ES2374603T3

ES2374603T3 - Agentes de unión a kir y procedimientos de uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2374603T3
Application number: ES06701729T
Authority: ES
Inventors: Søren Berg PADKÆR; Peter Andreas Nicolai Reumert Wagtmann; Pieter Spee; Stefan Zahn; Kristian Kjaergaard; Anders Svensson
Original assignee: Novo Nordisk AS; Innate Pharma SA
Current assignee: Novo Nordisk AS; Innate Pharma SA
Priority date: 2005-01-06
Filing date: 2006-01-06
Publication date: 2012-02-20
Anticipated expiration: 2026-01-06
Also published as: EP1836225B1; US9018366B2; CN104829720B; US8222376B2; CN101103043A; ATE531733T1; PT1836225E; EP1836225A1; US8388970B2; JP2008526221A; CY1112897T1; JP2013100320A; DK1836225T3; US20080305117A1; WO2006072626A1; US9708403B2; PL1836225T3; SI1836225T1; CN104829720A; US20160046712A1

Abstract

Un agente anticuerpo que se une a una porción extracelular de un receptor de tipo IgG de Killer humano inhibidor KIR2DL, en la que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las célula NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR.

Description

Agentes de unión a KIR y procedimientos de uso de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a agentes y procedimientos que son capaces de aumentar la muerte mediada por células NK de las células diana reduciendo la señalización inhibidora de KIR. Además, la presente invención se refiere al uso de dichos agentes para la preparación de medicamentos, así como procedimientos de producir anticuerpos e hibridomas y líneas de células transfeccionadas productoras de estos anticuerpos.

Antecedentes de la invención

Las células asesinas naturales (NK) son una subpoblación de linfocitos implicadas en la inmunidad y en el sistema de vigilancia del sistema inmunológico del huésped.

Las células NK son células mononucleares que se desarrollan en la médula ósea a partir de progenitores linfoides y las características morfológicas y las propiedades biológicas normalmente incluyen la expresión de los determinantes de grupos de determinación (cluster) (CD) CD16, CD56, y/o CD57; la ausencia del complejo del TCR alfa/beta o gamma/delta sobre la superficie celular; la capacidad de unirse y matar las células Diana que no expresan las proteínas “propias” del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)/antígeno leucocitario humano (HLA); y la capacidad para matar las células rumórale su otras células enfermas que expresan ligandos para activar los receptores de las NK. Las células NK se caracterizan por su capacidad para unirse y matar a varios tipos de líneas de células tumorales sin la necesidad de inmunización o activación previa. Las células NK también liberan proteínas solubles y citoquinas que ejercen un efecto regulador sobre el sistema inmunitario y pueden sufrir múltiples ciclos de división celular y producir células hijas con propiedades biológicas similares a las de la célula parental. Tras la activación mediante interferones y/o citoquinas, las células NK participan en la lisis de las células tumorales y de células infectadas por patógenos intracelulares mediante mecanismos que requieren contactos físicos directos entre la células NK y la célula diana. La lisis de las células diana implica la liberación de gránulos citotóxicos a partir de la célula NK sobre la superficie de la diana a la que se ha unido y las proteínas efectoras, como la perforina y la granzima B atraviesan la membrana plasmática diana e inducen apoptosis o muerte celular programada. Las células sanas normales están protegidas de la lisis por las células NK.

En base a sus propiedades biológicas, en la técnica se han propuesto varias estrategias terapéuticas y vacunales que residen en una modulación de las células NK. No obstante, la actividad de las células NKK está regulada por un complejo mecanismo que implica señales tanto estimuladoras como inhibidoras.

Brevemente, la actividad lítica de las células NK está regulada por varios receptores de superficie celular que translucen señales intracelulares positivas o negativas tras la interacción con ligandos sobre la célula diana. El equilibrio entre señales positivas y negativas transmitidas a través de estos receptores determina si una célula diana es o no lisada (eliminada) por una célula NK. Las señales estimuladoras de las células NK pueden estar mediadas por los Receptores de Citotoxicidad Natural (NCR), como NKp30, NKp44 y NKp46; así como por los receptores CD94/NKG2C, los receptores NKG2D, ciertos receptores similares a Ig activadores de las asesinas (KIR) y otros receptores activadores de NK (Lanier, Annual Review of Immunology 2005;23:225-74). Las señales inhibidoras de las células NK puede estar mediadas por receptores como Ly49, CD94/NKG2A, así como ciertos KIR inhibidores que reconocen las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I (Kärre y col., Nature 1986;319:675-8; Öhlén y col., Science 1989;246:666-8). Estos receptores inhibidores se unen a determinantes polimórficos de las moléculas de MHC de clase I (incluido el HLA de clase I) presentes sobre otras células e inhiben la lisis mediada por las células NK.

Los KIR se han caracterizado en seres humanos y primates no humanos y son moléculas transmembrana de tipo 1 polimórficos presentes sobre ciertas subpoblaciones de linfocitos, incluidas las células NK y algunas células T. Los KIR interaccionan con determinantes en los dominios alfa 1 y alfa 2 de las moléculas de MHC de clase I y, como se ha descrito anteriormente, distintos KIR son estimuladores o inhibidores para las células NK.

La nomenclatura para los KIR se basa en el número de dominios extracelulares (KIR2D y KIR3D tienen dos y tres dominios extracelulares de Ig, respectivamente) y su la cola citoplasmática es larga (KIR2DL o KIR3DL) o corta (KIR2DS o KIR3DS). La presencia o ausencia de un KIR dado es variable de una célula NK a otra dentro de la población NK presente en un único individuo. Entre los seres humanos también hay un nivel relativamente alto de polimorfismo de los genes de KIR, estando presentes ciertos genes de KIR en algunos, pero no en todos, individuos. La expresión de los alelos de KIR sobre las células NK está regulada estocásticamente, lo que significa que, en un individuo dado, un linfocito dado puede expresar uno, dos o más KIR diferentes según el genotipo del individuo. Las células NK de un único individuo normalmente expresan diferentes combinaciones de KIR, lo que les proporciona un repertorio de células NK con especificidades diferentes por las moléculas de MHC de clase I.

Ciertos productos del gen de KIR producen estimulación de la actividad linfocitaria cuando se unen a un ligando adecuado. Los KIR de activación tienen todos una cola citoplasmática corta con un residuo transmembrana cargado que se asocia con una molécula adaptadora que tiene motivos de activación basados en inmunorreceptores de tirosina (ITAM) que transducen las señales estimuladoras a la células NK. Por el contrario, los KIR inhibidores tienen una cola citoplasmática larga que contiene motivos de activación basados en inmunorreceptores de tirosina (ITAM) que transducen las señales inhibidoras a la célula NK a través de la unión de sus ligandos del MHC de clase I. Se ha dado a conocer que la mezcla de células NK con células de insecto que expresan HLA-C era suficiente para inducir la agrupación de KIR y la fosforilación de KIR y de SHP-1 (Faure y col., J Immunol 2003; 170:6107-6114). También se ha dado a conocer que KIR2DL1 se dimerizaba en presencia de Co(2+) y la sustitución del residuo His en aminoterminal por Ala anuló la capacidad de KIR2DL1 para unirse a Co(2+) (Fan y col., J. Biol. Chem. 2000. 98:1734).

Los KIR inhibidores conocidos incluyen miembros de las subfamilias de KIR2DL y KIR3DL. Los KIR inhibidores que tienen dos dominios Ig (KIR2DL) reconocen los alotipos de HLA-C: KIR2DL2 (antes denominado p58.2) y el producto génico alélico estrechamente relacionado KIRDL3 reconocen los alotipos de HLA-C de "grupo 1" (incluidos HLA-Cw1, -3, -7, y -8), mientras que KIR2DL1 (p58.1) reconoce los alotipos de HLA-C de “grupo 2” (tales como as HLA-Cw2, -4, -5 y -6). El reconocimiento por KIR2DL1 está dirigido por la presencia de un residuo Lys en la posición 80 de los alelos de HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 está dirigido por la presencia de un residuo Asn en la posición 80 en el HLA-C. Es importante el hecho de que la gran mayoría de alelos de HLA-C tienen un residuo Asn o Lys en la posición 80. Por tanto, KIR2DL1, -2 y -3 reconocen en conjunto esencialmente todos los alotipos de HLA-C encontrados en los seres humanos. Un KIR con tres dominios Ig, KIR3DL1 (p70), reconoce un epítopo compartido por los alelos HLA-Bw4. Por último, KIR3DL2 (p140), existente de forma constitutiva como un homodímero unido por puentes disulfuro de moléculas con tres dominios de IG reconoce HLA-A3 y -A11.

Aunque múltiples KIR inhibidores y/o otros receptores inhibidores específicos del MHC de clase I (Moretta y col., Eur J Immunogenet 1997;24(6):455-68; Valiante y col., Immunol Rev 1997;155:155-64; Lanier, Annu Rev Immunol 1998;16: 359-93) pueden estar co-expresados por las células NK, en cualquier repertorio de NK individual dado hay células que sólo expresan un único KIR y, por tanto, sólo son inhibidas por alelos específicos del MHC de clase I (o alelos pertenecientes al mismo grupo de alotipos del MCH de clase I). Las moléculas del MCH de clase I humanas a menudo se denominan antígeno de histocompatibilidad humano (HLA) de clase I.

Se ha mostrado que las poblaciones o clones de células NK con fallos en la unión KIR-ligando con respecto a sus dianas, es decir que expresan KIR que no reconocen ninguna molécula del HLA de un huésped, participan en las potentes respuestas antitumorales que pueden salvar la vida que se producen tras un transplante alogénico de médula ósea en pacientes de leucemia (Ruggeri y col., Science 2002,295: 2097-2100). El mecanismo subyacente se cree que es que el transplante hematopoyético con apareamientos erróneos de HLA condice a la expansión de células NK derivadas de donantes que expresan KIR que no reconocen ningún ligando de HLA en el receptor y, por tanto, no son inhibidos por la vía del KIR. Estos clones alogénicos de NK ejercen una potente actividad antitumoral. Esta respuesta es muy fuerte en pacientes con diagnóstico de leucemia mieloide aguda (LMA) y tratados con transplantes de haplotipo idéntico con apareamiento erróneo KIR-MHC. Un modo de reproducir este efecto mediante tratamiento farmacológico de un paciente sería administrar reactivos que bloquean la interacción KIR/HLA para activar las células NK endógenas del paciente.

Se ha demostrado que ciertos anticuerpos monoclonales específicos de KIR2DL1 bloquean la interacción de KIR2DL1 con los alotipos de “HLA-C” del “grupo 2", tal como HLA-Cw4 (Moretta y col., J Exp Med 1993;178:597604), y que estimulan la lisis mediada por NK de las células diana que expresan dichos alotipos de HLA-C. También se han descrito anticuerpos monoclonales contra KIR2DL2/3 que bloquean su interacción de KIR2DL2/3 con HLA-Cw3 o alotipos similares (Moretta y col., J Exp Med 1993; 178: 597-604). Moretta y col. (J. Exo. Med 1990; 171:695714), Pascale y col. (Eur. J. Immunol. 2004: 34: 2930-2940). Dorothee y col. (Oncogene 2003: 22:7192-7298). Epling-Burnette y col. (Blood 2004: 103(9):3431-3439). Lee y col. (PNAS USA 1998; 95:5199-5204); y Wagtmann y col. (Immunity 1995; 3:801-809) hacen referencia a varios anticuerpos, incluido EB6, GL183. ZIN276, HP-3E4. CH-L, NKB1, Z27 y DX9, que bloquean la interacción de KIR2DL2/3 con HLA-Cw3, así como los anticuerpos Q66 y 5.133, que no estaban disponibles como anticuerpos conocidos. Watzl y col. (Tissue Antigens 2000;56: 240-247) produjeron anticuerpos murinos de reacción cruzada que reconocen múltiples isotipos de KIR pero estos anticuerpos no potencian la actividad lítica de las células NK. Además, Spaggiari y col. (Blood 2002;99:1706-1714 y Blood 2002;100: 4098-4107) llevaron a cabo experimentos usando anticuerpos monoclonales murinos contra varios KIR. Uno de estos anticuerpos, NKVSF1 (también conocido como Pan2D), se dio a conocer que reconocía un epítopo común de KIR2DL1 (CD158a), KIR2DL2 (CD158b) y KIR2DS4 (p50.3). Shin y col. (Hybridoma 1999;18:521-7) también dio a conocer la producción de dos anticuerpos monoclonales, denominados 190llC311. 190llC611. A210 y A803g, capaces de unirse a todos KIR2DL1, KIR2DL3 y KIR2DS4. Ninguno de estos interfirió en la unión entre KIR y HLA-C ni fue capaz de bloquear la señalización de KIR inhibidora.

Los documentos WO2005003172, WO2005003168 y WO2005009465 describen KIR2DL1 y KIR2DL2/3 anticuerpos de reacción cruzada, tales como, por ejemplo DF200, 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5, y 1-6F1, y que DF200 y 1-7F9 potencian la citotoxicidad de las células NK.

El documento WO0050081 describe un procedimiento para desensibilizar, por ejemplo, un receptor de célula B o de célula NK poniéndolo en contacto con un compuesto regulador que inhiba la asociación con un componente transductor.

El documento WO0002583 describe procedimientos de tratar, por ejemplo, la psoriasis bloqueando la unión de un receptor de células NK-T a una molécula de MHC.

Los documentos WO9849292 y WO2005060375 se refieren, en general, a KIR u otros receptores de células NK y a anticuerpos de los mismos.

No obstante, los esfuerzos previos para aislar agentes, tales como anticuerpos, capaces de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK se han centrado en el bloqueo de la interacción de KIR con su correspondiente molécula de HLA, tal como, por ejemplo, HLA-C. Sigue existiendo la necesidad de dianas alternativas para agentes terapéuticos capaces de activar las células NK.

La presente invención proporciona dichas dianas nuevas, así como nuevos agentes de unión a dichas dianas, y nuevos procedimientos de uso de las mismas.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de nuevos agentes que se unen a determinantes de uno o más KIR inhibidores humanos y producen potenciación de las células NK que expresan al menos uno de dichos productos génicos de KIR mediante un nuevo mecanismo que no implica bloquear la unión entre KIR y su ligando HLA-C. En una realización, los agentes reducen la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR que, a su vez, produce potenciación de la actividad de las células NK.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente invención proporciona un agente anticuerpo que se une a una porción extracelular de un receptor de tipo IgG de Killer humano inhibidor (KIR), en la que el agente reduce la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las célula NK sin reducir de forma detectable la unión entre KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR. En una realización, el agente reduce la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la agrupación de KIR. En otra realización, el agente también, o como alternativa, reduce la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR.

En una realización, el agente reduce o bloquea la interacción entre los sitios de interacción asociados con el Dominio

1. Se divulga el sitio de interacción asociado con el dominio 1 que comprende al menos un residuo de aminoácido correspondiente a, por ejemplo, uno de los residuos 1-92 de la SEC ID Nº 14. Por ejemplo, el sitio de interacción asociado con el Dominio 1 puede comprender al menos un residuo de aminoácido correspondiente a H1, E2, H5, R6, D31, V32, M33, F34, E35, H36, H50, D57, G58, V59, V83, T84, H85, S86, Q89, L90, S91 o A92.

En otra realización, el agente reduce o bloquea la interacción entre los sitios de interacción asociados con el Dominio 2. Se divulga el sitio de interacción asociado con el dominio 2 que comprende al menos un residuo de aminoácido correspondiente a, por ejemplo, uno de los residuos 108-200 de la SEC ID Nº 14. Por ejemplo, el sitio de interacción asociado con el Dominio 2 puede comprender al menos un residuo de aminoácido correspondiente a P108, S109, L110, S111, A112, Q113, P114, L114, G115, T125, S127, S129, R131, K155, V156, N157, G158, T159, Q161, A162, D163, S192, D193, P194, L195, L196, V197, S198, V199 o T200. Por ejemplo, el sitio de interacción asociado con el Dominio 2 de KIR2DL1 puede comprender residuos de aminoácidos L110, S111, A112, Q113, P/L114 (lo que indica que el residuo 114 puede ser P o L) y L195.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el agente proporcionado por la invención puede, por ejemplo, reducir o bloquear al menos una homodimerización, heterodimerización, o ambos, entre los miembros de la familia KIR. Por ejemplo, el agente puede reducir o bloquear la homodimerización de KIR2DL1.

El agente puede ser cualquier compuesto adecuado, tal como, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo. El fragmento de anticuerpo se puede seleccionar de, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento Fab’-SH, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo, un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla y un anticuerpo multiespecífico. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, humanizado o quimérico, o el fragmento de anticuerpo derivado de dicho anticuerpo.

En una realización, el agente es un agente de unión a KIR transreactivo, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-KIR transreactivo o un fragmento de unión del mismo. El agente puede, por ejemplo, unirse a cada uno de KIR2DL1 y KIR2DL. En una realización, el agente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo que una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18. En una realización alternativa, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia de VL de la SEC ID Nº

18.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un agente de acuerdo con la invención para usar como medicamento.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente de acuerdo con la invención en una cantidad eficaz para potenciar de forma detectable la citotoxicidad de las células NK en un paciente y uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En una realización, la formulación farmacéutico comprende además un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente antiangiogénico, un agente apoptótico y un anticuerpo que bloquea la unión de HLA a un receptor de KIR inhibidor.

En otro aspecto, la invención divulga un procedimiento de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de células NK poniendo en contacto una célula NK con una cantidad eficaz de un agente de acuerdo con la invención. El agente puede, por ejemplo, reducir o bloquear la dimerización de KIR. El agente puede ser también un anticuerpo monoclonal anti-KIR o un fragmento de unión del mismo. En una realización, el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. En otra realización, el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un agente de acuerdo con la invención la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer, una enfermedad infecciosa, una infección vírica o un trastorno inmunitario. En una realización, el medicamento es para tratar un cáncer. En esta realización, el cáncer puede seleccionarse de, por ejemplo, leucemia mieloide aguda y crónica (LMA y LMC), leucemia linfoide aguda (LLA), síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin (NHL), mieloma múltiple, carcinoma de células renales, melanoma maligno y cáncer colorrectal. En una realización alternativa, el medicamento es para tratar una infección vírica causada por un virus seleccionado del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus Ébola.

En otro aspecto, la invención divulga un procedimiento para el tratamiento de cáncer, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto que sufre cáncer una cantidad eficaz de un agente de acuerdo con la invención. El agente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-KIR monoclonal transreactivo humano, humanizado

o quimérico, o el fragmento de unión del mismo. En una realización, el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. En otra realización, el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. El procedimiento puede comprender además administrar un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente antiangiogénico, un agente apoptótico y un anticuerpo que bloquea la unión de HLA a un receptor de KIR inhibidor.

En otro aspecto, la invención proporciona un agente capaz e neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK por medio de: a) proporcionar un conjunto in vitro de anticuerpos candidatos; b) seleccionar cualquier anticuerpo candidato que se une o interacciona con la porción extracelular de un KIR inhibidor; y c) seleccionar cualquier agente candidato de la etapa b) que sea capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión entre el KIR inhibidor y un ligando de HLA de clase I del KIR, en el que el orden de las etapas b) y c) opcionalmente se invierten. En una realización, el procedimiento comprende además una etapa de seleccionar un agente de unión a KIR transreactivo. El agente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal un fragmento de unión del mismo.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo aislado o un fragmento de unión del anticuerpo que es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK, que comprende las etapas de: a) inmunizar un animal no humano con una composición inmunogénica que comprende al menos una porción extracelular de un KIR; b) preparar anticuerpos del animal inmunizado, en el que los anticuerpos se unen al KIR; c) seleccionar un anticuerpo aislado de b) que es capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión entre el KIR inhibidor y un ligando de HLA de clase I del KIR; y d) preparar, opcionalmente, un fragmento de unión del anticuerpo.

En oro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo de KIR2DL1 como anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región H1 de CDR correspondiente a los residuos 31-35 de la SEC ID Nº 17, una H2 de CDR correspondiente a los residuos 50-66 de la SEC ID Nº 17, una H3 de CDR correspondiente a los residuos 99-108 de la SEC ID Nº 17; una L1 de CDR correspondiente a los residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18, una L2 de CDR correspondiente a los residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18 y una L3 de CDR correspondiente a los residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18. En otra realización, secuencia el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 comprende una secuencia de VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº

18.

En oro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo de KIR2DL1 como anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región H1 de CDR correspondiente a los residuos 31-35 de la SEC ID Nº 21, una H2 de CDR correspondiente a los residuos 50-66 de la SEC ID Nº 21, una H3 de CDR correspondiente a los residuos 98-103 de la SEC ID Nº 21; una L1 de CDR correspondiente a los residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18, una L2 de CDR correspondiente a los residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18 y una L3 de CDR correspondiente a los residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18. En otra realización, secuencia el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 comprende una secuencia de VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº

18.

La invención también proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento de unión del anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, in vector de expresión que comprende dicha secuencia de nucleótidos, una célula huésped aislada transfeccionada con dicho vector y un procedimiento de producir un anticuerpo que comprende cultivar dicha célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo.

Éstos y otros aspectos de la invención se describen en las secciones siguientes.

Descripción de los dibujos

La Figura 1ª ilustra la localización del sitio de interacción asociad con el dominio 1 sobre la estructura de KIR2DL1 (1NKR.pdb) con vistas frontal (D1 izquierda, D2 derecha), arriba (D1 izquierda, D2 derecha) y detrás (D2 izquierda D1 derecha) respectivamente. La Figura 1B ilustra la localización del sitio de interacción asociad con el dominio 2 sobre la estructura de KIR2DL1 (1NKR.pdb) con vistas frontal (D1 izquierda, D2 derecha), arriba (D1 izquierda, D2 derecha) y detrás (D2 izquierda D1 derecha) respectivamente. La Figura 1C muestra un modelo de agrupación de KIR2DL1-HLACw4 en la interfaz entre las células NK y la célula diana. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que tras la unión de KIR2DL1 (gris oscuro) a HLACw4 (gris claro), primer se forma un grupo de dímeros KIR2DL1-HLACw4. Los dímeros pueden formar interacciones D1-D1 y D2-D2, tal como se ilustra, para crear una agrupación de los dímeros en la interfaz entre la célula NK y la célula diana.

Las Figuras 2A-2H muestran alineación de las secuencias de KIR2DL1 (SEC ID Nº 1), 2DL2 (SEC ID Nº 2), 2DL3 (SEC ID Nº 3), 2DL4 (SEC ID Nº 4), 2DS1 (SEC ID Nº 5), 2DS2 (SEC ID Nº 6), 2DS3 (SEC ID Nº 7), 2DS4 (SEC ID Nº 8) y 2DS5 (SEC ID Nº 9) con indicación de los correspondiente residuos de los sitios de interacción asociados con el Dominio 1 y el Dominio 2.

Las Figuras 3A-2H muestran alineación de las secuencias de 3DL1 (SEC ID Nº 10), 3DL2 (SEC ID Nº 11), 3DL3 (SEC ID Nº 2), 3DS1 (SEC ID Nº 13) y 2DL1 (SEC ID Nº 1),con indicación de los correspondiente residuos de los sitios de interacción asociados con el Dominio 1 y el Dominio 2.

La Figura 4 muestra dos moléculas de KIR2DL1 de simetría relacionada (X, Y Z e Y, X, 1/3-Z, respectivamente) en el envase de cristal de la estructura de KIR2DL1/1-7F9 Fab’ (análisis REF). La primera molécula de KIR2DL1 se indica en la representación de un tubo gris junto con una representación de superficie de los residuos implicados en la interacción del dímero con la segunda molécula. La segunda molécula de KIR2DL1 se indica en una representación de lazo sólido negro.

La Figura 5 muestra la detección selectiva primaria de los anticuerpos monoclonales específicos de KIR (AcMo) mediante citometría de flujo. Las células YTS (A) e YTS-2DL1 (B) se incubaron con sobrenadantes de cultivo tisular procedentes de hibridomas derivados de ratones inmunizados con KIR2DL1. La unión del Ab se detectó con fragmentos Ab secundarios conjugados a ACP específicos de igG de ratón, que se visualizó mediante citometría de flujo (FACSarray). Los histogramas representan la unión específica del anticuerpo anti-KIR del hibridoma 1-26F117 a células YTS-2DL1 que expresan KIR2DL1, pero no a células YTS negativas para KIR2DL1.

La Figura 6 muestra la lisis de las células diana 721.221-Cw4 de LCL mediante células YTS-2DL1 NK en ausencia o presencia de AcMo anti-KIR, como se ha indicado. Las células YTS-2DL1 específicas de KIR2DL1 se preincubaron con sobrenadantes de cultivo tisular de hibridomas subclonados seleccionados productores de AcMo que reconocen al menos KIR2DL1 y -3. La capacidad de estas células para matar células LCL 721.221-Cw4 marcadas con 51Cr se midió después en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51Cr (proporción E:T= 6:1). En ausencia de anticuerpos anti-KIR, -5 % de las células diana murieron, mientras que el AcMo humano transreactivos 1-7F9 indujo aproximadamente un 25 % de muerte específica. Los AcMo 1-26F117-A3 y -A4 transreactivos recién identificados indujeron específicamente la muerte, lo que muestra que éstos son AcMo inhibidores de KIR, capaces de reducir la inhibición de la citotoxicidad de las células NK mediada por KIR.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de competición que analizan la unión de KIR2DL1 a HLA-Cw4 en presencia de varios AcMo anti-KIR. KIR2DL1-hFc (20 !g/ml, concentración final) se preincubó en presencia o ausencia de sobrenadantes de hibridomas anti-KIR subclonados o en presencia de anticuerpos control. La unión de las KIR2DL1-hFc a las células HLA-Cw4 en LCL 721.221-Cw4 se estudió después usando citometría de flujo (FACSarray). En presencia de un AcMo que interfiere con la unión de KIR-HLA, menos KIR2DL1-hFc se une a las células LCL 721.221-Cw4 en comparación con la unión de KIR2DL1-hFc en ausencia de AcMo, lo que tiene como resultado un desplazamiento hacia la izquierda sobre el eje X en el gráfico de puntos. (A) Cuando se preincubaron con DF200, la unión KIR2DL1-hFc a HLA-Cw4 compitió de un modo dependiente de la dosis DF200, mientras que la unión KIR2DL1-hFc no compitió con el AcMo específico de KIR2DL2 GL183 (controles). Cuando se preincubó con 126F117-A3 (B) o 1-26F117-A4 (C), no se impidió la unión de KIR2DL1-hFc a HLA-Cw4. En su lugar, las células LCL 721.221-Cw4 se unieron mediante complejos KIR2DL1-hFc/1-26F117-A3 o KIR2DL1-hFc/1-26F117-A4, como se indica mediante una tinción doble positiva de LCL 721.221-Cw4 en los gráficos de puntos, lo que confirma que HLA-Cw4 y 1-26F117-A3, o HLA-Cw4 y 1-26F117-A4 se pueden unir de forma simultánea a KIR2DL1- (D) Control (sin AcMo).

