ES2372806T3 - Proceso para la producción de transglutaminasa. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir transglutaminasa que comprende cultivar una bacteria corineforme que tiene un constructo de expresión genético en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de un dominio de péptido señal derivado de una bacteria corineforme se conecta al lado de aguas abajo de una secuencia promotora que funciona en una bacteria corineforme y en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural se conecta al lado de aguas abajo de dicha secuencia de ácido nucleico codificante de dicho dominio de péptido señal, permitiendo que dicha bacteria corineforme produzca y secrete dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural, y realizar luego la escisión y eliminación de la parte proestructural de dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural.
Description
Proceso para producción de transglutaminasa
La presente invención se refiere a un proceso para producir transglutaminasa, por producción por secreción. La transglutaminasa se ha utilizado en gran escala para elaboración de alimentos, la fabricación de productos farmacéuticos y otros fines.
Cierto número de procesos para la producción por secreción de proteínas heterólogas han sido publicados anteriormente, con inclusión de aquéllos que se describen en la revisión de la producción por secreción de una proteína heteróloga por una bacteria perteneciente al género Bacillus [Microbial. Rev., 57, 109-137 (1993)], la revisión de la producción por secreción de una proteína heteróloga por la levadura metilotrófica Pichia pastoris [Biotechnol., 11, 905-910 (1993)] y el informe acerca de la producción industrial de proteínas heterólogas por el moho perteneciente al género Aspergillus [Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988); Biotechnol., 9, 976-981 (1991)].
La transglutaminasa producida por la producción por secreción de acuerdo con una realización de la presente invención es una enzima que cataliza la reacción de transferencia de acilo de grupos y -carboxilamida en la cadena peptídica de la proteína. Cuando la enzima se hace reaccionar con una proteína, puede producirse la formación de la reticulación E-(y-Glu)-Lys y el reemplazamiento de Gln con Glu por desamidación. La transglutaminasa ha sido utilizada para fabricar productos alimenticios gelificados tales como gelatina, yogur, queso o productos cosméticos y otros gelificados, y para mejorar la calidad de la carne, etc (Publicación de Solicitud Japonesa Examinada No. 150382). Además, la transglutaminasa es una enzima que tiene alta utilidad industrial en el sentido de que se ha utilizado para fabricar materiales para microcápsulas termoestables, portadores para enzimas inmovilizadas, etc.
Transglutaminasas derivadas de animales y de microorganismos (transglutaminasa microbiana: a la que se hace referencia en lo sucesivo como 'MTG') se han dado a conocer con anterioridad. La primera es la enzima dependiente del ion calcio que está distribuida en órganos animales, piel, sangre, etc. Los ejemplos incluyen transglutaminasa hepática de cobayo (K. Ikura et al. Biochemistry 27, 2898 (1988)), transglutaminasa de queratinocitos epidérmicos humanos (M.A. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333 (1990)), factor XIII de coagulación de la sangre humana (A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900 (1990)) y otros.
En cuanto a la última, se han descubierto transglutaminasas independientes del calcio a partir de bacterias pertenecientes al género Streptoverticillium, que incluye, por ejemplo, Streptoverticillium griseocarneum IFO12776, Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum (éste puede abreviarse en lo sucesivo como S. cinnamoneum) IFO12852, Streptoverticillium mobaraense (éste puede abreviarse en lo sucesivo como S. mobaraense) IFO13819 y otras (Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No Examinada (JP-Kokai) No. 64-27471). El mapeado de los péptidos y el análisis estructural de los genes han revelado que la estructura primaria de la transglutaminasa producida por estos microorganismos no compartía homología alguna con las transglutaminasas de animales (Solicitud de Patente Europea No. 0481 504 A1).
Dado que la transglutaminasa derivada de microorganismos (MTG) se produce por la purificación de los cultivos de microorganismos tal como se ha descrito arriba, ha habido problemas en términos de cantidad y eficiencia y factores análogos. Se ha intentado también la producción de transglutaminasa utilizando un procedimiento de ingeniería genética. Proteínas transglutaminasa y los genes de las mismas se han publicado, por ejemplo, en Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994), Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 88-92(1994), Biochimie, 80, 313-319(1998), Eur. J. Biochem, 257, 570-576(1998), WO 96/06931, WO 96/22366, etc , que informan de la expresión y producción de transglutaminasa en sistemas hospedador-vector tales como Streptomyces lividans, Aspergillus oryzae y Escherichia coli. Además de esta información, se ha publicado un proceso en el cual se produce transglutaminasa por producción por secreción en microorganismos tales como E. coli y levadura (JP-Kokai No. 5-199883) y un método en el cual se produce MTG que posee actividades por expresión de MTG como una proteína fusionada inactiva en un cuerpo de inclusión dentro de E. coli y solubilización subsiguiente del cuerpo de inclusión utilizando agentes desnaturalizantes de proteínas, y reconstitución subsiguiente de la misma por eliminación de los agentes desnaturalizantes (JP-Kokai No. 6-30771). Sin embargo, se ha indicado el problema de que el nivel de expresión es significativamente bajo en la producción por secreción por microorganismos tales como E. coli o levadura.
Por otra parte, existen ejemplos de estudios previos para la producción por secreción eficiente de proteínas heterólogas utilizando una bacteria corineforme, que incluyen la secreción de nucleasas y lipasas [US4965197, J. Bacteriol., 174, 1854-1861 (1992)] y la secreción de proteasas tales como subtilisina [Appl. Environ. Microbiol., 61, 16101613 (1995)] por Corynebacterium glutamicum (éste puede abreviarse en lo sucesivo como C. glutamicum), un estudio acerca de la secreción de proteínas de la superficie celular de una bacteria corineforme [Solicitud de Patente Internacional Japonesa Publicada No. Hei 6-502548], la secreción de proteína de fijación de fibronectina utilizando este estudio [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], un informe en el cual la secreción de proteínas se mejoró utilizando una maquinaria secretora mutada [JP-Kokai No. 11-169162], etc., pero ha habido un número reducido de informes acerca de proteínas limitadas. Teniendo en cuenta la cantidad acumulada de proteínas, Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995) describe que se acumulaban aproximadamente 2,5 mg/ml de proteína por expresión del gen de proteasa alcalina de Dichelobacter nodosus en C. glutamicum utilizando un promotor del gen de subtilisina (aprE) de Bacillus subtilis, sitio de fijación de ribosoma y la secuencia de un péptido señal, pero US 4965197, JP-Kokai No. 6-502548 o JP-Kokai No. 11-169182 no describen específicamente los valores de la cantidad de las proteínas secretadas y acumuladas. Adicionalmente, en el caso de la proteína de fijación de fibronectina [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], únicamente se ha confirmado la acumulación secretora de la proteína de aproximadamente 2,5 Ig/1. Así pues, no ha habido informe alguno acerca de que pudieran acumularse eficientemente proteínas heterólogas en el medio a un nivel práctico.
Adicionalmente, se ha desarrollado una tecnología de ingeniería genética para una bacteria corineforme en un sistema que utiliza plásmido y fago, tal como el establecimiento de la transformación por protoplastos [J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Bacteriol., 161, 463-467 (1985)], el desarrollo de un tipo diverso de vectores [Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984); J. Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246(1984); Gene, 47, 301-306(1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69(1989)), el desarrollo del método de regulación de expresión génica [Bio/Technology, 6, 428-430 (1988)] y el desarrollo de cósmidos [Gene, 39, 281-286 (1985)]. Además, existen informes acerca de la clonación de genes a partir de una bacteria corineforme [Nucleic Acids Res., 14, 101131011(1986); J. Bacteriol., 167, 695-702(1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598(1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922(1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859(1988); Agric. Biol. Chem., 52, 525-531(1988); Mol. Microbiol., 2, 6372(1988); Mol. Gen. Genet., 218, 330-339(1989); Gene, 77, 237-251(1989)].
Adicionalmente, se ha publicado también un elemento transponible derivado de una bacteria corineforme [WO93/18151; EP0445385; JP-Kokai No. 6-46867; Mol. Microbiol., 11, 739-746(1994); Mol. Microbiol., 14, 571581(1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397- 405(1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6(1995); JP-Kokai No. 7-107976].
El elemento transponible se refiere a un fragmento de DNA que puede transponerse en el cromosoma y se sabe que está presente en una extensa gama de organismos que van desde procariotas a eucariotas. Se han desarrollado transposones que utilizan elementos transponibles [WO 93/18151; JP-Kokai No. 7-107976; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); JP-Kokai No. 9-70291] y ha llegado a estar disponible un gen heterólogo que se expresa utilizando un transposón.
Un objeto de la invención es proporcionar un proceso para la producción de transglutaminasa haciendo que una bacteria corineforme produzca transglutaminasa y liberando de modo eficiente el producto extracelularmente (es decir, por producción por secreción).
Los autores de la invención han encontrado un proceso para la producción por secreción eficaz de transglutaminasa, teniendo en cuenta el hecho de que una pro-parte así como un péptido señal en una proteína secretora de actinomicetos y análogos juegan un papel importante en el proceso de secreción.
Por consiguiente, la presente invención es un proceso para producir transglutaminasa caracterizado porque una proteína de fusión se produce y se secreta (secreto-producción) en una bacteria corineforme, en donde la transglutaminasa contiene su pro-parte ligada al lado de aguas abajo del dominio del péptido señal de una bacteria corineforme y después de ello se escinde y se elimina la pro-parte.
Más específicamente, la invención es un proceso para obtener una gran cantidad de transglutaminasa por transferencia de un constructo genético de expresión en una bacteria corineforme, en donde una secuencia génica de una proteína deseada que contiene una parte pro-estructural, en particular, la secuencia del gen de protransglutaminasa, que está ligada al lado de aguas abajo de una secuencia codificante del dominio del péptido señal de una bacteria corineforme, especialmente el dominio del péptido señal de una proteína de la superficie celular, cultivo de la bacteria corineforme así transformada, liberación extracelularmente eficiente de la proteína resultante y tratamiento de la proteína que se libera fuera de las células con una proteasa, etc. para escindir la pro-parte.
La invención es también un proceso para obtener transglutaminasa en el cual la parte pro-estructural de protransglutaminasa se escinde, en donde se generan también un constructo de expresión para proteasa y análogos del mismo modo que en el caso del constructo genético para transglutaminasa, introduciendo el mismo en una bacteria corineforme junto con el constructo de expresión que contiene el gen de pro-transglutaminasa y cultivando la bacteria corineforme así transformada, o introduciendo el constructo de expresión para la proteasa y análogos en otra bacteria corineforme, y cultivando la bacteria corineforme transformada junto con la bacteria introducida por el gen de pro-transglutaminasa, para expresar y secretar la pro-transglutaminasa y la proteasa.
Como se utiliza en esta memoria, "la secreción" de una proteína o péptido hace referencia al transporte de la molécula de proteína o péptido fuera de la célula bacteriana (transporte extracelular) incluyendo el caso en que la molécula de la proteína o del péptido existen finalmente en forma completamente libre en el medio así como el caso en que únicamente la parte de la molécula de proteína o péptido está presente fuera de la célula y el caso en que las mismas están localizadas en la superficie de la célula.
De acuerdo con el proceso de la invención, se utiliza una bacteria corineforme como sistema vector hospedador, y puede obtenerse una gran cantidad de transglutaminasa, de la cual se ha eliminado la parte pro-estructural, por generación de un constructo de expresión en el cual un gen de transglutaminasa que contiene una parte proestructural en forma secretora está ligado al lado de aguas abajo del péptido señal de la proteína de la superficie celular de una bacteria corineforme, introducción y expresión del constructo en una bacteria corineforme y tratamiento de la parte pro-estructural de la pro-transglutaminasa secretada extracelularmente con una proteasa y análogos para escindir la parte pro-estructural.
De acuerdo con el proceso de la presente invención, puede obtenerse directamente por vía extracelular una transglutaminasa en la cual está escindida la pro-parte por generación de un constructo genético de expresión para una proteasa y análogos de manera similar al constructo genético de pro-transglutaminasa, introducción y expresión del mismo en la bacteria corineforme junto con el constructo genético de pro-transglutaminasa y cultivo de la bacteria corineforme así transformada, o introducción del constructo genético de expresión para la proteasa y análogos en otra bacteria corineforme, y cultivo de la bacteria corineforme así transformada junto con la bacteria en la cual se ha introducido pro-transglutaminasa, logrando así que la bacteria exprese y secrete la pro-transglutaminasa y la proteasa.
Es de conocimiento general que una proteína secretora se traduce como un prepéptido o prepropéptido y se convierte después de ello en una proteína madura. Es decir, se sabe que, en general, la misma se traduce como un péptido
o prepropéptido, después de lo cual se escinde el péptido señal ("una pre-parte"), con lo cual aquélla se convierte en un péptido o propéptido maduro por escisión ulterior de la pro-parte con una proteasa. Como se utiliza en esta memoria, "una secuencia señal" hace referencia a la secuencia que está localizada en el terminal N de un precursor de proteína secretora y que no está presente en una proteína madura existente naturalmente, y "un péptido señal" hace referencia al péptido que se escinde de dicha proteína precursora. Generalmente, una secuencia señal se escinde acoplando la secreción extracelular por una proteasa (a la que se hace referencia generalmente como peptidasa señal). Aunque un péptido señal de este tipo comparte ciertas características comunes en la secuencia en diversas especies, un péptido señal que tiene función secretora en una especie no tiene necesariamente la misma función secretora en otra especie.
Como se utiliza en esta memoria, una proteína que contiene a la vez un péptido señal y una pro-parte, es decir, un producto de traducción primario puede denominarse "una preproproteína", y una proteína que no contiene un péptido señal pero contiene una pro-parte puede denominarse "una proproteína". Una pro-parte de una proproteína puede denominarse "una parte pro-estructural" o "una pro-estructura". Una "parte proestructural/pro-estructura" de una proteína puede utilizarse intercambiablemente en esta memoria con "una pro-parte" de una proteína. Un péptido señal en una preproproteína o preproteína puede derivarse de una proteína diferente o ser un péptido señal existente naturalmente en la proteína deseada y el mismo se deriva preferiblemente de una proteína secretora del hospedador a utilizar. Alternativamente, el mismo puede modificarse para tener el codón óptimo dependiendo del uso de codones del hospedador a utilizar. Además, el péptido señal que puede utilizarse para el propósito de la invención puede contener una parte de la secuencia de aminoácidos del terminal N de una proteína madura existente naturalmente de la cual se deriva el péptido señal. Una preproproteína puede designarse especialmente "una preproproteína fusionado heterólogamente" cuando el péptido señal se deriva de la proteína diferente. Por ejemplo, cuando una proteína es transglutaminasa, las mismas se denominan "preprotransglutaminasa", "protransglutaminasa" y "preprotransglutaminasa fusionado heterólogamente", respectivamente. Una proteína en la cual "la pro-parte está escindida" hace referencia a una proteína en la cual al menos uno o más aminoácidos que constituyen la pro-parte se ha eliminado por escisión del enlace peptídico, con inclusión de una proteína que tiene un aminoácido del terminal N idéntico al de la proteína existente naturalmente e incluye también una proteína que tiene uno o más aminoácidos adicionales en el terminal N que se derivan de la pro-parte comparada con la proteína existente naturalmente, y una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos más corta que la de una proteína madura existente naturalmente, con tal que la proteína tenga una actividad de la proteína deseada.
Como se describe en la técnica anterior, se han presentado un número limitado de informes en los cuales se ha conseguido la producción por secreción extracelular de una proteína heteróloga utilizando bacterias corineformes y el proceso de producción por secreción no se ha completado técnicamente. Asimismo, no se sabe que una bacteria corineforme secrete extracelularmente una proteína tal como una proteasa por sí misma. Los ejemplos conocidos son DNasa endógena [US 4965197] y los hechos de que la proteína de la superficie celular utilizada en la presente invención cae fuera de la superficie celular para encontrarse fuera de la célula [JP-Kokai No. 6-502548]. Sin embargo, cualquier péptido señal que esté implicado en la secreción de una proteína o bacteria corineforme no se ha dado a conocer con anterioridad excepto para las proteínas de la superficie celular. Las únicas proteínas conocidas de la superficie celular de corinebacterias, hasta la fecha, son genes para PS1 y PS2, las proteínas de la superficie celular de Corynebacterium glutamicum [JP-Kokai No. 6-502548], y el gen para SlpA, la proteína de la superficie celular de Corynebacterium ammoniagenes [que puede abreviarse en lo sucesivo como C. ammoniagenes] [JP-Kokai No. 10108675]. Entre estas proteínas, PS1 y SlpA comparten cierta homología (aproximadamente 30%), pero prácticamente no se encontró homología alguna entre otros, y adicionalmente no se ha encontrado homología alguna en el dominio de la secuencia señal entre unos y otros. Como ejemplos de secuencias señal, las secuencias señal de PS1 y PS2 de Corynebacterium glutamicum se muestran en SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 1, y la secuencia señal de SlpA de Corynebacterium ammoniagenes se muestra en SEQ ID NO: 2.
Por esta razón, los inventores clonaron el gen para la proteína PS2 de la cepa de C. glutamicum [anteriormente, Brevibacterium lactofermentum] ATCC13869 y determinaron la secuencia. Se encontró que no había diferencia alguna en el dominio de la secuencia señal respecto a la secuencia conocida de C. glutamicum, pero que había dos aminoácidos diferentes en la secuencia hasta el residuo del aminoácido trigesimooctavo del terminal N de la proteína madura de la superficie celular (residuo Asn en lugar de Thr en la posición 40 y residuo Glu en lugar de Gly en la posición 35 en la secuencia de aminoácidos, como se muestra en SEQ ID NO: 7). La secuencia de nucleótidos codificante de 68 residuos que comprenden 30 residuos de aminoácidos del péptido señal y 38 residuos de aminoácidos del terminal N de la proteína madura de la superficie celular y su región aguas arriba de 5' que contiene un dominio promotor se muestra en SEQ ID NO: 6 y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 7.
