ES2374370A1 - Método para la detección de daño renal. - Google Patents

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Abstract

Método para la detección de daño renal.La invención se refiere a un método para determinar la presencia de daño renal en un individuo así como un método para predecir la progresión de dicho daño renal por medio de la detección de Reg3B así como adicionalmente, por medio de la detección de una o varias proteínas que se seleccionan de la lista que comprende, fetuina B, Ras-related GTP-binding proteín A, inhibidor de la proteína serina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K. El daño renal puede ser un fallo renal agudo. Dichas patologías renales pueden ser causadas por la administración de un agente nefrotóxico, donde el agente nefrotóxico puede ser un antibiótico aminoglucósido como por ejemplo la gentamicina.

Description

Método para la detección de daño renal.
La invención se refiere a un método para determinar la presencia de daño renal en un individuo así como un método para predecir la progresión de dicho daño renal por medio de la detección de una o varias proteínas que se seleccionan de la lista que comprende Reg3B, fetuina B, Ras-related GTP-binding protein A, inhibidor de la proteína serina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa, gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K. El daño renal puede ser un fallo renal agudo. Dichas patologías renales pueden ser causadas por la administración de un agente nefrotóxico, donde el agente nefrotóxico puede ser un antibiótico aminoglucósido como por ejemplo la gentamicina.
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Estado de la técnica anterior
Los antibióticos aminoglucósidos se usan ampliamente contra infecciones bacterianas. Concretamente, la gentamicina se usa contra las infecciones Gram negativas. Su eficacia y uso terapéutico están gravemente obstaculizados por su toxicidad, que se produce principalmente a nivel renal y auditivo (Martínez-Salgado C, López-Hernández FJ y López-Novoa JM. 2007, Toxicol Appl Pharmacol., 223: 86-98). La nefrotoxicidad inducida por gentamicina aparece en el 10-25% de los tratamientos (Leehey DJ et al., 1993, J. Am. Soc. Nephrol., 4: 81-90). Se caracteriza principalmente por daño tubular (Nakakuki M et al., 1996, Can J Physiol Pharmacol., 74: 104-111), pero también podrían aparecer alteraciones glomerulares (Martínez-Salgado C, López-Hernández FJ y López-Novoa JM. 2007, Toxicol Appl Pharmacol., 223: 86-98) y vasculares (Goto T et al., 2004, Virchows Arch., 444: 362-74; Segilmi§ MA, et al., 2005, Nephron Physiol., 100: 13-20) de forma dependiente de la dosis (Hishida A et al., 1994, Ren Fail., 16: 109-116). El daño tubular afecta principalmente al túbulo proximal en el que, dependiendo de la intensidad de la agresión, la lesión puede oscilar desde un descamado epitelial leve hasta una necrosis tubular más grave (Nakakuki et al., 1996. Can J Physiol Pharmacol., 74: 104-111). Las lesiones tubulares dan como resultado un desequilibrio en la capacidad de resorción que activa la retroalimentación tubuloglomerular, que reduce drásticamente la tasa de filtración glomerular (TFG) para evitar una pérdida masiva de fluido. Finalmente, la gentamicina reduce el flujo sanguíneo renal (FSR) por contracción tanto de las arterias preglomerulares, como de las arteriolas aferentes y eferentes (Klotman et al., 1983. Kidney Int., 24: 638-643). Como consecuencia de una FSR menor, la TFG se deteriora. Un menor FSR también contribuye
a la necrosis tisular, especialmente en el interior de la zona cortical (Cheung et al, 2008. Drugs Aging, 25: 455-476).
Dependiendo de la edad, sexo, función renal anterior, duración del tratamiento, pauta terapéutica, nivel de hidratación y otros estados concomitantes (por ejemplo., embarazo o hipotiroidismo), la nefrotoxicidad asociada con gentamicina puede a veces llegar al fallo renal agudo.
El fallo real agudo es un tipo de daño renal en el que se manifiesta una pérdida de la función excretora del riñón, suficiente para impedir la limpieza de la sangre de productos de deshecho y agua así como de mantener el balance electrolítico (Bellomo R, Kellum JA y Ronco C, 2007. Intensive Care Med., 33: 409-413). El fallo renal agudo puede estar inducido por una amplia variedad de agresiones entre las que se incluyen fármacos, tóxicos químicos, hipoxia, obstrucción de las vías urinarias, infecciones y otros (Binswanger U, 1997. Kidney Blood Press Res., 20: 163). Este tipo de daño renal representa una enorme sobrecarga humana y socioeconómica derivada de su elevada incidencia y tasa de mortalidad. Se estima que casi el 1% de ingresos hospitalarios están asociados con el fallo renal agudo, y aproximadamente el 2-7% de los pacientes hospitalizados eventualmente lo desarrollan. Más importante, la mortalidad entre los pacientes de un fallo renal agudo se mantiene remarcablemente elevada en aproximadamente un 50% de los casos.
En la práctica clínica, un fallo renal agudo se diagnostica cuando la disfunción renal produce síntomas que se pueden medir. Estos típicamente se basan en la determinación de los niveles de creatinina y urea Lo más habitual es que sus concentraciones en suero aumenten a medida que la TFG disminuye. Sin embargo, en ese estado en el que ya se observa aumento de los niveles séricos de urea y creatinina, el fallo renal agudo resulta difícil de tratar. Así, las tendencias actuales en el diagnóstico buscan detectar eventos fisiopatológicos incipientes producidos en etapas tempranas, cuando el daño está menos extendido (Vaidya VS, Ferguson MA y Bonventre JV, 2008. Rev Pharmacol Toxicol., 48:463-493). Entre estos, la medida de ciertas enzimas celulares presentes en la orina como consecuencia de la rotura de células tubulares es actualmente el procedimiento más refinado para una detección temprana del fallo renal agudo, que cursa con daño tubular. Estas enzimas incluyen N-acetil-D-glucosaminidasa (NAG), pero también otras como lactato deshidrogenasa (DHL), fosfatasa alcalina (ALP) o gammaglutamil transpeptidasa (GGT). La mayor parte de estas enzimas tienen un valor moderado como marcadores urinarios tempranos y sensibles del fallo renal agudo, debido principalmente a problemas de estabilidad e inhibición por otros componentes de la orina (Vaidya VS, Ferguson MA y Bonventre JV, 2008. Rev Pharmacol Toxicol., 48: 463-493). Marcadores tempranos de última generación incluyen, entre otros, la medida en la orina de la molécula de daño renal 1 (KIM-1), o de la lipocalina asociada a la gelatinasa neutrófila (NGAL) (Vaidya y cols., 2008).
Sin embargo, existen todavía aspectos susceptibles de mejora en el diagnostico del daño renal agudo. Uno de esos aspectos es el diagnóstico etiológico del daño, es decir, no solamente la detección precoz del daño, sino también de su causa. Este aspecto cobra especial importancia en situaciones clínicas en las que convergen diversos agentes potencialmente neurotóxicos en el mismo individuo al mismo tiempo, como por ejemplo diferentes fármacos potencialmente nocivos para los riñones. En estas circunstancias, cuando aparecen los primeros síntomas de nefrotoxicidad, es imposible saber con la tecnología diagnostica actual cual de los fármacos es el causante del daño, lo que impide sustituir solamente ese o cambiar sólo su régimen terapéutico sin alterar el de los otros fármacos. Entre los fármacos de este tipo se pueden destacar los antibióticos aminoglucósidos. De esta manera se conseguiría proporcionar La identificación de marcadores o colecciones de marcadores específicos de cada agente potencialmente neurotóxico permitiría realizar un tratamiento más racional, individualizado y específico de situaciones clínicas cotidianas como los tratamientos simultáneos que contienen dos o más fármacos potencialmente nefrotóxicos. Esto permitiría redirigir correctamente el tratamiento sustituyendo únicamente el fármaco dañino o volviendo a conformar su pauta terapéutica.
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Explicación de la invención
La invención se refiere a un método para determinar un daño renal en un individuo así como un método para predecir la progresión de dicho daño renal por medio de la detección de una o varias proteínas que se seleccionan de la lista que comprende Reg3B, fetuina B, Ras-related GTP-binding protein A, inhibidor de la proteína serina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa, gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K. El daño renal puede ser un fallo renal agudo. Dichas patologías renales pueden ser causadas por la administración de un agente nefrotóxico, donde el agente nefrotóxico puede ser un antibiótico aminoglucósido como por ejemplo la gentamicina.
La presente invención proporciona evidencias de que el daño renal o un fallo renal agudo inducido por ejemplo, pero sin limitarse, por gentamicina, está relacionado con un incremento en la excreción de cualquier proteína seleccionada de la lista mencionada en el párrafo anterior, o de cualquiera de sus combinaciones.
Por tanto, la presente invención proporciona herramientas para la detección de un daño renal o de un fallo renal agudo. Estas herramientas permiten la predicción de la progresión de un daño renal o de un fallo renal agudo, es decir, la supervisión de la progresión de dicha patología cuando la persona sea tratada con, por ejemplo, pero sin limitarse, sustancias terapéuticas, o cuando la persona está expuesta a cualquier condición o a cualquier agente nefrotóxico o no nefrotóxico.
