ES2374152T3 - Inhibición de la formación de biopelículas. - Google Patents

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Abstract

Método de reducción o inhibición de biopelículas que comprende modular la expresión del gen cysD, el gen cysI, el gen cysJ, el gen cysK o el gen ybiK en una bacteria Gram-negativa capaz de formar biopelículas.

Description

Inhibición de la formación de biopelículas
5 La invención se refiere a procedimientos para reducir o inhibir la formación de biopelículas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las biopelículas bacterianas existen en entornos naturales, médicos, y de ingeniería. La biopelícula puede ofrecer
10 una ventaja selectiva a un microorganismo para asegurar su supervivencia, o le permita existir una cierta cantidad de tiempo en estado latente hasta que se producen condiciones adecuadas de crecimiento. Esta ventaja selectiva podría plantear serias amenazas para la salud humana. Por ejemplo, las biopelículas están implicadas en el 65% de las infecciones bacterianas humanas. Las biopelículas también están implicadas en prostatitis, infecciones del tracto biliar, infecciones del tracto urinario, cistitis, pielonefritis, infecciones pulmonares, infecciones de los senos,
15 infecciones del oído, acné y heridas crónicas.
Las biopelículas contribuyen a una variedad de condiciones médicas. Cada año en los Estados Unidos solamente, más de 7 millones de pacientes reciben implantes de dispositivos médicos, incluyendo catéteres venosos centrales, tubos endotraqueales, válvulas cardíacas mecánicas, marcapasos y prótesis articulares. Aproximadamente la mitad 20 de estos pacientes desarrollan infecciones nosocomiales, y aproximadamente 80.000 muertes anuales se atribuyen a las infecciones nosocomiales. Las biopelículas proporcionan una matriz estructural que facilita la adhesión de las bacterias a las superficies inertes de los implantes de dispositivos médicos y catéteres venosos. Estudios microscópicos confirman que los catéteres venosos centrales están recubiertos por bacterias. Estudios microscópicos confirman que los catéteres venosos centrales están cubiertos por bacterias incrustadas en
25 biopelículas. Desafortunadamente, más de 1 millón de pacientes desarrollan infecciones del tracto urinario por estos catéteres.
Las biopelículas constituyen una barrera protectora para las bacterias, permitiendo así que la bacteria resista tratamientos antibióticos. Los desarrolladores de los antibióticos deben afrontar el reto continuo de la resistencia a
30 los antibióticos. La resistencia a los antibióticos dificulta significativamente el tratamiento de la condición médica. Por ejemplo, la resistencia microbiana a minociclina y rifampicina, que son ampliamente utilizados para tratar infecciones, está emergiendo. Un estudio de 1998 de una unidad de cuidados intensivos reveló que 6 de cada 7 enterococos resistentes a vancomicina fueron resistentes a la rifampicina.
35 La inhibición de las biopelículas ofrece numerosas ventajas. Las bacterias no tienen ninguna resistencia conocida a los inhibidores de biopelículas.
Los inhibidores de biopelículas pueden actuar específicamente sobre los mecanismos biológicos que protegen las bacterias de los antibióticos y del sistema inmunológico de un huésped. En un estudio de catéteres urinarios, la
40 rifampicina fue capaz de eliminar Staphylococcus aureus planctónicos o suspendidos resistentes a la meticilina, pero fue incapaz de erradicar las bacterias en un biopelícula. El tratamiento actual de las infecciones, por ejemplo infecciones nosocomiales, a menudo requiere una administración secuencial o simultánea de una combinación de productos, tal como amoxicilina/clavulanato y quinupristina/dalfopristina. Una inhibición directa de los mecanismos bacterianos utilizada para formar biopelículas puede ayudar a reducir las infecciones del torrente sanguíneo (BSI).
45 Además, una inhibición directa de los mecanismos bacterianos usados para formar biopelículas retrasa la aparición de resistencia microbiana a los antibióticos y, posiblemente, reduce la aparición de bacterias multirresistentes. Otra aproximación para reducir o inhibir la formación de biopelículas es aplicar presión evolutiva a los mecanismos de crecimiento bacteriano. En consecuencia, una amplia investigación está dedicada a elucidar los genes, y
50 especialmente los más críticos, que intervienen en la formación de la biopelícula de control.
En consecuencia, por las razones expuestas anteriormente y otras, sigue habiendo una necesidad de un medio de control de la biopelícula y su formación.
55 DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
La presente invención (reivindicación 1) proporciona un método para reducir o inhibir una biopelícula que comprende modular la expresión del gen cysD, el gen cysl, el gen cysJ, el gen cysK o el gen ybiK en una bacteria Gramnegativa capaz de formar biopelículas.
