ES2371202T3 - Método de diagnóstico y de seguimiento de una vaginosis bacteriana mediante cuantificación molecular. - Google Patents

Abstract

Método de diagnóstico y de seguimiento in vitro del estado de la flora bacteriana vaginal frente a la presencia de una vaginosis bacteriana y, llegado el caso, para el seguimiento de su tratamiento terapéutico, caracterizado porque - 1/ se cuantifican las concentraciones de bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis * determinando las concentraciones de secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis presentes en una sola copia en el ADN de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis respectivamente, y de una secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, en el ADN extraído de una muestra de secreción vaginal de paciente, presentando dichas secuencias específicas un tamaño inferior a 150 nucleótidos, * mediante co-amplificación enzimática de tipo PCR de dichas secuencias específicas contenidas, por un lado, en dicho ADN extraído de la muestra y, por otro lado, en unas muestras de fragmentos de ADN sintéticos que comprenden cada una de dichas secuencias específicas dichas bacterias y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica de células humanas, sirviendo dichas muestras de estándar de calibrado de cuantificación del ADN, * realizándose la detección y la cuantificación de dichos fragmentos con la ayuda de sondas marcadas de secuencias distintas de las de los cebadores de amplificación para cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, * siendo dichas secuencias específicas de dichas bacterias las secuencias siguientes, que incluyen unas secuencias de dichas sondas (subrayadas) flanqueadas por unas secuencias de dichos cebadores (en negrita) o sus secuencias complementarias: - para Atopobium vaginae: - para Gardnerella vaginalis: - 2/ se determina la presencia de una vaginosis bacteriana o el fracaso del tratamiento terapéutico en curso, con un valor predictivo positivo de por lo menos 95% y un valor predictivo negativo de por lo menos 99%, si las concentraciones de fragmentos de ADN de las dos secuencias específicas de las bacterias Atopobium vaginae y respectivamente Gardnerella vaginalis en una muestra de extracción de secreciones vaginales de paciente que contiene por lo menos 10 4 células humanas/ml, son tales que se respeta una por lo menos de las 2 condiciones a) y b) siguientes: a) la concentración Ca en dicho fragmento de ADN de Atopobium vaginae es superior o igual a 10 8 copias/ml, y b) la concentración Cg en dicho fragmento de ADN de Gardnerella vaginalis es superior o igual a 10 9 copias/ml.

Description

Método de diagnóstico y de seguimiento de una vaginosis bacteriana mediante cuantificación molecular.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico y de seguimiento in vitro del estado de la flora bacteriana vaginal frente a la presencia de una vaginosis bacteriana (VB) o de su evolución, llegado el caso para el seguimiento de su asistencia terapéutica.

Las técnicas actuales de diagnóstico de la VB, que es una infección frecuente con unas consecuencias nefastas para el embarazo, se basan en unos criterios que son poco fiables. Algunas bacterias han sido descritas como asociadas a esta enfermedad, sin haberse beneficiado jamás de una calificación y de una cuantificación molecular fiable.

Durante mucho tiempo, la VB se ha definido desde el punto de vista microbiológico por una casi desaparición de la flora vaginal normal compuesta principalmente por lactobacilos en beneficio de otras bacterias, en particular Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. y micoplasmas genitales [Spiegel CA, CMR 1991 ; Thorsen P, AJGO 1998]. La VB es un motivo frecuente de consulta médica, estando implicada en particular en la susceptibilidad a las infecciones sexualmente transmisibles tales como el VIH, y para los embarazos en la premadurez y el nacimiento de niños de bajo peso. Su prevalencia en la mujer, incluyendo durante el embarazo, se sitúa entre 8 y 23% [Guise JM, AJPM 2001] según los métodos actuales de investigación.

Sin embargo, el repaso de la bibliografía es divergente en cuanto al impacto de la asistencia terapéutica de esta patología. En efecto, los primeros estudios, que habían demostrado una reducción del riesgo de parto prematuro durante el tratamiento de la VB, no han podido ser confirmados [Morales HJ, AJOG 1994; Hauth JC, NEJM 1995; Guise JM, AJPM 2001; McDonald H, CDSR 2005; Varma R, EJOGRB 2006; Okun N, OG, 2005; Leitich H, AJOG 2003; Guerra B, EJOGRB 2006].

El objetivo inicial de la presente invención era evaluar el impacto de la VB durante el embarazo así como la eficacia de la asistencia terapéutica de la VB durante el embarazo. Pero, para ello, no estaba disponible ninguna herramienta de diagnóstico. En efecto, el estudio de la bibliografía revela una gran confusión en lo que se refiere a la asistencia terapéutica de la VB relacionada principalmente con la ausencia de herramienta racional para el diagnóstico y el seguimiento de esta patología.

Actualmente, las dos herramientas de diagnóstico disponibles son la puntuación de Nugent y los criterios de Amsel. La puntuación de Nugent es el método más mencionado habitualmente en la bibliografía, considerado por algunos como la técnica de referencia, incluso si no se realiza en rutina en los laboratorios de microbiología clínica debido a su carácter fastidioso de su realización [Fredricks DN, NEJM 2005; Thomason JL, AJOG 1992; Ison CA, STD 2002; Nugent RP, JCM 1991]. La puntuación de Nugent identifica la VB gracias a un análisis morfológico semi-cuantitativo de las bacterias después de la coloración de Gram. Por lo tanto, es una técnica subjetiva cuya reproducibilidad ha sido cuestionada [Sha BE, JCM 2005; Schwebke JR, OG 1996]. Los criterios clínicos de Amsel (pH vaginal superior a 4,5; leucorreas grisáceas homogéneas adherentes; olor nitrogenado después de la adición de KOH al 10%; presencia de clue-cells) representan el segundo enfoque de diagnóstico [Amsel R AJM 1983]. Al igual que la puntuación de Nugent, es de determinación delicada y no se utiliza en la práctica clínica habitual.

Uno de los límites más peyorativos de estos métodos diagnósticos es la ausencia de identificación de ciertos microorganismos implicados en la VB. Por un lado, la ausencia de pared de los micoplasmas no permite sus identificaciones mediante la coloración de Gram y por lo tanto sus cotizaciones mediante la puntuación de Nugent. Por otro lado, la aportación de la biología molecular ha permitido identificar nuevas bacterias que pueden estar implicadas en la VB pero su demostración mediante los 2 métodos diagnósticos existentes es imposible. Atopobium vaginae es la principal nueva especie bacteriana caracterizada. Su presencia se correlaciona con la VB en algunos artículos sin por ello se haya realizado una apreciación cuantitativa fiable de su sitio relativo con respecto a los demás microorganismos [Bradshaw CS, JID 2006, Rodriguez JM, IJSB 1999; Ferris MJ, BMCID 2004; Ferris MJ, JCM 2004; Verhelst R, BMCM 2004].

En el artículo publicado recientemente por Bradshaw et al. [Bradshaw CS, JID 2006], se describe en particular una relación entre la detección de las bacterias A. vaginae y G. vaginalis y la VB, pero estos resultados son insuficientes para realizar un diagnóstico de VB y/o un seguimiento de la evolución de una VB fiables. En efecto, los datos presentados en este estudio permiten la detección de dichas bacterias pero no su cuantificación real. Además, esta detección ha mostrado una buena sensibilidad, siendo A. vaginae y G. vaginalis detectadas respectivamente en 96% y 99% de los pacientes que padecen VB. Sin embargo, su especificidad es mala puesto que A. vaginae se detecta en 12% de los pacientes que presentan una flora normal y G. vaginalis en 60%.

Los autores han intentado entonces un enfoque denominado "semi-cuantitativo" clasificando las cargas bacterianas como bajas o elevadas mediante la comparación de los CT ("Cycle Treshold") medianos de detección de los microorganismos en el seno de todas las muestras analizadas. Así, los autores han estimado una carga mediana de 4 x 105 copias para G. vaginalis (mediana que corresponde a 21 ciclos) y 4 x 106 copias para A. vaginae (mediana

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de 18 ciclos). Las cargas elevadas de G. vaginalis (>4 x 105) y de A. vaginae (>4 x 106) estaban significativamente más presentes en los pacientes que presentan una VB con respecto a los pacientes con una flora normal. Sin embargo, estos valores presentaban una mala sensibilidad, siendo A. vaginae y G. vaginalis solamente detectadas respectivamente en 49% y 71% de los pacientes que padecen VB (tabla 1). Además, 16 pacientes (28%) con una recaída de VB después del tratamiento presentaban una concentración en G. vaginalis por debajo del umbral determinado (tabla 3). Cuarenta pacientes (70%) con una recaída de VB presentaban asimismo una concentración por debajo del umbral en A. vaginae.

El enfoque "semi-cuantitativo" de los autores no se puede aplicar por lo tanto como herramienta de diagnóstico y de seguimiento inmediato de los pacientes. De hecho, las técnicas utilizadas para obtener estos resultados eran insuficientes en varios puntos. En primer lugar, las técnicas de PCR no eran suficientemente sensibles puesto que las dianas moleculares amplificaban fragmentos demasiado largos (fragmento del ARN 16S ribosómico de 430 pares de bases para A. vaginae y de 291 pares de bases para G. vaginalis). En la actualidad, se establece que con una secuencia determinada durante una reacción de PCR tan larga, la sensibilidad es baja. Además, las técnicas de PCR en tiempo real utilizaban para la detección y la cuantificación un marcado en SybrGreen del producto de amplificación, método mucho menos específico que los que utilizan unas sondas de hidrólisis marcadas que necesitan una triple especificidad (dos cebadores más la sonda, para amplificar un fragmento cuyo tamaño no excede 120 pares de bases). Las cuantificaciones se efectúan aparentemente con un estándar variable y no en función de una gama plasmídica estable, reproducible y comparable a lo largo del tiempo. Por último, no se beneficiaban de una herramienta de control cuantitativo que permite juzgar la calidad de sus extracciones. En efecto, buscaba solamente la presencia de β-globina humana en las muestras sin cuantificarla. Por lo tanto, es muy difícil comparar cuantitativamente las muestras entre sí puesto que la variación de la cantidad de bacterias puede estar relacionada con una variación cualitativa y cuantitativa de secreciones vaginales extraídas.

La evaluación de la asistencia terapéutica de las VB no puede por lo tanto librarse de la implementación previa de una herramienta fiable adaptada al diagnóstico de la VB y al seguimiento cualitativo y cuantitativo de la flora vaginal.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico y de seguimiento de la VB al mismo tiempo más fiable, más preciso y más simple de realizar en rutina en los laboratorios de análisis microbiológico clínico.

Para ello, los inventores han estudiado las extracciones vaginales de 204 mujeres embarazadas, y han buscado la presencia de cada microorganismo implicado en la VB, desarrollando un método de PCR en tiempo real que permite la detección del ADN específico de las bacterias y la determinación de la carga bacteriana por medio de una gama plasmídica establecida gracias a la construcción de un plásmido patrón. Este plásmido comprende los fragmentos de ADN específicos de dichas bacterias a amplificar y a cuantificar y del gen de la albúmina humana utilizado como control de la calidad de la muestra de ADN y de la amplificación molecular así como de la riqueza de la muestra biológica. Los microorganismos diana estudiados (Lactobacillus sp., G. vaginalis, Mobilincus curtisii, Mobilincus Mulieris, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma bominis, A. vaginae, y Candida albicans) eran los descritos como que podían estar implicados en la VB y/o la premadurez. Los resultados de la cuantificación de los diversos microorganismos obtenidos mediante biología molecular han sido confrontados con la clasificación por la puntuación de Nugent.

Según la presente invención, se ha demostrado que la presencia de A. vaginae a partir de un cierto umbral de concentración puede estar asociada a una VB de manera muy específica y significativamente y que esta detección molecular hace que el diagnóstico resulte fácil y fiable.

La existencia de un umbral de concentración específica de la VB para la bacteria G. vaginalis ha sido demostrada asimismo según la presente invención.

Además, se ha demostrado que la asociación de las 2 bacterias a ciertas concentraciones permite el diagnóstico de VB en particular con una predictividad positiva superior a 95% y sobre todo una predictividad negativa superior a 99%.

Por otra parte, durante las VB, las bacterias del género Lactobacillus sp., normalmente presentes en la vagina, presentan una concentración que va disminuyendo y se ha demostrado según la presente invención que por debajo de un cierto umbral de concentración la cuantificación de estas bacterias Lactobacillus sp. permite diagnosticar de manera fiable una VB. Por último, se ha demostrado que una evolución de la relación de las concentraciones de Lactobacillus sp. frente a la adición de las concentraciones de A. vaginae y G. vaginalis permite evaluar la evolución de la VB de manera fiable.