Además, la presente invención presenta una ventaja importante: La detección de una proteína, o de cualquiera de sus fragmentos, que se selecciona de la lista que comprende Reg3B, fetuina B, Ras-related GTP-binding protein A, inhibidor de la proteína serina A3L (serpina A3L), subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa, gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1 A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4 o inhibidor de la proteína serina A3K (serpina A3K), en muestras de orina, supone una ventaja adicional para el paciente ya que la evacuación de este fluido biológico es hecho fisiológico necesario que ocurre normalmente. Esto supone un muestreo no agresivo en el individuo.
A continuación se lleva a cabo una breve descripción de las proteínas detectadas y/o cuantificadas en el método de la presente invención.
Reg3B (conocida también, entre otros sinónimos, como Regenerating islet-derived protein 3 beta, pancreatic stone protein 2, Pap, Pap1, HIP, INGAP, pancreatitis-associated protein, Pancreatitis-associated protein 1, REG-III o RegIII [beta], Reg III-beta). Esta proteína se ha relacionado con la lectina. Reg3B está presente en pequeñas cantidades en un páncreas normal pero está sobreexpresada durante la fase aguda de la pancreatitis. Puede estar involucrada en la respuesta para el control de la proliferación bacteriana durante la pancreatitis aguda. Se ha conseguido clonar.
La fetuina B (conocida también, entre otros, como 16G2, Fetuin-B precursor, Gugu, IRL685). La fetuina es una proteína que se sintetiza en el hígado y es secretada al torrente sanguíneo. Pertenece a un grupo numeroso de proteínas que posibilitan el transporte y la disponibilidad de una amplia variedad de sustancias en el torrente sanguíneo. Esta proteína es más abundante en la sangre fetal que en la del individuo adulto, de ahí el nombre de "fetuin".
Ras-related GTP-binding protein A (conocida también, entre otros, como Rag A, FIP1, FIP-1, RagA, RAGA, RRAGA, Rag A, Ras-related GTP-binding protein A o Adenovirus E3 14.7 kDa-interacting protein 1). Esta proteína puede estar en forma de homodímero. Participa en la ruta RCC1/Ran-GTPasa y puede desempeñar una función directa en la señalización mediada por TNF-alfa, que produce la inducción de la muerte celular. Se expresa de forma ubicua en músculo esquelético, corazón y cerebro.
La proteína serpina A3L (algunos sinónimos para referirse a esta proteína son serine protease inhibitor A3L, serine protease inhibitor 1 o contratripsin-like protease inhibitor 3), pertenece a un grupo de proteínas capaces de inhibir otras enzimas del grupo de las proteasas. El nombre serpina deriva de la combinación de Serpin (Serine protease inhibitor) en virtud de sus propiedades funcionales. La serpina A3L se induce por hormonas de crecimiento y se ha descrito una reducción de los niveles de expresión de la misma en ratas durante inflamación aguda. El producto de la expresión del gen se ha localizado en hígado de Rattus norvegicus (rata). La proteína serpina A3K (algunos otros sinónimos para referirse a esta proteína son contratripsin-like protease inhibitor 1, Kallikrein-binding protein, serine protease inhibitor 2 o growth hormone-regulated proteinase inhibitor) es una proteína serpina extracelular que ha mostrado niveles bajos en retinas de ratas que padecen diabetes, lo que puede contribuir a una retinopatía.
El signalosoma COP9 es un complejo proteico conservado en células eucariotas compuesto por ocho subunidades (CSN1 a CSN8). COP9 es un regulador de la ubiquitinación. La ubiquitinación consiste en el proceso de mareaje de proteínas por medio de la proteína ubiquitina para su proteolisis. La ubiquitina se ancla a la proteína que se ha de eliminar y de esta forma, la proteína marcada se mueve hacia el proteasoma, una estructura donde se lleva a cabo el proceso de la proteolisis.
La subunidad gamma del complejo de la ATP sintasa (también conocida como subunidad gamma de la ATPasa tipo F) forma el eje central que conecta el dominio F0 de rotación al dominio catalizador F1 del complejo. La proteína ATP sintasa produce ATP utilizando ADP en presencia de un gradiente de protones entre el exterior y el interior de la célula. Las ATPasas tipo F tienen dos componentes, el componente F1, con función catalizadora y el componente F0, que es el canal de protones embebido en la membrana. F1 tiene cinco subunidades: alfa, beta, gamma, delta y epsilon. F0 tiene tres subunidades principales: a, b y c. La subunidad gamma es importante en la regulación de la actividad del complejo y en el flujo de protones.
La gelsolina es una proteína globular de 82 KDa con seis subdominios, llamados S1-S6. Esta proteína está implicada en el ensamblaje de los filamentos de actina.
La ribonucleasa (RNasa), es una enzima (nucleasa) que cataliza la hidrólisis de ARN en componentes más pequeños. La ribonucleasa UK114 es responsable de la inhibición de la traducción, hidrolizando el ARNm. La ribonucleasa 4 (RNasa 4) es una proteína de unos 16 kDa que tiene preferencia por la hidrólisis de polímeros de ácido ribonucleico.
La enzima aminoacilasa 1 (Acy 1) se clocaliza en el citosol, es homodimérica, dependiente de su unión a zinc y cataliza la hidrólisis de L aminoácidos acilados.
La enzima alfa-enolasa, una conocida enzima glucolítica, ha sido identificada como un autoantígeno de la encefalopatía Hashimoto, así como se ha relacionado con asma severo. La disminución en la expresión de la enzima ha sido encontrada en córneas de personas que padecen queratocono.
La queratina 5 es una citoqueratina frecuentemente relacionada con la queratina 14. Las citoqueratinas tipo II consisten en proteínas básicas o neutrales que están organizadas en pares de cadenas distintas de queratina coexpresadas durante la diferenciación de tejidos epiteliales simples y estratificados. Mutaciones en estos genes se han asociado con enfermedades llamadas epidermolisis simples.
La proteína parvalbúmina es una albúmina de bajo peso molecular (normalmente 9-11 kDa) que necesita unirse a calcio para ejercer su función. Está estructuralmente relacionada con calmodulina y troponina C. La parvalbúmina está localizada en los músculos de rápida contracción así como en el cerebro y algunos tejidos endocrinos.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal, que comprende:
a.
obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
b.
detectar y/o cuantificar en la muestra obtenida en (a) al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
-
una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
-
una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
-
una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
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El término "daño renal" tal como se entiende en la presente invención se refiere a cualquier daño en el sistema renal de un individuo que puede ocasionar o no una condición en el individuo que permita o no permita asignar dicha condición a una enfermedad renal. El origen de dicho daño renal puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, genético, inmune, isquémico o un tratamiento con cualquier fármaco. El daño renal o enfermedad antes mencionados puede ser también producido por un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, pero sin limitarse, de riñón, de próstata, de vejiga, de uréter o de uretra.
A continuación se describe la correspondencia de las secuencias citadas con las proteínas descritas así como los números de acceso (entre paréntesis) de cada una de ellas y el organismo del que proceden:
-
SEQ ID NO: 1; Reg3A (AAX29964 o NP_002571.1), correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 2; fetuina B (NP_055190.2, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 3; inhibidor de la proteína serina A3K (P05545.3, correspondiente a Rattus norvegicus),
-
SEQ ID NO: 4; subunidad gamma de la ATP sintasa (NP_001001973.1, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 5; gelsolina (NP_000168.1, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 6; ribonucleasa UK114 (P52758.1, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 7; aminoacilasa 1A (NP_000657.1, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 8; alfa-enolasa (AAB88178.1, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 9; queratina 5 (NP_000415.2, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 10; parvalbúmina alfa (P20472.2, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 11; ribonucleasa 4 (AAA96750.1, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 12; inhibidor de la proteína serina A3L (P05544.3, correspondiente a Rattus norvegicus)
-
SEQ ID NO: 13; subunidad 1 de COP9 (Q13098.4, correspondiente a Homo sapiens),
-
SEQ ID NO: 14; Ras-related GTP-binding protein A (NP_006561.1, correspondiente a Homo sapiens).
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El porcentaje de identidad se ha establecido en base a la determinación del % de identidad de la secuencia aminoacídica de la proteína correspondiente a Homo sapiens con respecto a la secuencia aminoacídica de la proteína correspondiente a Rattus norvegicus (Tabla 1).
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TABLA 1 Porcentajes de identidad de las proteínas de la invención correspondientes a Rattus norvegicus y Homo sapiens
1
2
El término "% de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos, tal como se entiende en la presente invención, se refiere al número de posiciones aminoacídicas sobre la longitud total de la secuencia que se compara, donde todos los aminoácidos en esa posición son idénticos.
