosa para que contuviera 250 mL de solución de Ringer estéril, y 150 mg de anticuerpo. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente serán conocidos por los expertos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980). La dosis eficaz de moléculas de unión específica a CD37 (incluyendo las moléculas de unión específica a CD37 humanizadas) está dentro del intervalo de 0,01 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa, oleaginosa inyectable estéril, dispersiones o polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La suspensión puede ser formulada de acuerdo con la técnica conocida utilizando los agentes dispersantes y humectantes y los agentes suspensores adecuados que han sido mencionados más arriba. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo en forma de una solución en 1,3-butanodiol. El portador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, se emplean convencionalmente aceites fijados, estériles como disolvente o medio suspensor. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijado blando incluyendo mono
o di-glicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.
En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una fácil jeringabilidad. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, por medio del uso de un revestimiento, tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso detensioactivos. Ésta debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservada de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede proporcionar por medio de diferentes agentes antibacterianos o antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, o similar. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las composiciones útiles para la administración se pueden formular con intensificadores de la fijación o la absorción para incrementar su eficacia. Tales intensificadores incluyen por ejemplo, salicilato, glicocolato/linoleato, glicolato, aprotinina, bacitracina, SDS, caprato y similares. Véase, p. ej., Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285, 1996) y Oliyai y Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544, 1993).
Además, las propiedades de carácter hidrófobo y carácter hidrófilo de las composiciones contempladas para su uso en la descripción están bien equilibradas, aumentando de ese modo su utilidad tanto en usos in vitro como especialmente in vivo, mientras otras composiciones que carecen de dicho equilibrio son sustancialmente de menos utilidad. Específicamente, las composiciones contempladas para su uso en la descripción tienen un grado apropiado de solubilidad en medio acuoso que permite la absorción y la biodisponibilidad en el organismo, a la vez que también tienen un grado de solubilidad en lípidos que permite que los compuestos atraviesen la membrana celular hasta el supuesto sitio de acción. De este modo, las composiciones de anticuerpo contempladas tienen una eficacia máxima cuando pueden ser liberadas en el sitio de actividad del antígeno diana.
La molécula de unión, o las composiciones combinadas pueden ser administradas oralmente, tópicamente, transdérmicamente, parenteralmente, mediante pulverización para su inhalación, vaginalmente, rectalmente, o mediante inyección intracraneana, o cualquiera de sus combinaciones. El término parenteral, según se utiliza en la presente memoria, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intracisternal, o técnicas de infusión. También se contemplan la administración mediante inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar o implantación quirúrgica en un sitio concreto. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser nocivas para el receptor. Se prefieren las inyecciones, especialmente intravenosas.
En una realización, la administración se realiza en el lugar de un cáncer o un tejido afectado que necesita tratamiento mediante inyección directa en el sitio o por medio de un mecanismo de reparto sostenido o de liberación sostenida, que puede liberar la formulación internamente. Por ejemplo, se pueden incluir microesferas o cápsulas biodegradables u otras configuraciones poliméricas biodegradables susceptibles de liberación sostenida de una composición (p. ej., un polipéptido, un anticuerpo, o una pequeña molécula soluble) en las formulaciones de la descripción implantadas cerca del cáncer.
También se pueden liberar composiciones terapéuticas en el paciente en múltiples sitios. Las administraciones múltiples se pueden presentar simultáneamente o se pueden administrar a lo largo de un periodo de tiempo. En ciertos casos resulta beneficioso proporcionar un flujo continuo de la composición terapéutica. Se puede administrar una terapia adicional periódicamente, de manera horaria, diaria, semanal o mensual.
La presente descripción también contempla la administración de la molécula de unión, o las composiciones combinadas conjuntamente con un agente terapéutico adicional. Los agentes terapéuticos adicionales contemplados por la descripción se enumeran en los párrafos de más abajo.
Un agente terapéutico adicional puede ser una molécula asociada con las células B. Otras moléculas asociadas con células B contempladas por la descripción incluyen moléculas de unión que se unen a las moléculas de superficie de las células B que no son CD37. Las moléculas asociadas con las células B, incluyen CD19 (antígeno CD19 de linfocitos B, también referido como antígeno superficial de linfocitos B B4, o Leu-12), CD20, CD21, CD22 (receptor de células B CD22, también referido como Leu-14, molécula de adhesión celular de linfocitos B, o BL-CAM), CD23, CD40 (antígeno de superficie de células B CD40, también referido como miembro 5 de la superfamilia de receptores del Factor de Necrosis Tumoral, receptor CD40L, o Bp50), CD80 (antígeno de activación de linfocitos T CD80, también referido como antígeno de Activación B7-1, B7, B7-1, o BB1), CD86 (antígeno de activación de linfocitos T CD86, también referido como antígeno de Activación B7-2, B70, FUN-1, o BU63), CD37 (también referido como miembro 9 de la superfamilia de receptores del Factor de Necrosis Tumoral), CD152 (también referido como proteína 4 de linfocitos T citotóxicos o CTLA-4), L6 (antígeno L6 asociado a Tumores, también referido como miembro 1 de la superfamilia 4 transmembrana, Marcador de superficie 1 componente de la membrana, o M3S1), CD30 (antígeno de activación de linfocitos CD30, también referido como miembro 8 de la superfamilia de receptores del Factor de Necrosis Tumoral, receptor CD30L, o Ki-1), CD50 (también referido como molécula de adhesión intercelular 3 (ICAM3), o ICAM-R), CD54 (también referido como molécula de adhesión Intercelular 1 (ICAM1), o receptor de rinovirus del grupo principal), B7-H1 (ligando para un receptor inmunoinhibidor expresado por células T, células B, y células mieloides activadas, también referido como PD-L1; véase Dong, et al., "B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion", Nat. Med., 5:1365-1369 (1999), CD134 (también referido como miembro 4 de la superfamilia de receptores del Factor de Necrosis Tumoral, OX40, receptor de OX40L, antígeno ACT35, o receptor 1 de glicoproteína activada transcripcionalmente por TAX), 41 BB (receptor del ligando 4-1BB, antígeno 4-1BB de células T, o antígeno ILA de células T), CD153 (también referido como miembro 8 de la superfamilia de ligandos del Factor de Necrosis Tumoral, ligando CD30, o CD30-L), CD154 (también referido como miembro 5 de la superfamilia de ligandos del Factor de Necrosis Tumoral, proteína de activación relacionada con TNF, TRAP, o antígeno Gp39 de células T), receptores Toll, o similares.
Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos contemplados como agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas (p. ej., mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, y clorambucilo); nitrosoureas (p. ej., carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), y semustina (metil-CCNU)); etileniminas y metil-melaminas (p. ej., trietilenmelamina (TEM), trietilentiofosforamida (tiotepa), y hexametilmelamina (HMM, altretamina)); alquilsulfonatos (p. ej., busulfan); y triazinas (p. ej., dacabazina (DTIC)); antimetabolitos, tales como análogos de ácido fólico (p. ej., metotrexato, trimetrexato, y permetrexato (antifolato multi-dirigido)); análogos de pirimidina (tales como 5-fluorouracilo (5-FU), fluorodesoxiuridina, gemcitabina, citosinarabinósido (AraC, citarabina), 5-azacitidina, y 2,2'-difluorodesoxicitidina); y análogos de purina (p. ej., 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fludarabinafosfato, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA)); Inhibidores de topoisomerasa de tipo I tales como camptotecina (CPT), topotecan, y irinotecan; productos naturales, tales como epipodofilotoxinas (p. ej., etoposido y teniposido); y alcaloides de vinca (p. ej., vinblastina, vincristina, y vinorelbina); antibióticos antitumorales tales como actinomicina D, doxorrubicina, y bleomicina; radiosensibilizadores tales como 5-bromodesoxiuridina, 5-yododesoxiuridina, y bromodesoxicitidina; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino, carboplatino, y oxaliplatino; ureas sustituidas, tales como hidroxiurea; y derivados de metilhidrazina tales como N-metilhidrazina (MIH) y procarbazina.
Los agentes terapéuticos adicionales contemplados para esta descripción para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias son referidos como agentes inmunosupresores, que actúan suprimiendo o enmascarando el sistema inmunitario del individuo que está siendo tratado. Los agentes inmunosupresores incluyen, por ejemplo, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), analgésicos, glucocorticoides, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FAME) para el tratamiento de la artritis, o modificadores de la respuesta biológica. Las composiciones de la descripción de las FAME también son útiles en el tratamiento de muchas otras enfermedades autoinmunitarias aparte de la AR.
Los AINE ilustrativos se seleccionan del grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sodico, inhibidores de Cox-2 tales como Vioxx y Celebrex, y sialilatos. Los analgésicos ilustrativos se seleccionan del grupo que consiste en acetaminofeno, oxicodona, tramadol o hidrocloruro de propoxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos se seleccionan del grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona,
o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ilustrativos incluyen moléculas dirigidas contra los marcadores de la superficie celular (p. ej., CD4, CD5, etc.), inhibidores de citoquinas, tales como los antagonistas de TNF (p. ej. etanercept (Enbrel), adalimumab (Humira) y infliximab (Remicade)), los inhibidores de quimioquinas y los inhibidores de las moléculas de adherencia. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales así como formas recombinantes de las moléculas. Los FAME ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Oro (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.
Se contempla que la composición de la molécula de unión y el agente terapéutico adicional se pueda administrar simultáneamente en la misma formulación. Alternativamente, los agentes se administran en una formulación separada pero a la vez, haciendo referencia concurrentemente a los agentes administrados, por ejemplo, a los minutos, horas o días entre sí.
En otro aspecto, el agente terapéutico adicional se administra antes de la administración de la molécula de unión. Administración previa hace referencia a la administración del agente terapéutico adicional en el intervalo de minutos, horas, o una semana antes del tratamiento con la molécula de unión, el agente quimioterapéutico bifuncional, o la composición combinada. Se contempla adicionalmente que el agente terapéutico adicional se administre con posterioridad a la administración de la composición de la molécula de unión. Se pretende que administración posterior describa la administración más de minutos, horas, o semanas después del tratamiento o la administración de la molécula de unión, el agente quimioterapéutico bifuncional, o la composición combinada.
Adicionalmente se contempla que cuando se administra la molécula de unión combinada con un agente terapéutico adicional, donde el agente terapéutico adicional es una citoquina o un factor de crecimiento, o un agente quimioterapéutico, la administración también puede incluir el uso de un agente radioterapéutico o de terapia de radiación. La terapia de radiación administrada combinada con una composición de anticuerpo se administra como determina el médico a cargo, y a las dosis típicamente administradas a los pacientes que están siendo tratados de cáncer.
Estas composiciones se pueden administrar en una sola dosis o en múltiples dosis. Los estudios de respuesta a la dosis convencionales, primero en modelos animales y después en ensayos clínicos, revelan dosificaciones óptimas para dolencias y poblaciones de pacientes concretas.
La administración de la molécula de unión o la composición combinada disminuye la población de células B al menos 20% después de una sola dosis de tratamiento. En una realización, la población de células B disminuye al menos aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, o aproximadamente 100%. La reducción de células B se define como un descenso en el recuento de células B absoluto por debajo del límite inferior del intervalo normal. La recuperación de células B se define como la restitución del recuento de células B absoluto, por ejemplo, al 70%, 80%, 90% del valor de la línea base del sujeto o el intervalo normal. Adicionalmente, la administración de la molécula de unión, o la composición combinada de esta descripción produce los efectos clínicos deseados en la enfermedad o trastorno que está siendo tratado.
En algunas realizaciones, los pacientes que padecen una enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B que reciben tratamiento de acuerdo con la descripción pueden demostrar una respuesta beneficiosa global al tratamiento, basándose en criterios clínicos bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica y descritos más abajo. Por ejemplo, en pacientes afectados por artritis reumatoide, la administración puede mejorar el estado del paciente en una cantidad clínicamente significativa [p. ej., logra una Detección Preliminar de la Mejoría del Colegio Americano de Reumatología (ACR20)], y/o una mejora de 20% en la articulación sensible e hinchada y una mejora del 20% en las 3/5 medidas de ACR restantes (Felson et al., Arthritis Rheum. 1995, 38:727-35). Las medidas biológicas para la mejora en un paciente con AR después de la administración de moléculas de unión específica a CD37 y específica a CD20 incluyen la medida de los cambios en los niveles de citoquinas, medidos a través de los niveles de proteína o ARN. Las citoquinas de interés incluyen, pero no están limitadas a, TNF-α, IL-1, interferones, Blys, y APRIL. Los cambios de citoquinas pueden estar debidos a la reducción del número de células B o a un descenso de células T activadas. En pacientes con AR, los marcadores relevantes para el recambio óseo (resorción
o erosión ósea) se miden antes y después de la administración de moléculas de unión específica a CD20. Los marcadores relevantes incluyen, pero no están limitados a, fosfatasa alcalina, osteocalcina, fragmentos de la rotura del colágeno, hidroxiprolina, fosfatasa ácida resistente a tartrato, y ligando RANK (RANKL). Otras lecturas relevantes para la mejora de la AR incluyen la medida de los niveles de proteína C reactiva (PCR), la velocidad de sedimentación de eritrocitos (VSE), el factor reumatoide, los anticuerpos PCC (péptido citrulinado cíclico) y la evaluación de los niveles de células B sistémicos y el recuento de linfocitos por medio de citometría de flujo. Los factores específicos también se pueden medir a partir de la sinovial de los pacientes con AR, incluyendo la evaluación de los niveles de células B en la sinovial procedente de biopsia de la sinovial, los niveles de RANKL y otros factores óseos y citoquinas expuestos más arriba.