60 Además, la presente invención (reivindicación 3) proporciona un método para modular la expresión de un gen cysD, un gen cysl, un gen cysJ, un gen cysK o un gen ybiK en una bacteria Gram-negativa capaz de formar biopelículas, que comprende poner en contacto dicha bacteria con una composición que comprende un compuesto seleccionado entre ácido ursólico o ácido asiático, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, un hidrato de
5 dicho compuesto, un solvato de dicho compuesto, un N-óxido de dicho compuesto, o una combinación de los mismos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
10 La figura 1 muestra la inhibición de la formación de biopelículas en E. coli K12, P. aeruginosa PAO1, y V. harveyi BB120 con ácido ursólico.
La figura 2 muestra la inhibición de biopelícula de interfaz aire-líquido con ácido ursólico.
15 La Figura 3 muestra una comparación de la inhibición de la formación de biopelículas mediante E. coli de tipo salvaje y E. coli mutante (mutación cys B) con ácido ursólico.
Las figuras 4-8 muestran análogos de ácido ursólico y ácido asiático.
20 La Figura 9 muestra las estructuras químicas del ácido ursólico y del ácido asiático.
Definiciones:
"Portador aceptable" se refiere a un portador que es compatible con los otros ingredientes de la formulación y no es 25 perjudicial para su receptor.
"Reducción o inhibición", en referencia a una biopelícula se refiere a la prevención de la formación o el crecimiento de la biopelícula, la reducción en el índice de formación o crecimiento de la biopelícula, la inhibición parcial o completa de la formación o crecimiento de la biopelícula.
30 "Modula" o "modulación" se refiere a la regulación hacia arriba o la regulación hacia abajo de la replicación de un gen o expresión.
Descripción:
35 La formación de biopelículas implica vías biológicas conservadas entre diferentes especies de bacterias. Por ejemplo, diferentes especies de bacterias comparten un regulador global común en la formación y el mantenimiento de las biopelículas. Jackson et. al. mostraron que la represión del catabolismo inducido por la glucosa causó una reducción del 30% al 95% en las biopelículas entre E. coli, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, y Salmonella
40 enterica. (Jackson, et al. J. Bacteriol. 2002, 184, 3406-3410). Una señal autoinductora bacteriana, AI-2, ha demostrado estar implicada en la formación de biopelículas. AI-2 y los genes de respuesta a esta señal se han identificado en una variedad de bacterias. La biopelícula se reduce o inhibe mediante modulación de la expresión de cysB en Escherichia coli, Proteus mirabilis, Francisella tularensis, Vibrio sp., Pseudomonas aeruginosa, V. harveyi, Pseudomonas sp., Salmonella sp., Haemophilus influenzae, Borrelia sp., Neisseria sp., Bacillus sp., Burkholderia sp.,
45 Klebsiella sp. , o Yersinia pestis. En particular, la biopelícula se reduce o inhibe por modulación de la expresión de cysB en bacterias Gram-negativas.
CysB se puede modular en una serie de maneras. Por ejemplo, la limitación de N-acetil-serina y azufre de regulación superior cysB. Lochowska, A. et al., Functional Dissection of the LysR-type CysB Transcriptional Regulator. J. Biol.
50 Chem. 2001, 276, 2098-2107. Además, al igual que otros reguladores tipo LysR, cysB se puede reprimir a sí mismo. Lilic, M. et al., Identification of the CysB-regulated gene, hslJ, related to the Escherichia coli novobiocin resistance phenotype. FEMS Micro. Letters. 2003, 224, 239-246.
La descripción aquí describe el descubrimiento de que el gen cysB, un regulador transcripcional de la biosíntesis de
55 cisteína, está implicado en la formación de la biopelícula. (Verschueren, K.H.G., Crystallization of full-length CysB of Klebsiella aerogenes, a LysR-type transcriptional regulator, BIOLOGICAL CRYSTALLOGRAPHY D57:260-262, 2001). Como se demuestra en los ejemplos aquí, la eliminación de cysB de E. coli resulta en una reducción significativa de la formación de biopelículas E. coli en comparación con E. coli de tipo salvaje. La proteína cysB es un regulador transcripcional de la familia LysR de genes. Los reguladores transcripcionales de esta familia tienen
60 motivos de unión al ADN de hélice-vuelta-hélice en su terminal amino. La proteína cysB se requiere para la
expresión completa de los genes cys, que participan en la biosíntesis de cisteína.