A continuación, el inventor examinó la secreción de una proteína heteróloga utilizando la región que contenía el dominio promotor o el dominio del péptido señal de la proteína de la superficie celular a fin de determinar si puede conseguirse la producción por secreción extracelular de una gran cantidad de la proteína heteróloga en una bacteria corineforme.
Dado que el gen de transglutaminasa de los actinomicetos tiene un contenido elevado de GC y el gen de la bacteria corineforme tiene un contenido de GC próximo al de los actinomicetos y ambos tienen también un uso de codones muy similar, existe la ventaja de que puede utilizarse directamente el gen de los actinomicetos. Por esta razón, el inventor investigó si puede utilizarse directamente un gen de transglutaminasa de actinomicetos y encontró que el péptido señal de transglutaminasa de los actinomicetos no funcionaba satisfactoriamente en una bacteria corineforme. Sin embargo, se ha descubierto que el gen de transglutaminasa codificante de la proteína madura que contiene la parte pro-estructural de los actinomicetos fusionada con el péptido señal de la proteína de la superficie celular de una bacteria corineforme funcionada eficazmente sin modificación alguna y era secretado eficientemente fuera de la célula como una proproteína que contenía la parte pro-estructural. Cuando se utilizó el gen para transglutaminasa con la parte pro-estructural que comprende adicionalmente 30 residuos de aminoácidos de la proteína de la superficie celular y 38 residuos de aminoácidos del domino del terminal N de la proteína madura de la superficie celular, es decir, el gen para transglutaminasa fusionado con el domino del terminal N de la proteína madura de la superficie celular, aumentó adicionalmente la eficiencia de la secreción extracelular de transglutaminasa.
Como se utiliza en esta memoria, una bacteria corineforme es un bacilo Gram-positivo aerobio, que incluye bacterias que se clasificaban anteriormente como Brevibacterium pero que se han unificado actualmente como Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)) con inclusión de Brevibacterium que está estrechamente relacionado con Corynebacterium. Una ventaja del uso de Corynebacterium es que el mismo secreta inherentemente una cantidad mucho menor de proteínas fuera de la célula comparado con mohos, levaduras o bacterias pertenecientes a Bacillus que han sido adecuadas previamente para efectuar la secreción de una proteína heteróloga, que permiten que el proceso de purificación del producto se simplifique y se acorte cuando se realiza la producción por secreción de una proteína heteróloga, y que ello es excelente en términos de su coste medio, el procedimiento de cultivo y el rendimiento, dado que se desarrolla satisfactoriamente en un medio de cultivo simple tal como los compuestos de amoníaco, sales inorgánicas, etcétera.
Ejemplos de Corynebacterium que pueden utilizarse como bacteria hospedadora en la presente invención incluyen cepas de tipo salvaje que incluyen Brevibacterium saccharolyticus ATCC 14066, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990, Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATTC 6871, y cepas mutantes derivadas de estas cepas de tipo salvaje, por ejemplo, cepas mutantes deficientes en la capacidad de producir glutamato, cepas mutantes para producción de aminoácidos tales como lisina y análogos, y cepas mutantes modificadas para producir otras sustancias tales como ácidos nucleicos, por ejemplo, inosina.
El constructo genético que puede utilizarse en la presente invención incluye generalmente un promotor, una secuencia codificante de un péptido señal apropiado y una fracción de ácido nucleico codificante de una proteína deseada, y una secuencia reguladora (un operador o terminador, etc.) necesaria para expresar el gen de la proteína deseada en una bacteria corineforme, en una posición apropiada tal que los mismos puedan funcionar. La proteína deseada puede tener una parte pro-estructural en el terminal N. Vectores que pueden utilizarse para este constructo no están limitados particularmente, e incluyen uno cualquiera que pueda funcionar en una bacteria corineforme, y pueden ser aquéllos que se multiplican autónomamente tales como plásmidos o vectores que están integrados en el cromosomade la bacteria. Son particularmente preferibles plásmidos derivados de bacterias corineformes. Éstos incluyen, por ejemplo, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), pAM330 (Agric. Biol, Chem., 48, 2901-2903(1984)), y plásmidos obtenidos por modificación de los mismos, que poseen genes farmacorresistentes. Pueden utilizarse también transposones artificiales y análogos. Cuando se utiliza un transposón, el gen deseado se introduce en el cromosoma por recombinación homóloga o por su propia capacidad de transposición.
Los promotores que pueden utilizarse en la invención no están limitados particularmente. Por regla general puede utilizarse cualquier promotor que pueda funcionar en la célula de una bacteria corineforme. El mismo puede ser también un promotor derivado de una especie diferente, por ejemplo, un promotor derivado de E. coli, tal como el promotor tac. Entre estos promotores, es más preferible un promotor potente, tal como el promotor tac, etc. Ejemplos de promotores derivados de una bacteria corineforme incluyen promotores para los genes de las proteínas de la superficie celular PS1, PS2 y SlpA, promotores para los genes en sistemas biosintéticos de aminoácidos diferentes, por ejemplo, el gen de glutamato-deshidrogenasa en el sistema de biosíntesis del ácido glutámico, el gen de glutamina-sintetasa en el sistema de síntesis de la glutamina, el gen de aspartoquinasa en el sistema de biosíntesis de lisina, el gen de homoserina-deshidrogenasa en el sistema de biosíntesis de treonina, el gen de acetohidroxilatosintasa en el sistema de biosíntesis de isoleucina y valina, el gen de 2-isopropilmalato-sintasa, el gen de glutamatoquinasa en el sistema de síntesis de prolina y arginina, el gen de fosforribosil-ATP-pirofosforilasa en el sistema de síntesis de la histidina, el gen de ácido desoxiarabinohepturónico-fosfato (DAHP)-sintasa en el sistema de biosíntesis de aminoácidos aromáticos tales como triptófano, tirosina y fenilalanina, etc., el gen de fosforribosilpirofosfato(PRPP)-amidotransferasa, el gen de inosinato-deshidrogenasa y el gen de guanilato-sintasa en el sistema de biosíntesis de ácidos nucleicos tales como inosinato y guanilato.
El péptido señal que se utiliza en la presente invención es el péptido señal de una proteína secretora del hospedador, Coryneform bacterium, y preferiblemente es el péptido señal de una proteína de la superficie celular de una bacteria corineforme. Las proteínas de la superficie celular incluyen PS1 y PS2 derivadas de C. glutamicum (JP-Kokai No. 6-502548), y SlpA derivada de C. ammoniagenes (JP-Kokai No. 10-108675). La secuencia de aminoácidos de PS1 se muestra en SEQ ID NO: 29, la secuencia de aminoácidos de PS2 en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de SlpA en SEQ ID NO: 2. Adicionalmente, se ha informado que la DNasa de una bacteria corineforme tiene también un péptido señal, como se describe en la patente U.S. No. 4965597, que puede utilizarse en la presente invención.
Al péptido señal puede estar conectada una porción de la secuencia del terminal N de aminoácidos de la proteína secretora de la que se deriva el péptido señal. La secuencia señal es escindida por una peptidasa señal mientras que el producto traducido se secreta extracelularmente. Además, el gen codificante del péptido señal puede utilizarse en forma nativa o en forma modificada para contener los codones óptimos dependiendo del uso de codones en el hospedador a utilizar.
Cuando se utilizan estos péptidos señal, los genes que codifican las proteínas deseadas se ligan al terminal 3' de los genes que codifican los péptidos señal y se localizan de tal modo que los mismos están sometidos a la regulación de expresiones por los promotores arriba descritos.
Las proteínas útiles que pueden producirse por secreción de acuerdo con la presente invención incluyen esencialmente, pero sin carácter limitante, la totalidad de las proteínas secretoras derivadas de animales y plantas y microorganismos. Por ejemplo, pueden producirse por secreción de acuerdo con la presente invención proteínas tales como proteasa, aminopeptidasa, carboxipeptidasa, colagenasa y quitinasa. Las proteínas que se preparan por la producción por secreción de acuerdo con la presente invención son preferiblemente proteínas secretoras existentes naturalmente, más preferiblemente proteínas que tienen partes pro-estructurales adicionales. Se prefiere particularmente transglutaminasa como una proteína útil preparada por la producción por secreción de acuerdo con la presente invención. Como genes de transglutaminasa, por ejemplo, se pueden utilizar genes para transglutaminasa secretora derivada de actinomicetos, por ejemplo, S. mobaraense IFO13819, S. cinnamoneum IFO12852, Streptoverticillium griseocarneum IFO12776, Streptomyces lydicus [WO 9606931], etc, y mohos tales como Oomicetos [WO9622366], para el propósito de la presente invención. Los genes que codifican estas proteínas pueden modificarse dependiendo del tipo del hospedador a utilizar y con objeto de conseguir la actividad deseada, y comprenden la adición, deleción, reemplazamiento de uno o más residuos de aminoácidos y opcionalmente pueden convertirse en el codón óptimo dependiendo de la secuencia de uso de codones en el hospedador.
Cuando la proteína preparada por la producción por secreción de acuerdo con la presente invención es la proteína expresada naturalmente como un prepropéptido, se utiliza preferiblemente el fragmento de gen codificante de la proproteína que contiene la parte pro-estructural (pro-parte). Como ejemplos de las secuencias de las pro-partes, las secuencias de las partes pro-estructurales de transglutaminasas derivadas de actinomicetos se muestran en SEQ ID NO: 3 (derivada de S. mobaraense) y SEQ ID NO: 4 (derivada de S. cinnamoneum). La pro-parte de la proteína puede ser escindida por medios apropiados, por ejemplo, proteasas. Puede utilizarse una aminopeptidasa, una endopeptidasa que escinde la misma en una posición apropiada, o una proteasa más específica. Preferiblemente, las proteasas que escinden la proteína de tal modo que la proteína resultante tiene una actividad equivalente o mayor que la de la proteína existente naturalmente. Alternativamente, la secuencia génica codificante de la proteína deseada o la parte pro-estructural de la proteína deseada puede modificarse también y diseñarse para expresar la proteína que tiene el sitio de reconocimiento para una proteasa específica para la localización deseada. Procedimientos generales de biotecnología molecular que incluyen dichas técnicas de modificación, técnicas de clonación de genes y técnicas de detección para las proteínas producidas son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, pudiendo hacerse referencia a Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and (D. N. Glover ed. 1985), F.M. Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed,, Stockton Press and etc.
Ejemplos de partes pro-estructurales que tienen las partes pro-estructurales modificadas que se muestran en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 incluyen las partes pro-estructurales modificadas que se describen en SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 38.
Textos libres de la lista de secuencias
SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 37: la parte pro-estructural modificada de transglutaminasa de S. mobaraense
SEQ ID NO: 38: la quimera de las partes pro-estructurales de transglutaminasa de S. mobaraense y S. cinnamoneum
Estas partes pro-estructurales modificadas tienen las características siguientes:
SEQ ID NO: 30 = AP en el terminal C de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está delecionado;
SEQ ID NO: 31 = FRAP en el terminal C de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está delecionado;
SEQ ID NO: 32 = D en el terminal N de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está delecionado;
SEQ ID NO: 33 = DNGAGE en el terminal N de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está delecionado;
SEQ ID NO: 34 = RAP en el terminal C de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está modificado a GPK;
SEQ ID NO: 35 = RAP en el terminal C de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está modificado a GPR;
SEQ ID NO: 36 = GPSFRAP en el terminal C de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está modificado a GPK (FRAP se ha delecionado y S en el terminal C se ha modificado a K);
SEQ ID NO: 37 = GPSFRAP en el terminal C de la parte pro-estructural de S. mobaraense (45 residuos de aminoácidos) está modificado a GPR (FRAP se ha delecionado y S en el terminal C se ha modificado a S);
SEQ ID NO: 38 = la parte quimérica pro-estructural (56 residuos de aminoácidos) constituida por las partes proestructurales parciales de S. mobaraense (15 residuos de aminoácidos) y las partes pro-estructurales parciales de S. cinnamoneum (41 residuos de aminoácidos).
Así pues, la parte pro-estructural puede tener reemplazamiento, deleción, inserción o adición de uno o más aminoácidos con tal que la misma tenga el sitio de reconocimiento específico para la proteasa en la posición dada.
La región del terminal N de la proteína generada por degradación de la proteasa puede no ser necesariamente idéntica a la de la proteína existente naturalmente, y uno o varios aminoácidos pueden añadirse adicionalmente a o delecionarse de la proteína existente naturalmente.
Generalmente se prefiere que la proteína resultante se escinda en la misma posición apropiada que la de una proteína existente naturalmente en términos de su actividad, y es más preferido que la misma sea idéntica al péptido maduro de una proteína existente naturalmente. Por ejemplo, las secuencias de transglutaminasas maduras de S. mobaraense y S. cinnamoneum se muestran en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 43, respectivamente. Por tanto, las proteasas específicas que escinden el propéptido en la posición tal que el mismo genera la misma proteína que la proteína madura existente naturalmente son generalmente muy preferibles. Sin embargo, para un objetivo particular los péptidos que tienen una secuencia más larga o más corta de residuos de aminoácidos en uno a varios residuos en el terminal N con relación a la de una proteína existente naturalmente pueden poseer actividad más apropiada. Tales proteasas incluyen, por ejemplo, Dispasa (disponible de Boehringer Manheim Co.) que puede estar disponible comercialmente y proteasas obtenidas a partir del medio de cultivo de microorganismos, tal como, por ejemplo, el medio de cultivo de actinomicetos. Dichas proteasas pueden utilizarse en un estado sin purificar u, opcionalmente, pueden utilizarse después de purificación hasta la pureza apropiada.
Un ejemplo de otra proteasa adecuada es SAMP45, una serina-proteasa producida por Streptomyces albogriseolus (éste puede abreviarse en lo sucesivo como S. albogriseolus). En el caso de la protransglutaminasa de S. mobaraense, dado que SAMP45 escinde predominantemente entre Ser en la posición 41 y Phe en la posición 42 de la parte pro-estructural como se define en SEQ ID NO: 3, se genera la proteína que tiene la estructura en la cual los cuatro aminoácidos adicionales de Phe-Arg-Ala-Pro del terminal C para la parte pro-estructural se añaden al terminal N de la transglutaminasa madura existente naturalmente que se muestra en SEQ ID NO: 5. Los autores de la presente invención confirmaron que estas proteínas tenían también las actividades de transglutaminasa. La secuencia del gen SAMP45 ha sido ya determinada y la secuencia de aminoácidos de la proteína con la parte pro-estructural adicional (proSAMP45) se muestra en SEQ ID NO: 39 (J. Bacteriol., 179, 430-438 (1997)), asimismo. Cuando se deja actuar SAMP45 sobre la protransglutaminasa en la forma del medio de cultivo de S. albogriseolus o en la forma de la célula
S. albogriseolus, el mismo puede escindir la parte pro-estructural dejando restante una parte del mismo, lo que da como resultado una transglutaminasa en la cual se ha eliminado prácticamente la totalidad de la parte proestructural. Alternativamente, la transglutaminasa en la cual se ha eliminado una gran parte de la parte proestructural puede obtenerse análogamente por co-cultivo de una bacteria corineforme en la cual se ha introducido el gen preproSAMP45 con una bacteria corineforme que produce pro-transglutaminasa por secreción.
Adicionalmente, la activación de la transglutaminasa por la escisión de la parte pro-estructural puede realizarse eficientemente introduciendo de modo similar el gen SAMP45 en la bacteria corineforme en la cual se ha introducido el gen de preprotransglutaminasa y dejando que se produzca simultáneamente por secreción el SAMP45 así como la protransglutaminasa.
Además, puede obtenerse transglutaminasa madura idéntica a la transglutaminasa existente naturalmente utilizando la peptidasa prolina-específica producida por S. mobaraense (svPEP), que ha sido encontrada por los inventores, combinada con SAMP45, lo que da como resultado la eliminación de los 4 aminoácidos Phe-Arg-Ala-Pro añadidos en el terminal N.
Esta svPep es una enzima que escinde específicamente los péptidos o los análogos peptídicos representados por la fórmula (I) siguiente en el sitio que se muestra conL en 1a formu1a, es decir, en e1 1ado de1 termina1 carboxi1o de1 tercer o cuarto residuo prolina desde el terminal N:
Y-Pro- L-Z (I)
en donde Y representa un oligopéptido constituido por dos o tres residuos de aminoácido y Z representa un aminoácido, péptido, amida o éster.
Más específicamente, esta peptidasa prolina-específica es una peptidasa prolina-específica que tiene las propiedades siguientes que se muestran en (1)-(8):
(1) Escinde al menos uno de los péptidos siguientes que contienen prolina en el sitio que se muestra con L, es decir, en el lado del terminal carboxilo del residuo prolina (en donde pNA es p-nitroanilida):
(en donde Xaa representa Pro-pNA y pNA representa p-nitroanilida))
Ala-Ala-Pro-L--pNA, Ala-Phe-Pro-L-pNA, Phe-Arg-Ala-Pro-L-pNA (idéntico a Phe-Arg-Ala Xaa (SEQ ID NO:68) (en donde Xaa representa Pro-pNA y pNA representa p-nitroanilida))
- (2)
- tiene el pH óptimo de 6,0-6,5;
- (3)
- es estable a pH 4-9;
- (4)
- tiene la temperatura óptima de 25-30ºC;
- (5)
- es estable por debajo de 20ºC;
- (6)
- su actividad es inhibida por fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y fluoruro de aminoetilbencenosulfonilo-clorhidrato
- (7)
- tiene el punto isoeléctrico de 10,2; y
- (8)
- tiene el peso molecular de aproximadamente 50.000.