En un aspecto relacionado, los efectos de la administración combinada sobre otras enfermedades se pueden medir de acuerdo con los patrones conocidos en la técnica. Por ejemplo, se contempla que los pacientes con enfermedad de Crohn tratados de acuerdo con la invención logren una mejora en el índice de Actividad de la Enfermedad de Crohn (CDAI) en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 unidades, donde la remisión es de 150 unidades (Simonis et al, Scand. J Gastroent. 1998, 33:283-8). Una puntuación de 150 o 200 se considera normal, mientras una puntuación de 450 se considera una puntuación de enfermedad grave. Adicionalmente se desea que la administración de las moléculas de unión específica de CD37 y específica a CD20 de como resultado una reducción de los anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos perinucleares (pANCA) y los anticuerpos anti-Saccharomyces cervisiae (ASCA) en individuos afectados por la enfermedad inflamatoria del intestino.
Se contempla adicionalmente que los pacientes con miositis del adulto y juvenil tratados de acuerdo con la descripción pueden lograr una mejora en el conjunto principal de evaluaciones, tales como 3 de 6 del núcleo principal medido mejoradas en aproximadamente 20%, con no más de 2 de las medidas principales peores en aproximadamente 25% (véase Rider et al., Arthritis Rheum. 2004, 50:2281-90).
Adicionalmente se contempla que los pacientes con LEG tratados de acuerdo con la descripción pueden lograr unamejora en la puntuación de Medida de Actividad del Lupus Generalizado (SLAM) o Índice de Actividad de la Enfermedad LEG (SLEDAI) al menos 1 punto (Gladman et al, J Rheumatol 1994, 21:1468-71) (Tan et al., Arthritis Rheum. 1982, 25:1271-7). Una puntuación SLAM >5, o una puntuación SLEDAI >2, son consideradas como una enfermedad clínicamente activa. La respuesta al tratamiento se puede definir como la mejora o la estabilización enlas 2 medidas de actividad de la enfermedad (el Índice de Actividad de la Enfermedad LEG [SLEDAI] y la Medida de Actividad del Lupus Generalizado) y 2 medidas de calidad de vida (evaluación global del paciente y Escala de Intensidad de la Fatiga Krupp) (Petri et al., Arthritis Rheum. 2004, 50:2858-68.) Adicionalmente se contempla que la administración de la molécula de unión a los pacientes con LEG da como resultado la reducción de anticuerpos anti-ADN de doble hebra. Alternativamente, la mejora puede ser calibrada utilizando los Criterios del Grupo de Evaluación del Lupus de las Islas Británicas (BILAG).
Adicionalmente se contempla que los pacientes que padecen esclerosis múltiple tratados de acuerdo con la descripción puedan lograr una mejora en la puntuación clínica en la escala ampliada del Estado Predicho de Discapacidad de Kurtzke (EDSS) (Kurtzke, F., Neurology 1983, 33:1444-52) de al menos 0,5, o un retraso en el empeoramiento de la enfermedad clínica de al menos 1,0 en la escala Kurtzke (Rudick et al., Neurology 1997, 49:358-63).
Adicionalmente se contempla que los pacientes que padecen MII tratados de acuerdo con la descripción pueden lograr una reducción de al menos uno de los cinco criterios expuestos en la evaluación de los Criterios de Evaluación de la Miopatía Inflamatoria Idiopática (IIMC) (Miller, F., supra). Adicionalmente se contempla que la administración a pacientes con MII puede dar como resultado la reducción de los factores asociados con MII seleccionados del grupo que consiste en creatina quinasa (CK), lactato deshidrogenasa, aldolasa, proteína C reactiva, aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), y autoanticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos específicos de miositis (AEM), y anticuerpos para antígenos nucleares extraíbles. Alternativamente, los pacientes satisfacen 3 de 6 de los criterios expuestos en Rider et al., Arthritis Rheum., 50(7):2281-2290 (2004), con un empeoramiento en no más de 2 criterios.
En algunas realizaciones, los pacientes que padecen un cáncer de células B que reciben tratamiento de acuerdo con la descripción pueden demostrar una respuesta beneficiosa global al tratamiento, basándose en criterios clínicos bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica, y descritos más abajo, tales como un descenso en el tamaño del tumor, una disminución en el número de tumores y/o una mejora en los síntomas de la enfermedad.
Los criterios clínicos ilustrativos son proporcionados por el Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos &quot;(NCI) en sus sigla Inglesas&quot;, que ha dividido algunas de las clases de cáncer en las categorías clínicas de linfomas &quot;indolentes&quot; y &quot;agresivos&quot;. Los linfomas indolentes incluyen linfomas de células foliculares, separados por &quot;grados&quot; citológicos, linfoma linfocítico difuso de células pequeñas/leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoplasmacitoide/Macroglobulinemia de Waldenstrom, Linfoma de la zona marginal y leucemia de células pilosas. Los linfomas agresivos incluyen el linfoma de células grandes mixto difuso, el linfoma de Burkitt/linfoma de células no escindidas pequeñas difuso, el Linfoma linfoblástico, el linfoma de las células del manto y el linfoma relacionadocon el SIDA. En algunos casos, el Índice Pronóstico Internacional (IPI) se utiliza en los casos de linfoma agresivo y folicular. Los factores a considerar en el IPI incluyen la edad (<60 años edad versus > 60 años de edad), lactato deshidrogenasa de suero (niveles normales versus elevados), estado funcional (0 o 1 frente a 2-4) (véase la definición de más abajo), fase de la enfermedad (I o Il versus III o IV), e implicación del sitio extranodal (0 o 1 versus 2-4). Los pacientes con 2 o más factores de riesgo tienen menos de un 50% probabilidad de ausencia de recaída y supervivencia global a los 5 años.
El estado funcional en el IPI agresivo se define como sigue: Descripción del grado: 0 Totalmente activo, capaz de mantener toda la función normal previa a la enfermedad sin restricción; 1 Restringido en la actividad físicamente extenuante pero ambulatorio y capaz de llevar a cabo un trabajo de naturaleza ligera o sedentaria, p. ej., trabajo doméstico ligero, trabajo de oficina; 2 Ambulatorio y susceptible de autocuidado pero incapaz de cualquier actividad de trabajo, hasta y aproximadamente más de 50% de horas de vigilia; 3 Susceptible solamente de un autocuidado limitado, confinado en cama o en una silla más del 50% de las horas de vigilia; 4 Completamente incapacitado, incapaz de llevar a cabo el autocuidado, totalmente confinado en cama o silla; y, 5 Fallecido. (Veáse, The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project. A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma. N. Engl. J. Med. 329:987-94, 1993).
Por lo general, el grado de los linfomas se evalúa clínicamente utilizando el criterio de que el linfoma de grado bajo normalmente se presenta como una enfermedad nodal y a menudo es indolente o de crecimiento lento. La enfermedad de grado intermedio y elevado normalmente se presenta como una enfermedad mucho más agresiva con grandes tumores masivos extranodales.
El sistema de clasificación de Ann Arbor también se utiliza para medir el progreso de los tumores, especialmente de los linfomas no Hodgkin. En este sistema, las fases I, II, III, y IV del LNH en adultos se pueden clasificar en las categorías A y B dependiendo de si el paciente tiene síntomas generalizados bien definidos (B) o no (A). La designación se aplica a pacientes con los siguientes síntomas: pérdida no explicada de más del 10% de peso corporal en los 6 meses previos al diagnóstico, fiebre no explicada con temperaturas por encima de 38°C y sudoración nocturna profusa. Las definiciones de las fases son las siguientes: Fase l-afectación de una única región ganglionar linfoide o afectación localizada de un único órgano o sitio extralinfático. Fase II-afectación de dos o más regiones ganglionares linfoides en el mismo lado del diafragma o afectación localizada de un único órgano o sitio extralinfático asociado y sus ganglios linfáticos regionales con o sin otras regiones ganglionares linfoides en el mismo lado del diafragma. Fase Ill-afectación de regiones ganglionares linfoides en ambos lados del diafragma, posiblemente acompañada de afectación localizada de un órgano o sitio extralinfático, afectación del bazo, o ambas. Fase IV-afectación diseminada (multifocal) de uno o más sitios extralinfáticos con o sin afectación ganglionar linfoide asociada o afectación de órganos extralinfáticos aislados con afectación ganglionar distante (no regional). Para más detalles, véase The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project: A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma, New England J. Med. (1993) 329:987-994.
En un aspecto, el efecto terapéutico de los métodos de acuerdo con la descripción se determina por el nivel de la respuesta, por ejemplo, una respuesta parcial se define como la reducción del tumor a menos de la mitad de su tamaño original. Una respuesta completa se define como la eliminación total de la enfermedad confirmada mediante evaluación clínica o radiológica. En una realización, el individuo que recibe el tratamiento de acuerdo con la invención demuestra al menos una respuesta parcial al tratamiento. De acuerdo con el criterio de Cheson para evaluar el LNH desarrollado en colaboración con el Instituto Nacional del Cáncer (Cheson et al., J Clin Oncol. 1999, 17:1244; Grillo-Lopez et al., Ann Oncol. 2000, 11:399-408), se obtiene una respuesta completa cuando existe una desaparición completa de toda evidencia clínica y radiográfica detectable de la enfermedad y los síntomas asociados, todos los ganglios linfáticos han vuelto a su tamaño normal, el bazo ha experimentado una regresión en su tamaño, y la médula ósea está libre de linfoma.
Se obtiene una respuesta completa no confirmada cuando un paciente muestra una desaparición completa de la enfermedad y el bazo ha experimentado una regresión en el tamaño, pero los ganglios linfáticos han experimentado una regresión de más del 75% y la médula ósea es indeterminada. Una respuesta completa no confirmada satisface y excede los criterios de la respuesta parcial. Una respuesta global se define como una reducción de al menos el 50 por ciento de la carga tumoral global.
Se han desarrollado criterios similares para otras formas diferentes de cáncer o enfermedades hiperproliferativas y ya se encuentran disponibles para los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Cheson et al., Clin Adv Hematol Oncol.
2006, 4:4-5, que describe los criterios para evaluar el LLC; Cheson et al., J Clin Oncol. 2003, 21:4642-9, que describe los criterios para la LMA; Cheson et al., Blood 2000, 96:3671-4, que describe los criterios para los síndrome mielodisplásicos.
En otro aspecto, una respuesta terapéutica en pacientes que tienen un cáncer de células B se manifiesta como una ralentización del progreso de la enfermedad en comparación con los pacientes que no reciben terapia. La medida del progreso ralentizado de la enfermedad o cualquiera de los factores anteriores se puede llevar a cabo utilizando mecanismo bien conocidos en la técnica, incluyendo tomografía ósea, tomografía computarizada, gammagrafía con galio 67, linfangiografía, IRM, TEM, ultrasonidos, y similares.
Como un aspecto adicional, la descripción incluye kits que comprenden uno o más compuestos o composiciones útiles en los métodos de esta descripción envasados de una manera que facilita su uso para poner en práctica los métodos de la descripción. En la realización más simple, dicho kit incluye un compuesto o una composición descritos en la presente memoria como útil para poner en práctica un método de la descripción envasado en un recipiente tal como una botella o vasija sellada, con una etiqueta fijada al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o la composición para poner en práctica el método de la descripción. Preferiblemente, el compuesto o la composición están envasados en una forma de dosificación unitaria. El kit puede incluir adicionalmente un dispositivo adecuado para administrar la composición de acuerdo con una ruta de administración preferida o para poner en práctica un análisis de escrutinio. El kit puede incluir una etiqueta que describa el uso de la composición o las composiciones de la molécula de unión en un método de la descripción.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
MOLÉCULAS DE UNIÓN ESPECÍFICA A CD37
Se pueden elaborar diferentes proteínas de unión específica a CD37 con los componentes ilustrativos proporcionados en las Tablas 2-4. Por ejemplo, se pueden elaborar anticuerpos o moléculas SMIP, y estas moléculas pueden ser quiméricas, humanizadas, o humanas. Más específicamente, las CDR de la región variable de la cadena ligera preferidas se encuentran en los SEQ ID NO: 236-240 y 247-254 y las CDR de los dominios variables de la cadena pesada preferidas incluyen los SEQ ID NO: 241-245 y 247-254. Asimismo, se proporcionan las regiones variables de la cadena ligera y pesada preferidas en el SEQ ID NO: 236-240 y SEQ ID NO: 241-245, respectivamente. También se pueden encontrar las regiones variables de las cadenas ligera y pesada preferidas en los SEQ ID NO: 247-254. Los conectores de los dominios variables preferidos incluyen los SEQ ID NO: 225-229, mientras las regiones bisagra preferidas incluyen los SEQ ID NO: 230-235.
