ES2370659T3 - Sistema para recuento de bacterias y determinación de su susceptibilidad a los antibióticos. - Google Patents

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Abstract

Un método para recuento de bacterias suspendidas en un fluido, en que una porción de dicho fluido se filtra para excluir partículas mayores que dichas bacterias y una muestra de la porción filtrada se pone en una cubeta que tiene al menos una ventana iluminada con un haz de luz coherente y colimado, comprendiendo el método las etapas de: i. medir repetidamente a una velocidad de repetición predefinida la intensidad de luz dispersada por la muestra a al menos dos ángulos diferentes de dispersión, ii. calcular representaciones gráficas de diferencia de las mediciones de intensidad de la luz a cada uno de los diferentes ángulos de dispersión a los que se mide la intensidad de la luz, comprendiendo cada representación gráfica de diferencia los valores absolutos de diferencias entre niveles de intensidad de luz medidos en dos momentos de tiempo o diferentes al mismo ángulo de dispersión y iii. igualar cada una de dichas representaciones gráficas de diferencia con una curva de calibración para proporcionar una estimación de la concentración de las bacterias en la muestra.

Description

Sistema para recuento de bacterias y determinaci6n de su susceptibilidad a los antibi6ticos
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invenci6n se refiere en general a ensayar fluidos biol6gicos. En particular, la presente invenci6n se 5 refiere a ensayar 6pticamente la orina para detectar bacterias y determinar su susceptibilidad a los antibi6ticos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Fluidos biol6gicos tales como la orina, fluidos amni6ticos, pleurales, peritoneales y cefalorraqufdeos se someten a veces a ensayo por la presencia de bacterias. Como etapa complementaria, se puede requerir determinar la susceptibilidad de tales bacterias infecciosas a los antibi6ticos para idear un plan de tratamiento si se detecta una
10 infecci6n. Metodos analfticos comunes implican cultivo y o microscopfa, requieren expertos y llevan tiempo y recursos. Normalmente, medicos y veterinarios tienen que esperar dfas para recibir resultados del laboratorio que determinen si un ser humano o un individuo animal esta infectado con bacterias y recomiende el antibi6tico como lo mas apropiado para el tratamiento requerido.
Un metodo para determinar la susceptibilidad bacteriana a agentes antibi6ticos que requiera menos tiempo se
15 explica en "Light scattering methods for antibiotic sensitivity tests", por J. Murray, P. Evans y D. W. L. Hukins, en J. Clin Pathol, (1.980) 33, 995-1.001. Este metodo se basa en la observaci6n de que el angulo de luz dispersada de una muestra de fluido que contiene bacterias cambia despues de que se anade un agente antibi6tico adecuado al fluido examinado. Se cultivan simultaneamente dos muestras del mismo fluido, una de las cuales es un agente antibi6tico. El tiempo de cultivo como se describe es significativamente mayor que la vida media de la proliferaci6n
20 bacteriana y es preferiblemente aproximadamente 90 minutos. Se realizan mediciones de dispersi6n de la luz por un intervalo angular amplio (incluyendo dispersi6n posterior) para ambas muestras mediante un fot6metro de dispersi6n de la luz diferencial. Se calculan parametros representativos, tal como un parametro de desplazamiento que es proporcional al area de separaci6n entre las representaciones graficas de perfiles de dispersi6n angular de las dos muestras dividido por el intervalo angular. Los valores de tales parametros se equiparan con una escala de
25 calibraci6n para determinar la susceptibilidad de las bacterias a un agente antibi6tico especffico. Sin embargo los resultados de implantar este metodo no son satisfactorios ya que se indica que se obtuvo al menos 20% de discrepancia entre ensayos usando el metodo descrito comparado con un metodo comun de incubaci6n y microscopfa.
Ademas de los metodos de cultivo comunes, se ha desarrollado una serie de tecnicas adicionales para la
30 determinaci6n de la presencia de bacterias en fluidos, incluyendo, por ejemplo, tiras de ensayo para investigaci6n de infecci6n del tracto urinario (UTI, por sus siglas en ingles), basadas en el ensayo de la presencia de productos en la muestra creada por infecci6n bacteriana tal como nitrito. Sin embargo, el metodo mencionado falla a la hora de detectar bacterias que no generan productos especfficos. El metodo requiere alta concentraci6n bacteriana en la muestra examinada y por lo tanto tal procedimiento de investigaci6n tiende a una sensibilidad insuficiente y una
35 especificidad relativamente baja.
La solicitud de patente internacional WO 06018839 A2 describe un sistema y un metodo para detectar y contar bacterias en tales fluidos biol6gicos. El metodo descrito incluye las etapas de: (1) retirar partfculas mas grandes en tamano que las bacterias por filtraci6n de una muestra del fluido; (2) medir la intensidad de la luz dispersada del fluido filtrado en uno o mas puntos desplazados del eje del rayo de luz iluminador; (3) asociar un perfil de dispersi6n 40 con las medidas de dispersi6n; (4) comparar el perfil de dispersi6n asociado con perfiles de dispersi6n de referencia almacenados; (5) la concentraci6n bacteriana se determina por el recuento respectivo relacionado con el perfil de dispersi6n de referencia que mejor se adapte al perfil de dispersi6n asociado. Los perfiles basicos almacenados segun el metodo descrito consisten en perfiles de dispersi6n medida y o calculada promediada de manera estadfstica relacionados con muestras calibradas de fluidos filtrados y o combinaciones lineales de tales perfiles.
45 Tambien se describe una cubeta especialmente apta para tal medici6n de dispersi6n de la luz. Obviamente tal metodo puede reducir significativamente el tiempo y laboratorio asociado con la detecci6n de infecci6n bacteriana, sin embargo la susceptibilidad de las bacterias detectadas a los antibi6ticos queda sin resolver.