Por ejemplo, esta svPEP puede prepararse como se describe más adelante en esta memoria. Actinomicetos que producen las peptidasas que tienen actividades de svPEP, por ejemplo, el actinomiceto S. mobaraense IFO13819 se cultiva de acuerdo con el método utilizado convencionalmente para el cultivo de actinomicetos. El medio de cultivo para cultivar el actinomiceto IFO13819 puede ser el medio común que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, iones inorgánicos y otros, convencionales. Glucosa, almidón, sacarosa y otros pueden utilizarse como las fuentes de carbono, peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, sales de amonio y otros se utilizan opcionalmente como las fuentes de nitrógeno en caso necesario. Los cultivos pueden incubarse en condición aerobia que está controlada adecuadamente dentro de, por ejemplo, el intervalo de pH comprendido entre pH 5,0 y 8,5 y el intervalo de temperatura entre 15 y 37ºC. El periodo de cultivo es usualmente tan largo como 1 a 10 días, aunque depende de la temperatura, el pH y el tipo de medio. En principio, el cultivo puede terminarse en el momento en que se alcance la máxima cantidad del svPEP deseado.
Después de la incubación del cultivo durante el periodo arriba descrito, la preparación de svPEP purificada puede obtenerse por recuperación de las células del cultivo, lavado breve de las mismas, elución de la fracción que contiene svPEP de la superficie de las células y purificación del eluyente con la combinación de métodos de purificación tales como HPLC y FPLC bien conocidos por los expertos en la técnica que se utilizan convencionalmente para purificación de tales proteínas. La elución de la fracción svPEP de la superficie de las células puede realizarse por agitación de las células mediante sacudidas en una solución tampón tal como, por ejemplo, 0,1 M de tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) durante un periodo dado de duración comprendida entre 1 y 5 horas.
La temperatura durante el procedimiento está comprendida entre 0 y aproximadamente 5ºC para prevenir la desactivación de la enzima. svPEP puede aislarse y purificarse del sobrenadante de los cultivos, pero contiene una gran cantidad de proteínas contaminadas y por consiguiente es más ventajoso eluir y purificar la proteína de la superficie de las células lavadas.
Las fracciones activas en cada paso pueden confirmarse por determinación de las actividades de la enzima en las fracciones. La determinación de las actividades puede lograrse utilizando una combinación de sustratos apropiados y el método de detección de los productos de reacción, por ejemplo, por reacción de las enzimas con Ala-Ala-PropNA, Ala-Phe-Pro-pNA, Phe-Arg-Ala-Pro-pNA como sustratos y medición de la cantidad de la pNA (p-nitroanilida) liberada por la reacción para cuantificar las actividades.
Los genes que codifican svPEP pueden obtenerse por determinación de la secuencia parcial de aminoácidos y diseño de sondas apropiadas, opcionalmente después de purificar ulteriormente la svPEP, que se ha purificado como se ha descrito anteriormente, utilizando cromatografía de fase inversa, etc. Este procedimiento es bien conocido por los expertos en la técnica. Véase, v.g., Molecular Cloning 2nd edition [J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9. 31 (1989)]. La secuencia del gen para svPEP obtenido de este modo y la secuencia entera de los aminoácidos codificados por el mismo se muestran en SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, respectivamente, y la secuencia de aminoácidos de la proteína madura de svPEP se muestra en SEQ ID NO: 40.
Cuando se hace reaccionar svPEP sobre la protransglutaminasa junto con la proteasa en la forma de medio de S. mobaraense o células de S. mobaraense, la parte pro-estructural puede escindirse por completo, dando como resultado la transglutaminasa madura cuya parte pro-estructural se ha eliminado por completo. Alternativamente, la transglutaminasa madura de la cual se ha eliminado por completo la parte pro-estructural puede obtenerse de modo análogo por cultivo de una bacteria corineforme en la cual se han introducido el gen pre-pro svPEP y un gen de proteasa junto con una bacteria corineforme que libera una protransglutaminasa extracelularmente por producción por secreción. Además, puede producirse eficientemente una transglutaminasa madura que tiene la misma estructura que la de una forma existente naturalmente introduciendo análogamente ambos genes SAMP45 y svPEP en una bacteria corineforme en la cual se ha introducido el gen de pre-protransglutaminasa, y dejando que la misma produzca por secreción pro-transglutaminasa y SAMP45 así como svPEP extracelularmente o en la superficie de las células.
El método para introducir los constructos genéticos que pueden utilizarse en la presente invención en una bacteria corineforme no está limitado a métodos particulares, incluyendo los métodos utilizados generalmente, por ejemplo, el método de los protoplastos (Gene, 39, 281-286 (1985)), el método de electroporación (Bio/Technology, 7, 10671070) (1989)), etc. El transformante resultante puede cultivarse de acuerdo con los métodos y condiciones convencionales. Por ejemplo, el transformante puede cultivarse por un medio convencional que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y fuentes inorgánicas. Opcionalmente, pueden añadirse al medio cantidades traza de nutrientes orgánicos tales como vitaminas y aminoácidos a fin de conseguir el crecimiento en mayor cantidad.
Pueden utilizarse carbohidratos tales como glucosa y sacarosa como fuentes de carbono, ácidos orgánicos tales como ácido acético, alcoholes y otros. Como fuentes de nitrógeno se pueden utilizar amoníaco gaseoso, amoníaco acuoso, sales de amonio y otros. Como iones inorgánicos, se utilizan opcionalmente en caso necesario ion calcio, ion magnesio, ion fósforo, ion potasio, ion ferroso o férrico, y otros. El cultivo se conduce durante aproximadamente 1 a 7 días en condición aerobia en el intervalo apropiado de pH entre 5,0 y 8,5, y el intervalo de temperatura entre 15ºC y 37ºC. Por cultivo del transformante en tales condiciones, se produce intracelularmente una gran cantidad de una proteína deseada y la misma se secreta eficientemente en el medio extracelular. Es sabido generalmente que la transglutaminasa es letal cuando la misma se acumula en gran cantidad en las células de microorganismos, pero de acuerdo con la presente invención, la transglutaminasa se produce continuamente sin producir efectos letales, dado que la transglutaminasa producida intracelularmente se libera en el medio extracelular.
Las proteínas que se secretan en el medio de acuerdo con la presente invención pueden aislarse y purificarse del medio de cultivo incubado de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las proteínas pueden aislarse y purificarse retirando las células del medio por centrifugación, etc., y utilizando a continuación métodos conocidos apropiados tales como precipitación por salado, precipitación con etanol, ultrafiltración, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía líquida de presión media-alta, cromatografía de fase inversa, cromatografía hidrófoba o combinaciones de los mismos. Las proteínas secretadas en la superficie de las células de acuerdo con la presente invención pueden aislarse y purificarse utilizando los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por solubilización de las mismas con concentraciones incrementadas de sal o agentes tensioactivos, y utilización posterior de los métodos similares al utilizado para las proteínas secretadas en el medio. Adicionalmente, en algunos casos, las proteínas secretadas en la superficie de la célula pueden utilizarse sin solubilización, por ejemplo, como enzimas inmovilizadas.
La presente invención se describe ulteriormente de modo específico en los ejemplos que siguen, que no deben interpretarse en modo alguno como limitación de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión de prepro-transglutaminasa derivada de S. mobaraense IFO13819 en C. glutamicum ATCC13869
(1) Adquisición del gen de transglutaminasa derivado de S. mobaraense IFO13819
La secuencia del gen de transglutaminasa derivado de la cepa de S. mobaraense DSMZ ha sido ya determinada [Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998)]. Los iniciadores indicados en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 se sintetizaron por referencia a la secuencia y la región codificante de la secuencia de transglutaminasa madura se amplificó utilizando el método PCR con el DNA cromosómico de S. mobaraense IFO13819 preparado de acuerdo con el procedimiento convencional (el método de Saito y Miura [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]. Para la reacción PCR, se utilizó DNA-polimerasa Pyrobest (Takarashuzo Co. Ltd.) y las condiciones de reacción siguieron el protocolo recomendado por el fabricante.
(SEQ ID NO: 8) 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
(SEQ ID NO: 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO:9: iniciador PCR
Se generó luego la sonda de DNA por reacción del fragmento amplificado de DNA de aproximadamente 1,0 kb con [a-32P]dCTP utilizando el Kit de Marcación de DNA Random Primer Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) de acuerdo con el protocolo unido al Kit. Se confirmó que el gen de transglutaminasa estaba presente en el fragmento de aproximadamente 4 kb escindido con la enzima de restricción SacI por hibridación de transferencia Southern utilizando la sonda generada y el DNA cromosómico de S. mobaraense IFO13819 de acuerdo con el método convencional, como se describe en Molecular Cloning 2nd edition [J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9. 31 (1989)].
De acuerdo con ello, el fragmento de aproximadamente 4 kb que había sido generado por digestión con SacI del DNA cromosómico de S. mobaraense IFO13819 se recuperó por electroforesis en gel de agarosa utilizando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) y se insertó en el sitio SacI de pUC18 (Takarashuzo Co. Ltd.) que se introdujo en células competentes de Escherichia coli JM109 (Takarashuzo Co. Ltd.) para generar una biblioteca.
Se obtuvo la cepa bacteriana que contiene el plásmido en el cual se clonó el fragmento del gen de transglutaminasa, por cribado de la biblioteca utilizando la sonda de DNA generada previamente para transglutaminasa por hibridación de colonias como se describe en Molecular Cloning 2nd edition [J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1. 90(1989)]. Se recuperó el plásmido de esta cepa y se designó como pUITG. Se determinó la secuencia del fragmento clonado en pUITG, lo cual confirmó que el gen de transglutaminasa de S. mobaraense IFO13819 tenía la misma secuencia que el de la transglutaminasa de la cepa DSMZ de S. mobaraense.
La determinación de la secuencia de nucleótidos reveló que el fragmento SacI de aproximadamente 4 kb era el fragmento incompleto de DNA del cual se había delecionado parcialmente la secuencia señal (la pre-parte). Por esta razón, se intentó la clonación de la región promotora y la región de la secuencia señal entera. La clonación se realizó utilizando el Kit de Clonación in vitro TAKARA LA PCR (Takarashuzo Co. Ltd.) y los iniciadores sintéticos que se muestran en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 de acuerdo con el protocolo unido.
(SEQ ID. NO 10) 5'-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3'
(SEQ ID NO: 11) 5'-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3',
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11: iniciadores PCR para la región promotora y la secuencia señal de S. mobaraense
Por consiguiente, cuando se utilizó una casete iniciadora de SalI, se obtuvo el fragmento de aproximadamente 800 pb amplificado por PCR y la secuenciación del fragmento confirmó que el fragmento contenía la región promotora y la región de secuencia señal para el gen de transglutaminasa. En consecuencia, se insertó el fragmento de aproximadamente 800 pb amplificado por PCR en el sitio SmaI de pVC7 descrito en JP-Kokai No. 9-070291 para obtener pVITGS5. Adicionalmente, el plásmido pUITG se digirió con SacI, se recuperó el fragmento de aproximadamente 4 kb por electroforesis en gel de agarosa, y se insertó el fragmento en el sitio SacI de pVITGS5 para construir el plásmido pVITGC que comprende el gen de transglutaminasa de longitud total. La determinación de la secuencia de nucleótidos se realizó utilizando el Kit de Secuenciación Dye Terminator Cycle (PE Applied Biosystems) y el secuenciador de DNA 373A (PE Applied Biosystems). La secuencia del gen de preprotransglutaminasa se muestra en SEQ ID NO: 12, en donde se cree que la secuencia de 31 aminoácidos del terminal N es la secuencia señal (la pre-parte). La secuencia de aminoácidos de la preprotransglutaminasa se muestra en SEQ ID NO: 13.
(2) Conversión de la región promotora del gen de transglutaminasa
La secuencia del gen para PS2, que es una proteína de la superficie de C. glutamicum, ha sido ya determinada [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 se sintetizaron recurriendo a la secuencia, y la región que comprende el promotor en la región aguas arriba de 5' del codón de iniciación del gen de la proteína PS2 se amplificó utilizando el método PCR a partir del DNA cromosómico de C. glutamicum ATCC13869 preparado de acuerdo con un método convencional.
(SEQ ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG4-3'
(SEQ ID NO: 15) 5'-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO:15: iniciadores PCR
Por otra parte, los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 9 se sintetizaron basándose en la secuencia del gen de transglutaminasa determinada en el Ejemplo 1 (1), y la región del gen de preprotransglutaminasa se amplificó utilizando el método PCR a partir de pUITG obtenido en el Ejemplo 1 (1).
(SEQ ID NO: 16) 5'-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 16: iniciador PCR
A continuación, el gen de fusión de transglutaminasa fusionado con la parte estructural pre-pro adicional, que se ligó a la región que comprendía el promotor del gen de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ACC 13869, se amplificó por realización de una PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 utilizando como moldes la mixtura de 1 I1 de cada uno de 1a so1ución PCR de la región amplificada que comprendía el promotor del gen PS2 de C. glutamicum ATCC13869 y la región del gen de pre-protransglutaminasa amplificado. El fragmento amplificado de aproximadamente 1,8 kb se detectó por electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento se recuperó a partir del gel de agarosa con EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) y se insertó en el sitio SmaI de pVC7 como se describe en JP-Kokai No. 9-070291 para obtener pVKPTG0. La secuencia de nucleótidos del fragmento insertado se determinó de acuerdo con el método arriba descrito y se confirmó que el gen de fusión se había construido como se esperaba.
(3) Expresión del gen de pre-protransglutaminasa en C. glutamicum ATCC13869
Se transformó C. glutamicum ATCC13869 con el pVITGC construido en el Ejemplo 1 (1) (tanto el promotor como el gen de pre-protransglutaminasa se derivaban de S. mobaraense) o con el pVKPTGO construido en el Ejemplo 1 (2) (el promotor se derivaba del gen PS2 de C. glutamicum ATCC13869 y el gen de pre-protransglutaminasa se derivaba de S. mobaraense) y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol (10 g de extracto de levadura, 10 g de triptona, 5 g de sacarosa, 5 g de NaCl, 5 g de agar por litro de agua destilada). El C. glutamicum ATCC13869 seleccionado que hospedaba pVITGC o pVKPTGO se cultivó en medio de cultivo MM (30 g de glucosa, 0,4 g de sulfato de magnesio heptahidrato, 30 g de sulfato de amonio, 1 g de dihidrogenofosfato de potasio, 0,01 g de sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g de sulfato de manganeso (II) pentahidratado, 200 Ig de hidroc1oruro de tiamina, 500 Ig de biotina, 0,15 g de DL-metionina, 50 g de carbonato de calcio por litro de agua destilada, ajustado a pH 7,5) que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol a 30ºC durante 48 horas, respectivamente. Después de terminada la incubación, se sometieron 10I1 de1 sobrenadante de1 cu1tivo a SDS -PAGE y luego a transferencia Western con anticuerpo anti-transglutaminasa como se describe en Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994) de acuerdo con el método convencional (por ejemplo, el procedimiento general que se describe en J. Sambrook et al. (1989) (supra)).
Como consecuencia, no pudo detectarse la secreción de transglutaminasa. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que la secuencia señal de transglutaminasa de S. mobaraense no funcionaba en C. glutamicum ATCC13869.
Ejemplo 2: Producción por secreción de transglutaminasa madura utilizando el gen de fusión codificante del péptido señal de la proteína de la superficie celular de Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum ATCC13869) y la transglutaminasa madura derivada de S. mobaraense IFO13819
(1) Construcción del gen de transglutaminasa que contiene la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ATCC13869
La secuencia del gen de PS2 que es la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ha sido ya determinada [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 17 recurriendo a la secuencia, y la región codificante de los 44 residuos de aminoácidos del terminal N (30 residuos de aminoácidos del péptido señal y 14 residuos de aminoácidos de la proteína madura de la superficie celular) de la proteína correspondiente a PS2 y la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora se amplificaron utilizando el método PCR con el DNA cromosómico de C. glutamicum ATCC13869 preparado de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1 (2). El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 17 comprende también la secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos de la región terminal N de la transglutaminasa madura a fin de construir el gen de fusión fusionado con transglutaminasa.
(SEQ ID NO: 14) 5'- AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(SEQ ID NO:17)
5'-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 17: iniciador PCR
Por otra parte, se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 basándose en la secuencia del gen de transglutaminasa determinada en el Ejemplo 1 (1) y la región del gen de transglutaminasa maduro se amplificó utilizando el método PCR con pUITG obtenido en el Ejemplo 1 (1).
El gen de fusión de la transglutaminasa madura, que estaba ligado a la región codificante de los 44 residuos de aminoácidos del terminal N de C. glutamicum ATCC13869 y a la región aguas arriba de 5' que comprendía el gen promotor del gen de la proteína de la superficie celular, se amplificó realizando una PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 utilizando como moldes la mixtura de 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada codificante de los 44 residuos de aminoácidos del terminal N de la proteína correspondiente a PS2 de C. glutamicum y la región aguas arriba de 5' que contenía el promotor, y 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada de la región del gen de la transglutaminasa madura,.
El fragmento amplificado de aproximadamente 1,7 kb se detectó por electroforesis en agarosa. Este fragmento se recuperó del gel de agarosa utilizando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) y se insertó en el sitio SmaI del pVC7 descrito en JP-Kokai No. 9-070291 para obtener pVKPTG3. La secuencia de nucleótidos del fragmento insertado se determinó de acuerdo con el método arriba descrito y se confirmó que se había construido el gen de fusión esperado.