Una realización particularmente preferida es CAS-024 [G28-1 VH (M99F, Y102S) -VL (T25A) scFv (SSC-P) H WCH2 WCH3], que es una proteína de fusión de cadena sencilla de 483 aminoácidos, recombinante que se une al CD37 humano. El dominio de unión comprende un scFv humanizado basado en las CDR de la región variable del anticuerpo G28-1, incluyendo mutaciones en la CDR3 de la cadena pesada y en la CDR1 de la cadena ligera. Los dominios variables están unidos por una secuencia (G4S)5 (25 aminoácidos) (SEQ ID NO: 229), que está conectada por medio de una unión de tres aminoácidos (GDQ) al extremo amino de una región bisagra de IgG1 núcleo y superior modificada (donde las dos primeras de las tres cisteínas encontradas en estas regiones bisagra están sustituidas cada una por una serina). El extremo carboxi de la bisagra está fusionado con un dominio efector que comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1. La secuencia de aminoácidos de CAS-024 se expone en el SEQ ID NO: 253. La Figura 1 muestra los alineamientos de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera de las secuencias G28.1 y CAS-024 de ratón, junto con una secuencia de identidad consenso.
Tabla 1. (Cont.)
Las regiones bisagra adicionales que se pueden utilizar en las moléculas de unión específica a CD-37, tales como las moléculas SMIP o los anticuerpos, se proporcionan en la siguiente tabla.
Tabla 2
Las regiones marco adicionales que se pueden utilizar en las moléculas de unión específica a CD-37, tales como las moléculas SMIP o los anticuerpos, se proporcionan en las siguientes tablas.
TABLA 3A
(cont.)
Las partes componentes ilustrativas preferidas de las moléculas SMIP específicas de CD-37 (incluyendo las secuencias líder utilizadas para la expresión y la exportación, pero que se separan de la proteína de fusión madura cuando son exportadas desde la célula; las secuencias conectoras utilizadas para unir los dominios variables de las cadenas ligera y pesada para formar los dominios de unión scFv; las bisagras utilizadas para unir los dominios de unión scFv a los dominios efectores; y los dominios efectores), así como ciertas moléculas SMIP específicas de CD37, incluyendo la proteína de fusión CAS-024 preferida, se proporcionan en la Tabla 4.
Tabla 4
(cont.) (cont.) (cont.) (cont.)
EJEMPLO 2
EXPRESIÓN DE CAS-024 Y OTRAS PROTEÍNAS DE UNIÓN ESPECÍFICA A CD37
5 Se clonaron CAS-024 y otras moléculas SMIP de unión específica a CD37 en un sistema de expresión de células de mamífero de Ovario de Hámster Chino (CHO). Las células CHO transfectadas que producían las moléculas SMIP se cultivaron en matraces con sacudimiento y los sobrenadantes de cultivo celular cosechados se titularon utilizando un sensor Octec Q Protein A.
La Tabla 5 demuestra que el constructo CAS-024 (formato VHVL con un conector del dominio variable de 25
10 aminoácidos) tenía un nivel de expresión inesperadamente superior, hasta aproximadamente 10 veces mejor, que las otras moléculas SMIP anti-CD37 humanizadas (la mayor parte del formato VLVH con un conector del dominio variable de 15 aminoácidos). En efecto, todos los constructos VLVH totalmente humanizados se expresan escasamente (datos no mostrados), como las moléculas híbridas ratón-humano en cualquier orientación (véase el Ejemplo 5).
15 Tabla 5.
(cont.)
EJEMPLO 3
PURIFICACIÓN Y CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS DE CAS-024 Y OTRAS PROTEÍNAS DE UNIÓN ESPECÍFICA A CD37
Para producir más proteína, se clonaron ácidos nucleicos que codificaban CAS-024 y otras moléculas SMIP de unión específica a CD37 diferentes en un sistema de expresión de células de mamífero de Ovario de Hámster Chino (CHO). Las células CHO transfectadas que producían las moléculas SMIP fueron cultivadas en matraces con sacudimiento.
Todas las moléculas SMIP de unión específica a CD37 se purificaron a partir de los sobrenadantes del cultivo de CHO mediante cromatografía de Afinidad con Proteína A. Se equilibró una columna de Proteína A-Sefarosa FF de 50 ml (GE Healthcare) a 5,0 mls/min (150 cm/hr) para Volúmenes de la Columna de 15 (VC) con dPBS. El sobrenadante de cultivo se cargó sobre la columna de rProteína A-Sefarosa FF a una velocidad de flujo de 1,7 mls/min utilizando el AKTA Explorer 100 Air (GE healthcare), que captura las moléculas SMIP recombinantes. La columna se lavó con dPBS para Volúmenes de la Columna de 5 (VC), después con NaCl 10 M, Fosfato de Sodio 20 mM, pH 6,0, y después con NaCl 25 mM, NaOAc 25 mM, pH 5,0. Las moléculas de unión específica a CD37 recombinante se hicieron eluir de la columna con glicina 100 mM, pH 3,5. Las fracciones (10 mL) del producto eluido se recuperaron y después se llevaron a pH 5,0 con un 20% del volumen eluido de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 0,5 M, pH 6,0. Este producto eluido se concentró a aproximadamente 25 mg/mL de proteína y se esterilizó por filtración. Esta proteína concentrada y esterilizada se purificó adicionalmente mediante cromatografía GPC/exclusión por tamaños (SEC) para lograr separar la molécula SMIP (dímero) de los productos agregados de peso molecular superior. Una columna XK 50/100 (GE healthcare) que contenía 1 L de Superdex 200–Sefarosa FF se equilibró a 12,6 ml/min (38 cm/hr) para volúmenes de la columna de 1 5 (VC) con dPBS. Se aplicó un volumen máximo de 54 mls (3% VC) de la muestra a la columna. La columna continuó circulando a 12,6 ml/min y la proteína eluida se fraccionó en fracciones de 40 mL. Cada fracción se analizó para determinar la calidad del producto utilizando una HPLC analítica, y las fracciones eluidas se reunieron a más de aproximadamente 95% de la proteína de interés (no agregada). La reserva resultante se esterilizó por filtración a 0,22 μm, se concentró, y después se formuló con fosfato de sodio 20 mM, sacarosa 240 mM, pH 6,0.
Las trazas de la SEC que muestran los picos que contienen la proteína de interés (PDI) para CAS-001 (SEQ ID NO: 6), CAS-002 (SEQ ID NO: 48), CAS-003 (SEQ ID NO: 52), y CAS-024 (SEQ ID NO: 253) se muestran en las Figuras 2A-2D, respectivamente. El pico de CAS-024 es más estrecho y más simétrico que los de las muestras de CAS-001, CAS-002, y CAS-003 (más amplios y asimétricos). La molécula CAS-006 (quimérica) produce un pico más agudo similar al de CAS-024. Las muestras de CAS-001, CAS-002, y CAS-003 tenían todas un hombro con una ligera cola, que si se integraba, representaba aproximadamente 35% del área PDI. Este &quot;hombro&quot; sería difícil de separar del PDI y probablemente representaría confórmeros plegados erróneamente o una población heterogénea de moléculas {p. ej., tienen diferentes niveles de glicosilación). Esto indica que CAS-024 no solo se había expresado mejor, si no que este constructo también produce una población de moléculas más homogénea.
EJEMPLO 4
LA UNIÓN CELULAR POR CAS-024 ES INESPERADAMENTE SUPERIOR A OTRAS PROTEÍNAS DE UNIÓN ESPECÍFICA A CD37
Se utilizó un análisis competitivo para comparar la afinidad de unión de diferentes moléculas inmunofarmacéuticas modulares pequeñas (SMIP) específicas anti-CD37 para el CD-37 encontrado en células Ramos (una línea celular linfoblastoide B derivada de un linfoma de Burkitt). Una molécula SMIP anti-CD37 quimérica purificada mediante SEC (CAS-006, SEQ ID NO: 247) se marcó con el colorante de fluorescencia FMAT Blue® (Applied Biosystems) y se utilizó como patrón para competir con la molécula SMIP anti-CD37 quimérica no marcada purificada (control positivo) y las moléculas de ensayo SMIP anti-CD37 humanizadas no marcadas purificadas. La mayor afinidad mostrada como una señal de fluorescencia más débil y un valor de fluorescencia FL1 se utilizó para generar la curva de competición. En resumen, la molécula SMIP anti-CD37 marcada con el reactivo FMAT Blue® se diluyó hasta 2 μg/ml en tampón de bloqueo FACS y las muestras de proteína purificada (CAS-001 (SEQ ID NO: 6), CAS-002 (SEQ ID NO: 48), CAS-003 (SEQ ID NO: 52), y CAS-024 (SEQ ID NO: 253)) se diluyeron seriadamente 1:2 a concentraciones que oscilaban entre 50 μg/ml y 0,02 μg/ml. Las células Ramos se cosecharon a 1.000 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en tampón de bloqueo FACS a 4 x 106 células/10 ml de tampón. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos de color negro se le añadió lo siguiente: 50 μl de muestra, 50 μl de molécula SMIP anti-CD37 quimérica marcada con FMAT Blue®, y 50 μl de células Ramos (4 x 104/pocillo). Las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 min y se leyeron en un 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems) regulado para un tamaño de células medio y una señal baja.
5 Este análisis competitivo FMAT demostró que CAS-024 (la molécula SMIP anti-CD37 humanizada que tenía un scFV de VHVL con un conector del dominio variable de 25 aminoácidos) tiene la misma afinidad por CD37 que la molécula SMIP anti-CD37 quimérica parental y, en contraste, tiene inesperadamente una afinidad hasta 4 veces mayor por CD37 que las moléculas SMIP anti-CD37 humanizadas que tenían la estructura VLVH inversa y un conector del dominio variable de 16 aminoácidos más corto (véase la Figura 3). La mejor unión, aunque
10 significativamente menor que la de CAS-006 o CAS-024, se encontró en un constructo VLVH que no tenía ninguna mutación en CDR (CAS-001). Sin embargo, CAS-001 fue sistemáticamente el constructo peor expresado y produjo una población no homogénea de moléculas purificadas – incluso para este constructo, CAS-024 se unía entre 1,5 y 2 veces mejor que CAS-001.
Este resultado también fue sorprendentemente porque M99 e Y102 de la CDR3 de la cadena pesada de CAS-024
15 están mutadas – la posición Y102 generalmente está conservada y cabría esperar que un cambio en esta posición solo disminuyera o incluso anulara la unión (p. ej., CAS-062, muta en la posición Y102, tiene una unión detectable pero gravemente disminuida en comparación con CAS-001 o CAS-024, mientras CAS-063 a CAS-067 tienen cada uno una actividad de unión de escasamente detectable a nula en este análisis cuando se añade una mutación en la posición M99 o D101, datos no mostrados). De este modo, la estructura de CAS-024 proporcionó una molécula que
20 se unía sorprendentemente tan bien como la molécula quimérica, CAS-006.
EJEMPLO 5
EXPRESIÓN Y UNIÓN CELULAR DE CAS-024 EN COMPARACIÓN CON LAS PROTEÍNAS DE UNIÓN
ESPECÍFICA A CD37 HÍBRIDAS DE RATÓN-HUMANO
Se produjeron las moléculas SMIP de unión específica a CD37 CAS-024 y otras por medio de la tecnología de ADN
25 recombinante y se transfectaron en células HEK293 durante 7 días. Los sobrenadantes del cultivo celular se cosecharon el día 7 y se titularon utilizando un sensor Octec Q Protein A.
De un modo similar a los resultados mostrados en el Ejemplo 2, aquí la Tabla 6 demuestra que CAS-024 (formato VHVL con un conector del dominio variable de 25 aminoácidos) se expresaba de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 27 veces mejor que las otras moléculas SMIP anti-CD37 híbridas de ratón-humano o
30 humanizadas. Las moléculas híbridas de ratón-humano no se expresaban bien con independencia de la orientación VHVL o VLVH.
Tabla 6.
Se utilizó un análisis competitivo como el descrito en el Ejemplo 4 para comparar la afinidad de unión de diferentes
35 moléculas SMIP anti-CD37 híbridas de ratón-humano en comparación con la unión de CAS-024 a células Ramos. Una molécula SMIP anti-CD37 quimérica purificada por medio de SERC (CAS-006, SEQ ID NO: 247) se marcó con el colorante de fluorescencia FMAT Blue® (Applied Biosystems) y se utilizó como patrón para competir con la molécula SMIP anti-CD37 quimérica no marcada purificada (CAS-006, control positivo) y las moléculas de ensayo SMIP anti-CD37 humanizadas no marcadas -CAS-002 (SEQ ID NO: 48), CAS-003 (SEQ ID NO: 52), CAS-014 (SEQ
40 ID NO: 251), CAS-017 (SEQ ID NO: 252), y CAS-024 (SEQ ID NO: 253).
Este análisis competitivo con FMAT demostró de nuevo que CAS-024 (molécula humanizada VHVL con un conector de 25 aminoácidos) tiene la misma afinidad por CD37 que la molécula SMIP anti-CD37 quimérica parental (CAS006), mientras CAS-002 y CAS-003 (moléculas humanizadas VLVH con un conector de 16 aminoácidos) no se unían tan bien (mostrando una reducción de 2-3 veces) (véase la Figura 4A). Las moléculas híbridas de ratón45 humano, con independencia de la orientación del dominio variable (VH de ratón-VL humanizada con un conector de 22 aminoácidos o VL humanizada-VH de ratón con un conector de 16 aminoácidos), se unían tan bien o incluso
mejor (1,5 a 2 veces) que CAS-006 y CAS-024 (véase la Figura 4B). Estos datos demuestran que una molécula híbrida de ratón-humano se une tan bien como o mejor que CAS-006, con independencia de la orientación, y que finalmente el constructo VLVH completamente humanizado sin mutaciones en CDR se une mejor que otras moléculas humanizadas pero todavía tiene una disminución de la unión en comparación con CAS-006 o CAS-024. En conjunto, estos datos sugieren que la carencia de mutaciones en las CDR para esta molécula proporcionaría mejores moléculas de unión. Asimismo, el orden concreto (VLVH o VHVL) no parecía resolver el problema de expresión, ni siquiera cuando se utiliza un conector con un dominio variable más largo (véase CAS-014). De este modo, fue imposible seleccionar una molécula con la estructura de CAS-024 y propiedades similares a la molécula parental CAS-006.