Más preferiblemente, en el apartado (b) del método se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, con:
-
al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
-
al menos un 80, 85, 90 ó 95% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
-
al menos un 90 ó 95% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
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En adelante, cuando se haga referencia a cualquiera de las proteínas de la presente invención se tendrá en cuenta que también puede detectarse cualquier proteína con el porcentaje de identidad que se ha mencionado en párrafos precedentes, según la proteína de la que se trate. Por tanto, en adelante, se podrá hacer referencia a cualquiera de las proteínas de la presente invención como "proteína de la invención" o "proteína de la presente invención".
Para detectar y/o cuantificar la proteína de la presente invención es suficiente con detectar uno o más fragmentos de dicha proteína ya que dicho fragmento es un constituyente de la secuencia aminoacídica y de la estructura de la proteína.
El apartado (b) del método de la presente invención se refiere a la detección y la cuantificación de la proteína, o de cualquiera de sus fragmentos, o se refiere también a su detección o a su cuantificación. Dicha detección y/o cuantificación se puede llevar a cabo por medio de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica.
Por otra parte, tal como se ha mencionado, el método de la presente invención se puede llevar a cabo mediante la detección y/o cuantificación de la combinación de cualquiera de las proteínas de la lista citada anteriormente o de la combinación de cualquiera de los fragmentos de dichas proteínas. Además, el término "cualquiera de sus combinaciones" también se refiere a que una o más proteínas de la invención (o cualquiera de sus fragmentos), pueden ser detectadas en combinación con la detección de cualquier otra proteína diferente de cualquiera de las proteínas de la presente invención.
Cualquiera de las proteínas de la presente invención es el producto de la expresión de una secuencia nucleotídica. Esta secuencia nucleotídica puede ser, por ejemplo pero sin limitarse, cualquier ARN como por ejemplo, pero sin limitarse, ARN mensajero (ARNm), o cualquiera de sus fragmentos. La secuencia nucleotídica puede ser también ADN complementario (ADNc) o cualquier de sus fragmentos. El ADNc es un ADN complementario a un ARMm o es también la secuencia nucleotídica que comprende los exones de la secuencia nucleotídica genómica pero no los intrones, es decir, el ADNc es la secuencia codificante. La transcripción de la secuencia nucleotídica genómica del gen que codifica para la proteína y su ADNc codifican para el mismo ARNm y, por tanto, para la misma proteína. En la presente invención también es posible detectar cualquier ARN o cualquier ADN, o cualquiera de sus fragmentos, en lugar de la detección de la proteína, o simultáneamente.
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Una realización preferida se refiere al método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal, donde se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende: SEQ ID NO: 1 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere a un método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal, donde se detecta y/o cuantifica una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos. Según una realización más preferida, se detecta y/o cuantifica la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere a un método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal, donde además comprende la comparación de los datos obtenidos en el apartado (b) con datos obtenidos de muestras control para buscar alguna desviación significativa.
El término "muestras control" tal como se entiende en la presente invención se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse, a una muestra obtenida de un individuo que no desarrolla un daño renal (individuo sano). Este tipo de muestra control, es un muestra control negativa o control negativo para un daño renal.
El término "desviación significativa" tal como se entiende en la presente invención se refiere, a la presencia de la proteína en la muestra aislada, o una mayor concentración de la proteína de la invención en la muestra aislada respecto de una muestra aislada procedente de un individuo sano. La selección del individuo sano se lleva a cabo por medio de la medida del nivel de uno o más marcadores comunes de un daño renal. El marcador común se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, creatinina, blood urea nitrogen (BUN) o proteinuria.
La muestra biológica aislada de un organismo, como por ejemplo, pero sin limitarse, un humano u otro animal, puede ser un fluido biológico o cualquier tejido celular de dichos organismos.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a un método para la determinación de un daño renal que comprende los apartados de los métodos de obtención de datos descritos en párrafos anteriores y además comprende la atribución de la desviación significativa al desarrollo de dicho daño renal, en el individuo. En consecuencia, esta realización preferida es un método para diagnosticar un daño renal.
Otra realización preferida se refiere al método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal donde el daño renal es un fallo renal agudo. El término "fallo renal agudo", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a una insuficiencia renal aguda en cualquier etapa (o gravedad) de una disfunción renal. El origen de fallo renal agudo puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, genético, inmune, isquémico o un tratamiento con cualquier droga. El fallo renal agudo puede ser producido también por un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, pero sin limitarse, de riñón, de próstata, de vejiga, de uréter o de uretra.
En otra realización preferida del método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal o un fallo renal agudo, la muestra biológica del apartado (a) es un fluido biológico. El fluido biológico puede incluir fluidos que son excretados o secretados por el cuerpo animal así como fluidos que no son excretados o secretados. El fluido biológico se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, fluido amniótico rodeando al feto, humor acuoso, sangre, plasma, fluido intersticial, linfa, leche, mucus (incluyendo secreción nasal y flema), saliva, sebo (aceite de la piel), suero, sudor, lágrimas u orina. La proteína de la presente invención puede ubicarse en cualquier compartimento biológico presente en el mencionado fluido biológico como por ejemplo, pero sin limitarse, en una célula o en una vesícula. En una realización más preferida, el fluido biológico es orina.
Otra realización preferida se refiere al método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal o un fallo renal agudo, donde la proteína, o cualquier fragmento de la misma, es detectada y/o cuantificada por medio de electroforesis, immunoensayo, cromatografía y/o tecnología de microarray.
La detección y/o cuantificación de la proteína de la presente invención puede llevarse a cabo por medio de cualquiera de las técnicas mencionadas o por cualquier combinación de las mismas. La proteína puede ser detectada evaluando su presencia o ausencia. La detección puede llevarse a cabo por medio del reconocimiento específico de cualquier fragmento de la proteína por medio de cualquier sonda y/o cualquier anticuerpo. La proteína de la presente invención, o cualquiera de sus fragmentos, puede ser cuantificada, sirviendo estos datos como referencia para compararlos con los datos obtenidos en la muestra control y buscar alguna desviación significativa. Esta desviación significativa puede ser asignada al diagnóstico de un daño renal en el individuo del que procede la muestra problema. En una realización preferida, la proteína de la invención, o cualquiera de sus fragmentos, puede ser detectada y/o cuantificada por medio de electroforesis y/o inmunoensayo.
La electroforesis es una técnica analítica de separación basado en el movimiento o la migración de macro-moléculas disueltas en un medio (buffer de electroforesis), mediante una matriz o un sólido apoyo como resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula depende de su movilidad electroforética y esta movilidad depende de la carga, tamaño y forma. Existen numerosas variaciones de esta técnica basadas en el equipamiento usado, soportes y condiciones para llevar a cabo la separación de las proteínas. La electroforesis se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, electroforesis capilar, electroforesis en papel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamida, isoelectroenfoque o electroforesis bidimensional.
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Un inmunoensayo es una prueba bioquímica que mide la concentración de una sustancia en un líquido biológico usando la reacción de un anticuerpo o anticuerpos con alguno de sus antígenos. El ensayo aprovecha la especificidad de un anticuerpo con su antígeno. La cantidad de anticuerpo o antígeno puede detectarse por medio de métodos conocidos en el estado de la técnica. Uno de los métodos más comunes es el que se basa en el mareaje del antígeno o de los anticuerpos. El mareaje puede llevarse a cabo, pero sin limitarse, una enzima, radioisótopos (radioinmunoensayo), etiquetas magnéticas (inmunoensayo magnético) o fluorescencia, y también otras técnicas incluidas aglutinación, nefelometría, turbidimetría o Western Blot. Los inmunoensayos heterogéneos pueden ser competitivos o no competitivos. El inmunoensayo puede ser competitivo: la respuesta será inversamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra, o puede ser no competitivo (conocido también como "sandwich assay"): los resultados son directamente proporcionales a la concentración del antígeno. Una técnica de inmunoensayo que puede ser utilizada en la presente invención es el ensayo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
Por medio de las técnicas cromatográficas, las moléculas pueden ser separadas, pero sin limitarse, por su carga, tamaño, masa molecular, mediante su polaridad o mediante su potencial redox. La técnica de cromatografía se selecciona, pero sin limitarse, cromatografía de líquidos (cromatografía de partición, cromatografía de adsorción, cromatografía de exclusión o cromatografía de intercambio iónico), cromatografía de gases o cromatografía de fluidos supercríticos.
La tecnología de microarray de la presente invención está basada, por ejemplo, sobre la fijación en un soporte sólido de una molécula que reconoce la proteína de la presente invención. El microarray basado en anticuerpos es el microarray de proteínas más común. En este caso, los anticuerpos se fijan en el soporte sólido (también se puede emplear el término chip para referirse a microarray). Estos anticuerpos son utilizados para capturar moléculas que permiten la detección de proteínas procedentes, pero sin limitarse, de muestras biológicas, de lisados celulares, de suero o de orina. El término "soporte sólido" tal como se emplea en la presente invención se refiere a una gran variedad de materiales, por ejemplo, pero sin limitarse, intercambio de iones o resina adsorción, vidrio, plástico, látex, nylon, gel, ésteres de celulosa, esferas paramagnéticas o la combinación de algunos de ellos.
