ES2371976A1 - Método de identificación de los patógenos de peces: photobacterium damsela, tenacibaculum soleae, tenacibaculum maritimum y vibrio harveyi. - Google Patents
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Abstract
Método de identificación de los patógenos de peces: Photobacterium damselae, Tenacibaculum soleae, Tenacibaculum maritimum y Vibrio harveyi mediante PCR y RLB (Reverse-line blot hybridization), sondas y kit de detección.
Description
Método de identificación de los patógenos de
peces: Photobacterium damselae, Tenacibaculum soleae,
Tenacibaculum maritimum y Vibrio harveyi.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la biología molecular y la veterinaria y se refiere a la
detección e identificación de las especies bacterianas,
Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum
soleae y Vibrio harveyi, todas ellas agentes etiológicos
de enfermedades comunes en peces cultivados, y por tanto, de
especial importancia en el campo de la acuicultura.
La acuicultura ha sido uno de los sectores de la
producción animal que más rápidamente ha crecido en los últimos
veinte años debido, fundamentalmente, a los avances tecnológicos.
Sin embargo, el estrés causado por distintos factores ambientales,
como variaciones en la temperatura o altas densidades de cultivo,
hace que disminuyan los mecanismos de defensa de los peces. Estos
factores, unidos a otros como, por ejemplo, la presencia en el medio
de contaminación orgánica que favorece el aumento de patógenos
oportunistas, pueden llevar a la aparición de brotes patológicos.
Así pues, en los sistemas de cultivos intensivos y
semi-intensivos, las enfermedades de origen
infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.) son un factor limitante
que puede determinar la calidad y seguridad del producto final. Un
diagnóstico rápido y preciso de las enfermedades, la aplicación de
medidas preventivas y unos estudios epidemiológicos precisos
constituyen las claves para minimizar el impacto de las enfermedades
en la acuicultura. Por eso, es necesario revisar los métodos
actuales de diagnóstico para mejorar el manejo sanitario de las
explotaciones acuícolas, y el control de las enfermedades.
Dentro de las patologías infecciosas, son las de
origen bacteriano las más frecuentes y a menudo también las mas
problemáticas y difíciles de controlar. En concreto son muy
frecuentes cuatro especies de bacterias gram negativas patógenas de
peces, que pueden aparecer aisladas o conjuntamente en un episodio
de mortalidad: Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum,
Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi.
Photobacterium damselae comprende dos
subespecies fenotípicamente distintas y que desarrollan distintas
enfermedades, aunque ambas han sido asociadas con enfermedades en
animales marinos. P. damselae subsp. piscicida (antes
Pasteurella piscicida) es el agente etiológico de la
pasteurelosis, una enfermedad caracterizada por la ausencia de
lesiones externas y la presencia de hemorragias y granulomas en
hígado, riñón y bazo. Es una de las enfermedades más devastadoras en
acuicultura marina, causando mortalidades masivas en muchas especies
de peces con una distribución mundial (Zorrilla et al., 1999,
Journal of fish diseases 22:167-172; Romalde
et al., 2002. Systematic and Applied Microbiology 25:
544-550, Toranzo et al., 2005.
Aquaculture 246: 37-61). Por otro lado, la
subespecie P. damselae subsp. damselae (antes
Vibrio damsela) comprende cepas que producen úlceras cutáneas
y septicemia hemorrágica en un amplio rango de peces. Aunque
generalmente es descrito como un patógeno secundario, algunos
aislados pueden ser patógenos primarios en peces e incluso en
humanos (Fouz et al., 2000. Journal of Applied
Microbiology 88:531-535, Fouz et al.,
1992. FHS/AFS Newsletter 20:3-4, Shin et
al., 1996. Clinical Infectious Diseases
22:856-857). La identificación de esta especie se
puede realizar mediante cultivo y caracterización bioquímica (API
20E, API CH50), mediante técnicas inmunológicas (aglutinación,
ELISA), o mediante métodos moleculares basados en la PCR, más
sensibles y rápidos. En este sentido, Kvitt et al., 2002.
(Diseases of Aquatic Organisms 48:187-195) y
Osorio et al., 1999 (Applied and Environmental
Microbiology 65(7): 2942-2946)
desarrollaron protocolos de PCR con cebadores específicos para P.
damselae, diseñados en el gen de ADN ribosómico 16S, mientras
que Rajan et al., 2003 (Journal of Applied
Microbiology 95:1375-1380) lo hizo basándose en
la secuencia del gen del polisacárido capsular. González et
al., 2004 (Journal of Clinical Microbiology.
p1414-1419) diseñaron sondas basándose en los loci
ureC (ureasa) y dly (síntesis de damselina) para la identificación
de P. damselae subsp. damselae utilizando microarrays
de ADN. Para la diferenciación de las dos subespecies, Osorio et
al., 2000 propusieron una PCR múltiple con primers dirigidos a
los genes 16S y ureC. La diferenciación de las
\hbox{dos
subespecies se hace en base a la ausencia o presencia del gen de la
ureasa (ureC).}
Tenacibaculum maritimum es el agente
etiológico de la tenacibaculosis o flexibacteriosis, enfermedad
ulcerativa de distribución mundial que afecta a gran número de
especies de peces marinos y que tiene un considerable impacto
económico en la acuicultura marina. La enfermedad fue descrita en
1977 por Masumura y Wakabayashi en Japón causando altas mortalidades
en peces marinos cultivados. Se caracteriza por la aparición de
cuadros ulcerativos en la superficie corporal del pez, erosión en
aletas y boca, pudiendo llegar a causar en algunos casos cuadros
septicémicos. El aislamiento de la bacteria a partir de las lesiones
puede resultar complicada, pues es fácilmente ocultada o inhibida
por el crecimiento de otras bacterias presentes en las mismas
(Avendaño-Herrera et al., 2006. Diseases
of Aquatic Organisms. 71: 255-266). La
identificación del patógeno se puede realizar en base a
características morfológicas y bioquímicas, o mediante métodos
moleculares. Toyama et al. 1996 (Fish Pathology,
31(1): 25-31) y Bader y Shotts 1998
(Journal of Aquatic Animal Health, 10(4):
311-319) diseñaron cebadores específicos que usaban
como diana el gen del ARN ribosómico 16S, flanqueando fragmentos de
1088 pb y 400 pb. Otros autores desarrollaron métodos basados en la
PCR, como PCR-ELISA (Wilson et al., 2002.
Journal of Microbiological Methods 51(33):
163-170), RT-PCR-EHA
(Wilson y Carson, 2003. Diseases of Aquatic Organisms
54:127-134) y microarrays con sondas de ADN (Warsen
et al., 2004. Applied and Environmental Microbiology
70: 4216-4221).
Tenacibaculum soleae es un patógeno
bacteriano recientemente descrito, aislado hasta el momento en
ejemplares enfermos de lenguado senegalés (Solea
senegalensis) en Galicia, España (Piñeiro-Vidal
et al., 2008. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology,
58(4):881-885). La identificación de esta
especie se puede realizar en base a características morfológicas,
bioquímicas y serológicas. No existe en la actualidad ningún método
de diagnostico rápido, basado en la PCR, específico para esta
especie.