La Figura 8 muestra los resultados de un experimento similar al de la Figura 7, con concentraciones crecientes de 126F117 purificado. Los resultados confirman que los anticuerpos producidos por el clon 1-26F117 no afectaron a las interacciones KIR/HLA-Cw4. (A) 2 !g/ml. (B) 10 !g/ml. (C) 20!g/ml. (D) 50 !g/ml. (E) Unión de KIR2DL1-hFc en ausencia de AcMo (control).

(F) Unión de fondo de anticuerpos secundarios en ausencia de KIR2DL1-hFc y AcMo primarios.

DEFINICIONES

Un "agente", como se divulga en la presente invención, comprende moléculas pequeñas, polipéptidos, proteínas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Moléculas pequeñas, en el contexto de la presente invención, quiere decir en una realización, agentes químicos con un peso molecular inferior a 1000 dalton, particularmente menor de 800 dalton, más particularmente menor de 500 dalton.

Con el término “polipéptido” no se pretende hacer referencia a una longitud específica del producto codificado y, por tanto, abarca péptidos, oligopéptidos y proteínas. El polipéptido puede también se una variante alélica natural o sometida a ingeniería de un polipéptido, así como proteínas en general.

Con el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento se pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina que tienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (p. ej., KIR). A menos que se indique lo contrario o esté claramente contradicho por el contexto, el término "anticuerpo" incluye, entre otros, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos humanos y no humanos; así como formas humanizadas y quiméricas de anticuerpos no humanos.

Con la expresión "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento se quiere decir una molécula que comprende uno o más fragmentos de anticuerpo que conserva la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (p. ej., KIR). Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “fragmento de anticuerpo” incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente compuesto por los dominios VL, VH, CL y CH I; (ii) fragmentos F(ab)2 y F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y coI., Nature (1989) 341 :544-546) que consta de un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, (vi) Fv de una sola cadena (scFv) (véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426: y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883); (vii) diacuerpos, que son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica pero usando un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando de este modo a que los dominios se apareen con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y coI., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., y col. (1994) Structure 2:1121-1123); y (viii) anticuerpos monovalentes compuestos por uno de los pares de cadena pesada-cadena ligera (anticuerpos de algunas subclases de IgG, tal como, por ejemplo, IgG4, se sabe que se “dividen” espontáneamente en dos fragmentos monovalentes).

Con la expresión “derivado de anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se pretende designar una variante de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo que conserva la capacidad de la molécula parental para unirse específicamente a un antígeno (p. ej., KIR), en el que uno o más de los aminoácidos de la molécula parental se han modificado químicamente mediante, por ejemplo, alquilación, PEGilación, acilación formación de éster o formación de amida. Esto incluye, entre otros, anticuerpos PEGilados, PEGilados-cisteína y variantes de los mismos.

En el contexto de la presente invención, “se une” o “interacciona” o “reacciona” significan cualquier unión de un agente (p. ej., un anticuerpo) a su determinante (p. ej., un epítopo) con una constante de disociación Kd inferior a 104 M. Los términos se une” o “interacciona” o “reacciona” o “que se une” o “que interacciona” o “que reacciona” se usan, cuando sea adecuado, de forma intercambiable con las expresiones “se une específicamente, “interacciona específicamente” o “reacciona específicamente”. Las interacciones incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces hidrofóbicos y enlaces iónicos.

Dentro del contexto de la presente divulgación, la expresión “agente que se une” a un determinante designa un agente que se une a dicho determinante con especificidad y/o afinidad. Un anticuerpo que se une a dicho determinante designa un anticuerpo que se une con especificidad y/o afinidad.

La expresión “que reduce o bloquea la dimerización” deberá entenderse como el proceso de interferir o evitar o disminuir la dimerización de los receptores KIR en la superficie de las células.

“Dimerización” de KIR, como se usa en el presente documento, comprende la heterodimerización, que significa dimerización entre dos miembros diferentes de la familia KIR, y homodimerización, lo que significa la formación de dímeros de dos miembros idénticos de la familia KIR.

El término “afinidad”, como se usa en el presente documento, significa la fuerza de la unión de un anticuerpo a un epítopo. La afinidad de un anticuerpo la proporciona la constante de disociación Kd, definida como [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], en la que [Ab-Ag] es la concentración molar del complejo anticuerpo-antígeno, [Ab] es la concentración molar del anticuerpo no unido y [Ag] es la concentración molar del antígeno no unido. La constante de afinidad Ka se define como 1/Kd. Procedimientos preferidos para determinar la afinidad de los AcMo se pueden encontrar en Harlow, y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan y col., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), y Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983). Un procedimiento preferido y convencional bien conocido en la técnica para determinar la afinidad de los AcMo es el uso de instrumentos Biacore.

Dentro del contexto de la presente invención, un “determinante” designa un sitio de interacción o unión que es compartido por varios productos génicos de la familia génica de KIR humanos.

El término “epítopo” se define como un determinante antigénico y es el área o región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Un epítopo proteico puede comprender residuos de aminoácidos implicados directamente en la unión, así como residuos de aminoácidos que están bloqueados eficazmente por el anticuerpo o péptido de unión al antígeno específico, es decir residuos de aminoácidos dentro de la “huella” del anticuerpo. Es la forma más simple o área estructural más pequeña sobre una molécula antigénica compleja que puede combinarse con un anticuerpo o un receptor (tal como, por ejemplo, un receptor de linfocito T). Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales/estructurales.

La expresión “epítopo lineal” se define como un epítopo compuesto por residuos de aminoácidos que son contiguos sobre la secuencia lineal de aminoácidos (estructura primaria). La expresión ”epítopo conformacional o estructural” se define como un epítopo compuesto por residuos de aminoácidos que no todos son contiguos y, por tanto, representa partes separadas de la secuencia lineal de aminoácidos que entran en proximidad entre sí plegando la molécula (estructuras secundaria, terciaria y/o cuaternaria). Un epítopo conformacional depende de la estructura tridimensional. Por tanto, el término “conformacional” a menudo se usa de forma intercambiable con “estructural".

La expresión “péptido de unión a anticuerpo” se define como un péptido que se une con una afinidad suficientemente alta a los anticuerpos.

El término “inmunógeno” es una sustancia que es capaz de inducir un anticuerpo humoral y/o respuesta inmunitaria mediada por células, en lugar de inducir tolerancia inmunológica. En ocasiones, el término “inmunógeno” se usa de forma intercambiable con “antígeno”, aunque el término especifica la capacidad para estimular una respuesta inmunitaria así como para reaccionar con sus productos, por ejemplo el anticuerpo. Por el contrario, algunos reservan "antígeno" para indicar una sustancia que reacciona con anticuerpo. Los inmunógenos principales son proteínas y polisacáridos, libres o unidos a microorganismos.

El término “inmunogénico” significa una capacidad para inducir un anticuerpo humoral y/o capacidad para una respuesta inmunitaria mediada por células.

Como se usa en el presente documento, un “Receptor de tipo Ig Killer” o “KIR” se refiere a una proteína o polipéptido codificado por un gen que es un miembro de la familia de genes KIR o por un ADNc preparado a partir he dicho gen. Una revisión detallada de la familia de genes KIR, incluida la nomenclatura de genes KIR y productos génicos KIR, y los números de registro en Genbank para KIR de ejemplo, se proporciona en "The KIR Gene Cluster" de M. Carrington y P. Norman, disponible en el sitio web de NCBI denominado "Bookshelf" (al que se puede acceder a través de la dirección en la red (WWW) ncbi.nlm.nih.gov/books). Las secuencias de los genes y ADNc KIR humanos, así como sus productos proteicos, están disponibles en las bases de datos públicas, incluida GenBank. Ejemplos no limitantes de entradas en GenBanl de genes humanos pertenecientes a la familia de genes humanos KIR tienen los números de registro siguientes: KIR2DL1: números de registro en Genbank U24076, NM_014218, AAR16197 o L41267; KIR2DL2: números de registro en Genbank U24075 o L76669; KIR2DL3: números de registro en Genbank U24074 o L41268; KIR2DL: número de registro en Genbank X97229; KIR2DS1: número de registro en Genbank X89892; KIR2DS2: número de registro en Genbank L76667; KIR2DS3: números de registro en Genbank MM_012312 o L76670 (variante de corte y empalme); KIR3DL1: número de registro en Genbank L41269; y KIR2DS4: número de registro en Genbank AAR26325.

5 Un KIR puede comprender de 1 a 3 dominios extracelulares y puede tener una cola citoplasmática larga (es decir, más de 40 aminoácidos) o corta (es decir, menos de 40 aminoácidos). Como se ha descrito previamente en el presente documento, estas características determinan la nomenclatura de un KIR. Proteínas KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de ejemplo comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos respectivas que representan sus dominios extracelulares.

10 Dominio extracelular de KIR2DL1:

en el que “X” en la posición 16 es P o R, y en el que “X” en la posición 114 es P o L, que representa variantes alélicas. Dominio extracelular de KIR2DL2:

Dominio extracelular de KIR2DL3:

El término "KIR2DL" hace referencia a una molécula de KIR que es una molécula KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 o KIR2DL4.

El término "KIR2DL2/3" hace referencia a una o a los dos receptores KIR2DL2 y KIR2DL3. Estos dos receptores

20 tienen una homología muy alta, son formas alélicas del mismo gen y se consideran en la técnica que son funcionalmente similares.

A menos que se especifique lo contrario, el término “MHC” abarca moléculas de MHC en todos los mamíferos, mientras que una molécula de "HLA" hace referencia a una molécula de MHC humana.

Un agente de unión a KIR “transreactivo” es un agente que se une a más de una molécula de KIR. Por ejemplo, un 25 “anticuerpo anti-KIR “transreactivo” es un anticuerpo que se une específicamente a más de una molécula de KIR.

“Unión específica” o “especificidad” hace referencia a la capacidad de un anticuerpo u otro agente a unirse de forma detectable a un epítopo presentado sobre un antígeno al tiempo que tiene una reactividad relativamente poco detectable con otras proteínas o estructuras (tales como oras proteínas presentadas sobre las células NK o sobre otros tipos de células). La especificidad se puede determinar relativamente mediante ensayos de unión o de unión

30 competitiva, por ejemplo instrumentos Biacore. La especificidad puede exhibirse por una proporción de afinidad/avidez de, por ejemplo, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1, 10.000:1 o mayor en la unión al antígeno específico y la unión no específica a otras moléculas irrelevantes. Un anticuerpo de unión a KIR específico de un KIR humano puede, en ocasiones, exhibir la unión específica a KIR similares de otras especies.

35 La frase de que un primer anticuerpo se une “sustancialmente” o “al menos parcialmente” al mismo epítopo que un segundo anticuerpo significa que el sitio de unión a epítopo del primer anticuerpo comprende al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o más de los residuos de aminoácidos sobre el antígeno que constituyen el sitio de unión a epítopo del segundo anticuerpo.

La capacidad de un anticuerpo anti-KIR para “bloquear” la unión de una molécula KIR a una molécula de HLA significa que el anticuerpo, en un ensayo que usa moléculas de KIR y HLA solubles o asociadas a la superficie celular, puede reducir de forma detectable la unión de una molécula de KIR a una molécula de HLA de un modo dependiente de la dosis, en la que la molécula de KIR se une de forma detectable a la molécula de HLA en ausencia del anticuerpo. Ensayos de ejemplo para determinar si un anticuerpo anti-KIR es capaz de dicho bloqueo se proporcionan en los Ejemplos.

La capacidad de un agente para “reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad producida por células NK”

: o “potenciar la citotoxicidad producida por células NK” significa que una célula NK que expresa un KIR, cuando entra en contacto con el anticuerpo, es más capaz de lisar las células diana que expresa sobre su superficie una MHC o HLA de clase I concreta (que es un ligando de dicho KIR) en presencia del agente, en comparación con un control. La “reducción de la inhibición” o “potenciación” significa cualquier incremento detectable en la citotoxicidad producida por las células NK, incluido al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 40 %, al menos 70 %, al menos 100 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, o más o, por ejemplo aproximadamente 50-100 %, aproximadamente 100-500 %, o aproximadamente 100 - 2000 % más, o al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10, o al menos aproximadamente 20 veces mayor en comparación con un control Esto se puede medir en un ensayo adecuado, por ejemplo un ensayo de citotoxicidad en el que un número mayor de células diana son lisadas por las células NK en presencia del agente que en ausencia del agente (es decir, el control). Por ejemplo, la capacidad del agente para incrementar de forma detectable la lisis específica se puede analizar mediante, por ejemplo, un ensayo clásico de liberación de cromo de la citotoxicidad, en comparación con el niveles de lisis específica obtenida sin el anticuerpo cuando una población de células NK que expresa un KIR dado entran en contacto con las células diana que expresan la molécula de MHC de clase I afín (reconocida por el KIR expresado sobre la célula NK). Como alternativa, el término “reducir la inhibición mediada por KIR” significa que, en un ensayo de cromo con un clon de células NK que expresa uno o varios KIR, y una célula diana que expresa sólo un alotipo de HLA reconocido por uno de los KIR del clon de NK y ninguna otra molécula de HLA de clase I reconocida por los otros KIR sobre el clon de NK, el nivel de citotoxicidad obtenido con el anticuerpo deberá ser al menos 60 %, preferentemente al menos 70 % o más de la citotoxicidad con un anticuerpo control que bloquea las interacciones entre KIR y HLA-C, tal como los AcMo anti-KIR GL183 o EB6 (disponibles en Immunotech, Francia).

Con el término “tratamiento” se pretende incluir tanto la prevención como la minimización de la enfermedad, el trastorno o la afección a la que se hace referencia. De acuerdo con esto, "tratamiento" se refiere a la administración tanto profiláctica como terapéutica de un agente o composición que comprende un agente, a menos que se indique lo contrario o que claramente esté contradicho por el contexto. No obstante, la administración terapéutica del agente

: o composición que comprende el agente y la administración profiláctica del agente o composición que comprende el agente se pueden considerar por separad aspectos únicos de la invención. Por ejemplo, el “tratamiento” de un paciente en el que no se han identificado síntomas o manifestaciones clínicamente relevantes de una enfermedad o trastorno es terapia preventiva.

La expresión "cantidad eficaz” se refiere a una cantidad que, cuando se libera en dosis adecuadas y durante los periodos de tiempo adecuados, es suficiente para alcanzar un resultado deseado, tal como, por ejemplo, reducir de forma detectable y/o sustancial la inhibición de la citotoxicidad de las las células NK mediada por KIR o reducir de forma detectable y/o sustancial la dimerización de KIR. En función del uso previsto, una “cantidad eficaz” puede ser también una “cantidad terapéuticamente eficaz”, “cantidad profilácticamente eficaz”, “cantidad fisiológicamente eficaz” o una combinación de las mismas. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un agente o composición eficaz, cuando se libera en dosis adecuadas y durante periodos de tiempo adecuados para alcanzar un resultado terapéutico deseado en un paciente u otro huésped (p. ej., la inducción, estimulación y/o potenciación de una respuesta fisiológica asociada con la reducción de uno o más aspectos del trastorno, tal como reducir la progresión del cáncer, reducir los síntomas de la enfermedad vírica, incrementar la probabilidad de supervivencia en un periodo de tiempo (p. ej., 18-60 meses tras el tratamiento inicial), reducir la diseminación de los crecimientos asociados a célula cancerosas y/o reducir la probabilidad de recurrencia del crecimiento del tumor). Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la composición para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una con la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición administrada es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz en dosis durante periodos de tiempo necesarios para alcanzar un resultado profiláctico deseado (p. ej., una reducción de la probabilidad de desarrollar un trastorno, una reducción de la intensidad o diseminación de un trastorno, un incremento de la probabilidad de supervivencia durante un trastorno inminente, un retraso en el inicio de una afección, una diseminación de una afección inminente en comparación con en pacientes similares que no están recibiendo el régimen profiláctico etc.) Normalmente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes, o en una etapa prematura de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad “profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad que es suficiente para inducir, estimular y/o potenciar el(los) efectos fisiológico(s) deseado(s).

La expresión “sustancialmente idéntica” en el contexto de dos secuencias de aminoácidos quiere decir que las secuencias, cuando están óptimamente alineadas, tal como mediante los programas GAP o BESFIT usando pesos de huecos predeterminados, comparten al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70. al menos aproximadamente 80. al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95, al menos aproximadamente 98 o al menos aproximadamente 99 por ciento de identidad de secuencia. En una realización, las posiciones de los residuos que no son idénticos difieren en sustituciones conservadoras de aminoácidos (que se describen adicionalmente en otro lugar del presente documento). Normalmente, la identidad de secuencia se mide usando el software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas aparea secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, el software GCG disponible para el público contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit”, que se pueden usar con parámetros por defecto para determinar homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos relacionados estrechamente, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína salvaje y una muteína de la misma. Por ejemplo, véase GCG, Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también se pueden comparar usando FASTA con los parámetros por defecto o recomendados. Un programa en GCG, versión 6.1, FASTA (p. ej., FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias solicitadas y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183: 63-98; Pearson, Methods Mol. BioI. 2000;132:185-219). Otro algoritmo preferido a la hora de comparar una secuencia con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de varios organismos es el programa para ordenador BLAST, especialmente blastp usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul y col., J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul y col., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997). Posiciones de aminoácidos “correspondientes” en dos secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas son las alineadas por cualquier software de análisis de proteínas mencionado en el presente documento, que normalmente usa los parámetros predeterminados.

Un agente “aislado” normalmente se refiere a un agente que no está asociado con cantidades significativas (p. ej., más de aproximadamente 1 %, más de aproximadamente 2 %, más de aproximadamente 3 % o más de aproximadamente 5 %) de moléculas biológicas extrañas o indeseables (tales como, por ejemplo, moléculas biológicas de unión a no KIR, por ejemplo anticuerpos) contenidas dentro de una célula, cultivo celular, medos químicos o animal en los que se produce la molécula en cuestión. Un agente "aislado” también se puede referir a un agente que ha pasado por la etapa de pureza debido a intervención humana (ya sea automática, manual o ambas) durante una cantidad significativa de tiempo (p. ej., durante al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, al menos una hora, o más).

Descripción de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de anticuerpos capaces de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin bloquear la unión de KIR a su ligando de HLA y el hallazgo de que la transducción de la señalización negativa a través de KIR, tras la unión de KIR a su ligando de HLA de clase I, implica una reorientación conformacional inducida por la unión al ligando de las moléculas de KIR que permite que se formen interacciones entre los KIR adyacentes en dominios específicos, que conduce a una agrupación acelerada. Aunque anteriormente se sabía que la unión al ligando conduce a la señalización mediante KIR, no se habían descrito mecanismos que pudieran explicar completamente cómo se podía transmitir la unión al ligando, que se produce en la parte extracelular del KIR en el exterior de la célula, a la cola citoplasmática del KIR y conducir a una señalización intracelular sólo cuando está unido el ligando, pero no cuando no hay unión a ligando. Asimismo, aunque en la literatura se ha descrito agrupación de algunos tipos de receptores, se cree que, antes de la presente invención, no se sabía que la dimerización o agrupación de un receptor inhibidor de células NK, tal como KIR, podía reducirse o bloquearse mediante el uso de agentes añadidos. El descubrimiento de sitios sobre KIR que permiten la dimerización de moléculas de KIR puede proporcionar actualmente una explicación de esto y permitir el desarrollo e identificación de agentes terapéuticos que prevendrían la señalización inhibitoria mediante KIR, dirigidos a estos y otros sitios no asociados con la unión de HLA.

Como se ha descrito en los ejemplos, en la actualidad se ha descubierto que el inicio y la propagación de la señalización inhibidora mediante KIR requiere que dos o más KIR se acerquen entre sí, es decir, dimericen. Sin desear quedar ligado a teoría alguno, el proceso de dimerización se inicia, probablemente, cuando el KIR se fine a los ligandos de MHC de clase I sobre las células diana. Esto puede acercar a los receptores KIR, lo que permite la iniciación de la señalización inhibidora mediante mecanismos que implican la fosforilación de ciertos residuos de tirosina en la cola citoplasmática de los KIR. Aunque los acontecimientos precisos que permiten que la unión a ligando induzca dimerización de KIR no están claros a nivel molecular, se ha dado a conocer que la agrupación de KIR (acercando varias moléculas de KIR) es suficiente para inducir la señalización inhibidora (Faure y col., ant.). Interfiriendo en este proceso de dimerización, o agrupación, o acercando, actualmente se ha descubierto que se puede prevenir el inicio y propagación de la señalización inhibidora. Anteriormente sólo se ha sabido que era posible reducir la señalización por KIR evitando la unión de KIR a su ligando de MHC de clase I. En el presente documento se describen agentes nuevos que evitan el inicio de la señalización inhibidora sin interferir en las interacciones de KIR con la molécula de HLA de clase I, sino que en su lugar modulan la señalización de KIR después de la unión a ligando mediante, por ejemplo, la prevención o reducción de la dimerización y/o la posterior agrupación de KIR. La ventaja de estos agentes nuevos, en comparación con los que bloquean la unión a ligando, es que no previenen que las interacciones de KIR-clase I contribuyan a la adhesión de las células NK a las células diana, aumentando de este modo la activación positiva de las NK por las células diana. Otra ventaja es que los epítopos de estos AcMo y los sitios de dimerización de KIR son los más conservados entre los miembros de la familia KIR, que son los dominios de unión a ligando y, por tanto, puede ser más fácil obtener AcMo que sufren reacción cruzada entre varios miembros de la familia KIR. Los anticuerpos que previenen la señalización negativa mediante múltiples KIR son ventajosos para los fines terapéuticos porque inducen la lisis por proporciones más grandes de células NK.

Como se describe en los ejemplos, uno de estos agentes identificados es el anticuerpo monoclonal murino IgG1 126F117-A3. Este anticuerpo es transreactivo, se une a al menos KIR2DL1 y KIR2DL3; potencia la citotoxicidad de las células NKA y no reduce la unión de KIR2DL1 a HLA-C. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de 1-26F117-A3 se han determinado del siguiente modo:

Región VH (SEC ID Nº 17):

Región VL (SEC ID Nº 18):

Las CDR de las regiones VH y VL de 1-26F117-A3 se han determinado del siguiente modo: CDR H1: GYFMN (residuos 31-35 de la SEC ID Nº 17) CDR H2: RINPFNGDAFYNQKFKG (residuos 50-66 de la SEC ID Nº 17)

15 CDR H3: LDYRGYFFDY (residuos 99-108 de la SEC ID Nº 17). CDR L1: KASQSVGSAVG (residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18) CDR L2: SASTRYT (residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18) CDR L3: HQYSRYPLS (residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18).

Las secuencias de ADNc de las regiones VH y VL de 1-26F117-A3 se han determinado del siguiente modo: 20 Región VH (SEC ID Nº 19):

Región VL (SEC ID Nº 20):

Otro agente de este tipo identificado es el anticuerpo monoclonal murino IgG1 1-26F117-A4. Como se ha descrito en 25 los Ejemplos, este anticuerpo potencia la citotoxicidad de las células NK y no reduce la unión de KIR2DL1 a HLA-C. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de 1-26F117-A4 se han determinado del siguiente modo:

Región VH (SEC ID Nº 21):

La secuencia VL fue idéntica a la secuencia VL de 1-26F117-A3; (SEC ID Nº 18). Las CDR de las regiones VH y VL de 1-26F117-A4 se han determinado del siguiente modo: CDR H1: DYGVS (residuos 31-35 de la SEC ID Nº 21)

5 CDR H2: LIWGDGRTNYHSALISR (residuos 50-66 de la SEC ID Nº 21) CDR H3: RGAMDY (residuos 98-103 de la SEC ID Nº 21) CDR L1: KASQSVGSAVG (residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18) CDR L2: SASTRYT (residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18) CDR L3: HQYSRYPLS (residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18).

10 Las secuencias de ADNc de las regiones VL y VH de 1-26F117 se han determinado del siguiente modo: Región VH (SEC ID Nº 22):

Región VL (SEC ID Nº 23):

15 De acuerdo con esto, en un aspecto, la invención se refiere a agentes de unión a KIR, incluidas moléculas pequeñas, polipéptidos y anticuerpos (incluidos los fragmentos de unión a anticuerpo o derivados) que son capaces de recuro la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin interferir en la unión de KIR a HLA, así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichos agentes, solos o en combinación con otros agentes activos. En una realización, el agente es un anticuerpo anti-KIR transreactivo, que se une a, por ejemplo, KIR2DL1 y

20 KIR2DL2 y/o KIR2DL3. En otra realización, el agente es un anticuerpo capaz de reducir la inhibición mediada porKIR2DL de la citotoxicidad de las células NK.