Adicionalmente, el gen de fusión de la transglutaminasa madura de aproximadamente 1,7 kb, que se había ligado a la región codificante de los 44 residuos de aminoácidos del terminal N de C. glutamicum ATCC13869 y la región aguas arriba de 5' que comprendía el promotor del gen de la proteína de la superficie celular, se escindió por digestión de pVKTG3 con KpnI y XbaI y se recuperó utilizando electroforesis en agarosa. Este fragmento se insertó en el sitio KpnI-XbaI de pPK4 descrito en JP-Kokai No. 9-322774 para construir pPKTG3.
(2) Secreción de transglutaminasa madura utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ATCC13869
Se transformó C. glutamicum ATCC13869 con el plásmido construido pVKTG3 o pPKTG3 (en ambos casos tanto el gen que comprendía el promotor como el gen codificante del péptido señal y los 14 residuos de aminoácidos del terminal N se derivaban de C. glutamicum ATCC13869, y el gen de transglutaminasa madura se derivaba de S. mobaraense) y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol o 25 mg/l de kanamicina. El C. glutamicum ATCC13869 seleccionado que contenía pVITG3 o pVKPTG3 se cultivó luego en medio de cultivo líquido MM, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol o 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 48 horas, respectivamente. Después de terminada la incubación, se sometieron 10 I1 de1 sobrenadante del cultivo a SDS-PAGE y se realizó luego una transferencia Western de acuerdo con un método convencional con anticuerpo anti-transglutaminasa como se describe en Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994). Como resultado, pudo detectarse una pequeña cantidad de transglutaminasa secretada que tenía un peso molecular similar al de la transglutaminasa madura en el sobrenadante del medio de cultivo de ambas cepas.
Ejemplo 3: Producción por secreción de pro-transglutaminasa utilizando el gen de fusión de pro-transglutaminasa (gen de fusión de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente) derivado de S. mobaraense IFO13819 ligado al péptido señal de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ATCC13869
(1) Construcción del gen de transglutaminasa (gen de fusión de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente) que contenía la parte pro-estructural adicional con el péptido señal de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ATCC13869
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 se sintetizaron recurriendo a la secuencia del gen de PS2 que era la proteína de la superficie celular de C. glutamicum [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. La región codificante para los 30, 31, 44 o 68 residuos de aminoácidos del terminal N (la región que comprende 30 residuos de aminoácidos del péptido señal) y la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora de la proteína correspondiente a PS2 se amplificaron por el método PCR utilizando la combinación de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 18, o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 19, o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 20, o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 21 del DNA cromosómico de C. glutamicum ATCC13869 preparada de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1 (2).
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 comprenden las secuencias que codifican los aminoácidos del terminal N de pro-transglutaminasa con objeto de construir el gen de fusión fusionado con la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural.
(SEQ ID NO: 18)
5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3'
(SEQ ID NO: 19)
5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3'
(SEQ ID NO: 20)
5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGATGTTGA-3'
(SEQ ID NO: 21)
5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 21: iniciadores PCR
Por otra parte, se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 9 basándose en la secuencia del gen de transglutaminasa determinada en el Ejemplo 1 (1) y la región del gen de pro-transglutaminasa se amplificó utilizando el método PCR con pUITG obtenido en el Ejemplo 1 (1).
(SEQ ID: NO: 22) 5'-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 22: iniciador PCR
A continuación se amplificó el gen de pro-transglutaminasa fusionado heterólogamente ligado a la región respectiva codificante de los 30, 31, 44 y 69 residuos de aminoácidos del terminal N y la región aguas arriba de 5' que comprendía la región promotora del gen de la proteína correspondiente a PS2 de C. glutamicum ATCC13869, es decir, los fragmentos de los genes prepro-transglutaminasa fusionados heterólogamente que se ligaron al promotor del gen para la proteína de la superficie celular C. glutamicum ATCC13869, por realización de una PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 utilizando como moldes la mixtura que comprendía 1 I1 de so1ución PCR de la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen de la proteína correspondiente a PS2 de C. glutamicum ATCC13869 y cada una de las regiones amplificadas codificantes de los 30, 31, 44 ó 68 residuos de aminoácidos del terminal N de la proteína, y 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada del gen para la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural.
Los fragmentos amplificados que comprendían aproximadamente 1,8 kb a 1,9 kb se detectaron por electroforesis en agarosa. Estos fragmentos se recuperaron de los geles de agarosa con EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) y se insertaron en el sitio SmaI de pVC7 como se describe en JP-Kokai No. 9-070291 para obtener pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3 y pVKPTG4, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de los fragmentos insertados se determinaron de acuerdo con el método mencionado anteriormente y se confirmó que se habían construido los genes de fusión esperados.
Adicionalmente, los genes de fusión de aproximadamente 1,8 kb a 1,9 kb de transglutaminasa que tenían las partes pro-estructurales, que estaban ligadas a las regiones respectivas codificante den los residuos de aminoácidos 30, 31, 44 y 68 y la región aguas arriba de 5' que comprendía la región promotora del gen de la proteína correspondiente a PS2 de C. glutamicum, se escindieron por digestión de pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3 y pVKPTG4 con KpnI y
5 XbaI y se recuperaron por electroforesis en agarosa. Estos fragmentos se insertaron en el sitio KpnI-XnaI de pPK4 descrito en JP-Kokai No. 9-322774 para construir pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 y pPKPTG4.
(2) Secreción de pro-transglutaminasa con la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ATCC13869
Se transformó C. glutamicum ATCC13869 con el plásmido construido pVKPTG1, pVKPTG2, VKPTG3, pVKPTG4,
10 pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 o pPKPTG4 y se seleccionaron las cepas que habían crecido en el medio de agar CM2S, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol o 25 mg/ml de kanamicina. El C. glutamicum ATCC13869 seleccionado que hospedaba pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 o pPKPTG4 se cultivó luego en el medio de cultivo MM, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol o 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 48 horas, respectivamente. Una vez terminada la incubación, se
15 sometieron 10 I1 de1 sobrenadante del cultivo a SDS-PAGE y se realizó luego una transferencia Western utilizando anticuerpo anti-transglutaminasa como se describe en Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994) de acuerdo con el método convencional. Como resultado, se confirmó para ambos vectores la secreción de la cantidad similar de transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural, pVC7 o pPK4, y se observó la diferencia significativa en la cantidad secretada dependiendo de la longitud de los residuos de aminoácidos del terminal N de la forma madura de
20 la proteína correspondiente a PS2. Las cantidades representativas secretadas se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. La cantidad secretada de pro-transglutaminasa utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ATCC13869
- Plásmido
- pro-transglutaminasa (mg/l)
- pPKPTG1
- 78
- pPKPTG4
- 210
25 (3) Escisión de las pro-transglutaminasas por digestión con Dispasa y detección de sus actividades
Al sobrenadante del cultivo de C. glutamicum ATCC13869 que hospedaba pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 o pPKPTG4, se añadió la proteasa Dispasa (Boehringer Manheim Co. ltd.) en una ratio sustrato:enzima = 1:1 y se mantuvo la reacción a 37ºC, pH 7,5 durante una hora. Después de la digestión con Dispasa, se confirmó la escisión de las pro-transglutaminasas por SDS-PAGE, y se confirmaron las
30 actividades específicas similares (aproximadamente 20 U/mg) a la de la transglutaminasa existente naturalmente, como se determinó por el método del hidroxamato [J. Biol. Chem., 241, 5518-5525 (1966)].
Ejemplo 4: Producción por secreción de pro-transglutaminasa utilizando el gen de fusión que tiene la secuencia codificante de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes y la protransglutaminasa derivada de S. mobaraense IFO13819
35 (1) Construcción del gen de transglutaminasa que tiene la parte pro-estructural adicional y la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes (gen de fusión de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente)
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 se sintetizaron recurriendo a la secuencia del gen de la proteína de la superficie celular (SlpA) [JP-Kokai No. 10-108675] de C. ammoniagenes, y la región que 40 comprendía la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora de la proteína de la superficie celular (SlpA) y la región codificante de los 25 residuos de aminoácidos del terminal N (el péptido señal) se amplificaron utilizando el método PCR a partir del DNA cromosómico de C. ammoniagenes preparado de acuerdo con el método convencional. El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 24 comprende también la secuencia codificante de los aminoácidos del terminal N de la pro-transglutaminasa a fin de construir el gen de fusión fusionado con la pro
45 transglutaminasa.
(SEQ ID NO: 23) 5'-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3'
(SEQ ID NO: 24) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCGACAGGTGCGGCCAGC
- -
- 3'
<Texto libre del listado de secuencias> SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24: iniciadores PCR
El gen de fusión transglutaminasa-transglutaminasa que contenía la parte pro-estructural adicional que estaba ligada a la región codificante de los 25 residuos de aminoácidos del terminal N de C. ammoniagenes y la región aguas arriba de 5' que comprendía la región promotora del gen de la proteína de la superficie celular (SlpA) (gen de preprotransglutaminasa fusionado heterólogamente) se amplificó por realización de una PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 9 utilizando la mixtura como moldes que contenían 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen de la proteína de la superficie celular (SlpA) y la región amplificada codificante de los 25 residuos de aminoácidos del terminal N de la proteína de la superficie ce1u1ar (S1pA) de C. ammoniagenes, y 1 I1 de so1uciaminasa que
ón PCR de la reacción del gen para la transglut tenía la parte pro-estructural adicional que se había amplificado en el Ejemplo 3 (1). El fragmento amplificado de aproximadamente 1,7 kb se detectó por electroforesis en agarosa. Este fragmento se recuperó del gel de agarosa utilizando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) y se insertó en el sitio SmaI de pVC7 para obtener pVSPTG1.
(2) Conversión de la región promotora: ligación con el promotor del gen de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum ATCC13869
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 25 se sintetizaron recurriendo a la secuencia del gen de PS2 que es la proteína de la superficie celular [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)] de C. glutamicum. La región aguas arriba de 5' que comprendía la región promotora del gen para la proteína correspondiente a PS2 se amplificó utilizando el método PCR a partir del DNA cromosómico de C. glutamicum ATCC13869 preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 1 (2). El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 25 comprende también la secuencia codificante de los aminoácidos del terminal N de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes a fin de construir el gen de fusión fusionado del gen de transglutaminasa que tiene la parte proestructural fusionada con la secuencia señal de la proteína de la zona superficial (SlpA) de C. ammoniagenes (gen de fusión de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente).
(SEQ ID NO: 25) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO:25: iniciador PCR
Por otra parte, se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 9 basándose en la secuencia del gen de fusión de transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural adicional, que contenía la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes, y la región de la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural adicional, que contenía la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes, se amplificó utilizando el método PCR a partir de pVSPTG1 obtenido en el Ejemplo 4 (1).
(SEQ ID NO:26) 5'-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO:26: iniciador PCR
El gen de fusión de transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural, que se ligó a la región codificante de los 25 residuos de aminoácidos del terminal N de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes y a la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen de la proteína correspondiente a PS2 de C. glutamicum ATCC13869, se amplificó luego realizando una PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 utilizando la mixtura que comprendía 1 I1 de so1 ución PCR de la región aguas arriba de 5' amplificada que contenía la región promotora del gen para la proteína correspondiente a PS2 de C. g1utamicum y 1 I1 de so1uci
ón PCR de la región amplificada del gen para la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural que tenía la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes (gen de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente).
El fragmento amplificado de aproximadamente 1,8 kb se detectó por electroforesis en agarosa. Este fragmento se recuperó del gel de agarosa utilizando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) y se insertó en el sitio SmaI de pVC7 descrito en JP-Kokai No. 9-070291 para obtener pVKSPTG1. La secuencia de nucleótidos del fragmento insertado se determinó de acuerdo con el método mencionado anteriormente y se confirmó que se había construido el gen de fusión esperado.
El gen de fusión de aproximadamente 1,8 kb del gen de fusión para transglutaminasa que tenía la pro-estructura, que estaba ligado a la región codificante de los 25 residuos de aminoácidos del terminal N (péptido señal) de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes y comprendía la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen de la proteína correspondiente a PS2 de C. glutamicum ATCC13869, se escindió por digestión de pVKSPTG1 con KpnI y XbaI y se recuperó utilizando electroforesis en agarosa. Este fragmento se insertó en el sitio KpnI-XbaI de pPK4 descrito en JP-Kokai No. 9-322774 para construir pPKSPG1. Ambos plásmidos, pVKSPTG1 y pPKSPTG1 comprendían el promotor del gen PS2 de C. glutamicum ATCC13869, el gen del péptido señal de SlpA de C. ammoniagenes y el gen de transglutaminasa de S. mobaraense.
(3) Conversión en el promotor tac de E. coli
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 se sintetizaron basándose en la secuencia del
5 plásmido pKK223-3 (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) en donde se clonó el promotor tac de E. coli. La región correspondiente al promotor tac se amplificó utilizando el método PCR a partir de DNA de pKK223-3. El iniciador representado en SEQ ID NO: 28 comprende también la secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos del terminal N de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes a fin de construir el gen de fusión que tenía la parte pro-estructural, que contenía la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes (gen de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente).
(SEQ ID NO; 27) 5'-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3'
(SEQ ID NO: 28) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28: iniciadores PCR
15 El gen de fusión para transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural adicional, que estaba ligada a la región codificante de los 25 residuos de aminoácidos del terminal N de la proteína de la zona superficial (SlpA) de C. ammoniagenes y que contenía el promotor tac (gen de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente), se amplificó por realización de una PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 9 utilizando la mixtura de 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada c orrespondiente a1 promotor tac y 1 I1 de so1uci
ón PCR de la región amplificada del gen para transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural, que contenía la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes, como moldes. El fragmento amplificado de aproximadamente 1,5 kb se detectó por electroforesis en agarosa. Este fragmento se recuperó del gel de agarosa por EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) y se insertó en el sitio SmaI del pVC7 como se describe en JP-Kokai No. 9-070291 para obtener pVTSPTG1. La secuencia de nucleótidos del fragmento insertado se determinó de acuerdo
25 con el método antes mencionado y se confirmó que se había construido el gen de fusión esperado.
El gen de fusión de aproximadamente 1,5 kb para transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural, que se ligó a la región codificante de los 25 residuos de aminoácidos del terminal N de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes y el promotor tac, se escindió por digestión de pVTSPTG1 con KpnI y XbaI y se recuperó utilizando electroforesis en agarosa. Este fragmento se insertó en el sitio KpnI-XbaI de pPK4 descrito en JP-Kokai No. 9-322774 para construir pPTSPTG1. Ambos plásmidos pVTSPTG1 y pPTSPTG1 comprendían el promotor tac derivado de E. coli, el gen del péptido señal derivado de SlpA de C. ammoniagenes y el gen de pro-transglutaminasa derivado de S. mobaraense.
(4) Secreción de la pro-transglutaminasa utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes
35 Se transformó C. glutamicum ATCC13869 con el plásmido construido pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1, o pPTSPTG1 y se seleccionaron las cepas cultivadas en el medio de agar CM2S, arriba descritas, que comprendían 5 mg/l de cloranfenicol o 25 mg/l de kanamicina. El C. glutamicum ATCC13869 seleccionado que hospedaba pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1, o pPTSPTG1 se cultivó luego en el medio de cultivo MM, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol o 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 48 horas, respectivamente. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10 I1 de1 sobrenadante de1 cu1tivo a SDS-PAGE y se realizó luego una transferencia Western con anticuerpo anti-transglutaminasa como se describe en Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994) de acuerdo con el método convencional. Como resultado, se confirmó que se secretaba la cantidad exhibida de transglutaminasa por cualquiera de los vectores, pVC7 o pPK4. Las cantidades representativas de la secreción se muestran en la Tabla 2.
45 Tabla 2. La cantidad secretada de pro-transglutaminasa utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes ATCC13869
(5) Escisión de protrans-transglutaminasa por digestión con Dispasa y detección de la actividad
Se añadió al sobrenadante del cultivo de C. glutamicum ATCC13869 que hospedaba pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1, o pPTSPTG1, una proteasa Dispasa (Boehringer Manheim Co. Ltd.) en una ratio de sustrato:enzima =1:1 y la reacción se mantuvo a 37ºC y pH 7,5 durante una hora. Después de la digestión con Dispasa, se sometió la mixtura de reacción a SDS-PAGE para confirmar la escisión de la protransglutaminasa que tenía la parte proestructural, y se confirmó que estaba contenida una actividad específica similar (aproximadamente 20 U/mg) a la de la transglutaminasa existente naturalmente, después de determinar la actividad de transglutaminasa por el método del hidroxamato.
Ejemplo 5: Escisión de protransglutaminasa utilizando el medio de cultivo o las células de S. mobaraense y la detección de la actividad.
- (1)
- Escisión de protrans-transglutaminasa utilizando el medio de cultivo y la detección de la actividad
Se cultivó la cepa de S. mobaraense IFO13819 en medio de cultivo ISP2 (4 g de extracto de levadura, 10 g de extracto de malta, 4 g de glucosa por litro de agua destilada, ajustado a pH 7,3) a 30ºC durante 24 horas. A 10 ml del medio de cultivo se añadió el sobrenadante del cultivo de C. glutamicum ATCC13869 que hospedaba pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1, o pPTSPTG1, que se utilizó también en el Ejemplo 4 (5) y donde se acumulaba protransglutaminasa, después de filtración a través de un filtro de membrana, y el medio de cultivo se mantuvo a 30ºC durante 6 horas. Se sometió luego a SDS-PAGE para confirmar la escisión de la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural. Se confirmó la actividad de la transglutaminasa, que tenía la actividad específica similar (aproximadamente 20 U/mg) a la de la transglutaminasa existente naturalmente como se determinó por el método del hidroxamato. Ulteriormente, se transfirió en condiciones semisecas sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) después de SDS-PAGE (Análisis Estructural de Proteínas para Clonación de Genes, Tokyo Kagaku Dojin (1993)). Después de la transferencia, la membrana de PVDF se tiñó con Azul Brillante Coomassie, se destiñó y se secó al aire. La porción que contenía la transglutaminasa madura se escindió y se analizó respecto a la secuencia de aminoácidos del terminal N utilizando un Secuenciador de Proteínas (Modelo 476A, Perkin Elmer Co. Ltd.). Como resultado, se confirmó que la proteína tenía la misma secuencia de aminoácidos que la de la transglutaminasa madura existente naturalmente representada en SEQ ID NO: 5.