Vibrio harveyi (sinónimos: Vibrio
carchariae, Vibrio trachuri) es un importante patógeno
bacteriano, causante de vibriosis en un amplio número de vertebrados
e invertebrados marinos. Particularmente afecta a los cultivos de
estos últimos (langostinos peneidos, langostas, orejas de mar, etc.)
en Asia y Sudamérica, causando mortalidades masivas que resultan en
graves pérdidas económicas y constituyendo un importante factor
limitante en el desarrollo de los mismos. Sin embargo también ha
sido descrito causando grandes mortalidades en distintas especies de
peces cultivados (lenguado, mero, besugo, etc.). Ha sido aislado
también en ejemplares enfermos de distintas especies de tiburones, y
causando gastroenteritis en humanos. Los síntomas que presentan los
peces afectados van desde úlceras cutáneas hasta lesiones en los
ojos, gastroenteritis, etc. (Austin y Zhang, 2006. Letters in
Applied Microbiology 43:119-124). La
identificación del patógeno mediante tests bioquímicos
convencionales es problemática debido a la heterogeneidad fenotípica
-y genotípica- de V. harveyi y a su estrecha relación con
otras especies de vibrios como V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus y V. campbellii. Gomez-Gil
et al., 2004 (Microbiology
150:1769-1777) mostraron que V. harveyi y
V. campbellii eran indistinguibles en mas de 100
características fenotípicas. Se han desarrollado varios métodos de
identificación basados en la PCR. Así, Oakey et al., 2003
(Journal of Applied Microbiology.
95:1293-1303) y Hernández y Olmos 2004 (Applied
Microbiology and Biotechnology 63:722-727)
desarrollaron protocolos de PCR con cebadores específicos para V.
harvey diseñados en el gen del ARN ribosómico 16S y en el gen
lux N, respectivamente. Conejero y Hedreyda, 2003 (Journal of
Applied Microbiology 95:1293-1303) y Pang et
al., 2006 (Letters in Applied Microbiology 43
(3):249-255) hicieron lo propio utilizando como
diana el gen toxR. No obstante, Oackey et al., 2003.
Journal of Applied Microbiology 95:1293-1303)
reportaron casos de falsos positivos con cepas de V.
alginolyticus, mientras que
\hbox{Conejero y Hedreyda, 2003
( Journal of Applied Microbiology
95:1293-1303) han reportado casos de falsos
negativos.}
Aunque el gen ribosómico 16S es frecuentemente
utilizado para la identificación de bacterias, la región intergénica
16S-23S es mas variable y permite una mejor
discriminación entre especies relacionadas, por lo que ha sido
ampliamente utilizada para el diseño de cebadores para PCR y sondas
específicas para hibridaciones (Barry et al., 1991. Genome
Research 1: 51-56; Lee et al., 2002.
Marine Pollution Bulletin 44:412-420; Hassan
et al., 2003. Systematic and Applied Microbiology
26:97-110; Osorio et al. 2005. Applied
and Environmental Microbiology. 71:
636-645; Matsuyama et al., 2006. Fish
Pathology 41:105-112).
La técnica de hibridación inversa con sondas
específicas o "Reverse-line blot
hybridization" (RLB) es una poderosa técnica desarrollada por
Kaufhold et al., 1994. (FEMS Microbiol. Lett.
119:19-25) que permite la identificación simultanea
de hasta 43 secuencias dianas distintas en 43 muestras, en un solo
ensayo. La esencia de esta técnica es la hibridación de productos de
PCR con sondas específicas, a fin de identificar diferencias en las
secuencias amplificadas. Ha sido aplicada en la detección de
múltiples especies de virus, bacterias y hongos, pero no para la
identificación de patógenos bacterianos de peces.
La utilización de esta técnica permite, sin
embargo, resolver el problema que plantea tener que identificar un
alto número de microorganismos que causan enfermedades en peces
cultivados y que pueden infectar conjuntamente a un individuo. Otra
ventaja radica en que las sondas diseñadas pueden utilizarse
conjuntamente con otras que hayan sido diseñadas en la misma región
del genoma, para otros patógenos.
La presente invención proporciona un método de
identificación de las principales bacterias patógenas gram negativas
que son agentes etiológicos frecuentes en acuicultura. La
identificación del agente causal de patologías comunes en peces
cultivados constituye una valiosa herramienta en la conducta
terapéutica a emplear y para el control de calidad y sanitario.
El método aquí propuesto consiste en la
utilización de sondas específicas, diseñadas o bien en la región
intergénica de los genes ribosómicos 16S y 23S o bien en el extremo
5' del gen 23S, para la identificación de los patógenos antes
mencionados mediante la técnica de hibridación inversa con sondas
específicas o "Reverse-line blot
hybridization" (RLB). En la presente invención, la región
ribosomal intergénica 16S-23S, junto con parte de
los genes ribosómicos 16S y 23S, son amplificadas mediante el empleo
de cebadores universales que se unen a regiones conservadas de los
extremos 3' del gen 16S y del 5' del gen 23S. Esto permite la
amplificación a partir de bacterias de distintos géneros, entre los
que se encuentran las bacterias detectadas por los métodos o el kit
de la invención. Los cebadores universales flanquean regiones
hipervariables que son amplificadas y detectadas por sondas
específicas diseñadas por los autores de la presente invención,
permitiendo la detección e identificación de las especies
bacterianas Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum,
Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a un método para la identificación de bacterias, de ahora en
adelante primer método de la invención, que comprende:
- a.
- extraer el ADN total de una muestra biológica aislada,
- b.
- poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene los cebadores para la amplificación de la región intergénica 16S-23S y parte de ambos genes ribosómicos flanqueantes,
- c.
- amplificar, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la región intergénica 16S-23S ribosomal y parte de ambos genes ribosómicos flanqueantes,
- d.
- identificar la presencia o ausencia de al menos una de las especies Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae mediante RBL con al menos una de las sondas cuya secuencia consiste en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente.
Un segundo aspecto se refiere a un método para
la identificación de bacterias, de ahora en adelante segundo método
de la invención, que comprende los pasos (a)-(c) del primer método
de la invención, y además:
- d.
- identificar la presencia o ausencia simultánea de al menos dos de las especies Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi mediante RBL con al menos dos de las sondas cuyas secuencias consisten en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente.
Los organismos de las especies Photobacterium
damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae y
Vibrio harveyi son bacterias gram negativas.
En esta memoria, Photobacterium damselae
es un organismo celular del Superreino Bacteria, Phylum
Proteobacteria, Clase Gammaproteobacteria, Orden
Vibrionales, Familia Vibrionaceae, Género
Photobacterium.
Tenacibaculum maritimum y
Tenacibaculum soleae son organismo celulares del Superreino
Bacteria, Phylum Bacteroidetes, Clase
Flavobacteria, Orden Flavobacteriales, Familia
Flavobacteriaceae, Género Tenacibaculum.
Vibrio harveyi es un organismo celular
del Superreino Bacteria, Phylum Proteobacteria, Clase
Gammaproteobacteria, Orden Vibrionales, Familia
Vibrionaceae, Género Vibrio.
Los inventores demuestran, como puede verse en
los ejemplos de la presente invención, que las sondas cuyas
secuencias consisten en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5
y SEQ ID NO: 6 son específicas para cada una de las especies
bacterianas Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum,
Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi respectivamente.
Todas ellas han sido diseñadas para hibridar en regiones variables
del espaciador ribosómico intergénico 16S-23S,
excepto la sonda de V. harveyi que fue diseñada para hibridar
sobre la parte inicial del extremo 5' del gen del ARN ribosómico
23S.
En esta memoria se entiende por "región
intergénica 16S-23S ribosomal y parte de ambos genes
ribosómicos flanqueantes" la región homologa a la secuencia que
se describe entre los nucleótidos de la posición 1390 de la región
16S del rRNA y la posición 456 del 23S del rRNA de E. coli,
tal y como se describe en Lee et al., 2002. (Marine
Pollution Bulletin 44:412-420).