El gen cysB está genéticamente conservados entre especies diferentes de bacterias, y más específicamente bacterias Gram-negativas. Verschueren, et al., Acta Cryst. (2001) D57, 260-262; Byme et al., J. Bacteriol. 1988 170 (7), p. 3150-3157. De hecho, cysB se conserva entre Pseudomonas sp. incluyendo, pero no limitado a, P. aeruginosa, P. putida, y P. syringae. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi. Búsqueda blast del gen cysB en la base de datos de Genómica Microbiana del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)). El gen cysB también está genéticamente conservado entre las siguientes especies de bacterias: Vibrio sp. (por ejemplo V. harveyi y V. cholera), Proteus mirablis, Burkholderia sp. (por ejemplo fongorum B., B. mallei, y B. cepacia), Klebsiella sp., Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis, Yersinia pestis, Salmonella typhimurium, y Acinetobacter sp. (Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi. Búsqueda blast del gen cysB en la base de datos genómica microbiana en NCBI del NIH). El gen cysB también está genéticamente conservados entre las bacterias Grampositivas de Bacilo sp. incluyendo, pero no limitado a, B. subtilis, B. cereus, y B. anthracis. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi. Búsqueda blast del gen cysB en la base de datos genómica microbiana en NCBI de los NIH; Van der Ploeg, J.R.; FEMS Microbiol. Lett. 2001, 201, p. 29-35).
La célula se selecciona de un grupo que consiste en bacterias Gram-negativas. En realizaciones, la célula se selecciona de un grupo que consiste en Escherichia coli, Proteus mirabilis, Francisella tularensis, Vibrio sp. Pseudomonas aeruginosa, V. harveyi, Pseudomonas sp. Salmonela sp. Haemophilus influenzae, Borrelia sp. Neisseria sp. Bacilo sp. Burkholderia sp., Klebsiella sp. y Yersinia pestis. Preferiblemente, la célula es E. coli, Pseudomonas aeruginosa o V. harveyi. Como se demuestra en el ejemplo 2, el ácido ursólico reduce o inhibe la formación de biopelículas en E. coli, P. aeruginosa, y V. harveyi. Utilizando un procedimiento similar descrito en el ejemplo 2, el ácido asiático se demostró en el ejemplo 6 que reduce o inhibe la formación de biopelículas en E. coli.
La presente invención proporciona un método para modular la expresión de cysD, cysi, cysJ y/o cysK. Cys B controla la familia cysDIJK de genes a nivel transcripcional. Leyh, T., et al. J. Biol. Chem. 1992, 267 (15), p. 1040510410. La administración de ácido ursólico regula hacia abajo la expresión de cysB y ciertos genes bajo su control transcripcional, tal como cysDIJK, mientras que la administración de ácido asiático regula hacia arriba la expresión de cysB y ciertos genes bajo su control transcripcional. Al modular la expresión de cysB, el ácido ursólico y el ácido asiático reducen o inhiben la formación de biopelículas.
Los miembros de la familia de los reguladores transcripcionales LysR se ha demostrado que regulan diversos procesos metabólicos. cysB presenta un control directo de la biosíntesis de cisteína. Verschueren et al., página 260. El gen cysB está implicado, directa o indirectamente, en el transporte intracelular de la glutationa, la utilización de fuente de carbono, deshidrogenasas alanina, y el sistema dependiente de la arginina. YbiK está bajo el control directo de cysB y participa en el transporte intracelular de la glutationa. Los datos en el ejemplo 1 demuestran la regulación a la baja de ybiK contactando una célula bacteriana con ácido ursólico. La regulación hacia abajo de ybiK en el ejemplo 1 de la memoria también apoya que el ácido ursólico regula hacia abajo cysB. En una realización de la invención, el ácido ursólico o el ácido asiático modula la expresión de ybiK.
La Figura 9 muestra la estructura química del ácido ursólico (C110) y el ácido asiático (C255). El ácido ursólico (UA) es un compuesto aislado de triterpeno pentacíclico de muchos tipos de plantas medicinales y está presente en la dieta humana. Se ha informado que tiene una amplia gama de beneficios farmacológicos, incluyendo terapias contra el cáncer y contra el envejecimiento. Véase por ejemplo, Hsu et al., Life Sci. 75 (19): 2303-2316, 24 de septiembre de 2004 y Both et al., Arch Dermatol. Res. 293 (11): 569-575, enero de 2002. El ácido ursólico también ha sido identificado como un antagonista del factor de crecimiento transformante (TGF�1). Murakami et al., FEBS Lett. 566 (1-3): 55-59, 21 de mayo de 2004. Sin embargo, antes de la descripción aquí, ni ácido ursólico ni ácido asiático ha sido informado de que modulen la expresión del gen cysB. Tampoco se ha informado que el ácido ursólico ni el ácido asiático reduzcan o inhiban las formaciones de biopelículas. Análogos del ácido ursólico (C110) y del ácido asiático (C 255) se espera que también modulen la expresión del gen cysB. Las figuras 4-8 muestran ejemplos de los análogos del ácido ursólico y del ácido asiático.