En la patente de EE.UU. 6.861.230 se describe un metodo para ensayar el crecimiento caracterfstico de las bacterias incluyendo ensayar la susceptibilidad bacteriana a un agente antibi6tico. Este metodo combina cultivar una 50 muestra de fluido y mediciones de luminiscencia de la muestra cultivada. En una fase de preparaci6n se cultiva una muestra del fluido que contiene el agente antibi6tico durante un rato para generar un nivel de referencia de adenilato cinasa libre. Se determina la susceptibilidad bacteriana comparando los niveles de adenilato cinasa libre medidos repetidamente de manera que: se realiza una primera medici6n; despues se anade el agente antibi6tico a la muestra
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examinada, que despues de una demora de preferiblemente quince minutos se hace una segunda medici6n. El nivel de adenilato cinasa aumenta en casos en que las bacterias son susceptibles al agente antibi6tico. El metodo descrito se indica que es sensible incluso en casos en que la concentraci6n bacteriana en el fluido examinado es considerablemente bajo y o la segunda medici6n del nivel de adenilato cinasa se retrasa por un intervalo de tiempo que es mas corto que el intervalo de tiempo preferido. Sin embargo su implantaci6n requiere qufmica humeda, cultivo y el uso de equipo relativamente sofisticado.
Por lo tanto, es beneficioso un metodo de investigaci6n rapido y que ahorre laboratorio que pueda obviar una cantidad significativa de trabajo costoso y que exija tiempo en la realizaci6n de los ensayos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es una presentaci6n esquematica de una medici6n de dispersi6n de la luz segun la presente invenci6n;
La Fig. 2 es un diagrama de bloques que describe un sistema para detectar y contar bacterias y determinar su susceptibilidad a los antibi6ticos segun el metodo de la presente invenci6n;
La Fig. 3A es una vista en secci6n longitudinal de una cubeta para detectar bacterias segun una realizaci6n preferida del metodo de la presente invenci6n;
La Fig. 3B es una vista en secci6n longitudinal de una cubeta para detectar bacterias segun otra realizaci6n preferida del metodo de la presente invenci6n;
La Fig. 4 es un diagrama de flujo que describe un procedimiento para detectar y contar bacterias y determinar su susceptibilidad a los antibi6ticos segun una realizaci6n preferida de la presente invenci6n;
La Fig. 5 es una imagen de puntos simulada de una muestra de orina sintetica que contiene bacterias;
La Fig. 6 muestra perfiles de intensidad-tiempo ejemplares calculados para bacterias en un movimiento;
La Fig. 7 es un grafico que presenta distribuciones de frecuencia ejemplares de la intensidad dependiente del tiempo de luz dispersada calculada para un pfxel de una imagen de puntos;
Las Figs 8A y 8B muestran respectivamente un perfil de intensidad - angulo de dispersi6n - tiempo de una muestra de orina que contiene E-coli y una muestra de orina que contiene partfculas de PMMA;
La Fig. 8C muestra perfiles de intensidad -tiempo medidos a uno de los pfxeles mostrados en las Figs 8A;
La Fig. 9A muestra graficos ejemplares de perfiles de dispersi6n estandar, un perfil de dispersi6n asociado a intensidades medidas de luz dispersada por una muestra de orina y un perfil de dispersi6n adaptado, como una funci6n del angulo de dispersi6n;
Las Figs 9B y 9C muestran respectivamente representaciones graficas diferentes calculadas en dos puntos diferentes en el tiempo empleando medidas de luz dispersada de una muestra ejemplar que contiene E-coli;
La Fig. 9D muestra un perfil de tiempo de un derivado promedio ejemplar de la concentraci6n de dispersores en el tiempo, calculado para una muestra ejemplar que contiene E-coli;
Las Figs 10A y 10B muestran respectivamente perfiles de intensidad con velocidad unidireccional constante y por partfculas con la misma velocidad unidireccional que se mueven simultaneamente en un movimiento Browniano.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCION
De acuerdo con la presente invenci6n, se proporciona un metodo para detectar y contar bacterias suspendidas en un fluido. El procedimiento segun la invenci6n emplea primero filtrado mecanico de una muestra de un fluido examinado seguido por medici6n de intensidades de luz dispersada por la muestra filtrada previamente a y despues de una introducci6n de un agente antibi6tico. La filtraci6n proporciona exclusi6n de partfculas cuyos tamanos exceden del tamano de las bacterias para evitar problemas de distribuci6n potencial de la luz. Las muestras de fluido se toman de individuos normalmente recibidas en un laboratorio para investigar las bacterias, tal como asociado a
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hospitales y o estudios clfnicos. Los fluidos examinados segun la invenci6n incluyen pero no se limitan a fluidos biol6gicos, tales como orina, fluidos amni6tico, pleural, peritoneal y cefalorraqufdeo. La muestra recibida o la muestra de fluido, no requiere ser cultivada o tratada de manera qufmica previamente al ensayo segun el metodo de la invenci6n.
Se hace referencia primero a la Fig. 1, que muestra esquematicamente un montaje para medici6n de dispersi6n de la luz segun la invenci6n. Un rayo de luz coherente, colimado en un volumen de haces confinado por 10 de luz, ilumina las partfculas 12 suspendidas en un fluido contenido en la cubeta 14. El punto 16 situado en una cara del detector 18 de luz esta separado aparte del eje 20 6ptico por una distancia indicada por la doble disposici6n 22. La luz dispersada por partfculas en un volumen por el que se propaga la luz iluminadora se acumula coherentemente para proporcionar la intensidad de luz medida en el punto 16. Tales partfculas son partfculas 12, u otras partfculas suspendidas de manera similar en el fluido. Otras posibles dispersiones son discontinuidades internas presentes en,
o partfculas situadas en, ventanas 26 y o las paredes de la cubeta 14. Los medios 28 para ocultar la luz evitan que cualquier luz de iluminaci6n directa alcance el detector 18 de luz, referido de ahora en adelante por imagenes de puntos.