- (2)
- Escisión de transglutaminasa con la parte pro-estructural utilizando las células de la cepa de S. mobaraense IFO13819
Se cultivó la cepa de S. mobaraense IFO13819 en medio de cultivo ISP2 a 30ºC durante 24 horas. Las células se cosecharon por centrifugación de 10 ml del medio de cultivo y se lavaron dos veces con solución salina. Las células cosechadas finalmente se suspendieron en 10 ml de solución salina. Después de filtrar, se añadieron a las suspensiones 10 ml del sobrenadante del cultivo de C. glutamicum ATCC13869 que hospedaba pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1, o pPTSPTG1, que se utilizó también en el Ejemplo 4 (5) y donde se acumulaba la pro-transglutaminasa, y la mezcla se mantuvo a 30ºC durante 6 horas. Se sometió luego la misma a SDS-PAGE y se confirmó la escisión de la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural, y la actividad de transglutaminasa que exhibía una actividad específica similar (aproximadamente 20 U/mg) a la de la transglutaminasa existente naturalmente se confirmó que estaba contenida como se determinó por el método del hidroxamato. Ulteriormente, se transfirió la misma en condiciones semisecas sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) después del proceso SDS-PAGE (Structural Analysis of Proteins for Gene Cloning, Tokyo Kagaku Dojin (1993)). Después de la transferencia, la membrana de PVDF se tiñó con Azul Brillante Coomassie, se destiñó y se secó al aire. La porción que contenía la transglutaminasa madura se escindió y se analizó respecto a la secuencia de aminoácidos del terminal N utilizando un Secuenciador de Proteínas.
Como resultado, se confirmó que la proteína tenía la misma secuencia de aminoácidos que la de la transglutaminasa madura existente naturalmente representada en SEQ ID NO: 5.
Ejemplo 6: Producción por secreción de pro-transglutaminasa utilizando el gen de fusión que contiene la secuencia codificante de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes y la protransglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852
(1) Construcción del gen de fusión que comprende la secuencia codificante de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes y la secuencia codificante de la pro-transglutaminasa derivada de S. cinnamoneum IFO12852.
La secuencia del gen de transglutaminasa de S. cinnamoneum IFO12852 ha sido determinada [Solicitud de Patente Japonesa No. 11-295649]. Se supone que la región de la posición 1 a la posición 32 en la secuencia de aminoácidos es la secuencia de la pre-parte, suponiéndose que desde la posición 33 a la posición 86 es la secuencia de la proparte y suponiéndose que desde la posición 87 a la posición 416 es la secuencia para la secuencia de glutaminasa madura. Las secuencias supuestas de la parte pro-estructural y la proteína madura se muestran en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 43, respectivamente. Adicionalmente, Escherichia coli AJ 13669 que se había transformado con el plásmido pUJ-MTG que contenía el gen ha sido depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, en fecha 14 de octubre de 1999 como FERM P-17602 y ha sido transferido al depósito conforme al tratado de Budapest en fecha 28 de agosto de 2000, habiéndosele asignado el número de depósito FERM BP-7287.
La región de 3,5 kb que abarcaba la longitud total del gen de prepro-transglutaminasa se escindió primeramente a partir de pUJ-MTG con la enzima de restricción BamHI, y se generó pUCSCTG en donde la región se insertó en el sitio BamHI de pUC19.
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 se sintetizaron, y la región del gen que comprendía la pro-transglutaminasa derivada de S. cinnamoneum IFO12852 se amplificó por el método PCR utilizando pUCSCTG como molde, conforme a lo descrito anteriormente.
(SEQ ID NO: 44) 5'-GGC GAT GGG GAAGAG AAG GGG-3'
(SEQ ID NO: 45) 5'-GGC GGA TCC TVG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45: iniciadores PCR
La región, que comprende la región aguas arriba de 5' que contiene la región promotora del gen PS2 que es la proteína de la superficie celular de C. glutamicum y la región que contiene las secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes, se amplificó luego por realización de una PCR utilizando la combinación de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 a partir de pPKSPTG1 como molde, que se construyó en el Ejemplo 4 (2).
El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 47 comprende también la secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos del terminal N de la pro-transglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852 a fin de construir el gen de fusión con la transglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852.
(SEQ ID NO: 46) 5'-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3'
(SEQ ID NO. 47) 5'-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GGC C -3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47: iniciadores PCR
El fragmento del gen de prepro-transglutaminasa fusionado heterólogamente, que estaba ligado a la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes y la región aguas arriba de 5' que comprendía la región promotora del gen PS2 se amplificó realizando una PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 45 utilizando como moldes la mixtura que comprendía 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada codificante del gen para la pro-transg1utaminasa derivada de C. cinnamoneum IF012852 y 1 I1 de so1uci
ón PCR de la región aguas arriba de 5' amplificada que contenía la región promotora del gen PS2 y la región amplificada que comprendía la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes.
El fragmento amplificado de aproximadamente 1,8 kb se detectó por electroforesis en agarosa.
Este fragmento se digirió con EcoRI y BamHI, y se recuperó luego del gel de agarosa, después de lo cual se insertó en el sitio EcoRI-BamHI del pUC19 para obtener pPUKSPTG2'. La secuencia del fragmento insertado se determinó de acuerdo con el método antes mencionado y se confirmó que el gen de fusión se había construido como era de esperar. Este pUKSPTG2' se digirió con EcoRI y se hizo romo en los extremos con Blunting Kit (Takarashuzo Co. Ltd.), y el enlazador XbaI (Takarashuzo Co. Ltd.) que tenía la secuencia 5'-CTCTAGAG-3' en donde el terminal 5' se fosforiló y se insertó y recicló luego para construir pUKSPTG2. El gen de prepro-transglutaminasa fusionado de aproximadamente 1,8 kb (el gen de pro-transglutaminasa se derivaba de S. cinnamoneum IFO12852) se escindió por digestión de pUKSPTG2 con XbaI y se recuperó utilizando electroforesis en agarosa. Estos fragmentos se insertaron en el sitio XbaI de pPK4 descrito anteriormente para construir pPKSPTG2.
Se construyó la prepro-transglutaminasa que tenía una parte pro-estructural quimérica, en la cual el terminal N de la parte pro-estructural se había reemplazado parcialmente por la parte pro-estructural de S. mobaraense (el gen de la transglutaminasa madura y la parte de la parte pro-estructural se derivaban de S. cinnamoneum IFO12852).
En primer lugar, el fragmento de aproximadamente 1,8 kb que contenía el gen de prepro-transglutaminasa de EcoRI-BamHI se escindió del plásmido pPKSPTG1 (para la expresión de la pro-transglutaminasa derivada de S. mobaraense IFO13819) que se construyó en el Ejemplo 4 (2), y el fragmento se insertó en el sitio EcoRI-BamHI de pUC19 (pUKSPTG1). El fragmento de aproximadamente 1,2 kb se escindió por digestión de pUKSPTG1 con AatII, y pUKSPTG2' se digirió también con AatII para preparar el fragmento de aproximadamente 3,3 kb eliminando el fragmento de aproximadamente 1,2 kb. Este fragmento de aproximadamente 3,3 kb se ligó al fragmento AatII de aproximadamente 1,2 kb derivado de pUKSPTG1, y los clones en los cuales se había insertado el fragmento AatII se seleccionaron de acuerdo con las técnicas convencionales de ingeniería genética. Con objeto de determinar en qué orientación se había insertado el fragmento AatII en los clones, se secuenciaron éstos serialmente y se seleccionaron los clones en los que fragmento se había insertado en la orientación deseada (pUKSPTG3'). Además, el sitio EcoRI de pUKSPTG3' se hizo también romo en los extremos como en el caso de pUKSPTG2' y el enlazador XbaI se insertó para construir pUKSPTG3. Ulteriormente, el fragmento XbaI de 1,8 kb escindido de pUKSPTG3 se insertó en el sitio XbaI de pPK4 para construir pPKSPTG3.
(2) Secreción de la pro-transglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852 utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes.
Se transformó C. glutamicum ATCC13869 utilizando el plásmido pPKSPTG2 o pPKSPTG3, y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S arriba descrito que comprendía 25 mg/l de kanamicina. La cepa seleccionada de C. glutamicum ATCC13869 que hospedaba pPKSPTG2 o pPKSPTG3 se cultivó luego respectivamente en medio de cultivo líquido MMTG (60 g de glucosa, 0,4 g de sulfato de magnesio heptahidratado, 30 g de sulfato de amonio, 1 g de dihidrogenofosfato de potasio, 0,01 g de sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g de sulfato de manganeso (II) pentahidratado, 450 Ig de hidroc1oruro de tiamina, 450 Ig de biotina, 0,15 g de DL-metionina, 50 g de carbonato de calcio por litro de agua destilada, ajustado a pH 7,5) que contenía 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 3 días. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10I1 de1 sobrenadante de1 cu1tivo a SDS -PAGE y se realizó luego un análisis por transferencia Western de acuerdo con el método convencional con anticuerpo antitransglutaminasa como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo es un anticuerpo para la transglutaminasa derivada de S. mobaraense, pero exhibía también reactividad frente a la transglutaminasa derivada de S. cinnamoneum. De este modo se confirmó la secreción de la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural derivada de S. cinnamoneum IFO12852 (aproximadamente 30 a 50 mg/l).
Ejemplo 7: Producción por secreción de transglutaminasa por reemplazamiento de la parte pro-estructural de la protransglutaminasa derivada de S. mobaraense IFO13819 por la parte pro-estructural derivada de S. cinnamoneum IFO12852 (generación del híbrido)
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 48 y la región aguas arriba de 5' que comprendía la región promotora del gen PS2 de C. glutamicum ATCC13869 y la región codificante de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes, así como la parte pro-estructural de la transglutaminasa derivada de S. cinnamoneum IFO12852 se amplificaron a partir de pPKSPTG2 o pPKSPTG3 utilizando el método PCR, respectivamente.
El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 48 comprende también la secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos del terminal N de la transglutaminasa madura derivada de S. mobaraense IFO13819 a fin de construir el gen de fusión que contenía la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen PS2 de C. glutamicum ATCC13869, la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de C. ammoniagenes y el gen para la transglutaminasa madura derivada de S. mobaraense IFO13819 que tenía la parte pro-estructural de la transglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852
(SEQ ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG3'
(SEQ ID NO: 48) 5'-GGG GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG GGG GCC CGG GAG GGC GCG CTG G-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 48: iniciador PCR
Por otra parte, se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 basándose en la secuencia del gen de transglutaminasa derivado de S. mobaraense determinada en el Ejemplo 1 (1) y la región del gen de la transglutaminasa madura derivada de S. mobaraense se amplificó utilizando el método PCR a partir de pUITG que se había obtenido en el Ejemplo 1 (1).
(SEQ ID NO: 8) 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
(SEQ ID NO: 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 8 y 9: iniciadores PCR
A continuación, el fragmento para el gen de fusión del gen de la transglutaminasa madura derivado de S. mobaraense IFO13819, que tenía la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen PS2 de C. glutamicum ATCC13869, la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes y la parte pro-estructural de la pro-transglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852, se amplificó utilizando como molde PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 empleando 1 ml de solución PCR de cada región amplificada que comprendía la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen PS2 de C. glutamicum ATCC13869, la región codificante de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular (SlpA) de
C. ammoniagenes y la secuencia codificante de la parte pro-estructural de la transglutaminasa derivada de S. cinnamoneum IFO12852, así como 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada del gen codificante de la transglut aminasa madura derivada de S. mobaraense IFO13819,. El fragmento amplificado de aproximadamente 1,8 kb se detectó por electroforesis en agarosa. El fragmento de aproximadamente 800 pb, que se generó por digestión del fragmento con ScaI y Eco065I, se recuperó del gel de agarosa. El fragmento escindido de pKSPTG1, que se había construido en el Ejemplo 4 (2), por digestión con ScaI y Eco065I se reemplazó por este fragmento para construir pPKSPTG4 y pPKSPTG5.
(SEQ ID NO: 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
(2) Secreción de la transglutaminasa derivada de S. mobaraense IFO13819 utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular C. ammoniagenes y la parte pro-estructural derivada de S. cinnamoneum IFO12852.
Se transformó C. glutamicum ATCC13869 con los plásmidos construidos pPKSPTG4 o pPKSPTG5, y se selecciona
10 ron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S arriba descrito que comprendía 25 mg/l de kanamicina. A continuación, se cultivó el C. glutamicum ATCC13869 seleccionado que hospedaba pPKSPTG4 o pPKSPTG5 en medio de cultivo MMTG, arriba descrito, que comprendía 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 30 días, respectivamente. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10 I1 de1 sobrenadante de1 cu1tivo a SDS-PAGE y se realizó luego un análisis por transferencia Western con anticuerpo anti-transglutaminasa como se ha descrito previamente de
15 acuerdo con el método convencional. De este modo, se confirmó la secreción de la transglutaminasa derivada de S. mobaraense IFO13819 que tenía la parte pro-estructural derivada de S. cinnamoneum IFO12582. La Tabla 3 muestra la cantidad de la producción de pro-transglutaminasa. Se utilizó como control pPKSPTG1 y se caracterizó genéticamente en el sentido de que la pro-parte se derivaba de S. mobaraense. Se caracterizó pPKSPTG4 en la construcción genética en el sentido de que la pro-parte se derivaba de S. cinnamoneum. pPKSPTG5 se caracterizó
20 en la construcción genética en el sentido de que la pro-estructura tenía una pro-estructura quimérica en la que los 16 aminoácidos del terminal N de la parte pro-estructural se derivaban de S. mobaraense y los 40 aminoácidos del terminal C se derivaban de S. cinnamoneum. Por lo demás, los 3 tenían las características comunes. Como resultado, se observó una diferencia significativa en la cantidad de secreción debido a la diferencia de la secuencia de aminoácidos de la parte pro-estructural. La cepa que tenía la estructura quimérica secretaba la cantidad máxima de
25 transglutaminasa (ATCC13869/pPKSPTG5).
Tabla 3: Cantidad de la producción por secreción de pro-transglutaminasa debida a la diferencia de la parte proestructural
Ejemplo 8: Clonación del gen de serina-proteasa (SAMP45) y la generación y evaluación de los plásmidos de expre30 sión
(1) Construcción del gen de serina-proteasa (SAMP45) que tiene la parte pro-estructural y la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes (gen de la prepro-serina proteasa (SAMP45) fusionado heterólogamente).
La secuencia del gen de SAMP45 que es una serina proteasa producida por S. albogriseolus [J. Bacteriol., 179, 430
35 438 (1997)] ha sido ya determinada. Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50 se sintetizaron recurriendo a esta secuencia y la región del gen que comprendía la parte proestructural del terminal N de SAMP45, SAMP45 maduro y la parte pro-estructural del terminal C se amplificó utilizando el método PCR de acuerdo con el método descrito anteriormente.
(SEQ ID NO: 49) 5'-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3'
40 (SEQ ID NO: 50) 5'-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50 : iniciadores PCR
La región que comprendía la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen de la proteína de la superficie celular PS2 de C. glutamicum y la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. am45 moniagenes se amplificó análogamente utilizando el método PCR con la combinación de SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 con pPKSPTG1 construido en el Ejemplo 4 (2) como molde.
El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 52 comprende la secuencia codificante de los aminoácidos del terminal N de pro-serina proteasa a fin de construir el gen de fusión que contenía la serina-proteasa que tenía la parte proestructural.
(SEQ ID NO: 51) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(SEQ ID NO: 52)
5'-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCACAGGTGCGGCC-3'
< Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52: iniciadores PCR para construir el gen fusionado de la pro-serina proteasa
A continuación, el fragmento del gen del gen de la prepro-serina proteasa fusionado heterólogamente, que se había ligado a la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes y la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen PS2, se amplificó por realización de PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 50 utilizando como moldes la mixtura que comprendía 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada que comprendía el gen para la parte pro-estructural del terminal N de SAMP45, SAMP45 madura y la pro-estructura de1 termina1 C, y 1 I1 de so1ución PCR de la regi ón amplificada que comprendía la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen PS2 y la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes, respectivamente.
El fragmento amplificado de aproximadamente 3,9 kb se detectó por electroforesis en agarosa.
El producto PCR se digirió con HindIII y EcoRI, se sometió luego a electroforesis en gel de agarosa, y el fragmento de aproximadamente 3,9 kb se recuperó del gel de agarosa y se insertó en el sitio HindIII-EcoRI del pVC7 arriba mencionado para obtener pVSS1, respectivamente. La secuencia del fragmento insertado se determinó de acuerdo con el método arriba mencionado y se confirmó que se había construido el gen de fusión como era de esperar.