El término "homología", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos
estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más
concretamente, a la semejanza entre dos o más secuencias de
nucleótidos o aminoácidos. Puesto que dos secuencias se consideran
homologas si tienen el mismo origen evolutivo, en general, se asume
que valores superiores de similitud o identidad del 50% indicarían
homología.
El término "identidad", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de
nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias
nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de
comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica,
e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG,
incluyendo GAP (Devereux et al., 1984. Nucleic Acids
Research 12: 287 Genetics Computer Group University of
Wisconsin, Madison, (WI); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul
et al., 1999. J. Mol. Biol. 215:
403-410).
Por tanto, cebadores universales capaces de
amplificar al menos la región homologa a la región definida como
"región intergénica 16S-23S ribosomal y parte de
ambos genes ribosómicos flanqueantes" en distintas especies
bacterianas serán útiles para lleva a cabo los métodos de la
presente invención. Por ejemplo, pero sin limitarnos, los cebadores
cuya secuencia consiste en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, descritos
en 16/23S-F Lee et al, 2002. (Marine
Pollution Bulletin 44:412-120).
La especificidad de las sondas se evaluó
utilizando 8 cepas de P. damselae subsp piscicida
aisladas de lenguado senegalés (Solea senegalensis), así como
las cepas de referencia P. damselae subsp damselae
CECT 626 y P. damselae subsp piscicida CECT 5895; 8
cepas de T. maritimum aisladas de lenguado senegalés
(Solea senegalensis) y acedía (Dicologoglossa cuneata)
y la cepa de referencia CECT 4276; 8 cepas de T. solaea
aisladas de rombo (Scophthalmus rhombus), lenguado senegalés
y acedía, además de la cepa tipo LL04 12.1.7; 13 cepas de V.
harveyi aisladas de lenguado senegalés y acedía, junto con las
cepas de referencia CECT 525 y CECT 5156. Además, se utilizaron 47
cepas pertenecientes a otras especies, tanto próximas como alejadas
filogenéticamente de las especies diana: Photobacterium spp.,
Photobacterium leiognathi, Photobacterium angustum,
Photobacterium phosphoreum, Vibrio spp., V. alginolyticus, V.
parahaemolyticus, Vibrio campbellii, Vibrio fischeri, Vibrio logei,
Vibrio natriegens, Vibrio tubiashii, V. tapetis, V. splendidus,
Aeromonas salmonicida subsp salmonicida, Pseudoalteromonas spp.,
Psychrobacter spp., Pseudomonas spp., Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas anguilliseptica,
Pseudomonas aeruginosa, Tenacibaculum spp., Tenacibaculum
ovolyticum, Flavobacterium marinotypicum, Flavobacterium johnsoniae,
Flavobacterium psychrophilum, Polaribacter spp. y Escherichia
coli. Todas las cepas de las especies diana fueron correctamente
identificadas, mientras que las cepas de las especies no diana
dieron resultados negativos, con la excepción de la reacción cruzada
entre la sonda de V. harveyi y la cepa V. campbellii
CECT
523.
523.
Sparagano et al., (2002) secuenciaron
parte del gen 23S de vahas especies de vibrios, encontrando que las
cepas tipo V. harveyi LMG 4044, V. harveyi LMG 7890 y
V. campbellii CECT 523 tenían secuencias similares. Por otra
parte la cepa ensayada para esta especie, Vibrio campbellii
CECT 523, presenta una secuencia similar a Vibrio harveyi
tanto en el gen 23S como en la región intergénica
16S-23S, por lo que esta región del genoma parece no
prestarse a la diferenciación de estas dos especies.
La sensibilidad del método se determino
utilizando diluciones decimales seriadas de ADN extraído de cultivo
puro de las cepas diana P. damselae subsp piscicida
a321, T. maritimum a443, T. soleae a47 y V.
harveyi a91. La concentración del mismo se determinó por
espectrofotometría (absorbancia a 260 nm). El límite de detección
fue de 10 pg en el caso de la sonda de P. damsela; 100 pg en
el caso de las sondas de T. maritimum y T. soleae, y 1
pg en el caso de la sonda de V. harveyi.
La detección por hibridación inversa con sondas
específicas, "Reverse-Line Blot
hibridization" o RLB presenta la ventaja de que no es
necesario partir de cultivos bacterianos puros. De este modo, y una
vez realizada la validación de los cebadores y las sondas con
muestras de ADN de las diferentes especies y subespecies, tal y como
se describe en los ejemplos de la invención, se pueden identificar
las distintas especies de bacterias patógenas simultáneamente con
sondas específicas a partir de la amplificación de ADN de muestras
no puras. Así, con los métodos de la presente invención es posible
detectar las bacterias y grupos bacterianos mencionados,
independientemente de la procedencia de las muestras. La muestra una
vez tomada es pretratada para poder llevar a cabo una PCR y una
posterior identificación de los amplicones mediante las sondas
específicas descritas en la presente invención. Por tanto, en una
realización preferida de los métodos de la invención, los cebadores
para la amplificación de la región intergénica
16S-23S según el paso (b) son universales. En una
realización aún más preferida, los cebadores empleados para la
amplificación intergénica son las secuencias nucleotídicas que
consisten en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.
En esta memoria se entiende por "cebadores
universales" aquellos que anillan en las regiones altamente
conservadas de los genes ribosómicos 16S y 23S, de manera que
permiten la amplificación del espaciador intergénico
16S-23S completo en un amplio rango de especies
bacterianas, aunque éstas se encuentren filogenéticamente alejadas
entre
sí.
sí.
El término "filogenia" como aquí se usa se
refiere a la relación histórica verdadera entre un conjunto de
taxones.
Por "categoría taxonómica" se entiende el
nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los
organismos.
Las bacterias detectadas por los métodos de la
presente invención pueden, en ocasiones, ser patógenas de varios
organismos, incluyendo mamíferos humanos, y se pueden relacionar con
enfermedades transmitidas por los alimentos. Por tanto, en una
realización preferida de la invención, la muestra del paso (a) es
una muestra biológica aislada de un organismo de interés.
Una muestra biológica aislada incluye, pero sin
limitarnos, a células, tejidos y/o fluidos biológicos de un
organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un
experto en la materia que sirva para tal fin. Preferiblemente en la
presente invención, la muestra biológica aislada proviene de órganos
internos, y más preferiblemente el órgano se selecciona de la lista
que comprende: hígado, riñón, bazo o cualquiera de sus
combinaciones. En otra realización preferida la muestra biológica
aislada proviene, si están presentes, de úlceras o lesiones externas
o internas.
Cuando la amplificación se realiza directamente
a partir de tejidos del organismo que, de forma natural, presentan
una microbiota propia, como es el caso de la piel, la branquia y el
tubo digestivo, los microorganismos de interés compiten con otros
por la unión a los cebadores y la consiguiente amplificación. De
esta manera, los porcentajes de identificación de dichas bacterias
disminuyen sensiblemente, siendo más adecuado, la identificación a
partir de cultivos puros.
Así pues, en una realización aún más preferida
de la invención, la identificación de las especies bacterianas
Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum
soleae y Vibrio harveyi se realiza a partir de cultivos
puros.
Se han detectado casos de septicemia en humanos
causada por Photobacterium damselae subsp. damselae
(Shin et al., 1996. Clinical Infectious Diseases
22:856-857), y de gastroenteritis provocada por
V. harveyi. Sin embargo, como se ha dicho, Photobacterium
damselae es el agente causal de la pasteurelosis en peces de aguas
frías y templadas, Tenacibaculum maritimum es el agente
etiológico de la tenacibaculosis o flexibacteriosis en peces
marinos, Tenacibaculum soleae es un patógeno bacteriano
recientemente descrito, aislado hasta el momento en ejemplares
enfermos de lenguado senegalés (Solea senegalensis) en
Galicia, España. Por tanto, en una realización preferida de este
aspecto de la invención, el organismo de interés del que se obtiene
la muestra biológica es un pez.