Dinamicade una imagen de puntos
Las imagenes de puntos varfan en el tiempo debido a movimiento Browniano y o motilidad bacteriana. El valor medio de la magnitud de una velocidad de las bacterias que se mueven en un movimiento Browniano esta tfpicamente en el intervalo de unas decenas de micr6metros por segundo (Im/s) pr6ximo a 1 Im/s. Una longitud tfpica de un intervalo de tiempo en que tales bacterias "olvidan" su direcci6n es aproximadamente 10 segundos. Las bacterias m6viles pueden nadar sustancialmente linealmente a una velocidad que es significativamente mayor y esta mas alla del intervalo de movimiento Browniano. El movimiento de las bacterias m6viles se interrumpe de manera caracterfstica por periodos de reposo en que las bacterias se dan la vuelta y cambian aleatoriamente su direcci6n de movimiento. Ademas, las bacterias quimiotacticas m6viles pueden moverse hacia concentraciones mayores de atractores y evitar concentraciones mayores de repelentes por sensibilidad a cambios temporales en concentraciones quimio-efectoras. (Una explicaci6n ejemplar de motilidad de las bacterias y quimiotaxis se proporciona en: "Motile behavior of bacteria", H. C. Berg, Phys. Today, (enero de 2.000), http://www.aip.org./pt/jan00/berg.html.) Las bacterias m6viles tambien se pueden mover a lo largo de un gradiente de temperaturas en lo que se conoce como termotaxis.
Caracteristicas del sistema
Ahora se hace referencia a la Fig. 2 que muestra esquematicamente el sistema 40. La luz emitida de una fuente 42 de luz coherente, tal como una fuente de luz, pasa por un colimador 44 y el rayo colimado entra en la cubeta 46.La luz dispersada por partfculas en una cubeta 46 se enfoca mediante lentes 48 simples o compuestas convergentes para formar imagenes por la cara de la disposici6n 50del detector de luz. Los medios 52para ocultar la luz bloquean el rayo de iluminaci6n. La unidad 54 receptora controla el detector 50, recibe, acondiciona y digitaliza senales inducidas por la luz dispersada y las almacena temporalmente. El procesamiento y la unidad 56 de control proporciona el control del procedimiento de ensayo, recibiendo datos y comandos del operario, encendiendo la fuente 42 de luz y la unidad 54 receptora, leyendo las senales almacenadas temporalmente en una 54 receptora y llevando a cabo tratamiento de senales y datos. Los resultados de los ensayos y los mensajes a un operario se muestran en una pantalla del operario, no mostrada. Las claves de entrada dedicadas unidas a procesamiento y la unidad 56 de control, no mostrado, proporcionan datos de entrada y o comandos al sistema. El procesamiento opcional y la unidad 56 de control transmite datos y resultados de ensayo y recibe datos y comandos de un ordenador remoto. El colimador 44 consta de una lente 58 simple o compuesta y uno o mas diagramas 60que contienen una abertura.
Se hace referencia a las Figs 3A y 3B que muestran vistas de secciones longitudinales de una cubeta para determinar la susceptibilidad de las bacterias a agentes antibi6ticos segun dos realizaciones del metodo de la presente invenci6n, respectivamente. Se disponen medios 70 para ocultar la luz en la superficie interna de la ventana 72 de la cubeta 74. El diafragma 76 cuya abertura es coaxial con medios 70 de oscurecimiento se dispone internamente adyacente a la ventana 78. La cubeta 90 es especialmente adecuada para ensayos de investigaci6n en que se presenta quimiotaxis. Un medio de oscurecimiento y un diafragma con una abertura se disponen internamente dentro de la cubeta 90 como se describi6 anteriormente. El compartimento 92 para contener un quimio-efector adecuado que sea un atractor o un agente repelente conocido esta confinado entre el divisor 94 y la pared lateral 96 de la cubeta 90. El divisor 94 tiene una pared lateral 96enfrentada a la pared porosa y una cubierta m6vil enfrentandose a una unidad 98 de flujo luminoso, no mostradas ninguna de las dos. La cubierta movible cuando se pone evita cualquier transferencia de material contenido en el compartimento 92 en la unidad de flujo luminoso 98. la pared porosa esta firmemente unida a la cubeta 90, proporcionando transferencia del reactivo qufmico contenido en el compartimento 92 y disolviendose en, o mezclandose con, el fluido contenido en la unidad de flujo luminoso 98. Regular la temperatura de una o mas paredes laterales opuestas de la cubeta 74 se efectua induciendo un gradiente de temperaturas por la muestra de fluidos proporcionando un movimiento termotactico.
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Las cubetas tales como la cubeta 74 o 90 estan montadas tfpicamente junto con un alojamiento externo que incluye medios de alineaci6n que proporcionan alineaci6n a la cubeta con el eje 6ptico del sistema. Tal alojamiento tiene una entrada para el compartimento 92 de carga con un reactivo qufmico adecuado y otra unidad de flujo luminoso 96 de carga o la unidad de flujo luminoso de la cubeta 74 con un fluido filtrado y o un agente antibi6tico. Opcionalmente, se proporciona un alojamiento de la cubeta con un filtro que tiene poros que no son mas pequenos que los tamanos de las bacterias.
Los componentes de una cubeta se hacen de materiales tales como resinas de plastico utilizadas tfpicamente para fabricar envases desechables para lfquidos. Tales materiales que son insolubles en los fluidos examinados y son pasivos desde el punto de vista qufmico a los reactivos qufmicos y o el agente antibi6tico utilizado durante el ensayo. Las ventanas son transparentes en un intervalo de longitudes de onda que contienen la longitud de onda o longitudes de onda de la fuente de luz. Las ventanas estan hechas, por ejemplo, de plastico usado tfpicamente para fabricar lentes 6pticas, vidrio o cuarzo. La homogeneidad de fndices de refracci6n de la ventana, es decir las variaciones en el fndice de refracci6n dentro de la ventana, no excede de 0,0001. El valor de la rafz cuadrada media de la rugosidad superficial de las ventanas no excede de 1 man6metro. Son preferibles ventanas con una cualidad 6ptica de sus superficies definidas por un numero de raya/marca de 40/20 o menor. Segun la invenci6n, las ventanas hechas de plastico o vidrio cuya anchura no excede de 0,5 milfmetros es un ejemplo viable. La homogeneidad 6ptica del volumen de la ventana y o su rugosidad superficial hace impacto en la relaci6n senal a ruido de una intensidad medida de la luz dispersada y a su vez la sensibilidad del sistema.