Según otra realización preferida del método de obtención de datos útiles para determinar un daño renal o un fallo renal agudo de la presente invención, el daño renal o el fallo renal agudo es producido por la administración o por la exposición del individuo a, al menos, un agente nefrotóxico. Una realización más preferida se refiere al método donde el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido.
Este agente nefrotóxico puede causar una o más patologías renales debido al nivel de la administración o de exposición. Dicha administración o exposición puede tener lugar durante un periodo de tiempo o puede estar limitado a un acontecimiento único, así como también puede deberse a uno o varios compuestos. Las circunstancias de la exposición pueden ser involuntarias, accidentales, intencionadas, como consecuencia de una sobredosis o como consecuencia de una necesidad terapéutica (administración). El riñón es el órgano principal de la excreción porque mantiene la homeostasis de moléculas solubles en agua, y puede concentrar determinadas sustancias activamente. En general, el túbulo proximal, distal o urinario pueden ser reparados, pero los glomérulos y la médula pueden tener una reparación significativamente menor.
El agente nefrotóxico, cuando es administrado, puede ser una composición farmacéutica (sustancia terapéutica) o, pero sin limitarse, anestésicos halogenados o un compuesto que está incluido en un alimento funcional, o en un complemento vitamínico, o en un complemento nutricional. El agente nefrotóxico, cuando el individuo está expuesto, puede ser además, un químico como por ejemplo, pero sin limitarse, metal pesado, plaguicida o antimicrobiano. El plaguicida puede ser, pero sin limitarse, un fungicida, un herbicida, un insecticida, un algicida, un molusquicida, un acaricida o un raticida. El insecticida puede ser, pero sin limitarse, un bactericida, un antibiótico, un antibacteriano, un antiviral, un antifúngico, un antiprotozoario o un agente antiparasitario.
El antibiótico aminoglucósido (aminoglucósido) ejerce su acción uniéndose a las subunidades ribosomales 30S y 50S bacterianas, inhibiendo la translocación de la peptidil-tRNA y también causando lectura errónea de ARNm, dejando a la bacteria incapaz de sintetizar proteínas vitales para su crecimiento. La antibiótico aminoglucósido puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, amikacina, arbekacina, gentamicina, kanamicina, neomicina netilmicina, paromomicina, rodostreptomicina, estreptomicina, tobramicina, apramicina, espectinomicina, higromicina B, verdamicina, astromicina o puromicina. Según una realización aún más preferida, el antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido de amplio espectro comúnmente empleado para tratar las infecciones de bacterias aeróbicas Gram negativas. Los aminoglucósidos son absorbidos mal cuando son administrados oralmente, pero se eliminan rápidamente por los riñones. Por otra parte, los aminoglucósidos difunden en las células bacterianas a través de canales localizados en la membrana exterior y son transportados hasta el citoplasma. Como resultado, la gentamicina actúa interfiriendo con la síntesis de proteínas bacterianas pero puede causar daño renal en el túbulo proximal, particularmente en el segmento S1 o S2, que puede dar lugar al desarrollo de un fallo renal agudo. El fallo renal agudo puede ser debido, además, a la administración simultánea o secuencial de un segundo agente nefrotóxico. Este segundo compuesto puede ser por ejemplo, pero sin limitarse, nitrato de uranilo o cisplatino. El nitrato de uranilo es un agente nefrotóxico que ocasiona insuficiencia renal grave y necrosis tubular aguda. Otros órganos diana incluyen el hígado, pulmones o el cerebro. El cisplatino es un agente antitumoral de amplio espectro comúnmente utilizado para tratar tumores de los testículos, ovarios, vejiga, piel, cuello o pulmones. El cisplatino difunde en las células y funciona por intercalarse dentro y entre las cadenas de ADN, provocando la muerte de la célula.
Otro aspecto de la presente invención es un método para predecir la progresión de un daño renal debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico, que comprende, en primer lugar, (a) determinar una primera concentración de una proteína, o cualquier fragmento de la misma, seleccionada de la lista que comprende:
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una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
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una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
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una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos,
en un fluido biológico aislado de un individuo expuesto o no expuesto a un agente nefrotóxico. En segundo lugar se determina una segunda concentración de la proteína cuya concentración se ha determinado en (a), en un fluido biológico del individuo, después de determinar la primera concentración de dicha proteína en el individuo expuesto, o después de la iniciación de la administración o exposición al agente nefrotóxico en el individuo no expuesto, y (c) comparar la segunda concentración obtenida en el apartado (b) con la primera concentración contenida en apartado (a) para buscar alguna desviación significativa. Es decir, si la determinación de la primera concentración se lleva a cabo en una muestra de un individuo expuesto al agente nefrotóxico, la medida de la segunda concentración se lleva a cabo tras la determinación de la primera concentración, y si la determinación de la primera concentración se lleva a cabo en una muestra de un individuo sin exposición al agente nefrotóxico, la medida de la segunda concentración se lleva a cabo después del comienzo de la administración o la exposición al agente nefrotóxico del individuo. La segunda concentración es comparada con la primera concentración buscando cualquier desviación significativa. La desviación significativa puede ser en el sentido de mayores o menores valores cuando la segunda concentración es comparada con la primera concentración, o cuando cualquier desviación significativa es comparada con una determinación anterior de la concentración.
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En la presente invención, el término "predecir la progresión" se refiere a una conclusión de la monitorización o supervisión de la progresión del daño renal, esto es, la manifestación sobre la progresión de un daño renal debida a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico.
Una realización preferida se refiere al método para predecir la progresión de un daño renal debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico, donde en el apartado (a) y (b) se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende: SEQ ID NO: 1 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al método para predecir la progresión de un daño renal debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico, donde se determina la concentración de una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos.
Según una realización más preferida, se detecta y/o cuantifica la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al método para predecir la progresión de un daño renal debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico, donde el daño renal es un fallo renal agudo.
Según otra realización preferida del método para predecir la progresión de un daño renal o de un fallo renal agudo, el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido. Una realización más preferida se refiere al método donde el antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
Otra realización preferida se refiere al método para predecir la progresión de un daño renal o de un fallo renal agudo, donde el fluido biológico es orina.
Para referirse a cualquiera de los métodos de la presente invención para la obtención de datos útiles para la determinación de un daño renal o de un fallo renal agudo, o de cualquiera de los métodos para predecir la progresión de dicho daño renal o de dicho fallo renal agudo, puede emplearse el término "método/s de la presente invención" o "método/s de la invención".
Según una realización preferida del método de la presente invención, el individuo es un humano. El individuo del método de la invención puede ser un animal ya que el citado método es útil para usos veterinarios.
Otro aspecto de la presente invención es el uso de al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
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una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
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una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
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una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos,
como biomarcador para determinar un daño renal o para predecir la progresión de un daño renal.
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Una realización preferida se refiere al uso donde se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID NO: 1 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al uso, donde se determina la concentración de una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos. Según una realización más preferida, se detecta y/o cuantifica la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos.
Este biomarcador indica un cambio en la expresión o estado de una proteína relacionada con un daño renal o con la progresión de un daño renal. Una vez que el bioindicador ha sido validado, puede ser utilizado para diagnosticar un daño renal, la progresión de un daño renal o para adecuar tratamientos a un individuo para dicho daño renal, por ejemplo, tratamiento con diversas drogas o regímenes de administración.
Si un tratamiento altera la presencia o la concentración de biomarcador detectado que tiene una relación directa con el riesgo de sufrir un daño renal, el bioindicador sirve como un informador para modificar cualquier tratamiento o exposición a cualquier agente nefrotóxico.
Una realización preferida del uso de una proteína o cualquier fragmento de la misma es el uso donde el daño renal o la progresión del daño renal es debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico. Según una realización más preferida del uso de una proteína o cualquier fragmento de la misma, el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido. Otra realización aún más preferida es el uso donde el antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para determinar un daño renal, para obtener datos útiles para la determinación de un daño renal o para predecir la progresión de un daño renal, en una muestra aislada de un individuo, que comprende, al menos, una o más sondas capaces de reconocer al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende
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una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos,
-
una proteína con al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 a 11, o cualquiera de sus fragmentos, o
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una proteína con al menos un 90% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
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Una realización preferida se refiere al kit, donde la/s sonda/s reconoce/n al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID NO: 1 a 14, o cualquiera de sus fragmentos.
Otra realización preferida se refiere al kit, donde la/s sonda/s reconoce/n una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 y/o una proteína con al menos un 60% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos. Según una realización más preferida, la/s sonda/s reconoce/n la proteína SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o cualquiera de sus fragmentos.
Una sonda es una sustancia que normalmente está marcada (pero no necesariamente) y que se utiliza para detectar, identificar y/o cuantificar cualquier proteína de la presente invención o cualquier fragmento de la misma. La sonda puede ser, pero sin limitarse, una sonda que reacciona con grupos thiol, biotina, avidina, estreptavidina o peptina. El soporte sólido es preferiblemente un gel, por ejemplo, pero sin limitarse, un gel de agarosa o un gel de poliacrilamida.