En esta memoria se entiende por "pez" los
organismos pertenecientes a las clases Myxini,
Cephalaspidomorphi, Chondrichthyes, Sarcopterygii y
Actinopterygii.
Vibrio harveyi es el causante de
vibriosis en un amplio número de vertebrados e invertebrados
marinos. Particularmente afecta a los cultivos de estos últimos
(langostinos peneidos, langostas, orejas de mar, etc.), aunque
también en distintas especies de peces cultivados (lenguado, mero,
besugo, etc.). Por tanto, en una realización preferida de este
aspecto de la invención, el organismo de interés del que se obtiene
la muestra biológica es un artrópodo.
En esta memoria se entiende por "artrópodo"
un organismo celular perteneciente al Superreino Eukaryota,
Reino Metazoa, Phylum Arthropoda.
Dada la gran abundancia de inhibidores de PCR
que pueden dar lugar a falsos negativos, es recomendable (Hoorfar
et al., 2003. J. of Clinical Microbiology,
41(12): 5835) que las pruebas de PCR contengan un Control
Interno de Amplificación (CIA). Este CIA no es más que un fragmento
de ADN, que se amplifica simultáneamente con la muestra diana, de
tal modo que su ausencia al final de las pruebas es indicativa de la
presencia de factores, que han provocado un indeseado desarrollo de
la PCR. Así pues, en una realización preferida el método según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende al menos
un control de amplificación interno.
Otro aspecto de la invención se refiere a las
sondas de secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, de
ahora en adelante sondas de la invención, que son específicas para
la detección de las especies bacterianas Photobacterium damselae,
Tenacibaculum maritimum y Tenacibaculum soleae,
respectivamente. Una realización preferida de este aspecto de la
invención se refiere a la sonda de secuencia SEQ ID NO: 6 que es
específica para la detección de la especie bacteriana Vibrio
harveyi.
Las sondas diseñadas pueden utilizarse
conjuntamente con otras que hayan sido diseñadas en la misma región
del genoma para otros patógenos. La PCR y RLB con sondas específicas
permite de esta manera la detección simultánea de más de 40 especies
bacterianas, resolviéndose así el problema que plantea tener que
identificar un alto número de microorganismos que causan
enfermedades en peces cultivados y que pueden infectar conjuntamente
a un individuo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit
de detección de bacterias, de ahora en adelante kit de la invención,
que comprende sondas específicas para la identificación de las
especies bacterianas Photobacterium damselae, Tenacibaculum
maritimum y Tenacibaculum soleae, que se seleccionan de
la lista que comprende la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
En otra realización preferida, el kit de detección de bacterias
comprende además la sonda de secuencia SEQ ID NO: 6, que es
específica para la detección de la especie bacteriana Vibrio
harveyi. En otra realización preferida, el kit de detección de
bacterias comprende además los medios adecuados para llevar a cabo
los métodos de la invención.
Dicho kit puede comprender cebadores, sondas y
todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el método de
la invención. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de
limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener
una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la
contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los
soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y
optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las
instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. A título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, el kit
contendrá todos los elementos necesarios para la detección de las
especies bacterianas por cualquiera de las técnicas que se han
descrito anteriormente, y que son conocidas por cualquier experto
medio en la materia.
A lo largo de la descripción, el termino
"específicos" implica que las sondas comprenden una secuencia
nucleotídica totalmente complementaria a los genes o fragmentos
intergénicos empleados por el método de la presente invención.
Los términos "regiones variables" o
"regiones polimórficas" en esta memoria, se entiende las
regiones que presentan una variación en la secuencia de un lugar
determinado del ADN entre los individuos de una determinada
categoría taxonómica.
Los términos "polinucleótido" y "ácido
nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a
formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto
ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Detección de Photobacterium
damselae subsp. piscicida . A) Aplicación del
protocolo con muestras de cultivos puros de cepas de distintos
patógenos de peces: Tenacibaculum soleae (líneas
2-8), Tenacibaculum maritimum (líneas
12-17), Vibrio harvey (líneas
21-27), Photobacterium damselae subsp
piscicida (líneas 31-36) y Pseudomonas
fluorescens (líneas 40-42). B) Límite de
detección del método utilizando distintas concentraciones de ADN y
de sonda. Líneas 1, 2, 3, 4, 5, y 6: 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10
pg y 1 pg de ADN de P. damselae subsp piscicida a321,
respectivamente. Filas a, b, c, d, e, f, g: 0'3, 0'6, 1'3, 2'6, 5'3,
10'6 y 21'3 \muM de sonda PG321 respectivamente.
Fig. 2. Detección de Tenacibaculum
maritimum . A) Aplicación del protocolo con muestras de
cultivos puros de cepas de distintos patógenos de peces:
Tenacibaculum soleae (líneas 2-8),
Tenacibaculum maritimum (líneas 12-17),
Vibrio harvey (líneas 21-27),
Photobacterium damselae subsp. piscicida (líneas
31-36) y Pseudomonas fluorescens (líneas
40-42). B) Límite de detección del método utilizando
distintas concentraciones de ADN y de sonda. Líneas 1,2,3, 4, 5, y
6: 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg y 1 pg de ADN de T.
maritimum a443, respectivamente. Filas a, b, c, d, e, f, g: 0'3,
0'6, 1'3, 2'6, 5'3, 10'6 y 21'3 \muM de sonda PG443,
respectivamente.
Fig. 3. Detección de Tenacibaculum
soleae A) Aplicación del protocolo con muestras de cultivos
puros de cepas de distintos patógenos de peces: Tenacibaculum
soleae (líneas 2-8), Tenacibaculum
maritimum (líneas 12-17), Vibrio harveyi
(líneas 21-27), Photobacterium damselae subsp
piscicida (líneas 31-36) y Pseudomonas
fluorescens (líneas 40-42).B) Límite de
detección del método utilizando distintas concentraciones de ADN y
de sonda. Líneas 1, 2, 3, 4, 5, y 6: 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10
pg y 1 pg de ADN de T. soleae a47, respectivamente. Filas a,
b, c, d, e, f, g: 0'3, 0'6, 1'3, 2'6, 5'3, 10'6 y 21'3 \muM de
sonda PG47, respectivamente.
Fig. 4. Detección de Vibrio
harveyi . A) Aplicación del protocolo con muestras de
cultivos puros de cepas de distintos patógenos de peces:
Tenacibaculum soleae (líneas 2-8),
Tenacibaculum maritimum (líneas 12-17),
Vibrio harveyi (líneas 21-27),
Photobacterium damselae subsp. piscicida (líneas
31-36) y Pseudomonas fluorescens (líneas
40-42). B) Límite de detección del método utilizando
distintas concentraciones de ADN y de sonda. Líneas 1, 2, 3, 4, 5, 6
y 7: 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg y 0'1 pg de ADN de V.
harveyi a91, respectivamente. Filas a, b, c, d, e, f, g: 0'3, 0'6,
1'3, 2'6, 5'3, 10'6 y 21'3 \muM de sonda PG91,
respectivamente.
Fig. 5. Detección de T. soleae, T.
maritimum, V. harveyi y P. damselae mediante
RLB con sondas específicas. Aplicación del protocolo con muestras de
cultivos puros de distintas cepas de las especies diana:
Tenacibaculum soleae (líneas 2-8),
Tenacibaculum maritimum (líneas 12-17),
Vibrio harveyi (líneas 21-27) y
Photobacterium damselae subsp piscicida (líneas
31-36), frente a las sondas específicas
correspondientes PG47, PG443, PG91 y PG321, respectivamente.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de los métodos de
detección de la invención, y de las sondas de la invención, para la
detección de las especies Photobacterium damselae, Tenacibaculum
maritimum, Tenacibaculum soleae y Vibrio harveyi.