EJEMPLO 6
CAS-006 Y LOS DIFERENTES ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE CD37 SE UNEN AL MISMO EPÍTOPO O A EPÍTOPOS SOLAPANTES SOBRE CD37
Se realizaron experimentos para identificar el epítopo CD37 unido a CAS-006 y otros anticuerpos específicos de CD37 descritos previamente. Se obtuvieron MB371 no conjugado (Núm. 555457) y MB371 conjugado con FITC (Núm. 555456) de BD Pharmingen (San Jose, CA), BL14 conjugado con FITC (Núm. 0457) de Immunotech/Beckman Coulter (Fullerton, CA), NMN46 conjugado con FITC (Núm. RDI-CBL 136FT) y NMN46 no conjugado (Núm. RDI-CBL 136) de RDI (Flanders, NJ), IPO24 conjugado con FITC (Núm. 186-040) e IPO-24 no conjugado (Núm. 186-020) de Ancell Corporation (Bayport, MN), HHI conjugado con FITC (Núm. 3081) y HH1 no conjugado (Núm. 3080) de DiaTec. Com (Oslo, Noruega) y WR17 conjugado con FITC (YSRTMCA483F) y WR17 no conjugado (YSRTMCA483S) de Accurate Chemical &amp; Scientific (Westbury, NY). La proteína SMIP CAS-006 fue producida como se describe en el Ejemplo 2.
CAS-006 se conjugó con FITC utilizando un Kit de Marcaje con FITC Fluoroinformador para Sondas Moleculares (F6434) de acuerdo con las instrucciones del fabricante como sigue: el pico de interés (PDI) de la proteína CAS-006 a 13,5 mg/mL se ajustó a 5 mg/mL con PBS. Se añadió un mg (200 μl) a los tubos del kit con una varilla de agitación, y se añadió NaHCO3 1 M (ajustado a pH 8,5 con NaOH 6N), hasta una concentración final de 0,1 M. Se añadieron 50 μl de DMSO a 370 μg de FITC y se añadieron a los tubos a razones molares de FITC:proteína de 15, 20, 30 y 40 utilizando la fórmula para determinar los μl de FITC a añadir: [ μl de solución de FITC a añadir = 5 mg/mL de proteína x 0,2 mL x 389 x 100 x razón molar deseada/Peso molecular de CAS-006 (110.000)].
Las reacciones se protegieron de la luz y se agitaron continuamente durante 75 minutos a la temperatura ambiente. Las reacciones se añadieron a columnas de centrifugación preparadas como se describe en el kit y se centrifugaron a 1.100 g durante 5 minutos para cambio de tampón en PBS por azida y separar el FITC no conjugado. Se determinó la densidad óptica a 280 nM y 494 nM con gotas de 2 μl en un Nanodrop; el coeficiente de extinción para CAS-016 se determinó experimentalmente para este aparato leyendo las diluciones de la molécula SMIP no conjugada de partida, la concentración de cada uno de los productos conjugados fue de 4,25 mg/ml y se determinaron las siguientes razones de FITC:proteína: 2,7 FITC/CAS-016 a una razón de 15; 3,7 FITC/CAS-016 a una razón de 20; 4,4 FITC/CAS-016 a una razón de 30; y 5,1 FITC/CAS-016 a una razón de 40.
Se añadió BSA a 3 mg/mL para ayudar a estabilizar la proteína. Se evaluó la unión de cada fracción a diluciones que oscilaban entre 100 y 24.300x en Ramos y entre 3.200 y 25.600 en PBMC humanas. Todas se unieron, pero se seleccionó la razón MR30 para su uso adicional puesto que daba una IMF elevada que se mantenía bien a lo largo del intervalo de titulación utilizado, indicando que la avidez de la unión resultaba menos afectada en esta reacción.
Los productos conjugados de anticuerpo marcado con FITC se titularon de 10 ng/mL a 10 μg/mL en un estudio de unión inicial para determinar la cantidad óptima a utilizar en los estudios de bloqueo. El nivel seleccionado estaba justo por debajo de las cantidades saturantes, y se mantuvo constante en los siguientes análisis, mientras los niveles de anticuerpo de bloqueo se incrementaron a lo largo de un intervalo de 10 veces. Los datos se trazaron como el porcentaje de unión máxima frente a la concentración de anticuerpo de bloqueo, de manera que los niveles superiores indican un bloqueo menos eficaz, mientras los niveles inferiores indican una actividad de bloqueo más eficaz. Todos los anticuerpos sometidos a ensayo mostraron una actividad de bloqueo de la unión máxima observada sin reactivos no marcados (Figura 5).
Después se tiñeron células BJAB, una línea de células B linfoblastoides con un panel de diferentes clones de mAb anti-CD37, incluyendo MB371, BL14, NMN46, IPO24, HH1, WR17, y SMIP CAS-006 quimérico. Para los análisis de unión competitivos, se incubaron 2,5 x 105 células BJAB en placas con el fondo en V de 96 pocillos en medio de tinción (PBS con suero de ratón al 2%) con los mAb anti-CD37 conjugados con FITC a 1,25 μg/mL en presencia de MAb anti-CD37 no conjugado a las concentraciones indicadas (2,5, 1,25, 0,6, o 0,3 μg/ml) o medio de tinción durante 45 minutos sobre hielo en la oscuridad. Los anticuerpos de bloqueo y los productos conjugados de anticuerpo marcados con FITC se añadieron a las reacciones antes de la adición de las células. Después las células se lavaron 2,5 veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 1% (USB, Cleveland, Ohio). Las células tratadas se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un aparato FACsCalibur y el programa CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA).
Para los análisis de bloqueo cruzado FACs, se incubaron 2,5 x 105 células BJAB en placas de fondo en V de 96 pocillos en medio de tinción (PBS con suero de ratón al 2%) en presencia de MAb anti-CD37 no conjugado a 5 μg/mL durante 45 minutos a la temperatura ambiente en la oscuridad. Se añadieron mAb anti-CD37 conjugados con FITC a una concentración final de 2 μg/ml, dando como resultado una dilución de los reactivos no marcados a 33
5 μg/ml. Las reacciones se incubaron adicionalmente durante 45 minutos a la temperatura ambiente en la oscuridad, después se lavaron 2,5 veces con PBS, y finalmente se fijaron en paraformaldehído al 1% en PBS (USB, Cleveland, Ohio). Las células se analizaron mediante citometría de flujo en un aparato FACsCalibur utilizando el programa Cell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA).
Para los análisis de unión celular, las células se resuspendieron en PBS (Gibco/lnvitrogen, Grand Island NY) que
10 contenía FBS al 2% (Gibco/lnvitrogen), (medio de tinción) a una concentración de aproximadamente 4 x 106 células/mL. Después las células se cultivaron en placa y luego se añadieron las muestras de ensayo, diluidas en medio de tinción, 1:1 a las concentraciones finales designadas. Las reacciones se incubaron durante 45 minutos sobre hielo. Las muestras se centrifugaron y se lavaron 2 veces con PBS. Se añadió anti-IgG humana de cabra con FITC (CalTag, Burlingame CA) a una dilución final de 1:50, y se incubó 45 minutos sobre hielo. Las muestras se
15 centrifugaron, se lavaron en PBS, después se fijaron en 200 μl de paraformaldehído al 1% en PBS (USB, Cleveland, Ohio). Las células se analizaron mediante citometría de flujo en un aparato FACsCalibur utilizando el programa Cell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA).
Cada anticuerpo mostró una inhibición de la unión dependiente de la dosis, indicando que todas las moléculas sometidas a ensayo se unen a un epítopo idéntico o íntimamente relacionado. Se observó una potencia diferente
20 para la inhbición de la unión para cada anticuerpo. La SMIP CAS-006 tenía el nivel más alto de actividad de bloqueo de todas las moléculas sometidas a ensayo, mientras HH1 dio un nivel intermedio de actividad de bloqueo, y WR17, IPO24 bloquearon mejor que MB371, pero mostraron un bloqueo menos eficaz que las otras dos moléculas no marcadas (Figura 5).
Además de los análisis de la actividad de bloqueo, se realizó una serie similar de experimentos en los que se
25 sometieron a ensayo diferentes anticuerpos dirigidos a CD37 para determinar su capacidad para competir entre sí por la unión al receptor de CD37. Los resultados de estos experimentos, como los resultados obtenidos en los estudios de bloqueo para todas las moléculas sometidas a ensayo, indicaron que los diferentes anticuerpos dirigidos a CD37 y CAS-006 tienen los mismos epítopos o epítopos íntimamente solapantes.
EJEMPLO 7
30 RESPUESTA A LA DOSIS DE CAS-024 EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE TUMOR HUMANO SUBCUTÁNEO ESTABLECIDO (DOHH2) EN RATONES SCID
El objetivo de este experimento fue examinar la respuesta a la dosis para el tratamiento con CAS-024 en un modelo de xenoinjerto de tumor humano subcutáneo establecido (DOHH2) en ratones SCID. DOHH2 es una línea de células B linfoblastoides humanas CD20+CD37+ derivada de un paciente con linfoma folicular (Kluin-Nelemans et al.,
35 Leukemia 5:221, 1991). De este modo, DOHH2 derivaba de un paciente con un LNH no Burkitt.
Se inyectaron cinco millones de células DOHH2 subcutáneamente en el flanco de ratones CB-17SCID hembra (Harlan, Somerville, NJ) de 6,5 semanas de edad y con un peso medio de 18,0 ± 0,1 g (oscilando entre 14,6 y 22,6 g). El día 8 después de la inoculación del tumor, los tumores palpables e hicieron evidentes en la mayor parte de los ratones. Los ratones que portaban tumores se clasificaron en cuatro grupos con volúmenes medios de los tumores 40 equivalentes (n=14 por grupo; 2 jaulas de 5 ratones y 1 jaula de 4 ratones para cada grupo). El día de la clasificación se definió como día 0. Los diámetros de los tumores se determinaron con un par de calibres y se calcularon los volúmenes de los tumores utilizando la fórmula: V = 1/2 [longitud x (anchura)2]. El volumen tumoral medio de la línea base fue de 228 mm3, el tamaño tumoral de la línea base media fue de 224 mm3, y el intervalo fue de 179 a 284
mm.
45 Tabla 7.
Reactivos para el Uso In Vivo
Reactivo
% PDI Concentración y Endotoxina Preparación para Inyectable
PBS
NA 1X Endotoxina < 0,03UE/mg NA
IgG Humana (huIgG)
No sometida a ensayo 10 mg/mL Endotoxina = 10 UE/mg Diluido a 1,0 mg/mL, PBS
CAS-024
100 9,6 mg/mL Endotoxina = 0,01 UE/mg Diluido a 1,0 mg/mL PBS para dosis de 200 μg; después diluir 1:2 para preparar dosis de 100 μg, después diluir seriadamente 1:3 para preparar las otras soluciones de dosificación.
Los grupos de ratones SCID que portaban tumores se trataron los días 0, 4, y 8 por medio de inyección IP de 0,2 mL de PBS que contenía 200 μg de hulgG (control negativo) o 200, 100, 30, 10, o 3 μg de CAS-024. Las dos soluciones de dosis más baja de CAS-024 se prepararon el día de la inyección para evitar la necesidad de añadir una proteína portadora a las soluciones más diluidas. Las soluciones de fármaco tenían códigos de color como se describe más abajo (véase la Tabla 8 de más abajo).
Tabla 8.
Se prepararon soluciones de dosificación con volúmenes similares y se indicaron los contenidos de los tubos en etiquetas eliminables. Un investigador que no estaba tratando ni evaluando los ratones colocó un código de color en 10 cada tubo y anotó el código y la identidad de los contenidos del tubo en un cuaderno de laboratorio. Los ratones se controlaron diariamente mediante inspección visual. Se determinaron los pesos semanalmente, y se determinaron los diámetros de los tumores al menos 3 veces por semana (L, X, V) por medio de un observador ciego (véase más arriba) para los grupos de tratamiento. Se calcularon los volúmenes de los tumores como se ha descrito más arriba. Los ratones fueron sometidos a eutanasia si el volumen de su tumor alcanzaba más de 1.500 mm3 (o 1200 mm3 los 15 Viernes). La muerte no fue el criterio de valoración de los protocolos tumorales y, a menos que se indique de otro modo, la &quot;supervivencia&quot; de un ratón estuvo determinada por el momento en el que fue sometido a eutanasia debido a que el volumen de su tumor alcanzaba los límites previamente determinados. (El protocolo requería que los ratones fueran sometidos a eutanasia si (1) el volumen de su tumor excedía de los parámetros indicados más arriba,
(2) se producía la ulceración de un tumor, (3) el tumor inhibía la movilidad del ratón, y (4) la pérdida de peso excedía 20 el 20% del peso corporal).