En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos de uso de dichos agentes, incluidos anticuerpos, para potenciar la citotoxicidad de las células NK mediada por KIR, para potenciar la muerte de las células diana mediada por las células NK, y para tratar el cáncer o enfermedades víricas. En una realización, el procedimiento es un

25 procedimiento de potenciar la citotoxicidad de las células NK mediada por KIR2DL, o mediada por KIR2DL1 y por KIR2DL2/3. En otra realización, el procedimiento es un procedimiento de potenciar la citotoxicidad de las células NK que expresan receptores KIR2DL1 o receptores KIR2DL2/3 o poblaciones de células NK que expresan KIR2DL1 y KIR2DL2/3, tal como en individuos humanos.

En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos de producir y/o identificar dichos agentes, incluidos

30 anticuerpos, produciendo y realizando detección selectiva de una biblioteca de anticuerpos de unión anti-KIR u otros agentes, y seleccionando los que

(a) inhiben mediante KIR la citotoxicidad de las células NK y (b) no reducen la unión de KIR a HLA, en la que las etapas (a) y (b) pueden, opcionalmente, invertirse. En una realización, la etapa (a) comprende seleccionar agentes que reducen la inhibición mediada por KIR2DL o KIR2DL1- y KIR2DL2/3 de la citotoxicidad de las células NK.

35 Ensayos adecuados para realizar dichos procedimientos se describe en el presente documento, particularmente en los Ejemplos. En un aspecto de la invención se usan los mismos o similares procedimientos para preparar e identificar hibridomas productores de anticuerpos de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos u otros agentes que compiten con 1-26F117-A3 y/o 1-26F117-A4 para unirse a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.

En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos u otros agentes que compiten con un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL que consisten esencialmente en las secuencias de VH y VL de 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.

En realizaciones a modo de ejemplo, el agente es un anticuerpo tal como un anticuerpo de longitud completa murino, humano, humanizado o quimérico; o un fragmento de unión o derivado del mismo. En una realización, el anticuerpo se une al mismo epítopo que 1-26F117. En otra realización, el anticuerpo se une sustancialmente al mismo epítopo que 1-26F117. En otra realización, el agente es un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo sobre KIR2DL1 y/o KIR2DL3 que es reconocido por el anticuerpo monoclonal 1-26F117-A3 y/o 1-26F117-A4, o por un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia de VL de la SEC ID Nº 18 o por un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia de VL de la SEC ID Nº 18. En otra realización, el anticuerpo, incluido un fragmento de unión o derivado del mismo, comprende las mismas regiones VH y/o VL sustancialmente idénticas que 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4. En otra realización, el anticuerpo, incluido un fragmento de unión o derivado del mismo, comprende una región VH que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la SEC ID Nº 18 o la SEC ID Nº 21. En otra realización, el anticuerpo, incluido un fragmento de unión o derivado del mismo, comprende una región VL que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la SEC ID Nº 18. En otra realización, el anticuerpo, incluido un fragmento de unión o derivado del mismo, comprende las mismas regiones CDR H1, H2, H3, L1, L2, y L3, o sustancialmente idénticas, que 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4. En una realización concreta, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEC ID Nº 17 y una secuencia de VL de SEC ID Nº 18. así como la secuencia de la región constante de la cadena pesada de IgG1 (nº de registro en GenBank D78344) y la secuencia para la región constante de la cadena ligera (nº de registro en GenBank V00807). En otra realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL que consisten esencialmente en las secuencias VH y VL de la SEC ID Nº 17 y la SEC ID Nº 18, respectivamente. En otra realización concreta, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEC ID Nº 21 y una secuencia de VL de SEC ID Nº 18. así como la secuencia de la región constante de la cadena pesada de IgG1 (nº de registro en GenBank D78344) y la secuencia para la región constante de la cadena ligera (nº de registro en GenBank V00807). En otra realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL que consisten esencialmente en las secuencias VH y VL de la SEC ID Nº 21 y la SEC ID Nº 18, respectivamente. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo aislado. Los procedimientos de preparación e identificación de dichos anticuerpos se describen en el presente documento. La invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican dichos anticuerpos, vectores de expresión que comprenden dichas secuencias, células huésped que comprenden dichos vectores y procedimientos de producir dichos anticuerpos a partir de dichas células huésped.

En otro aspecto, la invención se refiere a un agente que se une o interacciona con un determinante presente e un producto génico de KIR humano, en el que dicho agente es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al agente de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del agente de acuerdo con la invención la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, una enfermedad infecciosa, una infección vírica o un trastorno inmunitario.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un hibridoma que comprende una célula B de un huésped mamífero no humano que se ha inmunizado con un antígeno que comprende un determinante presente en un polipéptido KIR humano condensado con una célula inmortalizada, en el que dicho hibridoma produce un anticuerpo monoclonal que se une a un determinante presente en un polipéptido KIR humano y en el que dicho anticuerpo es capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK en una población de células NK que expresan dicho producto polipéptido KIR humano reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de aislar un agente capaz e neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK por medio de:

a) proporcionar el agente; y b) analizar la dimerización de KIR en presencia del agente en condiciones que conducen a la dimerización (tal como la presencia de células diana que expresan HLA-C u otros ligandos de KIR); c) seleccionar el agente de (b) que sea capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK, en el que el orden de las etapas (c) y (d) se puede invertir.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a un determinante en un producto génico del receptor de KIR humano, en el que dicho antibiótico es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK, que comprende las etapas de:

a) inmunizar un animal no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR; b) preparar anticuerpos a partir de dicho animal inmunizado, en el que dichos anticuerpos se unen a dicho polipéptido KIR; c) seleccionar anticuerpos que bloquean la dimerización de KIR; d) seleccionar los anticuerpos de (c) que son capaces de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK, en el que el orden de las etapas (c) y (d) se puede invertir.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente de acuerdo con la invención y uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

En una realización concreta, el agente es un anticuerpo monoclonal o un derivado o fragmento de unión del mismo.

En una realización concreta, los agentes de la presente divulgación son agentes tales como anticuerpos monoclonales o moléculas pequeñas, o péptidos o proteínas, que se unen a uno de los determinantes sobre KIR, de modo que se previene o reduce la señalización de inhibición.

En una realización concreta, el producto génico de KIR es un producto génico de KIR inhibidor. Algunos productos del gen KIR son de naturaleza inhibidora. Todos los KIR inhibidores confirmados tienen una cola citoplasmática larga y exhiben en su porción intracitoplasmática uno o varios motivos de aminoácidos que reclutan fosfatasas responsables de la señalización inhibidora. Distintos KIR interaccionan con diferentes subpoblaciones de antígenos de HLA de clase I. Los receptores KIR inhibidores conocidos incluyen miembros de las subfamilias de KIR2DL y KIR3DL.

En una realización concreta, el determinante es un epítopo y, más particularmente, un epítopo conformacional.

En una realización concreta, el agente es un anticuerpo.

Reducción de la señalización inhibidora de KIR

Los anticuerpos de la presente invención pueden neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK, particularmente la inhibición mediada por los receptores KIR2DL y, más particularmente, la inhibición mediada por al menos ambos KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Por tanto, estos anticuerpos “reducen” o “bloquean” la dimerización en el sentido de que bloquean, al menos parcialmente, la vía de señalización inhibidora mediada por los receptores KIR. Es más importante, esta actividad inhibidora se muestra con respecto a varios tipos de receptores KIR inhibidores, particularmente varios productos génicos receptores KIR2DL y, más particularmente, al menos KIR2DL1, KIR2DL2, y KIR2DL3, de modo que estos anticuerpos se pueden usar en varios sujetos con una eficacia elevada. La inhibición de la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK se puede evaluar mediante varios ensayos o pruebas, tales como ensayos de unión o celulares. Un ejemplo de procedimiento para analizar su un AcMo cumple los criterios de la presente invención, es decir tiene (1) la capacidad para reducir la señalización inhibidora mediada por KIR, (2) sin bloquear las interacciones KIR-HLA de clase I, es el siguiente (véase también los Ejemplos):

(1): La capacidad de un agente para reducir la señalización mediada por KIR se puede analizar en un ensayo convencional de citotoxicidad in vitro de 4 horas usando células NK que expresan KIR2DL1 y células diana que expresan HLA-Cw4. Estas células NK no matan las dianas que expresan HLA-Cw4 porque KIR2DL1 reconoce HLA-Cw4, lo que conduce a la dimerización de KIR, que, a su vez, conduce al inicio y propagación de la señalización inhibidora que previene la citólisis mediada por NK. El ensayo de citotoxicidad in vitro se lleva a cabo mediante procedimientos estándar bien conocidos en la técnica, como se describe en, por ejemplo, Coligan y col., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Las células diana se marcan con 51Cr antes de la adición de células NK y, después, la muerte se estima como proporcional a la liberación de 51Cr desde las células al medio, como resultado de la muerte. La adición de un agente que evite la dimerización de KIR o de agentes que eviten la unión de KIR a HLA-Cw4 tiene como resultado la prevención del inicio y propagación de la señalización de inhibición a través de KIR. Por tanto, la adición de estos agentes tiene como resultado incrementos de la muerte mediada por NK de las células diana. Por tanto, esta etapa identifica agentes que evitan la señalización negativa inducida por KIR mediante, por ejemplo, el bloqueo de la unión del ligando o evitando la dimerización de KIR y otros acontecimientos moleculares implicados en la transducción de la señal desde el exterior de la célula al interior de la célula, lo que indica que KIR se ha unido a un ligando. En un ensayo concreto de citotoxicidad de liberación de 51Cr, las células efectoras YTS que expresan KIR2DL1 (YTS-2DL1) pueden matar células diana LCL 721.221-Cw3 pero no células LCL 721.221-Cw4. En contraste, las células efectoras YTS que carecen de KIR (YTS) matan ambas líneas celulares con eficiencia. Por tanto, las células efectoras YTS-2DL1 no pueden matar las células LCL 721.221-Cw4 debido a la señalización inhibidora inducida por HLA-Cw4 a través de KIR2DL1. Cuando las células YTS-2DL1 se preincuban con AcMo anti-KIR bloqueantes o con AcMo de acuerdo con la presente invención en dicho

ensayo de citotoxicidad de liberación de 51Cr, las células LCL 721.221-Cw4 mueren de un modo dependiente de la concentración de AcMo anti-KIR.

(2): Para determinar sin un agente bloquea las interacciones de KIR con el HLA-clase I, se realiza la siguiente prueba: La línea celular 721.221 transfeccionada con HLA-Cw4 (Litwin y col. Journal of Experimental Medicine. 1993. Vol 178, páginas 1321-1336) se incuba con 10 ug/ml de una proteína de fusión KIR2DL1-Fc soluble (producida y purificada como se describe en Wagtmann y col. Immunity. 1995. Vol 3, páginas 801-809), durante 30 min a 4°C, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de un AcMo anti-KIR de ensayo. Las células se lavan y después se incuban con un anticuerpo secundario que reconoce la parte Fc de la proteína de fusión KIR-Fc, se lavan de nuevo y se analizan en un citómetro de flujo (FACScalibur, Beckton Dickinson), mediante procedimientos convencionales. En ausencia de AcMo anti-KIR, la proteína KIR-Fc se une bien a las células 721.221-Cw4. En presencia de un AcMo anti-KIR que bloquea la unión de KIR a HLA-C, existe una menor unión de KIR-Fc a las células, y dichos AcMo se denominan “AcMo bloqueantes”. Si el AcMo anti-KIR no conduce a una reducción de la unión de la proteína KIR-Fc a las células, el acmé anti-KIR se denomina AcMo “no bloqueantes”.

Si un AcMo anti-KIR induce la muerte de las células diana que expresan HLA-C por acción de las células NK que expresan KIR (mediante el experimento 1 anterior) y no bloquea la unión de KIR a HLA-C (en el experimento 2 anterior), el AcMo es un anticuerpo de la invención, que evita la señalización de KIR inhibidor mediante, por ejemplo, la reducción de la dimerización sin evitar la unión de KIR a HLA-C.

Los anticuerpos de la presente invención pueden reducir, por ejemplo neutralizar parcial o completamente, la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK. Por ejemplo, anticuerpos preferidos de la presente invención pueden inducir la lisis de la población de células diana equivalente o compatible con HLA o antóloga, es decir la población celular que no se lisaría de forma eficaz por acción de las células NK en ausencia de dicho anticuerpo. De acuerdo con esto, los anticuerpos de la presente invención también pueden definirse como que facilitan, potencian o estimulan la actividad citotóxica de las células NK, tanto in vitro como in vivo.

Tras la inmunización y producción de anticuerpos, se pueden realizar etapas de selección concretas para aislar anticuerpos de la invención. Una vez identificados como anticuerpos monoclonales capaces de unirse a los polipéptidos KIR, los anticuerpos se seleccionan por su capacidad para reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión a HLA y/o su capacidad para bloquear la dimerización de KIR. Esta selección se puede realizar como se describe en el presente documento.

En un aspecto específico, la invención también se refiere a procedimientos para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a un determinante en un producto génico del receptor de KIR humano, en el que dicho antibiótico es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK, que comprende las etapas de:

(a): inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR;

(b): preparar anticuerpos a partir de dicho animal inmunizado, en el que dichos anticuerpos se unen a dicho polipéptido KIR,

(c): seleccionar anticuerpos de (b) que son capaces de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK, y

(d): seleccionar anticuerpos de (c) que no reducen la unión de KIR a HLA-C,

en los que opcionalmente el orden de las etapas (c) y (d) se pueden invertir.

En una realización, los anticuerpos preparados en la etapa (b) son anticuerpos monoclonales. Por tanto, la expresión “preparar anticuerpos a partir de dicho animal inmunizado”, como se usa en el presente documento, incluye obtener las células B de un animal inmunizado y usar dichas células B para producir un hibridoma que expresa anticuerpos, así como obtener anticuerpos directamente del suero de un animal inmunizado. En otra realización, los anticuerpos seleccionados en la etapa (c) producen al menos un 10 % de aumento o reducción de la inhibición de la citotoxicidad de las NK mediada por las células NK que exhiben menos un KIR reconocido por el anticuerpo, preferentemente un aumento de al menos 40 o 50 % o, más preferentemente, de 70 % de la citotoxicidad de las NK, medido en un ensayo de liberación de cromo hacia una célula diana que expresa la molécula de HLA de clase I afín.

De acuerdo con otra realización, la invención divulga un hibridoma que comprende una célula B de un huésped no humano, en el que dicha célula B produce un anticuerpo que se una a un determinante presente en el producto génico receptor KIR humano, por ejemplo un producto génico receptor KIR humano inhibidor, y es capaz de reducir la actividad inhibidora de dichos receptores. El hibridoma de acuerdo con la presente divulgación se crea tal como se ha descrito en el presente documento mediante la fusión de esplenocitos a partir del mamífero no humano inmunizado con una línea celular inmortal. Los hibridomas producidos mediante esta fusión se someten a detección selectiva para determinar la presencia de dicho anticuerpo. Particularmente, el hibridoma produce un anticuerpo que no bloquea la unión de KIR a HLA-C y/o reconoce un determinante presente en el dominio 1 o dominio 2 o dominios homólogos como se ha descrito anteriormente y produce potenciación de la citotoxicidad de las las células NK.

En otros aspectos, los agentes de la divulgación compiten con 1-26F117-A3 y/o 1-26F117-A4 y/u otros anticuerpos de la divulgación en la unión a KIR2DL1 o KIR2DL3, y/o unirse al mismo epítopo de KIR2DL1 y/o KIR2DL3 o sustancialmente al mismo. Dichos agentes se pueden identificar usando varios procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la identificación de uno o más anticuerpos que compiten con un anticuerpo de la divulgación tal como, por ejemplo, 1-26F117-A3 y/o 1-26F117-A4, se pueden determinar usando ensayos de detección selectiva conocidos en los que se puede evaluar la competición con el anticuerpo. En la técnica se practican de forma rutinaria y se conocen bien numerosos de estos ensayos (véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 5.660.827). Por ejemplo, cuando los anticuerpos de ensayo que van a investigar se obtienen de diferentes fuentes animales o, incluso, son de un isotipo de Ig diferente, se puede usar un sencillo ensayo de competición en el que el anticuerpo control (por ejemplo, 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4) se mezcla con el anticuerpo de ensayo y después se aplica a una muestra que contiene uno o los dos KIR2DL1 y/o KIR2DL3. Los protocolos basados en, por ejemplo, ELISA, radioinmunoensayos, transferencia Western y el uso de análisis BIACORE son adecuados para usar en dichos estudios de competición sencillos.

En ciertas realizaciones, se mezclaría previamente el anticuerpo control con cantidades variables del anticuerpo de ensayo (p. ej., en las proporciones de aproximadamente 1:1, 1:2, 1:10 o aproximadamente 1:100) durante un periodo de tiempo antes de aplicar a la muestra de antígeno de KIR. Como alternativa, el control y las cantidades variables del anticuerpo de ensayo puede añadirse simplemente por separado y mezclarse durante la exposición a la muestra de antígeno de KIR. Siempre que se pueda distinguir los anticuerpos unidos de los libres (usando, por ejemplo, técnicas de separación o de lavado para eliminar los anticuerpos no unidos) y el anticuerpo control del anticuerpo de ensayo (usando, por ejemplo, especias específicas o anticuerpos secundarios específicos de isotipo o mediante marcaje específico del anticuerpo control con un marcador detectable), se podrá determinar su el anticuerpo de ensayo reduce la unión del anticuerpo control a los diferentes antígenos KIR2DL, lo que indica que el anticuerpo de ensayo reconoce sustancialmente el mismo epítopo que el control. La unión del anticuerpo control (marcado) en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante (que no se une a KIR) puede servir como valor control alto. El valor control bajo se puede obtener incubando el anticuerpo control marcado con el mismo anticuerpo control sin marcar, en el que se produciría competición y se reduciría la unión del anticuerpo marcado. En un ensayo de prueba, una reducción significativa de la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de ensayo es indicativa de un anticuerpo de ensayo que reconoce sustancialmente el mismo epítopo, es decir uno que compite con el anticuerpo control marcado. Por ejemplo, cualquier anticuerpo de ensayo que reduce la unión de un anticuerpo control 1-26F117 a uno o los dos antígenos de KIR2DL1 yKIR2DL3 en al menos aproximadamente un 50 %, tal como al menos aproximadamente un 60 % o, más preferentemente, al menos aproximadamente un 70 % (p. ej., aproximadamente 65-100 %), en cualquier proporción entre 1-26F117y el anticuerpo de ensayo de aproximadamente 1:1 o 1:10 y aproximadamente 1:100 se considera un anticuerpo que compite con el anticuerpo control 1-26F117.

La competición también se puede evaluar mediante, por ejemplo, citometría de flujo. En tal ensayo, las células portadoras de un KIR dado se pueden incubar primero con un anticuerpo control (1-26F117-A3 o 1-26F117-A4, por ejemplo), y después con el anticuerpo de ensayo marcado con un fluoro cromo o biotina. Se dice que el anticuerpo compite con el anticuerpo control si la unión obtenida tras la preincubación con una cantidad saturante de anticuerpo control es de aproximadamente 80 %, preferentemente aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % o menor (p. ej., de aproximadamente 30 %) de la unión (medido por medio de fluorescencia) obtenida mediante el anticuerpo de ensayo sin preincubación con el anticuerpo control. Como alternativa, se dice que un anticuerpo compite con el anticuerpo control si la unión obtenida con un anticuerpo control marcado (mediante un fluorocromo o biotina) sobre las células preincubadas con una cantidad saturante del anticuerpo de ensayo es de aproximadamente 80 %, preferentemente aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % o menor (p. ej., de aproximadamente 30 %) de la unión obtenida sin preincubación con el anticuerpo de ensayo.

También se puede usar de forma ventajosa un simple ensayo de competición en el que un anticuerpo de ensayo se pre-adsorbe y aplica a una concentración saturante a la superficie sobre la cual se inmovilizan KIR2DL1 o KIR2DL2/3, o ambos. La superficie en el ensayo de competición simple es, preferentemente, un circuito BIACORE (u otros medios adecuados para el análisis de resonancia en plasmón superficial). Se mide la unión de un anticuerpo control (p. ej., 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4) a la superficie recubierta con KIR. Esta unión a la superficie que contiene KIR del anticuerpo control solo se compara con la unión del anticuerpo control en presencia de un anticuerpo de ensayo. Una reducción significativa de la unión a la superficie que contiene KIR2DL1 y KIR2DL2/3 por el anticuerpo control en presencia de un anticuerpo de ensayo indica que el anticuerpo de ensayo reconoce sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo control, de modo que el anticuerpo de ensayo “compite” con el anticuerpo control. Cualquier anticuerpo de ensayo que reduce la unión del anticuerpo control a ambos antígenos KIR2DL1 y KIR2DL2/3 en al menos aproximadamente un 20 % o más, al menos aproximadamente un 40 %, menos aproximadamente un 50 %, menos aproximadamente un 70 % o más, se puede considerar un anticuerpo que compite con el anticuerpo control. Preferentemente, dicho anticuerpo de ensayo reducirá la unión del anticuerpo control a cada uno de al menos los antígenos KIR2DL1, 2, y 3 en al menos aproximadamente un 50 % (p. ej., al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 % o más). Se apreciará que el orden de los anticuerpos control y de ensayo se puede invertir; es decir, el anticuerpo control se puede unir primero a la superficie y, después, se pone en contacto el anticuerpo de ensayo con la superficie en un ensayo de competición. Preferentemente, el anticuerpo que tiene mayor afinidad por los antígenos KIR2DL1 y KIR2DL2/3 se une primero a la superficie que contiene KIR2DL1 y KIR2DL2/3, dado que cabrá esperar que la disminución en la unión observada par el segundo anticuerpo (suponiendo que los anticuerpos están compitiendo) sea de mayor magnitud. Ejemplos adicionales de dichos ensayos se proporcionan en los Ejemplos de la presente memoria descriptiva y en, por ejemplo, Saunal y Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41.

La determinación de si un anticuerpo u otro agente se une a la misma región de epítopo, o sustancialmente a la misma, que un anticuerpo de la divulgación, por ejemplo 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4, se puede llevar a cabo usando procedimientos conocidos para el experto en la técnica. En un ejemplo de procedimientos de mapeo/caracterización de epítopos, una región de epítopo para un anticuerpo anti-KIR se puede determinar mediante la “huella” del epítopo usando modificación química de las aminas/carboxilos expuestos en la proteína KIR2DL1 o KIR2DL2/3. Un ejemplo específico de dicha técnica de huella es el uso de HXMS (intercambio de hidrógeno-deuterio detectada mediante espectrometría de masas), en el que se produce un intercambio de hidrógeno/deuterio de los protones de la amida de la proteína receptora y el ligando, unión e intercambio inverso, de modo que los grupos amida de la estructura que participan en la unión de la proteína están protegidos del intercambio inverso y, por tanto, permanecerán deuterados. En este punto se pueden identificar regiones relevantes mediante proteólisis específica, separación por cromatografía de líquidos de alto rendimiento FAST MICROBORE y/o espectrometría de masas por ionización con electronebulización. Véase, por ejemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) y/o Engen, J.R. y Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Otro ejemplo de una técnica de identificación de epítopos adecuados es el mapeo de epítopos por resonancia magnética nuclear (RMN) en la que normalmente se comparan la posición de las señales en los espectros de RMN bidimensionales del antígeno libre y el antígeno en forma de complejo con el péptido de unión a antígeno, tal como un anticuerpo. Normalmente, el antígeno se marca isotópicamente de forma selectiva con 15N, de modo que solo las señales correspondientes al antígeno y no las señales del péptido de unión a antígeno se ven en el espectro de RMN. Las señales de antígeno que proceden de aminoácidos implicados en la interacción con el péptido de unión a antígeno normalmente cambiarán de posición en los espectros del complejo en comparación con los espectros del antígeno libre y los aminoácidos implicados en la unión se pueden identificar de este modo. Véase, por ejemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44):149-67; Huang y col., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); y Saito y Patterson, Methods. 1996 Jun; 9(3):516-24.

El mapeo/la caracterización del epítopo también se puede realizar usando procedimientos de espectrometría de masas. Véase, por ejemplo, Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr;35(4):493-503 y Kiselar y Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71(9):1792-801.

Las técnicas de digestión con proteasa también pueden ser útiles en el contexto de mapeo e identificación del epítopo. Las regiones/secuencias relevantes para determinante antigénico se pueden determinar mediante digestión con proteasa usando, por ejemplo, tripsina en una proporción de aproximadamente 1:50 con KIR2DL1 o KIR2DL2/3 en digestión a 37 º C y a pH 7-8, seguido de análisis de espectrometría de masas (EM) para la identificación del péptido. Los péptidos protegidos de la escisión con tripsina por el anticuerpo anti-KIR se puede identificar después mediante comparación de las muestras sometidas a digestión con tripsina y las muestras incubadas con anticuerpo y, después, sometidas a digestión con, por ejemplo, tripsina (de modo que se revela una huella del anticuerpo). Otras enzimas, como quimotripsina, pepsina etc.),se pueden usar también o como alternativa en procedimientos similares de caracterización de epítopos. Además, la digestión enzimática puede proporcionar un procedimiento rápido para analizar si una posible secuencia de determinante antigénico está dentro de una región del KIR2DL1 en el contexto de un agente de unión a KIR. Si el polipéptido no está expuesto en la superficie, es muy probable que no sea relevante en términos de inmunogenicidad/antigeneicidad. Véase, por ejemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27(1):15-9 una discusión de técnicas similares.