Ejemplo
1
La sonda específica para Photobacterium
damselae utilizada en la RLB es la PG321, cuya secuencia
consiste en la SEQ ID NO: 3. Esta diseñada en la región intergenica
16S-23S y lleva un grupo amino terminal en posición
5'. La concentración óptima de sonda esta en el rango de
1'3-21'3 \muM.
La especificidad del método se evaluó utilizando
8 cepas de P. damselae subsp piscicida aisladas de
lenguado, así como las cepas de referencia P. damselae subsp
damselae CECT 626 y P. damselae subs. piscicida
CECT 5895. Además, se utilizaron 80 cepas pertenecientes a otras
especies, tanto próximas como alejadas filogenéticamente de P.
damsela: Photobacterium spp., Photobacterium
leiognathi, Photobacterium angustum, Photobacterium phosphoreum,
Vibrio spp., Vibrio harveyi, V. alginolyticus, V.
parahaemolyticus, Vibrio campbellii, Vibrio fischeri, Vibrio logei,
Vibrio natriegens, Vibrio tubiashii, V. tapetis, V. splendidus,
Aeromonas salmonicida subsp salmonicida,
Pseudoalteromonas spp., Psychrobacter spp.,
Pseudomonas spp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
putida, Pseudomonas anguilliseptica, Pseudomonas aeruginosa,
Tenacibaculum spp., Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum
ovolyticum, Tenacibaculum soleae, Flavobacterium marinotypicum,
Flavobacterium johnsoniae, Flavobacterium psychrophilum,
Polaribacter spp., Escherichia coli.
La sensibilidad del método se determino
utilizando diluciones decimales seriadas de ADN extraído de cultivo
puro de la cepa P. damselae subsp piscicida a321. La
concentración del mismo se determino por espectrofotometría
(absorbancia a 260 nm). El límite de detección fue de 10 pg (unas 3
células según Becker et al., 2000).
Para la extracción de ADN de los aislados se
disolvió una colonia bacteriana en 100 \mul de agua destilada
estéril, tratándose a 99ºC durante 10 minutos. Se centrifugo a 12000
rpm durante 1 minuto, recuperándose el sobrenadante. La
concentración de ADN del mismo se determinó por espectrofotometría
(absorbancia a 260 nm).
La amplificación de la región intergénica
16S-23S se llevó a cabo con el producto comercial
REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix con MgCl_{2} (Sigma), siguiendo
las instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción fue la
siguiente:
- -
- REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix con MgCl_{2}: 25 \mu
- -
- Primer 16/23SF (10 \muM): 1 \mul
- -
- Primer 16/23SR-Biotina (10 \muM): 1 \mul
- -
- ADN diana: de 10 a 100 ng
- -
- Agua destilada: hasta un volumen final de 50 \mul.
Las condiciones de amplificación fueron las
siguientes: desnaturalización inicial a 94ºC 5 minutos; 35 ciclos de
desnaturalización (94ºC 1 minuto), alineamiento (54ºC 45 s), y
extensión (72ºC 45 s); finalmente un paso de extensión a 72ºC
durante 5 minutos.
La sonda específica PG321 se diluyó en
NaHCO_{3} 0'5 M pH 8'4 hasta obtener una concentración de 2'6
\muM. Se unió entonces a una membrana de nylon cargada
negativamente Biodine C (Pall Life Sciences), previamente activada
con una solución de EDAC (Sigma) al 16%, en un miniblotter ECL
Multiprobe XL (Amersham Biosciences). A continuación se inactivo la
membrana con NaOH 100 mM, y se lavó en buffer SSPE (Sigma) 2x con
0'1% SDS durante 5 minutos a 60ºC, quedando lista para su uso.
Los productos de PCR se desnaturalizaron (99ºC
10 minutos), se mantuvieron en hielo durante 10 minutos y se
transfirieron al miniblotter con la membrana, teniendo lugar la
hibridación durante 1 hora a 42ºC. Después, la membrana se lavó dos
veces con buffer SSPE 2x con 0'5% de SDS a una temperatura de 65ºC.
A continuación se incubó con peroxidasa conjugada a streptavidina
(Roche) diluida 1:4000, a 42ºC, durante 30 minutos. Se lavó entonces
con buffer SSPE 2x con 0'5% SDS a 42ºC. El revelado se produjo tras
incubar la membrana con reactivos ECL (Amersham) y exponerla a un
film ECL (Amersham).
Los resultados se muestran en la Figura 1.
El protocolo utilizado es el mismo que se ha
descrito en el ejemplo 1, salvo en lo que se refiere a la extracción
de ADN de la muestra y a la reacción de amplificación. Este
protocolo fue aplicado sobre muestras de peces (n = 10) infectados
tanto de forma natural como experimentalmente con P. damselae
subsp piscicida, siendo detectado el patógeno en el 100% de
los casos. Esto confirma la utilidad del protocolo
PCR-RLB para la detección de Photobacterium
damselae a partir de tejidos de peces.
Cada muestra de tejido, de unos 100 mg, se
homogeneizó en una mezcla de 800 \mul de buffer TE (Sigma), 45
\mul de SDS 20% y 4'5 \mul de proteinasa K 20 mg/ml (Sigma),
incubándose a una temperatura de 56ºC durante toda la noche, tras lo
cual se trataron con 2 \mul de ARNasa 10 mg/ml (Sigma) a 37ºC
durante 1 hora. La solución resultante se trató con la mezcla
fenol:cloroformo:isoamilico 25:24:1 (Sigma) y con
cloroformo:isoamilico 24:1, recuperándose entonces la fase acuosa.
El ADN se precipitó entonces con isopropanol en una primera fase y
con etanol 70% en una segunda. Finalmente se resuspendió en 50
\mul de agua destilada estéril.
Se llevó a cabo como se ha descrito en el
ejemplo 1 a), modificándose únicamente el número de ciclos de
amplificación, 45 en este caso.
Ejemplo
2
La amplificación de la región intergénica
16S-23S y parte de ambos genes ribosómicos
flanqueantes (los extremos 3' del gen 16S y 5' el gen 23S) se
realizó con los cebadores universales 16/23SF y 16/23SR (Lee et
al., 2002. Marine Pollution Bulletin
44:412-420). Se llevó a cabo en un volumen final de
50 \mul que incluía el tampón de amplificación (10 mM
Tris-HCL pH 8'3, 50 mM KCl, 1'5 mM MgCl_{2}), los
cuatro desoxinucleótidos (dATP, dCTP, TTP, dGTP) a una concentración
final de 200 \muM cada uno, 3 unidades de Taq DNA Polimerasa, agua
destilada (en función de la cantidad de ADN), los dos cebadores a
una concentración final de 200 nM cada uno y el ADN diana
(10-100 ng). El cebador 16/23SR va marcado con
biotina en el extremo 5'.
Las condiciones de amplificación fueron las
siguientes: desnaturalización inicial a 94ºC 5 minutos; 35 ciclos de
desnaturalización (94ºC 1 minuto), alineamiento (54ºC 45 s), y
extensión (72ºC 45 s); finalmente un paso de extensión a 72ºC
durante 5 minutos.
La sonda específica para T. maritimum
utilizada en la RLB es la PG443, cuya secuencia consiste en la SEQ
ID NO: 4. Esta diseñada en la región intergénica
16S-23S y lleva un grupo amino terminal en posición
5'. La concentración óptima de sonda está en el rango de
2'6-21 \muM. La hibridación se realizó a 42ºC y
los lavados a 65ºC.