Cubetas tales como la cubeta 74 se emplean tfpicamente para investigar bacterias que no son movibles y se refieren de ahora en adelante como cubetas del primer tipo. Las cubetas con un compartimento para contener repelentes o atrayentes tales como la cubeta 90 se refieren de ahora en adelante como cubetas del segundo tipo. Se describen mas caracterfsticas de las cubetas en el numero de publicaci6n de la solicitud internacional de las cuales es WO 06018839 A2 incorporada en la presente memoria como referencia.
El metodo de la presente invencian
Normalmente se emplea una cubeta del primer tipo para recuento de bacterias y determinaci6n de susceptibilidad bacteriana a los antibi6ticos. Ahora se hace referencia a la Fig. 4 que muestra un organigrama de un procedimiento de recuento de bacterias y determinaci6n de su susceptibilidad a los antibi6ticos segun una realizaci6n preferida de la presente invenci6n. Tal procedimiento incluye las siguientes etapas: una etapa 108 de iniciaci6n en que el sistema y el programa de ensayo se inician; una etapa 110 de preparaci6n en que se filtran muestras del fluido y se cargan en las cubetas de ensayo; una etapa 112 de iniciaci6n de ensayo en que se introduce una cubeta de ensayo en el sistema y se detectan las bacterias y se recuentan; en la etapa 114 se introduce manualmente un agente antibi6tico en la cubeta de ensayo; en la etapa 116 se realizan repetidamente mediciones de dispersi6n de la luz y se procesan; en la etapa 118 el sistema comprueba si los ensayos referidos a las muestras actuales de fluidos estan completados; en la etapa 120 el sistema comprueba si se tiene que empezar el ensayo del siguiente agente antibi6tico; en la etapa 121 el sistema comprueba si se ha completado el ensayo del agente antibi6tico actual; en la etapa 122 se ensaya la cubeta de control relacionada con la muestra actual de fluidos y el sistema comprueba en la 124 si hay mas muestras de fluidos esperando a ser ensayadas; el procedimiento termina en la etapa 126.
El procedimiento empieza en la etapa 108 encendiendo de manera manual la unidad de procesamiento y control por la que se activa el sistema. Los datos de entrada del operario relacionados con el plan de los ensayos y con las muestras, tales como la identidad del fluido examinado y el numero total de muestras que se tiene que Nt. La unidad de procesamiento y control inician automaticamente el programa de operaci6n de ensayo y el mensaje al operario para proporcionar datos relevantes. Una cola del agente antibi6tico segun una lista actualizada manualmente de agentes antibi6ticos que son adecuados para el fluido examinado se almacena en una memoria de la unidad de procesamiento y control. Al final de esta etapa de iniciaci6n el sistema esta (STD BY) y espera mas comandos. Mientras tanto el operario continua manualmente en una etapa 110 de preparaci6n (PREP) en que realiza las siguientes actividades: (a) filtrar de manera mecanica una muestra de fluido (b) llenar respectivamente con porciones del fluido filtrado una serie de cubetas. Este numero excede del numero de agentes antibi6ticos que se tienen que investigar al menos por uno sirve de control. Las cubetas restantes son las cubetas de ensayo cada una de las cuales se dedica a uno de los agentes antibi6ticos. Alternativamente, tales porciones del fluido bruto se presurizan por un filtro instalado en el alojamiento de las cubetas para llenarlas. En la etapa 112 de iniciaci6n del ensayo (TINIT) una cubeta de ensayo que contiene un fluido filtrado se introduce de manera manual y se alinea con el sistema. Siguiendo un comando de "inicio" del manual el sistema activa automaticamente la fuente de luz (cuando se examina la primera cubeta de ensayo de la primera muestra de fluidos) y se ponen en marcha los relojes para medir el tiempo; y recibe repetidamente para un primer intervalo T1 de tiempo predefinido una serie de imagenes de puntos discretas a una velocidad de repetici6n predefinida CPS1. Despues el sistema proporciona un mensaje al operario para introducir una dosis del primer agente en la cola actual de agentes antibi6ticos en esta cubeta examinada. Mientras tanto las imagenes de puntos recibidas son procesadas de manera automatica para "recuento de bacterias" como se describe ademas mas adelante. Los resultados del procesamiento se almacenan en una memoria de la unidad de procesamiento y control. Entonces el sistema se detiene automaticamente y espera un primer comando de "continuar" para iniciar la etapa 116.
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El operario que recibe el mensaje continua en paralelo a la etapa 114 en que introduce manualmente una dosis calibrada adecuadamente de agente antibi6tico en la cubeta examinada actualmente. El operario ordena al sistema que continue la etapa 116 para realizar mediciones de dispersi6n repetidas (RSM).
El sistema recibe imagenes de puntos discretas a lo largo del mismo intervalo T1 de tiempo y a la misma velocidad CPS1. estas imagenes de puntos son procesadas para determinar las susceptibilidad bacteriana a los antibi6ticos como se describe ademas mas adelante y los resultados se almacenan de acuerdo con esto. En la etapa 118 el sistema compara el valor de T, que es el tiempo transcurrido puesto que se ha introducido el tiempo como un comando de "inicio" en un segundo intervalo T2 de tiempo. T2 iguala un tercer intervalo T3 de tiempo, multiplicado por el numero de agentes antibi6ticos que se tienen que ensayar en el procedimiento actual. En un caso en que este tiempo transcurrido T es mas pequeno que T2 el sistema va a la etapa 120 en que compara el valor de T con el tercer intervalo de tiempo predefinido T3 Si T es menor que T3 el programa continua a la etapa 121 en que comprar el valor de TT con T3. TT designa el tiempo transcurrido o desde el momento en que se entr6 el ultimo comando "continuar" o desde el final del ultimo intervalo T1 de tiempo en que se recibi6 sucesivamente una serie de imagenes de puntos discretas. En un caso en que TT es mas corto que T3 el sistema espera un momento y va de nuevo a la etapa 118. De otro modo, el sistema vuelve a la etapa 116. En un caso en que T excede T3 el operario recibe el mensaje de ir a la etapa 114 y cambiar la cubeta de ensayo actual por la siguiente y continuar ensayando el siguiente agente antibi6tico. Entonces el programa espera un comando de "continuar" en la etapa 116. En un caso de que T no sea menor T2 el sistema envfa el mensaje al operario de cambiar entre la cubeta de ensayo medida en este momento y la respectiva cubeta de control e introducir un comando de "recuento de control" cuando se complete dicho cambio. El sistema procesa las mediciones de dispersi6n y determina los agentes antibi6ticos a que son susceptibles las bacterias como se describe ademas mas adelante. Entonces el sistema espera el comando de "recuento de control". Despues de este comando el sistema recibe automaticamente imagenes de puntos discretas a lo largo del mismo intervalo T1 de tiempo y a la misma velocidad de repetici6n CPS1 y procesa estas imagenes para un "recuento bacteriano de control" como se describe ademas mas adelante y almacena los resultados en una memoria de la unidad de procesamiento y control.