Otra realización preferida se refiere a un kit donde las sondas son anticuerpos capaces de reconocer la proteína o cualquiera de sus fragmentos. Dichos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
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Descripción de las figuras
Fig. 1. Muestra la tasa de supervivencia y la aparición de marcadores renales de daño correspondientes a ratas tratadas con gentamicina.
A. Tasa de supervivencia representada como porcentaje de animales supervivientes en cada grupo durante 7 días de tratamiento, B. Imágenes representativas de análisis mediante inmunotransferencia (Western blot) de niveles de expresión de la molécula de daño renal 1 (KIM-1) y proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) en homogenados de riñón procedentes de 3 ratas control aleatoriamente seleccionadas y 3 ratas tratadas con gentamicina tras 7 días de tratamiento.
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Fig. 2. Muestra imágenes representativas del córtex y papilla de secciones de tejido renal de ratas tratadas con gentamicina.
Imágenes representativas del córtex (A-D) y papilla (E-H) de secciones de tejido renal teñidas con hematoxilina y eosina, procedentes de ratas control (n=3) y ratas tratadas con gentamicina (n=3), aleatoriamente elegidas. Las imágenes A, B, E y F se tomaron con un aumento de 400x, mientras que las imágenes C, D, G y H con un aumento de 1000x.
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Fig. 3. Muestra la separación mediante SDS-PAGE de proteínas urinarias procedentes de ratas control y ratas tratadas con gentamicina.
Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 6% (A) y 15% (B), y teñidas posteriormente con azul brillante de Coomassie. Las proteínas presentes en las bandas (1-24) se determinaron mediante LC-ESI-Q-TOF y relacionadas en la tabla 3.
Hilera 1: patrones de peso molecular. Hilera 2: Orina de control. Hilera 3: orina del grupo de la gentamicina.
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Fig. 4. Muestra imágenes de electroforesis de 2 dimensiones (2D) de proteínas diferencialmente expresadas.
El análisis cuantitativo de intensidad usando el programa informático Image Master 2D Platinum (GE Healthcare) reveló 129 proteínas diferencialmente expresadas entre las muestras de orina normal y de gentamicina. Las manchas se marcaron con números correspondientes a los de la tabla 4 y se identificaron mediante LC-ESI-Q-TOF y MALDI-TOF. Cada uno de los geles mostrados en esta figura es representativo de 8 geles obtenidos con orina procedente de animales aleatoriamente seleccionados de cada grupo, cada uno de ellos analizado por duplicado.
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Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y métodos 1.1. Animales y protocolo experimental
Se usaron ratas Wistar hembra con un peso de 200-250 g. Los animales se alojaron en condiciones ambientales controladas en jaulas metabólicas individuales, de las que se recogieron individualmente muestras de orina de 24 h. Se administraron ad libitum pienso normal y agua. Las ratas se dividieron aleatoriamente en dos grupos: (i) grupo de control (C), recibiendo diariamente placebo i.p. durante 6 días, y (ii) grupo de gentamicina (G), recibiendo diariamente una dosis i.p. de gentamicina (150 mg/kg de peso corporal) durante 6 días. En el día 7, los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico y los riñones se perfundieron desde la aorta con solución salina (0,9% de NaCl) para eliminar la sangre. Inmediatamente, los riñones se diseccionaron. Uno de estos se congeló en nitrógeno líquido y se mantuvo posteriormente a -80ºC para estudios de inmunotransferencia, y el otro se sumergió en p-formaldehído al 3,7% para estudios histológicos. También se obtuvieron muestras de sangre en capilares heparinizados en diferentes puntos temporales a partir de una pequeña incisión en la punta de la cola. La sangre se centrifugó y el suero se guardó a -80ºC hasta su uso. La orina se clarificó por centrifugación a 10.000 g y 4ºC durante 10 minutos, y se almacenó a -80ºC hasta su uso.
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1.2. Estudios histológicos
Los riñones se mantuvieron en p-formaldehído durante toda la noche a 4ºC. A continuación, se fabricaron bloques de parafina y se cortaron secciones de tejido de 5-\mum y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se tomaron fotografías bajo un microscopio Olympus BX51 conectado a una cámara digital Olympus DP70 color.
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1.3. Medidas bioquímicas
Se midieron la concentración de creatinina en suero y nitrógeno ureico mediante tiras reactivas comerciales (Roche Diagnostics) y el analizador automático Reflotron® (Roche Diagnostics). La medida de concentración de creatinina tenía un límite de detección inferior de 0,5 mg/dL. La concentración de proteína ureica se midió mediante el método de Bradford (Bradford, 1976. Anal Biochem, 72: 248-254). El contenido en NAG de la orina se determina indirectamente por el grado de actividad NAG. La actividad enzimática NAG se determinó mediante un procedimiento colorimétrico basado en la conversión de la 3-cresolsulfonftaleinil-N-acetil-D-glucosaminida en el 3-cresol-cresolsulfonftaleinilo púrpura, que se midió a 580 nm con un fotómetro de placa (Thermo). Para la medida de la actividad NAG se usó un kit comercial (Roche Diagnostics) que se usó según las instrucciones del fabricante.
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1.4. Inmunotransferencia (Western blot)
Se realizaron inmunotransferencias con extractos tisulares (50 g de proteína total por muestra) preparados homogeneizando los riñones con un mezclador de tejido Ultra-Turrax T8, IKA®-Werwe) a 4ºC en tampón de homogenización (NaCl 140 mM, Tris-HCl 20 mM pH=7,5, ácido etilendiaminotetraacético 0,5 M EDTA, glicerol al 10%, Igepal CA-630 al 1%, 1 g/mL de aprotinina, 1 g/ml de leupeptina, 1 g/mL de pepstatina A, fluoruro de fenilmetilsulfonilo PMSF 1 mM). Los homogenados tisulares se centrifugaron a 22.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Se recogieron los sobrenadantes. La concentración de proteína se midió con un kit comercial (BioRad) basado en el método de Lowry. Las muestras se separaron por electroforesis en geles de acrilamida al 10-15% (sistema Mini Protean II, BioRad). Inmediatamente, las proteínas se transfirieron eléctricamente a una membrana Immobilon-P (Millipore). Tras bloquear la membrana para evitar la unión no específica, las membranas se sondearon con anticuerpos contra KIM-1 (R&D Systems) y proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7, bone morphogenetic protein 7, Santa Cruz Biotechnology).
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1.5. Separación electroforética de proteínas (1D y 2D)
La orina se concentró y desaló mediante filtración forzada por centrifugación a través de columnas Amicon Ultra con corte de 5 K (Millipore). Se determinó la concentración de proteínas por el método de Bradford. Para la separación electroforética 1 D se hicieron correr 100 mg de proteína total por muestra en geles de acrilamida al 6 y 15% (sistema Mini Protean II, BioRad, Madrid, España) y se tiñeron con azul brillante de Coomassie G-250. Para la electroforesis 2D, las proteínas ureicas se precipitaron con el kit Clean-Up (GE Healthcare) según las instrucciones de los fabricantes. Se rehidrataron 100 mg de proteína de cada muestra en urea 7 M, tiourea 2 M, Chaps al 4% (p/v), anfolitos al 0,5% pH 4-7 ó 4,5-5,5), ditiotreitol (DTT) 50 mM y azul de bromofenol, y se centraron isoeléctricamente (500-8.000 V) a través de tiras inmovilizadas de 18 cm de longitud con gradiente de pH (IPG), pH 4-7 ó 4,5-5,5 (GE Healthcare, Madrid, España), usando un equipo IPGphor (GE Healthcare). Las tiras IPG se preequilibraron durante 15 minutos en tampón de equilibrado [Tris-HCl 50 mM pH=8,8, urea 6 M, glicerol al 30% (v/v), dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2% (p/v), azul de bromofenol al 0,01% (p/v)] conteniendo DTT al 1% (p/v), y otros 15 minutos en tampón de equilibrado que contenía yodoacetamida al 2,5% (p/v) A continuación, las tiras IPG se transfirieron a geles de acrilamida de 18 cm de longitud al 12% y se separaron por electroforesis con un equipo SE 600 Ruby (GE Healthcare). Los geles se fijaron durante toda la noche en etanol al 30%, ácido acético al 10% y se tiñeron con plata con un kit comercial (GE Healthcare). A no ser que se indique otra cosa, todos los reactivos procedían de Sigma. Para visualización y análisis, los geles teñidos se escanearon (Image Sanner, GE Healthcare, Madrid, España), y procesaron y se analizaron estadísticamente con el programa informático Image Master 2D Platinum 6.0 (GE Healthcare, Madrid, España). La discriminación de manchas se realizó con los siguientes parámetros: (i) factor de alisado: 2; (ii) área mínima: 5 píxeles; (iii) "saliency" 100. El análisis se corrigió visualmente para eliminar artefactos. Para cada mancha individual, se restó el fondo y se normalizó la intensidad del volumen individual según la intensidad del volumen total (intensidad de todas las manchas). Para comparación de la misma mancha entre geles, se estableció una diferencia mínima de dos veces la intensidad para tener en cuenta una expresión diferencial.