La especificidad del método se evaluó utilizando
8 cepas de T. maritimum aisladas de lenguado (Solea
senegalensis) y acedía (Dicologoglossa cuneata)
pertenecientes a distintos serotipos, así como la cepa de referencia
T. maritimum CECT4276. Además, se utilizaron 81 cepas
pertenecientes a otras especies, tanto próximas como alejadas
filogenéticamente de T. maritimum: Tenacibaculum spp.,
Tenacibaculum ovolyticum, Tenacibaculum soleae, Flavobacterium
marinotypicum, Flavobacterium johnsoniae, Flavobacterium
psychrophilum, Polaribacter spp., Aeromonas salmonicida
subsp salmonicida, Vibrio spp., Vibrio harveyi, V.
alginolyticus, V. parahaemolyticus, Vibrio campbellii, Vibrio
fischeri, Vibrio logei, Vibrio natriegens, Vibrio tubiashii, V.
tapetis, V. splendidus, Photobacterium spp., Photobacterium
damselae subsp. piscicida, Photobacterium damselae subsp.
damselae, Photobacterium leiognathi, Photobacterium angustum,
Photobacterium phosphoreum, Pseudoalteromonas spp.,
Psychrobacter spp., Pseudomonas spp., Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas anguilliseptica,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli.
La sensibilidad del método se determinó
utilizando diluciones decimales seriadas de ADN extraído de cultivo
puro de la cepa T. maritimum a443. La concentración del mismo
se determino por espectrofotometría (absorbancia a 260 nm). El
límite de detección fue de 100 pg (unas 30 células según Becker
et al., 2000. Applied and Environnmental Microbiology
66(11): 4945-4953).
Para la extracción de ADN de los aislados se
disolvió una colonia bacteriana en 100 Gl de agua destilada estéril,
tratándose a 99ºC durante 10 minutos. Se centrifugó a 12000 rpm
durante 1 minuto, recuperándose el sobrenadante. La concentración de
ADN del mismo se determinó por espectrofotometría (absorbancia a 260
nm).
La amplificación de la región intergénica
16S-23S y de las regiones flanqueantes de los genes
16S y 23S se llevó a cabo con el producto comercial REDTaq ReadyMix
PCR Reaction Mix con MgCl_{2} (Sigma), siguiendo las instrucciones
del fabricante. La mezcla de reacción es la siguiente:
- -
- REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix con MgCl_{2}: 25 \mul
- -
- Primer 16/23SF (10 \muM): 1 \mul
- -
- Primer 16/23SR-Biotina (10 \muM): 1 \mul
- -
- ADN diana: 10 ng
- -
- Agua destilada: hasta un volumen final de 50 \mul.
Las condiciones de amplificación fueron las
siguientes: desnaturalización inicial a 94ºC 5 minutos; 35 ciclos de
desnaturalización (94ºC 1 minuto), alineamiento (54ºC 45 s), y
extensión (72ºC 45 s); finalmente un paso de extensión a 72ºC
durante 5 minutos.
La sonda específica PG443 se diluyó en
NaHCO_{3} 0'5 M pH 8'4 hasta obtener una concentración de 2'6
\muM. Se unió entonces a una membrana de nylon cargada
negativamente Biodine C (Pall Life Sciences), previamente activada
con una solución de EDAC (Sigma) al 16%, en un miniblotter ECL
Multiprobe XL (Amersham Biosciences). A continuación se inactivo la
membrana con NaOH 100 mM, y se lavó en buffer SSPE (Sigma) 2x con
0'1% SDS durante 5 minutos a 60ºC, quedando lista para su uso.
Los productos de PCR se desnaturalizaron (99ºC
10 minutos), se mantuvieron en hielo durante 10 minutos y se
transfirieron al miniblotter con la membrana, teniendo lugar la
hibridación durante 1 hora a 42ºC. Después, la membrana se lavó dos
veces con buffer SSPE 2x con 0'5% de SDS a una temperatura de 65ºC.
A continuación se incubó con peroxidasa conjugada a streptavidina
(Roche) diluida 1:4000, a 42ºC, durante 30 minutos. Se lavó entonces
con buffer SSPE 2x con 0'5% SDS a 42ºC. El revelado se produjo tras
incubar la membrana con reactivos ECL (Amersham) y exponerla a un
film ECL (Amersham).
La membrana puede reutilizarse unas 10 veces.
Para eliminar las muestras, incubar la membrana en SDS 1% a 90ºC 30
minutos. La membrana puede almacenarse hasta su uso a 4ºC en EDTA 20
mM pH 8.
Ejemplo
3
La amplificación de la región intergénica
16S-23S y la región intergénica
16S-23S y parte de ambos genes ribosómicos
flanqueantes (el extremo 3' del gen 16S y 5' del gen 23S) se realizó
con los cebadores universales 16/23SF y 16/23SR (Lee et al„
2002. Marine Pollution Bulletin 44:412-420).
Se llevó a cabo en un volumen final de 50 \mul que incluía el
tampón de amplificación (10 mM Tris-HCL pH 8'3, 50
mM KCl, 1'5 mM MgCl_{2}), los cuatro desoxinucleótidos (dATP,
dCTP, TTP, dGTP) a una concentración final de 200 DM cada uno, 3
unidades de Taq DNA Polimerasa, agua destilada (en función de la
cantidad de ADN), los dos cebadores a una concentración final de 200
nM cada uno y el ADN diana (10-100 ng). El cebador
16/23SR va marcado con biotina en su extremo 5'. Las condiciones de
amplificación fueron las siguientes: desnaturalización inicial a
94ºC 5 minutos; 35 ciclos de desnaturalización (94ºC 1 minuto),
alineamiento (54ºC 45 s), y extensión (72ºC 45 s); finalmente un
paso de extensión a 72ºC durante 5
minutos.
minutos.
La sonda específica para T. soleae
utilizada en la RLB es la PG47, cuya secuencia consiste en la SEQ ID
NO: 5. Esta diseñada en la región intergénica
16S-23S y lleva un grupo amino terminal en posición
5'. La concentración óptima de sonda esta en el rango de
2'6-21 \muM. La hibridación se realizó a 42ºC y
los lavados a 65ºC. La especificidad del método se evaluó utilizando
8 cepas de T. soleae aisladas de rombo (Scophthalmus
rhombus), lenguado (Solea senegalensis) y acedía
(Dicologoglossa cuneata) así como la cepa tipo T.
soleae LL04 12.1.7. Además, se utilizaron 81 cepas
pertenecientes a otras especies, tanto próximas como alejadas
filogenéticamente de T. soleae: Tenacibaculum spp.,
Tenacibaculum ovolyticum, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium
marinotypicum, Flavobacterium johnsoniae, Flavobacterium
psychrophilum, Polaribacter spp., Aeromonas salmonicida
subsp. salmonicida, Vibrio spp., Vibrio harveyi, V.
alginolyticus, V. parahaemolyticus, Vibrio campbellii, Vibrio
fischeri, Vibrio logei, Vibrio natriegens, Vibrio tubiashii, V.
tapetis, V. splendidus, Photobacterium spp., Photobacterium
damselae subsp. piscicida, Photobacterium damselae subsp.
damselae, Photobacterium leiognathi, Photobacterium angustum,
Photobacterium phosphoreum, Pseudoalteromonas spp.,
Psychrobacter spp., Pseudomonas spp., Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas anguilliseptica,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli.