Otros medios para controlar la formación de la biopelícula es comprender los factores genéticos subyacentes implicados. Como resultado, una compleja red de genes regula la formación y el mantenimiento de las biopelículas mediante bacterias. Por ejemplo, Sauer et al. han demostrado que aproximadamente 525 proteínas están reguladas diferencialmente en las distintas etapas de desarrollo de las mismas en Pseudomonas aeruginosa. Sauer et al., J. Bacteriol. Noviembre de 2004, 186 (21): 7312-26. Stanley et al. han demostrado que aproximadamente 519 proteínas están reguladas diferencialmente en las primeras 24 horas de formación de la biopelícula en Bacillus subtilis. Stanley, N.R. et al. J. Bacteriol. 2003, 185, 1951-1957. Aunque numerosos genes pueden estar implicados
en una variedad de vías biológicas, sólo unos pocos genes juegan un papel crítico. Los investigadores gastan una cantidad considerable de esfuerzo para determinar qué gen(es) es(son) fundamental(es) o esencial(es) en las vías biológicas que participan en las diversas etapas de la formación de la biopelícula y el mantenimiento. La descripción aquí describe el descubrimiento de los genes implicados en la formación de biopelículas, tal como gen(es) cysB, cysD, cysI, cysJ, cysK, y ybiK y los compuestos que modulan estos genes y reducen o inhiben la formación de la biopelícula.
Las biopelículas pueden adherirse a superficies, tales como tubos y filtros. Las biopelículas peligrosas son problemáticas en los entornos industriales, debido a que ensucian y corroen sistemas tales como intercambiadores de calor, oleoductos y sistemas de agua. Elvers et al., Biofilms and Biofouling 2ª ed., Vol. 1, Academic Press, San Diego, CA. Se pueden emplear inhibidores de biopelículas para evitar que los microorganismos se adhieran a las superficies que pueden ser porosas, blandas, duras, semiblandas, semiduras, regeneradoras, o no regeneradoras. Estas superficies incluyen, pero no están limitadas a, poliuretano, metal, aleación, o superficies poliméricas en productos sanitarios, esmalte de dientes y membranas celulares de animales, preferentemente mamíferos, más preferentemente, seres humanos. Las superficies pueden estar recubiertas o impregnadas con inhibidores de biopelícula antes de su uso. Por otra parte, las superficies pueden tratarse con inhibidores de biopelícula para controlar, reducir o erradicar los microorganismos adheridos a estas superficies.
Las descripciones aquí no están pensadas para limitar el alcance de la presente invención, sino sólo para demostrar la utilidad de gran alcance de la invención para los expertos en la materia.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Inhibición de la formación de biopelículas mediante E. coli K12 [R1drd19], P. aeruginosa Pao1, y V. harveyi BB120 mediante la adición de 10 µg/ml de ácido ursólico. Para E. coli K12 [R1drd19], los datos se recogieron 16 horas después de la adición de ácido ursólico a una biopelícula de 24 horas en medio LB, para P. aeruginosa PAO1, los datos fueron recogidos 18 horas después de la adición de ácido ursólico con la inoculación en medio LB más citrato de sodio al 1%, y para V. harveyi BB 120, los datos se recogieron 18 horas después de la adición de ácido ursólico con la inoculación en medio M9. Todas las lecturas de la masa de biopelículas en OD540 se normalizaron basadas en la lectura de tipo salvaje sin ácido ursólico que se normaliza a 1. Se muestra una desviación estándar. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Ejemplo 2
El Ejemplo 1 se repitió, excepto que se añadió ácido ursólico con la inoculación en E. coli JM109 crecido en glucosa LB al 0,2%. El ácido ursólico inhibió la biopelícula de interfaz aire-líquido. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Ejemplo 3
Para identificar los genes controlados mediante ácido ursólico, se cultivó E. coli K12 en medio LB durante la noche, diluido 1:100 en agua dulce LB suplementada con 0, 10, ó 30 µg/ml de ácido ursólico. La misma cantidad de etanol se suplementó para eliminar los efectos del solvente. El cultivo se realizó en una SD600 de 0,9. Las células se centrifugaron en una microcentrífuga durante 15 segundos a 20.000 x g en mini tubos de batido de cuentas (Biospec, Bartlesville, Oklahoma), que se enfriaron a -80°C antes del muestreo. Los gránulos de células fueron congeladas inmediatamente en un baño de hielo seco-etanol y se almacenaron a -80°C hasta el aislamient o del ARN.