Los resultados del ensayo incluyendo recuento de bacterias y el agente o agentes antibi6ticos a los que las bacterias son susceptibles se almacenan en la unidad de procesamiento y control y tambien se muestran al operario. En casos excepcionales, tales como los casos en que las discrepancias entre el compuesto intermedio y o los resultados finales que sean mayores que un umbral predefinido, se envfa mensaje al operario para repetir parcial o completamente el procedimiento de ensayo de acuerdo con esto. Entonces el programa vuelve automaticamente a la etapa 110. De otro modo, el programa continua a la etapa 124 en que el sistema comprueba si el numero N de ensayos completados con exito es mas pequeno que el numero total de muestras de fluido NT. En un caso en que haya mas muestras esperando ser ensayadas el sistema envfa mensaje al operario para continuar partiendo de la etapa 110. Mientras tanto el sistema espera un comando de "empezar" para cambiar a la etapa 112. De otro modo el proceso se completa en la etapa 126 despues de que se transmitan opcionalmente los datos completos a un ordenador remoto.
Procesamiento de se�ales � datos
La senal de fondo originada por partfculas suspendidas en la muestra de fluido que son mayores que las de bacterias se excluyen por filtrado mecanico segun el metodo de la presente invenci6n. Sin embargo, hay fuentes y dipersores de luz distintos de las bacterias que pueden contribuir a una senal de fondo estacionaria. Tales senales son originadas tfpicamente por partfculas estacionarias presentes dentro del espacio iluminado, impurezas de la fuente de luz, defectos en, y o partfculas que contaminan, los componentes 6pticos. Por lo tanto se computa una representaci6n grafica de diferencia para excluir fondo estacionario segun una realizaci6n preferida de la presente invenci6n. La intensidad medida en cada pfxel de una imagen de puntos se sustrae de la intensidad medida en el mismo pfxel de una imagen de puntos precedente para formar una representaci6n grafica de diferencia. La representaci6n grafica de diferencia es una imagen que tiene el mismo numero y disposici6n de los pfxeles a partir de una imagen de puntos, cuyas intensidades igualan los valores absolutos de las respectivas diferencias. Por lo tanto una represtaci6n grafica de diferencia s6lo muestra los componentes dependiendo del tiempo de la intensidad de luz dispersada por el fluido examinado.
Se promedia una serie de tales representaciones graficas de diferencia en el tiempo y o en una regi6n en una o dos dimensiones de angulos de dispersi6n para formar un derivado promediado de la concentraci6n de dispersores en el tiempo. Obviamente, las representaciones graficas de diferencia y los derivados promediados son mas suaves que las imagenes de puntos y la velocidad en que cambian en el tiempo principalmente depende de la velocidad en que cambia la concentraci6n de dispersores no estacionarios. Tfpicamente el intervalo dinamico de representaciones graficas y derivados promediados es mas pequeno que el intervalo dinamico de las respectivas imagenes de puntos y su relaci6n senal a ruido es mejor.
Para detectar y recontar las bacterias segun una realizaci6n preferida de la presente invenci6n primero se asocia un perfil de dispersi6n a un derivado promediado computado para las imagenes de puntos mas tempranas recibidas cuando se examina una cubeta de ensayo. Tal asociaci6n se consigue por ejemplo por una tecnica de ajuste
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numerico comun. Alternativamente, un numero de las imagenes de puntos mas tempranas recibidas para una cubeta de ensayo se promedia de manera similar en el tiempo y o en una regi6n angular de una o dos dimensiones. se asocia un perfil de dispersi6n a tal es imagenes de puntos promediadas empleando ajuste numerico comun de curvas o superficies tridimensionales. Despues se compara el perfil de dispersi6n asociado con perfiles de dispersi6n estandar almacenados en el sistema. La concentraci6n de bacterias en el fluido examinado iguala la concentraci6n del perfil de dispersi6n estandar que mejor se ajusta al perfil de dispersi6n asociado.
Para determinar la susceptibilidad de las bacterias a un agente antibi6tico, se compara un valor promedio de al menos dos derivados promediados computados primero para una cubeta de ensayo, inmediatamente despues de la introducci6n de un agente antibi6tico, con un promedio del mismo numero de derivados promediados computados para imagenes de puntos recibidas unos minutos mas tarde, preferiblemente despues de mas de 5 minutos. Se determina el agente antibi6tico para el que la diferencia entre estos derivados promediados es mayor.
En un recuento de control el ensayo segun la invenci6n incluye las etapas de detecci6n de bacterias y determinaci6n de su concentraci6n. El ensayo se realiza considerando el tiempo transcurrido desde el examen de la primera cubeta de ensayo, como se describi6 anteriormente.