La sensibilidad del método se determinó
utilizando diluciones decimales seriadas de ADN extraído de cultivo
puro de la cepa T. soleae a47. La concentración del mismo se
determino por espectrofotometría (absorbancia a 260 nm). El límite
de detección fue de 100 pg (unas 30 células según Becker et
al., 2000. Applied and Environnmental Microbiology
66(11): 4945-4953).
Para la extracción de ADN de los aislados se
disolvió una colonia bacteriana en 100 \mul de agua destilada
estéril, tratándose a 99ºC durante 10 minutos. Se centrifugó a 12000
rpm durante 1 minuto, recuperándose el sobrenadante. La
concentración de ADN del mismo se determinó por espectrofotometría
(absorbancia a 260 nm).
La amplificación de la región intergénica
16S-23S y de las regiones de los genes 16S y 23S que
la flanquean se llevó a cabo con el producto comercial REDTaq
ReadyMix PCR Reaction Mix con MgCl_{2} (Sigma), siguiendo las
instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción fue la
siguiente:
- -
- REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix con MgCl_{2}: 25 \mul
- -
- Primer 16/23SF (10 \muM): 1 \mul
- -
- Primer 16/23SR-Biotina (10 DM): 1 \mul
- -
- ADN diana: 10 ng
- -
- Agua destilada: hasta un volumen final de 50 \mul.
Las condiciones de amplificación fueron las
siguientes: desnaturalización inicial a 94ºC 5 minutos; 35 ciclos de
desnaturalización (94ºC 1 minuto), alineamiento (54ºC 45 s), y
extensión (72ºC 45 s); finalmente un paso de extensión a 72ºC
durante 5 minutos.
La sonda específica PG47 se diluyó en
NaHCO_{3} 0'5 M pH 8'4 hasta obtener una concentración de 2'6
\muM. Se unió entonces a una membrana de nylon cargada
negativamente Biodine C (Pall Life Sciences), previamente activada
con una solución de EDAC (Sigma) al 16%, en un miniblotter ECL
Multiprobe XL (Amersham Biosciences). A continuación se inactivo la
membrana con NaOH 100 mM, y se lavó en buffer SSPE (Sigma) 2x con
0'1% SDS durante 5 minutos a 60ºC, quedando lista para su uso.
Los productos de PCR se desnaturalizaron (99ºC
10 minutos), se mantuvieron en hielo durante 10 minutos y se
transfirieron al miniblotter con la membrana, teniendo lugar la
hibridación durante 1 hora a 42ºC. Después, la membrana se lavó dos
veces con buffer SSPE 2x con 0'5% de SDS a una temperatura de 65ºC.
A continuación se incubó con peroxidasa conjugada a streptavidina
(Roche) diluida 1:4000, a 42ºC, durante 30 minutos. Se lavó entonces
con buffer SSPE 2x con 0'5% SDS a 42ºC. El revelado se produjo tras
incubar la membrana con reactivos ECL (Amersham) y exponerla a un
film ECL (Amersham).
La membrana puede reutilizarse unas 10 veces.
Para eliminar las muestras, incubar la membrana en SDS 1% a 90ºC 30
minutos. La membrana puede almacenarse hasta su uso a 4ºC en EDTA 20
mM pH 8.
Ejemplo
4
La amplificación de la región intergénica
16S-23S y parte de los genes ribosómicos 16S y 23S
se realizó con los cebadores universales 16/23SF y 16/23SR (Lee
et al., 2002. Marine Pollution Bulletin
44:412-420). Se llevó a cabo en un volumen final de
50 \mul que incluía el tampón de amplificación (10 mM
Tris-HCL pH 8'3, 50 mM KCl, 1'5 mM MgCl_{2}), los
cuatro desoxinucleótidos (dATP, dCTP, TTP, dGTP) a una concentración
final de 200 \muM cada uno, 3 unidades de Taq DNA Polimerasa, agua
destilada (en función de la cantidad de ADN), los dos cebadores a
una concentración final de 200 nM cada uno y el ADN diana
(10-100 ng). El cebador 16/23SR va marcado con
biotina en el extremo 5'.
Las condiciones de amplificación fueron:
desnaturalización inicial a 94ºC 5 minutos; 35 ciclos de
desnaturalización (94ºC 1 minuto), alineamiento (54ºC 45 s), y
extensión (72ºC 45 s); finalmente un paso de extensión a 72ºC
durante 5 minutos. La sonda específica para Vibrio harveyi
utilizada en la RLB es la PG91, cuya secuencia consiste en la SEQ ID
O: 6. Está diseñada en el gen 23S y lleva un grupo amino terminal en
posición 5'. La concentración óptima de sonda está en el rango de
0'6-21'3 \muM. La hibridación se realizó a 42ºC y
los lavados a 65ºC.
La especificidad del método se evaluó utilizando
13 cepas de Vibrio harveyi aisladas de lenguado (Solea
senegalensis) y acedía (Dicologoglossa cuneata), así como
las cepas de referencia Vibrio harveyi CECT 525 y Vibrio
harveyi CECT 5156. Además, se utilizaron 75 cepas pertenecientes
a otras especies, tanto próximas como alejadas filogenéticamente de
Vibrio harveyi: V. alginolyticus, V. parahaemolyticus,
Vibrio campbellii, Vibrio fischeri, Vibrio logei, Vibrio natriegens,
Vibrio tubiashii, V. tapetis, V. splendidus, Vibrio spp.,
Photobacterium spp., Photobacterium damselae subsp.
damselae, Photobacterium damselae subsp.
piscicida, Photobacterium leiognathi,
Photobacterium angustum, Photobacterium phosphoreum, Aeromonas
salmonicida subsp. salmonicida, Pseudoalteromonas
spp., Psychrobacter spp., Pseudomonas spp.,
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas
anguilliseptica, Pseudomonas aeruginosa, Tenacibaculum spp.,
Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum ovolyticum, Tenacibaculum
soleae, Flavobacterium marinotypicum, Flavobacterium johnsoniae,
Flavobacterium psychrophilum, Polaribacter spp., Escherichia
coli.
La sonda permite la identificación de Vibrio
harveyi frente a otras especies estrechamente relacionadas, como
Vibrio parahaemolyticus y Vibrio alginolyticus, pero
no frente a Vibrio campbellii, una especie prácticamente
indistinguible fenotipicamente de Vibrio harveyi
(Gomez-Gil et al., 2004). Sparagano et
al., (2002) secuenciaron parte del gen 23S de varias especies de
vibrios, encontrando que las cepas tipo V. harveyi LMG 4044,
V. harveyi LMG 7890 y V. campbellii LMG 11216 tenían
secuencias similares. Por otra parte la cepa ensayada para esta
especie, Vibrio campbellii CECT 523, presenta una secuencia
similar a Vibrio harveyi tanto en la región intergénica
16S-23S como en el gen 23S, por lo que esta región
del genoma parece no prestarse a la diferenciación de estas dos
especies.
La sensibilidad del método se determinó
utilizando diluciones decimales seriadas de ADN extraído de cultivo
puro de la cepa V. harveyi a91. La concentración del mismo se
estimó por espectrofotometría (absorbancia a 260 nm). El límite de
detección fue de 1 pg (unas 0'3 células según Becker et al.,
2000. Applied and Environnmental Microbiology 66(11):
4945-4953).
Para la extracción de ADN de los aislados se
disolvió una colonia bacteriana en 100 \mul de agua destilada
estéril, tratándose a 99ºC durante 10 minutos. Se centrifugó a 12000
rpm durante 1 minuto, recuperándose el sobrenadante. La
concentración de ADN del mismo se determinó por espectrofotometría
(absorbancia a 260 nm).