Más precisamente, la presente invención proporciona un método de diagnóstico y de seguimiento in vitro del estado de la flora bacteriana vaginal frente a la presencia de una vaginosis bacteriana y, llegado el caso, para el seguimiento de su tratamiento terapéutico, caracterizado porque

-

1/se cuantifican las concentraciones de bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis

* determinando las concentraciones de secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis presentes en una sola copia en el ADN de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis respectivamente, y de una secuencia específica de un gen humano presente en

5 cualquier extracción biológica que contiene células humanas, en el ADN extraído de una muestra de secreción vaginal de paciente, presentando dichas secuencias específicas un tamaño inferior a 150 nucleótidos,

* mediante la co-amplificación enzimática de tipo PCR de dichas secuencias específicas contenidas, por un

10 lado, en dicho ADN extraído de la muestra y, por otro lado, en unas muestras de fragmentos de ADN sintéticos comprendiendo cada una de dichas secuencias específicas dichas bacterias y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica de células humanas, sirviendo dichas muestras de estándar de calibrado de cuantificación del ADN,

15 * realizándose la detección y la cuantificación de dichos fragmentos con la ayuda de sondas marcadas de secuencias distintas de las de los cebadores de amplificación para cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, y

20 * siendo dichas secuencias específicas de dichas bacterias las secuencias siguientes, que incluyen unas secuencias de dichas sondas (subrayadas) flanqueadas por unas secuencias de dichos cebadores (en negrita) o sus secuencias complementarias:

-

para Atopobium vaginae: 25

-

para Gardnerella vaginalis:

y

-

2/se determina la presencia de una vaginosis bacteriana o el fracaso del tratamiento terapéutico en curso si las concentraciones de fragmentos de ADN de dichas dos secuencias específicas de las bacterias Atopobium

35 vaginae y Gardnerella vaginalis respectivamente en una muestra de extracción de secreciones vaginales de paciente que contiene por lo menos 104 células humanas/ml, son tales que se respeta una por lo menos de las 2 condiciones a) y b) siguientes:

a) la concentración Ca en dicho fragmento de ADN de Atopobium vaginae es superior o igual a 108 copias/ml, y 40 b) la concentración Cg en dicho fragmento de ADN de Gardnerella vaginalis es superior o igual a 109 copias/ml.

Una concentración de bacteria Atopobium vaginae superior o igual al umbral de 108 permite detectar aproximadamente 90% de las vaginosis. La cuantificación de la bacteria Gardnerella vaginalis sirve como complemento en el caso en el que la concentración en Atopobium vaginae fuera inferior al umbral de 108

45 bacterias/ml, para detectar una vaginosis, puesto que el umbral de detección de G. vaginalis superior o igual a 109 bacterias/ml permitiría por sí mismo detectar únicamente aproximadamente la mitad de las vaginosis. Es por eso que, según la presente invención, es necesario cuantificar las concentraciones de ADN para las dos bacterias.

Por otra parte, se subraya que el desarrollo de una vaginosis bacteriana se confirma si las concentraciones Ca, Cg y

50 Cl de por lo menos tres fragmentos de secuencias específicas presentes en una sola copia en el ADN de las bacterias A. vaginae (Ca), G. vaginalis (Cg) y respectivamente Lactobacillus sp. (Cl) en el ADN extraído de una muestra de secreción vaginal de paciente son tales que la relación de las concentraciones Cl/(Ca+Cg) disminuye entre las 2 muestras extraídas sucesivamente en el tiempo a intervalo de tiempo suficiente, preferentemente por lo menos 1 mes.

55 Se entiende en este caso por "desarrollo de una vaginosis" una agravación de una vaginosis ya detectada o, en algunos casos, un riesgo de aparición de una vaginosis, es decir de un desequilibrio o una anomalía de la flora vaginal que puede volverse patológica.

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Asimismo, el fracaso del tratamiento en curso en función de las concentraciones de las secuencias específicas presentes en una sola copia en el ADN de las bacterias se confirma si la relación de las concentraciones Cl/(Ca+Cg) disminuye o no aumenta entre las 2 muestras extraídas a intervalo de tiempo suficiente, preferentemente por lo menos 1 mes.

Más particularmente, se realiza un método en el que:

-

a/en la etapa 1/, se cuantifican además las bacterias Lactobacillus sp. que comprenden por lo menos las bacterias Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseneii, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus iners,

*

determinando además la concentración de una secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp., estando dicha secuencia específica de los Lactobacillus sp. presente en una sola copia en el ADN de dichas bacterias Lactobacillus sp., y de tamaño inferior a 150 nucleótidos,

*

mediante la co-amplificación enzimática de tipo PCR adicional de dicha secuencia específica de las bacterias Lactobacillus sp. contenida, por un lado, en dicho ADN extraído de la muestra y, por otro lado, en una muestra de fragmentos de ADN sintético que comprende, además, dicha secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp., comprendiendo dicho fragmento de ADN sintético dicha secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp. que sirven de estándar de calibración de cuantificación,

*

siendo la detección y la cuantificación de dichos fragmentos realizadas con la ayuda de sondas marcadas de secuencias distintas de las de los cebadores de amplificación para cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, Lactobacillus sp. y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, y

-

b/en la etapa 2/, se determina una vaginosis bacteriana si, además, la concentración Cl en fragmento de ADN específico de dichas bacterias Lactobacillus sp. es inferior o igual a 108 copias/ml, preferentemente inferior o igual a 107 copias/ml.

Según la presente invención, la concentración en bacterias del género Lactobacillus sp. no es suficiente para concluir la presencia de una vaginosis bacteriana, pero sirve de complemento o de confirmación en el caso en el que se reúnen las condiciones de concentraciones en A. vaginae y G. vaginalis.

Preferentemente, se determina una vaginosis bacteriana si dichas concentraciones son tales que se respetan las 3 condiciones siguientes:

a- concentración Ca en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Atopobium vaginae superior o igual a 108 copias/ml,

b- concentración Cg en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Gardnerella vaginalis superior o igual a 109 copias/ml,

c-concentración Cl en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Lactobacillus sp. inferior o igual a 107 copias/ml,

Ventajosamente, dichas concentraciones Ca, Cg o Cl se determinan mediante amplificación enzimática de tipo PCR en tiempo real y cuantificación del ADN de dichos fragmentos de ADN de secuencias específicas de las bacterias respectivamente Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis y, llegado el caso, Lactobacillus sp, así como, preferentemente, de un fragmento de ADN humano presente en cualquier extracción biológica humana que contiene unas células.

Preferentemente, dichas secuencias específicas respectivamente de dichas bacterias Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis y, llegado el caso, Lactobacillus sp. presentan un tamaño de 70 a 150 nucleótidos, preferentemente de 90 a 120 nucleótidos.

Más preferentemente, se realizan unas reacciones de amplificación y cuantificación mediante PCR en tiempo real, utilizando unas sondas de hidrólisis específicas respectivamente de cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias y secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, en la muestra a ensayar.

La técnica de PCR en tiempo real consiste en una PCR clásica que utiliza unos cebadores de secuencia directa e inversa, y que comprende una detección del producto amplificado basada en la medición de la emisión de fluorescencia proporcional a la cantidad de genes amplificados con una sonda denominada de "hidrólisis". Para ello,

dicha sonda está marcada por un emisor de fluorescencia o fluoróforo en dirección 5' y un agente que bloquea la emisión de fluorescencia en dirección 3'. Este agente bloqueante absorbe la fluorescencia emitida cuando el fluoróforo y el agente bloqueante están cerca. Cuando el fluoróforo y el agente bloqueante se separan, la emisión de fluorescencia ya no es absorbida por el agente bloqueante. Durante su paso, la Taq polimerasa arrastra una 5 hidrólisis de la sonda y por lo tanto una liberación de los nucleótidos y del fluoróforo en disolución. La emisión de fluorescencia será por lo tanto proporcional al número de amplificado. El principio de la PCR en tiempo real se basa en la capacidad de la Taq polimerasa durante la etapa de elongación para hidrolizar una sonda hibridada sobre el ADN a copiar, permitiendo esta hidrólisis la emisión de fluorescencia, la cual permite una cuantificación. Durante la misma reacción, se pueden cuantificar dos dianas diferentes, introduciendo en la mezcla de reacción dos cebadores

10 y una sonda dirigidos contra una primera diana, y otros dos cebadores y sonda dirigidos contra la otra diana. Las dos sondas están marcadas con unos fluoróforos diferentes.

Más preferentemente, se utiliza un gran fragmento sintético de ADN que sirve de estándar de calibración de cuantificación del ADN, agrupando dicho gran fragmento de ADN sintético dichas secuencias específicas 15 respectivamente de cada una de dichas bacterias cuyas concentraciones son cuantificadas, y dicha secuencia de ADN humano específico de células humanas. La presencia de varias dianas moleculares en un mismo fragmento nucleico permite cuantificar unas dianas diferentes en una misma muestra y co-cuantificarlas de manera homogénea, permitiendo la cuantificación utilizando la misma gama de calibración de varias especies moleculares la comparación de la eficacia de las diferentes reacciones de PCR entre sí y de una determinación a la otra a lo largo

20 del tiempo y evita los sesgos relacionados con el control positivo.

Se entiende por "secuencia específica de dicha bacteria" una secuencia del genoma de dicha bacteria que no se encuentra en ningún otro genoma de organismo vivo.

25 Se entiende por "fragmento de ADN", un fragmento de ADN u oligonucleótido cuyas secuencias se escriben a continuación en el sentido 5'→3'.

Más particularmente, dichas secuencias específicas de dichas bacterias comprenden:

30 - para la bacteria Atopobium vaginae: el fragmento de las posiciones 248 a 334 del gen ARN 16S ribosomal de referencia Genebank AY 738658.1,

-

para la bacteria Gardnerella vaginalis: el fragmento de las posiciones 981 a 1072 del gen Cpn 60 de la proteína

protectora de 60 kDa de referencia Genebank AF 240579.3, y 35

-

para la bacteria Lactobacillus sp.: una secuencia común a las bacterias Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseneii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ineri y Lactobacillus acidophilus en el seno del gen tuf que codifica para el factor de elongación en las posiciones 253 a 343 del gen de referencia Genebank AY 562191.1.

40 Más particularmente todavía, dichas secuencias específicas de dichas bacterias son las secuencias siguientes que incluyen unas secuencias sondas (subrayadas) flanqueadas por unas secuencias cebadores (en negrita) o sus secuencias inversas y complementarias para los cebadores antisentido:

-

para Atopobium vaginae: 45

-

para Gardnerella vaginalis:

-

para Lactobacillus sp.

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Ventajosamente, se realiza además la cuantificación de las células humanas presentes en dicha muestra, en particular en el ADN obtenido a partir de la extracción vaginal a ensayar, a título de control de la riqueza de la extracción, de la calidad de la extracción del ADN, y de la presencia potencial de inhibidores de la reacción de PCR. Para ello, se cuantifica el número de copias de un gen humano presente en cualquier extracción biológica humana que contiene unas células, en particular el número de copias del gen de albúmina humana. La cuantificación del gen de albúmina humana sirve así de control interno para demostrar la calidad y la riqueza de la muestra. Además, durante el seguimiento de los pacientes, esta cuantificación es un medio de normalización entre dos muestras extraídas en tiempos diferentes. En efecto, el cálculo del número de microorganismos por millones de células humanas permite una comparación intercambiadora rigurosa. El gen de la albúmina está presente únicamente en 2 copias en las células humanas y la medición de la señal de esta secuencia permite por lo tanto la cuantificación del número de células humanas iniciales en la extracción. Una cantidad de células inferior o igual a 50 para 5 1l de muestra (104 células/ml), es decir una cantidad de ADN de albúmina inferior o igual a 102/5 1l, lleva a rechazar la extracción debido a una cantidad insuficiente.

Debido a la variabilidad de la calidad de la extracción, del transporte y de la conservación, la presente invención contiene así un control molecular de calidad que permite una sistematización del diagnóstico con una cuantificación fiable.

La cuantificación de las células permite asimismo detectar la ausencia de los limitadores de la reacción de PCR. En efecto, cuando la muestra se ensaya mediante PCR a diferentes diluciones, la cantidad de albúmina detectada aumenta cuando se aumentan las diluciones en presencia de los limitadores, mientras que disminuye cuando se aumentan las diluciones en ausencia de los limitadores de reacción PCR.

Más particularmente, se realiza además la cuantificación del ADN humano contenido en dicha muestra, y dicho gran fragmento de ADN comprende además una secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar tal como una secuencia específica de la albúmina.

Aún más particularmente, dicha secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar comprende el fragmento de las posiciones 16283-16423 del exón 12 del gen de la albúmina humana de referencia Genebank M12523.1 de secuencia del listado de secuencias siguiente o de la secuencia complementaria:

Sec. nº 1= 5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACAC AAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3’, preferentemente una secuencia Sec. nº 1 modificada por inserción de un sitio de escisión, en particular el sitio Xhol (secuencia rayada entre paréntesis) fuera de las secuencias que corresponden a los cebadores (secuencias en negrita) y secuencia sonda (secuencia subrayada) tal como la secuencia Sec. nº 17.