La mutagénesis dirigida es otra técnica útil para la elucidación de un epítopo de unión. Por ejemplo, en el “barrido de alanina”, cada residuo en un segmento proteico está sustituido con un residuo de alanina y se miden las consecuencias para la afinidad de unión. Si la mutación conduce a una reducción significativa de la afinidad de unión, es muy probable que esté implicado en la unión. Los anticuerpos monoclonales específicos de epítopos estructurales (es decir, anticuerpos que no se unen a la proteína sin plegar) se pueden usar para verificar que la sustitución con alanina no influye en el plegamiento global de la proteína. Véase, por ejemplo, Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; y Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:1-6.

También se puede usar microscopia electrónica para la “huella” del epítopo. Por ejemplo, Wang y col., Nature 1992;355: 275-278 usaron la aplicación coordinada de microscopia criolectrónica, reconstrucción de imágenes tridimensionales y cristalografía de rayos X para determinar la huella física de un fragmento Fab sobre la superficie de la cápside del virus del mosaico del caupí nativo.

Otras formas de ensayo “sin marcador” para la evaluación del epítopo incluyen resonancia de plasmón superficial (SPR, BIACORE) y espectroscopia por interferencia reflectométrica (RifS). Véase, por ejemplo, F5gerstam y col., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3:208-14; Nice y col., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert y col., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kroger y col., Biosensors and Bioelectronics 2002;17:937-944

También debe destacarse que un anticuerpo que se une al mismo epítopo, o sustancialmente el mismo, que un anticuerpo de la divulgación se puede identificar en uno o más de los ejemplos de ensayos de competición descritos en el presente documento.

Prevención de la dimerización de KIR

De acuerdo con la presente invención, una forma de prevenir la inhibición de la citotoxicidad de las las células NK sin interferir en la unión de KIR a HLA-C es evitar la dimerización de KIR. En un aspecto, otra forma de prevenir la inhibición de la citotoxicidad de las las células NK sin interferir en la unión de KIR a HLA-C es evitar la agrupación de KIR.

Como se describe en el Ejemplo 1, usando diferentes estrategias de modelación molecular, incluida “la estrategia del sitio conservado”, la “estrategia del acoplamiento proteína-proteína” y la “estrategia del empaquetamiento en cristal”, todas descritas más adelante, se descubrió que hay sitios sobre KIR que permiten que dos KIR interaccionen uno con otro. Un sitio de este tipo, definido en el presente documento como un "sitio de interacción asociado con el dominio 1" se localiza en el dominio 1 de KIR, correspondiente a los residuos 1-101 de la porción extracelular de KIR2DL1 (SEC ID Nº 14). Este sitio comprende una serie de residuos aminoácidos adyacentes en el polipéptido plegado. Los aminoácidos que forman este sitio pueden estar unidos por un agente de la presente divulgación. Los aminoácidos en un sitio de interacción en una molécula de KIR pueden interaccionar con los aminoácidos en el sitio idéntico en un KIR adyacente. Por tanto, la dimerización KIR-KIR implica interacciones entre los aminoácidos en el “sitio de interacción asociado con el dominio 1” en un KIR y los aminoácidos en el “sitio de interacción asociado con el dominio 1” en otro KIR. Este otro KIR puede ser del mismo tipo, tal como las interacciones KIR2DL1-KIR2DL1. No obstante, ya que el “sitio de interacción asociado con el dominio 1” está conservado en la mayoría o todos los demás KIR, las interacciones también pueden estar entre KIR diferentes, tal como KIR2DL1-KIR2DL2 o KIR2DL1-KIR2DS3, u otras interacciones.

Además de un sitio de interacción en el dominio 1 de KIR, también se identificó un sitio de interacción diferente en el dominio 2, que se denominó “sitio de interacción asociado con el dominio 2”. El dominio 2 de KIR corresponde a los residuos 105-200 de la porción extracelular de KIR2DL1 (SEC ID Nº 14). Dos KIR pueden dimerizar mediante interacciones entre los aminoácidos en el “sitio de interacción asociado con el dominio 2” en un KIR y los aminoácidos en el “sitio de interacción asociado con el dominio 2” de otro KIR. Los aminoácidos en un “sitio de interacción asociado con el dominio 2” están conservados en la mayoría o todos los demás KIR, por tanto, la dimerización puede estar entre dos KIR del mismo tipo (tal como KIR2DL2-KIR2DL2, o KIR2DL3-KIR2DL3) o entre diferentes tipos de KIR (tal como KIR2DL1-KIR2DL2, o KIR2DL1-KIR2DS4).

Por tanto, la divulgación proporciona agentes y procedimientos relacionados para evitar la dimerización de KIR, en los que un agente se unirá a un determinante de KIR dentro de un sitio de interacción asociado con el dominio 1 o 2 y, de este modo, inhibir o reducir la dimerización de KIR interfiriendo con la interacción entre los aminoácidos comprendidos en el sitio de interacción asociado con el dominio 1 o 2. El determinante puede estar comprendido en dicho sitio de interacción asociado con el dominio 1 o 2, no obstante, el determinante también podría estar adyacente al sitio de interacción y seguir afectando a la dimerización. En una realización, el determinante es un epítopo, particularmente un epítopo estructural.

Particularmente, el determinante puede ser compartido por al menos dos miembros del grupo de receptores KIR2DL. Más particularmente, el determinante puede ser compartido por al menos KIR2DL1 y KIR2DL2 y 3. Ciertos anticuerpos de la presente divulgación pueden, además de reconocer múltiples productos génicos de KIR2DL, también reconocen determinantes presentes sobre otros KIR inhibidores, tal como los productos génicos del grupo de receptores KIR3DL. Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden sufrir una reacción cruzada con KIR de activación, incluidos, entre otros, KIR2DS1 o KIR2DS2 o KIR2DS3. El determinante o epítopo puede representan un fragmento peptídico o un epítopo conformacional compartido por dichos miembros de la familia KIR.

Los sitios de interacción de acuerdo con la divulgación asociados con el dominio 1 o el dominio 2 de KIR están presentes en el polipéptido plegado como residuos aminoácidos adyacentes y, por tanto, son un sitio de interacción conformacional. Los residuos específicos y sus posiciones de proporcionan en los ejemplos y se reproducen más adelante. En una realización de la divulgación, el dicho determinante es un epítopo conformacional adyacente o comprendido en el sitio de interacción asociado con el dominio 1 o 2.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto de la invención, la dimerización de KIR se reduce o bloquea mediante inhibición de la interacción entre dos sitios de interacción asociados con el dominio 1.

En otro aspecto, la dimerización de KIR se reduce o bloquea mediante inhibición de la interacción entre dos sitios de interacción asociados con el dominio 2.

En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a un determinante en un producto génico del receptor de KIR humano, en el que dicho antibiótico es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK, que comprende las etapas de:

(c): seleccionar anticuerpos de (b) que bloquean la dimerización de los productos génicos de KIR, y

(d): seleccionar los anticuerpos de (c) que son capaces de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK, en el que el orden de las etapas (c) y (d) se puede invertir opcionalmente.

En una realización, los anticuerpos preparados en la etapa (b) son anticuerpos monoclonales. Por tanto, la expresión “preparar anticuerpos a partir de dicho animal inmunizado”, como se usa en el presente documento, incluye obtener las células B de un animal inmunizado y usar dichas células B para producir un hibridoma que expresa anticuerpos, así como obtener anticuerpos directamente del suero de un animal inmunizado. En otra realización, los anticuerpos seleccionados en la etapa © son los que se unen a un determinante de acuerdo con la divulgación, más particularmente los que se unen a los sitios de interacción asociados con el dominio 1 o el dominio 2 de la divulgación, y la dimerización en bloque de KIR. En otra realización más, los anticuerpos seleccionados en la etapa

(d) producen al menos un 10 % de aumento o reducción de la inhibición de la citotoxicidad de las NK mediada por las células NK que exhiben menos un KIR reconocido por el anticuerpo, preferentemente un aumento de al menos 40 o 50 % o, más preferentemente, de 70 % de la citotoxicidad de las NK, medido en un ensayo de liberación de cromo hacia una célula diana que expresa la molécula de HLA de clase I afín.

De acuerdo con otra realización, la divulgación proporciona un hibridoma que comprende una célula B de un huésped no humano, en el que dicha célula B produce un anticuerpo que se una a un determinante presente en el producto génico receptor KIR humano, por ejemplo un producto génico receptor KIR humano inhibidor, y es capaz de reducir la actividad inhibidora de dichos receptores. El hibridoma de acuerdo con la presente divulgación se crea tal como se ha descrito en el presente documento mediante la fusión de esplenocitos a partir del mamífero no humano inmunizado con una línea celular inmortal. Los hibridomas producidos mediante esta fusión se someten a detección selectiva para determinar la presencia de dicho anticuerpo. Particularmente, el hibridoma produce un anticuerpo que no bloquea la unión de KIR a HLA-C y/o reconoce un determinante presente en el dominio 1 o dominio 2 o dominios homólogos como se ha descrito anteriormente y produce potenciación de las células NK reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR.

Los procedimientos conocidos en la técnica se pueden usar para analizar si un agente reduce la inhibición mediada por KIR bloqueando la dimerización o agrupación de KIR con una simple modificación. Por ejemplo, el procedimiento basado en la Transferencia de energía de Resonancia de Fluorescencia (FRET) descrito por Faure y col. (J Immunol. 2003; 170:6107-14) se puede adaptar al siguiente ensayo para detectar si un agente de la divulgación reduce o bloquea la dimerización y/o agrupamiento de KIR. En este ensayo, la línea de células NK YTS-2DL1, que expresaban KIR2DL1, se incuba con células diana que expresan moléculas de HLA-Cw4 recombinantes, que son ligandos de KIR2DL1. Las moléculas de HLA-Cw4 transfeccionadas contienen en su extremo C una proteína fluorescente verde (GFP) o una proteína fluorescente amarilla (YFP), que emiten una luz verde o amarilla, respectivamente, cuando se excitan con un láser de 454 nm. Las células cotransfeccionadas con las construcciones Cw4-GFP y Cw4-YFP se mezclan con las células YTS-2DL1 NK, se incuban durante 20 minutos a 37 º C y los conjugados celulares se fijan. Después, se realiza el análisis FRET saliendo a 454 nm y registrando de forma simultánea las imágenes fluorescentes del espectro sobre un microscopio de barrido láser confocal. Mediante fotoblanqueamiento de la señal YFP se puede obtener una medida de la fluorescencia de la proteína GFP, que emitirá luz a diferentes longitudes de onda en función de su proximidad a YFP, es decir, cuando la fluorescencia se transfiere de YFP a GFP (señal FRET). Cuando las moléculas HLA-Cw4 se distribuyen de forma uniforma sobre la superficie de las células transfeccionadas en estado de reposo, muy pocas moléculas de HLA-Cw4 se acercan tanto (menos de 100 A) como se requiere para generar una señal FRET en la que la fluorescencia se transfiere de YFP a GFP. No obstante, en presencia de células YTS-2DL1, las moléculas HLA-Cw4 se acercan mucho de modo que son detectables mediante transferencia de fluorescencia de YFP a GFP (Faure y col. J Immunol. 2003; 170:6107-14). Dado que la estequiometría de la unión KIR-HLA-de clase I es 1:1 (Fan y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93:7178), la estrecha proximidad, o agrupamiento, o dimerización de HLA-Cw4, como reveló la FRET, implica de forma similar la proximidad estrecha de KIR. Realizando este ensayo en presencia o ausencia de AcMo anti-KIR, se obtiene una medida de la capacidad de AcMo anti-KIR para influir sobre la agrupación o dimerización de KIR. Un AcMo anti-KIR que reduce FRET mediante HLA-Cw4-GFP al nivel observado cuando las células diana se incuban en ausencia de las células NK es indicativa de un AcMo que evita la agrupación o dimerización de KIR.

En una configuración alternativa del mismo tipo de ensayo, se usan células diana que expresan HLA-Cw4 silvestre u otro ligando de HLA-C de un cierto KIR, que se expresa de forma recombinante, con marcadores de GFP o YTP en el extremo C en las células YTS. La fijación de KIR marcado con GFP y YFP por el HLA-C tiene como resultado la agrupación o dimerización que conducen a una señal FRET. La adición de AcMo anti-KIR que evitan la agrupación o dimerización de KIR conducirá a una reducción de la señalización de FRET.

En un ensayo alternativo, si un agente de unión anti-KIR concreto, tal como un anticuerpo, evita o no la dimerización de KIR se determina analizando si el agente se une a los dominios 1 o 2 de KIR. Un agente que se ha identificado que se une al dominio 1 o 2 debería reducir o bloquear la dimerización de KIR. Un ejemplo de ensayo para analizar la unión de un agente al dominio 1 o 2 se proporciona en el Ejemplo 8.

Los sitios de interacción asociados con el dominio 1 o el dominio 2 se identificaron mediante modelación sobre un miembro específico de la familia KIR, KIR2DL, y comprenden los dos sitios de interacción conformacional como se muestra en la Figura 1 y en los Ejemplos 1 y 2. En referencia a la secuencia de aminoácidos de la porción extracelular de KIR2DL1 (SEC ID Nº 14) y KIR2DS2 (comenzando en el residuo 22 de la SEC ID Nº 6, véase la Figura 3), se han predicho los siguientes sitios de interacción como se ha explicado en el presente documento y en los Ejemplos 1 y 2.

Sitio de interacción asociado con el dominio 1:

H1, E2, H5, R6, D31, V32, M33, F34, E35, H36, H50, D57, G58, V59, V83, T84, H85, S86, Q89, L90, S91, A92.

Sitio de interacción asociado con el dominio 2:

P108, S109, L110, S111, A112, Q113, P114 (o L114), G115, T125, S127, S129, R131, K155, V156, N157, G158, T159, Q161, A162, D163, S192, D193, P194, L195, L196, V197, S198, V199 y T200.

Por tanto, en una realización, el sitio de interacción asociado con el dominio 1 comprende las posiciones de los aminoácidos H1, E2, H5, R6, D31, V32, M33, F34, E35, H36, H50, D57, G58, V59, V83, T84, H85, S86, Q89, L90, S91, A92.

En otra realización, el sitio de interacción asociado con el dominio 2 comprende las posiciones de los aminoácidos P108, S109, L110, S111, A112, Q113, P114 (o L114), G115, T125, S127, S129, R131, K155, V156, N157, G158, T159, Q161, A162, D163, S192, D193, P194, L195, L196, V197, S198, V199 y T200.

Los dominios en otras KIR correspondientes a los dominios 1 y 2 en KIR2DL1 se pueden predecir mediante alineaciones de secuencia de las secuencias e KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL y KIR3DS. Ejemplos representativos se muestran en las Figuras 2 y 3, que muestran la alineación de , 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DS1, 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5 con indicación “(“1” para el dominio 2; “2" Para el dominio 2) de los residuos de interacción del dominio 1 y el dominio 2 (Figura 2), así como la alineación de 3DL1, 3DL2, 3DL3, 3DS1, 2DL1 con indicación de los residuos de interacción asociados con el dominio 1 y el dominio 2 (Figura 3).

Los agentes que se unen a dichas secuencias homólogas en otros miembros de la familia KIR y reducen o bloquean la dimerización también entran dentro del alcance de la presente divulgación. En el presente contexto, un “producto génico de KIR humano” significa una proteína codificada por un gen KIR.

Estrategias de modelación

Cuando la estructura tridimensional de una proteína se conoce a partir de un experimento de rayos X o modelación de la homología, existen al menos 3 procedimientos diferentes para identificar residuos con significado funcional. En la estrategia del sitio conservado, los sitios sobre la estructura proteica se comparan con una alineación de la secuencia para identificar los sitios conservados. En la estrategia de acoplamiento proteína-proteína, una proteína se puede acoplar sobre sí misma o sobre otra proteína para identificar los residuos funcionalmente significativos. En la estrategia de empaquetamiento en cristal, los cristales de rayos X se investigan para saber cómo se empaquetan las proteínas sobre otras proteínas de las mismas o diferentes composiciones en el cristal para determinar sitios funcionales.

En la estrategia del sitio conservado, la superficie molecular de tal proteína puede ser atravesada por los posibles sitios de interacción. Cada sitio se define por su localización sobre la superficie y el tamaño de la zona que rodea a la localización. Cuando se han determinado los átomos asociados con el sitio, el sitio se puede especificar en términos de su composición de residuos. El sitio definido por sus residuos pueden compararse después con los residuos en las mismas posiciones en una alineación de secuencia de una serie de proteínas relacionadas, por ejemplo homólogos, ortólogos, análogos o quimeras, y se pueden identificar sitios conservados con la misma composición de residuos en varias proteínas relacionadas. Dichos sitios conservados se asocian con significado funcional (del Sol MA, Pazos F, Valencia A, 2003, J. Mol. Biol. 326:1289-1302).

En la estrategia de acoplamiento proteína-proteína, que se ha revisado recientemente (Schneidman-Duhovny D, Nussinov R, Wolfson HJ, 2004, Curr. Med. Chem. 11:91-107), las dos superficies están representadas por rasgos característicos sobre las superficies. Los rasgos característicos incluyen capacidades para formar puentes de hidrógeno, cargas e hidrofobicidad. En un procedimiento basado en mallas, el espacio se divide en cubos y a cada cubo se le proporciona un valor de acuerdo con su posición respecto a la superficie (interior, superficie, exterior) y se le asigna el conjunto de rasgos característicos relevantes. A continuación se puede usar ajuste con fuerza bruta de las superficies mediante una función de puntuación mediante la búsqueda de los 3 grados trasnacionales y los 3 grados rotacionales de libertad completos. Las traslaciones se gestionan mediante transformada rápida de Fourier y la rotación se trata como cálculos individuales en una discretización estándar del espacio de rotación. A partir de los complejos de puntuación superiores, los resultados se pueden filtrar y puntuar mediante una serie de procedimientos, por ejemplo complementariedad de forma, interacciones de Van der Waals, hidrofobicidad, electrostática, desolvatación, puentes de hidrógeno, energía de contacto atómica, estadística de apareamiento residuo-residuo y apareamiento de grupos hidrófilos. Los complejos de puntuación superior se pueden evaluar con detalle e identificar los residuos de interacción.

En la estrategia de empaquetamiento en cristal, los cristales de rayos X se investigan para saber cómo se empaquetan y otras proteínas en el cristal, no solo por las coordenadas reducidas de simetría, sino para todos los paquetes relevantes dentro de la unidad-célula y sus células vecinas. En esta estrategia, todas las proteínas dentro de una malla 3 x 3 x 3 de unidad-células se analizan para determinar sus interacciones, que se mapean sobre una tabla pivote con un número de cadena en una columna y el número de residuos horizontalmente y los recuentos de interacciones en las células. La clasificación por número total de interacciones para cada cadena identifica las cadenas con un conjunto completo de vecinos y uno de estos se puede seleccionar para análisis posterior en un conjunto de estructura reducida con sólo la proteína y todos sus vecinos de interacción. Cada interacción se puede evaluar con detalle e identificar los residuos de interacción.

Los residuos con significado funcional se pueden validar mediante un análisis de los aspectos funcionales mediante análisis de mutaciones y sirven como diana para un agente terapéutico que inhibe el efecto funcional.

Anticuerpos

En función del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, a los anticuerpos se les asigna una de cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM. Varias de estas se dividen después en subclases o isotipos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan “alfa”, “delta”, “epsilon”, “gamma” y “mu”, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. IgG e IgM son las clases preferidas de anticuerpos empleados en la presente invención porque son los anticuerpos más frecuentes en el entorno fisiológico y porque se fabrican con más facilidad en un laboratorio. En una realización, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal de la subclase IgG4, o IgG1 o IgG2, que no se une a los receptores Fc y que no se fija al complemento, con el fin de evitar la depleción de las células NK in vivo.

Los anticuerpos de longitud completa comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (en la presente memoria descriptiva abreviada como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (en la presente memoria descriptiva abreviada como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas que se denominan regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi, en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir mediante diversas técnicas conocidas en la técnica. Normalmente, se producen mediante inmunización de un animal no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR, por ejemplo un polipéptido KIR inhibidor, preferentemente un polipéptido KIR2DL, más preferentemente un polipéptido KIR2DL humano. El polipéptido KIR puede comprender la secuencia de longitud completa de un polipéptido KIR humano, o un fragmento o derivado del mismo, normalmente un fragmento inmunogénico, es decir una porción del polipéptido que comprende un epítopo expuesto sobre la superficie de la célula que expresa un receptor KIR inhibidor. Normalmente dichos fragmentos contienen al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia polipeptídica madura, incluso más preferentemente, al menos 10 aminoácidos consecutivos de la misma. Esencialmente derivan del dominio extracelular del receptor. Incluso más preferido es un polipéptido KIR2DL humano que incluye al menos uno, más preferentemente los dos, dominios Ig extracelulares, del polipéptido KIRDL de longitud completa y es capaz de imitar al menos un epítopo conformacional presente en un receptor KIR2DL. En otras realizaciones, dicho polipéptido comprende al menos 8 aminoácidos consecutivos de un dominio Ig extracelular de KIR2DL1 (SEC ID Nº 14).

En una realización más particular, el inmunógeno comprende un polipéptido KIR2DL humano silvestre en una membrana lipídica, normalmente en la superficie de una célula. En una realización específica, el inmunógeno comprende células NK intactas, particularmente células NK humanas intactas, opcionalmente tratadas o lisadas.

En una realización preferida, el animal no humano es un mamífero, tal como un roedor (p. ej., ratón, rata etc.), bovino, porcino, caballo, conejo, cabra, oveja etc. Asimismo, el mamífero no humano puede modificarse genéticamente o someterse a ingeniería para producir anticuerpos “humanos”, como el Xenomouse™ (Abgenix) o HuMAb-Mouse™ (Medarex).

La etapa de inmunizar a un mamífero no humano con un antígeno se puede llevar a cabo de cualquier modo bien conocido en la técnica para estimular la producción de anticuerpos en un ratón (véase, por ejemplo, E. Harlow and

D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)). Después, el inmunógeno se suspende o disuelve en un tampón, opcionalmente con un adyuvante, tal como adyuvante completo de Freund. Los procedimientos para determinar la cantidad de inmunógeno, los tipos de tampones y las cantidades de adyuvante son bien conocidos para los expertos en la técnica y no limitan de ningún modo la presente invención. Estos parámetros pueden ser diferentes para diferentes inmunógenos, pero se elucidan fácilmente.

De forma similar, la localización y frecuencia de inmunización suficiente para estimular la producción de anticuerpos también es bien conocida en la técnica. En un protocolo de inmunización típico, los animales no humanos se inyectan por vía intraperitoneal con el antígeno el día 1 y, de nuevo, aproximadamente una semana después. A esto le siguen inyecciones de recuerdo del antígeno alrededor del día 20, opcionalmente con adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund. Las inyecciones de recuerdo se realizan por vía intravenosa y se pueden repetir durante varios días consecutivos. A esto le sigue una inyección de refuerzo el día 40, bien por vía intravenosa o bien intraperitoneal, normalmente sin adyuvante. Este protocolo tiene como resultado la producción de células B productoras de anticuerpo específico del antígeno tras aproximadamente 40 días. También se pueden usar otros protocolos, siempre que den como resultado la producción de células B que expresan un anticuerpo dirigido al antígeno usado en la inmunización.

Para la preparación de anticuerpos policlonales se obtiene suero de un animal no humano inmunizado y los anticuerpos presentes en la misma se aíslan mediante técnicas bien conocidas. El suero se puede purificar por afinidad usando cualquiera de los inmunógenos indicados anteriormente unidos a un soporte sólido para obtener anticuerpos que reaccionan con los receptores KIR inhibidores.

En una realización alternativa, los linfocitos de un mamífero no humano sin inmunizar se aíslan, se cultivan in vitro y, después, se exponen al inmunógeno en el cultivo celular. Después, se recogen los linfocitos y se lleva a cabo la etapa de fusión que se describe más adelante.

Para los anticuerpos monoclonales, la etapa siguiente es el aislamiento de esplenocitos del mamífero no humano inmunizado y la posterior fusión de los esplenocitos con una célula inmortalizada con el fin de formar un hibridoma productor de anticuerpo. El aislamiento de los esplenocitos de un mamífero no humano es bien conocido en la técnica y normalmente implica extraer el bazo de un mamífero no humano anestesiado, cortarlo en piezas pequeñas y apretar los esplenocitos desde la cápsula esplénica y a través de una malla de nylon de un colador celular en un tampón adecuado para producir una suspensión de células- Las células se lavan, se centrifugan y se resuspenden en un tampón que lisa los glóbulos rojos. La solución se centrifuga otra vez y los linfocitos remanentes en el sedimento se resuspenden, por último, en tampón fresco.

Una vez aislado y presente en la suspensión celular sencilla, los linfocitos se condensan a una línea celular inmortal. Normalmente, esta es una línea celular de mieloma de ratón, aunque en la técnica se conocen muchas otras líneas de células inmortales útiles para crear hibridomas. Líneas de mieloma murino preferidas incluyen, entre otras, las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. EE.UU. o células X63 Ag8653 y SP-2 disponibles en la colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, EE.UU. La fusión se efectúa usando polietilenglicol. Después, los hibridomas resultantes se cultivan en medio selectivo que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parental sin condensar. Por ejemplo, su las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirán hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Normalmente, los hibridomas se cultivan en una capa alimentadora de macrófagos. Preferentemente, los macrófagos de hermanos de camada del mamífero no humano usado para aislar esplenocitos y normalmente se deban con adyuvante incompleto de Freund o similares varios días antes de sembrar los hibridomas. Los procedimientos de condensación se describe en (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59103 (Academic Press, 1986)).