Un ratón del grupo de tratamiento con 100 μg de CAS-024 fue sometido a eutanasia el día 35 debido a una pérdida de peso >20%. Este ratón tenía un volumen del tumor de 266 mm3 en ese momento, y fue tratado censurando sus datos para el análisis de supervivencia (no sometido a eutanasia el día 35 debido al crecimiento del tumor). Para el cálculo de la incidencia sin tumores al final del estudio, este ratón fue clasificado como uno que había sido sometido
25 a eutanasia durante el estudio debido al crecimiento de su tumor (su tumor estaba volviendo a crecer en el momento de su fallecimiento). Ningún otro ratón fue encontrado muerto y ninguno fue sometido a eutanasia debido a la pérdida de peso, a la ulceración del tumor, o a la reducción de la movilidad. No hubo signos manifiestos de toxicidad ni se observaron pérdidas de peso en ninguno de los grupos de tratamiento (datos no mostrados).
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism. Se determinaron diferencias
30 significativas en los volúmenes medios de los tumores y los volúmenes medios relativos de los tumores utilizando un ANOVA de una vía para datos no paramétricos (test de Kruskal-Wallis) con un post-test de comparación múltiple de Dunn. Para examinar las diferencias entre cada uno de los grupos tratados con CAS-024 y el grupo con hulgG, se compararon todos los grupos. Para las comparaciones entre los grupos con CAS-024 solamente, se excluyó el grupo con hulgG. Además, se analizaron los grupos con dosis altas y medias (200, 100, y 30 μg) como un grupo de
35 datos, y se analizaron los grupos con dosis medias y bajas (30, 10, y 3 μg) como otro grupo de datos. Se determinaron las diferencias significativas en la supervivencia de los ratones a lo largo del tiempo utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier con un test de logaritmo del rango para comparar las curvas de supervivencia. Se determinaron las diferencias significativas en la incidencia de ratones libres de tumores utilizando el test de Fischer exacto, los valores de p <0,05 se consideraron significativos.
CAS-024 tuvo un efecto inhibidor dependiente de la dosis sobre el crecimiento de los tumores DOHH2. Con la excepción del grupo con un régimen de dosificación bajo (3 μg), el volumen medio del tumor de cada grupo tratado 5 con CAS-024 fue significativamente inferior al del grupo tratado con IgG humana tan pronto como el día 5, y permaneció bajo hasta el día 12. Los ratones tratados con hulgG fueron sometidos a eutanasia empezando el día 12; por lo tanto, las comparaciones de los volúmenes de los tumores de los grupos tratados con CAS-024 con el grupo tratado con hulgG no se realizaron para momentos más tardíos. En términos de la respuesta a la dosis, no hubo una diferencia significativa en los volúmenes medios de los tumores de los dos grupos de dosificación más
10 elevada en cualquier punto del estudio. En contraste, los volúmenes medios de los tumores de estos dos grupos difirieron significativamente de los de cada uno de los tres grupos de dosificación inferior entre los días 12 a 16 (el día 16 fue el último momento evaluable para el grupo con una dosificación baja). De un modo similar, los volúmenes medios de los tumores en ratones de los grupos con dosis de 30 μg y 10 μg difirieron entre sí y del grupo de dosis baja a lo largo de este mismo período.
15 Los tumores de los ratones tratados con hulgG crecieron rápidamente, y todos los ratones de este grupo se sometieron a eutanasia el día 19. Como se resume en las Tablas 9 y 10 de más abajo, la supervivencia de los ratones tratados con cualquiera de los regímenes de dosificación con CAS-024 fue prolongada con respecto al grupo tratado con hulgG (p<0,0001 en todos los casos). En términos de una respuesta a la dosis, no hubo una diferencia significativa en las curvas de supervivencia de los ratones tratados con los regímenes de dosificación más elevados
20 (200 y 100 μg) (p=0,7091). Con excepción de esta comparación de grupos, hubo una diferencia significativa entre la curva de supervivencia de cada grupo de dosificación y la curva de supervivencia de los grupos tratados con un régimen de dosificación más bajo (los valores de p oscilaron de 0,0132 a <0,0001).
Tabla 9. Tabla 10.
Tiempo Medio de Supervivencia e incidencia de Ratones Libres de Tumores
Grupo de Tratamientoa
Dosis Cumulativa Tiempo Medio de Supervivencia (Días)b Muerte (No Debida a Volumen Grande de Tumor) Incidencia de Libres de Tumor al Final del Estudioc Valor p para el Test de Fischer Exacto (Comparación de incidencia de libres de tumor)d
HuIgG 200
600 μg 14 0/14 0/14 (0%) NA
CAS-024 200
600 μg No definidoef 0/14 11/14 (79%)g <0,0001
CAS-024 100
300 μg No definido 1/14b 11/14 (79%) <0,0001
CAS-024 30
90 μg 35 0/14 5/14 (36%) 0,0407
CAS-024 10
30 μg 28 0/14 0/14 (0%) NA
CAS-024 3
9 μg 19 0/14 0/14 (0%) NA
a Los ratones fueron tratados con la proteína indicada por medio de inyección IP los días 0, 4, y 8. Los números indican la cantidad de proteína (μg) inyectada por día. b La supervivencia de un ratón fue determinada el día que se sometió a eutanasia debido al crecimiento del tumor. Un ratón del grupo con 100 μg de CAS -024 fue sometido a eutanasia el día 35 debido a una pérdida de peso >20%. El ratón tenía un tumor con un volumen de 266 mm3 en ese momento, y fue tratado como dato censurado (el volumen del tumor no alcanzaba, el día 35, el límite determinado previamente) para el análisis de Kaplan Meier. Ningún otro ratón fue sometido a eutanasia por razones distintas de que el volumen de su tumor alcanzara el límite previamente determinado. Los ratones &quot;libres de tumores&quot; no tenían tumores SC palpables. La ausencia de células tumorales no fue confirmada por la histología. El estudio terminó el día 61. d Cada grupo se comparó con el grupo de control tratado con HuIgG. e El tiempo de supervivencia medio es indefinido cuando >50% de los ratones están vivos al final del período de observación. f Los valores en negrita indican que las curvas de supervivencia del grupo indicado son significativamente diferentes de las del control con HuIgG (p<0,0001 en cada caso, test del logaritmo del rango). g Los valores en negrita son significativamente diferentes de los del grupo de control tratado con huIgG b Un ratón fue sometido a eutanasia el día 35 debido a un pérdida de peso >20%. El ratón tenía un volumen del tumor de 266 mm3 en ese momento y se trató como dato censurado para el análisis de Kaplan Meier.
Valores de p para la Comparación de las Curvas de Supervivencia e Incidencia de Libres de Tumores Entre los Grupos Tratados con CAS-024
Comparación de Gruposa
Valores de p para las Comparaciones Indicadas
Test del logaritmo del rango (comparación de curvas de supervivencia)
Test exacto de Fischer (comparación de incidencia de libres de tumores)
200 versus 100
0,7091 1,000
200 versus 30
0,0132h 0,0542
200 versus 10
<0,0001 <0,0001
200 versus 3
<0,0001 <0,0001
100 versus 30
0,0035 0,0542
100 versus 10
<0,0001 <0,0001
100 versus 3
<0,0001 <0,0001
30 versus 10
0,0002 0,0407
30 versus 3
<0,0001 0,0407
10 versus 3
<0,0001 NA
a Véase la leyenda de la Tabla 7 para la información sobre los grupos. b Los valores de p < 0,05 están en negrita para dar énfasis.
Todos los ratones del grupo tratado con huIgG y de los dos grupos con CAS-024 de dosis más baja (10 y 3 μg) se sometieron a eutanasia debido al crecimiento de sus tumores. Por el contrario, la mayor parte de los tumores en los grupos de ratones tratados con 200 o 100 μg de CAS-024 regresaron al punto en el que no se encontraba presente
5 ningún tumor palpable. Hacia el final del estudio, 11/14 (79%) de los ratones de cada uno de los dos grupos con las dosis más altas y 5/14 (36%) de los ratones del grupo con una dosis de 30 μg permanecieron libres de tumores (p<0,0001 y 0,0407, respectivamente, frente al grupo con hulgG).
De este modo, CAS-024 mostró efectos inhibidores dependientes de la dosis sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumores humanos subcutáneos establecidos (DOHH2) en ratones SCID. Los dos regímenes de dosificación más
10 altos (100 o 200 μg por inyección IP; dosis cumulativa de 300 o 600 μg, que corresponde a aproximadamente 16,7 o 33 mg/kg, respectivamente) tuvieron efectos inhibidores similares y fueron los más eficaces de los regímenes sometidos a ensayo en términos de inhibición del crecimiento de los tumores, prolongación de la supervivencia, e inducción de la regresión completa de los tumores.
EJEMPLO 8
15 EFICACIA DE CAS-024 Y RITUXAN® COMO AGENTES INDIVIDUALES EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE TUMOR HUMANO ESTABLECIDO (DOHH2) EN RATONES SCID
El objetivo de este estudio fue examinar la eficacia de CAS-024 y Rituxán como agentes individuales en un modelo de xenoinjerto de tumor humano establecido (DOHH2) en ratones SCID. Como se muestra más arriba, DOHH2 es una línea de células B linfoblastoides humanas CD20+CD37+ derivada de un paciente con linfoma folicular.
20 Se inyectaron cinco millones de células DOHH2 subcutáneamente en el flanco de ratones CB-17SCID hembra (Harlan, Somerville, NJ) de 6,5 semanas de edad. El día 8 después de la inoculación del tumor, se hicieron evidentes tumores palpables en la mayoría de los ratones. Los ratones que portaban tumores se clasificaron en cuatro grupos (n = 15 por grupo; 3 jaulas de 5 ratones para cada grupo) con volúmenes medios de tumores equivalentes. El día de la clasificación se definió como día 0 del estudio. Se determinaron los diámetros tumorales
25 con un par de calibres y se calcularon los volúmenes de los tumores utilizando la fórmula: V = 1/2 [longitud x (anchura)2]3. El volumen medio de los tumores de la línea base fue de 228 mm3; el tamaño tumoral de la línea base de la mediana fue de 227 mm; y el intervalo fue de 181 a 272 mm3. Los ratones (15 por grupo de tratamiento) se trataron los días 0, 4, y 8 por medio de inyección IP de 0,2 mL de PBS que contenía 200 μg de IgG humana, CAS024, o Rituxan® (para un total de 600 μg después de tres tratamientos). Para los grupos tratados IP con hulgG, CAS024, y Rituxan®, se prepararon soluciones en volúmenes similares y los contenidos de los tubos se anotaron en etiquetas eliminables. Un investigador que no estaba tratando o evaluando a los ratones colocó un código de color en cada tubo y anotó el código y la identidad de los contenidos de los tubos en un cuaderno de laboratorio.
Los ratones fueron controlados diariamente por medio de inspección visual. Los pesos fueron determinados semanalmente, y los diámetros de los tumores fueron determinados al menos 3 veces por semana (L, X, V) por un observador ciego (véase más arriba) para los grupos de tratamiento. Los volúmenes de los tumores se calcularon como se ha descrito más arriba. Los volúmenes de los tumores el último día que todos los ratones estuvieron vivos en cada grupo también se expresaron en términos de volúmenes tumorales con respecto al día 0, utilizando la fórmula:
(volumen el día de interés – volumen el día 0) Volumen tumoral relativo el día de interés = ----------------------------------------------------------------volumen el día 0
Los ratones fueron sometidos a eutanasia si el volumen de su tumor alcanzaba más de 1.500 mm3 (o 1200 mm3 los Viernes). La muerte no fue el critrio de valoración de los protocolos tumorales y, a menos que se indique de otro modo, la &quot;supervivencia&quot; de un ratón estuvo determinada por el momento en el que fue sometido a eutanasia debido a que el volumen de su tumor alcanzaba los límites previamente determinados. (El protocolo de los autores de la presente invención requería que los ratones fueran sometidos a eutanasia si el volumen de su tumor excedía los parámetros indicados más arriba, se producía la ulceración de un tumor, el tumor inhibía la movilidad del ratón, o la pérdida de peso excedía el 20%).
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism. Se determinaron diferencias significativas en los volúmenes tumorales medios y los volúmenes tumorales relativos medios utilizando un ANOVA de una vía para los datos no paramétricos (test de Kruskal-Wallis) con un post-test de comparación múltiple de Dunn. Se determinaron las diferencias significativas en la supervivencia de los ratones a lo largo del tiempo utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier con un test de logaritmo del rango para comparar curvas de supervivencia. Las diferencias significativas en la incidencia de ratones libres de tumores se determinaron utilizando el test exacto de Fisher (los valores de p <0,05 se consideraron significativos).
Los ratones se sometieron a eutanasia cuando los volúmenes de sus tumores alcanzaron los límites descritos más arriba. Un ratón del grupo de tratamiento con CAS-024 fue sometido a eutanasia el día 45 debido a una pérdida de peso >20%. Este ratón no tenía un tumor SC evidente en ese momento, y fue tratado como dato censurado para el análisis de supervivencia (no sometido a eutanasia el día 45 debido al crecimiento del tumor) y no fue incluido en la comparación de la incidencia de libres de tumores al final del estudio. No se encontró ningún otro ratón muerto ni se sometió a eutanasia debido a la pérdida de peso, la ulceración del tumor, o la disminución de la movilidad. No se observaron signos manifiestos de toxicidad ni pérdidas de peso en ninguno de los grupos de tratamiento (datos no mostrados).