Más ventajosamente, se realizan unas reacciones de amplificación y de cuantificación utilizando unos cebadores y unas sondas de hidrólisis específicos de cada una de las diferentes bacterias denominadas secuencias específicas de cada una de dichas bacterias a ensayar y, llegado el caso, de una secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar, tal como una secuencia específica de la albúmina humana, y dicha secuencia específica comprende una secuencia sonda flanqueada por unas secuencias aptas para servir como cebador en una reacción de amplificación del tipo PCR de dichas secuencias específicas.

Se entiende en este caso por "sonda" un oligonucleótido, más preferentemente de 20 a 30 nucleótidos, que se hibrida específicamente con dicha secuencia específica y que permite por lo tanto detectarla y cuantificarla de manera específica gracias a la medición del incremento de la fluorescencia relacionada de la reacción de PCR.

La sonda permite detectar el ADN específico amplificado y cuantificarlo mediante la comparación de la intensidad de la señal con la del estándar de cuantificación.

Se entiende en este caso por "cebador" un oligonucleótido preferentemente de 15 a 25 nucleótidos que se hibrida de manera específica con uno de los 2 extremos de la secuencia que el ADN polimerasa amplificará en la reacción de PCR.

Más particularmente, se utilizan los juegos de cebadores y de sondas seleccionados, llegado el caso, de entre las secuencias siguientes del listado de secuencias adjunto a la presente descripción, o respectivamente sus secuencias complementarias:

-

para Atopobium vaginae:

Cebador 5': Sec. n°5 = 5'-CCCTATCCGCTCCTGATACC-3' Cebador 3': Sec. n°6 = 5'-CCAAATATCTGCGCATTTCA-3' Sonda: Sec. n° 7 = 5'-GCAGGCTTGAGTCTGGTAGGGGA-3'

-

para Gardnerella vaginalis:

Cebador 5': Sec. n°8 = 5'-CGCATCTGCTAAGGATGTTG-3' Cebador 3': Sec. n°9 = 5'-CAGCAATCTTTTCGCCAACT-3' 5 Sonda: Sec. n° 10 = 5'-TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-3'

-

para Lactobacillus sp.:

Cebador 5':Sec. n° 11 = 5'-TACATCCCAACTCCAGAACG-3'

10 Cebador 3': Sec. n°12 = 5'-AAGCAACAGTACCCACGACCA-3' Sonda: Sec. n° 13 = 5'-TGACAAGCCATTCTTAATGCA-3',

-

para la albúmina humana:

15 Cebador 5': Sec. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' Cebador 3': Sec. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' Sonda: Sec. n° 16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3'

Preferentemente, dicho gran fragmento de ADN sintético constitutivo del ADN de la muestra estándar de calibrado 20 de la cuantificación se inserta en un plásmido.

En estos métodos de cuantificación de ADN, es importante saber si una reacción positiva no se debe a una contaminación por el plásmido recombinante utilizado como estándar de cuantificación o como control positivo. Para resolver este problema, un sitio de corte por una enzima de restricción se introduce ventajosamente en por lo menos

25 una de las dianas moleculares sintéticas. Este sitio está ausente en la secuencia natural. Por lo tanto, mediante corte enzimático y análisis del fragmento amplificado sobre gel de agarosa, o utilizando una sonda de PCR en tiempo real que reconoce específicamente el sitio de restricción, se puede así detectar la presencia eventual del plásmido contaminante.

30 Así, se pueden realizar más particularmente las etapas siguientes, en las que:

1- se realiza una reacción de amplificación enzimática de tipo PCR del ADN de por lo menos dicha secuencia específica de por lo menos uno de dichos agentes, en el ADN extraído de dichas muestras a ensayar y en el ADN de la muestra estándar de calibrado, con la ayuda de por lo menos un juego de cebadores apto para

35 amplificar al mismo tiempo dicha secuencia específica auténtica y dicha secuencia específica modificada,

2- se verifica si los amplificados eventuales del ADN extraído de dichas muestras a ensayar comprenden dicha secuencia específica, y

40 3- se detectan los falsos positivos eventuales que proceden de contaminaciones eventuales de dichas muestras a ensayar por el ADN que procede de la muestra de estándar de calibrado, mediante por lo menos una de las etapas siguientes:

-

3a-se realiza una digestión enzimática del producto de PCR obtenido con una enzima que corresponde al sitio 45 de escisión y análisis sobre gel de agarosa del producto de digestión en comparación con el producto de PCR no digerido por la enzima de restricción.

Si el fragmento digerido procede de la amplificación de la diana molecular insertada en el plásmido control, contiene el sitio de restricción, y será de un tamaño inferior al fragmento no digerido. 50 -3b-se realiza una reacción de tipo PCR en tiempo real con unos cebadores directos e inversos de una de las dianas moleculares, y una sonda específica de dicha secuencia exógena que contiene el sitio de restricción.

Sólo un fragmento que procede del plásmido control y que contiene la secuencia exógena podrá ser amplificado.

55 Más particularmente, se utiliza dicha secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar que comprende el fragmento de las posiciones 16283-16423 del exón 12 del gen de la albúmina humana de referencia Genebank M12523.1 modificada mediante inserción de un sitio de escisión, en particular el sitio Xhol, fuera de las secuencias que corresponden a los cebadores (secuencias en negrita) y secuencia sonda (secuencia subrayada) de secuencia

60 del listado de secuencias siguiente:

Sec. nº 17 = 5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CTCGAG)TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCA TGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAG TTT-3’, que comprende el sitio Xhol (entre paréntesis) fuera de las secuencias que corresponden a los cebadores

65 (secuencias en negrita) y secuencia sonda (secuencia subrayada).

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Más ventajosamente, se utiliza una pluralidad de reacciones de amplificaciones enzimáticas PCR simultáneas o no de cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias con el mismo gran fragmento de ADN sintético patrón, con la ayuda de una pluralidad de diferentes juegos de cebadores específicos de cada una de las diferentes denominadas secuencias específicas de cada una de dichas bacterias, no cruzándose las secuencias de los diferentes cebadores entre dichas diferentes bacterias y pudiendo dichos cebadores ser utilizados en una reacción de amplificación enzimática realizada según el mismo protocolo y, en particular, a la misma temperatura de hibridación.

Se conocen diferentes métodos para construir un gran fragmento de ADN quimérico que combina varios fragmentos, en particular de orígenes diversos, en particular el método descrito en el documento FR 2 882 063 en el que se prepara un gran primer fragmento de ADN sintético bicatenario de secuencia determinada que comprende una cadena en un orden determinado de una pluralidad de n segundos pequeños fragmentos de ADN sintéticos contiguos, que consiste esencialmente en la dimerización de una pluralidad de n oligonucleótidos mediante amplificación enzimática con la ayuda de una enzima polimerasa termorresistente que comprende:

-

una primera etapa de reacción de amplificación de ácidos nucleicos de tipo PCR en presencia de dicha enzima polimerasa, de una serie de n oligonucleótidos de secuencias determinadas, sin cebadores exógenos, que comprende una serie de ciclos en unas condiciones de temperaturas que permiten la hibridación de dichos oligonucleótidos, seguida de una elongación del complejo obtenido, destinada a poner extremo con extremo en un orden determinado dichos oligonucleótidos, correspondiendo las secuencias de dichos oligonucleótidos sucesiva y alternativamente a las secuencias sentido y antisentido de dichos diferentes segundos fragmentos sintéticos, y conteniendo cada dicho oligonucleótido en sus regiones 5' y 3' unas secuencias complementarias de las de los oligonucleótidos siguiente y anterior, llegado el caso, y

-

una segunda etapa de amplificación con la ayuda de cebadores específicos de los extremos 5' y 3' de dicha hebra directa de dicho gran primer fragmento sintético a preparar, permitiendo producir unas copias idénticas de dicho gran primer fragmento.

Esta técnica se basa por lo tanto en la utilización y en el control de un artefacto de la PCR, que consiste en la hibridación de los cebadores entre sí (dimerización de los cebadores). Este fenómeno se observa en el caso en el que las condiciones de PCR, en particular de temperatura, están mal adaptadas, y en el que los cebadores contienen unas secuencias parcialmente complementarias.

La técnica de construcción consiste por lo tanto, a partir de las secuencias dianas, en seleccionar las secuencias de los oligonucleótidos, con una alternancia de oligonucleótidos de secuencias directas ("sentido") o inversas (también denominadas "reversas" o "antisentido"). Con el fin de hacer posible la puesta extremo con extremo de estos oligonucleótidos, se procura introducir en dirección 3' de la secuencia de un oligonucleótido una secuencia nucleotídica complementaria de los primeros nucleótidos del oligonucleótido siguiente. Estos oligonucleótidos se hibridarán por sus partes complementarias, y gracias a la actividad polimerásica, por ejemplo de la Taq polimerasa, se realiza una síntesis de 5' en 3' con el fin de obtener unos fragmentos bicatenarios. El fragmento final (ensamblado) se sintetiza mediante PCR utilizando un par de cebadores directo e inverso que corresponden a las secuencias de los extremos del primer gran fragmento de ADN sintético bicatenario deseado.

Tal como se ha mencionado anteriormente, ventajosamente, dichos grandes fragmentos de ADN sintéticos, están ventajosamente insertados en un plásmido.

Esta técnica de construcción genérica de un fragmento nucleotídico sintético permite la puesta en contigüidad de varias dianas moleculares de interés. Se trata de un método simple de realizar, rápido y fiable, y que no necesita un equipamiento pesado y costoso.

La presente invención tiene asimismo por objeto un estuche de diagnóstico útil para la realización de un método de diagnóstico y de seguimiento de una vaginosis según la invención, caracterizado porque comprende:

-

unas muestras de ADN estándar de calibrado a una concentración conocida que comprende dichas secuencias específicas de cada una de dichas bacterias tales como se han definido anteriormente, y preferentemente dicha secuencia específica del ADN humano tal como la definida anteriormente, y más preferentemente dicho gran fragmento de ADN sintético que agrupa dichas secuencias específicas de cada una de dichas bacterias tales como las definidas anteriormente, y preferentemente dicha secuencia específica del ADN humano tal como la definida anteriormente, así como

-

dichos juegos de cebadores específicos de dichos fragmentos de ADN sintéticos modificados específicos de dichas bacterias y más preferentemente, dichas sondas tales como las definidas anteriormente, y

-

unos agentes reactivos de realización de una reacción de amplificación de ADN de tipo PCR.

Otras características de la presente invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la descripción

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detallada siguiente de diferentes ejemplos de realización haciendo referencia al listado de secuencias y a las figuras 1 a 4, en las que:

-

la figura 1A representa el análisis de las cargas microbianas de 20 vaginosis bacterianas definidas por la puntuación de Nugent cuantificadas mediante PCR en tiempo real según la presente invención.

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la figura 1B representa el análisis de las cargas microbianas de 167 floras normales definidas por la puntuación de Nugent cuantificadas mediante PCR en tiempo real según la presente invención.

-

la figura 2 representa el análisis de las cargas microbianas de 44 floras intermedias identificadas por la puntuación de Nugent cuantificadas mediante PCR en tiempo real según la presente invención.

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la figura 3 muestra 25 vaginosis bacterianas identificadas sobre unos criterios moleculares y cuantificadas según la presente invención a partir del grupo de las 44 floras intermedias definidas por la puntuación de Nugent.

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la figura 4 presenta 19 floras normales identificadas sobre unos criterios moleculares y cuantificadas según la presente invención después de la aplicación de los criterios moleculares de la vaginosis bacteriana al grupo de las 44 floras intermedias identificadas por la puntuación de Nugent.

I.

PACIENTES, MATERIALES Y MÉTODOS

I.1 Realización y transporte de las extracciones vaginales

Las mujeres embarazadas, con seguimiento de su embarazo, han sido reclutadas en el hospital de La Conception en Marsella. Un consentimiento informado es la condición necesaria para la inclusión. Las extracciones han sido realizadas a nivel de la cavidad vaginal posterior bajo el espéculo estéril no lubrificado y sin antiséptico. Se han realizado cuatro extracciones para cada mujer: dos extracciones mediante legra de algodón en tubo seco (Copan innovation®, Brescia, Italia) y dos extracciones mediante citocepillo (Scrinet® 5,5 mm, laboratoire C.C.D. international, Paris, Francia). Se utiliza una legra de algodón estándar para el estado fresco y el cultivo bacteriano. Se dispone una segunda en un medio de transporte específico (R1 Urée-Arginine LYO 2, BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, Francia) para la búsqueda de los micoplasmas genitales (M. bominis y M. urealyticum). Se utiliza un citocepillo para el esparcido sobre la lámina y coloración de Gram. Un segundo para la extracción del ADN con fines de cuantificación mediante amplificación molecular se transporta en 500 1l de medio de transporte MEM (Minimum Essential Médium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Se congela a -80ºC desde que llega al laboratorio hasta su utilización.