- (2)
- Secreción de la serina-proteasa utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes
Se transformó C. glutamicum ATCC13869 utilizando el plásmido pVSS1 y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S arriba descrito que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol. El C. glutamicum ATCC13869 seleccionado que hospedaba pVSS1 se cultivó luego en medio de cultivo MMTG que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol a 30ºC durante 70 horas. Se separó 1 ml del medio de cultivo en el sobrenadante del medio de cultivo y las células por centrifugación. Las células se suspendieron en tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,0). La actividad de la serina-proteasa se determinó como sigue: se añadieron 50 I1 de1 sobrenadante de1 medio de cu1tivo o 1a suspensión de células a tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0) que contenía Bz-Phe-Val-Arg-pNA 0,25 mM (Bachem Co. Ltd.) para dar una cantidad total de 0,6 ml, que se mantuvo a 30ºC durante 20minutos. Se terminó luego la reacción por adición de 0,4 ml de ácido acético al 50%. Se midió la absorbancia a 410 nm y se determinó la cantidad de p-NA (p-nitroanilida) liberada para determinar la actividad. Se definió una unidad de la enzima como la cantidad de enzima que 1ibera 1 Imo1 de pNA por minuto. Como resu1tado, no se detectaba 1a actividad de serina-proteasa en el sobrenadante del medio de cultivo, pero sí se detectaba en la suspensión de células. Calculando a partir de los valores de actividad detectada y los valores de la actividad específica consignada en la bibliografía [J. Bacteriol., 179, 430-438 (1997)], se confirmó que se expresaba tanto como aproximadamente 9 mg/l de serina-proteasa, y se secretaba en la superficie de la célula.
- (3)
- Escisión de la parte pro-estructural de la transglutaminasa que tiene la parte pro-estructural por serina-proteasa que se produce por secreción en C. glutamicum ATCC13869
- C.
- glutamicum ATCC13869 que hospedaba el plásmido de expresión por secreción pPKSPTG1 para la transglutaminasa que tiene la parte pro-estructural descrita en el Ejemplo 4 (2) se transformó con el plásmido construido pVSS1 y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/l de kanamicina. A continuación, el C. glutamicum ATCC13869 seleccionado que hospedaba pVSS1 y pPKSPTG1 se cultivó en el medio de cultivo MMTG, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/ml de kanamicina a 30ºC durante 70 horas. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10 I1 de1 sobrenadante del cultivo a SDS-PAGE y se realizó un análisis por transferencia Western con el anticuerpo antitransglutaminasa descrito previamente de acuerdo con el método convencional. Como resultado, se confirmó que SAMP45 se expresaba y secretaba normalmente, y que la parte pro-estructural se escindía de la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural que se secreta también, dando como resultado la secreción de una transglutaminasa que tiene el peso molecular similar al de la transglutaminasa madura existente naturalmente.
El sobrenadante del medio de cultivo se investigó respecto a actividad de transglutaminasa por el método del hidroxamato descrito previamente, lo que confirmó que tenía una actividad específica similar (aproximadamente 20 U/mg) a la de la transglutaminasa existente naturalmente.
Se transfirió ulteriormente el mismo en condiciones semisecas sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) de acuerdo con el método descrito previamente después de la SDS-PAGE. Después de la transferencia, la membrana de PVDF se tiñó con Azul Brillante Coomassie, se destinó y se secó al aire. La porción que contenía la transglutaminasa madura se escindió y se analizó respecto a la secuencia de aminoácidos del terminal N utilizando
5 un secuenciador de proteínas. Como resultado, se confirmó que la misma tenía una estructura en la cual los 4 aminoácidos del terminal C de Phe-Arg-Ala-Pro de la parte pro-estructural se añadían a la transglutaminasa madura existente naturalmente derivada de S. mobaraense que se muestra en SEQ ID NO: 5.
Ejemplo 9: Clonación del gen de la peptidasa específica de prolina (svPEP), y generación y evaluación de plásmidos de expresión
10 (1) Purificación de la peptidasa específica de prolina (svPEP) producida por S. mobaraense IFO13819
Se pusieron 800 ml de medio de cultivo líquido y SP2 (4 g de extracto de levadura, 10 g de extracto de malta, 4 g de glucosa completado hasta 1 l con agua, y ajustado a pH 7,3) en un matraz Sakaguchi de 5 l, se inoculó S. mobaraense IFO13819 desde la placa al matraz y se cultivó por agitación mediante sacudidas a 30ºC durante 48 horas a 120 rpm.
15 Se centrifugó el medio de cultivo para eliminar el sobrenadante del cultivo y se cosecharon las células. Después de lavado de las células con tampón Tris-HCl 20 mM que contenía 25 mg/l de kanamicina, las células resultantes se suspendieron en tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,0) que contenía 25 mg/ml de kanamicina. La suspensión se agitó mediante sacudidas en hielo durante 4 horas y se centrifugó para dar el sobrenadante, que se recogió. Después de esterilizar por filtración el sobrenadante utilizando un filtro de nitrocelulosa (0,22 Im de tamaño de poro,
20 Sartrius Co. Ltd.), el sobrenadante se pasó a través de una columna Butil-Sepharose 4FF (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) (1,6 ø x 10 cm), que se había pre-equilibrado con tampón de sulfato de amonio 1,5 M/ fosfato 50 mM (pH 7,0), utilizando FPLC (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) y se eluyó con un gradiente lineal de sulfato de amonio 1,5 a 0 M en el mismo tampón. Las fracciones que contenían los componentes activos se agruparon y se pasaron a través de una columna de Fenil-Sepharose HP (1 ml, Amersham Pharmacia Co. Ltd.) en las mismas condiciones, y las
25 fracciones activas se agruparon y se dializaron durante una noche contra tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) a 4ºC para dar una solución de enzima purificada parcialmente.
El peso total, la actividad total, la actividad específica y el rendimiento de proteínas en cada paso se presentan en la Tabla 4. La actividad enzimática en cada paso se determinó de acuerdo con el método de Yoshimoto et al (Tsuru y Funatsu compiladores, Seibutsukagaku Jikkenhou, 31 Proteolytic enzyme II, Gakkai Shuppan Center (1993), p. 187)
30 como sigue:
La solución enzimática se añadió a 20 mM de tampón de fosfato de sodio que contenía 0,25 mM de Ala-Ala-Pro-pNA (Bachem Co. Ltd.) para dar una cantidad total de 0,6 ml, que se mantuvo a 30ºC durante 5 minutos. Después de ello, se terminó la reacción por adición de 0,4 ml de ácido acético al 50%. Se midió la absorbancia a 410 nm y se calculó la cantidad de pNA liberada para determinar la actividad. Una unidad de la enzima se definió como la cantidad de la
35 enzima que libera 1 Imo1 de pNA por minuto.
Tabla 4. Purificación de la peptidasa específica de prolina derivada de S. mobaraense
- Pasos de Purificación
- Volumen (ml) Actividad total (id d ) Proteína total ( ) Actividad específica (id d/ ) Rendimiento (%) Nivel de purificación ( )
- Extracto bruto
- 550 308 385 0,80 100 1
- Butil-Sepharose 4FF
- 45,6 213 8,98 23,7 69 30
- Fenil-Sepharose HP
- 8 136 3,83 35,5 44 44
- (2)
- Secuenciación de la secuencia amino del terminal N de la peptidasa específica de prolina (svPEP) producida por
- S.
- mobaraense IFO13819
Una solución de la enzima parcialmente purificada se sometió a cromatografía de fase inversa para purificación ulterior. La condición de la cromatografía de fase inversa era como sigue:
Dispositivo HPLC: bomba: HITACHI L-6300, detector: L-4000H
Columna: PROTEIN C4 214TP5410 (VYDAC Co. Ltd.)
5 Elución: la elución se efectuó con un gradiente lineal de acetonitrilo 24-40%/0,1% ácido trifluoroacético (20 min) a la temperatura ambiente
Caudal: 1,0 ml/min
Longitud de onda de detección: 280 nm
Las muestras de enzima que se purificaron en las condiciones arriba descritas se transfirieron a una membrana de
10 poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) utilizando un Cartucho de Membrana (Perkin Elmer Co. Ltd.) y se analizó la secuencia de aminoácidos del terminal N utilizando el Secuenciador de Proteínas PPSQ-10 en fase gaseosa (Shimadzu Seisakusho Co., Ltd.). Como resultado, se determinaron los 20 residuos de aminoácidos del terminal N, que se muestran en SEQ ID NO: 53.
15 (3) Evaluación de las propiedades de la peptidasa específica de prolina (svPEP) producida por S. mobaraense IFO13819
La peptidasa específica de prolina (svPEP) producida por S. mobaraense IFO13819 se evaluó respecto a las propiedades siguientes:
(I) Especificidad de sustrato
20 (a) Cuando se utilizó como sustrato un péptido cromóforo conjugado con pNA:
Se añadió solución de enzima purificada a 20 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6,5) que contenía 0,25 mmol de cada uno de los diversos péptidos conjugados a pNA para dar una cantidad total de 0,6 ml, que se mantuvo a 37ºC durante 5 minutos. La reacción se terminó después de la adición de 0,4 ml de ácido acético al 50%. Se midió la absorbancia a 410 nm para determinar la actividad de escisión.
25 (b) Cuando se utilizó como sustrato un grupo cromóforo �NA (� -naftilamido)-péptido conjugado: se añadió solución de enzima purificada a 20 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6,5) que contenía 0,3 mmol de cada uno de diversos péptidos para dar una cantidad total de 1,0 ml, que se mantuvo a 37ºC durante 5 minutos. La reacción se terminó después de la adición de 0,4 ml de solución GBC Fast Garnet (se disolvió Fast Garnet GBA en 10% de Triton X-100/acetato de sodio 1 M (pH 4,0) para dar 0,1%).
30 Se midió la absorbancia a 550 nm para determinar la actividad de escisión.
(c) Cuando se utilizó como sustrato un péptido: se añadió solución de la enzima a la solución de péptido, que se preparó de modo que contuviera 1 mg/ml, como un sustrato y la reacción se efectuó a 30ºC durante una hora. La actividad de escisión se confirmó utilizando HPLC en las condiciones siguientes:
Columna: YMC-PACK ODS-A 4,6 x 150 mm (YMC)
35 Eluyente: ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA)-acetonitrilo
Caudal: 1 ml/min
Longitud de onda de detección: UV220 nm
Como resultado, se reveló que la enzima era la enzima que escinde un péptido específicamente en el lado del terminal carboxilo del residuo prolina, y que la misma reconoce preferiblemente Ala-Ala-Pro-pNA, Phe-Arg-Ala-Xaa (SEQ 40 ID NO: 68) (en donde Xaa representa Pro-pNA y pNA representa p-nitroanilida), Ala-Phe-Pro-pNA en este orden, y que la misma era más específicamente reactiva con el péptido que tenía prolina en la posición tercera o cuarta res
pecto al terminal N. Se reveló también que la enzima no actuaba sobre el péptido que tenía prolina en la posición segunda o quinta respecto al terminal N (Tabla 5).
Tabla 5. Especificidad de svPEP
- Sustrato peptídico
- Actividad relativa
- (%)
- p-pNA
- 0,04
- DP-pNA
- 0,00
- Z-GP-�NA
- 0,04
- GP- �NA
- 0,40
- AP- pNA
- 0,53
- RP-pNA
- 0,94
- Z-AGP-�NA
- 0,78
- Z-GAP- �NA
- 1,2
- Bz-FVR-pNA
- 0,002
- AAF-pNA
- 4,1
- AAA-pNA
- 8,5
- AFP-pNA
- 26,3
- AAP-pNA
- 100
- AAPL-pNA
- 0,3
- FRAP-pNA
- 49,0
- Suc-AAPF-pNA
- 0,01
- SFRAP-pNA
- 1,23
- PSFRAP-pNA
- 0,2
5 pNA: p-nitroanilida, �-NA �-naftilamido
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 68: sustrato para svPEP
(ii) pH óptimo
Se utilizaron como tampón, respectivamente
10 pH 4 a 6: tampón de fosfato de sodio 20 mM,
pH 5,5 a 8: tampón de fosfato de sodio 20 mM, y
pH 6,5 a 9,5: tampón tris-hidrocloruro 20 mM. La enzima se dejó actuar sobre Ala-Ala-Pro-pNA como el sustrato a 30ºC durante 5 minutos. Se calculó la actividad relativa de la enzima en cada tampón comparando con la actividad tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,5 como 100%. Como resultado, se reveló que su pH óptimo estaba com
15 prendido entre 6 y 6,5.
(iii) Estabilidad del pH
Se utilizaron tampones de GTA 0,15 M (tampones compuestos de ácido 3,3-dimetilglutárico, tris(hidroximetil)aminometano, 2-amino-2-metil-1,3-propanodio1) comprendidos entre pH 3 y pH 10. A 20 I1 de so1ución de enzima purificada, se añadieron 40 I1 de1 tampón a cada pH y las mixturas de reacción se dejaron en reposo
20 durante una noche a 4ºC, se ajustaron luego a pH 7,0 y se completó el volumen hasta 120 I1. A partes a1ícuotas de 50 I1, se añadió Ala -Ala-Pro-pNA y la reacción se efectuó a 30ºC durante 5 minutos. Se consideró que las cantidades relativas de sustrato que descomponían la enzima a cada pH eran la actividad restante comparada con la actividad de la enzima como 100% cuando la enzima se guardó en las mismas condiciones que se han descrito arriba excepto en lo que respecta a pH 7,0. Como resultado, se descubrió que la enzima era estable a pH 4 a 9.
25 (iv) Temperatura óptima
A 50 I1 de so1ución purificada de enzima, se añadieron 0,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 6,5) y se añadió Ala-Ala-Pro-pNA hasta 0,25 mM, y la mixtura se mantuvo a 20ºC-60ºC durante 5 minutos para efectuar la reacción de descomposición. Se consideró que la cantidad relativa de sustrato que descomponía la enzima era la
5 actividad relativa a cada temperatura, comparada con la cantidad de descomposición de sustrato a 25ºC como 100% de actividad. Como resultado, se reveló que la temperatura óptima estaba comprendida entre 25 y 30ºC.
(v) Estabilidad de temperatura
A 50 I1 de so1ución de enzima purificada, se añadieron 0,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 6,5). La mixtura se mantuvo a 4ºC o 20ºC-60ºC durante 15 minutos y se enfrió luego en hielo. Se añadió Ala-Ala-Pro-pNA
10 hasta 0,25 mM, y la mixtura se mantuvo a 30ºC durante 5 minutos. La actividad restante se calculó suponiendo que la actividad de la enzima que se trató a 4ºC era 100%. Como resultado, se reveló que la enzima era estable por debajo de 20ºC.
(vi) Inhibidores
A tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 6,5) que contenía cada compuesto a la concentración indicada que se
15 muestra en la Tabla 6, se añadió solución de enzima purificada y la mixtura se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió luego Ala-Ala-Pro-pNA y se efectuó la reacción a 30ºC durante 5 minutos. Suponiendo que la actividad de la enzima para Ala-Ala-Pro-pNA en la ausencia de compuestos es 100%, se consideró que la cantidad relativa de descomposición del sustrato en presencia del compuesto era la actividad relativa. Como resultado, se inhibió en cierto grado la enzima por medio de ácido cloromercuribenzoico, etc. que corresponde
20 a los inhibidores enzimáticos SH, pero se sometió a inhibición comparativamente fuerte por fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Nakaraitesk Co., Ltd.) y fluoruro de aminoetilbencenosulfonilo-clorhidrato (Boehringer Manheim Co. Ltd.) que eran los inhibidores de la serina-proteasa.
Tabla 6. Efectos de los inhibidores respecto a la actividad de la peptidasa específica de prolina derivada de S. mobaraense
- Compuestos
- Concentración (mM) Actividad relativa (%)
- Ninguno Inhibidores enzimáticos de serina Fluoruro de fenilmetilsulfonilo Fluoruro de aminoetilbencenosulfoniloclorhidrato Quimostatina
- 0 1 4 1 100 39,7 59,9 84,9
- Inhibidores enzimáticos SH Ácido p-cloromercuribenzoico N-Etilmaleimida Yodoacetamida
- 1 1 1 87,198,387
- Inhibidor enzimático de asparagina Pepstatina
- 1 165,7
- Inhibidores de metaloproteasas EDTA 1,10-Fenantrolina
- 10 1 105,292,5
- Inhibidor de aminopeptidasa Bestatina
- 1 97,6
- Agente reductor Ditiotreitol
- 10 102,5
- Inhibidores de prolil-endopeptidasa Z-(S)Pro-(S)Prolinal Z-Pro-(S)Prolinal Z-Pro-Prolinal
- 1 1 1 111,2105,899,7
(3) Adquisición del gen de peptidasa específica de prolina (svPEP) derivado de S. mobaraense IFO13819
Se seleccionó la región que tenía menos degeneración, que se deduce de la secuencia de aminoácidos del terminal N determinada de svPEP, Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-Glu-Glu-Lys, y se generó el oligonucleótido sintético que 5 se muestra en SEQ ID NO: 54. El DNA cromosómico preparado de acuerdo con el método convencional se digirió con diversas enzimas de restricción que reconocen la secuencia de 6 nucleótidos y se analizó luego por el método de hibridación mediante transferencia Southern utilizando este oligonucleótido sintético como sonda y de este modo se detectó una sola banda de aproximadamente 6 kb por escisión con SacI. De acuerdo con ello, el DNA cromosómico de S. mobaraense IFO13819 preparado de acuerdo con el método arriba mencionado se digirió con SacI y se 10 recuperó el fragmento de aproximadamente 6 kb utilizando electroforesis en gel de agarosa con EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.). El fragmento recuperado se insertó en el sitio SacI de pUC18, que se introdujo en la célula competente de Escherichia coli JM109 (Takarashuzo Co. Ltd.), produciendo de este modo una biblioteca. La biblioteca así generada se cribó respecto a la cepa que hospedaba el plásmido en la cual se había clonado el fragmento de svPEP, por cribado de la biblioteca mediante hibridación de colonias utilizando como sonda el oligonucleótido
15 sintético marcado con 32P que se muestra en SEQ ID NO: 54 para obtener el gen propuesto. El plásmido recuperado de esta cepa se designó como pUMP1.