Para lisar las células, 1,0 mL tampón RLT (Qiagen, Inc., Valencia, CA) y 0,2 mL 0,1 mm de cuentas de zirconia/sílice (Biospec) se añadieron a los tubos de batido de cuentas congelados que contienen los gránulos de la célula. Los tubos se cerraron herméticamente y se batieron durante 30 segundos a la máxima velocidad en una mini batidora de cuentas (cat. no. 3110BX, Biospec). El ARN total se aisló siguiendo el protocolo del equipo RNeasy Mini (Qiagen), incluyendo una digestión DNasa en columna con DNasa I RNasa (Qiagen). OD260 se utilizó para cuantificar el rendimiento de ARN. OD260/OD280 y 23S/16S ARNr fueron medidos usando un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, California) para comprobar la pureza y la integridad del ARN (RNeasy manual Mini, Qiagen).
Las micromatrices de ADN de E. coli fueron preparados tal como se describió anteriormente por parte de Wei, Y. et al. (Journal of Bacteriology, 2001, 183 (2), p. 545-556). Cada sonda genética fue sintetizada mediante PCR y tiene el
tamaño del marco de lectura totalmente abierta (200-2000 nt). Los productos de PCR de doble cadena se desnaturalizaron en dimetilsulfóxido 50% y luego se colocaron sobre portaobjetos de aminosilano (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA) como sondas para hibridar con las muestras de ADNc derivado de ARNm. Se ha mostrado que cada matriz puede detectar 4228 de los 4290 ORFs E. coli. Cada gen tiene dos puntos por lámina.
Brevemente, el ARN total de las muestras de E. coli K12 cultivadas con y sin ácido ursólico se convirtieron primero en ADNc etiquetado. A continuación, las muestras de ADNc (6 mg de cada una) se marcaron cada una con los tintes Cy3 y Cy5 para eliminar artefactos relacionados con diferentes eficiencias de etiquetado; así, todos los experimentos necesitaron al menos dos portaobjetos. La muestra marcada Cy3 sin ácido ursólico y la muestra marcada con Cy5 de ácido ursólico (con 10 ó 30 µg/ml de ácido ursólico) se hibridaron en el primer portaobjetos. De manera similar, la muestra marcada Cy5 sin ácido ursólico y la muestra marcada con Cy3 de ácido ursólico se hibridaron en el segundo portaobjetos. Como que cada gen tiene dos puntos en un portaobjetos, las dos hibridaciones generaron ocho puntos de datos para cada gen (cuatro puntos para la muestra sin ácido ursólico y cuatro puntos para la muestra de ácido ursólico). Los experimentos de micromatrices con intercambio de tintes se repitieron para las dos concentraciones de ácido ursólico.
Las muestras de ADNc de E. coli DH5a tratado con FCM o 0,5 x LB (6 µg de cada una) se marcaron cada una con tintes Cy3 y Cy5 para eliminar artefactos relacionados con diferentes eficiencias de marcado; así, cada experimento requirió por lo menos dos portaobjetos. La muestra FCM marcada con Cy3 y muestra 0,5 x LB marcada con Cy5 se hibridaron en el primer portaobjetos. De manera similar, la muestra FCM marcada con Cy5 y la muestra 0,5 x LB marcada con Cy3 se hibridaron en el segundo portaobjetos. Como cada gen tiene dos puntos en un portaobjetos, las dos hibridaciones generaron ocho puntos de datos para cada gen (cuatro puntos para la muestra FCM y cuatro puntos para la muestra de 0,5 x LB). Las micromatrices de ADN para E. coli DH5a tratados con ACM o 0,5 x LB se realizaron de una manera análoga.
Las micromatrices de ADN se incubaron en una solución de prehibridización (3,5 x SSC [1x SSC es 0,15 M NaCl, más 0,015 M citrato de sodio] [Invitrogen], 0,1% de sulfato dodecil de sodio [SDS] [Invitrogen], y 0,1% de albúmina sérica bovina [Invitrogen]) a 45°C durante 20 min. Las matrices se enjuagaron con agua bidestilada y se secaron de manera giratoria mediante centrifugación. ADNc marcado (6 µg) se concentró en 10 µl de volumen total y fue mezclado con 10 µl de solución de hibridación de ADNc 4x (Full Moon Biosystems) y 20 µl de formamida (EM Science, Gibbstown, NJ). La mezcla de hibridación se calentó a 95°C durante 2 min. y se añadió a las mi cromatrices de ADN; cada matriz se cubrió con un cubreobjetos (Coming, Big Flats, Nueva York) y se incubó durante una noche a 37°C para la hibridación. Cuando la hibridación s e terminó, los cubreobjetos se retiraron en el I x SSC-SDS 0,1% a temperatura ambiente, y las matrices se lavaron una vez durante 5 min en 1 x SSC-SDS 0,1% a 40°C, dos vece s durante 10 minutos en 0,1 x SSC-SDS 0,1% a 40°C, y dos veces durante 1 min en 0,1 x SSC a 40°C. Las matrices fueron enjuagadas rápidamente por inmersión en agua bidestilada a temperatura ambiente y a continuación se secaron mediante centrifugación. Los portaobjetos hibridados fueron escaneados con el Generation III Array Scanner (Molecular Dynamics Corp.). Lecturas a 570 nm y 670 nm se utilizaron para cuantificar las sondas marcadas con Cy3 y Cy5 por separado. La señal se cuantificó con Array Vision 4.0 o 6.0 (Imaging Research, St. Catherines, Ontario, Canadá). Los genes fueron identificados como diferencialmente expresados cuando el índice de expresión fue superior a 1,4 y el valor p (t-test) es inferior a 0,05. Los valores p se calcularon en intensidades normalizadas transformadas de registro. La inclusión del criterio de valor p asegura la fiabilidad de la lista de genes inducidos/reprimidos. La normalización es relativa respecto a la intensidad de fluorescencia media total por portaobjetos por canal.