I.2 Análisis bacteriológico

I.2.1. Estado fresco

La búsqueda de Trichomonas vaginalis se realiza mediante un examen en el estado fresco entre lámina y portaobjetos en el microscopio óptico (objetivo 10x).

1.2. Puntuación de Nugent:

I.2.2.1 La coloración de Gram:

Después del esparcido de la extracción sobre la lámina de vidrio y del secado, la coloración de Gram comprende: una coloración con cristal violeta oxalato (1 minuto), una coloración con líquido de Lugol (1 minuto), una decoloración con alcohol/acetona y coloración con safranina en disolución (BioMérieux). Cada etapa está seguida de un lavado con agua. La coloración de Gram permite establecer la puntuación de Nugent según una evaluación semicuantativa de 3 morfotipos bacterianos (tabla 1). En función de la puntuación, se identifican tres floras vaginales: una flora normal (FN) para una puntuación de 0 a 3, una flora intermedia (FI) para una puntuación de 4 a 6 y una VB para una puntuación superior a 7.

I.2.2.2 Cultivo

Las extracciones vaginales son inoculadas sobre 3 medios de cultivo: la gelosa Columbia ANC más 5% de sangre de oveja (BioMérieux), la gelosa Chocolat Poly Vitex PVX (BioMérieux), la gelosa CHOC VCAT (BioMérieux) incubadas a 37ºC durante 48 horas. Para la búsqueda de los micoplasmas, las extracciones son inoculadas sobre un kit específico (Urée-Arginine LYO 2, BioMérieux) y después se incuban a 37ºC y se inoculan sobre medios de cultivo anaeróbico (BioMérieux) durante 48 horas.

1.3. Detección y cuantificación mediante PCR en tiempo real:

I.3.1. Extracción del ADN

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La extracción del ADN utiliza el kit «QIAmp®DNA Mini Kit » (Qiagen®, Courtaboeuf, Francia). El protocolo se modifica de la manera siguiente: incubación durante 12 horas a 56ºC de 200 1l de muestra para 200 1l de tampón de lisis y 20 1l de proteinasa K. El lisado se trata según las recomendaciones del fabricante. El ADN se eluye en 100 1l de tampón de elución y después se almacena a -20ºC.

I.3.2 Realización de las PCR en tiempo real

I.3.2.1 Selección de las dianas moleculares

El análisis de los datos de la bibliografía, y de las secuencias depositadas en el sitio «GenBank» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html) permite conocer las secuencias disponibles para cada uno de los microorganismos dianas. La especificidad de los cebadores, de las sondas y de los fragmentos de las secuencias dianas de cada uno de los microorganismos seleccionados se ensayan para su especificidad en la página Internet NBCI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Los inventores han seleccionado unas dianas en todos los agentes potenciales de vaginosis, incluyendo unos agentes con un papel incierto. De manera sorprendente, la diana más significativa Atopobium vaginae no estaba considerada como un agente esencial.

Las dianas elegidas están localizadas en la secuencia del gen que codifica para la proteína protectora de 60 kDa (Cpn60) para G. vaginalis y M. curtisii, en la del ARN 16S para M. mulieris y A. vaginae, el gen fts Y para M. bominis, en la de la ureasa para U. urealyticum, el gen de la topoisomerasa III para C. albicans. Para la diana de Lactobacillus sp., se selecciona una secuencia común a: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners y Lactobacillus acidophilus, está situada en el gen que codifica para el factor de elongación tu (tuf). Una secuencia situada en el exón 12 del gen de la albúmina humana se selecciona con el fin de demostrar la presencia y la cantidad de ADN en la muestra ensayada.

1.3.2.2 Selección de las sondas y de los cebadores

Para cada microorganismo estudiado (Lactobacillus sp., G. vaginalis, M. curtisii, M. mulieris, U. urealyticum, M. bominis, A. vaginae, C. albicans) y la albúmina humana, se seleccionan una sonda, un par de cebador sentido y antisentido en las secuencias dianas definidas anteriormente utilizando el programa Primer 3® (http://frodo.wi.mit edu/primer3/primer3_code.html). Los cebadores y las sondas están descritos en el anexo 1 siguiente. Cada cebador y sonda están analizados en la página Internet NBCI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para asegurarse de su especificidad in silico (Anexo 1).

Con el fin de realizar unas PCR en tiempos reales en doble reconocimiento (PCD dúplex) se seleccionan arbitrariamente unos pares de reconocimiento de microorganismos: estando una de las sondas marcada FAM y estando la otra marcada VIC. Se definen así cuatro pares de PCR.

-

Lactobacillus sp. (FAM) y G. vaginalis (VIC)

-

M. curtisii (FAM) y M. mulieris (VIC)

-

U. urealyticum (VIC) y albúmina humana (FAM)

-

A. vaginae (VIC) y C. albicans (FAM)

-

Mycoplasma bominis (FAM) se cuantificará solo.

Los cebadores están sintetizados por Eurogentec® (Seraing, Bélgica), y las sondas por Applied Biosystems (Warrington, Cheshire, UK).

I.3.2.3 Ensayo de especificidad frente a las diferentes cepas ensayadas

Con el fin de ensayar la especificidad de los cebadores y de las sondas, el ADN extraído de cepas bacterianas de referencia (L. acidophilus CIP 104464, A. vaginae CIP 106431, G. vaginalis CIP 103660, M. curtisii subsp, bolmesii ATCC 35242, M. mulieris ATCC 35239, C. albicans UMIP 1180.79, U. urealyticum CIP 103755 y M. bominis CIP 103715) se utiliza a tres diluciones ((1/10a, 1/100a, 1/1000a) para la puesta a punto de las PCR en tiempo real (determinación de las cantidades relativas de cebadores y de sondas, de las especificidades, de las reactividades cruzadas). Cada cepa se ensaya con los cebadores y la sonda específica pero también con las sondas y los cebadores de los otros 7 microorganismos y las de la albúmina humana.

I.3.2.4 Puesta a punto de las PCR dúplex

Se han medido los valores de CT ("ciclo threshold"). Se trata del punto de intersección entre la línea de base de la reacción y la curva logarítmica de la representación de la amplificación. Este valor de CT corresponde al número de ciclo de amplificación necesario para que comience la amplificación. Está en relación con la concentración del producto nucleico a cuantificar, a saber cuanto más bajo es el CT, más elevada es la concentración.

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Las cantidades de cebadores y de sondas necesarios para la obtención de una amplificación óptima en simple y en doble fluorescencia están definidas ensayando las reacciones de amplificación en una mezcla de ADN bacteriano de las 8 cepas de referencia en equimolaridad, así como con las cepas puras, para una concentración final a 1/10a en los dos casos. Las condiciones experimentales consideradas son aquéllas para las cuales los valores de CT son idénticos a los obtenidos en simple fluorescencia.

I.3.2.5 Ensayo de especificidad frente a 40 cepas no ensayadas:

Las muestras de ADN genómico procedentes de 40 cepas bacterianas diferentes (Anexo) diferentes de las 8 cepas bacterianas de referencia se ensayan en dilución a 1/10a. El conjunto de estos ensayos se efectúa teniendo cuidado de introducir durante cada reacción de amplificación unos controles negativos que no contienen ningún ADN o unos controles positivos (mezcla del ADN de las 8 cepas de referencia). La especificidad se ensaya con los cuatro pares de PCR en tiempo real así como Mycoplasma bominis.

I.4 Construcción del plásmido

Se ha utilizado el método de preparación descrito en el documento FR 2 882 063.

1.4.1 Secuencia del fragmento hibrido de cuantificación:

La secuencia nucleotídica del fragmento híbrido de cuantificación se obtiene alineando las secuencias dianas de las PCR en tiempo real para los 8 microorganismos así como las de la albúmina humana. Se obtiene un fragmento híbrido de 931 pares de bases descrito en el Anexo 2 siguiente.

1.4.2 Secuencias de los oligonucleótidos de construcción del fragmento híbrido de cuantificación:

La secuencia del fragmento nucleotídico híbrido se divide en 6 fragmentos de oligonucleótidos consecutivos descritos en el Anexo 3. Con el fin de asegurar la continuidad de los oligonucleótidos adyacentes, se añaden 10 nucleótidos complementarios del extremo 3' en el oligonucleótido de corriente arriba en el extremo 5' del oligonucleótido de corriente abajo. Los tamaños de las 6 secuencias oligonucleotídicas se escalonan de 155 a 172 nucleótidos. Los oligonucleótidos consecutivos están alternativamente en secuencia directa y reversa. Así, los oligonucleótidos 1, 3 y 5 se utilizan en forma de secuencia directa, mientras que los oligonucleótidos 2, 4 y 6 se utilizan en secuencia reversa. Se sinterizarán unos cebadores denominados de construcción (sentido y antisentido) cuyas secuencias corresponden a las de los 20 nucleótidos en dirección 5' y en dirección 3' del fragmento híbrido de cuantificación. Los oligonucleótidos y los cebadores son sintetizados por Eurogentec®.

I.4.3 Construcción del fragmento híbrido:

El fragmento nucleotídico bicatenario se construye mediante reacción de amplificación gracias a la complementariedad de los extremos de dos oligonucleótidos adyacentes. Se necesitan dos PCR sucesivas.

I.4.3.1 Primera PCR:

Permite la hibridación de los oligonucleótidos por sus extremos y una elongación parcial cuando es compatible con la actividad de la Taq polimerasa. Los 6 oligonucleótidos son introducidos en equimolaridad (0,2 mMol), con tampón de polimerasa 1 X MgCl2 (1,5 mMol), los dNTP (0,2 mMol), 0,2 1l de Taq Roche (Roche®) a 5 UI/μl, en un volumen de reacción de 50 1l. El programa de amplificación es: 95ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos que comprenden 94ºC durante 30 s (desnaturalización), 37ºC durante 1 minuto (hibridación), 72ºC durante 1 minuto y 30 s (elongación).

I.4.3.2 Segunda PCR:

Permite obtener un fragmento de PCR que contiene extremo con extremo los motivos de oligonucleótidos esperados (Anexo 4). Se añade un 1l de producto de amplificación de la primera PCR a la mezcla de reacción siguiente: tampón de polimerasa Hotstar (Qiagen®) 1 X MgCl2 (1,5 mMol), los dNTP (0,2 mmol), 0,2 1l de Hotstar (Qiagen®) a 5 UI/μl, 0,2 mMol de los cebadores de construcción sentido y antisentido. El programa de PCR es: 95°C durante 15 minutos, seguido de 95°C durante 30 s, 58°C durante 45 s, 72°C durante 2 minutos 40 ciclos, 72°C durante 5 minutos. El fragmento de PCR obtenido se analiza sobre gel BET Agarosa al 1,5% en tampón TBE 0,5X. Si el tamaño del fragmento está de acuerdo con el tamaño esperado, se purifica utilizando el kit QIAquick® PCR Purification Kit 250 PCR Qiakit (Qiagen®).

I.4.3.3 Clonación del inserto

Se introducen dos 1l del fragmento obtenido anteriormente en una mezcla de reacción de ligación que contiene 5 1l de tampón de ligasa, 1 1l de ligasa y 1 1l de plásmido PGEM (kit pGEM®-T Easy Vector System 2 Promega®,

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Madison, Wiconsin, USA) linearizado y desfosforilado. El volumen final es de 10 1l. El producto de ligación se incuba a 15ºC durante una noche. Se mezclan siete 1l de producto de ligación con 50 1l de células competentes (Escherichia coli JM 109) mantenidas durante 20 minutos en hielo y después incubadas durante 1 minuto a 42ºC. Después de la adición de 950 1l de LB broth (USB®, Cleveland, Ohio, USA), y de la incubación durante 1h30 a 37ºC, se extienden 500 y 250 1l de este medio de cultivo en 2 cajas de Petri que contienen LB agar (USB®) con 100 1g/ml de ampicilina. Las cajas se incuban durante una noche a 37ºC. Las colonias recombinantes se depositan al mismo tiempo en 50 1l de agua destilada estéril y sobre una caja de LB agar ampicilina.

Se extraen las colonias de E. coli recombinantes para ser analizadas mediante PCR: 5 1l de suspensión bacteriana en agua destilada, el par de cebadores M13 (10 pm/μl) y el medio de reacción de PCR descrito anteriormente. El programa de PCR es idéntico al utilizado para la segunda etapa de la construcción. Los productos de PCR obtenidos se analizan sobre gel de agarosa al 1,5% en tampón TBE 0,5 X. Los fragmentos del tamaño esperado se purifican utilizando el kit Qiaquick® PCR Purification Kit 250 Qiakit (Qiagen®). A continuación, se secuencian utilizando el Big Dye® Terminator V1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems®, Warrington, UK), 3,2 pmol/μl de cebadores M13 sentido y antisentido cromatografiados sobre el secuenciador ABI PRIM 3100 (Applied Biosystems®). La secuencia obtenida se compara con la secuencia del fragmento esperado utilizando los programas auto assembler y Sequence Navigator (Applied Biosystems®). Uno de los clones recombinantes, de acuerdo con la secuencia esperada, se introducirá en gran cantidad en 100 ml de LB BROTH ampicilina y se purificará según el protocolo High Speed Plasmid Midi Kit (Qiagen®). El plásmido purificado se almacena después a -20ºC. La cepa recombinante seleccionada se congela a -80ºC.