(SEQ ID NO: 54) 5'-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO:54: sonda para svPEP
20 Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento que se clonó como pUMP1. La secuencia de nucleótidos del gen svPEP correspondiente a svPEP se muestra en SEQ ID NO: 41. Se dedujo la secuencia de aminoácidos codificada por este gen y se encontró la secuencia de aminoácidos del terminal N determinada anteriormente (20 residuos) basada en la proteína enzimática, y se determinó la secuencia primaria de aminoácidos de la svPEP madura que se muestra en SEQ ID NO: 40. Se determinó la secuencia primaria entera de aminoácidos que contenía la
25 secuencia señal supuesta y la parte pro-estructural de svPEP, que se muestra en SEQ ID NO: 42.
Escherichia coli AJ13669 que se transformó con pUMP1 ha sido depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial en fecha 15 de mayo de 2000 como FERM BP7160 de acuerdo con el tratado de Budapest.
(4) Construcción del gen de la peptidasa específica de prolina (svPEP) que tiene la parte pro-estructural con la se
30 cuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes (peptidasa específica pre-prolina fusionada heterólogamente (svPEP)).
Los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56 se sintetizaron recurriendo a la secuencia de svPEP determinada en el Ejemplo 9 (3), y la región del gen que contenía la pro-parte de svPEP y svPEP madura se amplificaron por el método PCR de la misma manera que se ha descrito anteriormente utilizando pUMP1 construido
35 en el Ejemplo 9 (3) como molde.
(SEQ ID NO: 55) 5'-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3 '
(SEQ ID NO: 56) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGGCGGCGGCACCCGG-3'
‹Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56: Iniciadores PCR
40 A continuación, se amplificó por el método PCR la región que comprende la región aguas arriba 5' que contiene la región promotora del gen PS2 que es el gen de la proteína de la superficie celular de C. glutamicum y la región que contiene la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes, a partir de pPKSPTG1 como molde construido en el Ejemplo 4 (2) utilizando la combinación de SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 57.
El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 57 comprende la secuencia codificante de los aminoácidos del terminal N de svPEP con objeto de construir el gen de fusión fusionado a la svPEP que tiene la parte pro-estructural.
(SEQ ID NO: 51) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGGCTGA-3'
(SEQ ID NO: 57)
5'-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3'
‹Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 57: Iniciador PCR
El fragmento del gen fusionado heterólogamente de prepro-svPEP, que estaba ligado a la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes y la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen PS2, se amplificó luego por realización de PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 56 utilizando como moldes la mixtura que comprendía 1I1 de cada so1ución PCR de la región que contenía el gen codificante de la parte pro-estructural de svPEP y la svPEP madura, que se amplificaron respectivamente, y 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada que comprendía la región aguas arriba 5' que contenía la región promotora del gen PS2 y la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes.
(SEQ ID NO: 51) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTTA-3'
(SEQ ID NO: 56) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'
El fragmento amplificado de aproximadamente 2,1 kb se detectó por electroforesis en agarosa. El fragmento PCR se digirió con HindIII, y se sometió luego a electroforesis en gel de agarosa, y el fragmento de aproximadamente 2,1 kb se recuperó del gel de agarosa y se insertó en el sitio HindIII del pVSS1 descrito en el Ejemplo 8 (1) para obtener pVSSSP1, respectivamente. La secuencia del fragmento insertado se determinó de acuerdo con el método convencional y se confirmó que se construía el gen de fusión esperado.
- (5)
- Secreción de la peptidasa específica de prolina utilizando la secuencia señal de la proteína de la superficie celular de C. ammoniagenes
- C.
- glutamicum ATCC 13869 se transformó con el plásmido pVSSSP1 construido y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CMS2 arriba descrito que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol. El C. glutamicum ATCC 13869 seleccionado que hospedaba pVSSSP1 se cultivó luego en medio de cultivo MMTG, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol a 30ºC durante 70 horas. Se separaron por centrifugación 10I1 de1 sobrenada nte del cultivo en el sobrenadante del medio de cultivo y las células. Las células se suspendieron en tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,0). La actividad de svPEP se determinó como sigue: se añadieron 50 I1 de1 sobrenadante del medio de cultivo o la suspensión de células a 20 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) que contenía AlaAla-Pro-pNA 0,25 mM (Bachem Co. Ltd.) para dar una cantidad total de 0,6 ml y la mixtura se mantuvo a 30ºC durante 20 minutos. Después de ello se terminó la reacción por adición de 0,4 ml de ácido acético al 50%. Se midió la absorbancia a 410 nm y se calculó la cantidad de p-NA (p-nitroanilida) liberada para determinar la actividad. Una unidad de la enzima se define como la cantidad de enzima que libera 1 Imo1 de pNA por minuto. Como resu1tado, 1a actividad de svPEP no se detectaba el sobrenadante del medio de cultivo, pero sí se detectaba en la suspensión de células. Calculando a partir de los valores de la actividad detectada y los valores de la actividad específica descritos en el Ejemplo 9 (1), se confirmó que se expresaba tanto como aproximadamente 50 mg/l de svPEP y se secretaba en la superficie de la célula.
- (6)
- Escisión de la parte pro-estructural por la serina-proteasa y la proteasa específica de prolina expresada y secretada por C. glutamicum ATCC 13869.
- C.
- glutamicum ATCC 13869 que hospedaba el plásmido de expresión por secreción pPKSPTG1 para transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural descrita en el Ejemplo 4 (2) se transformó con el plásmido pVSSSP1 construido, y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/l de kanamicina. A continuación, el C. glutamicum ATCC 13869 seleccionado que hospedaba pVSSSP1 y pPKSPTG1 se cultivó en medio de cultivo MMTG, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 70 horas. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10 I1 del sobrenadante del cultivo a SDS-PAGE y se realizó luego un análisis por transferencia Western con el anticuerpo anti-transglutaminasa descrito previamente de acuerdo con el método convencional. Como resultado, se confirmó que SAMP45 y svPEP se expresaban y secretaban normalmente, y que la parte pro-estructural se escindía de la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural que se había secretado también, con lo cual se confirmó la secreción de la transglutaminasa que tenía un peso molecular similar al de la transglutaminasa madura existente naturalmente.
La actividad de transglutaminasa del sobrenadante se testó por el método del hidroxamato descrito anteriormente, que confirmó que la misma tenía una actividad específica similar (aproximadamente 20 U/mg) a la de la transglutaminasa existente naturalmente.
Se transfirió luego el mismo en condiciones semisecas sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF)
5 de acuerdo con el método descrito previamente después de SDS-PAGE. Después de la transferencia, la membrana de PVDF se tiñó con Azul Coomassie Brillante, se destiñó y se secó al aire. Se separó la porción que contenía la transglutaminasa madura y se analizó respecto a la secuencia de aminoácidos del terminal N utilizando un secuenciador de proteínas. Como resultado, se confirmó que aquélla tenía la misma secuencia que la transglutaminasa existente naturalmente derivada de S. mobaraense que tiene Asp como el aminoácido del terminal N, que se muestra en SEQ ID NO: 5.
Ejemplo 10: Generación de la variante de deleción parcial de la pro-estructura de pro-transglutaminasa derivada de
S. mobaraense IFO13819 y producción de transglutaminasa por secreción
(1) Construcción del gen para variantes de deleción parcial de la pro-estructura de la transglutaminasa
Con objeto de generar la forma de deleción parcial en la que se delecionaron los residuos de aminoácidos del termi
15 nal C de la parte pro-estructural, se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 basándose en la secuencia del gen de transglutaminasa determinado en el Ejemplo 1 (1) y la región del gen de la transglutaminasa madura se amplificó utilizando pUITG obtenido en el Ejemplo 1 (1) por el método PCR similar al descrito previamente.
A continuación, la región del gen que comprendía la región aguas arriba 5' que contenía el promotor del gen PS2 que era la proteína de la superficie celular de C. glutamicum, la región del gen para la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. glutamicum y la parte pro-estructural de la transglutaminasa se amplificó con la combinación de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 58 o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 59, utilizando pPKSPTG1 construido en el Ejemplo 4 (2) como molde.
El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 58 tiene la secuencia que es deficiente en dos residuos de aminoácidos
25 del terminal C, Ala-Pro, de la parte pro-estructural de la transglutaminasa, y el iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 59 tiene la secuencia que es deficiente en los cuatro residuos de aminoácidos del terminal C, Phe-Arg-Ala-Pro, de la parte pro-estructural de la transglutaminasa y comprende adicionalmente la secuencia codificante de los residuos de aminoácidos del terminal N de la transglutaminasa madura a fin de construir el gen de fusión con transglutaminasa madura.
(SEQ ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(SEQ ID NO: 58) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC CGG AAC GAC GGG CGG GCG C-3'
(SEQ ID NO: 59) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC GAC GGG CCG GCG CTC GAA G-3 '
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59: Iniciadores PCR
35 El fragmento de gen para la transglutaminasa madura, que estaba ligado a la forma de deleción de la pro-estructura de la transglutaminasa, la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes y la región aguas arriba 5' que contenía la región promotora del gen de PS2 que es la proteína de la superficie celular de
C. glutamicum, se amplificó respectivamente utilizando PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 uti1izando como mo1de 1 I1 de cada so1ución PCR que comprendía la región aguas arriba de 5' amplificada que contenía la región promotora del gen PS2 que es la proteína de la superficie celular de C. glutamicum, la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes y cada una de la parte pro-estructural modificada, y 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada codificante de la transglutaminasa madura.
(SEQ ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(SEQ ID NO: 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTACC-3'
45 El fragmento amplificado de aproximadamente 1,8 kb se detectó por electroforesis en agarosa. El fragmento de aproximadamente 800 pb que se generó por digestión de este fragmento con las enzimas de restricción ScaI y Eco065I se recuperó del gel de agarosa y se reemplazó por el fragmento escindido de pPKSPTG1, que se construyó en el Ejemplo 4 (2), con ScaI y Eco065I para construir pPKSPTG1MAP (tipo de de1eci-Pro) y
ón Ala pPKSPTG1MFRAP (tipo de de1eción Phe-Arg-Ala-Pro).
A continuación, con objeto de generar la forma de deleción parcial de la pro-parte en donde los residuos de aminoácidos del terminal N de la parte pro-estructural se habían delecionado parcialmente, se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 basándose en la secuencia del gen de la transglutaminasa determinada en el Ejemplo 1 (1) y las regiones del gen de transglutaminasa madura se amplificaron utilizando pUITG obtenido en el Ejemplo 1(1) por la misma PCR con la combinación de SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 9 o de SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 9.
(SEQ ID NO: 60) 5'-AAT GGC GCG GGG GAA GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC T-3'
(SEQ ID NO: 61) 5'-GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC TAC CGC CTC ACG GCG G-3'
(SEQ ID NO: 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTCC-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEC ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61 : Iniciadores PCR
A continuación, las regiones que comprendían la región aguas arriba 5' que contenía el promotor del gen de PS2 que era la proteína de la superficie celular de C. glutamicum y la región para la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. glutamicum se amplificaron con la combinación de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 62 o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 63, utilizando pPKSPTG1 construido en el Ejemplo 4 (2) como molde.
El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 62 tiene la secuencia deficiente del primer residuo de aminoácido Asp del terminal N, de la pro-parte de la transglutaminasa, el iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 63 tiene la secuencia deficiente en los 6 residuos de aminoácidos Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu del terminal N, y los mismos comprenden adicionalmente la secuencia codificante de los residuos de aminoácidos del terminal C de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes para construir el gen de fusión fusionado con la secuencia señal de la proteína SlpA de la superficie celular de C. ammoniagenes.
(SEQ ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(SEQ ID NO: 62) 5'-GTC TCT TCC CCC GCG CCA TTT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3'
(SEQ ID NO: 63) 5'-TCG GCG TAG GAC TTC GTC TCT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63 : Iniciadores PCR
El fragmento del gen de transglutaminasa maduro, que estaba ligado al tipo de deleción parcial para la parte proestructural de la transglutaminasa, a la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes y también a la región aguas arriba 5' que contiene la región promotora del gen de PS2 que es la proteína de la superficie celular de C. glutamicum, se amplificó respectivamente utilizando PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 utilizando como mo1de 1 I1 de so1ución PCR para la región aguas arriba de 5' que contenía la región promotora del gen de PS2 que es la proteína de la superficie celular de C. glutamicum y la región codificante de la región que comprendía la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. ammoniagenes y 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada codificante de la pro-transglutaminasa en donde el terminal N de la parte pro-estructural se había delecionado parcialmente, respectivamente.
(SEQ ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(SEQ ID NO: 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
Los fragmentos amplificados de aproximadamente 1,8 kb se detectaron por electroforesis en agarosa. Los fragmentos de aproximadamente 800 pb que se generaron por digestión de estos fragmentos con las enzimas de restricción ScaI y Eco065I se recuperaron del gel de agarosa y se reemplazaron por el fragmento escindido de pPKSPTG1 con ScaI y Eco065I, que se construyó en el Ejemplo 4 (2), para construir pPKSPTG1
MD (tipo de de1eción de Asp) y pPKSPTG1MDNGAGE (tipo de de1eción Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu).
(2) Secreción de la transglutaminasa que tiene la forma de deleción parcial de la pro-estructura.
Se transformó C. glutamicum ATCC 13869 con el plásmido construido pPKSPTG1
MAP, pPKSPTG1MFRAP, pPKSPTG1MD o pPKSPTG1MDNGAGE, y se se1eccionaron 1as cepas que crecían en el medio de agar CM2S, arr iba descrito, que comprendía 25 mg/l de kanamicina. El C. glutamicum ATCC 13869 seleccionado que hospedaba pPKSPTG1MAP, pPKSPTG1MFRAP, pPKSPTG1MD o pPKSPTG1MDNGAG E se cu1tivó luego en el medio de cultivo MMPG, arriba descrito, que comprendía 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 48 horas, respectivamente. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10 I1 de1 sobrenadante de1 cu1tivo a SDS -PAGE y se realizó luego un análisis por transferencia Western con anticuerpo anti-transglutaminasa descrito anteriormente de acuerdo con el método convencional. Como resultado, se confirmó la secreción de la transglutaminasa en la cual se había delecionado parcialmente la parte pro-estructura1. E1 transformante que hospedaba pPKSPTG1MAP, pPKSPTG1MFRAP o pPKSPTG1MD exhibía una secreción equivalente a la de la forma existente naturalmente (pPKSPTG1), respectivamente, pero e1 transformante que hospedaba pPKSPTG1MDNGAGE exhibe
ía aproximadamente la mitad de secr ción con relación a la de la forma existente naturalmente (pPKSPTG1).
- (3)
- Escisión de la parte pro-estructural de la pro-transglutaminasa que tenía la forma de deleción parcial de la proestructura por la serina-proteasa producida por secreción a partir de C. glutamicum ATCC 13869
- C.
- glutamicum ATCC 13869 que hospedaba el plásmido de expresión por secreción
MAP,pPKSPTG1 pPKSPTG1MFRAP, pPKSPTG1MD o pPKSPTG1MDNGAGE para 1a pro-transglutaminasa que tenía la forma de deleción parcial de la pro-estructura, que se habían descrito en el Ejemplo 10 (2), se transformó con el plásmido pVSS1 construido en el Ejemplo 8 (1) y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/ml de kanamicina. El C. glutamicum ATCC 13869 seleccionado que hospedaba pVSS1 y pPKSPTG1MAP, pPKSPTG1MFRAP, pPKSPTG1MD o pPKSPTG1MDNGAGE se cultivó luego en el medio de cultivo líquido MMTG, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 70 horas. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10 I1 de1 sobrenadante de1 cultivo a SDS-PAGE y se analizaron luego por transferencia Western con anticuerpo anti-transglutaminasa descrito previamente de acuerdo con el método convencional.
Como resultado, se confirmó que SAMP45 se expresaba y secretaba normalmente, y que la parte pro-estructural de la pro-transglutaminasa secretada análogamente que tenía la forma de deleción parcial de la pro-estructura se escindía, dando como resultado la secreción de una transglutaminasa que tenía el peso molecular similar al de la transglutaminasa madura existente naturalmente.
Se realizó luego una transferencia semiseca sobre membrana PVDF después de SDS-PAGE, de acuerdo con el mismo método que se ha descrito previamente. Después de la transferencia, la membrana PVDF se tiñó con Azul Brillante Coomassie, se destiñó y se secó al aire. Las porciones que contenían la transglutaminasa madura se retiraron y se analizaron respecto a la secuencia de aminoácidos del terminal N utilizando un secuenciador de proteínas. Como resultado, se confirmó que se añadía Phe-Arg al terminal N de la transglutaminasa madura existente naturalmente que se muestra en SEQ ID NO: 5 en el transformante que hospedaba pPKSPTG1MAP, se añadía Ser -Ala-Gly-Pro-Ser al terminal N de la transglutaminasa madura existente naturalmente en el transformante que hospedaba pPKSPTG1MFRAP, y se añadía Phe-Arg-Ala-Pro a la transglutaminasa madura existente naturalmente en el transformante que hospedaba pPKSPTG1MD o pPKSPTG1MDNGAGE.
Ejemplo 11: Generación de las variantes para la parte pro-estructural de transglutaminasa derivada de S. mobaraense IFO13819 y producción por secreción de transglutaminasa
(1) Construcción de los genes de pro-transglutaminasa que tienen las variantes para la parte pro-estructural
Se sintetizaron los iniciadores que se muestran en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 basándose en la secuencia del gen de la transglutaminasa determinado en el Ejemplo 1 (1) y la región del gen de transglutaminasa madura se amplificó a partir de pUITG obtenido en el Ejemplo 1 (1) utilizando el método PCR.