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1.6. Cromatografía líquida bidimensional (cromatoenfoque + fase reversa) (2D-CF)
Se usó un sistema ProteomeLab PF2D (Beckman Coulter). Se diluyeron las orinas concentradas y desaladas en un tampón optimizado (urea 7,5 M, tiourea 2,5 M, glicerol al 12,5%, Tris-HCl 62,5 mM pH = 7,8-8,2, n-octilglucósido al 2,5% (p/v), clorhidrato de triscarboxietil fosfina 6,25 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este tampón se sustituyó a continuación, por start buffer (pH 8,5\pm0,1, Beckman Coulter) usando una columna PD-10 (GE Healthcare). La primera fracción de 3,5 ml se recogió y se cuantificó la concentración de proteínas. A continuación, 1 mg de cada muestra se introdujo en la columna de intercambio iónico cromatofocalizante y se eluyó en fracciones de 0,3 pH según el punto isoeléctrico mediante un gradiente lineal descendente de pH (8,5 hasta 4). Cada fracción de pH se separó a continuación a 50ºC según la hidrofobia proteica usando una cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa con una columna C18 no porosa (RP-HPLC) implementada con un gradiente lineal 5-100% de TFA al 0,08% en acetonitrilo a 0,75 mL/min en la que A es TFA al 0,1% en agua. Las fracciones de fase inversa de 0,6 min se recogieron y almacenaron a -80ºC. Se midió la absorbancia a 214 nm en la segunda dimensión, y los datos se analizaron mediante los programas informáticos 32 Karat y Delta View (Beckman Coulter).
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1.7. Identificación de proteínas procedentes de las separaciones 1D, 2D y 2D-CF
Se recortaron de los geles las bandas y manchas de interés procedentes de las separaciones 1D y 2D (respectivamente). Cada recorte de gel se deshidrató en acetonitrilo y éste se evaporó con una bomba de vacío y se volvió a suspender en NH_{4}HCO_{3}. Las fracciones 2D-CF se evaporaron también a vacío y los residuos se volvieron a suspender en NH_{4}HCO_{3}. De esta manera, las muestras procedentes de 1D, 2D y 2D-CF se trataron de forma idéntica. Se redujeron con DTT 10 mM en NH_{4}HCO_{3} 50 mM a 56ºC, y se alquilaron con yodoacetamida en NH_{4}HCO_{3} 50 mM. A continuación, las proteínas se digirieron en el gel a péptidos con tripsina porcina (Promega) durante 30 minutos a 4ºC. Posteriormente, los péptidos se extrajeron con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,5% (v/v). La disolución se evaporó a vacío y los péptidos se disolvieron en ácido fórmico al 0,1% (v/v) bajo sonicación. Las disoluciones que contenían péptidos se inyectaron en un espectrofotómetro de masas LC9 ESI-QUAD-TOF QSTAR XL (Applied Biosystems) con un micro HPLC 1100 (Agilent). Se usó una columna Supelco de poro ancho A de 150 x 0,32 mm (5 m) (Discovery BIO) con un caudal de 7 L/min. Se obtuvieron espectros MS/MS. La identificación de proteínas se realizó con el programa informático MASCOT (www.matrixscience.com) frente a bases de datos de secuencias proteínicas no redundantes (Swiss Prot y NCBI). Se ajustó la tolerancia másica a 50 ppm, la tolerancia MS/MS fue 0,5 Da, y el estado taxonómico fue Rattus. Solo se consideraron hitos significativos identificados mediante el análisis de probabilidad MASCOT, y se ajustó como umbral de aceptación al menos un emparejamiento de péptido con puntuación de ión superior a 20. En algunos casos en los que el procedimiento LC-ESIQUAD-TOF no produjo una identificación proteínica no ambigua, o en manchas seleccionadas aleatoriamente (para su confirmación, las proteínas se identificaron con un espectrómetro de masas Ultraflex I MALDI-TOF (Bruker Daltonics) en el Proteomic Service del Centro de Investigación del Cáncer de la Universidad de Salamanca-CSIC (Salamanca, España).
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1.8. Análisis estadístico
Los datos se representaron como promedio \pm error estándar o promedio \pm desviación estándar de n experimentos realizados, según se indica en cada caso. Excepto para el estudio de los resultados proteómicos (según se indica anteriormente), las comparaciones estadísticas se evaluaron mediante análisis ANOVA de una vía. Se evaluó la distribución de la normalidad (pasando al menos tres de los siguientes tests: normalidad de los residuos por asimetría, normalidad de los residuos por curtosis, normalidad de los residuos por ómnibus e igualdad de varianza por Levene modificada. Se usó el test de Scheffe para determinar la significancia estadística. Se consideró significativo un valor de p<0,05.
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Ejemplo 2 Caracterización de la lesión renal inducida por gentamicina
Tras 7 días de tratamiento, la gentamicina produjo un daño renal (fallo renal agudo o insuficiencia renal aguda) marcada con una mortalidad asociada de aproximadamente un 50% (Fig. 1 y tabla 2). Los animales supervivientes cursaron con una pérdida de peso pequeña pero significativa y poliuria. El fallo renal agudo se caracterizó adicionalmente por un importante aumento de la creatinina en suero y concentración BUN, indicando una reducción de la TFG. La excreción de NAG también aumento en una gran extensión, indicando daño tubular extensivo. La proteinuria fue también evidente en la orina de los animales tratados con gentamicina (Tabla 2).
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TABLA 2 Peso corporal (mostrado como porcentaje del peso inicial), concentración de creatinina en plasma, nitrógeno ureico plasmático (BUN), proteinuria, excreción NAG y flujo urinario en ratas de los grupos de control y de gentamicina tras 7 días de tratamiento, a, p<0,05 con respecto al grupo de control. n=12 al inicio del experimento en ambos grupos
3 
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Ejemplo 3 Estudio histopatológico renal
Las secciones renales teñidas con hematoxilina-eosina (Fig. 2) revelaron una clara necrosis tubular en las ratas tratadas con gentamicina, en las que se puede observar una masiva destrucción epitelial. No es evidente una modificación importante de los glomérulos. A nivel papilar, la obstrucción de los túbulos colectores con material hialino es habitual en los animales tratados con gentamicina. Estos estudios proporcionan el respaldo morfológico al menos para parte de la extensa disfunción renal observada.
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Ejemplo 4 Análisis proteómico diferencial de la orina
Se han usado en este estudio tres enfoques proteómicos diferentes (1D-SDS-PAGE, 2D y 2D-CF) y dos técnicas de espectrometría de masas para la identificación de proteínas (LC-ESI-QUAD-TOF y MALDI-TOF). Esta combinación se ha demostrado como parcialmente solapante y parcialmente no redundante. Los resultados representativos de 1D se muestran en las figuras. La Fig. 3 representa un perfil típico SDS-PAGE de la orina procedente de las ratas control y de las tratadas con gentamicina, del que se extrajeron y analizaron 24 bandas diferencialmente abundantes, conteniendo cada una varias proteínas. Las bandas de la 13 a la 16 fueron más abundantes en el grupo de control, mientras que las bandas de 1 a 12 y de 17 a 24 fueron más abundantes en el grupo de la gentamicina. Las proteínas identificadas mediante este enfoque se recogen en la tabla 5.
En estudios piloto, se determinó el perfil de distribución de proteínas en las orinas de control y de gentamicina según su punto isoeléctrico. La mayor parte de proteínas se incluyeron en el intervalo de pH de 4 a 7. En estudios piloto, los autores usaron tiras IPG cubriendo un amplio intervalo de pH) (2-10). Debido a que había un defecto en el alcance más allá de pH 7, y también porque se perdían comparativamente pocas proteínas en el intervalo de pH 7-10, los autores decidieron realizar los experimentos en el intervalo de pH de 4 a 7 para la primera dimensión de la separación 2D. Se muestra en los paneles superiores de la figura 4 una imagen representativa de un gel 2D (intervalo de pH 4-7) de muestras de orina procedentes de ratas control tratadas con gentamicina. Se observa una gran similitud entre las muestras procedentes de animales del mismo grupo, y se obtuvo una elevada reproducibilidad cuando se repitió la separación 2D con la misma muestra. Muchas proteínas se concentraron en el intervalo de pH 4,5-5,5. Por esta razón, se realizaron también las separaciones 2D de las mismas muestras de orina en este intervalo de pH. Una imagen significativa de esto último se muestra en los paneles inferiores de la Fig. 4. En ambos casos, se reconocieron y numeraron para identificación química manchas diferencialmente presentes estadísticamente significativas entre los grupos de control y de la gentamicina. (En la Fig. 4, los números asociados con las manchas se indican para el grupo en el que la proteína específica aparece de forma más abundante).
El proteoma de la orina de ambos grupos fue sustancialmente distinto. En primer lugar, se identificaron significativamente más manchas en la orina de las ratas tratadas con gentamicina que en las ratas control. En el intervalo de pH de 4-7, se identificaron 606 manchas procedentes del grupo de control y 933 del grupo de la gentamicina. En el intervalo de pH 4,5-5,5, los números fueron 358 y 724, respectivamente. De estas, se encontraron 129 manchas diferencialmente expresadas entre los grupos (37 sobreexpresadas en el grupo de la gentamicina, y 92 en el grupo de control). De estas 129 manchas, los datos de espectrometría de masas identificaron 98 de ellas en bases de datos de proteínas, correspondientes a isoformas o variantes modificadas post-trascripcionalmente de 34 proteínas (23 incrementadas en el grupo de la gentamicina y 11 en el grupo de control; véase la tabla 4).