I.4.3.4 Obtención de la gama plasmídica

Su concentración se determina mediante la medición de la densidad óptica a 260 nm. Es decir, por ejemplo: 0,38 para la disolución inicial. Una unidad DO corresponde a 50 1l/ml: 0,38 x 50 = 19 1g/ml = 19.10-6 g/ml de plásmido en la disolución inicial. El tamaño del plásmido = tamaño del pGEM®-T Easy + tamaño del fragmento = 3015 + 931 = 4334 pb, es decir 8668 bases. La masa molar de un nucleótido es de 330 Da (g/mol). La masa molar del plásmido será de 8668 x 330 = 2,860.106 g/mol. La concentración del plásmido será en mol/ml, es decir 19.10-6/2,860.106 = 6,64.10-12 mol/ml. Multiplicado por el número de Avogadro, se obtiene el número de copias de plásmido para 1 ml de disolución, es decir: 6,64.10-12 x 6,023.1023 = 40.1011 copias/ml es decir 2.1010 copias/5 μl. Una primera dilución de la disolución plasmídica inicial a 1/2500a permite ajustar la concentración a la primera constante de la gama plasmídica, es decir el punto 107 copias/5 1l de disolución plasmídica. Una cascada de dilución por pasos de 10 permite crear las constantes sucesivas de la gama (de 107 copias a 1 copia para 5 1l de disolución).

1.5. Análisis de las muestras

I.5.1 PCR cuantitativa en tiempo real

Se realizan las reacciones de cuantificación mediante PCR en tiempo real sobre los extractos de ADN de las extracciones vaginales. En el seno de cada placa de reacción se introducen: 4 controles negativos (NTC), la gama plasmídica de calibrado (de 107 a 1 copia por pocillo), 24 muestras a ensayar, puras y diluidas a 1/120a y a 1/100a para buscar unos inhibidores. Los controles negativos así como los puntos de la gama plasmídica se ensayan por duplicado. Para la amplificación y la cuantificación de los 8 microorganismos así como de la albúmina humana, se realizan 4 placas de PCR en doble fluorescencia y una en simple fluorescencia. Para la preparación de la mezcla de reacción, se utiliza el kit «Quantitect Probe PCR Kit» (Qiagen®) que contiene la mezcla de reacción 2X que asocia el tampón de la Taq polimerasa y la Taq polimerasa (Hotstar), los dNTP y dUTP. A este medio de reacción, se añaden los cebadores sentido y antisentido y las sondas necesarias para la realización de la PCR en simple o en doble fluorescencia según las condiciones experimentales indicadas descritas en el Anexo 6, las tomas de ensayo de las muestras diluidas o no y de los puntos de gama plasmídica son de 5 1l y 0,25 1l de UDG (Uracil DNA glycosylase a 100 unidades, Sigma-Aldrich, Lyon, Francia) se añaden para un volumen de reacción final de 25 1l. Las reacciones de PCR se realizan en el aparato Stratagene® MX 3000P (La Jolla, California). El programa de amplificación es el siguiente: 2 minutos a 50 ºC, 15 minutos a 95ºC, seguido de 45 ciclos de PCR que comprenden la desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos y después la fase de hibridación y de elongación a 60ºC durante 1 minuto.

I.5.2 Cálculo de la carga bacteriana

Para cada extracción vaginal y para cada microorganismo, con el fin de asegurar la comparabilidad de las muestras, la carga bacteriana se define de la manera siguiente. La cuantificación en número de copias de ADN de cada microorganismo para 5 1l de extracto de ADN se indica en número de bacterias para 1 ml de muestra inicial. Se debe tener en cuenta el volumen de elución del ADN (100 1l), del volumen del medio de transporte por muestra inicial (200 1l) y debido a que el gen cuantificado es un gen único. El valor obtenido para cada microorganismo en número de copias para 5 1l de extracto de ADN se multiplica por 102 para obtener una concentración en número de bacterias por ml de muestra, puesto que se ha realizado un volumen de elución de 100 1l de ADN extraído a partir de 200 1l de muestra.

1.5.3 Análisis estadístico

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El análisis estadístico de los datos de la cuantificación bacteriana por PCR en tiempo real se lleva a cabo utilizando el ensayo de Wilcoxon y el ensayo de Mann-Whitney para un grado de significado p<0,05. Para el análisis estadístico, se tienen en cuenta todos los valores de cuantificación incluyendo aquéllos por debajo del umbral de positividad. Para los valores de cuantificación igual a cero, se les atribuye la concentración más baja del conjunto de las muestras analizadas. El ensayo estadístico de Wilcoxon se aplica para describir la repartición de cada microorganismo en cada grupo de flora. El ensayo de Mann-Whitney se aplica para la comparación de la cuantificación de cada uno de los 8 microorganismos en el grupo de las VB y de las FN. Con el fin de buscar unos criterios moleculares de la VB, cada umbral de cuantificación bacteriana (de 103/ml a 109/ml) se estudia según la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y negativo calculados según la identificación por el umbral de las FN y de las VB previamente definidos por la puntuación de Nugent. Los umbrales de cuantificación, considerados aisladamente o de manera combinada, que tienen la mejor sensibilidad y especificidad se seleccionan como criterios moleculares de identificación de la VB.

II. RESULTADOS

II.1 Descripción de la población

De junio de 2005 a abril de 2006, se incluyen 204 mujeres embarazadas de 18 a 49 años de edad (media de edad de 28,9 ± 6,2 años). El origen étnico es África del norte (43%), Europa (42%), Sudáfrica (14%) y otros orígenes (1%). Se realiza una extracción vaginal a cada mujer. Setenta y dos por ciento de estas extracciones se realizan en el tercer trimestre contra 20% en el segundo y 8% en el primer trimestre de embarazo. Se realiza un seguimiento bacteriológico en veintiuna mujeres que comprende de 2 a 4 extracciones. Se analizan así un total de 231 extracciones.

II.2. Resultados bacteriológicos

II.2.1 Coloración Gram y establecimiento de la puntuación de Nugent

A partir de las 231 extracciones vaginales que proceden de 204 mujeres, la puntuación de Nugent permite identificar: 167 FN, 44 FI y 20 VB. La frecuencia de las anomalías de la flora vaginal teniendo en cuanta la primera extracción vaginal para cada una de las 204 mujeres es de 71% para la FN (145 casos), 19% para la FI (39 casos) y 10% para la VB (20 casos). La mitad de las mujeres que presentan una VB son sintomáticas. El síntoma observado más frecuentemente es la abundancia de pérdidas vaginales.

II.2.2 Cultivo y estado fresco

El cultivo permite aislar G. vaginalis, C. albicans, M. bominis, U. urealyticum así como Streptococcus agalatiae (tabla 1). Ninguna de las extracciones vaginales examinadas presenta T. vaginalis en el examen directo.

II.3. Resultados de la biología molecular

II.3.1. Puesta a punto de la PCR en tiempo real

Durante la realización de las PCR en simple y en doble fluorescencia, no se realiza ninguna reacción cruzada ni ninguna competición. Se obtienen unos resultados similares en valor de CT en simple y doble fluorescencia utilizando las cepas bacterianas puras y la gama plasmídica.

Las cantidades óptimas de cebadores y de sondas necesarias para la obtención de una amplificación óptima se presentan en el anexo 5.

II.3.2 Evaluación de la técnica de cuantificación por biología molecular

La cuantificación bacteriana para cada muestra está asegurada por la gama de dilución plasmídica. Para cada reacción de amplificación, se ensayan los 8 puntos de la gama plasmídica, de 107 copias a 1 copa para 5 1l. El punto de gama 107 copias se ha identificado de manera precoz para un CT alrededor de 17. Para el punto de gama de 1 copia la detección es más tardía con un CT a 37. Para el conjunto de los puntos de la gama, la reacción de amplificación es lineal. La representación gráfica da una recta cuya pendiente varía de -3,2 a -3,5. Esta linealidad se confirma ensayando las cepas puras diluidas a 1/10a, 1/100a y 1/1000a. Un umbral de positividad se define por encima de 10 copias (es decir 103 bacterias/ml), sea cual sea el tipo de microorganismo considerado (tabla 2). En efecto, de manera estadística, la amplificación del punto &quot;1 copia&quot; está asegurada en 75% mientras que es del 100% para el punto &quot;10 copias&quot;. En el seno de cada placa de amplificación, cada muestra se ensaya en disolución diluida, diluida a la décima y a la centésima. De manera reproducible, la detección del producto de amplificación sigue el paso de dilución puesto que una dilución a la décima corresponde a un aumento de 3 CT. Se considera únicamente la disolución pura para el cálculo de la carga bacteriana. Para cada muestra, se ensaya la albúmina humana mediante PCR en tiempo real. Los resultados obtenidos son homogéneos para el conjunto de las 231 muestras. Los

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valores de CT se distribuyen entre 19 y 22 (es decir 105 a 106 copias de ADN de la albúmina por 5 1l de ADN extraído). No se ha excluido ninguna muestra del análisis.

II.3.3 Análisis de los datos

II.3.3.1 Descripción molecular de las vaginosis bacterianas

Las concentraciones medianas de A. vaginae y de G. vaginalis son respectivamente de 1,1.109/ml y de 1,2.109/ml y no tienen diferencia estadística significativa mediante el ensato de Wilcoxon (p=0,3755). Estas 2 bacterias tienen unas concentraciones elevadas (figuras 1A y 3) con respecto a los demás microorganismos cuyas concentraciones medianas son estadísticamente más bajas (p=0,0001).

II.3.3.2 Comparación molecular de las vaginosis bacterianas y de las floras normales

La concentración mediana de Lactobacillus sp. es significativamente más baja (p<0,0001) para las VB (concentración mediana de 3.103/ml) que para las FN (concentración mediana de 5,7.107/ml). Por el contrario, las concentraciones medianas de A. vaginae, G. vaginalis, M. curtisii y M. bominis son significativamente más elevadas (p�0,0037) para las VB (concentración mediana respectivamente de 1,1.109/ml; 1,2.109/ml; 5.103/ml y 5,5.102/ml) que para las FN. Para las concentraciones medianas de U. urealyticum y C. albicans, no existe ninguna diferencia estadística significativa entre las VB y las FN, M. mulieris no está identificado (umbral de positividad � 103/ml) en ninguna de las VB ni ninguno de las FN.

II.3.3.3 Definición de los criterios moleculares de la vaginosis bacteriana

El análisis por umbral de la cuantificación para A. vaginae y G. vaginalis considerado aisladamente presenta los mejores criterios de sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo para la identificación molecular de las VB y de las FN definidos por la puntuación de Nugent (tabla 4). La asociación de una cuantificación de A. vaginae � 108/ml y/o de una cuantificación de G. vaginalis � 109/ml tiene una sensibilidad de 95%, una especificidad de 99%, un valor predictivo positivo (VPP) de 95% y un valor predictivo negativo (VPN) de 99%.

II.3.3.4 Caracterización molecular de las floras intermedias

La aplicación a las FI de la puntuación de Nugent (figura 2) de los criterios moleculares de identificación de la VB definidos anteriormente por una cuantificación de A. vaginae � 108/ml y/o por una cuantificación de G. vaginalis � 109/ml, permite caracterizar 25 floras (57%) que presentan un perfil de VB (figura 3) y 19 floras (43%) que presentan un perfil de FN (figura 4).

II.3.3.5 Seguimiento bacteriológico

Se ha realizado un seguimiento a ocho mujeres que presentan una VB o una FI por la puntuación de Nugent (tabla 7). La cuantificación molecular permite la demostración de la recidiva de la VB no identificada por la puntuación de Nugent para el sujeto 1. Permite confirmar la desaparición de la VB para los sujetos 7 y 8. Se caracterizan como VB las FI de la puntuación de Nugent persistentes con más de un mes de intervalo para los sujetos 2 y 5. Por último, confirma el carácter normal del seguimiento de la flora vaginal del sujeto 3.

III DISCUSIÓN

La repartición de las floras vaginales en FN (71%), VB (10%) y FI (19%) según la puntuación de Nugent está de acuerdo con las indicadas en la bibliografía en Francia [Goffinet F, EJOGR 2003], en Europa [Guise JM, AMJPM 2001] y en los Estados Unidos [Delaney ML, OG 2001]. La originalidad de la presente invención es la de haber establecido una herramienta racional de identificación de la flora vaginal asociando la técnica de detección específica por PCR en tiempo real y la cuantificación relativa por un plásmido de calibrado.