Se preparan perfiles de dispersi6n calibrados segun la invenci6n por perfiles de dispersi6n promediados de manera estadfstica medidos o computados para muestras calibradas de fluidos que contienen, y muestras sin, bacterias. Los perfiles de dispersi6n estandar incluyen perfiles de dispersi6n calibrados y combinaciones lineales de perfiles calibrados. Los perfiles de dispersi6n calibrados y o perfiles de dispersi6n estandar se almacenan previamente en el sistema. Mas caracterfsticas de los perfiles calibrados y perfiles estandar asf como una descripci6n mas detallada de tecnicas de ajuste se describen en la solicitud de patente WO 06018839 A2.
E�emplo 1
Se realiz6 un analisis simulado de imagenes de puntos. Se prepar6 un modelo sintetico de orina en que esferas de 2 -4 Im de diametro con la misma constante dielectrica que las de las bacterias representan bacterias. Las partfculas se distribuyen aleatoriamente en un medio uniforme que corresponde a una disoluci6n acuosa de sal. Esferas aleatoriamente distribuidas cuyo radio es menor que un micr6metro y con una correspondiente constante dielectrica representan partfculas de sal. La orina sintetica esta contenida en un cilindro que tiene un diametro de 0,5 milfmetros (mm) y una altura de 55 mm. Este cilindro conforma un volumen de separaci6n entre la abertura del diafragma 76 y un medio 70 para ocultar la luz dentro de la cubeta 74 mostrado en la Fig. 3A a la que se hace referencia de nuevo. Las partfculas se iluminan de manera coherente (espacialmente y temporalmente) tal como por medio de diodo laser. La intensidad de luz dispersada medida en un punto por la cara del detector de luz se calcula empleando un trazador de rayos coherente en que la intensidad en la cara de la partfcula de dispersi6n conforma la distribuci6n angular de dispersi6n segun la teorfa de Mie. �H. C. van de Hulst. "Light scattering by small particles", editorial John Wiley � Sons, NY, 1.957�.
Ahora se hace referencia a la Fig. 5 que muestra una imagen de puntos calculada tal como es recibida por un cuadrante de una disposici6n del detector planar. La intensidad de la luz dispersada como se muestra en la Fig. 5 disminuye con el angulo de dispersi6n conformal con la distribuci6n angular de dispersi6n segun la teorfa de Mie. La frecuencia espacial de los puntos aumenta con el angulo de dispersi6n a medida que un numero mayor de partfculas, que se distribuyen aleatoriamente, contribuye al patr6n de interferencia de los puntos.
E�emplo 2
Se realiza un analisis de la dinamica de una imagen de puntos simulada empleando los mismos modelos ffsicos y aproximaciones que se describe en el EJEMPLO 1 anterior. Ahora se hace referencia a la Fig. 6 que muestra comportamientos temporales ejemplares de la intensidad de la luz dispersada calculada en un punto de la cara del detector de luz. Este punto esta espaciado 1 mm aparte del eje 6ptico del sistema. Las partfculas suspendidas en la orina sintetica se mueven en direcciones distribuidas uniformemente a velocidades con magnitudes distribuidas normalmente. La representaci6n grafica 130 muestra un perfil de intensidad -tiempo simulado en que el valor medio de la magnitud de las velocidades es 0,25 Im/s. La representaci6n grafica 132 muestra otro perfil de intensidad -tiempo simulado en que el valor medio de la magnitud de las velocidades es 5 Im/s. La intensidad de la senal recibida por el detector de luz en este punto se mide en unidades arbitrarias (U. A.). El tiempo se da en segundos (S). La escala de la intensidad de la senal es lineal y la Representaci6n grafica 132 se desplaza aparte de la representaci6n grafica 130 (para fines graficos). Las partfculas que se mueven a velocidades mayores ocasionan que un segmento de la imagen de puntos resultante cambie y oscile a una velocidad mayor que un segmento similar inducido por partfculas mas lentas. Mientras las partfculas fijadas espacialmente dan como resultado una imagen de puntos estacionaria.
Ahora se hace referencia a la Fig. 7 que muestra distribuciones de frecuencia ejemplares de la magnitud dependiente del tiempo de una senal recibida en el mismo punto que en la Fig. 6. Las partfculas se mueven en el fluido a velocidades con direcciones distribuidas de manera uniforme y magnitudes distribuidas normalmente. Las
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representaciones graficas 140 � 146 muestran las distribuciones de frecuencia que corresponden a valores medios de 0,25, 0,50, 2,5 y 7,5 Im/s respectivamente. Las frecuencias se miden en Hertz (Hz) y las intensidades de las senales medidas en U. A. se representan graficamente empleando escala logarftmica. Por lo tanto las partfculas que se mueven activamente, tales como bacterias m6viles cuyas velocidades son considerablemente mayores que las velocidades tfpicamente asociadas al movimiento Browniano, se pueden investigar por un sistema de la invenci6n. Ademas, de acuerdo con el metodo de la presente invenci6n un tiempo de exposici6n preferible en que se muestrea una imagen de puntos en tales mediciones de dispersi6n es considerablemente menor que un ciclo de tiempo tfpico resultante de la distribuci6n de frecuencia asociada con el movimiento Browniano.
E�emplo 3
Un equipo ejemplar que muestra las caracterfsticas del metodo y el sistema de la invenci6n relacionado con la dinamica de la luz dispersada de fluidos que contienen bacterias se describe a continuaci6n. Se toman dos muestras de la misma muestra de orina, que estan exentas de bacterias. Se introduce una cantidad calibrada de E-coli en una de estas muestras, de manera que la concentraci6n bacteriana en la muestra es 106 unidades formadoras de colonias por mililitro (CFU/ml). Se introduce una cantidad de partfculas pf de un tamano de 2 Im en la otra muestra de orina, de manera que la concentraci6n de las partfculas iguale la concentraci6n bacteriana de la primera muestra. Estas partfculas se hacen de poli(metacrilato de metilo) (PMMA). Las dos muestras se filtran de manera mecanica para excluir partfculas mayores que 5 Im. Se examinan las muestras con un sistema para recuento de bacterias de la invenci6n cuya fuente de luz consiste en un diodo laser de 650 man6metros (nm) con una potencia de 0,2 milivatios (mw) y un diametro del haz de 0,5 mm. Un sensor CMOS sirve como detector de la luz. Las muestras de fluido se cargan en cubetas del primer tipo tales como las cubetas 74 mostradas en la Fig. 3A a las que se hace referencia de nuevo. Las dimensiones del espaciamiento del volumen iluminado de fluido entre la abertura del diafragma 76 y los medios 70 que ocultan la luz son los mismos que se describieron anteriormente.