Un estudio complementario del proteoma diferencial de la orina de dos animales control y dos tratados con gentamicina se realizó mediante el procedimiento 2D-CF. La similitud entre las muestras del mismo grupo fue buena y la reproducibilidad de los resultados de diferentes experimentos con la misma muestra fue también muy alta. La Fig. 5 muestra el mapa comparativo de la expresión de proteínas generado mediante análisis 2D-CF de ambos grupos. Cada mancha roja (tal como se ve en los experimentos. En la presente invención se presenta en escala de grises) representa una fracción aumentada (proteína) en el grupo de la gentamicina, mientras que cada mancha verde representa una fracción aumentada en el grupo de control (es decir, una disminución en el grupo de la gentamicina). El análisis por MS de las fracciones diferencialmente abundantes identificó 22 proteínas (véase la tabla 5). Muchas de estas proteínas coincidieron con algunas de las encontradas según el procedimiento 2D como 2-HS-glicoproteína, hemopexina, albúmina en suero, quininógeno T 1, transtiretina, proteína de unión con la vitamina D, y las proteínas urinarias 1, 2 y 3. Muchas de estas proteínas se identificaron también en varias reacciones, confirmando la existencia de variantes o isoformas. De manera interesante, este procedimiento identificó varias proteínas no detectadas mediante 1D y 2D. Es el caso de por ejemplo, la 2-microglobulina y la cistatina C. Hay que mencionar que, como resultado del fraccionamiento líquido, se obtuvo una mejor cobertura de las secuencias para la mayor parte de las proteínas también identificadas según el procedimiento 2D.
Los procedimientos de separación de proteínas usados, concretamente 1D, 2D y 2D-CF, demostraron ser parcialmente solapantes pero también parcialmente no redundantes, evidenciando su valor complementario.
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Análisis de los resultados
En la presente invención se ha seleccionado la orina como la muestra corporal más adecuada para análisis rutinarios a escala de población. En el caso de enfermedades renales, esto no sólo es conveniente por su accesibilidad sencilla y no traumática, sino también por su contacto directo con los tejidos en los que se producen los eventos patológicos, de los que es fácil recoger un importante material diagnóstico.
El muestreo de orina puede realizarse al cabo de 24 horas desde que se inicia el tratamiento o administración con antibióticos aminoglucósidos, frente a muestras puntuales de orina. El muestreo de 24 horas permite una normalización más fina y precisa a través del cálculo de la excreción diaria de cualquiera de las proteínas de la invención (marcadores). Sin embargo, su uso en el ámbito clínico está limitado a un subconjunto de pacientes. Las muestras puntuales de orina, por el contrario, sirven mejor para el análisis de la población en general. Sin embargo, el nivel de presencia de los marcadores potenciales puede depender fuertemente de la concentración de orina, que puede alterar resultados y conclusiones. Los intentos de normalizar la concentración de orina (es decir, por la concentración de creatinina urinaria) pueden llevar también a resultados sesgados, ya que los parámetros de normalización están frecuentemente alterados en condiciones patológicas.
Un intento de resolver estos inconvenientes sería actuar a través de la creación de perfiles urinarios de cualquiera de las proteínas de la invención cuya presencia en la orina esté alterada (tanto aumentada como disminuida) en términos relativos, como una fracción de todas las proteínas excretadas como consecuencia de una agresión (por ejemplo, un fármaco). Para aplicación en la práctica clínica, la magnitud de una proteína marcador en un modelo diagnóstico determinado sería el resultado de su normalización respecto de la cantidad total de proteínas en la muestra de orina analizada. Así, con este objetivo, en el presente estudio los autores han normalizado muestras de orina según el contenido proteico usando la misma cantidad de proteínas por muestra, y a continuación, estudiado la presencia relativa de cualquiera de las proteínas de la invención, que se habían identificado mediante técnicas de proteómica
diferencial.
Desde un punto de vista teórico, un aumento o disminución en la presencia absoluta o relativa de cualquiera de las proteínas de la invención en la orina, puede ser el resultado de numerosos factores: (i) alteraciones en la filtración glomerular y en la secreción tubular de proteínas procedentes de la sangre o el espacio extracelular renal; (ii) los marcadores pueden proceder de tejidos renales dañados o en reparación; (iii) la presencia alterada puede también ser la consecuencia de una capacidad de resorción impedida en general o de forma específica a nivel tubular; (iv) finalmente, y muy importante, los marcadores pueden proceder de síntesis, rutas de señalización, transporte transmembrana o exocitosis alterados en tejidos renales existentes o no alterados o de compartimentos específicos.
En la presente invención se han encontrado un número de proteínas marcadoras de daño renal que aparecen incrementados en la orina de ratas nefrointoxicadas por gentamicina con respecto a ratas sanas (control) mediante la aplicación de técnicas proteómicas (Tabla 6). Hay que tener en cuenta que la excreción de estas proteínas marcadoras está infraestimada porque 14 ratas del grupo de la gentamicina mostraron una evidente proteinuria. Esto significa que la excreción diaria de las proteínas marcadoras identificadas como aumentadas en la orina de estos animales es varias veces mayor que su presencia relativa en la orina (la excreción de proteínas en el grupo de la gentamicina es más de 5 veces superior que en el grupo de control, Tabla 2). El análisis de los perfiles electroforéticos 1D y 2D (Figs 3 y 4) de proteínas en orina procedentes de ambos grupos revela claramente que la abundancia relativa de proteínas de peso molecular bajo (<35 KDa) es mayor en las ratas control. Por el contrario, las proteínas de peso molecular intermedio (PMM) (35-65 KDa) son relativamente más abundantes en las ratas tratadas con gentamicina. En las últimas, es especialmente evidente de los experimentos 1D que las proteínas de peso molecular elevado (PME) (65 KDa), ausentes en el grupo de ratas control, aparecen como consecuencia del tratamiento con gentamicina. Se pueden encontrar estas proteínas grandes con hasta casi 200 KDa (Fig. 3, bandas 17-22). La presencia de proteínas PME en la orina se considera normalmente como un síntoma de lesión en la barrera de filtración glomerular (BFG) aumentando su permisividad para las proteínas más grandes, normalmente excluidas del ultrafiltrado. Sin embargo, las proteínas de peso molecular grande pueden aparecer también en la orina como resultado del desprendimiento de las estructuras renales en contacto directo con la orina, como las que forman la barrera de filtración, los diferentes segmentos tubulares, los uréteres o la vejiga. Una proteinuria tipo nefrítica derivada de una clara lesión en la barrera de filtración glomerular, se espera que produzca la aparición de proteínas con un intervalo no específico de pesos moleculares en la orina. Sin embargo, también se puede postular un daño más específico y sutil que produciría solo la aparición de algunas proteínas de peso molecular elevado en la orina. Es de notar que, en el caso de los animales tratados con gentamicina de la presente invención, la mayor parte de proteínas parecían concentrarse alrededor o por debajo del límite superior del tamaño de las proteínas normalmente filtradas (por ejemplo, aproximadamente el tamaño de la albúmina), con relativamente pocas por encima de dicho umbral.
Sin embargo, junto con estas proteínas PME, la excreción de numerosas proteínas de peso molecular bajo (PMB) también aumenta tras el tratamiento con gentamicina (véase la Tabla 6).
Estos datos, en su conjunto, aparentemente indican que esta pauta de gentamicina fuertemente nefrotóxica y dañina para el riñón sólo alteró moderadamente las propiedades de tamizado de la barrera de filtración glomerular, a pesar de producir una marcada insuficiencia renal que se correlaciona con una tasa de fallecimientos de un 50% (Figs 1 y 2).
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La influencia de la reabsorción tubular y de los procesos de secreción sobre la composición final de la orina, no es sólo la consecuencia de los efectos de la gentamicina a nivel tubular. También, la composición del ultrafiltrado altera específicamente la reabsorción de proteínas, supuestamente por procesos de competición. Así, un contenido en proteína específicamente alterado en el ultrafiltrado como resultado de este efecto también modifica específicamente su propio procesado tubular, contribuyendo adicionalmente a un marcador urinario específico de la agresión.
Los resultados mostrados en las Figs 1 y 2 apuntan a una evidente lesión tubular producida por la gentamicina, disminuyendo gravemente la recuperación de proteínas filtradas a nivel tubular (Tabla 2).
En la Tabla 6 se recogen principalmente proteínas PMM y PMB. Como en otras muchas enfermedades renales, la mayor parte de estas proteínas proceden de la sangre, y su excreción urinaria aparece aumentada tras tratamiento con gentamicina, evidenciando un modelo general de reabsorción tubular disminuida.