El resultado más sorprendente se refiere a A. vaginae. Esta bacteria ha sido identificada por primera vez en 1999 mediante amplificación y secuenciación del ARN 16S a partir de una extracción vaginal de sujeto sano [Rodriguez JM, IJSB 1999]. En 2003, A. vaginae ha sido aislada mediante cultivo en una extracción de absceso tubo-ovárico, dejando suponer un papel patógeno de la bacteria [Geissdorfer W, JCM 2003]. En 2004, un enfoque de amplificación del ARN 16S r acoplado a unas técnicas de clonación ha permitido la demostración de la bacteria en unas extracciones obtenidas en peroperatorio en unos pacientes que presentan una salpingitis [Hebb JK, JID 2004]. Según la presente invención, esta bacteria es de identificación frecuente en 19 de las 20 VB (95%) y 115 de las 167 FN (69%). El criterio más discriminante para el diagnóstico de las VB y de las FN es una concentración de A. vaginae � 108/ml con una sensibilidad de 90% (18 casos de 20 VB) y una especificidad de 99% (1 caso de 167 FN).

Desde 2004, 4 estudios basados en diversas técnicas moleculares han demostrado una posible asociación entre A. vaginae y VB, pero ninguno tenía en cuenta criterios de cuantificación rigurosos. En primer lugar, un enfoque mediante PCR que tiene como diana el ARN 16S r seguido de una migración sobre gel ha permitido demostrar A.

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vaginae entre sólo 12 VB de 20 (60%) y 2 FN de 24 (8,3%) [Ferris MJ, BMCID 2004]. Por PCR que tiene como diana específicamente el gen del ARN 16S r de A. vaginae, el ADN de la bacteria ha sido encontrado entre 7 VB de 9 (77,8%) y 22 FN de 112 (19,6%) [Verhelst R, BMCM 2004]. Aplicando la misma técnica, el ADN de A. vaginae ha sido demostrado entre 19 VB de 22 (86,4%) y 59 FN de 403 (14,7%) [Verhelst R, BMCM 2005]. Por último, mediante unas técnicas de amplificación, clonación y secuenciación, el ADN de A. vaginae se ha observado en 26 VB de 27 (96%) y 9 FN de 46 (19,5%) [Fredricks DN, NEJM 2005]. Ninguno de estos estudios ha cuantificado el ADN de A. vaginae, lo cual es esencial en las vaginosis bacterianas en las que la concentración de las bacterias es un elemento importante del diagnóstico.

A. vaginae falta en la puntuación de Nugent a pesar de su lugar capital en las anomalías de la flora vaginal. Su identificación por unos criterios morfológicos está poco adaptada. Su morfología variable en forma de un pequeño cocobacilo (0,6-0,9 1m) de Gram positivo a veces agrupado por pares o en cadena corta le asegura un camuflaje en contacto con otras bacterias, haciéndolo así indetectable [Verhelst R, BMCM 2004]. Su parecido a Lactobacillus sp. y a los estreptococos es por lo tanto fuente de error de identificación [Rodriguez JM, 1JSB 1999].

La descripción de una asociación entre A. vaginae y G. vaginalis en la VB es reciente, está poco documentada y es de alcance diagnóstico limitado en ausencia de cuantificación. Esta asociación es de 87,8% (8 de 9 VB) [Verhelst R, BMCM 2004] y de 90% (20 de 22 VB) [Zariffard MR, FEMS 2002] por PCR específica que tiene como diana el gen del ARN 16S r de A. vaginae y de G. vaginalis. Una publicación reciente describe la presencia de A. vaginae en las vaginosis bacterianas mediante un método semi-cuantitativo [Bradshaw CS, JID 2006].

Según la presente invención, esta asociación de A. vaginae y de G. vaginalis es de 90% (18 de 20 VB) pero la consideración de la cuantificación de A. vaginae 108/ml y/o de G. vaginalis 109/ml con una sensibilidad de 95% (19 de 20 VB) presenta los mejores criterios de especificidad (99%), de VPP (95%) y de VPN (99%) jamás obtenidos para la identificación de la VB. En consecuencia, se utiliza una concentración de A. vaginae 108/ml y/o una concentración de G. vaginalis � 109/ml para el diagnóstico molecular de la VB.

Los resultados según la presente invención sugieren que la cuantificación de G. vaginalis es menos discriminante que la de A. vaginae. Para los Lactobacillus sp., su disminución en la VB objetivada por la puntuación de Nugent se confirma mediante estos resultados. En efecto, si se considera una concentración de Lactobacillus sp. inferior o igual a 107/ml, la sensibilidad para diagnosticar una VB es de 100% y la especificidad de 44%. Por otra parte, si se considera una concentración de Lactobacillus sp. superior o igual a 108/ml, se observa una especificidad de 100% para demostrar una flora vaginal normal.

Para los Mobiluncus spp., a pesar del lugar que se les otorga por la puntuación de Nugent, ninguna PCR es positiva para M. mulieris. Sólo M. curtisii está asociada a la VB. Sin embargo, su utilización como posible criterio de diagnóstico molecular sigue siendo menor.

Los micoplasmas genitales no se tienen en cuenta para la puntuación de Nugent. Siguen siendo identificables mediante cultivo o biología molecular. El estudio por cultivo de 445 VB y 2729 FN, identificaba M. bominis como significativamente asociado a la VB con una prevalencia de 29% (129 VB) y U. urealyticum como no asociado a la VB a pesar de una prevalencia de 56% (253 VB) [Thorsen P, AJOG 1998]. Un estudio sobre 203 VB y 203 FN que tiene como diana M. bominis por PCR en tiempo real sugería una implicación de M. bominis en la VB [Zariffard MR, FEMS 2002]. Sin embargo, un estudio idéntico sobre un efectivo más restringido (5 VB y 16 FN) no demostraba esta relación [Sha BE, JCM 2005]. Según la presente invención, sólo M. bominis se correlaciona con la VB pero esta correlación es insuficiente para proponer este microorganismo como criterio diagnóstico de la VB.

Los resultados según la presente invención no demuestran ninguna relación entre la VB y C. albicans tal como lo muestran los datos en la bibliografía [Thorsen P, AJOG 1998]. Esto es interesante porque aunque el reparto genital de Candida albicans no aumenta el riesgo de premadurez [Cotch MF, AJOG 1998], un estudio reciente [Kiss H, BMJ 2004] ha mostrado una reducción del porcentaje de premadurez mediante el tratamiento del reparto genital de C. albicans.

La originalidad de la presente invención es poder proponer por primera vez una herramienta diagnóstica de la VB basada en la cuantificación de A. vaginae y G. vaginalis. Los criterios considerados actualmente asocian una concentración de A. vaginae 108/ml y/o una concentración de G. vaginalis 109/ml. Este ensayo diagnóstico tiene una sensibilidad de 95%, una especificidad de 99%, un VPP de 95% y un VPN de 99%. Varios métodos de lectura de los resultados de PCR, en particular los métodos mediante cálculo de ratio y de productos de concentraciones bacterianas, han sido ensayados para permitir identificar el método más pertinente.

Una de las aplicaciones más turbadora de la herramienta de biología molecular según la presente invención es la realizada sobre la FI de la puntuación de Nugent. Se sabe que la FI, únicamente identificada mediante la puntuación de Nugent, constituye una fracción no despreciable (8% a 22%) de la totalidad de las floras identificadas por esta última [Guerra B, EJOGRB 2006; Goffinet F, EJOGRB 2003; Delaney ML, OG 2001; Libman MD, DMID 2006; Larsson PG, STI 2004] y que está asociada a numerosas incertidumbres. En efecto, su interpretación está sujeta a confirmación puesto que no se sabe a qué realidad microbiológica corresponde esta flora intermedia. Algunos la

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consideran como una flora de transición entre FN y VB [Ison CA, STI 2002; Guerra B, EJOGRB 2006; Goffinet F, EJOGRB 2003; Ugwumadu A, Lancet 2003; Carey JC, NEJM 2000]. Otros la consideran como un grupo heterogéneo que agrupa unas FN y unas VB [Ison CA, STI 2002; Libman MD, DMID 2006; Larsson PG, STI 2004]. Unas tentativas de caracterización de la FI en FN o VB se describen en la bibliografía. Por la aplicación de los criterios de Amsel a 13 FI, 12 FI son recatalogadas en FN y 1 en VB [Ison CA, STI 2002]. Por la coloración de Kopeloff para el establecimiento de la puntuación de Nugent, 69 de las 232 FI (30%) son recatalogadas en FN o VB [Libman MD, DMID 2006]. En esta coloración, la fucsina sustituye la safranina de la coloración de Gram para permitir una mejor identificación de las bacterias de Gram negativo. Por último, la estandarización de los criterios de la puntuación de Nugent en función de la superficie del campo óptico del aparato microscópico utilizado, ha permitido reclasificar 458 de las 1176 FI (39%) en FN o VB [Larsson PG, ST1 2004].

La aplicación a las FI de criterios moleculares según la presente invención que asocian a la VB una concentración de A. vaginae 108/ml y/o una concentración de G. vaginalis 109/ml permiten prever una caracterización racional de esta FI. Así, 24 FI (57%) presentan un perfil similar al de las VB. Las otras diecinueve FI (43%) presentan un perfil similar al de las FN. Estos resultados dejan por lo tanto sugerir por un lado el carácter heterogéneo de las FI y por otro lado un defecto de sensibilidad de la puntuación de Nugent para diagnosticar más de la mitad de las VB. Estos datos confirman por lo tanto los límites de la puntuación de Nugent.

La etiología de la VB sigue siendo todavía un misterio pero se dispone por primera vez de una herramienta de cuantificación objetivo que permite un enfoque de diagnóstico racional de la VB. El carácter singular de la presente invención es haber mostrado al mismo tiempo la posición capital de A. vaginae en la VB pero también su utilización mediante cuantificación como criterio diagnóstico principal de la VB. Se entiende aún mejor el problema terapéutico suscitado por el carácter relativamente resistente de A. vaginae al metronidazol que puede explicar en parte la frecuencia de las recidivas después del tratamiento [ANAES 2001; Ferris MJ, BMC ID 2004; Secor AM, CNP 1997; Geissdorfer W, JCM 2003; De Backer E, BMC ID 2006]. Los criterios moleculares considerados para el diagnóstico de la VB asocian una concentración de A. vaginae 108/ml y/o una concentración de G. vaginalis 109/ml. Esta herramienta molecular permite el diagnóstico de la VB y la caracterización en VB de una fracción de la FI. Se ha podido asimismo prever la herramienta molecular como un método diagnóstico de la VB y de seguimiento para la evaluación de la asistencia terapéutica de la VB durante el embarazo.

Anexo 1. Diana molecular y secuencia nucleotídica del par de cebadores y de la sonda para cada microorganismo estudiado

En la tabla siguiente, las secuencias de los &quot;cebadores sentido&quot; y &quot;sondas&quot; están escritas en el sentido 5'->3', y las secuencias de los &quot;cebadores antisentido&quot; están escritas en el sentido 5'->3' complementario inverso.

Microorganismos

Dianas Secuencias nucleotídicas

M. curtisii

Cpn 60 Cebador sentido: TGGAAAAGGTGGGTCAAGAG Cebador antisentido: AAACGCATACCTTCGGTGAC Sonda: FAM-GGCGTCATCACCGTGGAAGAA-TAMRA

M. mulieris

ARN 16 S ribosomal Cebador sentido: ATGGATATGCGTGTGGATGG Cebador antisentido: CCAGGCATGTAAGCCCAAAC Sonda: VIC-IIIIGGGTGGGGGCGCTA-TAMRA

G. vaginalis

Cpn 60 Cebador sentido: CGCATCTGCTAAGGATGTTG Cebador antisentido: CAGCAATCMMCGCCAACT Sonda: VIC-TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-TAM RA

Lactobacillus sp.

Tuf Cebador sentido: TACATCCCAACTCCAGAACG Cebador antisentido: AAGCAACAGTACCACGACCA Sonda: FAM-TGACAAGCCATTCTTAATGCCA-TAMRA

U. urealyticum

Ureasa Cebador sentido: ACTGGTGACCGTCCTATCCA Cebador antisentido: CCTGATGGAATATCGAAACGA Sonda:VIC-TGAAAAAGGAAACGAAGACAAAGA-TAM RA

M. hominis

fts Y Cebador sentido: ATTGATTGCTGCAGGTGATACA Cebador antisentido: GGTGTTACAATATCAGCCCCAAC Sonda: FAM-AGAGCAGCGGCAGTTGAA-TAMRA

A. vaginae

ARN 16S ribosomal Cebador sentido: CCCTATCCGCTCCTGATACC Cebador antisentido: CCAAATATCTGCGCATTTCA Sonda: VIC-GCAGGCTTGAGTCTGGTAGGGGA-TAMRA

C. albicans

Topoisomerasa 3 Cebador sentido: CAACGCCAACGAAGACAAG Cebador antisentido: CCAGCTTTGTTTGCATCAAC Sonda: FAM-AAAGCCGATGGTAGTAGAAAACTGCTAMRA

Albúmina humana

Exón 12 Cebador sentido: GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT Cebador antisentido: AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC Sonda: FAM-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-TAMRA

Anexo 2. Secuencia teórica global del inserto de 939 pares de bases.