A continuación, la región que comprende la región aguas arriba 5' que contiene el promotor del gen de PS2 que era la proteína de la superficie celular de C. glutamicum, la región del gen de la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpA de C. glutamicum y la parte pro-estructural de transglutaminasa, se amplificó utilizando el método PCR con la combinación de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 64, o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 65, o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 66, o de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 67 utilizando pPKSPTG1 construido en el Ejemplo 4 (2) como molde.
El iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 64 comprende la secuencia génica en la que los residuos de 3 aminoácidos del terminal C de la parte pro-estructural de transglutaminasa, Arg-Ala-Pro se convirtieron en Gly-Pro-Lys, el iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 65 comprende la secuencia génica en la cual los residuos de 3 aminoácidos del terminal C de la parte pro-estructural de transglutaminasa, Arg-Ala-Pro, se convirtieron en Gly-Pro-Arg, el iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 66 comprende la secuencia génica en la cual los residuos de 5 aminoácidos del terminal C de la parte pro-estructural de transglutaminasa, Ser-Phe-Arg-Ala-Pro se convirtieron en sólo Lys, y el iniciador que se muestra en SEQ ID NO: 67 comprende la secuencia génica en la cual Ser-Phe-Arg-Ala-Pro se convirtieron solamente en Arg.
Adicionalmente, los mismos comprenden la secuencia codificante de los residuos de aminoácidos del terminal N de transglutaminasa madura a fin de construir el gen de fusión fusionado con transglutaminasa madura
(SEQ ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(SEQ ID NO: 64) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TGG CCG AAC GAC GGG C-3'
(SEQ ID NO: 65) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGG GGG CCG AAC GAC GGG C G-3'
(SEQ ID NO: 66) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TCC GGG CCG GCG CTC GAA G-3' (SEQ ID NO: 67) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGC GGG CGG GCG CTC GAA G-3'
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 67 : Iniciadores PCR
Los fragmentos del gen de transglutaminasa, que se ligaron a la parte pro-estructural modificada de la transglutaminasa que tenía la pro-estructura modificada, la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpASlpA de C. ammoniagenes y la región aguas arriba 5' que contenía la región promotora del gen de PS2 que es la proteína de la superficie celular de C. glutamicum, se amplificó por PCR de entrecruzamiento con SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 9 uti1izando 1 I1 de so1ución PCR de la región respectivamente amplif icada que comprendía los genes codificantes de la región aguas arriba 5' que comprende la región promotora del gen de PS2 que es la proteína de la superficie celular de C. glutamicum, la secuencia señal de la proteína de la superficie celular SlpASlpA de C. ammoniagenes, y la región codificante de la región que contiene la parte pro-estructura1 modificada, y 1 I1 de so1ución PCR de la región amplificada codificante de la transglutaminasa madura.
(SEG ID NO: 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(SEQ ID NO: 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
Los fragmentos amplificados de aproximadamente 1,8 kb se detectaron por electroforesis en agarosa. Los fragmentos de aproximadamente 800 pb, que se generaron por digestión de estos fragmentos con las enzimas de restricción ScaI y Eco065I, se recuperaron del gel de agarosa y se reemplazaron por el fragmento escindido de pPKSPTG1 construido en el Ejemplo 4(2) con SacI y Eco065I para construir pPKSPTG11 (variante modificada de tipo Gly-Pro-Lys) y pPKSPTG12 (variante modificada de tipo Gly-Pro-Arg), pPKSPTG13 (variante de tipo MPhe-Arg-Ala-Pro y de inserción Lys) y pPKSPTG14 (variante de tipo MPhe-Arg-Ala-Pro Y DE inserción Arg).
- (2)
- Secreción de la transglutaminasa en la forma de la parte pro-estructural modificada
Se transformó C. glutamicum ATCC 13869 con los plásmidos construidos pPKSPTG11, pPKSPTG12, pPKSPTG13
- o pPKSPTG14 y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S, arriba descritas, que comprendía 25 mg/l de kanamicina. A continuación, el C. glutamicum ATCC 13869 seleccionado que hospedaba pPKSPTG11, pPKSPTG12, pPKSPTG13 o pPKSPTG14 se cultivó en medio de cultivo MMTG, arriba descrito, que comprendía 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 48 horas, respectivamente. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10 I1 de1 sobrenadante de1 cu1tivo a SDS-PAGE y luego se realizó un análisis por transferencia Western con el anticuerpo anti-transglutaminasa descrito previamente de acuerdo con el método convencional. Como resultado, se confirmó la secreción de la transglutaminasa que tenía la parte pro-estructural.
- (3)
- Escisión de la parte pro-estructural de la transglutaminasa que tiene la variante de la parte pro-estructural con serina-proteasa producida mediante producción por secreción por secreción a partir de C. glutamicum ATCC 13869
- C.
- glutamicum ATCC 13869 que hospedaba el plásmido de expresión secretor pPKSPTG11, pPKSPTG12, pPKSPTG13 o pPKSPTG14 para la transglutaminasa que tenía la variante de la parte pro-estructural, que se describió en el Ejemplo 11 (2), se transformó con el plásmido pVSS1 construido en el Ejemplo 8 (1) y se seleccionaron las cepas que crecían en el medio de agar CM2S, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/l de kanamicina. El C. glutamicum ATCC 13869 seleccionado que hospedaba pVSS1 y pPKSPTG11, pVSS1 y pPKSPTG12, pVSS1 y pPKSPTG13 o pVSS1 y pPKSPTG14 se cultivó luego en el medio de cultivo líquido MMTG, arriba descrito, que comprendía 5 mg/l de cloranfenicol y 25 mg/l de kanamicina a 30ºC durante 70 horas. Una vez terminada la incubación, se sometieron 10I1 de1 sobrenadante de1 cu1tivo a SDS -PAGE y se realizó a continuación un análisis por transferencia Western con anticuerpo anti-transglutaminasa descrito previamente de acuerdo con el método convencional. Como resultado, se confirmó que SAMP45 se expresaba y secretaba normalmente, se confirmó que la variante pro-estructural de la transglutaminasa que tenía la variante pro-estructural, que se había secretado también, se escindía, y se confirmó por consiguiente la secreción de transglutaminasa que tenía un peso molecular similar al de la transglutaminasa madura existente naturalmente.
Se realizó luego una transferencia semiseca sobre membrana de PVDF de acuerdo con el mismo método que se ha descrito previamente después de la SDS-PAGE. Después de la transferencia, la membrana PVDF se tiñó con Azul Brillante Coomassie, se destiñó y se secó al aire. Las porciones que contenían transglutaminasa madura se escindieron y se analizaron respecto a la secuencia de aminoácidos del terminal N utilizando un secuenciador de proteínas. Como resultado, se confirmó una secuencia idéntica a la de la transglutaminasa madura existente naturalmente para C. glutamicum ATCC 13869 que hospedaba pVSS1 y pPKSPTG11, o pVSS1 y pPKSPTG12, que tenían Asp en el residuo de aminoácido del terminal N. En contraste, se encontró que se había añadido la secuencia en la que Ser-Ala-Gly-Pro-Lys (SEQ ID NO: 69) o Ser-Ala-Gly-Pro-Arg (SEQ ID NO: 70) a la secuencia de la transglutaminasa madura existente naturalmente para C. glutamicum ATCC 13869 que hospedaba pVSS1 y pPKSPTG13, o pVSS1 y pPKSPTG14.
Se determinó la actividad de transglutaminasa para el sobrenadante del medio de cultivo del primero, que exhibía la misma secuencia de aminoácidos que la de la transglutaminasa madura existente naturalmente, lo que confirmó que ambos tenían prácticamente la misma actividad específica (aproximadamente 20 U/mg) que la de la transglutaminasa existente naturalmente, como se determinó por el método del hidroxamato descrito anteriormente.
<Texto libre del listado de secuencias>
SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70: secuencia añadida a la secuencia de la transglutaminasa existente naturalmente
De acuerdo con la presente invención, es posible hacer que una bacteria corineforme produzca y secrete extracelularmente una gran cantidad de una proteína transglutaminasa útil. Dado que la proteína producida de acuerdo con la presente invención se libera al medio de cultivo, la proteína puede recuperarse directamente del medio de cultivo de modo más simple y en mayor escala por métodos conocidos apropiados.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Un método para producir transglutaminasa
<130> Y1H0862
<140>
<141>
<150> JP 11-280098
<151> 30-09-1999
<150> JP 2000-194043
<151> 28-06-2000
<160> 70
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Corynebacterium ammoniagenes
<400> 2
10 <210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
15 <400> 3 <210> 4
<211> 54
<212> PRT
<213> Streptoverticillium cinnamoneum
<400> 4
<210> 5 10 <211> 331
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 5
<210> 6
<211> 782
5 <212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS 10 <222> (579)..(782)
<400> 6
<210> 7
<211> 68
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
<210> 8
<211> 30
5 <212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR 10
<400> 8 gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc 30
<210> 9 15 <211> 30
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220> 20 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 9 cgctcacatc acggccagcc ctgctttacc 30
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 10 gtgaccctgt cgtcggagtc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 11 ggcatcctgt cgagcggctc 20
<210>12
<211> 1809
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<220>
<221> CDS
<222> (578)..(1798)
<400> 12
<210> 13
<211> 407
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 13
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 14 aaattcctgt gaattagctg atttag 26
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 15 gagctctccg gcgtatgcgc atagaggcga aggctccttg aata
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 16 atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc
- <210> 17 <211> 47 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 17 ggggtgaccc tgtcgtcgga gtcgttgaag ccgttgttga tgttgaa
- 47
- <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 18 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcagc gaatgctggg atagcaacgc c
- 51
- <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 19 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcctg agcgaatgct gggatagcta c 51
- <210> 20 <211> 51
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 20 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcgtt gaagccgttg ttgatgttga a 51
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 21 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcagt caggtcgcgg agggtttcct c 51
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial :PCR primer
<400> 22 gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc 30
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220> <400> 26
- <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 23 gcccagaagc ccaaaattga gattt
- 25
- <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 24 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtctgc cgttgccaca ggtgcggcca gc
- 52
- <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 25 cgcagccagc gatttcatgc gtttcataga ggcgaaggct ccttgaatag gt
- 52
- <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg 30
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 27 ggatccggag cttatcgact gcacg 25
<210> 28
<211> 52
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 28 cgcagccagc gatttcatgc gtttcataat tctgtttcct gtgtgaaatt gt 52
<210> 29
<211> 43
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 29
<210> 30
<211> 43
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 30
- 10
- <210> 31
- <211> 41
- <212> PRT
- <213> Streptoverticillium mobaraense
- 15
- <400> 31
<210> 32
<211> 44
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 32
- 10
- <210> 33
- <211> 39
- <212> PRT
- <213> Streptoverticillium mobaraense
- 15
- <400> 33
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: pro-región modificada de transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense
<400> 34
<210> 35
<211> 45
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: pro-región modificada de transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense
<400> 35
10 <210> 36
<211> 41
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
15 <220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: pro-región modificada de transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense
<400> 36
<210> 37
<211> 41
5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: pro-región modificada de transglutaminasa de Streptoverticillium mobara10 ense
<400> 37
<211> 56
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial:pro-región quimera de transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraence y Streotpverticillium cinnamoneum
<400> 38
<210> 39 10 <211> 1079
<212> PRT
<213> Streptomyces albogriseolus
<400> 39
<210> 40
<211> 444
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 40
<210> 41
<211> 1751
5 <212> DNA
<213> Streptoverticillium mobaraense
<220>
<221> CDS 10 <222> (229)..(1659)
<400> 41
<210> 42
<211> 477
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 42
<210> 43
<211> 330
<212> PRAT
<213> Streptoverticillium cinnamoneum
<400> 43
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 44 ggcgatgggg aagagaaggg g 21
<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 45 ggcggatcct cgcgtcgaga ggcgtggact ga 32
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 46 tacgaattcg agctcggtac c 21
<210> 47
<211> 43
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 47 ccccttctct tccccatcgc ctgccgttgc cacaggtgcg gcc 43
<210> 48
<211> 46
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 48 ggggtgaccc tgtcgtcgga gtcgggggcc cgggagggcg cgctgg 46
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 49 aacggggaga acagcacggc cgccgg 26
<210> 50
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 50 ggcgaattct ccggcgggcc gtcaccggt 29
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 51 ggcaagctta aattcctgtg aattagctga 30
<210> 52
<211> 44
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 52 cggccgtgct gttctccccg tttgccgttg ccacaggtgc ggcc 44
<210> 53
<211> 20
<212> PRT
<213> Streptoverticillium mobaraense
<400> 53
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador para syPEP
<400> 54 aagatccccg ggatgaagtt cgtcgaggag aag 33
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 55 gaggcggcgt cgatcaccgc ccc 23
<210> 56
<211> 32
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 56 <210> 60 <213> Secuencia Artificial
- gccaagcttg aagcaccggc ggcggcaccc gg
- 32
- <210> 57 <211> 46 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 57 ggggcggtga tcgacgccgc ctctgccgtt gccacaggtg cggcca
- 46
- <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 58 gtgaccctgt cgtcggagtc ccggaacgac gggccggcgc
- 40
- <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 59 gtgaccctgt cgtcggagtc cgacgggccg gcgctcgaag
- 40
- <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 60 aatggcgcgg gggaagagac gaagtcctac gccgaaacct
- 40
- <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 61 gagacgaagt cctacgccga aacctaccgc ctcacggcgg
- 40
- <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 62 gtctcttccc ccgcgccatt tgccgttgcc acaggtgcgg
- 40
- <210> 63 <211> 40 <212> DNA
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 63 tcggcgtagg acttcgtctc tgccgttgcc acaggtgcgg
- 40
- <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 64 gtgaccctgt cgtcggagtc cttggggccg aacgacgggc
- 40
- <210> 65 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
- <400> 65 gtgaccctgt cgtcggagtc gcgggggccg aacgacgggc
- 40
- <210> 66 <211> 40 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 66 gtgaccctgt cgtcggagtc cttcgggccg gcgctcgaag 40
<210> 67
<211> 40
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR
<400> 67 gtgaccctgt cgtcggagtc gcgcgggccg gcgctcgaag 40
<210> 68
<211> 4
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)
<223> Xaa es Pro-pNA, e p-nitroanilida
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sustrato para syPEP
<400> 68
<210> 69
<211> 5
<212> PRT <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial:secuencia adicional a transglutaminasa nativa
<400> 69
<210> 70 10 <211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial:secuencia adicional a transglutaminasa nativa
<400> 70
Claims (22)
- REIVINDICACIONES1.- Un método para producir transglutaminasa que comprende cultivar una bacteria corineforme que tiene un constructo de expresión genético en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de un dominio de péptido señal derivado de una bacteria corineforme se conecta al lado de aguas abajo de una secuencia promotora que funciona en una bacteria corineforme y en el cual una secuencia de ácido nucleico codificante de transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural se conecta al lado de aguas abajo de dicha secuencia de ácido nucleico codificante de dicho dominio de péptido señal, permitiendo que dicha bacteria corineforme produzca y secrete dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural, y realizar luego la escisión y eliminación de la parte proestructural de dicha transglutaminasa que contiene una parte pro-estructural.
- 2.- El método según la reivindicación 1, en el cual el péptido señal es un péptido señal de una proteína de la superficie derivada de una bacteria corineforme.
- 3.- El método según la reivindicación 1, en el cual el péptido señal es un péptido señal de una proteína de la superficie derivada de Corynebacterium glutamicum.
- 4.- El método según la reivindicación 3, en el cual el péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 29.
- 5.- El método según la reivindicación 1, en el cual el péptido señal es un péptido señal de una proteína de la superficie derivada de Corynebacterium ammoniagenes.
- 6.- El método según la reivindicación 5, en el cual el péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2.
- 7.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual la parte pro-estructural corresponde a una parte pro-estructural de una transglutaminasa derivada de un actinomiceto.
- 8.- El método según la reivindicación 7, en el cual la parte pro-estructural tiene la secuencia según SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
- 9.- El método según la reivindicación 7, en el cual una secuencia de aminoácidos de la parte pro-estructural, es cualquiera de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 38.
- 10.- El método según la reivindicación 1, en el cual la escisión y eliminación de la parte pro-estructural se efectúa con una proteasa.
- 11.- El método según la reivindicación 10, en el cual la bacteria corineforme que produce y secreta la transglutaminasa produce también la proteasa.
- 12.- El método según la reivindicación 11, en el cual la escisión y eliminación de la parte pro-estructural se realiza con la proteasa y una peptidasa.
- 13.- El método según la reivindicación 12, en el cual la bacteria corineforme que produce y secreta la transglutaminasa produce adicionalmente la proteasa y la peptidasa.
- 14.- El método según la reivindicación 10 ó 12, en el cual la proteasa se deriva de un actinomiceto.
- 15.- El método según la reivindicación 10 ó 12, en el cual la proteasa se deriva de Streptomyces albogriseolus.
- 16.- El método según la reivindicación 12, en el cual la peptidasa se deriva de un actinomiceto.
- 17.- El método según la reivindicación 12, en el cual la peptidasa se deriva de Streptomyces mobaraense.
- 18.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual la transglutaminasa es una transglutaminasa derivada de un actinomiceto.
- 19.- El método según la reivindicación 18, en el cual la transglutaminasa es la transglutaminasa derivada de Streptoverticillium mobaraense.
- 20.- El método según la reivindicación 19, en el cual la transglutaminasa tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 5.
- 21.- El método según la reivindicación 18, en el cual la transglutaminasa es una transglutaminasa derivada de Streptoverticillium cinnamoneum.
- 22.- El método según la reivindicación 21, en el cual la transglutaminasa tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 43.
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