Ahora se hace referencia a las Figs 8A � 8C. En la Fig. 8A se muestran las intensidades de las senales de luz dispersada por la muestra incluyendo E-coli. Las senales recibidas por un segmento de una fila de pfxeles dispuestos por la cara del detector de luz; se muestrean peri6dicamente a una velocidad de 300 Hz a lo largo de un intervalo de tiempo de un segundo. En la Fig. 8B se muestran las intensidades de las senales de luz dispersada por la muestra incluyendo partfculas de PMMA. La senal es recibida por el mismo segmento de pfxeles y se muestrea de manera similar y se representa graficamente como en el caso mostrado en Fig. 8A. La magnitud de la intensidad medida se representa por el color de las representaciones graficas que oscilan del negro para intensidad cero a blanco para la intensidad maxima medida. Cualquier punto a lo largo de una lfnea que es paralela al eje 148 corresponde al mismo momento del tiempo, mientras que cualquier lfnea paralela al eje 149 corresponde al mismo angulo de dispersi6n o el mismo pfxel en el segmento de la fila de pfxeles.
Una serie de lfneas casi horizontales cuyo color cambia peri6dicamente a una velocidad moderada se muestra en la Fig. 8B. Tal comportamiento temporal corresponde a una distribuci6n de frecuencia sustancialmente estrecha de la intensidad dependiente del tiempo de la luz dispersada. Tal comportamiento es tfpico en los casos en que las partfculas tales como las partfculas de PMMA se mueven en un movimiento Browniano. Las bacterias E-coli son m6viles y son capaces de moverse a velocidades significativamente mayores. Por lo tanto, la correspondiente distribuci6n de la frecuencia es considerablemente mas amplia en que mayores frecuencias tienen una contribuci6n considerable en hacer parecer la Fig. 8A ruidosa y puntiaguda.
Los perfiles intensidad -tiempo relacionados con estas dos muestras se muestran en la Fig. 8C. Las intensidades de una senal recibidas en un pfxel ejemplar (que es uno de los pfxeles asociados a la generaci6n de la Fig. 8A�, e miden en unidades arbitrarias. La escala de intensidad es lineal y el tiempo se mide en segundos (S). La representaci6n grafica 150 corresponde a la muestra que incluye E-coli mientras la representaci6n grafica 152 a la muestra que incluye partfculas de PMMA. La representaci6n grafica 150 se desplaza aparte de la representaci6n grafica 152 (por fines graficos). Las frecuencias considerablemente mayores inducidas por la motilidad bacteriana contribuyen significativamente al comportamiento temporal de la representaci6n grafica 150. Mientras las frecuencias considerablemente bajas en el intervalo de unos Hertz inducidas por el movimiento Browniano de las partfculas de PMMA proporcionan la dependencia del tiempo moderada de la representaci6n grafica 152. Ayudado por tales representaciones graficas de la intensidad como en las Figs 8A �8C un operador puede seleccionar un tiempo de exposici6n y una velocidad de muestreo en que se tienen que recibir las imagenes de puntos.
E�emplo 4
Se describe a continuaci6n un experimento que demuestra caracterfsticas de un metodo para procesamiento de datos segun una realizaci6n preferida de la presente invenci6n. Se prepara una muestra calibrada ejemplar de orina que E-coli. El sistema empleado en este experimento se describe en el ejemplo 3 anterior. Despues del procedimiento descrito en la etapa 110 y siguientes mostrado en la Fig. 4 a la que se hace referencia de nuevo, se hacen las siguientes actividades. Primero una muestra tomada de esta muestra se filtra de manera mecanica para excluir partfculas cuyos tamanos exceden de 5 Im. Despues se llena con una porci6n del fluido filtrado la primera cubeta de ensayo, que es una cubeta del primer tipo. Se pone la cubeta y se alinea y se hacen mediciones de
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dispersi6n de luz para detectar y recontar bacterias.
Se hace referencia ahora a las Figs 9A � 9C. En la Fig. 9A se muestran respectivamente dos perfiles de dispersi6n calibrados ejemplares de una serie de perfiles calibrados y los perfiles de dispersi6n medidos e igualados de esta muestra de orina. La curva 156 representa el perfil de dispersi6n calibrado de orina no infectada. La curva 158 representa uno de los perfiles de dispersi6n calibrados de orina que contiene bacterias a un nivel de concentraci6n bacteriana especffico. La curva 159 representa el perfil de dispersi6n igualado a la muestra examinada. Los cfrculos representan valores del perfil de dispersi6n asociado como se mide. La lfnea continua representa la combinaci6n lineal mejor ajustada de perfiles de dispersi6n calibrados que representan orina que contiene bacterias a una concentraci6n de 105 CFU/ml. Un nivel considerablemente alto de igualaci6n se demuestra por un intervalo significativo de angulos de dispersi6n. El nivel detectado de concentraci6n bacteriana en esta muestra examinada se desvi6 del nivel de referencia por un porcentaje.