Los ratones tratados con CAS-024 y Rituxán mostraron una rápida respuesta al tratamiento. Los volúmenes tumorales medios de los grupos tratados con CAS-024 y Rituxan® fueron significativamente más bajos que los del grupo tratado con IgG humana tan pronto como el día 4 (después de una única inyección de fármaco) y permanecieron más bajos hasta el día 11. No hubo diferencias significativas en los volúmenes tumorales medios o en los volúmenes tumorales relativos medios entre los grupos tratados con CAS-024 y Rituxan® hasta el día 11. Los ratones tratados con hulgG fueron sometidos a eutanasia empezando el día 11; por lo tanto, las comparaciones de los volúmenes de los tumores no se realizaron para momentos más tardíos.
Los tumores de los ratones tratados con hulgG crecieron rápidamente y todos los ratones de este grupo fueron sometidos a eutanasia el día 15. En contraste, sobre el día 15, la mayoría de los tumores de los grupos tratados con CAS-024 y Rituxán habían mostrado regresión hasta el punto de que no se encontraron presentes tumores palpables. Notablemente, la respuesta al tratamiento fue duradera solamente en el grupo tratado con CAS-024. Hacia el final del estudio, todos los ratones tratados con Rituxán fueron sometidos a eutanasia debido al crecimiento de sus tumores, mientras 10/14 (71 %) de los ratones del grupo tratado con CAS-024 permanecieron libres de tumores. Véase la Tabla 9. De este modo, al final del estudio, las curvas de supervivencia y la incidencia de ratones libres de tumores en el grupo tratado con CAS-024 difirieron significativamente del grupo de control con hulgG y el grupo tratado con Rituxan®. La Figura 6 demuestra que CAS-024 era estadísticamente superior a Rituxán en el tratamiento in vivo de este modelo animal de linfoma folicular.
Tabla 11.
Tiempo Medio de Supervivencia e Incidencia de Ratones Libres de Tumores
Grupo de Tratamiento
Días de Tratamiento y Dosis Cumulativa Tiempo Medio de Supervivencia (Días)a Valor p a partir del Test de Logaritmo del Rango Muerte (distinta del Sacrificio por el Tamaño del Tumor) Ratones Libres de Tumores el Día 81c Test Exacto de Fischer (Comparación con Incidencia de libres de tumores)b
HuIgG
Días 0, 4, 8 600 μg 13 - 0/15 0/15 NA
CAS-024 IP
Días 0, 4, 8 600 μg No definidod,e <0,0001 1/15f 10/14 (71%) <0,0001
Rituxán® IP
Días 0, 4, 8 600 μg 43 <0,0001 0/15 0/15 (0%) NA
a La supervivencia se determinó el día que el ratón fue sometido a eutanasia debido al crecimiento del tumor. Aparte de un ratón del grupo al que se habían administrados dosis de CAS-024 (véase (f)), ningún ratón fue sometido a eutanasia por razones que no fueran que el volumen del tumor alcanzara el límite previamente determinado. b Cada grupo fue comparado con el grupo de control tratado con HuIgG. c Los ratones &quot;libres de tumores&quot; no tenían tumores SC palpables; la confirmación de la ausencia de células tumorales no fue ratificada por la histología. d El tiempo medio de supervivencia es indefinido cuando >50% de los ratones están vivos al final del período de observación. e Los valores en negrita son significativamente diferentes de los del control con HuIgG. f Un ratón fue sometido a eutanasia el día 45 debido a una pérdida de peso >20%. El ratón no tenía un tumor SC aparente en ese momento y fue excluido del grupo para la comparación de ratones libres de tumores el día 81.
En conclusión, CAS-024 y Rituxán fueron eficaces como agentes individuales en el modelo de xenoinjerto de tumor humano (DOHH2) en ratones SCID. Si bien ambos agentes causaron una regresión inicial del tumor en la mayor parte de los ratones, solamente se observó regresión del tumor a largo plazo en el grupo de ratones tratados con 5 CAS-024 ya que se observó recurrencia de los tumores después del tratamiento óptimo con anti-CD20. Por consiguiente, CAS-024, un SMIP anti-CD37 humanizado, muestra una eficacia significativa en modelos de xenoinjerto con tumores pre-clínicos incluyendo modelos que demuestran que el Rituxan® fracasa con el tiempo. Estos resultados sugieren por lo tanto que el tratamiento con CAS-024 de pacientes con linfoma y leucemia de células B es beneficioso y es un tratamiento alternativo viable en pacientes en los que fracasa el tratamiento con
10 Rituxan®.
EJEMPLO 9
EVALUACIÓN IN VITRO DE CAS-024 COMBINADO CON AGENTES QUIMIOTERAPÉUTICOS
Se demostró previamente que CAS-006 actúa sinérgicamente combinado con el agente quimioterapéutico fludarabina para eliminar las células con leucemia linfocítica crónica (LLC) in vitro (véase, p. ej., la Publicación de la 15 Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2007/0059306). Puesto que las células con LLC no se dividen activamente en cultivo celular in vitro, los datos indican que no se requiere proliferación celular para el efecto proapoptótico de CAS-006 o CAS-024 para determinar su sinergia con agentes quimioterapéuticos. El propósito de este estudio, por lo tanto, fue determinar si CAS-024 y los diferentes agentes quimioterapéuticos fueron eficaces sobre la línea celular de linfoma de las células del manto (LCM), Rec-1, que crece activamente y se divide en cultivo celular
20 in vitro y si la combinación de CAS-024 y un agente quimioterapéutico (fármaco) des-sensibilizaría o intensificaría la respuesta del linfoma de las células del manto a los diferentes agentes quiomioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos sometidos a ensayo fueron doxorrubicina, vincristina, y fludarabina, que se utilizan para tratar el linfoma no Hodgkin y otras malignidades linfoides.
Las células Rec-1, una línea de células B humanas CD37+ establecida a partir de un paciente con linfoma de las
25 células del manto, fueron sometidas a ensayo para determinar la inhibición del crecimiento en respuesta a CAS-024 entrecruzado en presencia o ausencia de doxorrubicina, vincristina, o fludarabina, (véase la Figura 7). Se pre-incubó CAS-024 con anti-F(ab)'2 de IgG humana para entrecruzar la proteína. Las células se cultivaron con medio solo o con medio que contenía diferentes concentraciones de la proteína CAS-024 entrecruzada, en presencia o ausencia diferentes concentraciones de doxorrubicina, vincristina, o fludarabina. Los cultivos se incubaron durante 96 horas y se evaluó la inhibición del crecimiento utilizando el sistema de detección de células viables por medio de ATP (esto es, células viables cuantificadas mediante liberación de ATP).
Se utilizó el método del Efecto Mediana/Índice de Combinación (IC) de Chou y Talalay (Adv. Enzyme Regul. 22:27, 1984) para el análisis de los datos. Un valor numérico, asignado a cada combinación de fármacos a niveles de dosificación previamente definidos, permitió comparaciones de fármaco/interacción de fármaco cuantitativas entrediferentes combinaciones de fármacos. Los resultados se expresaron como Índices de combinación (lV) frent al nivel del efecto, donde el nivel del efecto representaba el porcentaje de inhibición del crecimiento celular. Se promedió el IC medio ± ETM para cada nivel a lo largo de tres experimentos. Se consideró sinergia un IC < 1,0, avidez un IC = 1,0, y antagonismo un lC > 1,0. Los valores presentados son la media ± ETM para cada nivel de efecto, promediando tres análisis independientes.
La combinación de CAS-024 con vincristina o fludarabina, fue sinérgica (IC < 1,0) y la combinación de CAS-024 y doxorrubicina fue aditiva (IC no significativamente diferente de 1,0). Ninguna de las combinaciones de CAS-024 y agentes quimioterapéuticos fue antagónica (IC >1,0) a todos los niveles de efecto. Por lo tanto, la combinación de CAS-024 con cada uno de los tres agentes quimioterapéuticos sometidos a ensayo no des-sensibilizó las células diana a la inhibición del crecimiento inducida por fármacos, pero en lugar de eso dio como resultado efectos inhibidores sinérgicos o aditivos sobre el crecimiento de las células diana. Una realización preferida sería la combinación de CAS-024 (SEQ ID NO: 253) con vincristina o fludarabina. Estos datos indican que la eficacia de los agentes quimioterapéuticos establecidos aumenta cuando se utilizan combinados con CAS-024.
EJEMPLO 10
RESULTADOS DE LA FASE CLÍNICA 1/2 PRELIMINAR
Como se ha mantenido en la presente memoria, los estudios pre-clínicos han demostrado que las moléculas SMIP CD37 median una eliminación significativamente mayor de las células con leucemia linfocítica crónica (LLC) directa y mediada por células asesinas naturales (NK) en comparación con otros anticuerpos terapéuticos utilizados en la LLC. Por consiguiente, se ha iniciado un estudio de aumento de la dosis a escala, abierto de fase 1/2 en pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) recurrente.
Los pacientes con LLC o linfoma linfocítico de células pequeñas (LLP) recurrentes/refractarios que tenían una función orgánica adecuada, > 30.000 plaquetas/mm3 fueron los candidatos. Se estudiarán seis dosis y dos programas diferentes (cohortes 1 -10). Las dosis planeadas oscilan entre 0,03 mg/kg y 10 mg/kg IV una vez a la semana durante 4 dosis (cohortes 1-6 y 9). El segundo programa (cohorte 7, 8, y 10) someterá a ensayo 3,0, 6,0, o 10,0 mg/kg los días 1, 3 y 5 la primera semana seguido de 3 dosis semanalmente. El aumento y la disminución de las dosis a escala se basa en los grados de toxicidad de la Common Toxicity Criteria Adverse Events (CTC AE). Los pacientes pueden recibir 2 ciclos adicionales, si hay un efecto biológico positivo después del primer ciclo.
Resultados: Hasta la fecha, se han inscrito 22 pacientes (cohorte 1-7 y 9) y han completado el tratamiento (todos recibieron fludarabina previa, y tratamiento con rituximab). Seis pacientes entraron en un segundo ciclo y dos pacientes entraron en un tercer ciclo. Los pacientes que estaban siendo tratados han pasado por numerosos regímenes previos (p. ej., en la Cohorte 4 los pacientes tenían de 6 a 10 (mediana 6) y en la Cohorte 5 tenían de 5 a 13 (mediana 9,5) regímenes previos). Ocho de los diez tienen rasgos genómicos de alto riesgo [del(17p13.1), n=5 y del(11q22.3), n=3]. No se produjeron toxicidades ni eventos adversos graves limitantes de la dosis. Se observó una toxicidad suave por la infusión (grado 1 -2) en tres pacientes. Comenzando con la dosis de 0,3 mg/kg, los ocho pacientes demostraron evidencia de actividad biológica incluyendo los pacientes con del(17p13.1). Dos pacientes tuvieron un aclaramiento parcial de leucemia cutis, y la reducción de la mediana en el recuento de linfocitos periféricos fue del 64% (véase la Figura 5). Un paciente presento una reducción del 99% en el recuento de linfocitos periféricos sin eventos adversos graves y una respuesta continua después de 3 meses de tratamiento (véase la Figura 6). Un paciente presentó un incremento en la hemoglobina del 40% y una reducción en el tamaño de los ganglios linfáticos del 36% determinada mediante Tomografía Axial Computarizada y continuó respondiendo después de 3 meses de tratamiento (véase la Figura 7). Dos pacientes tuvieron un incremento significativo en el recuento de plaquetas.
Conclusión: Hasta la fecha, esta molécula SMIP para CD37 es un tratamiento bien tolerado con una toxicidad infusional mínima y sin toxicidad limitante de la dosificación observada. También parece haber una implicación del complemento pues los pacientes con caídas graves en los recuentos de linfocitos no muestran signos de síndrome de lisis tumoral. Se ha observado ya una reducción esperanzadora en los recuentos sanguíneos de linfocitos tumorales, una reducción en el tamaño de los ganglios linfáticos/bazo, un aclaramiento de la leucemia cutis, y/o un aclaramiento parcial de la enfermedad medular, y/o una mejora en la función hematopoyética normal en pacientes con alto riesgo de LLC genómica a dosis bajas, no saturantes de moléculas SMIP para CD37.
EJEMPLO 11
EFICACIA IN VITRO DE CAS024 COMBINADA CON BENDAMUSTINA Este estudio se realizó para determinar los efectos de CAS024, bendamustina, y la combinación de CAS024 y bendamustina sobre células Rec-1 (una línea celular de linfoma de las células del manto) y SU-DHL-6 (una línea de linfoma de células grandes difuso).
Se utilizaron las siguientes líneas celulares humanas que expresaban CD37: Rec-1 y SU-DHL-6 (ambas de DSMZ, Braunschweig, Alemania). Se adquirió Bendamustina (TREANDA®) de la Farmacia de la Universidad de Washington (Seattle, WA) y se disolvió en PBS y se almacenó a -20oC hasta su uso.