Se dejan crecer las células en el medio de selección durante tiempo suficiente para la formación de colonias y producción de anticuerpos. Normalmente esto es entre 7 y 14 días. Después, las colonias de hibridoma se analizan para detectar la producción de anticuerpos que se unen a los productos génicos de KIR. Normalmente, el ensayo es un ensayo colorimétrico de tipo ELISA, aunque se pueden usar varios otros tipos de ensayos, incluidos inmunoprecipitación, radioinmunoensayo, ensayos Biacore o ensayos de proximidad por centelleo (SPA), también conocidos en la técnica. Si hay más de una colonia presente, las células se pueden volver a clonar y cultivar para garantizar que sólo una célula única ha dado lugar a la colonia productora del anticuerpo deseado. Los pocillos positivos con una sola colonia aparente normalmente se vuelven a clonar y a analizar para garantizar que sólo se detecta y produce un anticuerpo monoclonal.

Los hibridomas que se confirma que están produciendo un anticuerpo monoclonal de la presente invención y después se cultivan en cantidades mayores en un medio adecuado, tal como DMEM o RPMI-1640. Como alternativa, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Después del cultivo suficiente para producir el anticuerpo monoclonal deseado, el medio de crecimiento que contiene anticuerpo monoclonal (o el fluido ascítico) se separa de las células y se purifica el anticuerpo monoclonal presente en el mismo. Normalmente, la purificación se consigue mediante cromatografía usando proteína A o proteína G-Sefarosa o una Ig anti-ratón unida a un soporte sólido, tal como perlas de agarosa o Sefarosa (todos descritos en, por ejemplo, Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publicación nº 18-1037-46, Edición AC). Normalmente, el anticuerpo unido se eluye de las columnas de proteína A/proteína G usando tampones de pH bajo (tampones de glicina o acetato de pH 3,0 o menor) con neutralización inmediata de las fracciones que contienen anticuerpo. Estas fracciones se combinan, dializan y concentran según sea necesario.

De acuerdo con una realización alternativa, el ADN que codifica un anticuerpo de la invención se aísla del hibridoma, se introduce en un vector de expresión adecuado para transfeccionar en un huésped adecuado. Después, el huésped se usa para la producción recombinante del anticuerpo, o variantes del mismo, tal como una versión humanizada del anticuerpo monoclonal, fragmentos activos del anticuerpo o anticuerpos quiméricos que comprenden la porción de reconocimiento antigénico del anticuerpo. Particularmente, el ADN usado en esta realización codifica un anticuerpo que reconoce un determinante que comprende el dominio 1 y/o dominio 2 de los productos génicos de KIR2DL y produce potenciación de las células NK que expresan al menos uno de los receptores KIR.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos murinos). Una vez aislado, el ADN se introduce en los vectores de expresión que después de transfeccionan en células huésped tales como E. coli, células COS de simio, células de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que, de otro modo, no producen proteína inmunoglobulina para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped. La expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); y Pluckthun, Immunol. Revs., 130, pp. 151 (1992).

También se pueden producir anticuerpos mediante la selección de bibliotecas combinatorias de inmunoglobulinas, como se divulga en, por ejemplo, Ward y col. (Nature 341 (1989) 544).

Fragmentos y derivados de anticuerpos

Se pueden producir fragmentos y derivados de anticuerpos de la presente invención mediante técnicas conocidas en la materia. “Fragmentos inmunorreactivos” comprenden una porción del anticuerpo intacto, en general, el sitio de unión a antígeno o la región variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, and Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que es un polipéptido que tiene una estructura primaria consistente en una secuencia no interrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominado en el presente documento "fragmento de anticuerpo de cadena sencilla" o "polipéptido de cadena sencilla"), incluidas, sin limitaciones (1) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) (2) polipéptidos de cadena sencilla que solo contienen un dominio variable de cadena ligera o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de la cadena ligera, sin un resto de cadena pesada asociada y (3) polipéptidos de cadena sencilla que sólo contiene una región variable de cadena pesada o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR de la región variable de la cadena pesada, sin un resto de cadena ligera asociada, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se producen fragmentos Fab o F(ab’)2 mediante digestión con proteasa de los anticuerpos aislados de acuerdo con técnicas convencionales.

Como alternativa, el ADN de un hibridoma productor de un anticuerpo de la presente invención se puede modificar para codificar un fragmento de la presente invención. Después, el ADN modificado se inserta en un vector de expresión y se usa para transformar o transfeccionar una célula adecuada que, después, expresa el fragmento deseado.

En una realización alternativa, el ADN de un hibridoma productor de un anticuerpo de la presente invención se puede modificar antes de la inserción en un vector de expresión mediante, por ejemplo, sustitución de la secuencia codificadora para los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias no humanas homólogas (p. ej., Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia codificadora de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina. De este modo, se preparan anticuerpos “quiméricos” o “híbridos” que tienen la especificidad de unión del anticuerpo original. Normalmente, dichos polipéptidos no inmunoglobulínicos se sustituyen con los dominios constantes de un anticuerpo de la invención.

Por tanto, los anticuerpos de la presente invención se pueden convertir en “anticuerpos quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en el anticuerpo original, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Cabilly y col., ant.; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)).

La producción recombinante de anticuerpos a partir de cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) y regiones constantes humanas conocidas se ha descrito en, por ejemplo, Ruker y col. (Annals of the New York Academy of Sciences. 1991;646:212-219), que dan a conocer la expresión de un anticuerpo monoclonal humano anti-HIV-1 en células CHO; Bianchi y col. (Biotechnology and Bioengineering. 2003;84:439-444), que describe la expresión de niveles elevados de anticuerpos de longitud completa usando vectores de expresión transcomplementarios, No Soo Kim y col. (Biotechnol. Prog. 2001;17:69-75), que describe determinantes clave en la aparición de variación clonal en la expresión de anticuerpo humanizado de células CHO durante la amplificación génica mediada por la dihidrofolato reductasa King y col. (Biochemical Journal. 1992;281:317-323), que da a conocer la expresión, purificación y caracterización de un anticuerpo quimérico humano-ratón y fragmento Fab’ quimérico; el documento WO 2003064606, que describe anticuerpos monoclonales humanos aislados que comprenden una región variable de cadena pesada humana y una región variable de cadena ligera humana, comprendiendo ambas las secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4; y el documento WO 2003040170, que describe anticuerpos monoclonales quiméricos o humanos u porciones de unión a antígeno que se unen específicamente y activa el CD40 humano.

En un ejemplo de realización se produce un AcMo recombinante quimérico de las secuencias VH y VL de 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4 VH, o un derivado o variante del mismo. Para subclonar los genes del anticuerpo en vectores de expresión de mamífero, se diseñan cebadores para la amplificación de los genes de la cadena ligera variable (VL) y la cadena pesada variable (VH), respectivamente, en base a los ADNc que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del AcMo. Las regiones variables se formatean mediante PCR para incluir una secuencia Kozak, una secuencia líder y sitios de restricción únicos. Para la VL, esto se consigue diseñando cebadores en 5’ para PCR para introducir un sitio HindIII, la secuencia Kozak y para que sean homólogos al extremo 5’ de la secuencia líder de la región variable de la cadena ligera. El cebador de 3’ es homólogo al extremo 3’ de la región variable e introduce un sitio BsiWI en el límite 3’ de la región variable. La región VH se genera de un modo similar, excepto que se introducen un sitio NotI y un sitio Nhel en los extremos 5’ y 3’ en lugar de HindIII y BsiWI, respectivamente.

Los productos génicos amplificados se clonan, cada uno, en un vector de expresión eucariótica comercialmente disponible o conocido de otro modo que contiene las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada para un anticuerpo humano o no humano, usando técnicas estándar. Un ejemplo de un vector disponible comercialmente es pASK84, disponible en la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, número de catálogo 87094). Los fragmentos de ADN de la VL se digieren con HindIII and BsiWI y se ligan en un vector de expresión eucariótica que contiene el gen de la beta-lactamasa que codifica resistencia a ampicilina y un origen de replicación de E. coli (Puc); el plásmido resultante se denomina VLCL. Los fragmentos de ADN de VH se digieren con NotI y Nhel y se introducen en el vector VLCL resultante de la introducción del fragmento VL, como se ha descrito anteriormente. El plásmido resultante contiene casetes de expresión funcionales que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo en el mismo plásmido. El plásmido ligado se usa para transformar E. coli. El ADN plasmídico se prepara a partir de estas poblaciones bacterianas resistentes a ampicilina y se usan para la transfección en células CHO u otras líneas de células de mamífero. La transfección y el cultivo celular se pueden realizar mediante procedimientos convencionales, como se describe en, por ejemplo, “Molecular Cloning", Sambrook y col. El resultado es líneas celulares transfeccionadas que expresan y secretan de forma estable la molécula de anticuerpo de interés, tal como una versión quimérica de 1-26F117, que comprende sus regiones VH y VL originales y las regiones constantes de un AcMo humano.

Las secuencias de ADN completas que codifican las regiones constantes de IgG humana se pueden encontrar en los siguientes registros de GenBank:

Región constante de la cadena pesada de IgG1 humana: Número de registro en GENBANK: J00228 Región constante de la cadena pesada de IgG2 humana: Número de registro en GENBANK: J00230 Región constante de la cadena pesada de IgG3 humana: Número de registro en GENBANK: X04646 Región constante de la cadena pesada de IgG4 humana: Número de registro en GENBANK: K01316 Región constante de la cadena ligera kappa humana: Número de registro en GENBANK: J00241.

Como alternativa, las regiones VH y VL de 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4, o mutantes o derivados de las mismas, se pueden clonar en vectores que codifican regiones constantes truncadas con el fin de expresar fragmentos de anticuerpo (p. ej., fragmentos Fab).

El cambio de isotipo del anticuerpo se puede realizar de acuerdo con principios similares. Por ejemplo, se puede obtener un anticuerpo con la misma exacta especificidad que 1-26F117-A3 o-A4 pero de diferente isotipo mediante subclonación del ADNc que codifica las secuencias VL y VH en plásmidos que contienen ADNc que codifica las regiones constantes de la cadena ligera kappa y una región constante de la cadena pesada seleccionadas de las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 o IgG2 o IgG3 o IgG4. Por tanto, un anticuerpo generado puede poseer cualquier isotipo y se puede cambiar el isotipo del anticuerpo usando técnicas convencionales en la materia. Dichas técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.816.397), técnicas de fusión célula-célula (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5,916,771) y otras técnicas adecuadas conocidas en la materia. De acuerdo con esto, la función efectora de los anticuerpos proporcionada por la invención puede “cambiarse” con respecto al isotipo de un anticuerpo parental mediante cambio de isotipo a, por ejemplo, un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM para varios usos terapéuticos o de otro tipo.

De acuerdo con otra realización, el anticuerpo de la presente invención es humanizado. Las formas "humanizadas” de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’) 2, u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos), que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina murina. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR del anticuerpo original (anticuerpo donante), al tiempo que se mantiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas del anticuerpo original. En algunos casos, los residuos de la región estructural Fv de la inmunoglobulina humana pueden sustituirse con los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en la CDR importada o las secuencias estructurales. Estas modificaciones se efectúan para perfeccionar y optimizar adicionalmente el funcionamiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las del anticuerpo original y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann y col., Nature, 332, pp. 323 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992). De acuerdo con esto, las versiones humanizadas de -26F117-A3 o 1-26F117-A4 que comprenden las regiones CDR de VH y VL de 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4 y las regiones constantes y estructurales de un AcMo humano se pueden preparar usando las secuencias conocidas de AcMo humanas constantes un estructurales y técnicas establecidas en la materia, como se describe en el presente documento.

Los procedimientos para humanizar los anticuerpos de la presente invención son bien conocidos en la técnica.

En general, un anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él procedentes del anticuerpo original. Estos residuos de aminoácidos murinos u otros no humanos a menudo se denominan residuos de “importación”, que normalmente proceden de un dominio variable de “importación”: La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321, pp. 522 (1986); Riechmann y col., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239, pp. 1534 (1988)). De acuerdo con esto, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (Cabilly y col., patente de EE.UU. nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido con la correspondiente secuencia del anticuerpo original. En la práctica, los anticuerpos humanizados de acuerdo con la presente invención son, habitualmente, anticuerpos en los que algunos residuos CDR y, posiblemente algunos residuos FR, están sustituidos con residuos de sitios análogos del anticuerpo original.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligero como pesado, que se van a usar la fabricar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigeneicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de la presente invención se somete a detección selectiva contra toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos. Por tanto, la secuencia humana más parecida a la del ratón se acepta como la estructura (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol., 151, pp. 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196, pp. 901 (1987)). Otro procedimiento usa una estructura concreta de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligera o pesada. La misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, pp. 4285 (1992); Presta y col., J. Immunol., 51, pp. 1993)).

Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con la retención de una afinidad elevada para múltiples receptores KIR inhibidores y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y varios producíos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizadas. Habitualmente de dispone de modelos tridimensionales de inmunoglobulina y los expertos en la técnica están familiarizados con ellos. se dispone de programas informáticos que ilustran y exhiben probables estructuras conformacionales tridimensionales de candidatos a secuencias de inmunoglobulina seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite en análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir el análisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias consenso y de importación, de modo que se consigue el anticuerpo deseado característico, tal como un incremento de afinidad por el(los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están directamente, y más sustancialmente, implicados en la influencia de la unión a antígeno.

Otro procedimiento de fabricar anticuerpos monoclonales “humanizados” es usar un XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) como el ratón usado para inmunización. Un XenoMouse es un huésped murino de acuerdo con la presente invención en el que se han sustituido sus genes de inmunoglobulina por genes de inmunoglobulina humana funcional. Por tanto, los anticuerpos producidos por este ratón o en hibridomas preparados a partir de las células B de este ratón ya son humanos. El XenoMouse se describe en la patente de EE.UU. nº 6.162.963. Se puede conseguir un procedimiento análogo usando un HuMAb-Mouse™ (Medarex).

Los anticuerpos humanos también se pueden producir de acuerdo con otras diversas técnicas, tal como usando, para la inmunización, otros animales transgénicos que se han sometido a ingeniería para expresar un repertorio de anticuerpos humanos (Jakobovitz y col., Nature 362 (1993) 255) o mediante la selección de repertorios de anticuerpos usando procedimientos de expresión en fagos. Dichas técnicas son conocidas para el experto y se pueden implementar a partir de anticuerpos monoclonales, como se divulga en la presente solicitud.

Otros derivados dentro del alcance de la presente invención incluyen anticuerpos funcionarizados, es decir anticuerpos que están conjugados o unidos covalentemente a una toxina, tal como ricino, toxina diftérica, abrina y exotoxina de Pseudomonas, con un resto detectable, tal como un resto fluorescente, un radioisótopo o un agente para prueba de imagen; una molécula PEG; o con un soporte sólido, tal como perlas de agarosa. Los procedimientos para conjugación o unión covalente de estos otros agentes a anticuerpos son bien conocidos en la técnica.

La conjugación con un resto detectable es útil cuando el anticuerpo de la presente invención se usa con fines diagnósticos. Dichos fines incluyen, entre otros, ensayos de muestras biológicas para detectar la presencia de las células NK portadoras del KIR sobre su superficie celular y detectar la presencia de células NK portadoras del KIR en un organismo vivo. Dicho ensayo y procedimientos de detección son también realizaciones alternativas de la presente invención.

La conjugación de un anticuerpo de la presente invención con un soporte sólido es útil como herramienta para la purificación por afinidad de las células NK portadoras del KIR sobre su superficie celular procedentes de una fuente, tal como un fluido biológico. Este procedimiento de purificación es otra realización alternativa de la presente invención, como es la población purificada resultante de las células NK.

En una realización alternativa, los anticuerpos de la presente invención se pueden incorporar en liposomas (“inmunopolisomas”), solos o junto con otras sustancia para la liberación dirigida a un animal. Estas otras sustancias incluyen ácidos nucleicos para la liberación de genes para terapia génica o para la liberación de ARN antisentido, ARNi o ARNsi para suprimir un gen en una célula NK, o toxinas o fármacos para la muerte dirigida de las células NK.

El procedimiento descrito anteriormente para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a un determinante en un producto génico del receptor de KIR humano, en el que dicho antibiótico es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK también se puede aplicar para el aislamiento de otros agentes. En una realización concreta, la invención se refiere a un procedimiento de aislar un agente capaz e neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK por medio de:

a) proporcionar un grupo de agentes de ensayo; y b) seleccionar los agentes de ensayo que reducen o bloquean la dimerización de KIR en condiciones que conducen a la dimerización (tal como la presencia de células diana que expresan HLA-C u otros ligandos de KIR); c) seleccionar cualquier agente de (b) que sea capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK, en el que el orden de las etapas (b) y (c) se puede invertir.

En otra realización concreta, la invención se refiere a un procedimiento de aislar un agente capaz e neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK por medio de:

a) proporcionar un grupo de agentes de ensayo; y b) seleccionar los agentes de ensayo que no reducen ni bloquean de forma detectable y/o sustancial la unión de KIR a HLA en condiciones que conducen a la unión de KIR a HLA-C (tal como la presencia de células diana que expresan HLA-C u otros ligandos de KIR); c) seleccionar cualquier agente de (b) que sea capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las las células NK, en el que el orden de las etapas (b) y (c) se puede invertir.

Composiciones y administración

La divulgación también proporciona composiciones que comprenden un agente, por ejemplo un agente como se ha definido anteriormente, incluidos fragmentos de unión y derivados de los mismos, en cualquier vehículo adecuado en una cantidad eficaz para potenciar de forma detectable la citotoxicidad de las células NK en un paciente o en una muestra biológica que comprende células NK. La composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión "muestra biológica”, como se usa en el presente documento, incluye, entre otros, un fluido biológico (por ejemplo suero, linfa o sangre), muestra celular o muestra tisular (por ejemplo, médula ósea).

Vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en estas composiciones incluyen, entre otros, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tampón, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas glicéridas parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Las composiciones de la presente invención se pueden usar en un procedimiento de potenciación de la actividad de las células NK en un paciente o muestra biológica. Este procedimiento comprende la etapa de poner en contacto dicha composición con dicho paciente o muestra biológica. Dicho procedimiento será útil para fines diagnósticos y terapéuticos.

En una realización concreta, la invención se refiere a un procedimiento de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión de KIR a su ligando HLA, por ejemplo reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR.

En una realización adicional, la dimerización se bloquea mediante la unión de un agente a un determinante que afecta a la interacción entre los sitios de interacción asociados con el dominio 1 o 2 de KIR2DL1, -2 o -3, o a los sitios de interacción homólogos en todos los KIR, así como otros potenciales KIR.

En una realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento de reducir la inhibición mediada por KIR de una citotoxicidad de las células NK usando un agente, tal como un anticuerpo, que compite con un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL del anticuerpo 1-26F117-A3 o-A4 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.

En una realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento de reducir la inhibición mediada por KIR de una citotoxicidad de las células NK usando un agente, tal como un anticuerpo, que compite con el epítopo de KIR2DL1 y/o KIR2DL3 reconocido por un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL del anticuerpo 126F117-A3 o-A4.

Para usar junto con una muestra biológica, la composición de anticuerpo se puede administrar simplemente mezclando o aplicando directamente sobre la muestra, dependiendo de la naturaleza e la muestra (fluido o sólido). La muestra biológica puede entrar en contacto directamente con el anticuerpo en un dispositivo adecuado (placa, bolsa, matraz, etc.). Para usar junto con un paciente, la composición debe formularse para administración al paciente.

Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende un agente de unión anti-KIR que está presente en una concentración de 1 mg/ml a 500 mg/ml, y en la que dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además un sistema tampón, conservante(s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y tensioactivos. En una realización de la invención, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir una formulación que comprende agua. Normalmente, dicha formulación es una solución o una suspensión. En una realización adicional de la invención, la formulación farmacéutica es una solución acuosa. La expresión “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos uno 50 % p/p de agua. Asimismo, la expresión “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua y la expresión “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua.

En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añade disolventes y/o diluyentes antes de usar.

En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación seca (p. ej., liofilizada o desecada por aerosol) lista para usar sin ninguna disolución previa.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende una solución acuosa del agente, un tampón, en la que el agente está presente en una concentración de 1 mg/ml o superior, y en la que dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

En otra realización de la invención, el pH de la formulación se selecciona de la lista que consiste en 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 y 10,0.

En una realización adicional de la invención, el tampón se selecciona del grupo que consiste en acetato sódico, carbonato sódico, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógenofosfato sódico, hidrogenofosfato disódico, fosfato sódico y tris(hidroximetil)aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tampones específicos constituye una realización alternativa de la invención.

En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además un conservante farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional de la invención, el conservante se selecciona del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, phidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomerosal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato sódico, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de benzetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) o mezclas de los mismos. En una realización adicional de la invención, el conservante a una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el conservante a una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el conservante a una concentración de 5 mg/ml a 10 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el conservante a una concentración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un conservante en composiciones farmacéuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además un agente isotónico. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico se selecciona del grupo que consiste en una sal (p. ej., cloruro sódico), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (p. ej., L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (p. ej., glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propileneglicol), 1,3propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (p. ej., PEG400), o mezclas de los mismos. Se puede usar cualquier azúcar, tales como mono, di o polisacáridos, o glucanos hidrosolubles, incluidos, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trealosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietilalmidón y carboximetilcelulosa-Na. En una realización, el aditivo de azúcar es sacarosa. El alcohol de azúcar se define como un hidrato de carbono de C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una realización, el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o alcoholes de azúcar mencionados anteriormente se pueden usar de forma individual o en combinación. No hay un límite fijo de la cantidad usada, siempre que el azúcar o alcohol de azúcar sea soluble en la preparación líquida y que no afecte adversamente a los efectos estabilizantes conseguidos usando los procedimientos de la invención. En una realización, la concentración del azúcar o del alcohol de azúcar está entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente a una concentración de 1 mg/ml a 50 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente a una concentración de 1 mg/ml a 7 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente a una concentración de 8 mg/ml a 24 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente a una concentración de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada uno de estos agentes isotónicos específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un agente isotónico en composiciones farmacéuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además un agente quelante. En una realización adicional de la invención, el agente quelante se selecciona de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico, y mezclas de los mismos. En una realización adicional de la invención, el agente quelante está presente a una concentración de 0,1 mg/ml a 5mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente quelante está presente a una concentración de 0,1 mg/ml a 2mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente quelante está presente a una concentración de 2mg/ml a 5mg/ml. Cada uno de estos agentes quelantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un agente quelante en composiciones farmacéuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además un estabilizante. El uso de un estabilizante en composiciones farmacéuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

Más particularmente, las composiciones de la invención son composiciones farmacéuticas líquidas estabilizadas cuyos componentes terapéuticamente activos incluyen un polipéptido que posiblemente exhibe formación de agregados durante el almacenamiento en formulaciones farmacéuticas líquidas. Por “formación de agregados” se pretende decir una interacción física entre las moléculas de polipéptido que tiene como resultado la formación de oligómeros, que pueden permanecer solubles, o de agregados grandes visibles que precipitan en la solución. Por "durante el almacenamiento" se pretende decir una composición o formulación farmacéutica que una vez preparada no se administra inmediatamente a un sujeto. En su lugar, tras la preparación se envasa para almacenar, bien en forma líquida, en estado congelado o en forma seca para su posterior reconstitución en una forma líquida u otra forma adecuada para administrar a un sujeto. Por “forma seca” se pretende decir la composición o formulación farmacéutica líquida se seca bien mediante secado por congelación (es decir, liofilización; véase, por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59), secado por nebulización (véase Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5ª ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broad-head y col. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; y Mumenthaler y col. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), o secado por aire (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; y Roser (1991) Biopharm.4:47-53). La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversamente a la actividad biológica de dicho polipéptido, lo que tiene como resultado la pérdida de eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede producir otros problemas, tales como bloqueo de tubos, membranas o bombas cuando la composición farmacéutica que contiene el polipéptido se administra usando un sistema de infusión.

La composiciones farmacéuticas de la invención pueden además comprender una cantidad de una base de aminoácidos suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. Por “base de aminoácidos” se pretende decir un aminoácido o una combinación de aminoácidos en la que cualquier aminoácido está presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Cuando se usa una combinación de aminoácidos, todos los aminoácidos pueden estar presentes en sus formas de base libre, todos pueden estar presentes en sus formas de sal o algunos pueden estar presentes en sus formas de base libre mientras que otros están presentes en sus formas de sal. En una realización, los aminoácidos para usar en la preparación de las composiciones de la invención son los portadores de una cadena lateral cargada, tal como arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. Cualquier estereoisómero (es decir, L, D, o una mezcla de los mismos) de un aminoácido concreto (p. ej., metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina y mezclas de los mismos) o combinaciones de estos estereoisómeros, puede estar presente en las composiciones farmacéuticas de la invención siempre que el aminoácido concreto esté presente en su forma de base libre o en su forma de sal. En una realización, se usa el L-estereoisómero. Las composiciones de la invención también se pueden formular con análogos de estos aminoácidos. Por “análogo de aminoácido” se pretende decir un derivado del aminoácido natural que conlleva el efecto deseado de disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención. Análogos adecuados de arginina incluyen, por ejemplo, aminoguanidina, ornitina y N-monoetil-L-arginina, análogos adecuados de metionina incluyen etionina y butionina, y análogos adecuados de cisteína incluyen S-metil-L-cisteína. Como con los otros aminoácidos, los análogos de aminoácidos se incorporan en las composiciones en su forma de base libre o su forma de sal. En una realización adicional de la invención, el aminoácido o análogos de aminoácidos se usan en una concentración que es suficiente para evitar o retrasar la agregación de la proteína.