Secuencias en negrita = Secuencias de los cebadores sentido y antisentido Secuencias subrayadas = Secuencias de las sondas específicas Secuencias en negro = Secuencias intercalantes Secuencias entre paréntesis = Secuencias del sitio de restricción Xhol

10 Anexo 3. Secuencias de los 6 oligonucleótidos y de los cebadores de construcción del inserto.

-

Oligonucleótido 1 sentido, 178 nucleótidos: secuencias de M. curtisii y M. mulieris

-

Oligonucleótido 2 antisentido, 183 nucleótidos: G. vaginalis y Lactobacillus sp.

-Oligonucleótido 3 sentido, 145 nucleótidos: U. ura/yticum

-

Oligonucleótido 4 antisentido, 188 nucleótidos: M. bominis

-

Oligonucleótido 5 sentido; 152 nucleótidos: A. vaginae y C. albicans

-

Oligonucleótido 6 antisentido, 147 nucleótidos: albúmina humana

-

Cebadores de construcción para el plásmido recombinante con el fragmento de 939 pares de bases

-

Sentido Sec. n°25 = 5'GCCATGGAAAAGGTGGGTC3'

-

Antisentido Sec. n° 28 = 5'CCAAACTCATGGGAGCTGCT3'

15 Anexo 4. Esquemas teóricos de construcción de un inserto por doble PCR. El principio de construcción de un inserto con 6 oligonucleótidos

Esquema de construcción del plásmido

Anexo 5. Cantidad de sonda y de cebadores sentido y antisentido necesaria para la reacción de amplificación de 5 1l de extracto de ADN para cada microorganismo y la albúmina humana.

Microorganismos

Sonda (cantidad expresada en μl por pocillo) Cebador sentido (cantidad expresada en μl por pocillo) Cebador antisentido (cantidad expresada en μl por pocillo)

M. curtisii

0,25 0,5 0,5

M. mulieris

0,25 0,5 0,5

G. vaginalis

0,25 0,5 0,5

Lactobacillus sp.

0,25 0,5 0,5

U. urealyticum

0,25 0,5 0,5

M. bominus

0,125 0,125 0,125

A. vaginae

0,25 0,5 0,5

C. albicans

0,25 0,5 0,5

Albúmina humana

0,125 0,125 0,125

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Verhelst R, Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Van Simaey L, De Ganck C, De Backer E, Temmerman M, Vaneechoutte M. Comparison between Gram stain and culture for the characterization of 45 vaginal microflora: definition of a distinct grade that resembles grade I microflora and revised categorization of grade I microflora. BMC Microbiol. 14 de oct. de 2005; 5:61.

Zariffard MR, Saifuddin M, Sha BE, Spear GT. Détection of bacterial vaginosis-related organisms by real-time PCR for Lactobacilli, Gardnerella vaginalis and Mycop/asma bominis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002 13; 50 34:277-81.

Tabla 1. Resultados del cultivo bacteriano para los 3 tipos de flora identificados por la puntuación de Nugent.

Cutlivo

Flora normal Flora intermedia Vaginosis bacteriana Total

Microorganismo buscado

Número de extracciones positivas en número de extracciones ensayadas (%)

G. vaginalis

6 de 167 (3,6%) 6 de 44 (13,6%) 15 de 20 (75%) 27 de 231 (12%)

M. bominis y U. urealyticum

16 de 163 (9,8%) 6 de 39 (15%) 4 de 16 (25%) 26 de 2 (9%)

C. albicans

30 de 167 (18%) 17 de 44 (38,6%) 3 de 20 (15%) 50 de 231 (21,6%)

Streptococcus agalactiae

5 de 167 (3%) 1 de 44 (2%) 0 de 20 6 de 231 (2,6%)

Tabla 2. Detección de la presencia de los 8 microorganismos mediante PCR en tiempo real para las 231 muestras.

Microorganismos determinados mediante PCR

Número y porcentaje de PCR positiva (límite de positividad 103/ml)

Lactobacillus sp.

177 (77%)

G. vaginalis

131 (57%)

A. vaginae

172 (74%)

M. mulieris

1 (0,4%)

M. curtisii

41 (18%)

M. bominis

47 (20%)

U. urealyticum

32 (14%)

C. albicans

60 (26%)

Tabla 3. Análisis de las concentraciones bacterianas medianas obtenidas mediante PCR cuantitativo para las vaginosis bacterianas y las floras vaginales normales determinadas por la puntuación de Nugent.

Microorganismos

20 vaginosis bacterianas 167 floras normales Valor P

Concentración bacteriana mediana/ml (concentración mínima y máxima)

Ensayo estadístico de Mann-Whitney

Lactobacillus sp.

2,7.103 (<103-8.107) 5,6.107 (<103-5,4.109) < 0,0001

G. vaginalis

1,1 109 (<103-1,5.1010) <103(<103-5.108) < 0,0001

A. vaginae

1,2 109 (<103-1,2.1010) 4,7.103 (<103-2.103) < 0,0001

M. mulieris

<103 <103 No se puede medir

M. curtisii

4,9.103 (<103-1,3.106) <103 (<103-6,2.104) < 0,0001

M. bominis

8,5.102 (<103-13.108) <103 (<103-2,2.109) 0,0054

U. urealyticum

<103 (<103-3,4.105) <103 (<103-5.106) 0,3344

C. albicans

<103 (<103-1,7.103) <103(<103-7.106) 0,0991

Tabla 4. Impacto de la cuantificación bacteriana mediante PCR en tiempo real para la identificación de las vaginoisis bacterianas.

El grupo de floras normales y de vaginosis bacterianas definidas por la puntuación de Nugent son utilizados como referencia

Microorganismos

Umbral de cuantificación (bacterias/ml) FN identificadas* VB identificadas* Sensibilidad** Especificidad** VPP*** VPN***

A. vaginae

> 103 116 (69%) 19 (95%) 0,95 0,31 0,14 0,98

> 104

65 (39%) 19 (95%) 0,95 0,61 0,23 0,99

> 105

25 (15%) 19 (95%) 0,95 0,85 0,43 0,99

> 106

13 (7,8%) 19 (95%) 0,95 0,92 0,59 0,99

> 107

6 (3,6%) 19 (95%) 0,95 0,96 0,76 0,99

> 108

1 (0,6%) 18 (90%) 0,90 0,99 0,95 0,99

> 109

0 13 (65%) 0,65 1,00 1,00 0,96

G. vaginalis

> 103 79 (47%) 19 (95%) 0,95 0,53 0,19 0,99

> 104

59 (35%) 19 (95%) 0,95 0,65 0,24 0,99

> 105

39 (23%) 19 (95%) 0,95 0,77 0,33 0,99

> 106

25 (15%) 19 (95%) 0,95 0,85 0,43 0,99

> 107

12 (7%) 18 (90%) 0,90 0,93 0,60 0,99

> 108

7 (4%) 16 (80%) 0,80 0,96 0,70 0,98

> 109

0 10 (50%) 0,50 1,00 1,00 0,94

M. curtisii

> 103 > 104 > 105 > 106 21 (12,6%) 2 (1,2%) 0 0 13 (65%) 9 (45%) 9 (45%) 1 (5%) 0,65 0,45 0,45 0,05 0,87 0,99 1,00 1,00 0,38 0,82 1,00 1,00 0,95 0,94 0,94 0,90

M. bominis

> 103 22 (13%) 10 (50%) 0,50 0,87 0,31 0,94

> 104

13 (7,8%) 7 (35%) 0,35 0,92 0,35 0,92

> 105

6 (3,6%) 7 (35%) 0,35 0,96 0,54 0,93

> 106

2 (1,2%) 6 (30%) 0,30 0,99 0,75 0,92

> 107

2 (1,2%) 6 (30%) 0,30 0,99 0,75 0,92

> 108

2 (1,2%) 1 (5%) 0,05 0,99 0,33 0,90

> 109

1(0,6%) 0 0 0,99 0 0,89

U. urealyticum

> 103 > 104 > 105 > 106 22 (13%) 17 (10%) 13 (7,8%) 7 (4,2%) 5 (25%) 5 (25%) 3 (15%) 0 0,25 0,25 0,15 0 0,87 0,90 0,92 0,96 0,18 0,23 0,19 0 0,91 0,91 0,90 0,89

E07866534 04-11-2011

(continuación)

El grupo de floras normales y de vaginosis bacterianas definidas por la puntuación de Nugent son utilizados como referencia

Microorganismos

Umbral de cuantificación (bacterias/ml) FN identificadas* VB identificadas* Sensibilidad** Especificidad** VPP*** VPN***

Lactobacillus

> 103 141 (84%) 12 (60%) 0,60 0,16 0,08 0,76

spp.

> 104

134 (80%) 7 (35%) 0,35 0,20 0,05 0,72

> 105

116 (69%) 4 (20%) 0,20 0,30 0,03 0,76

> 106

106 (63%) 4 (20%) 0,20 0,36 0,04 0,79

> 107

97 (58%) 3 (15%) 0,15 0,42 0,03 0,80

> 108

74 (44%) 0 0 0,55 0 1

> 109

13 (7,8%) 0 0 0,92 0 1

*Número de FN y número de VB identificadas de 167 FN ensayadas (%) y 20 VB ensayadas (%) respectivamente. **Sensibilidad y especificidad del umbral de cuantificación para la identificación de las VB ***VPP valor predictivo positivo y VPN valor predictivo negativo

Tabla 5. Impacto de la asociación de los criterios de cuantificación por PCR en tiempo real de A. vaginae y G. vaginalis para la identificación de las vaginosis bacterianas. Se utilizan como referencia el grupo de floras normales y de vaginosis bacterianas definidas por la puntuación de Nugent.

Microorganismos asociados

Umbral de cuantificación de G. vaginalis (bacterias/ml) FN identificadas* VB identificadas* Sensibilidad** Especificidad** VPP*** VPN***

A. vaginae 107 y G. vaginalis

106 107 108 109 5 (3%) 5(3%) 2(1,2%) 0 18 (90%) 17 (85%) 15 (75%) 9 (45%) 0,90 0,85 0,75 0,45 0,97 0,97 0,99 1 0,78 0,77 0,88 1 0,99 0,98 0,97 0,94

A. vaginae 108 y G. vaginalis

106 107 108 109 1 (06%) 1 (0,6%) 0 0 17 (85%) 17 (85%) 15 (75%) 9 (45%) 0,85 0,85 0,75 0,45 0,99 0,99 1 1 0,94 0,94 1 1 0,98 0,98 0,97 0,94

A. vaginae 107 y/o G. vaginalis

106 107 108 109 26 (15%) 13 (7,8%) 11 (6,6%) 6 (3,6%) 20 (100%) 20 (100%) 20 (100%) 20 (100%) 1 1 1 1 0,84 0,92 0,93 0,96 0,43 0,61 0,64 0,77 1 1 1 1

A. vaginae 108 y/o G. vaginalis

106 107 108 109 25 (15%) 12 (7,2%) 7 (4,2%) 1 20 (100%) 19 (95%) 19 (95%) 19 (95%) 1 0,95 0,95 0,95 0,85 0,93 0,96 0,99 0,44 0,61 0,73 0,95 1 0,99 0,99 0,99

*Número de FN y número de VB identificadas de 167 FN ensayadas (%) y 20 VB ensayadas (%)* respectivamente **Sensibilidad y especificidad del umbral de cuantificación para la identificación de las VB ***VPP valor prdictivo positivo y VPN valor predictivo negativo

Tabla 6. Seguimientos bacteriológicos de 8 pacientes que presentan una vaginosis bacteriana o una flora intermedia por la puntuación de Nugent. Correspondencia entre la clasificación por la puntuación de Nugent y la identificación de la VB por criterios moleculares.