En esta fase se introduce una dosis de gentamicina de manera que su concentraci6n en la cubeta de ensayo iguala el 1%. En las Figs 9B y 9C se muestran respectivamente dos representaciones graficas de diferencias computadas siguiendo la introducci6n del agente antibi6tico en esta cubeta de ensayo. Se emplean dos imagenes de puntos recibidas sucesivamente en dos momentos diferentes de tiempo separadas por al menos 20 milisegundos (ms) para cada representaci6n grafica de diferencia. Las representaciones graficas de diferencia se computan sustrayendo el primero de cada par de estas imagenes de puntos del segundo. En la Fig. 9B se muestra una representaci6n grafica de diferencia deriv6 inmediatamente siguiendo a la introducci6n de los antibi6ticos, mientras la Fig. 9C muestra una representaci6n grafica de diferencia derivada 30 minutos mas tarde. Aunque los niveles de las senales en ambas representaciones graficas de diferencia es relativamente baja, se ven claramente los puntos en Fig. 9B mientras la Fig. 9C muestra un nivel considerablemente mas suave. Una reducci6n significativa en la concentraci6n de dispersores no estacionarios ha tenido lugar como resultado de la introducci6n de un agente antibi6tico adecuado. Se promedian representaciones graficas de diferencia en el tiempo a lo largo de un intervalo de tiempo preespecificado y o en los angulos de dispersi6n por un intervalo angular de una o dos dimensiones preespecificado segun la presente invenci6n, para proporcionar un derivado promedio de la concentraci6n de dispersores en el tiempo. El comportamiento temporal de derivado promediado asociado con esta muestra que contiene E-coli se muestra como referencia a Fig. 9D. En la Fig. 9D se muestran valores del derivado promediado normalizado por su valor maximo representado frente al tiempo medido en minutos (MIN). Se demuestra una reducci6n significativa (de unas decenas por ciento) en los valores del derivado promediado unos minutos antes de la introducci6n de los antibi6ticos.
E�emplo 5
Se realiza un analisis de la contribuci6n de la quimiotaxis y o termotaxis a la dinamica de una imagen de puntos simulada. Se emplearon los mismos modelos y la aproximaci6n ffsica como se describen en el EJEMPLO 1 anterior. El detector de luz modelo es un sensor CMOS bidimensional. El movimiento Browniano se modela por las velocidades de partfcula con direcciones distribuidas uniformemente y las magnitudes distribuidas normalmente con un valor medio de 0,5 Im/s. Se modelan movimientos quimiotacticos o termotacticos por una velocidad de las partfculas uniforme de 5 Im/s perpendicular al haz laser.
Ahora se hace referencia a las Figs 10A � 10B. En la Fig. 10A se muestra un perfil de intensidad - angulo de dispersi6n -tiempo tridimensional a lo largo de un segmento de una fila pfxeles. La intensidad de la luz dispersada medida en cada pfxel se representa por una escala de colores de negro y blanco; en que el negro representa intensidad cero y blanco representa la intensidad maxima medida. El tiempo de exposici6n es menor que 10 milisegundos y la velocidad de repetici6n del muestreo es 100 Hz. La longitud del segmento de la fila de pfxeles empleados para simular estos perfiles es 0,15 mm. La longitud del intervalo de tiempo a lo largo del cual se muestran las intensidades simuladas es 2 s. Se miden las intensidades mostradas a lo largo de una lfnea que es paralela al eje 160 en el mismo pfxel. Las intensidades a lo largo de una lfnea paralela al eje 162 se miden en el mismo momento del tiempo.
En la Fig. 10B un perfil de intensidad -angulo de dispersi6n -tiempo inducido por partfculas que se mueven en un movimiento Browniano y que tienen tambien el mismo componente de velocidad constante de 5 Im/s. Es distinguible un componente promediado de un movimiento colectivo unidireccional que exceda de 2 Im/s y es diferente de velocidades tfpicamente asociadas con el movimiento Browniano. Por lo tanto, tal analisis de imagenes de puntos se puede usar tambien para estudiar la dinamica de las bacterias por medio del metodo de la invenci6n.
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Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para recuento de bacterias suspendidas en un fluido, en que una porci6n de dicho fluido se filtra para excluir partfculas mayores que dichas bacterias y una muestra de la porci6n filtrada se pone en una cubeta que tiene al menos una ventana iluminada con un haz de luz coherente y colimado, comprendiendo el metodo las etapas de:
    i. medir repetidamente a una velocidad de repetici6n predefinida la intensidad de luz dispersada por la muestra a al menos dos angulos diferentes de dispersi6n,
    ii. calcular representaciones graficas de diferencia de las mediciones de intensidad de la luz a cada uno de los diferentes angulos de dispersi6n a los que se mide la intensidad de la luz, comprendiendo cada representaci6n grafica de diferencia los valores absolutos de diferencias entre niveles de intensidad de luz medidos en dos momentos de tiempo o diferentes al mismo angulo de dispersi6n y
    iii. igualar cada una de dichas representaciones graficas de diferencia con una curva de calibraci6n para proporcionar una estimaci6n de la concentraci6n de las bacterias en la muestra.
  2. 2.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que las mediciones se realizan a una pluralidad de angulos de dispersi6n para establecer un perfil de dispersi6n para la muestra.
  3. 3.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende ademas calcular una derivada promedio con respecto al tiempo de la concentraci6n estimada de bacterias.
  4. 4.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende ademas introducir un agente antibi6tico en dicha muestra de fluido filtrado previamente al comienzo de la medici6n de la intensidad de la luz.
  5. 5.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 4, que comprende ademas la etapa de esperar durante al menos un minuto despues de introducir el agente antibi6tico previamente al comienzo de la medici6n de la intensidad de la luz.
  6. 6.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende ademas la etapa de introducir un quimioefector en dicha muestra de fluido filtrado previamente a dicha medici6n.
  7. 7.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende ademas inducir un gradiente de temperatura por dicha muestra de fluido filtrado previamente al comienzo de la medici6n de la intensidad de la luz.
  8. 8.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que al menos dicha ventana se caracteriza por una caracterfstica 6ptica seleccionada de un grupo de caracterfsticas 6pticas que consiste en transparencia dentro de un intervalo de longitudes de onda que contiene una longitud de onda de dicha luz de iluminaci6n, homogeneidad del fndice de refracci6n que es mejor que 0,0001, el valor de la rafz cuadrada media de la rugosidad superficial de una cara de al menos dicha ventana no excede de 1 nan6metro, la calidad de una cara de al menos dicha ventana definida por una serie de rayas/marcas no excede 40/20 y cualquier combinaci6n de las mismas.
  9. 9.
    Un metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que la anchura de al menos dicha ventana no excede de 0,5 milfmetros.
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