En una realización adicional de la invención se puede añadir metionina (u otro aminoácido sulfúrico o análogo de aminoácido) para inhibir la oxidación de los residuos de metionina en sulfóxido de metionina cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a dicha oxidación. Por “inhibe” se quiere decir la acumulación mínima de especies de metionina oxidada con el tiempo. La inhibición de la oxidación de metionina tiene como resultado una mayor conservación del polipéptido en su forma molecular adecuada. Se puede usar cualquier estereoisómero de metionina (L o D) o combinaciones de los mismos. La cantidad a añadir deberá ser una cantidad suficiente para inhibir la oxidación de los residuos de metionina de modo que la cantidad de sulfóxido de metionina es aceptable para las agencias reguladoras. Normalmente, esto significa que la composición contiene no más de aproximadamente del 10 % a aproximadamente el 30 % del sulfóxido de metionina. En general, esto se puede conseguir añadiendo metionina de modo que la proporción de metionina añadida a los residuos de metionina varía de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1, tal como 10:1 a aproximadamente 100:1.

En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además un estabilizante seleccionado del grupo de polímeros de peso molecular alto o compuestos de peso molecular bajo. En una realización adicional de la invención, el estabilizante se selecciona de polietilenglicol (p. ej., PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxihidroxicelulosa o derivados de los mismos (p. ej., HPC, HPC-SL, HPC-L and HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monitioglicerol, ácido tioglicílico y 2-metiltioetanol y sales diferentes (p. ej., cloruro sódico). Cada uno de estos estabilizantes específicos constituye una realización alternativa de la invención.

KAS composiciones farmacéuticas pueden también comprender agentes estabilizantes adicionales, que además potencian la estabilidad de un polipéptido terapéuticamente activo en las mismas. Agentes estabilizantes de particular interés para la presente invención incluyen, entre otros, metionina y EDTA, que protegen el polipéptido contra la oxidación de metionina, y un tensioactivo no iónico, que protege al polipéptido contra la agregación asociada con la descongelación o con la cizalladura mecánica.

En una realización adicional de la invención, la formulación compende además un tensioactivo. En una realización adicional de la invención, el tensioactivo se selecciona a partir de un detergente, aceite de ricino etoxilado, glicéridos poliglicolizados, monoglicéridos acetilados, ésteres de ácido graso de sorbitano, polímeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno (p. ej., poloxámeros tales como Pluronic® F68, poloxámero 188 y 407, Triton X-100), ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitano, derivados de polioxietileno y polietileno tales como derivados alquilados y alcoxilados (tweens, p. ej., Tween-20, Tween-40, Tween-80 y Brij-35), monoglicéridos o derivados etoxilados de los mismos, diglicéridos o derivados de polioxietileno de los mismos, alcoholes, glicerol, lectinas y fosfolípidos (p. ej., fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, difosfatidilglicerol y esfingomielina), derivados de fosfolípidos (p. ej., ácido dipalmitoilfosfatídico) y lisofosfolípidos (p. ej., palmitoil lisofosfatidil-L-serina y ésteres 1-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina o treonina) y alquilo, alcoxilo (éster de alquilo), derivados de alcoxi(éter de alquilo) de lisofosfatidol y fosfatidilcolinas, por ejemplo derivados de lauroílo y miristoílo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y modificaciones del grupo de cabeza polar, es decir colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol y el DODAC con carga positivo, DOTMA, CDP, BISHOP, lisofosfatidilserina y lisofosfatidiltreonina, y glicerofosfolípidos (p. ej., cefalinas), gliceroglicolípidos (p. ej., galatopiranósido), esfingoglicolípidos (p. ej., ceramidas, gangliósidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de huevo de gallina, derivados de ácido fusídico (p. ej., taurodihidrofusidato etc.), ácidos grasos de cadena larga y sales de los mismos C6-C12 (p. ej., ácido oleico y ácido caprílico), acilcarnitinas y derivados, derivados Na-acetilados de lisina, arginina o histidina, o derivados acilados de cadena lateral de lisina o arginina, derivados N-acilados de dipéptidos que comprenden cualquier combinación de lisina, arginina o histidina, y un aminoácido neutro o ácido, derivado Na-acilado de un tripéptido que comprende cualquier combinación de un aminoácido neutro y dos aminoácidos cargados, DSS (docusato sódico, nº de registro CAS [577-11-7]), docusato cálcico, nº de registro CAS [128-49-4]), docusato potásico, nº de registro CAS [7491-09-0]), SDS (dodecilsulfato sódico o laurilsulfato sódico), caprilato sódico, ácido cólico o derivados del mismo, ácidos biliares y sales de las mismos, y conjugados de glicina o taurina, ácido ursodesoxicólico, colato sódico, desoxicolato sódico, taurocolato sódico, glicocolato sódico, N-Hex-adecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, tensioactivos monovalentes de (alquil-aril-sulfonatos) aniónicos, tensioactivos zwiteriónicos (p.ej., N-alquil-N,N-dimetilamonio-1-propanosulfonatos, 3-colamido-1-propildimetilamonio-1-propanosulfonato, tensioactivos catiónicos (bases de amonio cuaternario) (p.ej. bromuro de cetil-trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio), tensioactivos no iónicos (p. ej., Dodecil ß-Dglucopiranósido), poloxaminas (p. ej., Tetronic), que son copolímeros de bloque funcionales derivados de la adición secuencial de óxido de propileno y óxido de etileno en etilendiamina, o el tensioactivo se puede seleccionar del grupo de derivados de imidazolina o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tensioactivos específicos constituye una realización alternativa de la invención.

El uso de un tensioactivo en composiciones farmacéuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995. En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además inhibidores de la proteasa, tales como EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y benzamidina-HCl, pero también se pueden usar otros inhibidores de la proteasa disponibles comercialmente. El uso de un inhibidor de la proteasa es particularmente útil en composiciones farmacéuticas que comprenden cimógenos de proteasas, con el fin de inhibir la autocatálisis.

Es posible que en la formulación farmacéutica de la presente invención pueda haber presentes otros ingredientes.

Dichos ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes espesantes, modificadores de la tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (p. ej., seroalbúmina, gelatina o proteínas) y un ion dipolar (p. ej., un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Dichos ingredientes adicionales, por supuesto, no deberían afectar de forma adversa a la estabilidad global de la formulación farmacéutica de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un agente de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un paciente que necesite tal tratamiento en varios puntos, por ejemplo en puntos tópicos, por ejemplo puntos de la piel y la mucosa, en puntos que sortean la absorción, por ejemplo administración en una arteria, en una vena, en el corazón, y en puntos que implican absorción, por ejemplo administración en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.

La administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede realizarse por varias vías de administración, por ejemplo lingual, sublingual, bucal, en la boca, oral, en el estómago y el intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo a través de los bronquiolos y alvéolos o una combinación de los mismos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo a través de la conjuntiva, uretral y parenteral, a los pacientes que necesiten tal tratamiento.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar en varias formas de dosificación, por ejemplo como soluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, emulsión múltiple, espumas, salvas, pastas, plastas, pomadas, cápsulas rectales, gotas, geles, pulverizadores, polvo, erosoles, inhaladores, gotas oculares, pomadas oftálmicas, lavados oftálmicas, pesarios vaginales, anillos vaginales, pomadas vaginales, solución para inyección, soluciones de transformación in situ, por ejemplo gelificación in situ, fijación in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, solución in situ, solución para infusión e implantes.

Las composiciones de la invención pueden además formar compuestos, o fijarse, mediante, por ejemplo, interacciones covalentes, hidrofóbicas y electrostáticas, un vehículo farmacológico, un sistema de liberación de fármaco y un sistema de liberación de fármaco avanzado con el fin de potenciar adicionalmente la estabilidad del compuesto, incrementar la biodisponibilidad, incrementar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, conseguir cronoterapia bien conocida para los expertos en la técnica e incrementar el cumplimiento del paciente, o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de vehículos, sistemas de liberación de fármaco y sistemas de liberación de fármaco avanzados incluyen, entre otros, polímeros, por ejemplo celulosa y derivados, polisacáridos, por ejemplo dextrano y derivados, almidón y derivados, poli(alcohol polivinílico), polímeros de acrilato y metacrilato, ácido poliláctico y poliglicólico, y copolímeros de bloque de los mismos, polietilenglicoles, proteínas transportadoras, por ejemplo albúmina, geles, por ejemplo sistemas de termogelificación, por ejemplo sistemas copoliméricos de bloque bien conocidos para los expertos en la técnica, micelas, liposomas, microesferas, nanopartículas, cristales líquidos y dispersiones de los mismos, fase L2 y dispersiones de los mismos, bien conocidos para los expertos en la técnica del comportamiento de fase en sistemas de lípido-agua, micelas poliméricas, emulsiones múltiples, autoemulsiones, automicroemulsiones, ciclodextrinas y derivadas de las mismas, y dendrímeros.

Las composiciones de la presente invención son útiles en la formulación de sólidos, semisólidos, polvos y soluciones para administración pulmonar del agente, usando, por ejemplo, un inhalador de dos medida, inhalador de polvo seco y un nebulizador, siendo todos dispositivos bien conocidos para los expertos en la técnica. Composiciones de la presente invención son específicamente útiles en la formulación de sistemas de liberación de fármacos controlada, sostenida, protraída, retardada y de liberación lenta. Más específicamente, pero sin limitarse a ello, las composiciones son útiles en la formulación de sistemas de liberación parenteral controlada y de liberación sostenida (ambos sistemas conducen a una reducción de muchas veces el número de administraciones), bien conocidos para

5 los expertos en la técnica. Incluso más preferentemente, son sistemas de liberación controlada o de liberación sostenida administrados por vía subcutánea. Sin limitar el alcance de la invención, ejemplos de sistema de liberación controlada útiles y composiciones son hidrogeles, geles oleaginosos, cristales líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas.

Procedimientos para producir sistemas de liberación controlada útiles para composiciones de la presente invención incluyen, entre otros, cristalización, condensación, co-cristalización, precipitación, co-precipitación, emulsificación, dispersión, homogeneización de presión alta, encapsulación, secado por pulverización, microencapsulación, coacervación, separación de fases, evaporación de disolvente para producir procesos de microesferas, extrusión y fluido supercrítico. Se hace referencia general al Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) y al Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and

15 Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).

La administración parenteral se puede realizar por inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, por medio de una jeringuilla, opcionalmente una jeringuilla de tipo lápiz. Como alternativa, la administración parenteral se puede realizar por medio de una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede ser una solución o suspensión para la administración del agente en forma de un nebulizador nasal o pulmonar. Como otra opcional adicional, las composiciones farmacéuticas que contienen el agente de la invención también se pueden adaptar a administración transdérmica, por ejemplo mediante inyección sin aguja o desde un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o administración transmucosa, por ejemplo bucal.

El agente se puede administrar por vía pulmonar en un vehículo, como solución, suspensión o polvo seco usando cualquiera de los tipos conocidos de dispositivos adecuados para liberación pulmonar del fármaco. Ejemplos de

25 estos comprenden, entre otros, los tres tipos generales de generador de aerosol para liberación pulmonar del fármaco y pueden incluir nebulizadores de chorro o ultrasónicos, inhaladores de dosis medida o inhaladores de polvo seco (véase, Yu J, Chien YW.). Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).

En base a la metodología de análisis convencional, el diámetro aerodinámico (da) de una partícula se define como el diámetro geométrico equivalente de una partícula esférica estándar de referencia de densidad la unidad (1 g/cm3). En el caso más simple, para las partículas esféricas, el da está relacionado con un diámetro de referencia (d) como función de la raíz cuadrada de la proporción de la densidad, como se describe mediante:

Para las partículas no esféricas se producen modificaciones de estar relación (véase Edwards DA, Ben-Jebria A,

35 Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Los términos "MMAD" y "MMEAD" se describen bien y son conocidos en la técnica (véase, Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). La mediana del diámetro arodinámico de la masa (MDAM) y la mediana del diámetro aerodinámico eficaz de la masa (MDAEM) se usan de forma intercambiable, son parámetros estadísticos y empíricamente describen el tamaño de las partículas de aerosol en relación con su potencial para depositarse en los pulmones, con independencia de la forma, el tamaño o la densidad reales (véase Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). La MMDAM normalmente se calcula a partir de la medición realizada con impactadores, un instrumento que mide el

45 comportamiento de la partícula inerte en el aire.

En una realización adicional, la formulación se podría aerosolizar mediante cualquier tecnología de aerosolización conocida, tal como la nebulización, para conseguir una MDAM de las partículas de aerosol inferior a 10 !m, más preferentemente entre 1-5 !m, y más preferentemente entre 1-3 !m. El tamaño de partícula preferido se basa en el tamaño más eficaz para la liberación del fármaco a zonas profundas de los pulmones, en las que la proteína se absorbe de forma óptima (véase Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).

El depósito en zonas profundas de los pulmones de las formulaciones pulmonares que comprenden el agente pueden opcionalmente optimizarse usando modificaciones de las técnicas de inhalación, por ejemplo, entre otras: Flujo de inhalación lento (p. ej., 30 Umin), mantenimiento de la respiración y el momento de la aplicación.

La expresión “formulación estabilizada” hace referencia a una formulación con mayor estabilidad física, mayor estabilidad química o mayor estabilidad física y estabilidad química.

La expresión “estabilidad física” de una formulación de proteína (p. ej., un anticuerpo), como se usa en el presente documento, se refiere a la tendencia de la proteína a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de la proteína como resultado de la exposición de la proteína a tensiones termomecánicas y/o la interacción con interfaces y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies e interfaces hidrofóbicas. Estabilidad física de las formulaciones de proteína acuosa se evalúa por medio de inspección visual y/o mediciones de la turbidez después de exponer la formulación cargada en contenedores adecuados (p. ej., cartuchos o viales) a tensión mecánica/física

(p. ej., agitación) a diferentes temperaturas durante varios periodos de tiempo. La inspección visual de las formulaciones se realiza en una luz focalizada nítida con un fondo oscuro. La turbidez de la formulación se caracteriza por una puntuación visual que clasifica el grado de turbidez en, por ejemplo, una escala de 0 a 3 (una formulación que nuestra ausencia de turbidez corresponde a una puntuación visual de 0 y una formulación que muestra turbidez visual con luz diurna corresponde a una puntuación visual de 3). Una formulación se clasifica como físicamente inestable con respecto a la agregación de proteínas cuando muestra una turbidez visual a la luz diurna. Como alternativa, la turbidez de la formulación se puede evaluar mediante simples mediciones de la turbidez bien conocidas para el experto. La estabilidad física de las formulaciones de proteína acuosas también se puede evaluar usando un agente o sonda espectroscópica del estado conformacional de la proteína Preferentemente, la sonda es una molécula pequeña que preferentemente se une a un conformador no nativo de la proteína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica molecular pequeña de la estructura proteica es tioflavina T. La tioflavina T es un pigmento fluorescente que se ha usado ampliamente para la detección de fibrillas de amiloide. En presencia de fibrillas, y quizá de otras configuraciones proteicas también, la tioflavina T da lugar a una nueva excitación máxima a aproximadamente 450 nm y una emisión potenciada a aproximadamente 482 nm cuando se une a una forma de fibrilla de la proteína. Esencialmente, la tioflavina T sin unir es no fluorescente a las longitudes de onda.

Se pueden usa moléculas pequeñas como sondas de los cambios de la estructura proteica desde estados nativos a no nativos. Por ejemplo, las sondas de “parche hidrófobo” se unen, preferentemente, a parches hidrófobos expuestos de una proteína. Los parches hidrófobos generalmente se entierran en la estructura terciaria de una proteína en su estado nativo, pero pasan a quedar expuestos cuando una proteína comienza a desplegarse o desnaturalizarse. Ejemplos de estas sondas espectroscópicas moleculares pequeñas son pigmentos hidrófobos aromáticos, tales como antraceno, acridina, fenantrolina. Otras sondas espectroscópicas son complejos de metalaminoácido, tal como complejos del metal cobalto de aminoácidos hidrófobos, tales como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina y valina.

La expresión “estabilidad química” de la formulación proteica, como se usa en el presente documento, se refiere a cambios covalentes químicos en la estructura de la proteína que conducen a la formación de productos de degradación química con una potencial disminución de la potencia biológica y/o un potencial incremento de las propiedades inmunogénicas en comparación con la estructura nativa de la proteína, Se pueden formar varios productos de la degradación química según el tipo y la naturaleza de la proteína nativa y el entorno al que se expone la proteína. La eliminación de la degradación química puede, con mayor probabilidad, no evitarse completamente y a menudo se ven cantidades crecientes de productos de la degradación química durante el almacenamiento y uso de la formulación proteica, algo bien conocido para el experto en la técnica. La mayoría de las proteínas son propensas a la desamidación, un procedimiento en el que el grupo amida de la cadena lateral en los residuos glutaminilo o asparaginilo se hidroliza para formar un ácido carboxílico libre. Otras vías de degradación implican la formación de productos de transformación de alto peso molecular, en las que dos o más moléculas proteicas están unidas covalentemente entre sí mediante transamidación y/o interacciones disulfuro que conducen a la formación de productos de degradación diméricos, oligoméricos y poliméricos unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). La oxidación (de, por ejemplo, residuos metionina) se puede mencionar como otra variante de la degradación química. La estabilidad química de la formulación proteica se puede evaluar midiendo la cantidad de los productos de degradación química varios puntos de tiempo tras la exposición a diferentes condiciones ambientales (la formación de los productos de degradación a menudo se puede acelerar mediante, por ejemplo, aumento de la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual a menudo se determina mediante la separación de los productos de degradación, dependiendo del tamaño molecular y/o de la carga usando varias técnicas cromatográficas (p. ej., SEC-HPLC y/o RP-HPLC).

Por tanto, como se ha indicado anteriormente, una “formulación estabilizada” hace referencia a una formulación con mayor estabilidad física, mayor estabilidad química o mayor estabilidad física y estabilidad química. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y almacenamiento (en cumplimiento de las condiciones de uso y almacenamiento recomendadas) hasta que llegue la fecha de caducidad.

En una realización de la invención, la formulación farmacéutica que comprende un agente de la invención es estable durante más de 6 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento.

En otra realización de la invención, la formulación farmacéutica que comprende un agente de la invención es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento.

En una realización adicional de la invención, la formulación farmacéutica que comprende un agente de la invención es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento.

En una realización adicional más de la invención, la formulación farmacéutica que comprende el agente de la invención es estable durante más de 2 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento.

Como se ha descrito anteriormente, las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante, por ejemplo vía parenteral, aerosol para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término “parenteral”, como se usa en el presente documento, incluye las técnicas de administración de inyección intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión. Preferentemente, las composiciones se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa.

Las formas inyectables estériles de las composiciones de la presente invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones se puede formular de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles en forma de un disolvente o un medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo blando, incluidos mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas pueden también contener un diluyente o dispersanle alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes de dispersión similares, que normalmente se usan en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables incluidas emulsiones y o suspensiones. Otros tensioactivos de uso habitual tales como Tweens, Spans y otros agentes enulsionantes similares o potenciadores de la biodisponibilidad que normalmente se usan en la fabricación de sólido, líquido u otras formas de dosificación farmacéuticamente aceptables pueden también usarse para los fines de la formulación.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, incluidas, entre otras, cápsulas, comprimidos, suspensiones acuosas o soluciones. En el caso de los comprimidos para uso oral, los vehículos que normalmente se usan incluyen lactosa y almidón de maíz. Agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, también se añaden de forma habitual. Para la administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes de emulsión y de suspensión. Si se desea se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.

Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estas se pueden preparar mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y, por tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao, cera de abeja y polietilenglicoles.

Las composiciones de la presente invención también pueden administrarse por vía tópica, especialmente cuando la diana del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica, incluidas enfermedades de los ojos, la piel o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos.

La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior se puede efectuar en una formulación de supositorio rectal (véase anteriormente) o en una formulación de enema adecuada. También se pueden usar parches transdérmicos tópicos.

Para las aplicaciones tópicas, las composiciones pueden formularse en una pomada adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Los transportadores para administración tópica de los compuestos de la presente invención incluyen, entre otros, aceite mineral, petróleo líquido, petróleo blanco, propilenglicol, compuesto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, las composiciones se pueden formular con una loción o crema adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los transportadores adecuados incluyen, entre otros, aceite mineral, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol estearílico, 2-octildeodecanol, alcohol bencílico y agua.

Para uso oftálmico, las composiciones se pueden formular como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica con pH ajustado o, preferentemente, como soluciones en solución salina isotónica con pH ajustado, con o sin un conservante tal como cloruro de bencilalconio. Como alternativa, para uso oftálmico, las composiciones se pueden formular en una pomada, tal como vaselina.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse también mediante aerosol o inhalación nasales.

Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse en forma de soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, estimulantes de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o de dispersión convencionales.

Se ha demostrado que varios anticuerpos monoclonales son eficientes en situaciones clínicas, tales como Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) o Xolair (Omalizumab), y se pueden usar regímenes de administración similares (Es decir, formulaciones y/o dosis y/o protocolos de administración) con los anticuerpos de la presente invención. Los programas y dosificaciones para la administración se pueden determinar de acuerdo con procedimientos conocidos para estos productos por ejemplo, usando las instrucciones de los fabricantes. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal se puede suministrar a una concentración de 10 mg/ml en viales de un solo uso de 100 mg (10 ml) o 500 mg (50 ml). El producto se formula para administración IV en 9,0 mg/ml de cloruro sódico, 7,35 mg/ml de ditrato sódico dihidrato, 0,7 mg/ml de polisorbato 80 y agua estéril para inyección. El pH se ajusta a 6,5. Un ejemplo de intervalo de dosificación para un anticuerpo KIR transreactivo de la invención puede ser entre aproximadamente 10 mg/m2 y 500 mg/m2. No obstante, se apreciará que estos programas son de ejemplo y que el programa y el régimen óptimos se pueden adaptar teniendo en cuenta la afinidad del anticuerpo y la tolerabilidad de los anticuerpos anti-KIR que deben determinarse en ensayos clínicos. Las cantidades y el programa de inyección de anti-KIR que saturan las células NK durante 24 horas, 48 horas, 72 horas o una semana o un mes se determinarán considerando la afinidad del anticuerpo y sus parámetros farmacocinéticos.

De acuerdo con otra realización, las composiciones de anticuerpo de la presente invención pueden comprender además otro agente terapéutico, incluidos los agentes de uso habitual para el fin terapéutico concreto para el que anticuerpo se está administrando. Habitualmente, el agente terapéutico adicional estará presente en la composición en cantidades normalmente usadas para dicho agente en una monoterapia para la enfermedad o afección concreta que se está tratando. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes terapéuticos usados en el tratamiento de cánceres, agentes terapéuticos usados para tratar enfermedades infecciosas, agentes terapéuticos usados en otras inmunoterapias, citoquinas (tales como IL-2 o IL-15), otros anticuerpos y fragmentos de otros anticuerpos.

Por ejemplo, se dispone de una serie de agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer. Las composiciones de anticuerpos y procedimientos de la presente invención se pueden combinar con otros procedimientos de uso habitual en el tratamiento de la enfermedad concreta, particularmente un tumor, una enfermedad cancerosa u otra enfermedad o trastorno que exhiba el paciente. Siempre que se sepa que una estrategia terapéutica no es perjudicial para la afección del paciente en sí y que no contrarresta de forma significativa el tratamiento basado en anticuerpos KIR inhibidores, se contempla su combinación con la presente invención.

En relación con el tratamiento de tumores sólidos, la presente invención se puede usar en combinación con estrategias clásicas, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia. Por tanto, la invención proporciona terapias combinadas en las que los anticuerpos KIR de acuerdo con la invención se usan de forma simultánea con, antes o después de la cirugía o la radioterapia; o se administran a pacientes junto con, antes o después de los agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos o antiangiogénicos convencionales, o inmunotoxinas o coaguligandos dirigidos.

Cuando uno o más agentes se usan en combinación con una composición de la presente invención en un régimen terapéutico, no se requiere que los resultados combinados sean aditivos a los efectos observados cuando cada tratamiento se efectúa por separado. Aunque generalmente son deseables al menos los efectos aditivos, es beneficioso cualquier incremento anti-canceroso por encima de una de las terapias únicas. Asimismo, no hay un requisito concreto para que el tratamiento combinado exhiba efectos sinérgicos, aunque ello es posible y ventajoso.

Para practicar una terapia anti-cancerosa combinada, simplemente se administraría a un paciente una composición de la presente invención en combinación con otro agente anti-canceroso de un modo eficaz para dar lugar a sus acciones anti-cancerosas combinadas dentro del animal. Por tanto, los agentes se proporcionarían en cantidades eficaces y durante periodos de tiempo eficaces para tener como resultado su presencia combinada dentro de la vasculatura del tumor y sus acciones combinadas en el entorno del tumor. Para conseguir este objetivo, una composición de la presente invención y agentes anti-cancerosos se pueden administrar al paciente de forma simultánea, bien en una única composición combinada o como dos composiciones distintas usando la misma o diferentes vías de administración.

Como alternativa, la administración de una composición de la presente invención puede preceder, o seguir, al tratamiento con el agente anti-canceroso en, por ejemplo, intervalos que van desde minutos a semanas y meses. Se debe asegurar que el agente anti-canceroso y el agente activo en la composición de la presente invención ejerzan un efecto combinado ventajoso sobre el cáncer. Como ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar a pacientes con linfoma No Hodgkin(NHL). Normalmente, estos pacientes tratados con una combinación de Rituximab y una combinación de agentes de quimioterapia conocidos como CHOP. De acuerdo con esto, los anticuerpos anti-KIR de la presente invención se pueden usar para tratar pacientes de NHL que están recibiendo tratamiento con Rituximab y CHOP, mediante combinación de la administración de todos los agentes en un programa de tratamiento en el que los agentes se administran el mismo día o en días diferentes, con un periodo de tratamiento más prolongado.

Otros agentes anti-cancerosos se pueden administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración de una composición de la presente invención. No obstante, cuando los inmunoconjugados de un anticuerpo se usan en la composición de anticuerpo de la presente invención se pueden administrar varios agentes anti-cancerosos de forma simultánea o posteriormente.