Tabla 1. Genes E. coli K12 reprimido mediante 10 y 30 µg/ml de ácido ursólico. Las relaciones subrayadas indican que los genes correspondientes fueron significativamente reprimidos por el ácido ursólico. Los genes remarcados fueron reprimidos tanto por 10 y 30 µg/ml de ácido ursólico. ER es el coeficiente de expresión y Pv es el valor p.
Gen
b# 10 Ig/ml de ácido ursólico 30 Ig/ml de ácido ursólico Descripción
ER
Pv ER Pv
arsC
b3503 -1,5 0,045 1,4 0,014 enzima, sensibilidad fármaco/análogo
b2789
b2789
-1,9 0,056 -2,5 0,038 permeasa D-glucarato putativa (familia MFS)
Gen
b# 10 Ig/ml de ácido ursólico 30 Ig/ml de ácido ursólico Descripción
ER
Pv ER Pv
cspF
b1558 -1,6 0,003 -1,1 0,357 proteínas a modo de choque en frío
cspG
b0990 -2,5 0,009 -1,7 0,017 homólogo de proteína de choque en frío de Salmonela
cysB
b1275 -1,7 0,038 -1,4 0,018 regulador positivo de la transcripción de regulón cisteína
cysD
b2752 -2,5 9E-04 -2,5 0,024 metabolismo central intermediario: metabolismo de azufre
cysI
b2763 -1,5 0,069 -1,7 2E-04 metabolismo central intermediario: metabolismo de azufre
cysJ
b2764 -3,6 0,015 -3,3 0,009 metabolismo central intermediario: metabolismo de azufre
cysK
b2414 -3,6 0,003 -3,3 0,008 biosíntesis de aminoácidos: cisteína
frvR
b3897 -5,4 0,006 -2 0,175 proteína reguladora operón frv putativo
gntU_1
b3436 -1,5 0,026 -1,4 0,043 transporte de pequeñas moléculas: carbohidratos, ácidos orgánicos, alcoholes
narH
b1225 -1,6 0,002 -1,4 0,028 metabolismo de energía, carbono: respiración anaeróbica
pheM
b1715 -1,6 0,011 1 0,762 sintetasas aminoacil ARNt, modificación del ARNt
pheP
b0576 -1,5 0,021 -1,1 0,499 transporte de moléculas pequeñas: aminoácidos, aminas
rimL
b1427 -1,5 0,022 1 0,719 enzimas, ribosomas - maduración y modificación
rmf
b0953 -1,5 0,003 1 0,662 Factor: ribosomas - maduración y modificación
rpmI
b1717 -1,6 0,007 1 0,708 componente estructural, proteínas ribosomales - síntesis, modificación
slp
b3506 -1,5 0,006 -1,6 0,002 constituyentes membrana externa
ugpB
b3453 -1,4 0,045 -1,5 0,021 transporte de pequeñas moléculas: carbohidratos, ácidos orgánicos, alcoholes
ybiK
b0828 -2,4 7E-04 -2,2 0,005 asparaginasa putativa
yhaD
b3124 -1,6 0,025 -2,6 0,009 glicerato quinasa I
yhaF
b3126 -1,5 0,009 -2,4 0,002 alfa-dehidro-beta-deoxi-D-giucarato aldolasa
yhaG
b3128 -2 0,004 -2,2 0,008 (D)-deshidrogenasa galactarato
b0309
b0309
-1,7 0,042 -1,3 0,155 orf, proteína hipotética
b0484
b0484
-1,5 0,044 -1,1 0,425 enzima putativa, no clasificada
b0485
b0485
-1,8 0,009 -1,3 0,019 enzima putativa, no clasificada
b0829
b0829
-1,5 0,032 -1,5 0,09 transporte putativo, no clasificado
61729
b1729 -5,6 0,003 -2 0,133 enzima putativa, no clasificada
Gen
b# 10 Ig/ml de ácido ursólico 30 Ig/ml de ácido ursólico Descripción
ER
Pv ER Pv
b2379
b2379
-1,5 0,011 1 0,325 enzima putativa, no clasificada
hdeA
b3510 -1,7 0,008 -1,4 0,008 orf, proteína hipotética
hdeB
b3509 -1,8 6E-04 -1,4 0,01 orf, proteína hipotética
yeeD
F2012 -2,3 0,025 -1,4 0,228 orf, proteína hipotética
yeeE
b2013 -13 0,006 -2 0,182 transporte putativo, no clasificado
yjeB
b4178 -1,4 0,005 1 0,833 orf, proteína hipotética
ybhG
b0795 -1,4 0,013 -1,4 0,002 membrana putativa, no clasificada
yhaU
b3127 -1,9 0,074 -4,2 0,003 proteína de transporte putativa
Ejemplo 4
Efecto de la adición de 30 µg/ml de ácido ursólico en la formación de biopelícula en medio LB en presencia de la