Las células Rec-1 y SU-DHL-6 se cultivaron en placa a 1 x 104 células/pocillo en 100 μL de medio en placas de fondo redondo de color negro, paredes de color negro y 96 pocillos. Las células se trataron con diferentes concentraciones de CAS024 que habían sido incubadas previamente con anti-F(ab)'2 de IgG humana y las placas se incubaron durante 96 hr a 37oC, con 5% de CO2 en presencia de diluciones seriadas de bendamustina. El volumen final de cada pocillo fue de 150 μL. Después de la incubación, las placas se enfriaron a la temperatura ambiente y se marcaron con 100 μL/pocillo de reactivo de detección ATPIite (Perkin Elmer, Boston, MA). El análisis mide el ATP celular como marcador de células viables. Las muestras se analizaron mediante detección de la luminiscencia utilizando un lector de placa Topcount NXT (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los datos se redujeron utilizando un ajuste de las curvas de 4 parámetros en Prism (versión 4.0, Graphpad Software, San Diego, CA) y se definió la CI50 como la concentración que da como resultado una inhibición del 50% en comparación con los cultivos no tratados. Para la determinación de la sinergia se utilizó el método del Efecto Mediana/Índice de Combinación (IC) para el análisis de datos (Chou y Talalay). Un valor numérico, asignado a cada combinación de fármacos a los niveles de dosificación definidos previamente, permite las comparaciones de fármaco/interacción de fármaco cuantitativas entre las diferentes combinaciones de fármacos. Los valores de IC asignan interacciones en tres categorías: sinergismo, aditividad, y antagonismo (lC<1,0, =1, o >1,0 respectivamente). Después del marcaje y la reducción de datos, sedeterminaron los valores de los Índices de Combinación (lC) utilizando el paquete de programas Calcusyn (Biosoft, Cambridge, RU). Los resultados de dos experimentos separados demuestran que la combinación de CAS024 con bendamustina da como resultado efectos inhibidores sinérgicos sobre el crecimiento de las células diana (véase, la Figura 11). Se obtuvieron resultados similares que demuestran que la combinación de CAS024 con bendamustina también inhibe sinérgicamente el crecimiento de las células SU-DHL-6.
También se determinaron los efectos de la combinación de CAS-024 con otro agente alquilante, clorambucilo, utilizando el método descrito más arriba y las concentraciones se muestran en la Figura 12. A diferencia de la bendamustina, el clorambucilo combinado con CAS-024 no dio como resultado efectos inhibidores sinérgicos sobre el crecimiento de las células SU-DHL-6 (véase, la Figura 13)
EJEMPLO 12
EFICACIA DE CAS024 COMBINADO CON BENDAMUSTINA EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE TUMOR HUMANO
Este estudio se realizó para comparar la eficacia de CAS024 combinado con bendamustina frente a cada agente administrado individualmente contra xenoinjertos de tumor humano DOHH2 subcutáneo en ratones SCID.
Establecimiento de los xenoinjertos de tumor y clasificación en grupos de tratamiento. Como se ha descrito más arriba, DOHH2 es una línea de células linfoblastoides B humanas CD20+CD37+ derivada de un paciente con linfoma folicular. Se inyectaron 5 millones de células DOHH2 subcutáneamente en el flanco de ratones SCID CB-17 hembra. El día 8 después de la inoculación del tumor, resultaban evidentes tumores palpables en la mayor parte de los ratones. Los ratones portadores de tumores fueron clasificados en cinco grupos con volúmenes tumorales medios equivalentes (n=15 por grupo; 3 jaulas de 5 ratones para cada grupo). El día de la clasificación se definió como día
0. Los diámetros de los tumores se determinaron con un par de calibres y los volúmenes de los tumores se calcularon utilizando la fórmula: V = 1/2 [longitud x (anchura)2]. El volumen del tumor medio de la línea base fue de 231 mm3, el tamaño tumoral de la línea base de la mediana fue de 229 mm3, y el intervalo fue de 201 a 261 mm3.
Tratamiento in vivo. Los grupos de ratones fueron tratados con una inyección de 0,2 mL de PBS que contenía 10 μg de hulgG (días 0, 4, 8 IV), 10 μg de CAS024 (días 0, 4, 8 IV), 10 mg/kg de Bendamustina (0, 2, 4, 7, 9 IP), o 10 μg de CAS024 (días 0, 4, 8 IV) y 10 mg/kg de Bendamustina (0, 2, 4, 7, 9 IP).
Control y criterios de valoración. Los ratones fueron controlados diariamente mediante inspección visual. Los pesos fueron determinados semanalmente, y los diámetros de los tumores se determinaron al menos 3 veces por semana (L, X, V) por medio de un observador ciego (véase más arriba) para los grupos de tratamiento. Los volúmenes de los tumores se calcularon como se ha descrito más arriba.
Los ratones fueron sometidos a eutanasia si el volumen de sus tumores alcanzaba más de 1.500 mm3 (o 1200 mm3 los Viernes). La muerte no fue el criterio de valoración en este estudio, y a menos que se indique de otro modo, la &quot;supervivencia&quot; de un ratón estuvo determinada por el momento en que fue sometido a eutanasia debido a que el volumen de su tumor alcanzaba los límites determinados previamente. Los ratones fueron sometidos a eutanasia si el volumen de su tumor excedía los parámetros indicados más arriba, se producía la ulceración del tumor, el tumor inhibía la movilidad del ratón, o si la pérdida de peso excedía el 20%.
Análisis estadísticos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism. Se determinaron las diferencias significativas en los volúmenes tumorales medios y los volúmenes tumorales relativos medios se determinaron utilizando un ANOVA de una vía para datos no paramétricos (Test de Kruskal-Wallis) con un Post-Test de comparación múltiple de Dunn. Las diferencias significativas en la supervivencia de los ratones
5 fueron determinadas utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier con un test de logaritmo del rango para comparar las curvas de supervivencia. Se determinaron las diferencias significativas en la incidencia de ratones libres de tumores utilizando el Test exacto de Fisher, los valores de p <0,05 se consideraron significativos.
En los grupos tratados con Bendamustina se observaron pelajes desaliñados y diarrea que comenzaron alrededor del día 6. El día 10, un ratón del grupo de tratamiento con CAS024 + Bendamustina fue sometido a eutanasia debido
10 a una pérdida de peso > 20 %. Este ratón fue tratado como un dato censurado para el análisis de las curvas de supervivencia. No se observaron signos clínicos de toxicidad en el grupo de tratamiento con CAS024 solo.
Todos los tratamientos, demostraron un efecto inhibidor sobre el crecimiento de DOHH2 en comparación con hulgG. El día 13 (que fue el último día que todos los ratones estuvieron vivos) el volumen tumoral medio y el volumen tumoral relativo medio de todos los grupos de tratamiento fueron estadísticamente diferentes de los del grupo de
15 ratones de control con hulgG (Figuras 14A y 4B). También se observó una diferencia significativa en los volúmenes tumorales medios y los volúmenes tumorales relativos medios entre el grupo de tratamiento con Bendamustina y el de CAS024 + Bendamustina combinados. No hubo diferencias significativas en los volúmenes tumorales medios o los volúmenes tumorales relativos medios entre otros dos grupos de tratamiento cualesquiera. Los volúmenes tumorales medios a lo largo del tiempo de los cuatro grupos se muestran en la Figura 15.
20 Los tumores en los ratones tratados con hulgG crecieron rápidamente, y todos los ratones de este grupo fueron sometidos a eutanasia el día 17. Como se muestra en la Figura 16 y se resume en las Tablas 12 y 13, la supervivencia de los ratones a los que se había administrado una dosis con cualquiera de los grupos de tratamiento se prolongó en comparación con el grupo tratado con hulgG (p < 0,0001 para todos los grupos). También hubo una diferencia significativa entre las curvas de supervivencia de los tres grupos de tratamiento y entre sí siendo superior
25 la combinación de CAS024/bendamustina a cualquier agente individual.
Ninguno de los ratones tratados con hulgG permaneció con viva (por consiguiente ninguno estaba libre de tumores) al final del estudio (día 34) (Figura 17 y Tabla 12). La incidencia de ratones libres de tumores en los otros grupos fue de 0/15 (0%) en el caso de los grupos de tratamiento con CAS024 y Bendamustina y de 2/14 (14%) en el grupo de tratamiento combinado con CAS024 + Bendamustina. No hubo diferencia significativa en la incidencia de ratones
30 libres de tumores entre ninguno de los grupos de tratamiento.
Tabla 12.
Tiempo Medio de Supervivencia e Incidencia de Ratones Libres de Tumores al final del Período de Observación Este estudio demuestra que CAS024 combinado con Bendamustina mostró efectos inhibidores sobre el crecimiento de tumores DOHH2 en ratones SCID mayores que los observados con cualquiera de los agentes solos.
Grupo de Tratamientoa
Días de Tratamiento Tiempo Medio Supervivencia (Días)a Incidencia Libres de Tumores al Final del Estudio
hulgG
Días 0, 4, 8 15 0/15 (0%)
CAS024 10 μg
Días 0, 4, 8 17b 0/15 (0%)
Bendamustina 10 mg/kg
Días 0, 2, 4, 7, 9 17 0/15 (0%)
CAS024 + Bendamustina
Días 0, 4, 8, 0, 2, 4, 7, 9 24 2/14 (14%)d
a La &quot;supervivencia&quot; de un ratón se determinó por el día que fue sometido a eutanasia debido al crecimiento del tumor. Un ratón del grupo con la combinación CAS024 + Bendamustina fue sometido a eutanasia el día 10 debido a una pérdida de peso > 20%. Este ratón se trató como un dato censurado cuando se calcularon las curvas de supervivencia. Ningún otro ratón fue sometido a eutanasia por razones que no fueran que el volumen de su tumor alcanzara el límite predeterminado. b Los valores en negrita indican que las curvas de supervivencia del grupo indicado son significativamente diferentes de las del control con hulgG control (p<0,0001 para todos los grupos de tratamiento; Test del logaritmo del rango). c Los ratones &quot;libres de tumores&quot; no tienen tumores SC palpables. La ausencia de células tumorales no fue confirmada por la histología. El estudio terminó el día 34. d En el grupo con la combinación CAS024 + Bendamustina un ratón fue sometido a eutanasia el día 10 debido a una pérdida de peso > 20%. Ningún otro ratón fue sometido a eutanasia por razones de toxicidad.