En algunas situaciones, puede ser incluso deseable extender significativamente el periodo de tiempo para el tratamiento cuando pasan varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o incluso varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre la respectiva administración del agente anti-canceroso o el tratamiento anticanceroso y la administración de una composición de la presente invención. Esto podría ser ventajoso en circunstancias en las que se pretende que el tratamiento anti-canceroso destruya el tumor, tal como cirugía o quimioterapia, y con la administración de una composición de la presente invención se pretendía prevenir las micrometástasis o la recurrencia del tumor.

También se ha previsto que se use más de una administración de una composición basada en un agente anti-KIR de la presente invención o el agente anti-canceroso. Estos agentes se pueden administrar de forma intercambiable, el días o semanas alternos; o un ciclo de tratamiento con una composición del agente anti-KIR de la presente invención, seguido de un ciclo de terapia con el agente anti-canceroso. En cualquier caso, para conseguir la regresión del tumor usando una terapia combinada, todo lo que se necesita es liberar ambos agentes en una cantidad combinada eficaz para ejercer un efecto antitumoral, con independencia de los tiempos de administración.

En términos de cirugía se puede realizar cualquier intervención quirúrgica en combinación con la presente invención. En relación con la radioterapia, se contempla cualquier mecanismo para inducir daños locales en el ADN de las células cancerosas, tal como radiación gamma, rayos X, radiación UV, microondas e incluso emisiones electrónicas. También se contempla la liberación dirigida de radioisótopos en células cancerosas y puede usarse junto con un anticuerpo dirigido y otros medios dirigidos.

En otros aspectos, se pueden administrar compuestos o regímenes inmunomoduladores en combinación o como parte de las composiciones de la presente invención. Ejemplos preferidos de compuestos inmunomoduladores incluyen citoquinas. En dichas estrategias combinadas se pueden emplear varias citoquinas. Ejemplos de citoquinas útiles en las combinaciones contempladas por la presente invención incluyen IL-1-lfa, IL-1-beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma. Las citoquinas usadas en el tratamiento de combinación o las composiciones de la presente invención se administran de acuerdo con regímenes estándar, consistentes con indicaciones clínicas tales como la afección del paciente y la toxicidad relativa de la citoquina. Otros compuestos inmunomoduladores que se pueden administrar en combinación o como parte de las composiciones de la presente invención incluyen anticuerpos que se unen específicamente a otros receptores inhibidores sobre los linfocitos, incluidos, sin limitaciones, anticuerpos tales como anticuerpos anti-CTLA4

o anticuerpos anti-CD94/NKG2A (véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de EE.UU. 20030095965). Variantes y derivados de estas moléculas que se conocen en la técnica se pueden usar también, o de forma alternativa, en dichos procedimientos, e incorporar en composiciones de la invención, según sea adecuado.

En ciertas realizaciones, las composiciones terapéuticas que comprenden anticuerpos anti-KIR no bloqueantes de HLA, inhibidores, opcionalmente bloqueantes de la presente invención se pueden administrar en combinación con, o pueden comprender además, un agente quimioterapéutico o de terapia hormonal. Varias terapias hormonales y agentes quimioterapéuticos se pueden usar en los procedimientos de tratamiento combinado divulgados en el presente documento. Los agentes quimioterapéuticos contemplados como ejemplo incluyen, entre otros, agentes alquilantes, anti-metabolitos, antibióticos citotóxicos, alcaloides de la vinca, por ejemplo adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, raxol, taxotere, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etopósido (VP-16), 5-fluorouracilo (5FU), arabinósido citosina, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatino (CDDP), aminopterina, combretastatina(s) y derivados y profármacos de los mismos.

Los agentes hormonales incluyen, entre otros, por ejemplo, agonistas de LHRH tales como leuprorelina, goserelina, triptorelina y buserelina; anti-estrógenos tales como tamoxifeno y toremifeno; anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, ciproterona y bicalutamida; inhibidores de la aromatasa tales como anastrozol, exemestano, letrozol y fadrozol; y progestágenos, tales como medroxi, clormadinona y megestrol.

Como entenderán los expertos en la técnica, las dosis adecuadas de agentes quimioterapéuticos se aproximarán a las ya empleadas en terapias clínicas en las que los quimioterapéuticos se administran solos o combinados con otros quimioterapéuticos. A modo de ejemplo solo, se pueden usar agentes tales como cisplatino y otro alquilante de ADN. El cisplatino se ha usado ampliamente para tratar el cáncer, con dosis eficaces usadas en las aplicaciones clínicas de 20 mg/m2 durante 5 días cada tres semanas durante un total de tres ciclos. El cisplatino no se absorbe por vía oral y, por tanto, se puede liberar mediante inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal.

Otos agentes quimioterapéuticos útiles incluyen compuestos que interfieren en la replicación del ADN, la mitosis y la segregación cromosómica, y agentes que alteran la síntesis y la fidelidad de los precursores polinucleotídicos. En la Tabla C de la patente de EE.UU. nº 6.524.583 se enumeran una serie de agentes quimioterapéuticos de ejemplo para la terapia combinada. Cada uno de los agentes enumerados son ejemplos y no son limitantes. Se remite al experto a "Remington’s Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, capítulo.33, en particular a las páginas 624-652. En función de la afección que se esté tratando es probable que se produzcan variaciones de las dosis. Los médicos que administran tratamiento podrán determinar la dosis adecuada para el sujeto concreto.

Las composiciones de la presente invención se pueden usar en combinación con una cualquiera o más terapias antiangiogénicas o pueden además comprender agentes anti-angiogénicos. Ejemplos de dichos agentes incluyen anticuerpos neutralizantes, ARN antisentido, ARNsi, ARNi, aptámeros de ARN y ribozimas, cada uno dirigido contra VEGF o receptores de VEGF (patente de EE.UU. nº 6.524.583). También se pueden usar variantes de VEGF con propiedades antagonistas, como se describe en el documento WO 98116551. Ejemplos adicionales de agentes antiangiogénicos que son útiles junto con la terapia combinada se enumeran en la Tabla D de la patente de EE.UU. nº 6.524.583.

Las composiciones de la presente invención también se pueden usar de forma ventajosa en combinación con procedimientos para inducir apoptosis o pueden comprender agentes apoptóticos. Por ejemplo, se ha identificado una serie de oncogenes que inhiben la apoptosis, o muerte celular programada. Ejemplos de oncogenes en esta categoría incluyen, entre otros, bcr-abl, bcl-2 (distinto del bcl-1, ciclina D1; números de registro en GenBank M14745, X06487; patentes de EE.UU. nº 5.650.491 y 5.539.094) y los miembros de la familia, incluidos Bcl-x1, Mcl1, Bak, A1, y A20. La sobreexpresión de bcl-2 se descubrió primero en linfomas de células T. El oncogen bcl-2 funciona uniéndose e inactivando Bax, una proteína en la vía de la apoptosis. La inhibición de la función de bcl-2 impide la inactivación de Bax y permite que la vía apotótica progrese. La inhibición de esta clase de oncogenes usando, por ejemplo, secuencias de nucleótidos antisentido, ARNi, ARNsi o compuestos químicos de molécula pequeña, se contempla para usar en la presente invención para proporcionar potenciación de la apoptosis (patentes de EE.UU. nº 5.650.491, 5.539.094; y 5.583.034.

Las composiciones de agente anti-KIR de la presente invención pueden también comprender o usarse en combinación con moléculas que comprenden una porción dirigida, por ejemplo anticuerpo, logando, o conjugado del mismo, dirigido a un marcador específico sobre una célula diana (“agente dirigido”), por ejemplo una célula tumoral diana. En términos generales, los agentes dirigidos para usar en estos aspectos adicionales de la invención reconocerán preferentemente antígenos tumorales accesibles que se expresan preferentemente, o específicamente, en el sitio del tumor. En general, los agentes dirigidos se unirán a un componente que se expresa en la superficie, accesible en la superficie o localizado en la superficie de una célula tumoral. Asimismo, preferentemente, los agentes dirigidos exhibirán propiedades de alta afinidad y no ejercerán efectos secundarios significativos in vivo contra los tejidos normales de soporte vital, tales como uno o más tejidos seleccionados de corazón, riñón, cerebro, hígado, médula ósea, colon, mama, próstata, tiroides, vesícula biliar, pulmones, glándulas suprarrenales, músculo, fibras nerviosas, páncreas, piel u otro órgano o tejido de soporte vital en el cuerpo humano. La expresión “no ejerce efectos secundarios significativos”, como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que un agente dirigido, cuando se administra in vivo, producirá únicamente efectos secundarios insignificantes o clínicamente tratables, tales como los que normalmente aparecen durante la quimioterapia.

En el tratamiento de tumores, una composición de la presente invención puede comprender además o se puede usar en combinación con compuestos auxiliares. Los compuestos auxiliares pueden incluir, a modo de ejemplo, antieméticos tales como antagonistas de la serotonina y terapias tales como fenotiazinas, benzamidas sustituidas, antihistamínicos, butirofenonas, corticosteroides, benzodiacepinas y cannabinoides; bisfosfonatos tales como ácido zoledrónico y ácido pamidrónico; y factores de crecimiento hematopoyético tales como eritropoyetina y G-SCF, por ejemplo filgrastim, lenograstim y darbepoietina.

En otra realización, dos o más anticuerpos u otros agentes de la presente invención que reconocen diferentes epítopos o determinantes se pueden combinar en una única composición para reducir o neutralizar los efectos inhibidores de tantos productos génicos KIR como sea posible. Las composiciones que comprenden combinaciones de anticuerpos KIR inhibidores transreactivos de la presente invención, o fragmentos de unión o derivados de los mismos, permitirán una utilidad incluso mayor porque es probable que exista un pequeño porcentaje de la población humana que pueda carecer de los productos génicos de KIR inhibidores reconocidos por un único anticuerpo transreactivo. De forma similar, una composición de anticuerpo de la presente invención puede comprender además uno o más anticuerpos transreactivos o no transreactivos que bloquean la unión de KIR a HLA. Dichas combinaciones proporcionarían de nuevo una utilidad más amplia en un contexto terapéutico. De acuerdo con esto, un anticuerpo de la presente invención se puede combinar con otro anticuerpo anti-KIR que bloquea la unión a HLA de uno o más de, por ejemplo, KIR2DL1, KIR2DLK2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, y KIR3DL3.

La invención también se refiere a un procedimiento de potenciar la actividad NK en un paciente que lo necesite, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una composición de acuerdo con la presente invención. El procedimiento está dirigido más específicamente a incrementar la actividad de las células NK en pacientes que tienen una enfermedad en la que un incremento de la actividad de las células NK es beneficioso, que implica, afecta

o se debe a las células susceptibles a la lisis producida por las células NK, o que se produce o se caracteriza por una actividad insuficiente de las células NK, tales como un cáncer, una enfermedad infecciosa o un trastorno inmunitario.

Más específicamente, los procedimientos y composiciones de la presente invención también se usan en el tratamiento de diversos cánceres y de otras enfermedades de proliferación anormal, incluidas, entre otras: carcinoma, incluido el de vejiga urinaria, de mama, de colon, renal, hepático, pulmonar, de ovarios, de próstata, de páncreas, de estómago, de cuello uterino, de tiroides y de piel; incluido carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluida leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células peludas, linfoma de Burkitt’; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluidas leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica y síndrome mielodisplásico; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluidos melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluidos astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, incluidos melanoma, xeroderma pigmentosum, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma.

Trastornos preferidos que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo tumores de células T y de células B, incluidos, entre otros, trastornos de células T tales como leucemia prolinfocítica T (LPL-T). incluidas las de tipo de células pequeñas y cerebriforme; leucemia de linfocitos granulares grandes (LGL), preferentemente del tipo de células T; síndrome de Sezary (SS); linfoma de leucemia de células T del adulto (ATLL) y/o linfoma hepatoesplénico T-NHL; linfoma de células T periférico/postímico (subtipos pleomórfico e inmunoblástico); linfoma de células T angioinmunoblástico, linfoma de células T angiocéntrico (nasal), linfoma de células granes anaplásico (Ki 1+), linfoma de células T intestinales, linfobástica T, linfoma/leucemia (TLbly/T-ALL).

Otros trastornos proliferativos también se pueden tratar de acuerdo con la invención, incluidos, por ejemplo, hiperplasias, fibrosis (especialmente pulmonar, pero también otros tipos de fibrosis, tales como fibrosis renal), angiogénesis, psoriasis, aterosclerosis y proliferación de músculo liso en los vasos sanguíneos, tales como estenosis o reestenosis tras angioplastia. El tratamiento basado en anticuerpos KIR se puede usar para tratar o prevenir enfermedades infecciosas, incluidas, preferentemente, cualquier infección causada por virus, bacterias, protozoos, mohos u hongos. Dichos organismos infecciosos incluyen, entre otros, los virus de la hepatitis tipo A, de la hepatitis tipo B, de la hepatitis tipo C, de la gripe, de la varicela, adenovirus, del herpes simple tipo I (HSV-1), del herpes simple tipo 2 (HSV-2), RINDERPEST, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, papilomavirus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la polio y virus de la inmunodeficiencia humana tupo I o tipo 2 (VIH-1, VIH-2). Las bacterias constituyen otra clase preferida de organismos infecciosos, incluidas, entre otras, las siguientes: Staphylococcus; estreptococos, incluido S. pyogenes; enterococos; bacilos, incluidos Bacillus anthracis y Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella incluida G. vaginalis; Nocardia; estreptomices; Thermoactinomyces vulgaris; Treponema; Campylobacter, Pseudomonas incluida P. aeruginosa; Legionella; Neisseria incluida N. gonorrhoea y N. meningitides; Flavobacterium incluido F. meningosepticum y F. odoraturn; Brucella; Bordetella incluida B. pertussis y B. bronchiseptica; Escherichia incluida E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia incluida S. marcescens y S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus incluido P. mirabilis y P. vulgaris; estreptobacilos; Rickettsiaceae incluida R. fickettsfi, Chlamydia incluidas C. psittaci y C. trachornatis; micobacterias incluidas M. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare y M. lepraemurium; and Nocardia. Los protozoos pueden incluir, entre otros, leishmania, kokzidioa y trypanosoma. Los parásitos incluyen, entre otros, chlamydia y rickettsia. En el sitio web del Centro Nacional de Enfermedades Infecciosas NCID) en el Centro para el Control de Enfermedades (CDC) (dirección World-Wide Web (www) cdc.gov/ncidod/diseases/) se puede encontrar una lista completa de enfermedades infecciosas. Todas las enfermedades citadas son candidatas al tratamiento usando los anticuerpos KIR inhibidores opcionalmente transreactivos de la invención.

.

Dichos procedimientos pueden emplear los agentes, por ejemplo anticuerpos, fragmentos de unión y derivados de la presente invención, solos o en combinación con otros tratamientos y/o agentes terapéuticos, tales como radioterapia, quimioterapia o terapia génica. Cuando estos procedimientos implican tratamientos adicionales con agentes terapéuticos, dichos agentes se pueden administrar junto con los anticuerpos de la presente invención, bien en una sola forma de dosificación o como múltiples formas de dosificación. Cuando se administran como una sola forma de dosificación, el agente adicional se puede administrar antes, de forma simultánea o después de la administración del anticuerpo de la presente invención.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se divulgarán en la siguiente sección experimental, que debería considerarse como ilustrativa.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de los sitios de interacción asociados con los dominios 1 y 2 de KIR

Usando las estrategias generales tratadas anteriormente se descubrieron posibles dominios implicados en la dimerización de KIR2DL1.

El presente Ejemplo muestra la transducción de la señalización negativa a través de KIR, tras la unión de KIR a su ligando de HLA de clase I, implica una reorientación conformacional inducida por la unión al ligando de las moléculas de KIR, lo que permite la formación de interacciones dominio 1-dominio 1 y dominio 2-dominio 2 entre KIR adyacentes, lo que conduce a un agrupamiento acelerado. Aunque anteriormente se sabía que la unión al ligando conduce a la señalización mediante KIR, no se ha descrito mecanismos que pudieran explicar completamente cómo se podía transmitir la unión al ligando, que se produce en la parte extracelular del KIR en el exterior de la célula, a la cola citoplasmática del KIR y conducir a una señalización sólo cuando está unido el ligando, pero no cuando no hay unión a ligando. El descubrimiento de sitios sobre KIR que permiten la dimerización de moléculas de KIR puede proporcionar actualmente una explicación de esto y permitir el desarrollo de agentes terapéuticos que prevendrían la señalización inhibitoria mediante KIR, dirigidos a estos sitios.

Análisis

Este ejemplo usa la nomenclatura de residuos y dominios para KIR según Fan y col., 1997, Nature vol. 389: 96-100: El dominio 1 comprende los residuos 6-101 de KIR y el dominio 2 comprende los residuos de aminoácidos 105-200. Usando la estrategia de sitio conservado sobre la estructura de KIR2DL1 (1 NKR.pdb) y una alineación de KIR2DL1 (humano), KIR2DL2 (humano), KIR2DL3 (humano), KIR2DS1 (humano), KIR2DS2 (humano), KIR2DS3 (humano), KIR2DS4 (humano), KIR (Q8MK11, mono Rhesus), KIR (Q8MK12, mono Rhesus) se identificó el siguiente sitio conservado. P108, S109, L110, S111, A112, Q113, P114, G115, T125, S127, S129, T159, Q161, A162, D163, S192, L195.

Usando la estrategia de acoplamiento proteína-proteína, en la que se han introducido 2 complejos KIR2DL1 - HLA CW4 de 1 IM9.pdb encima del dímero H2K, sugerido por Mitra y col. 2004 (Current Biology vol. 14: 718-724), se identificó cómo este dímero KIR-HLA permite el crecimiento del agrupamiento tanto a través de las interacciones dominio 1-dominio 1: R6, D31, V32, M33, F34, E35, D57, G58, V59, V83, T84, H85, S86, Q89 como dominio 2dominio 2 L110, S111, A112, Q113, T125, S127, S129, R131, K155, V156, N157, G158, T159, Q161, D163, L195..

Usando la estrategia de empaquetamiento en cristal, se identificó que cada proteína en la estructura de rayos X de KIR2DS2 (1 M4K.pdb) tenía 6 vecinos de interacción, uno de estos es una interacción simétrica dominio 1-dominio 1 en la que V32, M33, F34, V83, T84, Q89, L90, S91, A92 interacciona con los mismos residuos sobre otra proteína. Los extremos C están mirando hacia el mismo lado consistente con una proteína unida a la membrana. Dado que la secuencia de 2DS2 es idéntica a la 2DL2 en la región de las interacciones, los residuos son consistentes con los resultados del acoplamiento. Además, la localización del extremo N es indeterminada en todas las estructura de rayos X de KIR, lo que se puede explicar por dos sitios de Zn en reticulación con la interacción dominio 1-dominio 1: Los 2 sitios de Zn son E2(A), H5(A), D31 (A), H85(B) and H1 (A), E35(B), H36(B), H50(B).

En consecuencia, los inventores definen el sitio de interacción asociado con el dominio 1: H1, E2, H5, R6, D31, V32, M33, F34, E35, H36, H50, D57, G58, V59, V83, T84, H85, S86, Q89, L90, S91, A92 y el sitio de interacción asociado con el dominio 2: P108, S109, L110, S111, A112, Q113, P114 (o L114), G115, T125, S127, S129, R131, K155, V156, N157, G158, T159, Q161, A162, D163, S192, D193, P194, L195, L196, V197, S198, V199 y T200, y reivindica que cualquier agente terapéutico que interacciona con uno o más de estos residuos reducirá o impedirá la señalización del receptor KIR. Véanse las Figuras 1A a 1C para ilustración.

La base de datos de proteínas (PDB, banco de datos de proteínas) denominado en el presente documento se describe en: H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G.Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne: The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp. 235-242 (2000).

Los identificadores del PDB son siempre 4 caracteres alfanuméricos, por ejemplo 1 NKR y 10M3, en ocasiones denominados 1 NKR.pdb y 1 OM3.pdb.

Ejemplo 2: La estructura de cristal de KIR2DL1 en complejo con HuKIRI-7F9-Fab’ revela homodímeros KIR2DL1/ KIR2DL1

La estructura de cristal de KIR2DL1 en complejo con el fragmento Fab’ del anticuerpo anti-KIR transreacivo 1-7F9 se resolvió y perfeccionó a una resolución a 2.35 A con cristalografía de rayos X. Los resultados confirmaron que en la estructura de cristal hay una interfaz del dímero KIR2DL1-KIR2DL1.

Materiales y procedimientos

Se mezclaron KIR2DL1 extracelular (aminoácido 1-223 de la SEC ID Nº 14, siendo el residuo 16 arginina (R) y siendo el residuo 114 leucina (L) e incluye un residuo metionina (M) adicional en el extremo N y el Fab' anti-KIR

humano de 1-7F9 (con la secuencia de la cadena ligera de la SEC ID N1 24 y la secuencia de la cadena pesada de los residuos 1-221 de la SEC ID Nº 25) con un ligero exceso de KIR2DL1 y el complejo se purificó en una columna de filtración en gel. Después, el complejo se concentró hasta aproximadamente 13,5 mg/ml. Los cristales se cultivaron con la técnica de la gota colgante en 10 % de PEG 6000 y tampón citrato 500 mM con un pH de 4,2. Los 5 cristales se sometieron a ultracongelación en N2 líquido y los datos cristalográficos a una resolución de 2,35 A se recogieron a 100 K usando la línea de haz BL7111, MAX-lab, Lund, Suecia. Los datos se integraron en el programa XDS (Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993;26:795-800). Para la determinación de la sustitución molecular se usó el programa NOLREP del conjunto CCP4 ((Bailey, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1994;50:760-763) y las estructuras depositadas en PDB 1 RZJ (la parte 1 de Fab) y 1 NKR (KIR). Las mejoras de fase se realizaron con el 10 programa ARP/WARP (Lamzin y Wilson, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1993;49:129-147) y se realizaron modificaciones manuales en el modelo de estructura derivada de rayos X con el programa QUANTA (disponible en Accelrys Inc., San Diego, CA, EE.UU.). En perfeccionamiento se realizó en el programa informático REFMAC5 del conjunto CCP4. Mediante el programa ARP/WARP se añadieron moléculas de agua. El modelo comprendió los residuos 6-114 t 124-200 de KIR2DL1, 1-212 de la cadena ligera de 1-7F9 y 1-136 junto con 143-224 de la cadena

15 pesada 1-7F9. Además se introdujeron 330 moléculas de agua. R y sin R para el modelo fueron 0,191 y 0,253, respectivamente.

Resultados

Los residuos de contacto entre KIR2DL1 con simetría "X, Y, Z" and "Y, X, 1/3-Z" se identificaron mediante el programa de ordenador CONTACT del conjunto CCP4 usando una distancia de corte de 4,0 A. Se encontró que el 20 área de interfaz del dímero resultante en el dominio 2 de KIR comprendía los residuos siguientes de KIR2DL1 (SEC ID Nº 14): L110, S111, A112, Q113, L114, D193, P194, L195, L196, V197, S198, V199 y T200). La interfaz del dímero KIR2DL1 y los residuos implicados en la unión a hidrógeno, también se indican en la secuencia de aminoácidos de KIR2DL1 en la Figura 4. El área de interfaz del dímero se calculó, mediante el programa CCP4 de AREAIMAOL, que era 665 A2. En el empaquetado de cristal, el bucle de KIR2DL1 que contiene los residuos 115

25 123 no está ordenado. Por tanto, los residuos biológicos de interfaz importantes pueden también contener residuos con dicho intervalo.

La Tabla 1 muestra las interacciones KIR2DL1-KIR2DL1 en la estructura de cristal de KIR2DL1 en complejo con la cadena VL de Fab’ de 1-79F9. Se usó un corte de 4,0 A. Los contactos se identificaron mediante el programa informático CONTACT del conjunto CCP4 usando tarjetas de simetría (X,Y,Z) y (Y,X,1/3-Z). En la última columna

30 “***” indica la fuerte posibilidad de un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3,3 A) calculado mediante CONTACT, "*" indica una débil posibilidad (distancia > 3,3 A). El blanco indica que el programa consideró que no había posibilidad de un enlace de hidrógeno. En los cálculos se ignoraron las moléculas de agua.