5 mutación cysB (E. coli K12 [R1drd19] respecto a E. coli K12 cysB[R1drd19], datos recogidos 16 horas después de la adición de ácido ursólico. Todas las lecturas de la masa de biopelículas en OD540 se normalizaron basadas en la lectura de tipo salvaje sin ácido ursólico que se normalizó a 1. Se muestra una desviación estándar. Los resultados se muestran en la Figura 3.
10 Ejemplo 5
El ejemplo 1 fue repetido, experto que el ácido asiático se añadió con inoculación en E. coli JM109 en medio de MC9 glucosa. El ácido asiático demostró aproximadamente una inhibición de biopelícula del 75%, 80% y 85% cuando se probó a 5 µg/ml, 10 µg/ml, y 15 µg/ml, respectivamente.
15 Ejemplo 6
El ejemplo 3 fue repetido, excepto que ácido asiático (C 255) fue añadido en lugar del ácido ursólico. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
20 Tabla 2. Los genes E. coli JM109 inducidos mediante 10 µg/ml y 30 µg/ml de ácido asiático en medio de glucosa M9C. Las relaciones subrayadas indican que los genes correspondientes fueron inducidos de manera significativa mediante ácido asiático. ER es el coeficiente de expresión y Pv es el valor p.
10 ug ml
30 ug/ml
Ácido asiático
Ácido asiático
Gen
b# Pv ER Pv ER Descripciones
b0829
b0829
0,000001 2,83 0,000001 2,46 componente putativo de unión a ATP de un sistema de transporte
b1729
b1729
0,000001 2,64 0,000001 2,30 parte de una quinasa
b1963
b1963
0,000838 2,14 0,000007 2,30 orf, proteína hipotética
b2332
b2332
0,000002 2,14 0,000002 2,30 orf, proteína hipotética
b2420
b2420
0,000006 4,29 0,004108 2,14 orf, proteína hipotética
b2531
b2531
0,000002 2,46 0,000002 2,14 orf, proteína hipotética
b2670
b2670
0,000001 3,25 0,002057 2,64 orf, proteína hipotética
b2834
b2834
0,000063 2,30 0,000121 2,00 orf, proteína hipotética
bolA
b0435 0,000001 2,30 0,000001 2,64 regulador posible de genes mureína
cbl
b1987 0,000001 13,93 0,000001 13,00 regulador transcripcional regulón cys; circuito regulador accesorio
10 ug ml
30 ug/ml
Ácido asiático
Ácido asiático
Gen
b# Pv ER Pv ER Descripciones
que afectan cysM
cysA
b2422 0,000002 4,00 0,000002 3,48 componente de unión a ATP de sulfato permeasa A proteína, la resistencia a cromato
cysB
b1275 0,000001 6,06 0,000001 4,29 regulador de transcripción positivo de regulón de cisteína
cysC
b2750 0,000001 10,56 0,000001 6,96 adenosina 5- fosfosulfato quinasa
cysD
b2752 0,000001 6,96 0,000001 6,502 ATP: sulfurilasa (ATP: adeniltransferasa sulfato), subun
cysH
b2762 0,000001 4,59 0,000001 3,03 reductasa 3-fosfosulfato 5-fosfoadenosina
cysI
b2763 0,000002 4,29 0,000002 3,25 reductasa sulfito, subunidad alfa
cysJ
b2764 0,000002 3,73 0,000002 4,00 sulfito reductasa (NADPH), subunidad beta flavoproteína
cysK
b2414 0,000001 4,59 0,000001 3,48 cisteína sintasa A, O-sulfhidrolasa acetilserina A
cysM
b2421 0,000001 3,73 0,000004 3,25 cisteína sintasa B, O-sulfhidrolasa acetilserina B
cysN
b2751 0,000001 11,31 0,000001 7,46 ATP-sulfurilasa (ATP: adeniltransferasa sulfato), subunidad 1, probablemente una GTPase
cysP
b2425 0,000001 4,29 0,000001 4,92 proteínas de unión tiosulfato
cysU
b2424 0,000002 4,92 0,000002 4,92 sulfato, proteína tiosulfato sistema de transporte permeasa T
cysW
b2423 0,000002 4,59 0,000002 4,00 Proteína W sistema de transporte de sulfato permeasa
dgt
b0160 0,000002 2,14 0,000057 2,30 trifosfohidrolasa trifosfato de desoxiguanosina
fliY
b1920 0,000002 4,00 0,000002 3,25 proteína putativa de transporte periplásmico de unión
ftn
b1905 0,000001 3,25 0,000001 3,03 ferritina citoplasmática (una proteína de almacenaje de hierro)