Sujeto

Plazo de la extracción vaginal Clasificación por puntuación de Nugent Tratamiento VB por criterios moleculares Plazo de parto Peso del recién nacido (gramo)

1

24 SA 28 SA 38 SA VB FN FN Sí Sí Sí 39 SA 3420

2

27 SA 39 SA FI FI Sí Sí 40 SA 3090

3

6 SA 28 SA 32 SA FN FI FI 40 SA 3490

4

6 SA 31 SA 37 SA 40 SA FI FN FN FN Sí 38 SA 3580

E07866534 04-11-2011

(continuación)

Sujeto

Plazo de la Clasificación por Tratamiento VB por criterios Plazo de parto Peso del recién

extracción

puntuación de moleculares nacido

vaginal

Nugent (grammo)

5

26 SA FI Sí 38 SA 2970

31 SA

FI Sí

6

31 SA 39 SA FN FI Sí 39 SA 2700

7

25 SA 29 SA VB FN Sí Sí 37 SA 4100

8

27 SA VB Sí Sí 38 SA 2700

30 SA

FN

32 SA

FN

Listado de secuencias

<110> UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE (Aix-Marseille II)

<120> Método de diagnóstico y de seguimiento de una vaginosis bacteriana mediante cuantificación molecular 10 <130> H52 437 caso 19 FR

<160> 28

<170> PatentIn version 3.1 15 <210> 1

<211> 135

<212> ADN

<213> Albúmina humana 20 <400> 1

<210>2

<211> 81 25 <212> ADN

<213> atopobium vaginae

<400> 2

30

<210>3

<211> 86

<212> ADN

<213> Gardnerella vaginalis

35

<400> 3

<210>4 40 <211> 90

<212> ADN

<213> Lactobacillus sp.

<400> 4 15

5

<210>5 <211> 20 <212> ADN <213> atopobium vaginae

10

<400> 5

ccctatccgc tcctgatacc

20

15

<210>6 <211> 20 <212> ADN <213> atopobium vaginae

20

<400> 6 ccaaatatct gcgcatttca

20

25

<210>7 <211> 23 <212> ADN <213> atopobium vaginae

<400> 7

30

gcaggcttga gtctggtagg gga 23

35

<210>8 <211> 20 <212> ADN <213> Gardnerella vaginalis

<400> 8

40 45

cgcatctgct aaggatgttg <210>9 <211> 20 <212> ADN <213> Gardnerella vaginalis <400> 9 20

cagcaatctt ttcgccaact

20

50 55

<210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Gardnerella vaginalis <400> 10 tgcaactatt tctgcagcag atcc 24

60

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Lactobacillus sp.

<400> 11

E07866534 04-11-2011

tacatcccaa ctccagaacg 20

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Lactobacillus sp.

<400> 12

aagcaacagt accacgacca 20

<210> 13

<211> 21

<212> ADN

<213> Lactobacillus sp.

<400> 13

tgacaagcca ttcttaatgc a 21

<210> 14

<211> 22

<212> ADN

<213> Albúmina humana

<400> 14

gctgtcatct cttgtgggct gt 22

<210> 15

<211> 23

<212> ADN

<213> Albúmina humana

<400> 15

aaactcatgg gagctgctgg ttc 23

<210> 16

<211> 26

<212> ADN

<213> Albúmina humana

<400> 16

cctgtcatgc ccacacaaat ctctcc 26

<210> 17

<211> 141

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento del exón 12 del gen de la albúmina humana de las posiciones 16283 a 16423 modificado por inserción del sitio de escisión XhoI

<400> 17

<210> 18 <211>939

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia que combina unas secuencias de Mobilincus curtisii, Mobilinc us mulieris, Gardnerella vaginalis, Lactobacillus sp, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Atopobium vaginae, Candida albic ans y albúmina humana

<400> 18

<210> 19

<211>178 15 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de Mobilincus curtisii y Mobilincus mulieris 20

<400> 19

<210> 20 25 <211> 183

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 30 <223> Secuencia de Gardnerella vaginalis y Lactobacillus sp

<400> 20

<210> 21

<211> 145

<212> ADN

<213> Ureaplasma urealyticum

<400> 21

10

<210> 22

<211> 188

<212> ADN

<213> Mycoplasma hominis

15

<400> 22

<210> 23 20 <211> 150

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 25 <223> Secuencia de Atopobium vaginae y Candida albicans

<400> 23

30 <210> 24

<211> 145

<212> ADN

<213> Albúmina humana

35 <400> 24

5

<210> 25 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia artificial

10

<220> <223> cebador <400> 25

gccatggaaa aggtgggtc

19

15

<210> 26 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

20

<220> <223> cebador

<400> 26

25

cctgatggaa tatcgaaacg a 21

30

<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador

35

<400> 27

actggtgacc gtcctatcca

20

40

<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

45

<220> <223> cebador <400> 28

ccaaactcat gggagctgct

20

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de diagnóstico y de seguimiento in vitro del estado de la flora bacteriana vaginal frente a la presencia de una vaginosis bacteriana y, llegado el caso, para el seguimiento de su tratamiento terapéutico, caracterizado porque

   5 -1/ se cuantifican las concentraciones de bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis

   * determinando las concentraciones de secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis presentes en una sola copia en el ADN de dichas bacterias Atopobium vaginae y

   10 Gardnerella vaginalis respectivamente, y de una secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, en el ADN extraído de una muestra de secreción vaginal de paciente, presentando dichas secuencias específicas un tamaño inferior a 150 nucleótidos,

   15 * mediante co-amplificación enzimática de tipo PCR de dichas secuencias específicas contenidas, por un lado, en dicho ADN extraído de la muestra y, por otro lado, en unas muestras de fragmentos de ADN sintéticos que comprenden cada una de dichas secuencias específicas dichas bacterias y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica de células humanas, sirviendo dichas muestras de estándar de calibrado de cuantificación del ADN,

   * realizándose la detección y la cuantificación de dichos fragmentos con la ayuda de sondas marcadas de secuencias distintas de las de los cebadores de amplificación para cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas,

   * siendo dichas secuencias específicas de dichas bacterias las secuencias siguientes, que incluyen unas secuencias de dichas sondas (subrayadas) flanqueadas por unas secuencias de dichos cebadores (en negrita) o sus secuencias complementarias:

   30 - para Atopobium vaginae:

   -

   para Gardnerella vaginalis:

   -

   2/ se determina la presencia de una vaginosis bacteriana o el fracaso del tratamiento terapéutico en curso, con un valor predictivo positivo de por lo menos 95% y un valor predictivo negativo de por lo menos 99%, si las

   40 concentraciones de fragmentos de ADN de las dos secuencias específicas de las bacterias Atopobium vaginae y respectivamente Gardnerella vaginalis en una muestra de extracción de secreciones vaginales de paciente que contiene por lo menos 104 células humanas/ml, son tales que se respeta una por lo menos de las 2 condiciones a) y b) siguientes:

   45 a) la concentración Ca en dicho fragmento de ADN de Atopobium vaginae es superior o igual a 108 copias/ml, y b) la concentración Cg en dicho fragmento de ADN de Gardnerella vaginalis es superior o igual a 109 copias/ml.
2. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque:

   50 - a/ en la etapa 1/, se cuantifican además las bacterias Lactobacillus sp. que comprenden por lo menos las bacterias Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseneii, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus iners,

   * determinando además la concentración de una secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp.,

   55 estando dicha secuencia específica de los Lactobacillus sp. presente en una sola copia en el ADN de dichas bacterias Lactobacillus sp., y siendo de tamaño inferior a 150 nucleótidos,

   * mediante co-amplificación enzimática de tipo PCR adicional de dicha secuencia específica de las bacterias Lactobacillus sp. contenida, por un lado, en dicho ADN extraído de la muestra y, por otro lado, en una muestra de fragmentos de ADN sintético que comprende, además, dicha secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp., comprendiendo dicho fragmento de ADN sintético dicha secuencia específica de

   5 dichas bacterias Lactobacillus sp. que sirven de estándar de calibración de cuantificación,

   * siendo la detección y la cuantificación de dichos fragmentos realizadas con la ayuda de sondas marcadas de secuencias distintas de las de los cebadores de amplificación para cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, Lactobacillus sp. y dicha

   10 secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, y

   -

   b/ en la etapa 2/, se determina una vaginosis bacteriana si, además, la concentración Cl en fragmento de ADN

   específico de dichas bacterias Lactobacillus sp. es inferior o igual a 108 copias/ml, preferentemente inferior o 15 igual a 107 copias/ml.
3. 3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque se determina una vaginosis bacteriana si dichas concentraciones son tales que se respetan las 3 condiciones siguientes:

   20 a- concentración Ca en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Atopobium vaginae es superior o igual a 108 copias/ml,

   b-concentración Cg en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Gardnerella vaginalis es superior o igual a 109 copias/ml, y 25 c-concentración Cl en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Lactobacillus sp. es inferior o igual a 107 copias/ml.
4. 4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se realizan unas reacciones de

   30 amplificación y de cuantificación mediante PCR en tiempo real, utilizando unas sondas de hidrólisis específicas respectivamente de cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias y secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, en la muestra a ensayar.

   35 5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dichas secuencias específicas presentan un tamaño de 70 a 150 nucleótidos, preferentemente de 90 a 120 nucleótidos.
5. 6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utiliza un gran fragmento sintético de ADN que sirve de estándar de calibrado de cuantificación del ADN, agrupando dicho gran fragmento de ADN

   40 sintético dichas secuencias específicas respectivamente de cada una de dichas bacterias cuyas concentraciones son cuantificadas, y dicha secuencia de ADN humano específico de células humanas.
6. 7. Método según la reivindicación 1 a 6, caracterizado porque dichas secuencias específicas de dichas bacterias comprenden para la bacteria Lactobacillus sp., una secuencia común a las bacterias Lactobacillus crispatus,

   45 Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners y Lactobacillus acidophilus en el seno del gen tuf que codifica para el factor de elongación en las posiciones 253 a 343 del gen de referencia Genebank AY 562191.1.
7. 8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha secuencia específica para Lactobacillus sp. es la

   secuencia siguiente que incluye una sonda (subrayada) flanqueada por unas secuencias de dichos cebadores (en 50 negrita) o sus secuencias complementarias:
8. 9. Método según una de las reivindicaciones 6 y 8, caracterizado porque dicho gran fragmento de ADN comprende, 55 como secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar, una secuencia específica de la albúmina.
9. 10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque dicha secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar comprende el fragmento de las posiciones 16283-16423 del exón 12 del gen de la albúmina humana de referencia Genebank M12523.1 de secuencia del listado de secuencias siguiente o la secuencia

   60 complementaria: 11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar comprende el fragmento de las posiciones 16283-16423 del exón 12 del gen de la albúmina humana de referencia Genebank M12523.1 modificada mediante inserción de un sitio de escisión, en particular el sitio Xhol (secuencia entre paréntesis), fuera de las secuencias que corresponden a los cebadores (secuencias en negrita) y secuencia sonda (secuencia subrayada) de secuencia del listado de secuencias siguiente o la secuencia complementaria:

   10 12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se utilizan los juegos de cebadores y de sondas seleccionados, llegado el caso, de entre las secuencias siguientes del listado de secuencias o respectivamente sus secuencias complementarias:

   -

   para Atopobium vaginae:

   15 Cebador 5': Sec. n°5 = 5'-CCCTATCCGCTCCTGATACC-3' Cebador 3': Sec. n°6 = 5'-CCAAATATCTGCGCATTTCA-3' Sonda: Sec. n° 7 = 5'-GCAGGCTTGAGTCTGGTAGGGGA-3'

   20 - para Gardnerella vaginalis:

   Cebador 5': Sec. n°8 = 5'-CGCATCTGCTAAGGATGTTG-3' Cebador 3': Sec. n°9 = 5'-CAGCAATCTTTTCGCCAACT-3' Sonda: Sec. n° 10 = 5'-TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-3'

   -

   para Lactobacillus sp.:

   Cebador 5':Sec. n° 11 = 5'-TACATCCCAACTCCAGAACG-3' Cebador 3': Sec. n°12 = 5'-AAGCAACAGTACCCACGACCA-3'

   30 Sonda: Sec. n° 13 = 5'-TGACAAGCCATTCTTAATGCA-3',

   -

   para la albúmina humana:

   Cebador 5': Sec. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'

   35 Cebador 3': Sec. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' Sonda: Sec. n° 16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3'
10. 13. Método según una de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque dicho gran fragmento de ADN sintético

    constitutivo del ADN de la muestra estándar de calibrado de la cuantificación se inserta en un plásmido. 40
11. 14. Estuche de diagnóstico útil para la realización de un método según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende

    -

    unas muestras de ADN estándar de calibrado que comprende dichas secuencias específicas de cada una de

    45 dichas bacterias tales como las definidas en una de las reivindicaciones 1, 5, 7 y 8, preferentemente dicha secuencia específica del ADN humano tal como la definida en las reivindicaciones 1, 9, 10 y 11 y, más preferentemente, dicho gran fragmento de ADN sintético tal como el definido en las reivindicaciones 6 y 13, así como

    50 - dichos juegos de cebadores específicos de dichos fragmentos de ADN sintéticos modificados específicos de dichas bacterias y más preferentemente, dichas sondas tales como las definidas en una de las reivindicaciones 1, 4, 8 y 12, y

    -

    unos agentes reactivos de realización de una reacción de amplificación de ADN de tipo PCR.