Tabla 1. Interacciones. KIR2DL1-KIR2DL1

Átomos fuente: Átomos diana Distancia Posible enlace de H

Leu: 110A O Leu 196A CB 3,84

Ser: 111A CA Leu 196A O 3,38

Ser: 111A CB Leu 196A C 3,97

Leu: 196A O 3,53

Leu: 196A CG 3,59

Leu: 196A CD2 3,65

Ser: 111A OG Ser 198A OG 3,24 ***

Ser: 198A CB 3,92

Ser: 111A C Leu 196A O 3,64

Ala: 112A N Leu 196A O 2,9 ***

Ala: 112A CA Leu 196A O 3,89

Ala: 112A CB Leu 196A O 3,88

Ala: 112A O Ser 198A O 3,49 *

Ser: 198A OG 3,98 *

Átomos fuente: Átomos diana Distancia Posible enlace de H

Val: 197A CG1 3,35

Leu: 196A O 3,97 *

Val: 197A CA 3,37

(continuación) (continuación)

Átomos fuente: Átomos diana Distancia Posible enlace de H

Val: 197A CB 3,96

Val: 197A C 3,68

Ser: 198A N 3,02 ***

Gln: 113A CA Ser 198A O 3,14

Ser: 198A OG 3,67

Gln: 113A CB Ser 198A O 3,95

Ser: 198A OG 3,66

Gln: 113A CG Ser 198A O 3,68

Thr: 200A CG2 3,61

Ser: 198A OG 3,44

Gln: 113A CD Ser 198A OG 3,64

Gln: 113A NE2 Ser 198A OG 3 ***

Gln: 113A C Ser 198A O 3,27

Leu: 114A N Ser 198A O 2,47 ***

Ser: 198A C 3,65

Leu: 114A CA Ser 198A O 3,38

Leu: 114A CB Val 199A CG1 3,86

Leu: 114A CG Thr 200A CG2 3,13

Leu: 114A CD1 Thr 200A CG2 3,73

Leu: 114A CD2 Thr 200A CG2 3,76

Asp: 193A OD2 Pro 194A CG 3,87

Pro: 194A CG Asp 193A OD2 3,87

Leu: 195A CD1 Leu 196A O 3,6

Leu: 196A N 3,81

Leu: 196A N Leu 195A CD1 3,81

Leu: 196A CB Leu 110A O 3,84

Leu: 196A CG Ser 111A CB 3,59

Leu: 196A CD2 Ser 111A CB 3,65

Leu: 196A C Ser 111A CB 3,97

Leu: 196A O Ala 112A O 3,97 *

Ala: 112A CB 3,88

Ser: 111A CA 3,38

Ser: 111A CB 3,53

Átomos fuente: Átomos diana Distancia Posible enlace de H

Ser: 111A C 3,64

Ala: 112A N 2,9 ***

Ala: 112A CA 3,89

Leu: 195A CD1 3,6

Val: 197A CA Ala 112A O 3,37

Val: 197A CB Ala 112A O 3,96

Val: 197A CG1 Ala 112A O 3,35

Val: 197A C Ala 112A O 3,68

Ser: 198A N Ala 112A O 3,02 ***

Ser: 198A CB Ser 111A OG 3,92

Ser: 198A OG Gln 113A CG 3,44

Gln: 113A CA 3,67

Gln: 113A CB 3,66

Gln: 113A NE2 3 ***

Ala: 112A O 3,98 *

Gln: 113A CD 3,64

Ser: 111A OG 3,24 ***

Ser: 198A C Leu 114A N 3,65

Ser: 198A O Gln 113A CG 3,68

Gln: 113A CA 3,14

Gln: 113A CB 3,95

Gln: 113A C 3,27

Leu: 114A N 2,47 ***

Leu: 114A CA 3,38

Ala: 112A O 3,49 *

Val: 199A CG1 Leu 114A CB 3,86

Thr: 200A CG2 Leu 114A CD2 3,76

Gln: 113A CG 3,61

Leu: 114A CG 3,13

Leu: 114A CD1 3,73

Ejemplo 3: Generación de anticuerpos anti-KIR murinos

Este ejemplo describe la producción e identificación de anticuerpos anti-KIR que (1) no interfieren en la unión de HLA-C y (2) son capaces de potenciar la citotoxicidad de las células NK.

Inmunización y fusión

Ratones RBF normales se inmunizaron tres veces con procedimientos estándar con 20 !g de la proteína KIR2DL1 soluble, correspondiente al dominio extracelular completo de KIR2DL1 (SEC ID Nº 14), producido en E. coli y replegado in vitro. Los ratones recibieron un refuerzo de 20 !g de KIR2DL1 soluble mediante inyección intravenosa y fueron sacrificados tras tres días. El bazo de extrajo asépticamente y se dispersó en una suspensión de célula única. La fusión de las células de bazo y las células de mieloma FOX-NY se realizó mediante el procedimiento de electrofusión. Las células se sembraron en placas de microtitulación y se cultivaron a 37º C en 5 % de CO2. EL medio de cultivo tisular, que contiene AAT para selección, se cambió tres veces en un periodo de dos semanas.

Con el fin de generar un hibridoma monoclonal y estable, las células se subclonaron usando el procedimiento de dilución límite. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de una célula/célula. Después de dos semanas, los sobrenadantes de cada pocillo se sometieron a detección selectiva en un ELISA indirecto y se analizaron para competición con 1-7F9 (véase más adelante). Las células de los pocillos positivos se transfirieron después a un volumen de cultivo mayor, se expandieron y subclonaron de nuevo hasta obtener una línea celular estable y monoclonal (con los subclones identificados añadiendo A1, -A2, -A3, -A4 etc. al mismo clon parental). Después, se realizaron pruebas iguales o similares con los subclones, así como secuenciación de anticuerpos monoclonales producidos por los subclones seleccionados.

Detección selectiva primaria de hibridomas

Los hibridomas derivados de los ratones RBF inmunizados con KIR2DL1 se sometieron a detección selectiva de la producción de AcMo específicos de KIR2DL1 mediante el análisis de los sobrenadantes para reconocer las células positivaos para KIR2DL1 mediante citometría de flujo. Los sobrenadantes del cultivo tisular se incubaron con YTS (negativas para KIR2DL1) e YTS-2DL1 (positivas para KIR2DL1) en una dilución de 1:2. Tras incubación en hielo durante una hora, las células se lavaron con DEMEM/ 2 % de FCS y se incubaron con fragmentos de Ab secundario anti-ratón de mono conjugados con APC durante 30 minutos en hielo. Después de un extenso lavado con PBS, la unión del Ab con células vivas se analizó usando FACSarray (BD Biosciences). Los AcMo se designaron “positivos para KIR2DL1” cuando los AcMo de ratón en los sobrenadantes de cultivo tisular del hibridoma se unieron a YTS2DL1, pero no a las células YTS (véase la Figura 5).

Además, los sobrenadantes del cultivo tisular se analizaron para AcMo KIR2DL1 y -3 transreactivos (o “panKIR”) en un ensayo ELISA indirecto, analizando el reconocimiento de los dominios extracelulares de KIR2DL1 y -3. Para esto se revistieron inmunoplacas Nunc con 0,5 !g/ml de Ab específicos de IgG anti-ratón de cabra (Caltech, Ca) en PBS y se incubaron durante la noche a 4 º C. Las placas se bloquearon con PBS con 0,05 % de Tween-20 durante 15 minutos y se lavaron con PBS/0,05 % de Tween-20. Se añadieron los sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de otro lavado, se añadió KIR2DL1 o KIR2DL3 biotinilado soluble a una concentración de 1 !g/ml y se incubó durante una hora. Después de lavar se añadieron 100 !l de una solución de estreptavidina-HRPO. Después de otra hora de incubación las placas se lavaron y desarrollaron con sustrato de TMB (Kem-EN-Tec), como ha descrito el fabricante. La absorbancia a 450 nm se midió en un lector de ELISA, que directamente se acopló a placas de 96 pocillos.

Para la detección selectiva primaria se identificaron clones productores de AcMo transreactivos, incluidos un clon designado 1-26F117. Estos se analizaron adicionalmente en ensayos BiaCore, ensayos de citotoxicidad de NK y ensayos de unión a ligando de KIR (véase más adelante).

Ejemplo 4: Competición con 1-7F9 por la unión a KIR2DL1 y -3

Para determinar si los AcMo transreactivos de ratón seleccionados se habían unido a KIR2DL1 and -3 sobre epítopos diferentes del AcMo humano 1-7F9, su capacidad para competir por la unión de 1-7F9 a KIR2DL1 y/o 3 se midió mediante análisis de resonancia en plasmón superficial. Esto se realizó en un instrumento Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Cantidades idénticas de 1-7F9 purificado se inmovilizaron en las cuatro celdas de flujo en un circuito sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) usando un kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore AB). KIR2DL3 recombinante purificado en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mN, EDTS 3 mM, 0,005 % de polisorbato 20 (v/v) se inyectó en una concentración de 10 !g/ml en las celdas de flujo 1 y 3 durante un minuto a un caudal de 10 !l/min. Después, el KIR2DL1 recombinante purificado en tampón HBS-EP se inyectó en una concentración de 10 !g/ml en las celdas de flujo 2 y 4 durante un minuto a un caudal de 10 !l/min. Tras la inyección de KIR2DL1 y KIR2DL3, la primera muestra del sobrenadante de cultivo tisular del hibridoma diluido a

1:1:5 en tampón HBS-EP se inyectó en las celdas de flujo 1 y 2, durante un minuto a un caudal de 10 !l/min. Después, la segunda muestra se inyectó en las celdas de flujo 3 y 4 en condiciones similares. Las muestras se clasificaron como positivas para la unión cuando la respuesta UR > 20. Por último, se realizó regeneración del circuito sensor mediante inyección de glicina 10 mM-glicina-HCl a pH 1,8 durante 15 segundos, a un caudal de 30 !l/min.

En el ensayo se encontró que 1-26F117 no competía con 1-7F9 para unirse a KIR2DL1 y -3, lo que indica que este anticuerpo se unía a las moléculas KIR en un epítopo distinto del de 1-7F9.

Ejemplo 5: Ensayos de citotoxicidad de NK

La capacidad de AcMo transreactivos seleccionados para inhibir la función de KIR se analizó en ensayos de citotoxicidad de NK. Las células YTS-2DL1 se preincubaron con sobrenadantes de cultivo tisular de hibridomas productores de AcMo seleccionados durante 30 minutos en una dilución de 1:2. Posteriormente, las células LCL 721.221-Cw4 marcadas con 51Cr que expresaban el ligando de KIR2DL1 HLA-Cw4 se añadieron en una proporción de E:T de 6:1. Tras la incubación durante 4 horas a 37 º C en un incubador de CO2 humidificado, la liberación de51Cr en el medio de cultivo tisular se midió en un contador de rayos y. La muerte específica de las células diana en una mezcla se determinó calculando el porcentaje de 51Cr medido en el medio de cultivo tisular comparado con la libración máxima de 51Cr de las células lisadas con Triton X-100. Las muestras se analizaron por triplicado.

En presencia del AcMo de referencia, 1-7F9 (20 !g/ml), YTS-2DL1 mató ~24 % de las células LCL 721.221-Cw4 en este ensayo, en comparación con -5 % en ausencia de cualquier AcMo anti-KIR. Los AcMo de ensayo murinos se denominaron bloqueantes de KIR cuando podían inducir la muerte de las células diana al menos 1,5 veces la muerte en ausencia de AcMo, es decir, cuando la muerte en ausencia de un AcMo se normaliza a 2, la muerte en presencia de un AcMo bloqueante de KIR es al menos 1,5. Como se muestra en la Figura 6, el anticuerpo 1-26F117 indujo la muerte de las células LCL 721.221-Cw4 mediante YTS-2DL1 3.7 y casi 2 veces más que la muerte en ausencia de AcMo para 1-26F117-A3 y 1-26F117-A4, respectivamente.

Ejemplo 6: Ensayos de competición de la unión del ligando KIR2DL1-Fc

Para determinar su AcMo anti-KIR que bloqueaban la señalización de KIR (como se ha determinado en el Ejemplo 5), tal como 1-26F117-A3 and 1-26F117-A4, podía inducir lisis por NK impidiendo la unión de KIR a su ligando HLA, se midió la capacidad de estos AcMo para impedir la interacción entre KIR2DL1 y HLA-Cw4. Para esto, se produjo proteína KIR2DL1-Fc soluble como se ha descrito (Wagtmann et al., Immunity 1995;3(6):801-9), a excepción de que el Fc humano se sustituyó con Fc de IgG1 murina. El complejo KIR-Fc se une a las células que expresan los alotipos específicos de HLA-C que son reconocidos por KIR2DL1 y esta unión se puede visualizar mediante citometría de flujo usando un Ab conjugado con fluorocromo secundario específico para la parte Fc murina de la proteína KIR-Fc. Por ejemplo, KIR2DL1-Fc se une a las células transfeccionadas con HLA-Cw*0402 (transfectantes LCL 721.221-Cw4) (Litwin y col., J Exp Med. 1993;178:1321-36) pero no a células LCL 721.221 no transfeccionadas.

KIR2DL1-Fc se preincubó con sobrenadante del hibridoma 1-26F117-A3 o 1-26F117-A4 en cantidades similares usadas para inducir la lisis de NK durante 30 minutos, en hielo. Posteriormente se añadieron 0,5 x 104 células LCL 721.221-Cw4 a la mezcla de incubación en DMEM/2 % de FCS, que se incubó adicionalmente durante 60 minutos en hielo. Después de lavar en DMEM/2 % de FCS, las mezclas de reacción se incubaron con una mezcla de 1:1 De fragmentos de Ab secundario contra IgG de ratón (conjugada con PE) y contra IgG humana (conjugada con APC). Tras la incubación en hielo durante 30 minutos, las células se lavaron varias veces con PBS y la unión de KIR2DL1hFc y los AcMo anti-KIR se analizaron mediante citometría de flujo (FACSarray).

En este ensayo, los AcMo 1-26F117-A3 and 1-26F117-A4 no evitaron la interacción entre KIR2DL1-hFc y las células LCL 721.221-Cw4, lo que muestra que 1-26F117-A3 y -A4 bloquean la señalización sin impedir la unión de KIR a los ligandos HLA. Esto queda subrayado por el hecho de que 1-26F117-A3 y 1-26F117-A4 se unían a través de KIR2DL1-hFc a las células LCL 721.221-Cw4, lo que tiene como resultado células teñidas dobles positivas en los gráficos de puntos de FACS (véase la Figura 7B). Como control, en el mismo tipo de ensayo realizado con diferentes concentraciones de AcMo conocido DF200, se impidió la unión de KIR2DL1-hFc a las células LCL 721.221-Cw4 de un modo dependiente de la dosis de DF200, pero no cuando KIR2DL1-hFc se preincubó con el AcMo conocido específico de KIR2DL2, GL183 (Figura 7A).

En un ensayo similar en el que KIR2DL1-hFc se preincubaba con diferentes concentraciones (2-50 !g/ml) de 126F117 purificado, se confirmó que este clon no producía anticuerpos que impidan la unión de KIR2DL1 a HLA-Cw4 (véase la Figura 8). Por tanto, el clon 1-26F117 produce anticuerpos que bloquean la señalización de KIR sin afectar las interacciones KIR-ligando.

Ejemplo 7: Ensayos de competición de la unión del ligando KIR2DL1-Fc

La capacidad de los AcMo anti-KIR -7F9, 1-4F1, and DF200 para bloquear la interacción entre las moléculas de HLA-C y KIR se evaluó compitiendo la unión de proteínas de fusión KIR-Fc recombinantes solubles a las células que expresan HLA-C.

Para analizar si los AcMo anti-KIR podían impedir esta interacción entre KIR2DL1-Fc y HLA-Cw4, las proteínas KIR2DL1-Fc se preincubaron con concentraciones crecientes de AcMo anti-KIR y después se añadieron a las células LCL.721.221-Cw4, se incubaron a 4 º C, se lavaron, se incubaron con Fc de IgG1 anti-murina conjugada con APC, se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo en un FACScalibur, o un FACScanto (Beckton Dickinson), mediante procedimientos estándar.

DF200, 1-7F9 y 1-4F1 impidieron la unión de KIR2DL1-Fc a las células que expresan HLA-Cw4, lo que muestra que estos AcMo bloquean la interacción entre KIR2DL1 y HLACw4.

Ejemplo 8: Análisis de la unión al dominio 1 o 2

Este ejemplo describe cómo determinar si los anticuerpos seleccionados u otros agentes se unen al dominio 1 o al dominio 2 de un KIR.

Se mide la unión de los anticuerpos anti-KIR u otro agente a una forma recombinante truncada de KIR, consistente en el dominio 2 extracelular de KIR unido a un fragmento Fc. Esta construcción se realiza delecionando los nucleótidos que codifica el dominio 1 a partir de la construcción que codifica KIR2DL1-Fc, transfeccionando la construcción resultante (denominada KIR2DL1-D2-Fc) en células COS o HEK293 y purificando la proteína KIR2DL1-D2-Fc sobre la proteína A, como se describe para KIR2DL1-Fc intacto (véase los ejemplos 6 y 7, y Wagtmann y col. 1995, ant.).

La unión de agentes anti-KIR a KIR2DL1-D2-Fc purificado se mide mediante análisis de resonancia en plasmón superficial. Esto se realiza en un instrumento Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Cantidades idénticas de KIR2DL1-D2-Fc purificado se inmovilizaron en las cuatro celdas de flujo en un circuito sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) usando un kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore AB). KIR2DL1-D2-Fc recombinante purificado en tampón HBS-EP (HEPES 10 Mm, NaCl 150 mM, EDTA 3 Mm, 0,005 % de polisorbato 20 (v/v)) se inyecta en una concentración de 10 !g/ml en las celdas de flujo 1 y 3 durante un minuto a un caudal de 10 !l/min. Tras la inyección de KIR2DL1-D2-Fc, los sobrenadantes de cultivo tisular de hibridoma 1:1,5 en tampón HBS-EP se inyectan en celdas separadas durante un minuto a un caudal de 10 !l/min. Las muestras se clasifican como positivas para la unión cuando la respuesta UR > 20. Por último, la regeneración del circuito sensor se realiza mediante inyección de glicina 10 Mm-HCl a ph 1,8 durante 15 segundos, a un caudal de 30 !l/min. De este modo se muestra que los sobrenadantes del hibridoma que se unen a KIR2DL1-D2-Fc contienen AcMo que se unen al dominio 2 de KIR, mientras que los que no, se designan como que contienen AcMo que se unen al dominio 1 o que se unen a epítopos complejo que abarcan el dominio 1 y el dominio 2.

Un ensayo similar se puede realizar usando una construcción KIR2DL1-D1-Fc para determinar si los anticuerpos anti-KIR u otros agentes de unión a KIR se unen al dominio 1.

Los intervalos de valores citados en el presente documento están destinados simplemente a servir como procedimiento abreviado de hacer referencia individualmente a cada valor por separado que entra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor distinto se incorpora en la memoria descriptiva como si se hubiera citado individualmente en el presente documento. A menos que se indique lo contrario, todos los valores exactos proporcionados en el presente documento son representativos de los correspondientes valores aproximados (p. ej., todos los valores de ejemplo exactos proporcionados con respecto a un factor o medida concreta se pueden considerar para proporcionar también una medida aproximada, modificada por “aproximadamente”, cuando sea adecuado).

Yodos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que, de otro modo, claramente se contradiga en el contexto.

La descripción en el presente documento de cualquier aspecto o realización de la invención usando términos tales como "que comprende", "que tiene"; "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos se pretende que proporcionen apoyo para un aspecto o realización de la invención similar que “consiste en”, “consiste esencialmente en” o “comprende sustancialmente” dicho elemento o elementos concretos, a menos que se indique lo contrario que claramente esté contradicho por el contexto (p. ej., una composición que en el presente documento se describe como que comprende un elemento concreto deberá entenderse que también describe una composición que consiste en dicho elemento, a menos que se indique lo contrario o que claramente esté contradicho por el contexto).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> NOVO NORDISK A/S

<120> AGENTES DE UNIÓN A KIR Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE LOS MISMOS

<130> 6923.204-wO

<150> PA 2005 00021

<151>

<160> 25

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 348

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 348

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 341

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 377

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 444

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 455

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 410

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 387

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 224 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: misc_feature 10 <222> (16)..(16)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>: misc_feature 15 <222> (114)..(114)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 14

<210> 15

<211> 224

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 224

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

<210> 18

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

<210> 19

<211> 357

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 19

10

<210> 20

<211> 324

<212> ADN

<213> Mus musculus

15

<400> 20

20 <210> 21

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus

25 <400> 21

<210> 22

<211> 342

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 22

<210> 23

<211> 324

<212> ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 23

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un agente anticuerpo que se une a una porción extracelular de un receptor de tipo IgG de Killer humano inhibidor KIR2DL, en la que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las célula NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR.
2.

El agente de la reivindicación 1, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la agrupación de KIR.
3.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK reduciendo o bloqueando la dimerización de KIR.
4.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente reduce o bloquea la interacción entre los sitios de interacción asociados con el dominio 1.
5.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente reduce o bloquea la interacción entre los sitios de interacción asociados con el dominio 1.
6.

El agente de la reivindicación 5, en el que el sitio de interacción asociado con el dominio 2 de KIR2DL1 comprende los residuos aminoácidos L110, S111,A112, Q113, P/L114 y L195.
7.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente reduce o bloquea al menos una de homodimerización, heterodimerización o ambas entre los miembros de la familia KIR.
8.

El agente de la reivindicación 7, en el que el agente reduce o bloquea la homodimerización de KIR2DL1.
9.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el agente es un anticuerpo, un fragmento de unión del mismo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo multiespecífico.
10.

El agente de la reivindicación 9, en el que el fragmento se selecciona de un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento Fab’-SH, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo y un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla.
11.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
12.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente es un agente de unión a KIR transreactivo.
13.

El agente de la reivindicación 12, en el que el agente es un anticuerpo anti-KIR transreactivo o un fragmento de unión del mismo.
14.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, en el que el agente se une a cada uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
15.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
16.

El agente de la reivindicación 15, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18.
17.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
18.

El agente de la reivindicación 17, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18.
19.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usar como medicamento.
20.

Una composición farmacéutica que comprende un agente de acuerdo con las reivindicaciones 1-19 en una cantidad eficaz para potenciar de forma detectable la citotoxicidad de las células NK en un paciente y uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
21.

La formulación farmacéutica de la reivindicación 20, que además comprende un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente antiangiogénico, un agente apoptótico y un anticuerpo que bloquea la unión de HLA a un receptor de KIR inhibidor.
22.

Un procedimiento in vitro de reducción de la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de células NK que

comprende poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz del agente de cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
23.

El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el agente reduce o bloquea la dimerización de KIR.
24.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22 y 23, en el que el agente es un anticuerpo anti-KIR monoclonal o un fragmento de unión del mismo.
25.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
26.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
27.

Un uso del agente de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer, una enfermedad infecciosa, una infección vírica o un trastorno inmunitario.
28.

El uso de la reivindicación 27, en el que el medicamento es para tratar un cáncer.
29.

El uso de la reivindicación 28, en el que el cáncer se selecciona de, por ejemplo, leucemia mieloide aguda y crónica (LMA y LMC), leucemia linfoide aguda (LLA), síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin (NHL), mieloma múltiple, carcinoma de células renales, melanoma maligno y cáncer colorrectal.
30.

El uso de la reivindicación 27, en el que la infección vírica es causada por un virus seleccionado del virus de lainmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus Ébola.
31.

Un agente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para usar en el tratamiento de cáncer, una enfermedad infecciosa, una infección vírica o un trastorno inmunitario.
32.

El agente de la reivindicación 31 para el tratamiento de cáncer.
33.

El agente de la reivindicación 31 o 32, en el que el agente es un anticuerpo monoclonal anti-KIR transreactivo humano, humanizado o quimérico o un fragmento de unión del mismo.
34.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
35.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que el agente compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
36.

El agente de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, que se va a usar en combinación con un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente antiangiogénico, un agente apoptótico y un anticuerpo que bloquea la unión de HLA a un receptor de KIR inhibidor.
37.

Un procedimiento de producción de un anticuerpo capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK por medio de:

a) producir in vitro una combinación de anticuerpos candidatos; b) seleccionar cualquier anticuerpo candidato que se une o interacciona con la porción extracelular de un KIR2DL inhibidor; y c) seleccionar cualquier anticuerpo candidato de la etapa b) que es capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión entre el KIR inhibidor y un ligando de HLA de clase I del KIR;

en donde, opcionalmente, el orden de las etapas b) y c) se invierte.
38.

El procedimiento de la reivindicación 37, que comprende además una etapa de seleccionar un agente de unión a KIR transreactivo.
39.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 37 y 38, en el que el agente es un anticuerpo monoclonal

o un fragmento de unión del mismo.
40.

Un procedimiento para producir un anticuerpo aislado o un fragmento de unión del mismo que es capaz de reducir la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK, que comprende las etapas de:

a) inmunizar un animal no humano con una composición inmunogénica que comprende al menos una porción extracelular de un KIR; b) preparar anticuerpos a partir del animal inmunizado, en el que los anticuerpos se unen al KIR; c) seleccionar un anticuerpo aislado de la etapa b) que es capaz de neutralizar la inhibición mediada por KIR de la citotoxicidad de las células NK sin reducir la unión entre el KIR inhibidor y un ligando de HLA de clase I del KIR; y d) preparar opcionalmente un fragmento del anticuerpo.
41.

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión del mismo que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR.
42.

El anticuerpo o fragmento de unión de la reivindicación 41, que se une al mismo epítopo de KIR2DL1 como anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
43.

El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 41 y 42, que comprende una región H1 de CDR correspondiente a los residuos 31-35 de la SEC ID Nº 17, una H2 de CDR correspondiente a los residuos 50-66 de la SEC ID Nº 17, una H3 de CDR correspondiente a los residuos 99-108 de la SEC ID Nº 17; una L1 de CDR correspondiente a los residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18, una L2 de CDR correspondiente a los residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18 y una L3 de CDR correspondiente a los residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18.
44.

El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 17 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18.
45.

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión que compite con un anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3, en el que el agente reduce la inhibición mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de las células NK sin reducir de forma detectable la unión entre el KIR y un ligando de HLA de clase I del KIR.
46.

El anticuerpo o fragmento de unión de la reivindicación 45, que se une al mismo epítopo de KIR2DL1 como anticuerpo que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18 en la unión a al menos uno de KIR2DL1 y KIR2DL3.
47.

El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 45 y 46, que comprende una región H1 de CDR correspondiente a los residuos 31-35 de la SEC ID Nº 21, una H2 de CDR correspondiente a los residuos 50-66 de la SEC ID Nº 21, una H3 de CDR correspondiente a los residuos 98-103 de la SEC ID Nº 21; una L1 de CDR correspondiente a los residuos 24-34 de la SEC ID Nº 18, una L2 de CDR correspondiente a los residuos 50-56 de la SEC ID Nº 18 y una L3 de CDR correspondiente a los residuos 89-97 de la SEC ID Nº 18.
48.

El anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, que comprende una secuencia VH de la SEC ID Nº 21 y una secuencia VL de la SEC ID Nº 18.
49.

Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento de unión de cualquiera de las reivindicaciones 41 a 48.
50.

Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 49.
51.

Una célula huésped aislada transfeccionada con el vector de acuerdo con la reivindicación 50.
52.

Un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 51 en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo.

FIGURA 4