glgs
b3049 0,000001 2,14 0,000001 2,30 biosíntesis de glucógeno, dependiente rpoS
ilvG_1
b3767 0,000005 2,83 0,000059 2,00 acetolactato sintasa II, subunidad grande, críptico, interrupte
ilvL
b3766 0,000003 2,30 0,000005 3,48 péptido líder operón ilvGEDA
msrA
b4219 0,000001 2,30 0,000001 2,64 reductasa péptido metionina sulfóxido
NLPA
b3661 0,000001 18,38 0,000001 9,85 lipoproteína-28
pssR
b3763 0,001336 2,46 0,001832 2,14 regulador de pssA
pstS
b3728 0,000002 2,64 0,000002 2,00 sistema de transporte específico de fosfato de alta afinidad; proteína de unión de fosfato periplásmico
sbp
b3917 0,000001 18,38 0,000001 12,13 proteína de unión de sulfato periplásmico
tauA
B3065 0,000001 2,46 0,000001 2,00 proteínas periplásmica de sistema de transporte de taurina
yaeG
b0162 0,007398 4,59 0,042948 4,00 orf, proteína hipotética
yaiB
b0382 0,000001 2,30 0,000014 2,64 orf, proteína hipotética
ybgR
b0752 0,000002 2,46 0,000002 2,46 proteína de permeasa de sistema de transporte putativo
ybiK
b0828 0,000001 6,50 0,000001 5,66 asparaginasa putativa
yciW
b1287 0,000002 3,03 0,000002 3,73 oxidorreductasa putativa
yedO
b1919 0,000002 3,73 0,000002 2,83 deaminasa 1-aminociclopropano-1-carboxilato putativa
yeeD
F2012 0,000002 3,73 0,000002 2,30 orf, proteína hipotética
yeeE
b2013 0,000002 3,25 0,000002 2,14 sistema de transporte putativo proteína permeasa
10 ug ml
30 ug/ml
Ácido asiático
Ácido asiático
Gen
b# Pv ER Pv ER Descripciones
ygbE
b2749 0,000002 6,96 0,000004 5,28 subunidad putativa de oxidasa citocromo
yicG
b3646 0,000001 2,83 0,000001 2,30 orf, proteína hipotética
yicL
b3660 0,000001 6,50 0,000057 2,83 transportador permeasa putativo
yjaE
b3995 0,000002 2,00 0,000002 2,14 regulador transcripcional putativo
yjiD
b4326 0,000001 7,46 0,000001 9,85 orf, proteína hipotética
yrbL
b3207 0,000001 2,64 0,000001 2,46 orf, proteína hipotética

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método de reducción o inhibición de biopelículas que comprende modular la expresión del gen cysD, el gen cysI,
    el gen cysJ, el gen cysK o el gen ybiK en una bacteria Gram-negativa capaz de formar biopelículas. 5
  2. 2. Método, según la reivindicación 1, que comprende poner en contacto la bacteria con una composición que comprende un compuesto seleccionado entre ácido ursólico, ácido asiático, y sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos y N-óxidos de dichos ácidos.
    10 3. Método de modulación de la expresión de un gen cysD, un gen cysI, un gen cysJ, un gen cysK o un gen ybiK en una bacteria Gram-negativa capaz de formar una biopelícula, que comprende poner en contacto la bacteria Gramnegativa con una composición que comprende un compuesto seleccionado entre ácido ursólico, ácido asiático, sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos y N-óxidos de dichos ácidos.
    15 4. Método, según la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho compuesto es ácido ursólico.
  3. 5. Método, según la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho compuesto es ácido asiático.
  4. 6.
    Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria es una bacteria Escherichia coli. 20
  5. 7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la bacteria es una bacteria Pseudomonas aeruginosa.
  6. 8.
    Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha biopelícula es adherente a una 25 superficie.
    Ácido asiático
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