Tabla 13. Valores para la Comparación de las curvas de supervivencia entre los Grupos Tratados
Valores de p para la Comparación de las curvas de supervivencia (Test del logaritmo del rango)
huIgG
TRU-016 Bendamustina TRU-016+Bendamustina
huIgG
NA <0,0001 <0,0001 <0,0001
TRU-016
<0,0001a NA 0,0050 0,01
Bendamustina
<0,0001 0,0050 NA <0,0001
TRU-016 + Bendamustina
<0,0001 0,01 <0,0001 NA
Estos y otros cambios pueden ser realizados en las realizaciones a la luz de la descripción detallada anterior. En general, en las siguientes reivindicaciones, no se debe considerar que los términos utilizados limitan las reivindicaciones a las realizaciones específicas descritas en la memoria y en las reivindicaciones, si no que se debe considerar que incluyen todas las posibles realizaciones junto con el alcance total de los equivalentes a los cuales se dirigen dichas reivindicaciones. Por consiguiente, las reivindicaciones no están limitadas por la descripción.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Trubion Pharmaceuticals, Inc. Tan, Phillip Simon, Sandy A. Cerveny, Charles G. Nilsson, Christy Anne Brady, William Ledbetter, Jeffrey A. Hayden-Ledbetter, Martha S. Thompson, Peter A. Morales, Cecile
<120> AGENTE INMUNOTERAPÉUTICO PARA CD37 Y COMBINACIÓN CON UN AGENTE QUIMIOTERAPÉUTICO BIFUNCIONAL DEL MISMO
<130> 910180.420PC
<140> PCT
<141> 10-04-2009
<150> US 61/190,067
<151> 11-04-2008
<160> 269
<170> Patentln versión 3.3
<210> 1
<211> 1510
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> proteína de unión específica a CD37
<400> 1
<210>
2
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
proteína de unión específica a CD37
<400>
2
<210> <400> 000
3 3
40
<210>
4
<400>
4
000
<210>
5
<211>
1482
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
proteína de unión específica a CD37
<400>
5
<210>
6
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
6
<210>
7
<211>
1482
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
7
<210>
8
<211>
493
<212>
PRT
45
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
8
<210>
9
<211>
1482
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
9
<210>
10
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
10
<210>
11
<211>
1482
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
11
<210>
12
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
12
<210>
13
<211>
1482
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
13
<210>
14
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
14
<210>
15
<211>
1482
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
15
<210>
16
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
16
<210> <211> <212> <213>
17 1479 ADN Secuencia artificial
63
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
17
<210> 18
<211> 492
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
18
<210>
19
<211>
1479
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
19
<210>
20
<211>
492
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
20
<210>
21
<211>
1479
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
21
<210> <211> <212> <213>
22 492 PRT Secuencia artificial
<220> <223>
Proteína de unión específica a CD37
71
<400> 22
<210>
23
<211>
1503
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
23
<210>
24
<211>
500
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
24
<210> <211> <212> <213>
25 1488 ADN Secuencia artificial
77
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
25
<210> 26
<211> 495
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
26
<210>
27
<211>
1503
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
27
<210>
28
<211>
500
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
28
<210>
29
<211>
1479
84
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
29
<210>
30
<211>
492
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
30
<210>
31
<211>
1479
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
31
<210>
32
<211>
492
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
32
<210>
33
<211>
1479
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
33
<210> <211> <212> <213>
34 492 PRT Secuencia artificial
<220> <223>
Proteína de unión específica a CD37
92
<400>
34
<400>
42
<210>
35
<211>
1479
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
35
<210>
36
<211>
492
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
36
<210>
37
<211>
1476
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
37
<210> <211> <212> <213>
38 492 PRT Secuencia artificial
99
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
38
<210>
39
<211>
1476
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
39
<210>
40
<211>
492
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
40
<210>
41
<211>
1476
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
41
<210> <211> <212> <213>
42 492 PRT Secuencia artificial
<220> <223>
Proteína de unión específica a CD37
106
<210>
43
<211>
1476
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
43
<210>
44
<211>
492
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
44
<210>
45
<211>
1482
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
45
<210>
46
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
46
<210>
47
<211>
1500
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
47
<210>
48
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
48
<210>
49
<400>
49
000
<210>
50
<400>
50
000
<210>
51
<211>
1381
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
51
<210>
52
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
52
<210> 53
<400> 53 000
<210> 54
<400> 54 000
<210> 55
<400> 55 000
<210> 56
<400> 56 000
<210> 57
<400> 57 000
<210> 58
<400> 58 000
<210> 59
<400> 59 000
<210> 60
<400> 60 000
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CDR
<400> 61
<210>
62
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
62
<210>
63
<211>
5
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
63
<210>
64
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
64
<210>
65
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
65
<210>
66
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
66
<210>
67
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223> CDR
<400> 67
<210>
68
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
68
<210>
69
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
69
<210> 70
<400> 70 000
<210> 71
<400> 71 000
<210> 72
<400> 72 000
<210> 73
<400> 73 000
<210> 74
<400> 74 000
<210> 75
<400> 75 000
<210> 76
<400> 76 000
<210> 77
<400> 77 000
<210> 78
<400>
78
000
<210>
79
<211>
1500
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
79
<210> <211> <212> <213>
80 493 PRT Secuencia artificial
<220>
128
<223> Proteína de unión específica a CD37
<400>
80
<400>
84
<210>
81
<211>
1494
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
81
<210>
82
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
82
<210>
83
<211>
1476
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
83
<210> <211> <212> <213>
84 485 PRT Secuencia artificial
<220> <223>
Proteína de unión específica a CD37
135
<210>
85
<211>
1494
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
85
<210> <211> <212> <213>
86 493 PRT Secuencia artificial
139
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
86
<210>
87
<211>
1494
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
87
<210>
88
<211>
493
<212>
PRT
143
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
88
<210> 89
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 89 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgtccaccgt gccca
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 90
<210> 91
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 91 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgtccaccgt gccca
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 92 <223> Región bisagra
<210>
93
<211>
45
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<400> 93 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgtccaccgt gctca
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 94
<210> 95
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 95 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgtccaccga gctca
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 96
<210> 97
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 97 45
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccga gccca
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 98 <210> 99
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 99
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccga gctca
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 100
<210> 101
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 101
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccgt gccca
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 102
<210> 103
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 103 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccgt gctca
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
104
<210> 105
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 105 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gccca
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 106
<210> 107
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 107 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gctca
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 108 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccga gccca
<210>
109
<211>
45
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
109
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 110
<210> 111
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 111 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccga gctca
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 112
<210>
113
<400>
113
000
<210>
114
<400>
114
000
<210>
115
<211>
19
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
115
<210> 116
<211> 6
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
116
<210>
117
<211>
186
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
117
<210>
118
<211>
62
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
118
<210>
119
<211>
45
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 119 gagcccaaat cttctgacac acctccccca tgcccacggt gcccc
<210> 120
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 120
<210> 121
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 121 gagcccaaat cttgtgacac acctccccca tccccacggt cccca
<210> 122
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 122
<210> 123
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 123 gagcccaaat cttctgacac acctccccca tccccacggt cccca
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 124
<210> 125
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400> 125 gagcccaaat cttgtgacac acctccccca tccccacggt gccca
<210> 126
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región bisagra
<400>
126
<400>
150
<400>
159
<400>
163
<210>
127
<211>
58
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
127
<210>
128
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
128
<210>
129
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
129
<210>
130
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
130
<210>
131
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
131
<210>
132
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
132
<210>
133
<211>
5
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
133
<210>
134
<211>
5
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
134
<210>
135
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
135
<210>
136
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
136
<210>
137
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
137
<210>
138
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
138
<210>
139
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
139
<210>
140
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
140
<210>
141
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
141
<210>
142
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
142
<210>
143
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
143
<210>
144
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
144
<210>
145
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
145
<210>
146
<211>
30
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
146
<210>
147
<211>
14
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
147
<210>
148
<400>
148
000
<210>
149
<400>
149
000
<210>
150
<211>
14
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<210>
151
<211>
14
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
151
<210>
152
<400>
152
000
<210>
153
<400>
153
000
<210>
154
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
154
<210>
155
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
155
<210>
156
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
156
<210>
157
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
157
<210>
158
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
158
<210>
159
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<210>
160
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
160
<210>
161
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
161
<210>
162
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
162
<210>
163
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<210>
164
<400>
164
000
<210>
165
<400>
165
000
<210>
166
<400>
166
000
<210>
167
<400>
167
000
<210>
168
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
168
<210>
169
<211>
11
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
169
<210>
170
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
170
<210>
171
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
171
<210>
172
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
172
<210>
173
<400>
173
000
<210>
174
<400>
174
000
<210>
175
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
175
<210> 176
<400>
176
<400>
180
<400>
191
<210>
177
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
177
<210>
178
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
178
<210>
179
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
179
<210>
180
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<210>
181
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
181
<210>
182
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
182
<210>
183
<400>
183
000
<210>
184
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
184
<210>
185
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
185
<210>
186
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
186
<210>
187
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
187
<210>
188
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
188
<210>
189
<400>
189
000
<210>
190
<400>
190
000
<210>
191
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<210>
192
<400>
192
000
<210>
193
<400>
193
000
<210>
194
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
194
<210>
195
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
195
<210>
196
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
196
<210>
197
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
197
<210>
198
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
198
<210>
199
<400>
199
000
<210>
200
<400>
200
000
<210>
201
<400>
201
000
<210>
202
<400>
202
000
<210>
203
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
203
<210>
204
<400>
204
000
<210>
205
<211>
32
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
205
<210>
206
<211>
10
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
206
<210>
207
<211>
10
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
207
<210> 208
<211> 10 <210> 213
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
208
<210>
209
<211>
10
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
209
<210>
210
<211>
10
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región marco
<400>
210
<210>
211
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
211
<210>
212
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
212
<211> 7 <210> 218
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
213
<210>
214
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
214
<210>
215
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
215
<210>
216
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
216
<210>
217
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
217
<211> 7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
218
<210>
219
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
219
<210>
220
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
CDR
<400>
220
<210>
221
<211>
1530
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
221
<210>
222
<211>
503
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
222
<210>
223
<211>
23
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia conectora
<400>
223
<210>
224
<211>
20
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia conectora
<400>
224
<210>
225
<211>
16
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia conectora
<400>
225
<210>
226
<211>
16
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia conectora
<400>
226
<210> 227
<211> 16
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia conectora
<400>
227
<210>
228
<211>
16
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia conectora
<400>
228
<210>
229
<211>
25
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia conectora
<400>
229
<210>
230
<211>
5
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia bisagra
<400>
230
<210>
231
<211>
16
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia bisagra
<400>
231
<210>
232
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia bisagra
<400>
232
<210>
233
<211>
17
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia bisagra
<400>
233
<210>
234
<211>
18
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia bisagra
<400>
234
<210>
235
<211>
18
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Secuencia bisagra
<400>
235
<210>
236
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena ligera
<400>
236
<210>
237
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena ligera
<400>
237
<210>
238
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena ligera
<400>
238
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región variable de cadena ligera
<400> 239
<210>
240
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena ligera
<400>
240
<210>
241
<211>
116
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena pesada
<400>
241
<210>
242
<211>
116
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena pesada
<400>
242
<210>
243
<211>
116
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena pesada
<400>
243
<210>
244
<211>
116
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena pesada
<400>
244
<210>
245
<211>
116
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región variable de cadena pesada
<400>
245
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Regiones CH2 y CH3 de IgG1 humana
<400>
246
<400>
260
<210>
247
<211>
473
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
247
<210>
248
<211>
473
185
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
248
<210>
249
<211>
473
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
249
<210>
250
<211>
473
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
250
<210>
251
<211>
480
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
251
<210>
252
<211>
472
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
252
<210>
253
<211>
483
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
253
<210>
254
<211>
473
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
254
<210>
255
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
255
<210>
256
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
256
<210>
257
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
257
<210>
258
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
258
<210>
259
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
259
<210>
260
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<210>
261
<211>
15
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Región bisagra
<400>
261
<210>
262
<211>
493
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
262
<210>
263
<211>
10
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
263
<210> 264
<211>
4
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
264
<210>
265
<211>
4
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
265
<210>
266
<211>
473
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
266
<210>
267
<211>
473
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
267
<210> <211> <212> <213>
268 473 PRT Secuencia artificial
<220> <223>
Proteína de unión específica a CD37
201
<400> 268
<210>
269
<211>
473
<212>
PRT
<213>
Secuencia artificial
<220>
<223>
Proteína de unión específica a CD37
<400>
269

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una molécula de unión específica a CD37, que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO. 253.
  2. 2.
    Una molécula de unión específica a CD37 de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 253.
  3. 3.
    Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de unión específica a CD37 humanizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  4. 4.
    Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.
  5. 5.
    Una célula anfitriona que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 4.
  6. 6.
    Una composición que comprende una molécula de unión específica a CD37 humanizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  7. 7.
    Una molécula de unión de la reivindicación 1 o 2 o la composición de la reivindicación 6 para su uso en terapia.
  8. 8.
    Una molécula de unión específica a CD37 humanizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para su uso en un método para reducir las células B o tratar una enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B.
  9. 9.
    Una molécula de unión de la reivindicación 8, donde la enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B es un linfoma de las células B, una leucemia de células B, un mieloma de células B, una enfermedad caracterizada por la producción de auto-anticuerpos, o una enfermedad caracterizada por la estimulación inapropiada de las células B asociada con una ruta de las células B.
  10. 10.
    La molécula de unión de la reivindicación 9, donde la enfermedad caracterizada por la producción de autoanticuerpos es la miopatía inflamatoria idiopática, la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, la miastenia grave, la enfermedad de Graves, la diabetes melitus de tipo I, la enfermedad de la membrana del basamento antiglomerular, la glomerulonefritis de progreso rápido, la enfermedad de Berger (nefropatía IgA), el lupus eritematoso generalizado (LEG), la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa, la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), el síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, la neuromielitis óptica, la esclerosis múltiple, una enfermedad autoinmunitaria, la dermatomiositis, la polimiositis, o la macroglobinemia de Waldenstrom.
  11. 11.
    La molécula de unión de la reivindicación 9, donde la enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B es la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma no Hodgkins (LNH), la leucemia de las células pilosas, el linfoma linfocítico de células pequeñas, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma esplénico de la zona marginal, el linfoma de células B de la zona marginal extra-nodal de tipo tejido linfoide asociado a la mucosa (TLAM), el linfoma de células B de la zona marginal nodal, el linfoma folicular, el linfoma de las células del manto, el linfoma de células B grandes difuso, el linfoma de células B grandes de mediastino (tímico), el linfoma de células B grandes intravascular, el linfoma de efusión primaria, o el linfoma/leucemia de Burkitt.
  12. 12.
    El uso de la molécula de unión específica a CD37 humanizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para la fabricación de un medicamento para su uso en un método para reducir las células B o tratar una enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B.
  13. 13.
    El uso de la reivindicación 12, donde la enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B es un linfoma de células B, una leucemia de células B, un mieloma de células B, una enfermedad caracterizada por la producción de auto-anticuerpos, o una enfermedad caracterizada por la estimulación inapropiada de las células T asociada con una ruta de las células B.
  14. 14.
    El uso de la reivindicación 13, donde la enfermedad caracterizada por la producción de auto-anticuerpos es la miopatía inflamatoria idiopática, la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, la miastenia grave, la enfermedad de Graves, la diabetes melitus de tipo I, la enfermedad de la membrana del basamento anti-glomerular, la glomerulonefritis de progreso rápido, la enfermedad de Berger (nefropatía IgA), el lupus eritematoso generalizado (LEG), la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa, la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), el síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, la neuromielitis óptica, la esclerosis múltiple, una enfermedad autoinmunitaria, la dermatomiositis, la polimiositis, o la macroglobinemia de Waldenstrom.
  15. 15.
    El uso de la reivindicación 13, donde la enfermedad asociada con la actividad aberrante de las células B es la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma no Hodgkins (LNH), la leucemia de las células pilosas, el linfoma linfocítico de células pequeñas, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma esplénico de la zona marginal, el linfoma de células B de la zona marginal extra-nodal de tipo tejido linfoide asociado a la mucosa (TLAM), el linfoma de células B de la zona marginal nodal, el linfoma folicular, el linfoma de las células del manto, el linfoma de células B grandes difuso, el linfoma de células B grandes de mediastino (tímico), el linfoma de células B grandes intravascular, el linfoma de efusión primaria, o el linfoma/leucemia de Burkitt.
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