Las proteínas detectadas de forma diferencial (Tabla 6), comunes a otras enfermedades renales son catepsina B, algunas proteinasas (alfa-1-antitripsina, cistatina C, inhibidor inter-alfa-tripsina, serpina A3L, y varias proteínas de fase aguda y respuesta inmune (alfa-1-microglobulinas, alfa-2-HS-glicoproteína, ceruloplasmina, complemento C3 y C9, haptoglobina, hemopexina, inmunoglobulinas, lisozima C, quininógenos T). El aumento de su excreción podría explicarse por un aumento de la presencia en el ultrafiltrado (no como consecuencia de una hiperfiltración, sino en su lugar debido a sus mayores niveles en sangre) combinado con una reabsorción tubular desequilibrada.
De todas las proteínas detectadas diferencialmente (Tabla 6), el incremento en los valores urinarios de las siguientes proteínas tiene un valor biomarcador con valor diagnóstico de daño renal: proteína Reg3B, fetuina B, Ras-related GTP-binding protein A, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, subunidad gamma de la ATP sintasa, gelsolina, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina-5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3K. Estas proteínas no se han relacionado con anterioridad con la obtención de datos útiles en el diagnóstico de enfermedades renales o en el diagnóstico propiamente dicho. Excepto la gelsolina y serpina A3K, estas proteínas están normalmente ausentes de la sangre. El aumento de cualquiera de dichas proteínas en la orina es el resultado de los eventos que tienen lugar en el riñón por acción de la gentamicina. Además, hay serios candidatos para los que explorar adicionalmente su utilidad en el pronóstico del daño renal y/o en el fallo renal agudo ocasionado por antibióticos aminoglucósidos como por ejemplo la gentamicina.
Además, un análisis proteómico diferencial del córtex del riñón reveló que la gentamicina causa la sobrerregulación de proteínas principalmente relacionadas con (i) gluconeogénesis y glicolisis (por ejemplo, fructosa 1,6-bisfosfatasa y alfa-enolasa); (ii) transporte y metabolismo de ácidos grasos (por ejemplo, proteína de transporte de ácidos grasos, acetil-CoA carbolilasa, metilacil-CoA racemasa); (iii) el ciclo del ácido cítrico (por ejemplo, sucinil CoA sintetasa ATP específica, malato deshidrogenasa); y (iv) respuesta al estrés (por ejemplo, moesina, SPI 1, chaperona molecular tipo adnK). Una excepción es la alfa-enolasa, que también está aumentada en la orina de las ratas del ensayo tratadas con gentamicina (Tablas 4 y 6). Esta divergencia en la modificación del modelo proteico entre el tejido renal y la orina probablemente refleja que la mayor parte de las proteínas biomarcadoras de la presente invención, derivadas del riñón, no son el resultado de un aumento de producción, sino supuestamente de (i) una secreción alterada procedente de células renales, o (ii) tejidos desprendidos o dañados y residuos celulares excretados a la orina.
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TABLA 3 Proteínas identificadas en bandas en SDS-PAGE (electroforesis de 1 dimensión; 1D) en muestras de orina de ratas tratadas con gentamicina respecto de ratas control, donde se tienen en cuenta tanto proteínas presentes en el grupo control gentamicina y ausentes en el control, o viceversa. Las proteínas que también se han identificado en electroforesis de 2 dimensiones (2D) están resaltadas en negrita
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5
6 
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TABLA 4 Proteínas cuyo nivel urinario aumenta o disminuye en el grupo gentamicina con respecto al control, identificadas mediante cromatografía bidimensional (2D)
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9 
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10
TABLA 5 Proteínas cuyo nivel urinario aumenta o disminuye en el grupo gentamicina con respecto al control, identificadas por cromatografía líquida bidimensional (2D-CF)
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TABLA 6 Resumen de las proteínas detectadas en orina aumentadas en su excreción en ratas tratadas con gentamicina respecto de ratas control, mediante separaciones electroforéticas 1D, 2D y/o 2D-CF. Las proteínas resaltadas en negrita son aquellas que no han sido relacionadas previamente con daño renal. Las proteínas están ordenadas alfabéticamente
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16 
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<110> Universidad de Salamanca
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<120> Método para la detección de daño renal
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<130> 1367.34BIS
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<160> 14
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<170> PatentIn version 3.5
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<210> 1
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<211> 175
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 382
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 413
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 298
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 782
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 137
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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34 
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<210> 7
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<211> 408
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 336
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 8
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37
38 
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<210> 9
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<211> 590
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 9
40
41
42 
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<210> 10
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<211> 110
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 119
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 11
44
45 
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<210> 12
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<211> 413
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 12
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46
47 
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<210> 13
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<211> 491
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 13
49
50 
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<210> 14
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<211> 313
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 14
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51
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Claims (36)

1. Método para determinar un daño renal, que comprende:
a.
obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
b.
detectar y/o cuantificar en la muestra obtenida en el paso (a) la proteína Reg3B.
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2. Método según la reivindicación 1, donde se detecta y/o cuantifica la proteína Reg3B de Homo sapiens.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde además comprende detectar y/o cuantificar en la muestra al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
-
fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método según la reivindicación 3, donde se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde además comprende la comparación de los datos obtenidos en el apartado (b) con datos obtenidos de al menos una muestra control para buscar alguna desviación significativa, siendo dicha desviación significativa la presencia de la proteína en la muestra aislada, o una mayor concentración de la proteína en la muestra respecto de una muestra control aislada.
6. Método para la determinación de un daño renal según la reivindicación 5, donde además comprende la atribución de la desviación significativa al desarrollo de dicho daño renal, en el individuo.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el daño renal es un fallo renal agudo.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la muestra biológica del apartado (a) es un fluido biológico.
9. Método según la reivindicación 8, donde el fluido biológico es orina.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la proteína,es detectada y/o cuantificada por medio de electroforesis, immunoensayo, cromatografía y/o tecnología de microarray.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el daño renal es producido por la administración o por la exposición del individuo a, al menos, un agente nefrotóxico.
12. Método según la reivindicación 11, donde el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido.
13. Método según la reivindicación 12, donde el antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el individuo es un humano.
15. Método para determinar la progresión de un daño renal debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico, que comprende:
a.
determinar una primera concentración de la proteína Reg3B, en un fluido biológico aislado de un individuo expuesto o no expuesto a un agente nefrotóxico,
b.
determinar una segunda concentración de la proteína, o cualquiera de sus combinaciones, cuya concentración se ha determinado en el apartado (a) en un fluido biológico del individuo después de determinar la primera concentración en el fluido biológico del individuo expuesto, o después de la iniciación de la administración o exposición al agente nefrotóxico en el individuo no expuesto, y
c.
comparar la segunda concentración obtenida en el apartado (b) con la primera concentración obtenida en el apartado (a) para buscar alguna desviación significativa, siendo dicha desviación significativa la presencia de la proteína en la muestra aislada, o una mayor concentración de la proteína en la muestra respecto de una muestra control aislada.
\newpage
16. Método según la reivindicación 15, donde en el apartado (a) y (b) se detecta y/o cuantifica la proteína Reg3B de Homo sapiens.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, donde además comprende detectar y/o cuantificar en la muestra al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
-
fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Método según la reivindicación 17, donde se detecta y/o cuantifica al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde el daño renal es un fallo renal agudo.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, donde el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido.
21. Método según la reivindicación 20, donde el antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, donde el fluido biológico es orina.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, donde el individuo es un humano.
24. Uso de la proteína Reg3B como biomarcador para determinar un daño renal o para predecir la progresión de un daño renal.
25. Uso según la reivindicación 24, donde la proteína Reg3B es de Homo sapiens.
26. Uso de:
a.
la proteína Reg3B y
b.
de al menos una proteína o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
-
fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
como biomarcadores para determinar un daño renal o para predecir la progresión de un daño renal.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Uso según la reivindicación 26, donde se selecciona al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, de la lista que comprende SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde el daño renal es un fallo renal agudo.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, donde el daño renal o la progresión del daño renal es debido a la administración de, al menos, un agente nefrotóxico.
30. Uso según la reivindicación 29, donde el agente nefrotóxico es un antibiótico aminoglucósido.
31. Kit para determinar un daño renal o para determinar la progresión de un daño renal, en una muestra aislada de un individuo, que comprende, al menos, una o más sondas para la proteína Reg3B.
32. Kit según la reivindicación 31, donde la proteína Reg3B es de Homo sapiens.
33. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, donde además comprende el uso de una o más sondas para al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, seleccionada de la lista que comprende:
-
fetuina B, serpina A3K, subunidad gamma de la ATP sintasa, ribonucleasa UK114, aminoacilasa 1A, alfa-enolasa, queratina 5, parvalbúmina alfa, ribonucleasa 4, serpina A3L, subunidad 1 de COP9, Ras-related GTP-binding protein A.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Kit según la reivindicación 41, donde se selecciona al menos una proteína, o cualquiera de sus combinaciones, de la lista que comprende SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14.
35. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, donde las sondas son fijadas a un soporte sólido.
36. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, donde las sondas son anticuerpos.
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