La amplificación de la región intergénica
16S-23S y parte de los genes16S y 23S se llevó a
cabo con el producto comercial REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix con
MgCl_{2} (Sigma), siguiendo las instrucciones del fabricante. La
mezcla de reacción fue la siguiente:
- -
- REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix con MgCl_{2}: 25 \mul
- -
- Primer 16/23SF (10 \muM): 1 \mul
- -
- Primer 16/23SR-Biotina (10 \muM): 1 \mul
- -
- ADN diana: 10 ng
- -
- Agua destilada: hasta un volumen final de 50 \mul.
Las condiciones de amplificación fueron:
desnaturalización inicial a 94ºC 5 minutos; 35 ciclos de
desnaturalización (94ºC 1 minuto), alineamiento (54ºC 45 s), y
extensión (72ºC 45 s); finalmente un paso de extensión a 72ºC
durante 5 minutos.
La sonda específica PG91 se diluyó en
NaHCO_{3} 0'5 M pH 8'4 hasta obtener una concentración de 2'6
\muM. Se unió entonces a una membrana de nylon cargada
negativamente Biodine C (Pall Life Sciences), previamente activada
con una solución de EDAC (Sigma) al 16%, en un miniblotter ECL
Multiprobe XL (Amersham Biosciences). A continuación se inactivo la
membrana con NaOH 100 mM, y se lavó en buffer SSPE (Sigma) 2x con
0'1% SDS durante 5 minutos a 60ºC, quedando lista para su uso.
Los productos de PCR se desnaturalizaron (99ºC
10 minutos), se mantuvieron en hielo durante 10 minutos y se
transfirieron al miniblotter con la membrana, teniendo lugar la
hibridación durante 1 hora a 42ºC. Después, la membrana se lavó dos
veces con buffer SSPE 2x con 0'5% de SDS a una temperatura de 65ºC.
A continuación se incubó con peroxidasa conjugada a streptavidina
(Roche) diluida 1:4000, a 42ºC, durante 30 minutos. Se lavó entonces
con buffer SSPE 2x con 0'5% SDS a 42ºC. El revelado se produjo tras
incubar la membrana con reactivos ECL (Amersham) y exponerla a un
film ECL (Amersham).
La membrana puede reutilizarse unas 10 veces.
Para eliminar las muestras, incubar la membrana en SDS 1% a 90ºC 30
minutos. La membrana puede almacenarse hasta su uso a 4ºC en EDTA 20
mM pH 8.
<110> Instituto Andaluz de investigación y
Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria y de la Producción
Ecológica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de identificación de los
patógenos de peces: Photobacterium damselae, Tenacibaculum
soleae, Tenacibaculum maritimum y Vibrio harveyi.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1682.6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 17
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador 16/23SF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0,8cm
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<210> 2
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> cebador 16/23SR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda PG321
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda PG443
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda PG47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> sonda PG91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
Claims (14)
1. Método para la detección de bacterias, que
comprende:
- a.
- extraer el ADN total de una muestra biológica aislada,
- b.
- poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene los cebadores para la amplificación de la región ribosomal intergénica 16S-23S y parte de ambos genes ribosómicos flanqueantes.
- c.
- amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa, la región ribosomal intergénica 16S-23S y parte de ambos genes ribosómicos flanqueantes,
- d.
- identificar la presencia o ausencia de al menos una de las especies Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae mediante RBL con al menos una de las sondas cuya secuencia consiste en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente.
2. Método para la detección de bacterias, que
comprende los pasos (a)-(c) según la reivindicación anterior, y
además:
- d.
- identificar la presencia o ausencia simultánea de Vibrio harveyi y al menos una de las especies Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum y Tenacibaculum soleae mediante RBL con la sonda cuya secuencia se recoge en SEQ ID NO: 6 y al menos una de las sondas cuya secuencia se recoge en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
3. Método para la detección de bacterias según
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde los
cebadores para la amplificación de la región intergénica
16S-23S según el paso (b) son universales.
4. Método para la detección de bacterias según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde los
cebadores para la amplificación de la región intergénica
16S-23S según el paso (b) son las secuencias
nucleotídicas que consisten en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO:
2.
5. Método para la detección de bacterias según
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la
identificación de las especies bacterianas Photobacterium
damselae, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum soleae y
Vibrio harveyi se realiza a partir de cultivos puros.
6. Método para la detección de bacterias según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la
muestra del paso (a) es una muestra biológica aislada de un
organismo de interés.
7. Método para la detección de bacterias según
la reivindicación 6, donde el organismo de interés del que se
obtiene la muestra biológica es un pez.
8. Método para la detección de bacterias según
la reivindicación 6, donde el organismo de interés del que se
obtiene la muestra biológica es un artrópodo.
9. Método para la detección de bacterias según
cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que además
comprende, al menos, un control de amplificación interno.
10. Sondas cuya secuencia nucleotídica consiste
en las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, que son
específicas para la detección de las especies bacterianas
Photobacterium damselae, Tenacibaculum maritimum y
Tenacibaculum soleae, respectivamente.
11. Sonda cuya secuencia nucleotídica consiste
en las SEQ ID NO: 6, para la detección de la especie bacteriana
Vibrio harveyi.
12. Kit de detección de bacterias que comprende
las sondas según la reivindicación 10.
13. Kit de detección de bacterias según la
reivindicación anterior, que además comprende la sonda cuya
secuencia nucleotídica consiste en las SEQ ID NO: 6.
14. Kit de detección de bacterias que comprende
los medios adecuados para llevar a cabo el método de detección según
cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
Priority Applications (1)
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| ES200930440A ES2371976B1 (es) | 2009-07-10 | 2009-07-10 | Método de identificación de los patógenos de peces: photobacterium damsela, tenacibaculum soleae, tenacibaculum maritimum y vibrio harveyi. |
Applications Claiming Priority (1)
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| ES200930440A ES2371976B1 (es) | 2009-07-10 | 2009-07-10 | Método de identificación de los patógenos de peces: photobacterium damsela, tenacibaculum soleae, tenacibaculum maritimum y vibrio harveyi. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2371976A1 true ES2371976A1 (es) | 2012-01-12 |
| ES2371976B1 ES2371976B1 (es) | 2012-11-19 |
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US20060228718A1 (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-12 | National Cheng Kung University | Method for rapidly identifying bacteria and kit thereof |
| CN1877328A (zh) * | 2006-07-12 | 2006-12-13 | 南开大学 | 用23s核糖体基因探针阵列检测水生动物病原菌的方法 |
| EP1895015A1 (en) * | 2005-06-17 | 2008-03-05 | Instituto de Salud Carlos III | Method and kit for the detection of bacterial species by means of dna analysis |
-
2009
- 2009-07-10 ES ES200930440A patent/ES2371976B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060228718A1 (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-12 | National Cheng Kung University | Method for rapidly identifying bacteria and kit thereof |
| EP1895015A1 (en) * | 2005-06-17 | 2008-03-05 | Instituto de Salud Carlos III | Method and kit for the detection of bacterial species by means of dna analysis |
| CN1877328A (zh) * | 2006-07-12 | 2006-12-13 | 南开大学 | 用23s核糖体基因探针阵列检测水生动物病原菌的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| (MATSUYAMA, T. et al) Rapid discrimination of fish pathogenic Vibrio and Photobacterium species by oligonucleotide DNA array. Fish Pathology, Sep. 2006, Vol 41(3), páginas 105-112. ISSN 0388-788X * |
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| (ZWART, G. et al.) Rapid Screening for Freshwater Bacterial Groups by using Reverse Line Blot Hybridization. Applied and Environmental Microbiology , Oct. 2003. Vol 69(10), paginas 5875-5883. ISSN 0099-2240 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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